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1. INTRODUÇÃO
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Homeostase de Ca2+
Os organismos unicelulares, assim como os organismos multicelulares,
precisam sentir e responder ao seu ambiente. Todas as células e organismos
possuem uma apurada “rede” de comunicação, sendo esta, responsável pela
sobrevivência da célula em seu ambiente. As células utilizam um sistema de
sinalização celular para comunicarem-se umas com as outras e desencadear
processos tais como: reprodução, obtenção de alimento, determinar funções
especializadas e responder a fatores ambientais adversos (Alberts et al., 1999). Para
isto as células utilizam diversas moléculas extracelulares, proteínas, peptídeos,
aminoácidos, esteróides e etc., para enviar sinais. A propagação intracelular desses
sinais é mediada por vários mensageiros secundários como cálcio, AMP cíclico e IP3
(Alberts et al., 1999; Sanders et al., 2002).
O Ca2+ possui uma função ampla e importante como mensageiro secundário
intracelular. A concentração de Ca2+ livre no citosol ([Ca2+])c em células eucarióticas
é muito baixa, variando de 50 a 200 nM em leveduras (Halachmi & Eilam, 1993;
Miseta et al., 1999), 100 a 300 nM em fungos (Iida et al., 1990; Miller et al., 1990;
Halachmi & Eilam, 1989), 100 a 200 nM em células animais (Carafoli, 1987) e
apresentando uma concentração média de cerca de 200 nM em células vegetais
(revisado por Sanders et al., 1999).
O aumento da concentração de Ca2+ livre no citosol ([Ca2+])c pode acontecer
em resposta a muitos sinais diferentes. Em plantas, mudança da [Ca2+]C aparece
durante a transdução de sinais desencadeados por uma variedade de sinais
abióticos e bióticos (Sanders et al., 2002). O aumento da concentração extracelular
de cálcio pode, por exemplo, causar um aumento na concentração de cálcio no
citosol da célula (Alberts et al., 1999). O controle da concentração de Ca2+ é
essencial para as células eucarióticas, pois a mudança dessa concentração afeta
diversos processos celulares incluindo a secreção de proteínas (Durr et al., 1998), o
ciclo celular (Hartley et al., 1996), a morfologia celular (Campbell, 1983; Johannes et
al., 1991; Bush, 1995) o metabolismo energético, a expressão de genes
(Stathopoulos & Cyert, 1997; Yoshimoto et al., 2002), e a fusão de membranas
(Takita et al., 2001).
A regulação do Ca2+ livre é feita por um conjunto de processos que são
coletivamente chamados de homeostase de Ca2+, que é coordenada pela atividade
de vários transportadores: os canais de Ca2+ (influxo passivo de Ca2+) presentes na
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MP e membranas de organelas, as Ca2+-ATPases que transportam Ca2+ pela
hidrólise do ATP, H+-ATPases que criam um gradiente protônico e trocadores
Ca2+/H+ que utilizam o gradiente protônico para transportar o Ca2+ (transportadores
secundários) (Bush, 1995; Sanders et al., 2002) (Figura1).
Figura 1: Representação esquemática da homeostase do Ca2+ em células de
levedura, fungos e plantas. 1) Membrana plasmática (MP); 2) Organelas ou
vesículas da via secretória (RE, Golgi, compartimento intermediário entre o RE e o
Golgi, vacúolo, etc.);
Transportadores de efluxo de Ca2+: 3) Ca2+-ATPase de MP; 3*) Ca2+-ATPase de
membranas de vesículas da via secretória; 4) P H+-ATPase de MP; 5) V1V0 H+-
ATPase de membranas intracelulares; 6) trocador Ca2+/H+ de MP; 6*) trocador
Ca2+/H+ de organelas ou vesículas da via secretória.
Transportadores do influxo de Ca2+: 7) Canal de Ca2+ de MP; 7*) Canal de Ca2+ de
organelas ou vesículas da via secretória.
Fonte: Silva, 1998.
[~100nM]
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ H+
H+
H+
1
3*
7
2
7*
5
3
4
6*
ATP
ATP
ATP
ADP + P i
ADP + P i
Pi +ADPADP + P i
[~1mM]
Ca2+
Ca2+
H+
6
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O Ca2+ ativa várias proteínas e enzimas regulatórias, tais como, calmodulina,
proteínas quinases e proteínas fosfatases (Gadd, 1994; Yoshimoto et al., 2002).
Uma das mais conhecidas vias de sinalização pelo Ca2+ que altera a transcrição de
um grande número de genes é a via calmodulina/calcineurina/ Crz1p (Yoshimoto et
al., 2002). Esta é uma via conservada em células de mamíferos e células de
levedura onde se apresenta com alguns componentes diferenciados (Figura 2); isso
mostra a importância do Ca2+ como sinalizador em diferentes organismos e seu
estudo em células de levedura como modelo.
Figura 2: Regulação da transcrição da calcineurina em leveduras e células de
mamíferos. CHP, proteína homologa a calcineurina.
Fonte: Crabtree, 2001.
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Transportadores de Ca2+
A) O Influxo de Ca2+:
Canais de Ca2+
Em células eucarióticas a sinalização por Ca2+ tem início pela abertura de
canais de Ca2+ localizados na membrana plasmática (MP) e em membranas de
algumas organelas, como por exemplo, vacúolo (Locke et al., 2000; Bush, 1995).
Este processo é iniciado por um estímulo que aumenta a [Ca2+]c entre 10 a 100
vezes (Cunningham & Fink, 1994a). Após este efeito a [Ca2+]c retorna rapidamente
para o nível inicial, de aproximadamente 50-100nM, pela atividade dos
transportadores ativos do efluxo de Ca2+.
Esta mudança dinâmica da [Ca2+]c é controlada efetivamente e representa a
base da sinalização celular pelo Ca2+. Existem alguns tipos de canais de Ca2+
descritos na literatura:
� Canais controlados por ligantes: os canais de Ca2+ que podem ser abertos em
resposta ao aumento de IP3 ou ADP-ribose cíclico, foram descritos em células
de animais (Bush, 1995) de plantas (revisado por Sanders et al., 1999), em
vacúolos de Neurospora crassa (Cornelius et al., 1989) e S. cerevisiae (Belde
et al., 1993).
� Canais voltagem-dependente: foram descobertos em membranas do vacúolo
de Candida albicans (Calvert & Sanders, 1995). Os canais se abrem no caso
de um aumento do potencial do tonoplasto (TN), ficando com o lúmen
vacuolar positivo. Esse tipo de canal também foi caracterizado em plantas
(Bush, 1995), em MP de planta (White, 2000). Em MP de levedura este canal
é formado pela interação do produto dos genes MID1 e CCH1 (Fischer et al.,
1997; Locke et al., 2000). Nestes organismos a entrada de Ca2+ por esse
canal causa um aumento citoplasmático de Ca2+ que irá causar a ativação da
expressão de genes de transportadores de Ca2+, através da via
calmodulina/calcineurina/ Crz1p. Após a sinalização haverá conseqüente
retirada do Ca2+ do citosol para as organelas da via secretória através dos
seus transportadores (Figura 3).
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� Canais iônicos mecano-sensíveis: são encontrados em plantas e leveduras.
Em levedura esse canal foi encontrado na membrana vacuolar e é codificado
pelo gene YVC1 (Palmer et al., 2001). Existem indicações de que este tipo de
canal está envolvido na resposta à mudança osmótica do meio (Bush, 1995;
Palmer et al., 2001; Sanders et al., 2002; Denis & Cyert 2002; Zhou et al.,
2003); quando há um estresse por choque hiperosmótico, há um aumento na
concentração de Ca2+ no citosol que é liberado do vacúolo através deste
canal. A célula utiliza então os transportadores de Ca2+ presentes nas
organelas da via secretória para detoxificar o citosol (Figura 4).
Figura 3: Papel fisiológico para o mecanismo CCE-like em levedura. Um modelo articulado
da homeostase e da sinalização de Ca2+ em levedura. Depleção dos estoques de Ca2+ da
via secretória durante o crescimento em ambientes com baixa concentração de Ca2+ ativa o
canal de Ca2+ de alta-afinidade Mg2+-resistente composto de Cch1p e Mid1p através de um
mecanismo de CCE que envolve CIF possivelmente (seta 1 ou 2). Cch1p e Mid1p ativados
provê mais substrato para que Pmr1p transporte para aumentar o Ca2+ nos compartimentos
da via secretória e eleva [Ca2+]c que pode estimular expressão de Pmr1p e Pmc1p.
Aumentando o Ca2+ armazenado na via secretória por Pmr1p (e possivelmente Pmc1p em
trânsito para o vacúolo) prevenindo CIF acumulação e a ativação de Cch1p e Mid1p, mas
não afeta um canal de baixa afinidade (sistema de captação Mg2+-sensível. Depleção de
Ca2+ na via secretória e estímulo de entrada de Ca2+ também podem ser alcançados
geneticamente diminuindo atividade de Pmr1p ou Pmc1p crescente ou atividades de Vcx1p.
Fonte: Locke et al., 2000.
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A rápida liberação dos estoques de Ca2+ requer um grande gradiente de
concentração. A concentração total de Ca2+ no lúmen do retículo endoplasmático
(RE) é estimada em 1 a 3 mM. Uma porção do Ca2+ é livre, mas a concentração de
Ca2+ livre no RE é extremamente difícil de medir e ainda é ponto de grande
controvérsia, pois dependendo do método aplicado estes valores podem variar de
1µM a 3 mM (Meldolesi & Pozzan, 1998). O RE de células ciliadas pode gerar
flutuações periódicas na concentração de Ca2+ em seu lúmen, o que resulta em
liberações oscilatórias para o citosol e oscilação local da [Ca2+] no citosol que
precede o aumento dos batimentos ciliares induzido pelo ATP. Nguyen et al. (1998)
descreveram que quando o inositol trifosfato (IP3) está ligado ao seu receptor nos
canais de Ca2+ do RE, estes liberam Ca2+ para o citosol. Em células pancreáticas
também foi descrito o mesmo mecanismo de liberação através do IP3, mas não
somente dele, mas também de outras substâncias como, por exemplo, a ADP ribose
cíclica, que também mobilizaria o Ca2+ do RE (Dyachok et al., 2004). O aumento do
Ca2+ no citosol ativa o canal de K+ estimulado por Ca2+ ocasionando o influxo do K+
para o RE. Isto vai ocasionar o aumento da concentração de Ca2+ livre no RE, por
meio de troca de Ca2+ por K+ e a ampliação marcante do gradiente de Ca2+ do lúmen
do RE/citosol para liberação local no citosol (Nguyen et al.,1998).
Figura 4: Modelo para liberação e
seqüestro de Ca2+ vacuolar. Choque
hiperosmótico induz o vacúolo a
liberar Ca2+ por YVC1 que requer a
presença de pelo menos um dos
transportadores de Ca2+ Pmc1p ou
Vcx1p. Depois que Ca2+ é liberado,
Vcx1p rapidamente seqüestra o Ca2+
para o vacúolo e diminui o Ca2+
citosólico.
Fonte: Denis & Cyert, 2002.
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B) O efluxo de Ca2+:
Ca2+-ATPases
As ATPases são enzimas que utilizam diretamente a energia da hidrólise do
complexo ATP-Mg2+ como substrato para transportar Ca2+, H+, K+, Na+ ou outros
íons como Cu2+ e Mn2+ (Carafoli, 1987; Pedersen & Carafoli, 1987).
As Ca2+-ATPases são membros da família de ATPases do tipo P (Pedersen &
Carafoli, 1987; Carafoli, 1987). Uma característica comum deste tipo das ATPases é
a sensibilidade para ortovanadato e a formação de intermediario fosforilado, γ-
aspartilfosfato da enzima (Pedersen & Carafoli, 1987). Outros exemplos desse tipo
de ATPases são as H+-ATPases de membrana plasmática (MP) de leveduras,
fungos e plantas (Bowman & Bowman, 1986; Pedersen & Carafoli, 1987) e Na+/K+-
ATPases de células animais (Pedersen & Carafoli, 1987). As Ca2+-ATPases podem
ser encontradas em MP de plantas (Dixon, 1984; Bush,1985) e células animais, em
retículo sarcoplasmático (RS) de células musculares (Pedersen & Carafoli, 1987;
Carafoli, 1987; Eslhorst et al., 1999) e retículo endoplasmático (RE) de levedura
(Okorokov, 1997; Okorokov & Lehle, 1998).
As informações sobre Ca2+-ATPase de MP de leveduras são limitadas e
contraditórias. Hiraga et al. (1991) solubilizaram e purificaram parcialmente uma
ATPase de MP de S. cerevisiae, por cromatografia de afinidade por calmodulina. A
atividade hidrolítica dessa ATPase foi estimulada por Ca2+ e calmodulina e inibida
por altas concentrações de ortovanadato. Porem o transporte de Ca2+, realizado por
essa ATPase nunca foi demonstrado. Alguns grupos de pesquisadores acreditam
que a MP das leveduras não possui sua própria Ca2+-ATPase (Marchi et al., 1999;
Catty, et al., 1997), porém não discutem como seria(m) o(s) mecanismo(s) de efluxo
de Ca2+ através desta membrana (MP).
Em S. cerevisiae dezesseis genes codificam ATPases do tipo P (Catty et al.,
1997). Até o momento, os produtos de somente dois genes foram identificados
bioquimicamente como Ca2+-ATPases, o gene PMR1 que codifica Ca2+-ATPase de
Golgi (Rudolph et al., 1989) e o gene PMC1 que codifica Ca2+-ATPase de vacúolo
(Cunningham & Fink, 1994b).
O gene PMR1 foi descoberto inicialmente como um gene codificador de uma
proteína que possui similaridade com as Ca2+-ATPases de MP e RE (Rudolph et al.,
1989), sendo mais tarde comprovado bioquimicamente que o produto do gene
PMR1 podia transportar Ca2+, ou seja, que o gene PMR1 realmente codifica uma
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Ca2+-ATPase (Okorokov, 1995; Okorokov, 1997; Sorin et al., 1997; Okorokov &
Lehle, 1998). A localização de Pmr1p (Ca2+-ATPase) foi indiretamente determinada
no Golgi através de imunolocalização (Antebi & Fink, 1992), verificando que a
presença dessa mesma Ca2+-ATPase era necessária para a realização das funções
normais do Golgi, como a glicosilação de proteínas (Rudolph et al., 1989; Durr et al.,
1998). Evidências bioquímicas diretas mostraram que esta Ca2+-ATPase está
localizada em no mínimo dois subcompartimentos do Golgi e em compartimento
intermediário entre o RE e o Golgi (Okorokov & Lehle, 1998). O segundo gene,
PMC1, codifica outra Ca2+-ATPase que transporta Ca2+ para dentro do vacúolo de S.
cerevisiae (Cunningham & Fink, 1994b).
Alguns geneticistas moleculares sugeriram que S. cerevisiae expressaria
aproximadamente dez Ca2+-ATPases (Catty & Goffeau, 1996), depois chegaram à
conclusão que existiriam apenas duas Ca2+-ATPases, PMR1 e PMC1, em células de
S. cerevisiae (Catty et al., 1997).
A hipótese de que cada organela da via secretória tem sua própria Ca2+-
ATPase (Okorokov, 1994; 1995), foi reforçada por evidências bioquímicas que
mostraram a existência de no mínimo quatro Ca2+-ATPases em S. cerevisiae, uma
no RE, uma Ca2+-ATPases no Golgi, uma em membranas semelhantes às do Golgi
e outra no vacúolo (Okorokov, 1994). Okorokov (1996 e 1997) mostrou que atividade
de Ca2+-ATPases foi encontrada em diversas vesículas de membranas, separadas
por gradiente de sacarose e enriquecidas por membranas de várias organelas e que
essas ATPases apresentavam sensibilidades diferentes para ortovanadato. Foi
observado que 50% do transporte de Ca2+ inibido pelo ortovanadato ocorreu nas
concentrações de 30 µM nas membranas vacuolares, 150 a 400 µM nas membranas
do Golgi e membranas semelhantes ao Golgi, 610 a 650 e 230 µM nos
subcompartimentos do RE e 15 µM nas membranas mais pesadas de RE (Okorokov
et al., 1996; Okorokov, 1997).
Reforçando ainda mais esta hipótese, alguns trabalhos descreveram a
presença de ATPases envolvidas na homeostase de Ca2+ que estão localizadas no
RE, como a Cta4p em S. pombe (Okorokova Façanha et al., 2002) e a Cod1p em S.
cerevisiae (Cronim et al., 2002).
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Trocadores Ca2+/H+
Os trocadores de H+ são transportadores ativos secundários, pois utilizam o
gradiente de H+, gerado por uma H+-ATPase para transportarem outros íons e
aminoácidos para organelas celulares, resultante da troca com prótons (Ohsumi &
Anraku, 1983; Okorokov et al., 1985a, 1985b; Okorokov et al., 1988; Bush, 1995). A
energia reservada em forma de gradiente de H+ (∆pH) é usada para o transporte de
Ca2+ pelo trocador Ca2+/H+ ocorrendo simultaneamente à troca de H+ pelo Ca2+. No
caso do trocador Ca2+/H+ de organelas intracelulares o Ca2+ entra na organela e o H+
sai (Ohsumi & Anraku, 1983; Okorokov et al., 1985a; 1985b). No caso do trocador
Ca2+/H+ de MP o H+ entra na célula e o Ca2+ sai da célula (Stroobant & Scarborough,
1979).
Em leveduras, outros tipos de trocadores além de Ca2+/H+ são conhecidos:
arginina+/H+ (Ohsumi & Anraku, 1981 Okorokov et al., 1985a), Zn2+/H+, Mg2+/H+,
Mn2+/H+, Cd2+/H+ em membranas vacuolares (Okorokov et al., 1985a; 1985b; White
& Gadd, 1986) e/ ou Na+/H+ em levedura (Prior et al., 1996) e em Candida albicans
(Soong et al., 2000). O número específico de trocadores para cátions não é
conhecido (Klionsky et al., 1990).
A atividade do trocador Ca2+/H+ foi mostrada em membranas vacuolares de S.
cerevisiae (Ohsumi & Anraku, 1983). E o gene que codifica esse trocador foi
encontrado por dois grupos independentemente, VCX1 (Cunningham & Fink, 1996)
e HUM1 (Pozos et al., 1996). O trocador Vcx1p está envolvido na captação quando
há um aumento da concentração do Ca2+ para eliminar o excesso de Ca2+ no citosol,
rapidamente (Miseta et al., 1999). A atividade do trocador foi determinada nas
diferentes organelas da via secretória tanto de S cerevisiae (Okorokov, 1995;
Okorokov, 1997) quanto de S. pombe (Okorokov et al.,1997; Silva, 1998; Okorokov
et al., 2001).
A atividade do trocador Ca2+/H+ pode ser desfeita por protonóforos, como o
FCCP, pois este possui a capacidade de colapsar o ∆pH gerado pela H+-ATPase,
permitindo um equilíbrio de H+ através da membrana (Kakinuma et al., 1981;
Okorokov et al., 1985a; 1985b; Schumaker & Sze, 1986; Banta et al., 1988). O
colapso do ∆pH provocado pelo FCCP induz a saída de Ca2+ que foi acumulado nas
vesículas de membranas vacuolares anteriormente, indicando a importância do ∆pH
para o acúmulo e retenção do Ca2+ nas vesículas de membranas (Okorokov et al.,
1988; Silva, 1998; Okorokov et al., 2001).
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Atividade do trocador em MP de levedura ainda não foi mostrada, porém,
essa atividade foi encontrada nos fungos Neurospora crassa (Stroobant &
Scarborough, 1979) e Phytophtora megasperma (Giannini et al., 1988). Nesse caso
o gradiente protônico é formado por H+-ATPase do tipo P e esta enzima possui alta
sensibilidade para o ortovanadato, portanto a atividade do trocador Ca2+/H+ de MP
pode ser inibida por protonóforos ou pelo ortovanadato (Stroobant & Scarborough,
1979). Até o momento, foi mostrado que a atividade do trocador Ca2+/H+ de
membranas intracelulares é suportada pela H+-ATPase do tipo V (V H+-ATPase)
(Ohsumi & Anraku, 1983; Okorokov, 1985; Okorokov et al., 1988; Silva, 1998;
Okorokov et al., 2001). No caso, a atividade do trocador Ca2+/H+ pode ser inibida por
protonóforos (Kakinuma et al., 1981; Schumaker & Sze, 1986; Banta et al., 1988) ou
pelos inibidores específicos da V H+-ATPase bafilomicina A1 ou concanamicina A.
Portanto as atividades dos trocadores Ca2+/H+ de MP e de membranas da via
secretória podem ser diferenciadas com o uso de inibidores específicos de V-H+-
ATPases e P-H+-ATPases (Okorokov et al., 1985b; Okorokov et al., 1988; Silva,
1998; Okorokov et al., 2001).
A maioria das publicações concorda com a hipótese de que o vacúolo é a
principal organela armazenadora de Ca2+ em leveduras, fungos e plantas (Halachmi
& Eilam, 1989; Klionsky et al., 1990; Cunningham & Fink, 1994a; Calvert & Sanders,
1995; Pozos et al., 1996, Tanida et al., 1996; Cunningham & Fink, 1996) e de que o
trocador Ca2+/H+ está localizado somente em membranas vacuolares (Ghislain et al.,
1990; Dunn et al., 1994; Pozos et al., 1996; Cunningham & Fink, 1996). Porém,
atividade do trocador foi demonstrada em várias membranas de organelas de S.
cerevisiae, separadas em gradiente de densidade de sacarose sendo, portanto,
proposto que cada compartimento da via secretória de leveduras possuem seus
próprios trocadores Ca2+/H+ e também Ca2+-ATPases (Okorokov, 1995; Okorokov,
1997).
Em mutante que não expressa VCX1 (trocador de Ca2+/H+ vacuolar) de S.
cerevisiae, foi encontrada uma alta atividade do trocador Ca2+/H+ em membranas
mais densas que membranas do RE, sugerindo que este trocador é codificado por
um gene diferente de VCX1 (Marchi et al., 1999). Em S. pombe os íons de Ca2+
foram transportados somente pelo trocador Ca2+/H+, utilizando o gradiente de H+
gerado pela V H+-ATPase, pois não foi encontrada nenhuma atividade da Ca2+-
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ATPase(s), enquanto a atividade do trocador Ca2+/H+ foi encontrada em todos os
compartimentos da via secretória de S. pombe (Okorokov et al., 2001).
Regulação dos transportadores de Ca2+
Cepas de levedura do tipo selvagem podem crescer em meios contendo mais
de 100 mM de cálcio, porém mutações que inativam a subunidade da V-ATPase ou
outros fatores necessários para a acidificação do lúmen do vacúolo, causam extrema
sensibilidade à adição de CaCl2, causando um aumento na [Ca2+]c de
aproximadamente seis vezes (Ohya et al., 1986; Ohya et al., 1991).
O aumento da concentração de Ca2+ extracelular causa um aumento na
concentração de Ca2+ no citosol; esse aumento ativa a proteína fosfatase
Ca2+/calmodulina dependente, calcineurina (CaN) e estimula a expressão de PMC1
(Ca2+-ATPase de vacúolo) que é induzida pela calcineurina. Em leveduras, a
calcineurina ativada aumenta a tolerância a níveis tóxicos de Na+, Li+ (Mendoza et
al., 1996), Ca2+ e Mn2+ (Cunningham & Fink, 1996). Logo, em levedura, o aumento
da [Ca2+]c, extracelular pode promover a expressão dos genes PMC1 e PMR1 em
aproximadamente 7 e 2 vezes, respectivamente (Yoshimoto et al., 2002).
A contribuição da calcineurina na homeostase de Ca2+ foi verificada através
de análises com mutantes e verificou-se que a cepa mutante de pmc1 (Ca2+-ATPase
de vacúolo, pmc1∆) reduz a tolerância a altas concentrações de Ca2+ (Cunningham
& Fink, 1994b). Este mesmo resultado foi encontrado quando se adiciona FK506
(antagonista de calcineurina) em mutante de vma (VH+-ATPase de vacúolo) ou
mutante duplo cnb1 vma (calcineurina e VH+-ATPase de vacúolo) (Tanida et al.,
1996). Mostrando que as atividades das Ca2+-ATPases e do trocador Ca2+/H+ são
importantes para tolerância a cátions.
A cepa deficiente dos três transportadores, VCX1 (trocador Ca2+/H+ de
vacúolo), PMC1 (Ca2+-ATPase de vacúolo) e PMR1 (Ca2+-ATPase de Golgi) é
inviável (mutante triplo). O mutante duplo pmr1 pmc1 (deficientes das duas Ca2+-
ATPases) também é inviável, porém a inativação da calcineurina (deleção do gene
cnb1) promove a viabilidade deste mutante (Cunningham & Fink, 1996). Uma cepa
que seja deficiente, mas contenha pelo menos um destes transportadores de Ca2+
funcional consegue promover e manter o papel relativo de cada transportador e seus
reguladores (Cunningham & Fink, 1996).
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Cepas de levedura mutantes pmr1∆ sofrem de fragmentação vacuolar o que
parece ser uma resposta celular normal frente a um aumento do Ca2+ citoplasmático,
já que um ou dois transportadores de Ca2+ estão ausentes de suas funções
(Kellermayer et al., 2003).
Cunningham e Fink (1996), baseados em dados experimentais, propuseram
um modelo, pelo mecanismo de “feedback”, da homeostase de Ca2+, em levedura,
que envolve pelo menos calmodulina (CaM), calcineurina e três transportadores de
Ca2+. Juntos estes transportadores de Ca2+ controlam a concentração de Ca2+ e
previnem a acumulação tóxica de Ca2+ no citosol, que é extremamente importante
em condições de alta concentração de Ca2+ extracelular. A ativação da calcineurina
por calmodulina e por altas concentrações de Ca2+ no citosol, leva ao aumento da
expressão de PMC1 e possivelmente de PMR1 e uma redução significativa da
atividade do Vcx1p, por um mecanismo pós-transcricional ainda desconhecido.
Os pesquisadores que estudam a homeostase de Ca2+ acreditam que o
trocador Ca2+/H+ VCX1 possui uma baixa afinidade pelo Ca2+ porém possui uma alta
capacidade de transportar o Ca2+ para o vacúolo (Cunningham & Fink, 1996; Miseta
et al., 1999). Miseta et al. (1999) mostraram que a concentração de Ca2+ livre no
citosol de levedura é de 70 a 80 nM e quando as células são submetidas à alta
concentração de Ca2+ há um aumento rápido na concentração desse íon no
citoplasma e também rapidamente sua concentração volta ao normal. A deficiência
nos transportadores de Ca2+ causa uma resposta diferente a esse aumento de Ca2+,
quando o trocador VCX1 é o principal responsável por diminuir a concentração de
Ca2+ no citosol mais rapidamente e efetivamente (Figuras 5 e 6). Após a exposição
ao Ca2+ extracelular há um aumento na concentração de Ca2+ nas células de
levedura; na cepa selvagem (sem mutação) a concentração é de 290 nM; na cepa
deficiente de uma Ca2+-ATPase (pmc1∆) a concentração é de 250 nM e na cepa
deficiente do trocador Ca2+/H+ (vcx1∆) a concentração é de 400 nM (Miseta, et al.,
1999). O que contradiz a suposição de que a afinidade do trocador Ca2+/H+ pelo
Ca2+ seja baixa, já que quando a célula não tem o gene que codifica para o trocador
não consegue atingir os mesmos níveis de concentração de Ca2+ que as células que
possuem o gene.
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Figura 5: Medidas do nível de Ca2+ citosólico por aquoporina quando exposto a altas
concentrações de Ca2+ ambiental. Emissão clara dependente do Ca2+ foi registrada em
10 s com Ca2+ médio para determinar a concentração citosólica basal do Ca2+. CaCl2 foi
acrescido a uma concentração de A: 50 mM ou B: 400 mM e as mudanças do Ca2+ no
citosol foram monitorados até 150 s.
Fonte: Miseta, et al., 1999.
Figura 6: Efeito da bafilomicina A1 no nível de Ca2+ do citosol quando exposto a alta
concentração de Ca2+ ambiental. Células WT ou vcx1∆ foram tratadas por 10 min com
bafilomicina A1 (em DMSO) ou só em DMSO. Emissão clara dependente do Ca2+ foi
registrada em 10 s com Ca2+ médio para determinar a concentração citosólica basal do
Ca2+. CaCl2 foi acrescido a uma concentração de 100 mM, e emissão clara foi registrada
até 110 s. A: Efeito da bafilomicina A1 na resposta da cepa WT para o choque de Ca2+.
B: Efeito da bafilomicina A1 na resposta da cepa vcx1∆ para choque de Ca2+.
Fonte: Miseta, et al., 1999.
15
Assim como já dito o trocador tem papel fundamental para a homeostase de
Ca2+. Podemos observar isto quando a célula é deficiente de outros transportadores
de Ca2+ e como o trocador é capaz de manter uma concentração de Ca2+ e sem o
mesmo (inibido) não é capaz (Figura 7) (Kellermayer et al., 2003).
Além dos efeitos da alta concentração de Ca2+ extracelular no aumento da
concentração desse íon no citosol, outros fatores podem contribuir também para
esse aumento, como já foi descrito, entre eles está o estresse por hiper
osmolaridade. Denis e Cyert (2002) demonstraram que o trocador VCX1 é
importante, também neste caso, para a volta da concentração de Ca2+ normal no
citosol. Também evidenciaram que o sinal de Ca2+, ou seja, o aumento da
concentração do mesmo ocorre de modo diferenciado, ratificando a especificidade
do sinal de Ca2+ dependendo do desencadeador, neste caso alta concentração de
Ca2+ ou choque osmótico (Figura 8) (Denis & Cyert, 2002).
Figura 7: VCX1 tem um papel importante na homeostase de Ca2+ em cepas pmc1∆
e pmr1∆ / pmc1∆. Nível de Ca2+ citosólico livre medido pelo sistema aquoporina Ca2+.
A seta representa a adição de 100 mM CaCl2.
Fonte: Kellermayer et al., 2003.
1
16
Efeito da glicose sobre a homeostase de Ca2+ e H+ em levedura
A presença da glicose extracelular induziu modificações nas propriedades
cinéticas da P H+-ATPase, resultando na estimulação da atividade dessa enzima
(Serrano, 1983). Supply et al. (1993) mostraram que esta ativação pode ser de duas
a três vezes, porém a adição de frutose (Kotyk & Georghiou, 1994) pode
proporcionar uma ativação da H+-ATPase da MP maior que a adição da glicose,
sugerindo que a frutose-6-fosfato pode ativar a H+-ATPase da MP.
A V H+-ATPase é formada por dois complexos, o complexo catalítico V0 e o
complexo regulatório V1. O transporte de H+ realizado pela V H+-ATPase ocorre
somente quando os complexos V1 e V0 estão associados de forma funcional, ou
Figura 8: Mudanças no Ca2+ ciosólico com respeito a choque hiperosmótico. (a)
Resposta de luminescência em uma cepa tipo selvagem (YPH499) depois da adição
(tempo 0) de 0,1 M de CaCl2 (cinza), ou depois do choque hiperosmótico com os
tratamentos: 0,8 M de NaCl (vermelho); 0,9 M de KCl (amarelo); e 0,7 M de sorbitol
(azul). Como medida de osmolaridade, a osmolaridade média com 0,8 M de NaCl é
igual à com 0,9 M de KCl, e é 1,2 vezes mais alta que com 0,7 M de sorbitol. (b)
Resposta de luminescência depois do tratamento com 0,8 M de NaCl nas cepas tipo
selvagem (YPH499, preto), pmc1∆ (TPYp, azul), vcx1∆ (KKY127, roxo), e
pmc1∆vcx1∆ (KKY124, rosa). Todas as cepas foram transformadas com
PEVP11/AEQ.
Fonte: Denis e Cyert, 2002.
17
seja, o complexo V0 não transporta prótons quando o complexo V1 está dissociado
(Zhang et al., 1992). Em levedura, tem sido mostrado que a ausência da glicose
promove a dissociação de aproximadamente 70% dos complexos V1 e V0, porém a
adição da glicose extracelular induz uma rápida e eficiente associação dos
subcomplexos previamente sintetizados. O mesmo efeito dissociação/ associação
dos complexos da V H+-ATPase ocorre na presença de glicose extracelular e
ciclohexamida (inibidor da síntese protéica), sugerindo que este mecanismo ocorre
pós-traducionalmente (Kane, 1995; Kane & Parra, 2000). O mecanismo de
dissociação e a associação da V H+-ATPase pode representar processos
controlados independentemente, já que a dissociação requer microtúbulos intactos,
enquanto que a associação não (Xu & Forgac, 2001).
Mutações que inativam subunidades da V H+-ATPase ou outros fatores
necessários para a acidificação do lúmen do vacúolo, causam o aumento de
aproximadamente seis vezes na concentração de Ca2+ livre no citosol (Ohya et al.,
1991). Este distúrbio de homeostase de Ca2+ foi interpretado pela incapacidade da V
H+-ATPase das membranas do mutante de suportar a atividade do trocador Ca2+/H+,
Vcx1p, promovendo o seqüestro intracelular de Ca2+ através da troca com o H+
(Ohya et al., 1991).
Em membrana plasmática de N. crassa, foi encontrado um trocador Ca2+/H+,
que utiliza o gradiente eletroquímico criado anteriormente por uma H+-ATPase de
tipo P (Stroobant & Scarborough, 1979); já na membrana plasmática de
Dictyostelium discoideum, foi encontrada uma Ca2+/nH+-ATPase que troca
simultaneamente Ca2+ pelo H+, utilizando a energia direta da hidrólise do ATP
(Rooney & Gross, 1992). Isto mostra que a homeostase de H+ esta intimamente
relacionada com a homeostase de Ca2+.
A perda da principal isoforma da fosfoglucomutase (PGM2), enzima que
catalisa a transferência da glicose-1-fosfato (Glc-1-P) para glicose-6-fosfato (Glc-6-
P) causou mudança na homeostase de Ca2+ celular e na sinalização das células de
S. cerevisiae que cresceram em meio contendo galactose como fonte de carbono
(Fu et al., 2000). A cepa pgm2∆ (mutante deficiente na isoforma da PGM2) exibiu
maior taxa de captação e maior conteúdo de Ca2+ celular total, quando comparada à
cepa selvagem (Sc252)��� $� FLFORVSRULQD� $� �&V$��� LQLELGRU� GD� SURWHtQD� IRVIDWDVHcalcineurina, na concentração de 10 µg/mL inibe o crescimento da cepa pgm2∆,
sugerindo que a sobrevivência desse mutante é dependente da ativação dos
18
transportadores de Ca2+ pela CaN, realizando uma rápida remoção do Ca2+ do
citosol. Porém estes efeitos não são visualizados no mutante pgm2∆, quando este
cresce na presença de glicose ou lactose. Esses efeitos na mudança da homeostase
de Ca2+ (Fu et al., 2000; Aiello et al., 2002) na cepa pgm2∆ crescendo na presença
de galactose, também foram encontrados por Halachmi & Eilam (1996) na cepa
pmr1∆, incluindo o acúmulo de Ca2+.
Aiello et al. (2004) demonstram que os níveis relativos de Glc-1-P e Glc-6-P
têm um papel importante na regulação da distribuição de Ca2+ nos diferentes
compartimentos intracelulares. Nesse trabalho é sugerido que a mutação de pgm2∆
conduz simultaneamente o aumento da captação de Ca2+ pelo vacúolo e reduz essa
captação no RE/Golgi, quando essas células são crescidas em galactose como fonte
de carbono. O acúmulo de Ca2+ no vacúolo dessas células de pgm2∆ não é alterado
quando o trocador Vcx1p é desativado. Também não há mudança quando a Ca2+-
ATPase do RE (Cod1p) é desativada. Somente quando PMC1p está desligada é que
há um aumento nos defeitos no fenótipo (Aiello et al., 2004).
Foi demonstrado na levedura S. cerevisiae que a adição de glicose, depois de
um período de ausência de glicose, ocasionaria um ligeiro aumento na concentração
de Ca2+ no citosol (Souza et al., 2001), e uma diminuição do pH citoplasmático
devido à glicólise (Ohya et al., 1996). Isso irá consequentemente ativar rapidamente
a H+-ATPase vacuolar (V H+-ATPase) (Parra & Kane, 1998; Kane, 1999) e também
da P H+-ATPase de MP (Chang & Slayman, 1991).
O trocador Ca2+/H+ vacuolar (VCXp) parece mediar mais rapidamente à
captação de Ca2+ do citosol (Miseta et al., 1999) e como já foi dito mutações que
inativam subunidades da V H+-ATPase ou outros fatores necessários para a
acidificação do lúmen do vacúolo, causam o aumento de aproximadamente seis
vezes na concentração de Ca2+ livre no citosol (Ohya et al., 1991). Estas
observações sugerem uma importante relação entre a regulação do pH citosólico e a
homeostase de Ca2+ (Kellermayer et al., 2004).
Foi sugerido então que tanto o vacúolo como o complexo de Golgi têm um
papel significante na distribuição e aumento dos níveis de Ca2+ citosólicos, sendo
que o trocador Ca2+/H+ vacuolar e as Ca2+-ATPases do vacúolo e do Golgi têm um
importante papel na compartimentalização do Ca2+ e estão envolvidas no aumento
transiente do Ca2+ no citoplasma (Kellermayer et al., 2004).
19
A concentração de Ca2+ citoplasmático é importante para qualquer célula,
como já foi dito, pois este está envolvido com vários processos. Quando há alteração
nesta homeostase ocorrem deficiências orgânicas nas células, sendo que o aumento
na concentração de Ca2+ no citoplasma é capaz de ativar vários processos
potencialmente prejudiciais. Alguns destes acontecem pela ativação de enzimas
hidrolíticas, como a fosfolipase A2, proteases e endonucleases (Song et al., 2003).
Quando há aumento da glicose há aumento da concentração de Ca2+ intracelular de
modo dose dependente em células de ratos, acarretando problemas nas células de
indivíduos diabéticos (Song et al., 2003).
20
2. OBJETIVOS
21
OBJETIVO PRINCIPAL
Sabendo que a glicose extracelular estimula tanto as atividades das H+-ATPases do
tipo P e V como o metabolismo das células de levedura, nosso objetivo foi verificar o
seu efeito sobre as atividades das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ nas
diferentes organelas da via secretória da levedura Saccharomyces cerevisiae.
OBJETIVOS EXPERIMENTAIS
1) Isolar membranas de esferoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae
X2180, incubados ou não com glicose.
2) Determinar o transporte de H+ dependente de ATP nas membranas totais, pelas P
H+-ATPase (sensível ao vanadato) e V H+-ATPases (resistentes ao vanadato e
inibidas pela concanamicina A).
3) Avaliar a captação de Ca2+ pelas Ca2+-ATPases e trocador Ca2+/H+ de MT
isoladas de esferoplastos incubados ou não incubados com glicose extracelular.
4) Determinar as atividades das Ca2+-ATPases e do trocador Ca2+/H+ em todas as
frações de membranas separadas em gradiente de sacarose comparando diferentes
condições de fracionamento das membranas e determinação da captação de Ca2+.
5) Identificar, através de determinação das atividades de enzimas marcadoras das
frações, membranas enriquecidas por vesículas de membranas do Golgi e RE.
22
3. MATERIAIS & MÉTODOS
23
3.1 Cepa de levedura
A levedura Saccharomyces cerevisiae cepa X2180, genótipo “wild type strain”
(tipo selvagem): MATa, gal2, mal, mal; foi generosamente doada ao Prof. Ludwig
Lehle (Regensburg, Alemanha) e pelo Prof. Hans Rudolph (Institut für Biochemie der
Universitat Stuttgart, Alemanha).
3.2 Meio de cultura e manutenção da cepa
Foi utilizado o meio de cultura contendo: 1% de extrato de levedura (Difco ou
Oxoid), 2% de glicose (Vetec) e 2% de bactopeptona (Difco ou Oxoid)
O meio YEPD sólido continha adicionalmente 2% de ágar (Vetec). Os meios
foram autoclavados a 0,5 atm (marcados no nanômetro), 110 °C por 30 min. O meio
sólido foi vertido em placas de Petri e levado à estufa a 37 ºC durante 24 horas para a
realização do controle de esterilidade. Após este procedimento, algumas colônias de S.
cerevisiae (X2180) foram retiradas do meio YEPD sólido de estocagem e semeadas em
um novo meio YEPD sólido.
3.3 Curva de crescimento
A curva de crescimento foi feita com meio YEPD líquido. Primeiramente, foi feito
um pré-inóculo onde algumas colônias das cepas X-2180 foram retiradas do meio
YEPD sólido e inoculadas em 40 mL de meio YEPD líquido e cresceram a 30 °C em
agitação constante de 250 rpm por aproximadamente 24 h. Após este tempo de
crescimento foi verificado o crescimento celular no espectrofotômetro em comprimento
de onda de 600 nm.
A curva de crescimento inicia-se no tempo 0, ou seja, o tempo onde uma
alíquota do pré-inóculo é introduzida no meio YEPD. A cepa X-2180 iniciou o
crescimento com a DO 600 nm de 0,1 e cresceu por 36 h a 30 0C em agitação constante
de 250 rpm.
3.4 Preparo do pré-inóculo
Algumas colônias de levedura foram retiradas do meio sólido YEPD e foram
colocadas em 40 mL do meio YEPD líquido, de forma que a leitura inicial do pré-inóculo
no espectrofotômetro no comprimento de onda 600 nm estivesse em torno de 0,1 de
densidade ótica. As células cresceram a 30 ºC sob agitação constante de 250 rpm até a
fase estacionária.
24
3.5 Preparo da levedura para o isolamento
O volume do pré-inóculo a ser adicionado em 200 mL do meio YEPD
(Erlenmeyers de 1000 mL) foi calculado, considerando o tempo de geração da cepa X-
2180 de 2 horas, de acordo com a curva de crescimento, de forma que, após
aproximadamente 17 h a 30 ºC em agitação de 250 rpm, as células crescessem até o
final da fase logarítmica. Após o crescimento celular, foi realizado o isolamento das
vesículas de membranas de S. cerevisiae.
3.6 Isolamento de membranas e fracionamento subcelular
O isolamento foi realizado de acordo com o método descrito por Okorokov &
Lehle (1998) com modificações. Todos os procedimentos foram realizados sob
refrigeração (banho de gelo). Soluções, tubos, rotores e centrífugas foram
previamente resfriados.
3.6.1 Obtenção de células
As células de S. cerevisiae foram inoculadas em meio YEPD e colocadas
para crescer sob agitação (250 rpm a 30 °C) até o fim da fase logarítmica, no caso
da levedura em estudo até aproximadamente 9 unidades/ ml. A cultura de
suspensão celular foi centrifugada a 4000 x g por 6 min a 4 °C (centrífuga Allegra 6R
– BeckMan Coulter). Em seguida foi feito o descarte do meio e determinado o peso
úmido das células.
3.6.2 Obtenção dos esferoplastos
Para cada 1 g de peso úmido de células foram adicionados 5 mL de tampão
de esferoplastos (Sorbitol 1,2 M, Tris 10mM, pH 7,4) contendo 2 mg do complexo
enzimático lítico (liticase), e 12 �/� β-mercaptoetanol (concentração final 30 mM).
Esta suspensão celular em tampão para esferoplastos foi incubada a 37 °C sob
fraca agitação (manual).
O monitoramento cinético da hidrólise da parede celular foi realizado
espectrofotometricamente no comprimento de onda de 600 nm, misturando 10 µL
desta suspensão celular em 990 µL H2O. Este monitoramento foi feito a cada 5 ou
10 min a partir do tempo 0 (zero) de incubação até o tempo máximo de 50 min ou
até que a absorbância chegasse ao valor entre 20 a 10% do valor inicial.
O tubo contendo a suspensão de esferoplastos foi transferido para o gelo e a
reação de hidrólise da parede celular foi finalizada pela adição do tampão de parada
(“stop solution”), nas concentrações finais de Tris-HCl 10 mM pH 7,4, EDTA 1 mM,
25
Sorbitol 60 mM, Benzamidina 1 mM e PMSF 1 mM. Para eliminar os resíduos de
enzimas líticas, a suspensão de esferoplastos (~15 mL) foi adicionada sobre 30 mL
da solução colchão (“cushion”) (Sorbitol 1,4 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4) no tubo de
centrifuga. Isto foi feito com o auxílio de uma pipeta, devagar e inclinadamente
evitando a mistura da suspensão de esferoplastos com a solução colchão. Este
material foi centrifugado a 4000 x g por 6 min a 4 °C (centrífuga Allegra 6R –
BeckMan Coulter). O sobrenadante foi cuidadosamente descartado e as paredes
dos tubos foram secas com papel de filtro para evitar que possíveis enzimas líticas
atuem nos esferoplastos.
3.6.3 Pré-incubação dos esferoplastos com glicose
Os esferoplastos foram então separados em dois grupos: 1° grupo - os
esferoplastos do controle (sem glicose) foram incubados a 30 °C por 10 minutos com
20mL de tampão de incubação (Sorbitol 1,2 M, MgSO4 3 mM, KH2SO4 10 mM, Tris-
HCl 10mM, pH 7,2) e 2° grupo - os esferoplastos (com glicose) foram incubados a
30 °C por 10 minutos com 20mL de tampão de incubação (Glicose 100 mM, Sorbitol
1,2 M, MgSO4 3 mM, KH2SO4 10 mM, Tris-HCl 10mM, pH 7,2). Os tubos foram
centrifugados a 4000 x g por 6 min a 4 °C (centrífuga Allegra 6R – BeckMan
Coulter).
3.6.4 Obtenção de membranas totais
O sedimento obtido das duas preparações de esferoplastos foram
ressuspensos em 20 mL de tampão de lise (Sacarose 12,5 %, MOPS-KOH 20 mM,
pH 7,6),contendo DTT 1 mM, coquetel de inibidores de proteases 1 µg/mL (solução
estoque do coquetel de inibidores de proteases é composto de quimistatina,
pepstatina, antipaína, leupeptina e aprotinina na concentração de 1 mg/mL cada
um), benzamidina 1mM e PMSF 1mM.
A ressuspensão foi homogeneizada, em homogeneizador de vidro com pistilo
de teflon (“potter”), com 21 ciclos completos (“strokes”). O homogeneizado foi
centrifugado a 4000 x g por 6 min a 4 °C (centrífuga Allegra 6R – BeckMan Coulter).
O sedimento foi desprezado e o sobrenadante (suspensão de membranas
totais) foi transferido para o tubo da ultracentrífuga (Himac 75β, rotor P50A2) e
centrifugada a 45000 x g por 45 min a 4 °C.
26
3.6.5 Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente
de densidade de sacarose
Foram adotadas duas metodologias de ressuspensão e
fracionamento de membranas totais
Na primeira metodologia, o sedimento (membranas totais) foi ressuspenso em
aproximadamente 1,5 mL (para aproximadamente 1,0 mL do conteúdo de
membranas) do tampão de lise (Sacarose 12,5 %, MOPS-KOH 20 mM, pH 7,6), na
presença 1 µg/mL do coquetel de inibidores de proteases (solução estoque do
coquetel de inibidores de proteases é composto de quimistatina, pepstatina,
antipaina, leupeptina e aprotinina na concentração de 1 mg/mL cada um). Este
volume foi adicionado gradativamente geralmente de 300 em 300 µL misturando
bem, até que o volume final determinado fosse atingido. A ressuspensão de
membranas totais foi colocada no homogeneizador de vidro com o pistilo de teflon
(“potter”) e homogeneizada com 7 ciclos completos (“strokes”).
Um volume de 1,2 mL de ressuspensão de membranas totais foi colocado
sobre um gradiente descontínuo de sacarose com concentrações de 20 a 56% (cada
concentração de sacarose foi diluída peso/peso (p/p) em MOPS-NaOH 10 mM pH
7,2). O gradiente foi centrifugado a 140000 x g por 2 horas e 45 minutos a 4°C
(centrífuga Himac 75β, rotor P28S). O volume de membranas totais restante foi
aliquotado em volumes de 70 a 100 µL, congelado em nitrogênio líquido e
armazenado no freezer a -70 até o momento das análises.
As vesículas de membranas separadas no gradiente descontínuo de sacarose
foram fracionadas pela introdução de um capilar de vidro até o fundo do tubo de
centrífuga, onde as membranas se encontravam. Foram coletadas 10 gotas de
vesículas de membranas sendo esta coleta realizada do fundo para a superfície do
tubo com o auxílio de uma bomba peristáltica e um coletor de frações. Desta forma,
as primeiras frações de vesículas de membranas coletadas representam as
vesículas de membranas mais densas e as últimas frações, as vesículas de
membranas menos densas. Após o fracionamento, as frações de vesículas de
membranas foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas no freezer a -70
°C até o momento das análises.
Na segunda metodologia foram feitas as seguintes modificações: O
sedimento (membranas totais) foi ressuspenso em um tampão diferente composto
de Tampão de lise (Mops-KOH 20 mM, Sacarose 12,5%, pH 7,6) na presença de
27
glicerol 1,7g, 1 µg/mL do coquetel de inibidores de proteases (solução estoque do
coquetel como descrito anteriormente), de benzamidina 0,5 mM, de PMSF 0,5 mM e
de DTT 0,2 mM. O procedimento seguinte foi semelhante ao da primeira
metodologia.
O gradiente descontínuo de sacarose também sofreu modificação, foi feito
com concentrações de 20 a 56% (cada concentração de sacarose foi diluída
peso/peso (p/p) em MOPS-NaOH 10 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,2) e complementado
com glicerol a fim de que todas as bandas formadas pelas diferentes concentrações
de sacarose tivessem a mesma miliosmolaridade que a mais concentrada (56%). O
procedimento restante foi semelhante ao da primeira versão.
3.7 Determinação do transporte de 45Ca+2
O ensaio de captação de 45Ca2+ em membranas de levedura foi realizado
seguindo o protocolo descrito por Okorokov & Lehle (1998) com modificações. Para a
determinação da cinética de captação de 45Ca2+ foi utilizada a solução de incubação
(MOPS-KOH 10 mM, KCl 160 mM, MgSO4 5 mM, EGTA 9,8 µM, CaCl2 10,3 µM, 45Ca2+
0,5 µCi, pH 7,2) nas seguintes condições: (1) na ausência de ATP-Mg (s/ATP); (2) na
presença de ATP-Mg 1 mM (ATP-FCCP); (3) na presença de ATP-Mg 1 mM e de
FCCP 1 µM (ATP+FCCP) (usado para bloquear a atividade do trocador Ca2+/H+).
No ensaio de cinética, a captação de Ca2+ foi analisada nos tempos de 1, 3, 5,
10, 15 e 30 min. Foram adicionados em 25 µL de suspensão de membranas totais 1,1
mL dos meios de incubação com 45Ca2+ descritos acima e incubado a 30 0C.
Aproximadamente 15 segundos antes de terminar cada tempo de incubação, uma
alíquota de 150 µL da solução incubada com a amostra foi retirada e exatamente ao
terminar o tempo de incubação esta alíquota foi colocada em aproximadamente 18 mL
do tampão de lavagem (MOPS-KOH 10 mM, KCl 160 mM, MgSO4 5 mM, pH 7,2)
gelado, que já se encontrava dentro do sistema de filtração. As amostras foram então
filtradas através de filtros de nitrocelulose (poros 0,45 µm) com o auxílio de uma bomba
de vácuo e imediatamente ao fim da filtração foi adicionado aproximadamente o mesmo
volume do tampão de lavagem anterior, para a lavagem das paredes do sistema de
filtração. Após a lavagem, os filtros foram secos e colocados em frascos apropriados
para o cintilador (“vial”) contendo aproximadamente 4 mL de líquido de cintilação (27
mM PPO, 55 µM POPOP dissolvidos em 1 L de tolueno) e a radioatividade associada
ao filtro de nitrocelulose, correspondente ao 45Ca2+ captado pelas vesículas de
28
membranas que se associaram com o filtro nitrocelulose foi quantificada por contagem
no cintilador (1600 TR Liquid Scintillation Analyzer – PAKARD). Procedimento
semelhante foi utilizado para as membranas fracionadas em gradiente de sacarose,
onde 30 µL de membranas fracionadas foram usados para 180 µL de solução de
incubação de 45Ca2+. Esta solução foi incubada a 30 0C por 15 min. Após este tempo,
180 µL da solução incubada foi retirada e filtrada e procederam as lavagens, como
descrito acima.
A atividade das Ca2+-ATPases foi determinada pelos valores encontrados na
captação de 45Ca2+, avaliada na presença de 1 mM de ATP e de 1 µM de FCCP
(ATP+FCCP). A atividade do trocador Ca2+/H+ foi determinada subtraindo os valores
obtidos na captação de 45Ca2+ feita na presença de 1 mM de ATP (ATP-FCCP) dos
valores obtidos na captação de Ca2+, feita na presença de FCCP (ATP+FCCP).
Testamos também outra metodologia (segunda) do transporte de 45Ca2+ na qual
adicionamos sacarose aos tampões de análise, a fim de normalizar a osmolaridade
presente durante as análises.
Para a determinação da cinética de captação de 45Ca2+ foi utilizada a solução de
incubação (MOPS-KOH 10 mM, KCl 160 mM, MgSO4 5 mM, Sacarose 12,5%, EGTA
9,8 µM, CaCl2 10,3 µM; 45Ca2+ 0,5 µCi, pH 7,2) nas seguintes condições: (1) na
ausência de ATP-Mg (s/ATP); (2) na presença de ATP-Mg 1 mM (ATP-FCCP); (3) na
presença de ATP-Mg 1 mM e de FCCP 1 µM (ATP+FCCP). O procedimento foi
semelhante ao da primeira metodologia, porém o tampão de lavagem utilizado foi (10
mM MOPS-KOH, pH 7,2; 160 mM de KCl; 12,5% Sacarose; 5 mM de MgSO4 gelado).
Para determinar o KM e Vmax (velocidade máxima) das enzimas, foi analisada a
cinética enzimática, com descrito anteriormente durante os tempos de 30, 60, 90 e 120
segundos, utilizando os tampões descritos para a segunda versão de experimentos
(normalizando a osmolaridade), Tais cálculos de KM e a Vmax das Ca2+-ATPases e dos
trocadores Ca2+/H+ em membranas totais de esferoplastos incubados ou não com
glicose foram baseados na metodologia clássica proposta por Lineweaver, H e Bur, K D
(1934).
3.8 Determinação do conteúdo de proteína
O conteúdo de proteína foi determinado seguindo o protocolo descrito Bradford
(1976) e modificado por Read & Northcote (1981) usando BSA como padrão.
O reagente de Bradford foi preparado a partir da adição de etanol absoluto
29
(12 mL) de Comassie Brilliant Blue G 90% (28 mg) e foi deixado sob agitação por 1
hora, protegido da luz. Após este tempo foi adicionado à solução, ácido ortofosfórico
85% (25 mL). Após homogeneização, o volume foi completado para 250 mL com
água destilada e a solução foi misturada. Esta solução foi filtrada por 4 vezes em
filtro de papel. A solução de Bradford foi armazenada em vidro âmbar na geladeira.
Albumina de soro bovino (1 mg/mL) foi utilizada como padrão de proteína.
Para determinar a curva de proteína, foram retirados volumes entre 2 a 20 µL
da solução de albumina (1 mg/mL) e estes foram completados com quantidade
suficientes para um volume final de 100 µL com água destilada. Após este
procedimento foi adicionado 1 mL da solução de Bradford. Cada reação foi mantida
a temperatura ambiente por 10 min exatos (isto é, havia um intervalo de 30
segundos entre os tubos onde ocorriam as reações). Após este tempo, procederam-
se as leituras de cada amostra no espectrofotômetro, sob um comprimento de onda
de 595 nm, respeitando-se os intervalos de 30 segundos.
O conteúdo de proteína foi determinado tanto nas membranas totais quanto
nas membranas fracionadas, utilizando 5 a 15 µL de suspensão de membranas e
completando o volume para 100 µL com água destilada e adicionando-se 1 mL da
solução de Bradford. As reações processaram-se por exatamente 10 min e
procederam-se as leituras no espectrofotômetro em comprimento de onda de 595
nm. Para valores de conteúdo de proteínas que ficaram fora da faixa de linearidade
ou na extremidade da curva padrão, foram realizados os seguintes procedimentos a
fim de que suas leituras permanecessem, preferencialmente, entre os valores
médios estabelecidos na curva padrão: (1) ou aumentou-se o conteúdo de
membranas; (2) ou diluiram-se as membranas com água destilada.
4.9 Curva padrão de fosfato inorgânico (Pi) para as determinações
fosfohidrolíticas de ATP e GDP
Foi detectada pelo aumento da quantidade de fosfato inorgânico (Pi) resultante
da hidrólise de ATP seguindo o método descrito por Albeijon et al. (1989).
A solução estoque de 0,5 µmol/mL de KH2PO4 (previamente desidratado a uma
temperatura entre 40ºC a 60°C por 2 – 3 h) foi usada como padrão do conteúdo de
fosfato inorgânico (Pi). Volumes entre 50 e 1000 µL dessa solução foram utilizados para
determinar a curva padrão. Os volumes abaixo de 1000 µL foram completados com
quantidade suficiente de água destilada para completar o volume final de 1 mL. A
30
solução de Pi foi incubada a 30 °C por 30 min. Após esta incubação, 2,0 mL da solução
C foram adicionados (com 30 s de intervalo de um tubo de reação para outro). Cada
amostra foi incubada por exatamente 10 min a 30 °C seguida imediatamente da leitura
no espectrofotômetro no comprimento de onde de 750 nm.
A solução C consiste de uma mistura (100:1) da solução A e da solução B, que
deve ser preparada próximo à sua adição na reação (solução A: molibidato de amônio
0,5%, SDS 0,5%, H2SO4 2%; solução B: ácido ascórbico 10%). A solução C foi utilizada
em iguais condições e proporções para as determinações de hidrólise do ATP, PPi e
GDP.
Todas as determinações de fosfohidrolases foram feitas com os respectivos
controles, que continham quantidades iguais dos meios de reação, porém na ausência
de proteínas (vesículas de membranas). Portanto, o resultado das atividades
fosfohidrolíticas encontradas em cada fração de membranas foi referente à diferença
entre as atividades “totais” de cada fração e as atividades de seus respectivos controles.
3.10 Determinação da hidrólise de ATP
A atividade ATPásica foi medida pelo aumento da quantidade de fosfato
inorgânico (Pi) resultante da hidrólise de ATP.
O preparo dos ensaios de hidrólise de ATP (ATPase total) foi feita sob
refrigeração. Nos tubos de ensaio foram colocados 20 µL de suspensão de vesículas de
membranas e 230 µL da solução D (MES-KOH 30 mM, MgSO4 3,75 mM, molibidato de
amônio 262 µM, pH 6,5 - para obter as concentrações finais de MES 23 mM, MgSO4 2,1
mM e molibidato de amônio 192 µM), 10 µL de ATP-NaOH 50mM pH 7,2 (ATP 1,62 mM
concentração final) e 40 µL de água destilada necessária para completar 300 µL. O
meio de reação foi incubado a 30ºC por 30min. Após o tempo de incubação os tubos
foram colocados no gelo novamente, completou-se o volume da reação de hidrólise
para 1ml com água destilada gelada e adicionaram-se 2ml da solução C (descrita
anteriormente). A solução foi incubada por 10 min, em banho maria a 30 °C, seguida
imediatamente da leitura da absorbância no comprimento de onda de 750 nm ( como
descrito no item 3.9).
Para determinar as atividades das ATPases do tipo P, foram adicionados no
meio de reação, acima descrito, 10µl de VO4-3 3mM (inibidor de P-ATPases) na solução
D, em tubos de ensaios diferentes, incubando-se a 30 °C por 30 min. Após o tempo de
incubação os tubos foram colocados no gelo, completando o volume da reação de
31
hidrólise para 1ml e adicionando-se 2ml da solução C. A solução foi incubada por 10
min, em banho maria a 30 °C, e procedeu-se à leitura da absorbância em comprimento
de onda de 750 nm.
A atividade hidrolítica das ATPases do tipo P foi calculada pela diferença dos
valores encontrados na hidrólise total do ATP (em ausência de vanadato) e dos valores
encontrados na hidrólise de ATP sensível ao vanadato em pH 6,5.
3.11 Determinação de GDPase (enzima marcadora de membranas do Golgi)
A atividade GDPásica foi detectada pelo aumento da quantidade de fosfato
inorgânico (Pi) resultante da hidrólise de GDP seguindo o método descrito por Albeijon
et al. (1989). A preparação para determinação de GDPase foi feita no gelo, colocando-
se 10 µL de imidazol 200 mM pH 7,4; 10 µL de triton X-100 1%; 2 µL CaCl2 100 µM; 10
µL de GDP 70 mM; 48 µL de água destilada; 20 µL de suspensão de membranas. As
amostras foram incubadas a 37 °C por 30 min. Após este tempo, as amostras
retornaram ao gelo e foram adicionados 10 µL de SDS 5% a fim de paralisar a reação e
880 µL de água destilada gelada. Após a adição da água, 2,0 mL da solução C foram
adicionados (com 30 s de intervalo de um tubo de reação para outro). Cada reação foi
incubada por 10 min a 30 °C e submetida imediatamente à leitura de sua absorbância
em comprimento de onda de 750 nm.
3.12 Determinação de NADPH óxido-redutase (enzima marcadora de RE)
A atividade da NADPH citocromo c óxido-redutase foi determinada segundo o
método de Feldman et al. (1987). A determinação foi feita diretamente na cubeta com
900 µL da solução de citocromo c KCN (Sorbitol 0,6 M; KH2PO4 50 mM, KCN 400 µM,
citocromo c 1 mg/mL, pH 7,4) pré-aquecida a 30 oC, 100 µL da solução de NADP-H
(Sorbitol 0,6 M; KH2PO4 50 mM, NADPH 1 mM, pH 7,4) e 30 µL de frações de vesículas
de membranas separadas em gradiente de sacarose. O tempo da reação foi iniciado
quando as frações de vesículas de membranas foram adicionadas na solução e a
cubeta foi invertida aproximadamente 3 vezes (para misturar os componentes da
reação). A primeira leitura da cinética foi feita no tempo de 10 s após a introdução das
vesículas de membranas. As leituras da absorbância foram feitas no comprimento de
onda de 550 nm com intervalos de 5 s até completar o tempo de 180 s.
As absorbâncias registradas sob comprimento de onda de 550 nm foram
tratadas da seguinte forma: (1) cada DO encontrada entre os intervalos de 5 s foi
32
colocada no papel milimetrado; (2) apenas os pontos lineares da curva foram
considerados válidos (geralmente os primeiros pontos); (3) foi traçada uma reta de
tendência, que foi utilizada para o cálculo da atividade; (4) foi encontrado o ∆s (a
diferença entre o ponto inicial e o ponto final na reta de tendência) para o tempo de 1
min; (5) a velocidade enzimática foi determinada pela razão do ∆s e o t (1 min). A
unidade da velocidade enzimática desta enzima foi especificada como unidades
relativas/min.
3.13 Determinação do gradiente de H+ ((∆∆pH - transporte de H+)
A determinação do gradiente de H+ foi feito seguindo o protocolo de Okorokov
& Lichko (1983) e foi realizada no fluorímetro (Hitachi F 45000 ou Shimadzu RF-5301
PC) com abertura de 5/10 nm no comprimento de onda� �� GH� H[FLWDoão 415 nm e de
emissão 485 nm.
Foi utilizada uma solução contendo: 20 µL de KCl 2 M (20 mM concentração
final); 100 µL de MgSO4 50 mM (2,5 mM concentração final); 20 a 50 µL de vesículas
de membranas (este volume foi dependente da atividade); quantidade suficiente de
tampão de MOPS-KOH (Sacarose 12,5%; MOPS-KOH 20 mM, pH 7,4) para
completar o volume final para 2,0 mL. Foram adicionados 3 µL de ACMA 1mM
(estoque dissolvido em etanol). Esta reação foi preparada direto na cubeta e
incubada diretamente no fluorímetro a 30 oC por 5 min. Após esta incubação, foi
inicializada a reação no aparelho aguardando-se aproximadamente 50 s (tempo de
estabilização do platô da fluorescência) e adicionando-se imediatamente 20 µL de ATP-
NaOH 100 mM pH 7,2 (concentração final 1 mM). A cinética da extinção da
fluorescência (“qüenching”) foi observada até o tempo de aproximadamente 600
segundos (ou tempo necessário para atingir a completa extinção da fluorescência),
sendo então adicionados 20 µL de NH4Cl 2 M (concentração final de 20 mM) a fim de
refazer a fluorescência inicial, ou seja, desfazer o gradiente de H+ formado.
Para análise da P H+-ATPase foi seguido o mesmo procedimento, porém foram
adicionados 200 µM de ortovanadato 10 mM (inibidor de P -ATPase) ao tampão de
incubação.
A determinação da velocidade inicial (V0) e da fluorescência máxima (∆Fmáx) na
suspensão de vesículas de membranas foi feita utilizando-se os dados do gráfico obtido
nas análises (Esquema 1).
Utilizamos a seguintes fórmulas:
V0 = [F0 / (Fmáx * t)] * 100 , onde:
33
V0: velocidade inicial de formação do ∆pH (%);
F0: fluorescência dependente de V0 num tempo t, determinado pela extrapolação da
maior inclinação inicial para o eixo do tempo;
Fmáx: fluorescência máxima (total);
t: tempo em minutos;
∆∆Fmáx = Feq / Fmáx * 100
Feq: fluorescência de equilíbrio, determinada como fluorescência do “platô” que
reflete o equilíbrio entre o influxo e o efluxo de H+ nas vesículas.
T (min.)
Figura 9: Representação esquemática da determinação de velocidade inicial e
amplitude máxima do transporte de H+ por membranas de S. cerevisiae, cepa
AA255, separadas em gradiente de sacarose. Velocidade inicial (Vo= [Fo/
(Ftotal*T)]*100); Amplitude máxima ( ∆∆Fmax= (Feq/ Ftotal )*100)
Fo
Ftotal
t=10 min.
Feq
NH4Cl
34
4. RESULTADOS
35
Efeito da glicose extracelular sobre a atividade das Ca2+-ATPase(s) e dos
trocador(s) Ca2+/H+ em membranas isoladas de levedura.
Neste trabalho a levedura Saccharomyces cerevisiae cepa X2180 foi utilizada
como organismo modelo para analisar o efeito da glicose extracelular sobre a
atividade das Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+.
Verificamos o perfil de crescimento da levedura no meio YEPD (Fig. 10). A
fase de crescimento celular reflete o estado fisiológico de cultura que pode
determinar a homeostase iônica. Portanto, para evitar possíveis mudanças na
homeostase iônica dependentes da fase de crescimento do microorganismo,
coletamos as células de levedura no final da fase logarítmica de seu crescimento
que corresponde a uma DO600nm/mL em torno de 9, com um tempo aproximado de
12 horas de crescimento (Fig. 10).
A glicose, principal fonte de carbono e de energia da levedura, é capaz de
estimular o metabolismo e a atividade das H+-ATPases de MP (Serrano, 1983), uma
ATPase do tipo P. Desta forma foi analisado o efeito da glicose sobre a atividade
das Ca2+-ATPases. A glicose estimula seletivamente as V H+-ATPases de RE (4
vezes), de vacúolos (2 vezes ) e de Golgi (não é estimulada) (Samarão, 2003). Visto
que estas formas diferentes de V H+-ATPases oferecem a energia de gradiente
protônico para os trocadores Ca2+/H+ dessas organelas, esperamos que a glicose
possa indiretamente ativar estes trocadores de maneira parecida. No caso em que
os próprios trocadores são objetos da regulação pela glicose podemos esperar que
a ativação dos trocadores não possuam dependência exclusiva da atividade das V
H+-ATPases.
Utilizamos à ativação do transporte de ambas H+-ATPases como controle
positivo da ação da glicose. Para analisar se a glicose poderia controlar as bombas
de H+ em nossas condições foi realizado o isolamento de membranas de S.
cerevisiae onde os esferoplastos foram incubados ou não com glicose extracelular
por 10 minutos. Pudemos verificar que houve uma estimulação de 9 vezes da P H+-
ATPase (atividade sensível a 200 µM de ortovanadato) e de aproximadamente 5,3
vezes das V H+-ATPases (atividade resistente a 200 µM de ortovanadato) (Fig.11).
36
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tempo (horas)
Con
teúd
o de
cél
ulas
(D
O60
0nm/m
l)
Fig. 10 – Curva de crescimento da levedura S. cerevisiae X-2180.A curva foi feita em meio YPD pH 6,8. O crescimento celular foimedido no espectrofotômetro no comprimento de onda de 600nm.
Fase logarítmica
37
Fig. 11 – Efeito da glicose extracelular sobre os transportadoresde H+, P H+-ATPases e V H+-ATPases em membranas totais.Atividade feita na presença de 1 mM ATP. A atividade total das H+-ATPases foi feita na ausência de inibidores, a atividade da P H+-ATPase foi obtida pela diferença da atividade da H+-ATPase sensívela 200 µM de ortovanadato da atividade insensível. A atividade das VH+-ATPases foi considerada como a atividade insensível a 200 µM deortovanadato. Média de 3 experimentos.
0
500
1000
1500
2000
2500
H+-ATPases PH+-ATPase VH+-ATPase
Flu
ores
cênc
ia (
%)/
mg
de p
rote
ina
sem glicosecom glicose
7
5,39
38
Foi analisado então se a glicose poderia controlar os transportadores de Ca2+.
A Fig. 12A mostra que a incubação dos esferoplastos com glicose extracelular foi
capaz de estimular 5 vezes (10 min de captação) a captação de Ca2+ por ambos
transportadores de Ca2+ em membranas totais (MT). Usando o protonóforo FCCP
avaliamos as atividades dos dois tipos de transportadores de Ca2+ e encontramos
que eles foram estimulados pela glicose seletivamente. A atividade de todas Ca2+-
ATPases juntas foram ativadas em 2,3 vezes enquanto que a atividade dos
trocadores aumentaram sua atividade total às 6 vezes (Fig.12B).
Conhecendo que a glicose extracelular pode estimular a atividade das Ca2+-
ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ de membranas totais, o próximo passo do
trabalho foi responder a seguinte pergunta: a glicose extracelular estaria estimulando
de maneira igual as Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+ de diferentes organelas da
via secretória?
Para analisarmos a atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+
nas várias organelas da via secretória foi realizado o fracionamento das vesículas de
membranas totais de esferoplastos que foram ou não incubados com glicose.
Para identificar as frações de membranas enriquecidas por membranas do
Golgi e do RE, foram detectadas as atividades das suas enzimas marcadoras,
GDPase (Fig. 13) e NADPH citocromo c oxido-redutase (Fig. 14), respectivamente,
nas frações obtidas no fracionamento em gradiente de densidade de sacarose.
Verificamos que as membranas enriquecidas por membranas do Golgi se
localizavam entre as frações 33 e 44 (Fig. 13), enquanto que as membranas
enriquecidas por membranas do RE localizavam-se entre as frações 10 e 32 (Fig.
14). As membranas mais densas que membranas do RE/MP, são consideradas
provavelmente como envelope nuclear que comigram na mesma densidade de
sacarose. E as mais leves que as do Golgi, são consideradas como membranas
vacuolares, migram em uma menor densidade de sacarose.
39
Fig. 12 – Efeito da glicose extracelular sobre os transportadoresde Ca2+, Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ em membranastotais. Os esferoplastos foram incubados ou não com 100 mM deglicose extracelular. A Atividade do transporte total de Ca2+, feito napresença e na ausência de 1 mM de ATP (cinética). B Atividade dasCa2+-ATPases (na presença de 1 mM de ATP e 1 µM de FCCP e dostrocadores Ca2+/H+ (diferença entre a atividade total e a atividade dasCa2+-ATPases em membranas totais (atividade em 15 minutos, médiade 3 experimentos.
0,0
2000,0
4000,0
6000,0
8000,0
10000,0
12000,0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
pmol
de
Ca
2+/m
g de
pro
teín
aTransporte total
s/ATP
Transporte total (glic)
s/ATP (glic)
A
B
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Ca2+-ATPase Ca2+-ATPase(glic)
TrocadorCa2+/H+
TrocadorCa2+/H+ (glic)
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
2,3
6
40
Fig. 13 – Atividade de GDPase, em membranas de S. cerevisiae
X-2180 isoladas de esferoplastos, fracionadas em gradiente desacarose. Nas membranas de esferoplastos que foram ou nãoincubadas com glicose extracelular foi determinada à atividade deGDPase, enzima marcadora de membranas enriquecidas pormembranas do Complexo de Golgi. Experimento representativo de 3isolamentos.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
nmol
de
Pi/m
g de
pro
teín
a de
MT
GDPase
GDPase (glic)
41
Fig. 14 – Atividade da NADPH citocromo c oxido-redutase, emmembranas de S. cerevisiae X-2180 isoladas de esferoplastos,fracionadas em gradiente de sacarose. Nas membranas deesferoplastos que foram ou não incubadas com glicose extracelularfoi determinada à atividade da NADPH citocromo c óxido-redutase,enzima marcadora de membranas enriquecidas por membranas doReticulo Endoplasmático. Experimento representativo de 3isolamentos.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
NA
DP
-H c
it c
oxod
ored
utas
e (u
nid
rela
tiva.
30.m
g-1)
NADP-H
NADP-H (glic)
42
Na Fig. 15A podemos observar o efeito da glicose sobre a atividade das Ca2+-
ATPases em vesículas de membranas fracionadas em gradiente de densidade de
sacarose. Assim como em MT, a glicose extracelular estimulou a atividade das Ca2+-
ATPases nas frações de membranas. Para avaliar a estimulação da atividade da
Ca2+-ATPase de cada organela foi feito o somatório das atividades das Ca2+-
ATPases de vesículas de membranas enriquecidas por membranas do vacúolo,
Golgi, RE/MP e das membranas mais densas que as membranas do RE/MP,
provavelmente envelope nuclear (Fig. 15B) para obtermos a contribuição da(s) Ca2+-
ATPase(s) de cada compartimento e constatamos que a glicose estimulou 3,1; 1,3;
1,9 e 1,8 vezes as Ca2+-ATPases das membranas dessas organelas,
respectivamente.
A Fig. 16 mostra o somatório das atividades dos trocadores Ca2+/H+ de
vesículas de membranas derivadas de diferentes organelas da via secretória. A
incubação dos esferoplastos com glicose extracelular estimulou a atividade dos
trocadores Ca2+/H+ apenas no RE/MP e no Golgi em aproximadamente 1,2 e 1,4
vezes, respectivamente. Foi observado que a atividade do trocador Ca2+/H+ em
vesículas de membranas fracionadas em gradiente de densidade de sacarose
perdeu aproximadamente 90% da atividade comparada à atividade encontrada nas
MT aplicada no gradiente (comparem os valores nas Figs. 12 e 16).
Ao analisar esses resultados, foi observado que a perda da atividade do
trocador estaria ocorrendo durante o fracionamento das membranas provavelmente
devido à diferença da osmolaridade na transição das vesículas de membranas em
cada camada de densidade de sacarose.
Para avaliar essa hipótese foi realizado um experimento onde foi
normalizada a osmolaridade de todas as camadas do gradiente e das outras
soluções a partir do tampão da ressuspensão de MT.
O resultado deste experimento mostrou que não houve diferença
significativa da estimulação da atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores
Ca2+/H+ de membranas totais pela glicose quando comparamos os dois protocolos
(Figs. 12 e 17). A glicose estimulou aproximadamente 1,7 vezes as Ca2+-ATPases e
5 vezes dos trocadores Ca2+/H+ (Fig. 17).
43
Fig. 15 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dasCa2+-ATPases em membranas intracelulares de S. cerevisiae. Osesferoplastos foram incubados ou não com 100 mM de glicoseextracelular e fracionados em gradiente de sacarose. A: atividade dasCa2+-ATPases (feita na presença de 1 mM de ATP e 1 µM de FCCP)(pmol/15min). B Somatório da atividade das Ca2+-ATPases emdiferentes organelas da via secretória. Valores acima das colunascorrespondem a quanto de atividade das Ca2+-ATPases foiestimulada pela glicose extracelular em cada compartimento da viasecretória. Experimento representativo de 2 isolamentos.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ina
Ca2+-ATPaseCa2+-ATPase(glic)
EN
vacúolo
Golgi
RE/MPA
B
0
50
100
150
200
250
300
350
400
EN RE/MP Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Ca2+-ATPase
Ca2+-ATPase(glic)
1,81,9
1,33,1
44
Fig. 16 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dostrocadores Ca2+/H+ em membranas intracelulares de S.
cerevisiae. Os esferoplastos foram incubados ou não com 100 mMde glicose extracelular e fracionados em gradiente de sacarose.Somatório da atividade dos trocadores Ca2+/H+ em diferentesorganelas da via secretória. Valores acima das colunascorrespondem a quanto de atividade dos trocadores Ca2+/H+ foiestimulada pela glicose extracelular nos compartimentos da viasecretória. Experimento representativo de 2 isolamentos.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
EN RE/MP Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Trocador Ca2+/H+
Trocador Ca2+/H+ (glic)
1,2
1,4
45
Fig. 17 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dasCa2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ em membranas totais.Atividade das Ca2+-ATPases (na presença de 1 mM de ATP e 1 µMde FCCP) e dos trocadores Ca2+/H+ (diferença entre a atividade totale a atividade das Ca2+-ATPases em membranas totais (atividade em15 minutos, média de 3 experimentos). Atividade das membranas queforam isoladas com o segundo protocolo que normaliza aosmolaridade das soluções.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Ca2+-ATPase Ca2+-ATPase(glic)
TrocadorCa2+/H+
TrocadorCa2+/H+ (glic)
pmol
de
Ca2
+/m
g de
pro
teín
a
1,7
4,5
46
Foram obtidos resultados semelhantes com as bombas de H+ de membranas
totais. A Fig.18 mostra que a estimulação pela glicose do transporte total de H+, da P
H+-ATPase (atividade sensível a 200 µM de ortovanadato) e das V H+-ATPases
(atividade resistente a 200 µM de ortovanadato) foi de 5,2; 5,1 e 5,5 vezes
respectivamente. Tais valores foram semelhantes aos apresentados na Fig. 11,
mostrando que mesmo com a normalização da osmolaridade, a atividade das H+-
ATPases, Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+ em MT, não sofreram modificação
quando se comparam os resultados obtidos com o primeiro protocolo (Fig. 11 e Fig.
12).
A Fig. 19 mostra a atividade hidrolítica da P-ATPase e do conteúdo de
proteína encontrado nas frações de vesículas de esferoplastos que foram ou não
incubados com glicose extracelular. O somatório das atividades hidrolíticas da P-
ATPase em todas as frações de membranas separadas em gradiente de densidade
de sacarose mostrou que a glicose extracelular foi capaz de estimular sua atividade
em 2,7 vezes (dado não mostrado).
Na Fig. 20A podemos observar a atividade das Ca2+-ATPases encontradas
em todas as vesículas de membranas separadas em gradiente de sacarose. Em
concordância com os resultados obtidos com membranas totais encontramos que a
incubação de esferoplastos com glicose extracelular estimulou as Ca2+-ATPases em
todas as vesículas de membranas das organelas da via secretória. A Fig. 20B
mostra o somatório das atividades das Ca2+-ATPases de frações de membranas
derivadas de diferentes organelas da via secretória é observado que a incubação
dos esferoplastos com glicose extracelular estimulou a atividade das Ca2+-ATPases
do RE/MP, Golgi, vacúolo e das membranas mais densas que as membranas do RE
em aproximadamente 2,6; 2,3; 2,1 e 3,8 vezes, respectivamente.
A estimulação das Ca2+-ATPases em membranas que foram fracionadas
nessas novas condições (o gradiente de sacarose mantinha uma osmolaridade igual
e a concentração de Mg2+ foi maior) (Fig.21) foi maior do que a estimulação nas
membranas que foram isoladas seguindo o protocolo onde as membranas sofriam
maior variação da osmolaridade (Fig.15).
47
Fig. 18 – Efeito da glicose extracelular sobre os transportadoresde H+, P H+-ATPases e V H+-ATPases em membranas totais.Atividade feita na presença de 1 mM ATP. A atividade total das H+-ATPases foi feita na ausência de inibidores, a atividade da P-H+-ATPase foi obtida pela diferença da atividade da H+-ATPase sensívela 200 µM de ortovanadato da atividade insensível. A atividade das V-H+-ATPases foi considerada como a atividade insensível a 200 µM deortovanadato (média de 3 experimentos). Atividade das membranasque foram isoladas com o segundo protocolo que normaliza aosmolaridade das soluções.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Total P-ATPase V-ATPase
Flu
ores
cênc
ia/m
g de
pro
teín
a
sem gilcosecom glicose
5,1
5,2
5,5
H+-ATPases
48
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
0,0025
0,003
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
qqq
cont
eúdo
de
prot
eína
µg/fr
ação
ProteínaProteína (glic)
A
B
Fig. 19 – Atividade da hidrólise do ATP realizado pela P-ATPasee o conteúdo de proteína de esferoplastos incubados ou não comglicose. As MT foram separadas em gradiente de densidade desacarose e a atividade ATPásica foi determinada na presença de 1mM de ATP. A: a P-ATPase foi determinada pela hidrólise do ATPsensível a ortovanadato. B: O conteúdo de proteína foi determinadopelo método de Bradford.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
qqq
nmol
de
Pi/m
g de
pro
teín
a de
MT
P-ATPaseP-ATPase (glic)
Frações
Frações
49
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
180,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Ca2+-ATPaseCa2+-ATPase (glic)
EN
vacúolo
Golgi
RE/MP
Fig. 20 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dasCa2+-ATPases em membranas intracelulares de S. cerevisiae. Osesferoplastos foram incubados ou não com 100 mM de glicoseextracelular. A: atividade das Ca2+-ATPases em membranassubmetidas ao fracionamento subcelular (feita na presença de 1 mMde ATP e 1 µM de FCCP) (pmol/15min). B Somatório da atividadedas Ca2+-ATPases em diferentes organelas da via secretória.Valoresacima das colunas correspondem a quanto de atividade das Ca2+-ATPases foi estimulada pela glicose extracelular em cadacompartimento da via secretória. Experimento representativo de 2isolamentos. Atividade das membranas que foram isoladas com osegundo protocolo que normaliza a osmolaridade das soluções.
A
0
500
1000
1500
2000
2500
EN RE/MP Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Ca2+-ATPaseCa2+-ATPase(glic)
3,8
2,6
2,3
2,1
B
50
Na Fig.21A vemos a atividade dos trocadores Ca2+/H+ encontrados em todas
as vesículas de membranas separadas em gradiente de densidade de sacarose. Em
concordância com os resultados obtidos com membranas totais, a glicose
extracelular estimulou a atividade desse transportador, em todas as vesículas de
membranas das organelas da via secretória (Fig.21A).
Para avaliar a estimulação da atividade do trocador de cada organela foi
feito o somatório das suas atividades encontradas em membranas enriquecidas por
membranas das respectivas organelas (Fig.21B). Desta maneira achamos que a
glicose extracelular estimulou a atividade dos trocadores Ca2+/H+ do RE/MP, Golgi,
vacúolo e das membranas mais densas que as membranas do RE em
aproximadamente 9; 19; 1,8 e 4,1 vezes, respectivamente diferente dos resultados
anteriores que não mostravam estimulação (Fig. 16).
A comparação dos resultados obtidos com o uso da primeira e segunda
versão do fracionamento celular indica que a perda principal das atividades de
ambos transportadores de Ca2+ ou/e a perda das propriedades das membranas
acontecem provavelmente durante o fracionamento das membranas em gradiente de
sacarose nas condições do primeiro protocolo.
Comprovando que mudanças nas condições do isolamento das membranas
podem melhorar ou piorar (a qualidade da) as atividades dos transportadores de
Ca2+ ou/e as propriedades das membranas. Sugerindo que essas mudanças podem
acontecer também durante o ensaio do transporte de Ca2+, então modificamos os
tampões utilizados na determinação mesmo (como descrito no item 3.7 – segunda
versão).
Com essa modificação no protocolo, pudemos observar um aumento na
captação de Ca2+ feita pelas Ca2+-ATPases e principalmente pelos trocadores
Ca2+/H+ em membranas totais (Fig. 22) em comparação aos protocolos anteriores
(Fig. 12 e Fig. 17). A estimulação pela glicose da atividade das Ca2+-ATPases e dos
trocadores Ca2+/H+ foi de 1,7 e 6,8 vezes, respectivamente (Fig. 22). Podemos
observar que apesar da modificação do protocolo de determinação de Ca2+, em MT
o efeito estimulatório da glicose se manteve semelhante em ambas as condições
experimentais (Fig. 12, Fig. 17 e Fig. 22).
51
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
EN RE/MP Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Trocador Ca2+/H+
Trocador Ca2+/H+(glic)
4,1
9 19
1,8
Fig. 21 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dostrocadores Ca2+/H+ em esferoplastos incubados ou não com 100mM de glicose extracelular. A: atividade dos trocadores Ca2+/H+ emmembranas submetidas ao fracionamento subcelular (diferença entreatividade total e atividade das Ca2+-ATPase) (pmol/15min). BSomatório da atividade dos trocadores Ca2+/H+ em diferentesorganelas da via secretória. Valores acima das colunascorrespondem a quanto de atividade das Ca2+-ATPases foiestimulada pela glicose extracelular em cada compartimento da viasecretória. Experimento representativo de 2 isolamentos. Atividadedas membranas que foram isoladas com o segundo protocolo quenormaliza a osmolaridade das soluções.
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
350,00
400,00
450,00
500,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
pmol
de
Ca2
+/m
g de
pro
teín
a
TrocadorTrocador (glic)
EN
vacúolo
Golgi
RE/MPA
B
52
Fig. 22 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dasCa2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ em membranas totais.Atividade das Ca2+-ATPases (na presença de 1 mM de ATP e 1 µMde FCCP) e dos trocadores Ca2+/H+ (diferença entre a atividade totale a atividade das Ca2+-ATPases em membranas totais (atividade em15 minutos, média de 2 experimentos). Atividade das membranas queforam isoladas com o segundo protocolo que normaliza aosmolaridade das soluções e também das soluções para a análise dotransporte de 45Ca2+.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Ca2+-ATPase Ca2+-ATPase(glic)
TrocadorCa2+/H+
TrocadorCa2+/H+ (glic)
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
1,7
6,8
53
Sabendo que a modificação de protocolo no ensaio de transporte de Ca2+ não
mudou os resultados com MT, avaliamos seu efeito no nível de membranas
fracionadas.
A Fig. 23A mostra a atividade das Ca2+-ATPases encontradas em todas as
frações de membranas separadas em gradiente de densidade de sacarose. Em
concordância com os resultados obtidos com membranas totais, a incubação com
glicose extracelular estimulou as Ca2+-ATPases em todas as frações de membranas
das organelas da via secretória.
A Fig. 23B mostra o somatório das atividades das Ca2+-ATPases de
vesículas de membranas derivadas de diferentes organelas da via secretória e
revela que a glicose extracelular estimulou a atividade das Ca2+-ATPases do RE/MP,
Golgi, vacúolo e das membranas mais densas que as membranas do RE em
aproximadamente 2,1; 2,7; 3 e 3,3 vezes, respectivamente.
Com esses resultados, percebemos que a captação de Ca2+ pelas Ca2+-
ATPases nas membranas onde foi mantida a osmolaridade tanto no fracionamento
subcelular quanto na determinação do transporte de Ca2+, foi maior (Fig. 23) e que a
atividade de Ca2+-ATPase em membranas vacuolares, EN e Golgi tiveram uma
maior estimulação (Fig. 23) do que a captação nas que foram isoladas seguindo o
protocolo nas quais as membranas sofriam menor variações de osmolaridade
também, mas que na captação de Ca2+ essa osmolaridade não foi mantida (Fig. 20).
Fig. 24A apresenta a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em membranas separadas
em gradiente de sacarose. Em concordância com os resultados obtidos com
membranas totais, observamos um aumento na estimulação da atividade desse
transportador, pela glicose extracelular. A Fig. 24B mostra o somatório das
atividades dos trocadores Ca2+/H+ de vesículas de membranas derivadas de
diferentes organelas da via secretória e exibe que a glicose extracelular estimulou a
atividade dos trocadores Ca2+/H+ do RE/MP, Golgi, vacúolo e das membranas mais
densas que as membranas do RE em aproximadamente 3,9; 5,4; 7,8 e 6,8 vezes,
respectivamente. Quando esses resultados foram comparados com os da Fig. 21, foi
observado que o segundo protocolo foi capaz de estabilizar melhor a atividade, não
somente das membranas de esferoplastos incubados com glicose, mas também os
que não foram incubados, possibilitando uma melhor analise da estimulação
encontrada nessas membranas (Fig. 20 e Fig. 17).
54
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Ca2+-ATPaseCa2+-ATPase (glic)
EN
Golgi
vacúolo
RE/MP
Fig. 23 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dasCa2+-ATPases, em esferoplastos incubados ou não com 100 mMde glicose extracelular. A: atividade das Ca2+-ATPases emmembranas submetidas ao fracionamento subcelular (feita napresença de 1 mM de ATP e 1 µM de FCCP) (pmol/15min). BSomatório da atividade das Ca2+-ATPases em diferentes organelas davia secretória. Valores acima das colunas correspondem a quanto deatividade das Ca2+-ATPases foi estimulada pela glicose extracelularem cada compartimento da via secretória. Experimentorepresentativo de 2 isolamentos. Atividade das membranas que foramisoladas com o segundo protocolo que normaliza a osmolaridade dassoluções e também das soluções para a análise do transporte de45Ca2+.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
EN RE/MP Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Ca2+-ATPaseCa2+-ATPase(glic)
3,32,7
2,1
3
A
B
56
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
EN RE/MP Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Trocador Ca2+/H+ Trocador Ca2+/H+ (glic)
6,8
7,8
5,4
3,9
Fig. 24 – Efeito da glicose extracelular sobre a atividade dostrocadores Ca2+/H+, em esferoplastos incubados ou não com 100 mmde glicose extracelular. A: atividade dos trocadores Ca2+/H+ emmembranas submetidas ao fracionamento subcelular (diferença entreatividade total e atividade das Ca2+-ATPase) (pmol/15min). B Somatórioda atividade dos trocadores Ca2+/H+ em diferentes organelas da viasecretória. Valores acima das colunas correspondem a quanto deatividade dos trocadores Ca2+/H+ foi estimulada pela glicose extracelularem cada compartimento da via secretória. Experimento representativo de2 isolamentos. Atividade das membranas que foram isoladas com osegundo protocolo que normaliza a osmolaridade das soluções e tambémas soluções para a análise do transporte de 45Ca2+.
B
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Trocador Ca2+/H+
Trocador Ca2+/H+ (glic)
EN
Golgi
vacúolo
RE/MP
A
56
Calculamos a porcentagem de contribuição de cada transportador de Ca2+ em
relação à contribuição total dos mesmos transportadores (somatório de cada
transportador em todas as organelas) e observamos que a contribuição desses
transportadores foi diferenciada dependendo da organela da via secretória analisada
(Fig. 25A), podemos ver que nas membranas mais densas que correspondem às
frações enriquecidas por membranas do EN e RE/MP a contribuição das Ca2+-
ATPases foi maior do que a contribuição dos trocadores Ca2+/H+, enquanto que nas
membranas enriquecidas por membranas do Golgi e do vacúolo observamos o
contrário (Fig. 25A). Quando calculamos a porcentagem de contribuição de cada
transportador dentro de cada uma das organelas da via secretória pela atividade
total do transporte de Ca2+ observamos que o trocador Ca2+/H+ foi quem mais
contribuiu para o transporte de Ca2+ no RE/MP, Golgi e vacúolo (Fig. 25B).
Podemos observar nas Fig. 26 A e B não somente a estimulação das Ca2+-
ATPases pela glicose extracelular, consolidar a contribuição das mesmas em cada
organela da via secretória (com visto na Fig. 25) como averiguar a eficiência dos
diferentes protocolos utilizados e visualizar que o protocolo modificado nesta tese foi
o melhor para observarmos os resultados. Nas Fig. 26 C e D podemos observar o
mesmo para a atividade dos trocadores Ca2+/H+.
Tendo em vista estes resultados observamos que quando as membranas
foram fracionados com o protocolo que mantinha a osmolaridade, e feita à
determinação do transporte de Ca2+ também obedecendo a essa osmolaridade a
atividade dos transportadores de Ca2+, principalmente dos trocadores Ca2+/H+,
permitiu uma melhor caracterização dos mesmos.
Resolvemos investigar as propriedades cinéticas desses dois
transportadores de Ca2+ utilizando também a incubação ou não com glicose
extracelular já que em nosso próprio trabalho foi observado que essa incubação
causa estimulação de ambos os tipos de transportadores. Encontramos então que
as Ca2+-ATPases sem glicose possuem um KM = 45,5 nM e uma Vmax = 0,29
nmol/min.mg de proteína (Fig. 27), após a incubação com glicose o KM = 51 nM e a
Vmax = 1.2 nmol/min.mg de proteína (Fig. 28). Enquanto os trocadores Ca2+/H+
possuem um KM = 100 nM e uma Vmax = 4,3 nmol/min.mg de proteína (Fig. 30) nas
membranas incubadas com glicose e quando não foram incubados com glicose um
KM = 61 nM e uma Vmax = 0,52 nmol/min.mg de proteína (Fig. 29). Mudando o
conceito que tínhamos de que os trocadores tinham baixa afinidade pelo Ca2+ e as
57
Ca2+-ATPases alta afinidade, demonstrando que ambos os tipos de transportadores
possuem alta afinidade pelo Ca2+, portanto sendo responsáveis pela detoxificação
do citosol quando há um aumento na concentração de Ca2+ livre no mesmo.
58
Fig. 25 – Contribuição das atividades das Ca2+-ATPases e dostrocadores Ca2+/H+, em esferoplastos incubados com 100 mM deglicose extracelular. A: Atividade total do transporte de Ca2+, dasCa2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ em membranas submetidasao fracionamento subcelular (acima das colunas está a porcentagemde contribuição de cada transportador no transporte total); B:Atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ emmembranas submetidas ao fracionamento subcelular (acima dascolunas está à porcentagem de contribuição de cada transportadornas diferentes organelas) (atividade em 15 minutos, média de 2experimentos).
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
EN RE Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Total Ca-ATPase Trocador Ca2+/H+
18,3
21,3
19,5
53,6
47,5
41,4
12,924,4
11,8
20,8
18,3
10,3
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
EN RE Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
Ca-ATPase Trocador Ca2+/H+
51,5
76,2
23,8
61,1
38,9
48,5
75,9
24,1
A
B
59
Fig. 26 – Contribuição das atividades das Ca2+-ATPases e dos trocadoresCa2+/H+, em esferoplastos incubados com 100 mM de glicose extracelulare comparação dos diferentes protocolos utilizados na tese. A: Atividadetotal do transporte de Ca2+, das Ca2+-ATPases sem glicose; B: Atividade totaldo transporte de Ca2+, das Ca2+-ATPases com glicose; C: Atividade total dotransporte de Ca2+, dos trocadores Ca2+/H+ sem glicose; D: Atividade total dotransporte de Ca2+, dos trocadores Ca2+/H+ com glicose.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
EN RE Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
1 experimento2 experimento3 experimento
0
500
1000
1500
2000
2500
EN RE Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
1 experimento2 experimento3 experimento
0
100
200
300
400
500
600
700
800
EN RE Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
1 experimento2 experimento3 experimento
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
EN RE Golgi Vac
pmol
de
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
1 experimento2 experimento3 experimento
A
C
B
D
60
0
5
10
15
20
25
-0,04 -0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
1/(nM Ca2+
)
1/(
nm
ol
Ca
2+/m
in.m
g)
Ca2+
- ATPases sem glicose
Km = 44,4 nM Ca2+
Vm = 0,25 nmol Ca2+
/min.mg de proteina
Fig. 26 – Determinação das propriedades cinéticas das Ca2+-ATPases em MT que não foram incubados com glicose. Atividadedas Ca2+-ATPases (na presença de 1 mM de ATP e 1 µM de FCCP),cinética de 2 min. Média de 5 experimentos.
Ca2+-ATPases sem glicose
Km= 45 ± 4,5 nM Ca2+
Vm = 0,3 ± 0,03 nmol Ca2+/min.mg de proteína
61
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
-0,06 -0,04 -0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
1/(nM Ca2+
)
1/(
nm
ol
Ca2
+/m
in.m
g)
Ca2+
- ATPase com glicose
Km = 29,9 nM Ca2+
Vm = 1,01 nmol Ca2+
/min.mg of proteina
Fig. 27 – Determinação das propriedades cinéticas das Ca2+-ATPases em MT que foram incubados com glicose. Atividade dasCa2+-ATPases (na presença de 1 mM de ATP e 1 µM de FCCP), ),cinética de 2 min. Média de 3 experimentos
Ca2+-ATPases com glicose
Km= 51 ± 22,2 nM Ca2+
Vm = 1,2 ± 0,12 nmol Ca2+/min.mg de proteína
62
0
2
4
6
8
10
12
14
-0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
1/(nM Ca2+
)
1/(
nm
ol
Ca2
+/m
in.m
g)
Trocador Ca2+
/H+ sem glicose
Km = 87,9 nM Ca2+
Vm =0,84 nmol Ca2+
/min.mg de proteina
Fig. 28 – Determinação das propriedades cinéticas dosTrocadores Ca2+/H+ em MT que não foram incubados comglicose. Atividade dos Trocadores Ca2+/H+ (diferença entre aatividade do transporte total e a atividade das Ca2+-ATPases. Médiade 2 experimentos.
Trocador Ca2+/H+ sem glicose
Km= 61 ± 27 nM Ca2+
Vm = 0,52 ± 0,32 nmol Ca2+/min.mg de proteína
63
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
-0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
1/(nM Ca2+
)
1/(
nm
ol
Ca2
+/m
in.m
g)
Trocador Ca2+
/H+ com glicose
Km = 112,5 nM Ca2+
Vm = 4,81 nmol Ca2+
/min.mg of proteina
Fig. 29 – Determinação das propriedades cinéticas dosTrocadores Ca2+/H+ em MT que foram incubados com glicose.Atividade dos Trocadores Ca2+/H+ (diferença entre a atividade dotransporte total e a atividade das Ca2+-ATPases. Média de 2experimentos.
Trocador Ca2+/H+ com glicose
Km= 100 ± 13 nM Ca2+
Vm = 4,3 ± 0,49 nmol Ca2+/min.mg de proteína
64
5. DISCUSSÃO
65
Neste trabalho, nós avaliamos o efeito da presença/ausência de glicose
extracelular, fonte de energia e carbono, sobre a atividade dos transportadores de
Ca2+, Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+ e das bombas de H+, P H+-ATPase e V
H+-ATPases.
O efeito da glicose tem sido caracterizado nas P H+-ATPase de MP e V H+-
ATPases de membranas intracelulares de levedura. Uma vez que, a adição de
glicose ao meio de crescimento acidifica o citoplasma da levedura (Nicolay et
al.,1983) é esperável que as bombas de H+ possam ser ativadas por razões da
homeostase de H+.
A glicose estimula a atividade de P H+-ATPase em 2 a 3 vezes (Serrano,
1983; Kotyk & Georghiou, 1994), porém, adição de frutose proporcionou uma
ativação da H+-ATPases de MP maior que a glicose (Kotyk & Georghiou, 1994)
sugerindo que a via de sinalização desta enzima é por frutose-6-fosfato.
A glicose também está envolvida na regulação da atividade da V H+-ATPase
através da dissociação dos complexos V1 e Vo na ausência de glicose e na
associação desses complexos quando a glicose é adicionada (Kane, 1995). Foi
encontrado ainda que a ativação da V-ATPase não ocorre apenas no vacúolo (2
vezes) mas também no RE e provavelmente EN. A estimulação não foi evidenciada
no Golgi indicando a regulação seletiva dessas bombas em diferentes organelas
(Samarão et al., 2002).
Nossos resultados estão em concordância com a literatura, pois a glicose
estimulou tanto a atividade das P H+-ATPases quanto das V H+-ATPases em
aproximadamente 5 vezes em MT (Figs. 7 e 14). Podemos ressaltar que a
velocidade inicial das V H+-ATPases foi de 25% mais alta do que a das P H+-
ATPases nas membranas totais, cujos esferoplastos não foram incubadas com
glicose extracelular, já nas membranas, que os esferoplastos foram incubados esse
aumento foi de 85 % (dados não mostrados). Indicando que “in vivo” V H+-ATPase
pode criar o gradiente de H+ mais rápido quando comparado com P H+-ATPase.
Porém, a P H+-ATPase é o principal contribuinte (73%) na formação de amplitude
máxima (“steady state”) do pH se levarmos em consideração que 50% de todas as
vesículas de MP.
Analisando o transporte de Ca2+ conseguimos evidenciar pela primeira vez
que a glicose extracelular foi capaz de estimular os transportadores de Ca2+. Foi
66
observado que 80% da captação de Ca2+ foi feita pelos trocadores Ca2+/H+ e estes
foram estimulados aproximadamente 6 vezes e as Ca2+-ATPases foram estimuladas
aproximadamente 2 vezes em membranas totais (Figs. 8, 13, 18). Esse fato é muito
importante, pois avalia pela primeira vez a contribuição dominante dos trocadores
Ca2+/H+ em condições similares a condição in vivo.
A fim de analisar a estimulação da atividade da Ca2+-ATPase em cada
compartimento da via secretória, realizamos o fracionamento das membranas totais
de esferoplastos que foram ou não incubados com glicose. A determinação da
atividade de enzimas marcadoras de RE e do Golgi mostrou que as membranas
estavam razoavelmente separadas (Fig. 9, 10). As membranas do vacúolo estavam
localizadas no topo do gradiente de densidade de sacarose pela atividade específica
do trocador Ca2+/H+ e pelo immunobloting para a subunidade catalítico A da V H+-
ATPase (Teodoro, 2004), como também o conteúdo de proteína das membranas
fracionadas também mostra uma separação razoável (Fig. 15).
Esses experimentos revelaram que a glicose estimulou a atividade de todas
as Ca2+-ATPases da via secretória, ou seja, em membranas enriquecidas por
membranas mais pesadas que o retículo endoplasmático (provavelmente envelope
nuclear/MP), retículo endoplasmático e membrana plasmática (RE/MP), Golgi e
vacúolo (Figs. 11, 16, 19).
Porém, na tentativa de evitar a perda da atividade do transporte de Ca2+,
tantos os protocolos de isolamento quanto de determinação do transporte de Ca2+
foram otimizados. Com isso podemos observar que quando houve otimização
desses protocolos principalmente as membranas enriquecidas por membranas mais
pesadas que retículo endoplasmático (provavelmente EN/MP), retículo
endoplasmático RE/MP, Golgi e vacúolo reduziram a perda de atividade de Ca2+-
ATPases, isto é, essas enzimas foram capazes de captar uma maior quantidade de45Ca2+ (Fig. 24).
Nossos resultados mostram que a glicose extracelular foi capaz de estimular
as Ca2+-ATPases de Golgi e Vacúolo em 2,7 e 3 vezes respectivamente. Cabe aqui
ressaltar que essas são as únicas Ca2+-ATPases as quais os gene foram
identificados. Porém, gostaríamos de chamar a atenção para a estimulação pela
glicose em outros compartimentos da via secretória, cujos genes ainda são
desconhecidos. Podemos observar que a glicose estimulou a atividade das Ca2+-
ATPases de RE/MP e EN em 2,1 e 3,3 vezes respectivamente, confirmando que
67
esses compartimentos possuem sua própria Ca2+-ATPase(s).
Nós sugerimos que os genes COD1 em S. cerevisiae (Cronin et al. 2002) e
CTA4 em S. pombe (Okorokova-Façanha et al., 2002) que estão localizados no RE
e estão envolvidos com a homeostase de Ca2+ são bons candidato a genes
codificadores de Ca2+-ATPases de RE.
Nosso trabalho mostra pela primeira vez o a glicose estimula de forma
seletiva as Ca2+-ATPases de diferentes organelas via secretória. E mais nossos
resultados trazem mais evidências, em condições mais próximas de in vivo (na
presença de glicose), de que cada compartimento da via secretória possui sua
própria Ca2+-ATPase como já foi sugerindo anteriormente (Okorokov, 1994;
Okorokov, 1996; Okorokov, 1997 e Okorokov & Lelhe, 1998).
O grupo de Bedwell et al., 1999 vem publicando sobre o efeito da galactose
em mutantes para fosfoglucomutase (pgm2∆) de S. cerevisiae, eles acreditam que o
acumulo de glicose-1-fosfato estaria acoplada ao aumento da captação de Ca2+ (Fu
et al., 2000). Aielo et al., (2002 e 2004) demonstraram que os níveis relativos de
glicose-1-fosfato e glicose-6-fosfato têm um papel importante na regulação da
distribuição de Ca2+ nos diferentes compartimentos intracelulares. Sugerem ainda
que a ausência da fosfoglucomutase (pgm2∆) causa um alto nível de dependência
de Pmc1p no acumulo de Ca2+ no vacúolo e simultaneamente na redução da
captação no RE/MP e Golgi. Mas nesses trabalhos não foram feitos fracionamento
de membranas, determinaram somente o Ca2+-trocável e não trocável em células de
levedura.
Neste trabalho também analisamos a atividade do trocador Ca2+/H+ e o efeito
da glicose sobre essa atividade. Verificamos que quando esse experimento foi feito
pela primeira vez (Fig. 12) percebemos que durante o fracionamento celular houve
uma grande perda de atividade do trocador Ca2+/H+ quando comparada à atividade
encontrada nas MT (Fig. 8).
Na tentativa de reduzir a perda da atividade do trocador Ca2+/H+ durante o
fracionamento de membranas, o protocolo foi modificado de forma que se
mantivesse a mesma osmolaridade em todas as camadas de densidade de
sacarose. Obtivemos o seguinte resultado, a glicose extracelular estimulou a
atividade do trocador Ca2+/H+ em 4,1; 9; 19 e 1,8 em membranas enriquecidas por
membranas do EN, RE/MP, Golgi e vacúolo respectivamente. Mas a atividade
68
encontrada, sem o efeito glicose, foi extremamente baixa (Fig. 17). A estimulação
encontrada no Golgi estava em discordância com Samarão (2003) que mostrou que
a V H+-ATPase encontrado no Golgi quase não foi estimulada pela glicose. Uma
vez que a V H+-ATPase é responsável em suportar o gradiente de H+ para o
trocador Ca2+/H+ (Okorokov, et al., 1988; Silva, 1998; Okorokov et al., 2001).
Para a obtenção de melhores resultados, o protocolo de determinação de
Ca2+ foi otimizado para que as vesículas de membranas não tivessem diferença na
osmolaridade. Nessas condições, a glicose extracelular estimulou a atividade do
trocador Ca2+/H+ em 6,8; 3,9; 5,4 e 7,8 nas membranas enriquecidas por membranas
do EN, RE/MP, Golgi e vacúolo respectivamente (Fig. 20). Podemos considerar que
esse protocolo, provavelmente, se aproximou mais das condições in vivo, uma vez
que os esferoplastos foram incubados com glicose.
Como já foi dito anteriormente a V H+-ATPase é a enzima responsável em
criar o gradiente de H+ que será utilizado pelo trocador Ca2+/H+ nas membranas
intracelulares.
Desse ponto de vista, nossos resultados sobre a estimulação pela glicose do
trocador Ca2+/H+ estão em concordância com os dados de estimulação pela glicose
da V H+-ATPase encontrada nas membranas do EN, RE/MP e vacúolo (Samarão,
2003). Porém, entram em discordância com relação à atividade encontrada nas
membranas do Golgi (Samarão, 2003). Com os dados existentes até o momento,
nossos resultados sugerem que a glicose estimula de forma direta o trocador
Ca2+/H+. Porém, não podemos descartar a possibilidade que a estimulação do
trocador Ca2+/H+ foi de forma indireta através do aumento da atividade da VH+-
ATPase ocasionada pela glicose. Para isso devemos analisar novamente o efeito da
glicose sobre a VH+-ATPase nas membranas enriquecidas por membranas do Golgi
em condições com maior osmolaridade a fim de verificar se essa enzima é mais
“sensível” que as outras e por isso perdeu atividade ou se realmente ela não sofre
estimulação pela glicose extracelular.
Vale a pena destacar que Marchi et al. (1999) encontraram atividade de
trocador Ca2+/H+ em mutante de vcx1∆ de S. cerevisiae, indicando a existência de
outro trocador Ca2+/H+ além de VCX1. Em S. pombe, esse fato também foi
evidenciado, ou seja, outros compartimentos além do vacúolo tiveram atividade do
trocador Ca2+/H+ e mais nessa levedura apenas a atividade do trocador Ca2+/H+ foi
encontrada bioquimicamente, seus autores sugerem que ou essa levedura pode
69
sobreviver apenas com o trocador Ca2+/H+ ou o método de análise utilizado não foi
sensível o suficiente para detectar a atividade Ca2+-ATPases (Okorokov et al., 2001).
Nossos resultados juntos com os dados da literatura sugerem que cada
compartimento da via secretória também é equipado com seu próprio trocador
Ca2+/H+. Experimentos futuros devem identificar os genes diferentes de VCX1 que
codificam esses trocadores Ca2+/H+.
Verificamos a existência de Ca2+-ATPases e de trocadores Ca2+/H+ em
diferentes organelas da via secretória. Nosso próximo passo foi avaliar a
contribuição desses transportadores para o efluxo de Ca2+ em cada compartimento.
A Ca2+-ATPase e o trocador Ca2+/H+ do RE e provavelmente da MP são os
principais contribuintes na captação de Ca2+ do citosol. Pois cada um destes
colabora mais do que os conhecidos e considerados principais transportadores do
efluxo de Ca2+ do citosol de levedura, as Ca2+-ATPases do Golgi e vacúolo (Pmr1p e
Pmc1p respectivamente) e do trocador Ca2+/H+ de vacúolo (Vcx1p) (Cunningham &
Fink, 1994b; Cunningham & Fink 1996; Marchi et al., 1999; Denis & Cyert, 2003).
Também podemos observar que a Ca2+-ATPase do RE/MP foi responsável por
quase a metade do transporte feito pelas Ca2+-ATPases (41%) comparadas as Ca2+-
ATPases do Golgi, vacúolo e EN juntas (59%). A contribuição do trocador Ca2+/H+ do
RE/PM é maior do que do Golgi ou do vacúolo. Até o momento em levedura apenas
um gene foi determinado para trocadores Ca2+/H+ (VCX1) não sendo descrito
nenhum gene para trocador Ca2+/H+ de outras organelas da via secretória.
(Okorokov, 1997; Okorokov et al., 2001; Marchi et al., 1999).
Nossos resultados sobre a significante contribuição do RE/MP para a captação
de Ca2+ total (efluxo para o citosol) chamam atenção por estar em discordância da
opinião atual que o RE tem um papel quase secundário na homeostase de Ca2+ em
levedura. Realmente, o resultado que mostra que o Ca2+ livre no lúmen do RE é
somente 10 µM (Strayle et al. 1999) não pode ser usado como um argumento da
participação insignificante desta organela em ambos os casos, no armazenamento
de Ca2+ e na sinalização pelo Ca2+. A concentração de Ca2+ livre no lúmen do
vacúolo de levedura é de 30 µM (Dunn et al., 1994). Além disso, o influxo de Ca2+
pode ser realizado por canais de Ca2+ nas respectivas organelas e não precisa de
uma concentração muito alta de Ca2+ livre 25 µM, na organela que armazena o Ca2+
(Nguyen et al., 1998).
70
Ainda há uma pergunta sem resposta se a MP e a membrana nuclear de
levedura possuem sua própria Ca2+-ATPase e trocador Ca2+/H+. A atividade do
trocador Ca2+/H+ foi demonstrada para MP de fungos (Stroobant & Scarborough,
1979; Gianini et al., 1988), mas não há nenhuma evidência direta, até agora, sobre
os transportadores de MP na levedura. Desse ponto de vista, a indução significativa
da atividade do transporte de Ca2+ como resultado da ativação do metabolismo pela
glicose e a contribuição no transporte total nas membranas mais pesadas estimula
estudos adicionais sobre os transportadores de Ca2+ dessas membranas. Os dados
disponíveis sobre possível contribuição de vesículas do RE e de MP para captação
de Ca2+ permitem sugerir que RE é o principal participante no transporte pelo menos
quando estimulado pela glicose. Pois quando a MP foi removida pela ligação da
concanavalina A foi verificado que a formação do acil-fosfato pode ser inibida por
ácido ciclopiazônico e pelo La3+ e que apenas concentrações altíssimas de TFP e
calmidazólio (inibidores de Ca2+-ATPase de MP) poderiam bloquear o transporte de
Ca2+ nessas vesículas, sugerindo que as Ca2+-ATPases de RE são os principais
contribuintes nessa população de membranas (Okorokov et al., 1997).
A significância fisiológica para a existência de diferentes compartimentos que
armazenam o Ca2+ é que provavelmente 2 transportadores assegurem 2 sinais
diferentes e específicos de Ca2+ dependendo do local. Sabe-se que o Ca2+ não pode
se difundir rapidamente pelo citosol (Sanders et al., 2002) e por esta razão sua
liberação de uma organela pode criar uma zona de alta concentração de Ca2+ perto
de uma determinada organela(s). Isto assegura que o sinal local só possa regular
enzimas e proteínas locais. Adicionalmente, existem várias amplitudes e formas de
sinais de Ca2+ locais que podem contribuir para a especificidade da sinalização e
pode ser modulado até mesmo se tiver uma localização separada entre Ca2+-
ATPase e trocador Ca2+/H+ que funcionam com velocidades diferentes em domínios
de membrana distintos. Esta condição pode assegurar e modular a duração e a
forma do sinal e provavelmente pode ser uma das razões fisiológicas para a
presença de dois tipos de transportadores de Ca2+ na mesma membrana. A segunda
razão poderia ser que as Ca2+-ATPases exibem uma afinidade muito alta por ATP.
Por exemplo, Ca2+-ATPase do Golgi de levedura tem KM=5 µM (Bush, 1995)
enquanto a V H+-ATPase tem o KM=200 µM o que significa que quando há pouca
energia dê preferência as Ca2+-ATPases e os trocadores são enzimas que estariam
“dormentes”.
71
Nossos dados também chamam atenção à idéia atualmente aceita que o
vacúolo é o principal compartimento armazenador de Ca2+ em levedura (Halachmi &
Eilam, 1989; Dunn et al., 1994; Denis & Cyert, 2003). Esta idéia está exclusivamente
baseada no fato que grande quantidade de Ca2+ intracelular foi liberado pelo
resultado do choque osmótico de células de levedura com MP permeabilizadas e
que era considerado de origem vacuolar (Halachmi & Eilam, 1989). Porém, lá não foi
levado em consideração o choque de outras organelas que também libertaram Ca2+
(Okorokov et al., 1993; nossos dados inéditos). Essa levedura continua sendo um
excelente modelo para as células animais e humanas e é necessária uma
investigação mais cuidadosa sobre o RE, MP e transportadores de Ca2+ nucleares.
O vacúolo é importante para a detoxificação do Ca2+ a longo tempo assim
como para outros íons como Mg2+, Mn2+, Cd2+ Zn2+. Porém, o vacúolo pode,
provavelmente, compartilhar essa função com outras organelas.
A estimulação da atividade dos trocadores Ca2+/H+ pela glicose extracelular
na concentração de 1 µM de Ca2+ livre (que foi usado em nossos experimentos)
como também a sua mais alta velocidade na captação de Ca2+ (Fig.13, 16, 23) nos
instigou a avaliar suas características cinéticas em MT. A principal razão foram às
determinações que já havia sido feitas do KM do trocador de levedura, fungos e
vacúolos de planta que tem seu valor entre 10-100 µM (Ohsumi & Anraku, 1983;
Okorokov et al., 1985a; Schumaker & Sze, 1986) que estava baseado no conteúdo
total do cátion e então era necessário superestimar seu real valor significativamente.
Realmente, a determinação das propriedades cinéticas dos trocadores de MT
estimulados pela glicose através de concentrações controladas de Ca2+ livre revelou
sua afinidade relativamente alta por Ca2+ com o KM= 100 nM e Vmax= 4,3 nmol/
min×mg-1 de proteína de MT. As Ca2+-ATPases mostraram a mesma ordem da
afinidade (o KM= 51 nM) mas o Vmax= 1,2 nmol/min×mg-1 de proteína de MT,
comparados com os trocadores que não foram estimulados pela glicose extracelular
têm KM= 61 nM e Vmax= 0,52 nmol/min×mg-1 de proteína de MT, enquanto Ca2+-
ATPases têm KM = 45,5 nM e Vmax = 0,29 nmol/min×mg-1 de proteína de MT.
Nesses experimentos os trocadores que não foram estimulados pela glicose tem
mais afinidade pelo Ca2+ do que os que foram estimulados pela glicose e também as
Ca2+-ATPases. Porém todas nossas experiências mostraram que os trocadores tem
o Vmax mais alto que mantém a afinidade semelhante as Ca2+-ATPases.
72
É evidente que nossos dados das propriedades cinéticas dos trocadores
Ca2+/H+ e da contribuição dos diferentes compartimentos e seus transportadores de
Ca2+ na atividade total do efluxo de Ca2+ do citosol foi obtido nas condições que mais
se assemelham ao crescimento ativo da levedura. Estes dados não só demonstram
a contribuição principal dos trocadores Ca2+/H+ na captação de Ca2+ na limpeza do
citosol da levedura durante a sinalização pelo Ca2+ e a competição efetiva deles com
Ca2+-ATPases em diferentes estados fisiológicos da célula de levedura. Eles
também revelaram pela primeira vez a alta afinidade dos trocadores Ca2+/H+ e ainda
Vmax é mais alta em comparação com Vmax das Ca2+-ATPases o que finamente
explicou por que estes transportadores são tão cruciais para a homeostase de Ca2+
na levedura.
73
6. CONCLUSÕES
74
Neste trabalho, avaliamos o efeito da glicose extracelular sobre a atividade das
Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ de levedura através da análise do
transporte de Ca2+ em vesículas de membranas totais e membranas fracionadas em
gradiente descontínuo de densidade de sacarose enriquecidas por membranas do
RE/MP, Golgi, vacúolo e provavelmente de EN. Concluímos que:
A glicose extracelular estimula a atividade dos transportadores de H+ (P e V H+-
ATPases) e de Ca2+ (Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+) significativamente, porém
durante o processo de fracionamento celular o efeito estimulatório da glicose sobre
essas atividades foi parcialmente perdido;
Modificações dos protocolos de isolamento, fracionamento e análise do
transporte de 45Ca2+ em condições de prevenção de choque osmótico puderam
prevenir a perda das atividades dos transportadores de Ca2+. Isso nos permitiu
concluir mais efetivamente que:
A glicose estimulou as atividades das Ca2+ATPases e Ca2+/H+ trocadores em 2 e
6 vezes, respectivamente, em membranas totais;
A glicose estimulou a atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ de
todas as organelas da via secretória, dando mais evidências que cada
compartimento da via secretória possui ambos os transportadores de Ca2+;
Tanto a estimulação das Ca2+-ATPases quanto dos trocadores Ca2+/H+ foi
diferenciada, evidenciando que a glicose está regulando de modo seletivo ambos os
transportadores de Ca2+.
A afinidade pelo Ca2+ de ambos transportadores, Ca2+-ATPases e trocadores
Ca2+/H+, é alta. Os trocadores Ca2+/H+ possuem uma velocidade máxima maior do
que o das Ca2+-ATPases o que explica sua mais efetiva participação para manter a
baixa concentração de Ca2+ livre no citosol em condições de estresse por altas
concentrações de Ca2+ extracelular descrita na literatura.
75
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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