camundongo nod no estudo sobre a eficácia da auto-hemoterapia

8/9/2019 Camundongo NOD no estudo sobre a eficcia da auto-hemoterapia.

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Utilizao do camundongo NOD (Non-obese diabetic) como modelo de

estudo sobre a eficcia da autohemoterapia.

Dr. Flvio Alves Lara

Bacharel em Microbiologia

Mestre em Biocincias e Biotecnologia

Doutor em Qumica Biolgica

Assistente de Pesquisa do Laboratrio de Microbiologia Celular

Instituto Oswaldo Cruz

Fundao Oswaldo Cruz

Fica aqui registrado que se trata de um estudo preliminar, que no d respaldo cientfico ao

uso da ferramenta em humanos. Apesar da sua provvel eficcia em um modelo animal

clssico de doena autoimune, seu mecanismo de ao e riscos em potencial no so

conhecidos.

Endereo:

Flavio Alves Lara

Laboratrio de Microbiologia Celular

Pavilho Hansenase, sala 27

Av. Brasil 4365 Manguinhos

Rio de Janeiro Brasil

CEP: 21045-900

e-mail: [email protected]


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Introduo

A linhagem de camundongo NOD (Non-obese diabetic) largamente utilizadaem estudos envolvendo modulao da resposta imune, fisiologia de linfcitos T

reguladores e diabetes. Os animais dessa linhagem apresentam o desenvolvimento

espontneo de uma sndrome autoimune, levando em poucas semanas de vida

infiltrao linfomononuclear progressiva das ilhotas de Langerhans (insulite), iniciada

na quinta semana de vida, levando ao desenvolvimento do quadro clnico de diabetes

dependente de insulina (Kikutani e Makino, 1992). A linhagem NOD foi gerada por

pesquisadores japoneses atravs da induo de polimorfismo no lcus Idd3, associado

produo de IL-2, o que acarreta no desaparecimento da populao de linfcitos T

reguladores (Makino e cols, 1980). A perda da populao de lifocitos responsveis pela

gesto da imunotolerancia acarreta em um leque maior de sndromes autoimunes a

serem observadas na supracitada linhagem, tais como sialites autoimune, tireoidites

autoimune, polineuropatia perifrica autoimune e dermatite sistmica autoimune.

Estudos recentes apontam o papel imunomodulador apresentado por

componentes sanguines tais como plaquetas e heme (Porto e cols. 2007; Graca-Souza e

cols. 2002; Knighton e cols. 1986).

Dessa forma, decidimos no presente estudo fracionar os componentes do

sangue em trs: frao celular, frao plasmtica e frao heme, realizando protocolo

semelhante autohemoterapia em camundongos NOD, observando dessa forma a

contribuio individual de cada componente para a imunomodulao j observada

durante o tratamento envolvendo a autohemoterapia em humanos (comunicao

pessoal). Utilizamos como grupo controle animais injetados com salina tamponada,

utilizando-se um total de 20 animais para cada condio.


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Metodologia

Fraes do sangue

A partir de uma colnia isognica (mesmo pool gentico) de camundongos BalbC

NOD, machos foram sacrificados por asfixia em cmara de CO2 e sangrados com aajuda de uma seringa contendo heparina como anticoagulante. O sangue foi rapidamente

centrifugado a 1000g por 10 minutos, no sentido de separarmos a frao celular (que

nas pranchas das figuras 1 e 2 so abreviadas como sangue) e a frao plasmtica (que

nas figuras 1 e 2 so chamadas de plasma). Ambas as fraes so congeladas em freezer

para uso posterior.

Soluo de HemeNeste trabalho uma soluo de 10mM de heme (Fe-Protoporfirina IX) foi preparada da

seguinte forma: heme em p adquirido da empresa Molecular Products foi resuspendido

em soluo de NaOH 0.1N, e posteriormente tamponado com PBS (tampo fosfato

tamponado a pH 7,2).

PBS

A soluo de PBS foi montada atravs da combinao de solues contendo 100mM de

fosfato de sdio monobsico e dibsico adicionados de 150mM de NaCl at atingir-se o

pH 7,2. Todos os sais foram adquiridos da empresa Merck.

Tratamento

O tratamento consistiu de injees intramusculares de 10l dos diferentes estmulos

(frao celular do sangue, frao plasmtica do sangue, heme e PBS) em apenas um dos

membros inferiores por vez, a cada 2 semanas, de forma que um mesmo membro

recebia injees a cada 4 semanas. No foram observados nos animais em questo sinais

maiores de desconforto atribudos ao tratamento. Foram utilizados 20 animais por

grupo, iniciando-se o tratamento no segundo ms de vida. Divergncias no padro de

dermatite autoimune foram registradas ao longo do perodo, interrompendo-se o estudo

ao sexto ms de vida.

Dessa forma, decidimos no presente estudo fracionar os componentes do sangue em

trs: frao celular, frao plasmtica e frao heme, realizando protocolo semelhante

autohemoterapia em camundongos NOD, observando dessa forma a contribuio


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Nos voltamos ento para a frao celular do sangue, a nica que apresentou

forte efeito imunomodulador. Acreditamos que a pouca ao da frao plasmtica se

deve aos contaminantes presentes da frao celular, que provavelmente te juntam a esta

aps lise celular proveniente do procedimento de coleta de sangue. Sabemos que o

efeito benfico da frao celular no proveniente da ao de inoculao de clulas

sanguneas viveis no ambiente intramuscular, visto que esta frao foi congelada aps

seu preparo e descongelada previamente ao uso, procedimento que inviabiliza a

existncia de clulas viveis. conhecido tambm que o tratamento prvio do sangue

com oznio, o que acarreta no rompimento de todas as clulas ali presentes, aumenta

sua eficcia como imunomodulador (comunicao pessoal). Dessa forma, acreditamos

em um componente protico presente no interior de alguma populao celular presente

no sangue como responsvel pelos efeitos teraputicos da autohemoterapia.

O heme o grupamento prosttico da hemoglobina, e no apresentou qualquer

efeito, no entanto, peptdeos gerados a partir da hidrolise da hemoglobina apresentam

uma gama de efeitos no organismo de mamferos, dentre eles a cascata de sinalizao de

protena kinase C (PkC) e caseina kinase 2 (Chen-Roetling et al, 2008). Os eritrcitos

lisados e injetados intramuscularmente dessa forma estariam envolvidos na ao

teraputica da autohemoterapia. Temos que ter em mente tambm que um antgeno

comum e no ativador como a hemoglobina pode ser subvertido a um imunoativador,

supressor ou modulador por estar sendo reconhecido fora de seu ambiente natural, o

sangue. O grupo de evidencias que descrevem as diferenas no reconhecimento de

antgenos decorrentes ao ambiente e/ou o tipo celular atravs dos quais so apresentados

s clulas efetras criou a hiptese do Danger Model (Matzinger, 2002).

Por outro lado, no podemos nos abster em discutir um outro tipo celular

potencialemnte envolvido no efeito terapeutico visualizado na frao celular do sangue,

as plaquetas. Um grande numero de fatores de crescimento so porduzidos earmazenados no interior dessas clulas, tais como: fator de crescimento derivado de

plaquetas (PDGF), um potente agente quimiottico, TGF- (transforming growth factor-

) que possui atividade imunosupressora por evitar a ativao de linfcitos e

macrofagos, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), IGF-1 (insulin-like growth

factor-1) tambm reconhecido imunomodulador por aumentar a viabilidade celular de

fagocitos, dentre outros fatores de crescimento. De fato, autohemoterapia utilizando-se

apenas da frao plaquetria j utilizada em vrios tipos de tratamento, de implantes


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sseos cura de ulceraes cutneas, associadas ou no diabetes (OConnell e cols.

2008; Sanchez e cols. 2007; Knighton e cols. 1990; Knighton e cols. 1986).

Como concluso, observamos novas evidencias a respeito da eficcia da

autohemoterapia como ferramenta teraputica imunomodulatria. Nossos resultados

iniciais apontam para a participao preponderante da frao celular em detrimento da

frao plasmtica e do componente heme. Novos estudos tornam-se necessrio para

uma total compreenso do mecanismo de ao da supracitada ferramenta teraputica.


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Referncias

Chen-Roetling J, Li Z, Regan RF (2008). Hemoglobin Neurotoxicity is Attenuated byInhibitors of the Protein Kinase CK2 Independent of Heme Oxygenase Activity. CurrNeurovasc Res. 5, 193-8.

Graca-Souza AV, Arruda MA, de Freitas MS, Barja-Fidalgo C, Oliveira PL (2002).Neutrophil activation by heme: implications for inflammatory processes. Blood. 99,4160-4165.

Kikutani H, Makino S (1992). "The murine autoimmune diabetes model: NOD andrelated strains".Adv. Immunol. 51: 285322.

Knighton DR, Ciresi KF, Fiegel VD, Austin LL, Butler ELL. Classification andtreatment of chronic nonhealing wounds: successful treatment with autologous platelet-derived wound healing factors (PDWHF). Ann surg 1986; 204:322-30.

Knighton DR, Ciresi K, Fiegel VD, Schumerth S, Butler E, Cerra F. Stimulation ofrepair in chronic, non healing, cutaneous ulcers using platelet-derived wound healingformula. Surg Gynecol Obstet 1990; 170:56-60.

Porto BN, Alves LS, Fernndez PL, Dutra TP, Figueiredo RT, Graa-Souza AV, BozzaMT. Heme induces neutrophil migration and reactive oxygen species generationthrough signaling pathways characteristic of chemotactic receptors. J Biol Chem. 2007Aug 17;282(33):24430-6.

MF, Oliveira PL, Graa-Souza AV, Bozza MT, Figueiredo RT, Fernandez PL, Mourao-Sa DS, Porto BN, Dutra FF, Alves LS, Oliveira. Characterization of heme as activatorof Toll-like receptor 4. J Biol Chem. 2007 Jul 13;282(28):20221-9

Matzinger P (2002). The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305.

Makino S, Kunimoto K, Muraoka Y, Mizushima Y, Katagiri K, Tochino Y (1980)."Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice".Jikken Dobutsu 29 (1): 113.

OConnell S, Impeduglia T, Hessler K, Wang XJ, Carroll R, Dardik H. Autologous

platelet-rich fibrin matrix as cell therapy in the healing of chronic lower-extremityulcers. Wound Rep Reg 2008; 16:749-756.

Snchez M, Anitua E, Azofra J, Anda I, Padilla S, Mujika I. Comparison of surgicallyrepaired Achilles tendon tears using platelet-rich fibrin matrices. The American Journalof Sports Medicine 2007; 35 (2): 245-51.


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Plasma

Heme

Figura 1- Viso dorsal de fmeas de camundongos NOD de 6 meses deidade com 4 meses de tratamento envolvendo injees intramusculares

contendo diferentes estmulos.Animais enquadrados no grupo de tratamento envolvendo administrao deplasma e sangue apresentam aparncia dorsal saudvel, no entanto animais dogrupo tratado com plasma apresentam leve arrepiamento de pelo, indicativo de

desconforto. O mesmo no visto no grupo tratado com a frao celular dosangue. Animais tratados com PBS (salina tamponada) e heme (Fe-Protoporfirina IX) apresentam claro sinal de dermatite, com perda de pelo (setas)e visvel arrepiamento de pelo.

Sangue


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Figura 2- Viso ventral de fmeas de camundongos NOD de 6 meses deidade com 4 meses de tratamento envolvendo injees intramusculares

contendo diferentes estmulos.A viso ventral torna evidente a diferena de eficcia entre o tratamento usandoa frao celular do sangue, e o tratamento envolvendo a frao plasmtica.Enquanto os primeiros apresentam ausencia total de dermatite, animais tratados

com a frao plasmtica do sangue apresentam nveis de inflamaosemelhantes ao grupo que recebeu heme e o grupo controle (PBS). Setasapontam regies onde h perda de plo decorrente de dermatite autoimune.

Sangue

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