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HOMEOSTASE DE Ca2+ NA LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae
EM DIFERENTES CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS: A DINÂMICA DAS
Ca2+-ATPases E DOS TROCADORES Ca2+/H+ DAS ORGANELAS DA VIA SECRETÓRIA E O PAPEL DA CALCINEURINA
FLAVIA EMENEGILDA DA SILVA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
Darcy Ribeiro - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ
MARÇO – 2009
i
HOMEOSTASE DE Ca2+ NA LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae
EM DIFERENTES CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS: A DINÂMICA DAS
Ca2+-ATPases E DOS TROCADORES Ca2+/H+ DAS ORGANELAS DA VIA SECRETÓRIA E O PAPEL DA CALCINEURINA
FLAVIA EMENEGILDA DA SILVA
Orientador: Prof. Dr. Lev Alexandrovitch Okorokov UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE Darcy Ribeiro
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ
MARÇO – 2009
“Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do titulo de Doutor em Biociências e Biotecnologia.”
ii
HOMEOSTASE DE Ca2+ NA LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae
EM DIFERENTES CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS: A DINÂMICA DAS
Ca2+-ATPases E DOS TROCADORES Ca2+/H+ DAS ORGANELAS DA VIA SECRETÓRIA E O PAPEL DA CALCINEURINA
FLAVIA EMENEGILDA DA SILVA
Aprovada em:
13 de março de 2009
Comissão examinadora:
___________________________________________________________________ Prof. Dr. Alessandro Coutinho Ramos - UVV ___________________________________________________________________ Profa. Dra. Anna Lvovna Okorokova Façanha - UENF ___________________________________________________________________ Profa. Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin - UFRJ ___________________________________________________________________ Prof. Dr. Lev Alexandrovitch Okorokov – UENF (Orientador)
“Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do titulo de Doutor em Biociências e Biotecnologia.”
iii
Aos meus pais, Glicério e Rosa;
Ao meu irmão, Binho
À lindinha da titia (Karol)
por todo amor e carinho.
iv
Um tempo para cada coisa
Para tudo há um tempo,
Para cada coisa há momento debaixo dos céus:
tempo para nascer e tempo para morrer;
tempo para plantar e tempo para arrancar;
tempo para matar e tempo para curar;
tempo para demolir e tempo para construir.
tempo para chorar e tempo para rir
tempo para gemer e tempo para dançar
tempo para espalhar pedras e tempo para ajuntá-las;
tempo de abraçar e tempo de afastar.
tempo de procurar e tempo de perder;
tempo de economizar e tempo de desperdiçar;
tempo de rasgar e tempo de remendar;
tempo para calar e tempo de falar;
tempo de amar e tempo de odiar;
tempo de guerra e tempo de paz.
(Eclesiasties 3: 1-8)
v
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar presente sempre na minha vida. E que me tem me dado força e
paciência na minha caminhada.
A minha Família pelo amor, carinho, compreensão pela minha ausência e por ser
minha referência, meu porto seguro.
Ao meu orientador, Prof. Lev A. Okorokov, um exemplo de Mestre, pesquisador e ser
humano a ser seguido. Obrigada por sua notável orientação, amizade e respeito que
foram construídos/conquistados aos longos dos anos.
À Profª Solange Samarão por ser a revisora deste trabalho e também pela amizade
construída ao longo do tempo.
À Profa. Anna L Okorokova-Façanha pelas críticas e sugestões dadas para o
melhoramento desta tese e por aceitar fazer parte da banca. Pela amizade, por se
mostrar sempre disposta a ajudar e ensinar.
Ao Prof. Alessandro Coutinho Ramos e a Profª Vânia Margaret Flosi Paschoalin por
terem aceitado o convite para participar da banca, pelas contribuições (discussões e
sugestões) pertinentes.
Aos Professores do LFBM (Valdirene, Júlio César e João Carlos) pelo convívio
agradável no laboratório.
À minha grande Família da Bioenergética (estudantes), Flavia Paiva, Renan, Sheila,
Lays, Géssika, Flavia Azevedo, Ana Cristina, Lívia, Ludmila e Keila, pela amizade,
carinho e companheirismo que nos fazem ser literalmente essa grande família.
Ao Luiz Carlos de Souza pelo convívio agradabilíssimo e pela imensa ajuda no
laboratório.
À Marta, ex-técnica do laboratório pela amizade e aprendizados práticos muito
valiosos.
Aos amigos do LFBM, Mariângela, Suzanna, Izabela, Érica, Gabriel pelo agradável
convívio.
Ao meu amigo André pela profunda amizade, companheirismo e agradabilíssimas
conversas.
Ao Prof. Eduardo Teodoro pela amizade.
À Camila C. Rebeiro, minha eterna pupila e grande amiga obrigada pelo
companheirismo, amizade, respeito.
vi
Às minhas primeiras e eternas amigas Mariana e Geísa (Gê) e suas famílias pela
grande amizade fortalecida desde a graduação.
À minha eterna irmã de república Geisa pela amizade conquistada ao longo do
tempo.
À Rô (Rosiane) pela amizade, paciência e compreensão no momento final de
preparação da tese.
Aos laboratórios do LBCT, LBT e LQFPP pelo uso dos equipamentos.
Aos Professores do CBB/UENF pelo ensinamento.
Aos demais professores e funcionários dessa universidade pela contribuição direta
ou indireta para a realização desta tese.
Aos órgãos financiadores deste trabalho CNPq, CAPES, FAPERJ e UENF.
vii
SUMÁRIO GERAL
Resumo............................................................................................... xvi
Abstract............................................................................................... xviii
Abreviaturas........................................................................................ xx
1 Revisão Bibliográfica.......................................................................... 1
1.1 Homeostase de íons........................................................................... 1
1.1.1 Homeostase de Mn2+.......................................................................... 2
1.1.2 Homeostase de Ca2+.......................................................................... 5
1.2 Transportadores de Ca2+................................................................... 10
1.2.1 Canais de Ca2+................................................................................... 10
1.2.2 Ca2+-ATPases de leveduras............................................................... 11
1.2.2.a Pmr1, Ca2+- e Mn2+-ATPase............................................................... 15
1.2.3 Trocadores de Ca2+/H+....................................................................... 16
1.3 Calcineurina........................................................................................ 19
1.4 Regulação dos transportadores de Ca2+............................................ 22
1.4.1 Efeito de altas concentrações de Ca2+ sobre a homeostase de Ca2+
e H+ em levedura................................................................................
22
1.4.2 Efeito da glicose sobre a homeostase de Ca2+ e H+ em levedura ..... 25
2 Objetivos............................................................................................. 28
3 Materiais e métodos............................................................................ 29
3.1 Cepas de leveduras............................................................................ 29
3.2 Meio de cultura e manutenção da cepa.............................................. 29
3.3 Preparo do pré-inóculo....................................................................... 29
3.4 Preparo da levedura para o isolamento.............................................. 29
3.5 Isolamento de membranas e fracionamento subcelular..................... 30
3.5.1 Isolamento de membranas para a condição I (com e sem glicose).... 30
3.5.1.a Obtenção de células........................................................................... 31
3.5.1.b Obtenção dos esferoplastos............................................................... 31
3.5.1.c Pré-incubação dos esferoplastos com glicose.................................... 32
3.5.1.d Obtenção de membranas totais.......................................................... 33
3.5.1.e Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente
de densidade de sacarose..................................................................
33
viii
3.5.2 Isolamento de membranas para a condição II (com YEPD; com
YEPD+CaCl2; com YEPD+CaCl2+CsA)..............................................
34
3.5.2.a Obtenção de células........................................................................... 35
3.5.2.b Obtenção dos esferoplastos............................................................... 35
3.5.2.c Obtenção de membranas totais.......................................................... 35
3.5.2.d Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente
de densidade de sacarose..................................................................
36
3.5.3 Isolamento de membranas para a condição III (crescimento das
células com: YEPD; YEPD+CaCl2).....................................................
36
3.5.3.a Obtenção de células........................................................................... 36
3.5.3.b Obtenção dos esferoplastos............................................................... 37
3.5.3.c Pré-incubação dos esferoplastos com glicose.................................... 37
3.5.3.d Obtenção de membranas totais.......................................................... 37
3.5.3.e Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente
de densidade de sacarose..................................................................
37
3.6 Determinação do transporte de 45Ca+2..................................................... 37
3.7 Determinação do conteúdo de proteína................................................... 38
3.8 Curva padrão de fosfato inorgânico (Pi) para as determinação
fosfohidrolítica de pirofosfato (PPi) e GDP......................................
39
3.9 Determinação hidrolítica do pirofosfato (PPi) (Pirofosfatase de
membrana (PPiase) – enzima marcadora de membranas do vacúolo).
40
3.10 Determinação de GDPase (enzima marcadora de membranas do
Golgi) .................................................................................................
41
3.11 Determinação de NADP-H citocromo “c” oxido-redutase (enzima
marcadora de RE).....................................................................................
41
3.12 Determinação da fosfatase alcalina (enzima marcadora do vacúolo)... 42
3.13 Imunoensaio (imunoresposta de Pmc1p::HA por “dot blotting”)............. 42
3.14 Determinação da concentração de sacarose.......................................... 44
4 Resultados.......................................................................................... 45
4.1 Identificação das membranas intracelulares da via secretória S.
cerevisiae............................................................................................
45
4.2 Efeito do estresse por altas concentrações de Ca2+ extracelular
sobre as atividades dos transportadores de Ca2+ S. cerevisiae.........
54
ix
4.2.1 Estresse de curto tempo pelo alto Ca2+ em células não energizadas
pela glicose extracelular.....................................................................
54
4.2.2 Estresse permanente pelo alto Ca2+ em células não energizadas
pela glicose extracelular.....................................................................
62
4.2.3 Estresse permanente pelo alto Ca2+ em células energizadas pela
glicose extracelular.............................................................................
73
4.3 O papel da calcineurina (CaN) na regulação dos transportadores de
Ca2+ em S. cerevisiae em condições fisiológicas...............................
84
4.4 Caracterização da inativação dos transportadores de Ca2+
vacuolares sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ em
outras organelas em S. cerevisiae isolados de esferoplastos
energizados pela glicose....................................................................
89
4.5 Transportadores de Ca2+ não possuem afinidade pelo Mn2+ em S.
cerevisiae............................................................................................
93
5 Discussão........................................................................................... 105
6 Conclusões......................................................................................... 115
7 Referências Bibliográficas.................................................................. 117
x
ÍNDICE DE ESQUEMAS
No Título Pág.
1 Um diagrama de uma típica célula comparando a via de transporte de
Mn2 + na levedura Saccharomyces cerevisiae.......................................
4
2 Homeostase do Ca2+ em células de levedura......................................... 7
3 Mecanismo de ação da calcineurina (CaN) na regulação da
transcrição de células de mamíferos e levedura.....................................
21
4 Modelo de regulação da calcineurina (CaN) sobre os transportadores
em levedura............................................................................................
22
5 Medições dos níveis de Ca2+ citosólico por aequorina........................... 24
6 Diagrama do isolamento de membrana na condição I............................ 30
7 Diagrama do isolamento de membrana na condição II........................... 34
8 Diagrama do isolamento de membrana na condição III.......................... 36
ÍNDICE DE TABELAS
No Título Pág.
1 Concentração de Ca2+ livre estimada no retículo endo- e
sarcoplasmático......................................................................................
8
2 Exemplo de como se controla cineticamente o rompimento da parede
celular de leveduras por hidrólise enzimática.........................................
32
3 Localização das frações de membranas de compartimentos da via
secretória de S. cerevisiae separados em gradiente de densidade de
sacarose..................................................................................................
53
4 Efeito da pré-incubação com 100 mM Ca2+ extracelular e da CsA na
atividade das Ca2+-ATPases em MT e nas organelas da via secretória
de S. cerevisiae AA255 cujos esferoplastos não foram energizados
com glicose.............................................................................................
60
5 Efeito da pré-incubação com 100 mM Ca2+ extracelular e da CsA na
atividade dos trocadores Ca2+/H+ em MT da cepa selvagem AA255 de
S. cerevisiae cujos esferoplastos não foram energizados com glicose..
61
xi
6A Efeito do estresse permanente por 150 mM Ca2+ sobre a atividade
das Ca2+-ATPases nas MT de S. cerevisiae AA255, cujos
esferoplastos não foram energizados com glicose extracelular.............
66
6B Efeito do estresse permanente por 150 mM Ca2+ sobre a atividade
das Ca2+-ATPases nas organelas da via secretória de S. cerevisiae
AA255, cujos esferoplastos não foram energizados com glicose
extracelular..............................................................................................
67
7 Efeito do estresse permanente por 150 mM Ca2+ sobre a atividade
dos trocadores Ca2+/H+ em MT e nas organelas da via secretória de
S. cerevisiae AA255, cujos esferoplastos não foram energizados com
glicose extracelular.................................................................................
68
8 Estimulação da atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+
no estresse por alto Ca2+ aplicado por curto tempo (incubação com
100 mM Ca2+ por 2,5 h) ou permanente (crescimento com 150 mM
Ca2+)........................................................................................................
72
9 Concentração total e livre dos íons Ca2+ e Mn2+ nos experimentos de
captação de 45Ca2+. ................................................................................
101
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
No Título Pág.
1 Efeito do Ca2+ extracelular sobre a atividade da Ca2+-ATPase em
membranas celulares da cepa X-2180 de S.
cerevisiae.......................................................................
48
2A Atividades da GDPase, PPiase de membrana, NADPH citocromo “c”
oxi-redutase de membranas isoladas de células que não foram pré-
incubados com Ca2+..............................................................................
49
2B Atividades da GDPase, PPiase de membrana, NADPH citocromo “c”
oxi-redutase vesículas de membranas isoladas de células que foram
pré-incubados com Ca2+.......................................................................
49
2C Atividades da GDPase, NADPH citocromo “c” oxi-redutase em
células do tipo selvagem (K601)...........................................................
50
2D Atividades da GDPase, NADPH citocromo “c” oxi-redutase em células mutantes de calcineurina (cnb1)............................................
50
3 Atividade das enzimas marcadoras do Vacúolo (fosfatase alcalina e
Vcx1p) e imunoreatividade da Pmc1p::HA (Ca2+-ATPase do vacúolo)
em membranas intracelulares de S. cerevisiae....................................
51
4 Atividade das Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+ e imunoresposta
da Pmc1p::HA (Ca2+-ATPase do vacúolo) em membranas
intracelulares de S. cerevisiae K699 de esferoplastos que foram
energizadas pela glicose......................................................................
52
5 Efeito do Ca2+ extracelular e da CsA sobre a captação de 45Ca2+ em
membranas totais (MT) da cepa AA255 de S. cerevisiae..........
57
6A Efeito do Ca2+ extracelular e da CsA sobre a atividade das Ca2+-
ATPases em vesículas de membranas totais da cepa AA255 de S.
cerevisiae de esferoplastos não energizados pela glicose...................
58
6B Efeito do Ca2+ extracelular e da CsA sobre a atividade dos
trocadores Ca2+/H+ em vesículas de membranas totais da cepa
AA255 de S. cerevisiae de esferoplastos não energizados pela
glicose. ………………………………………………………………………
58
7 Efeito do Ca2+ extracelular e da CsA sobre a atividade das Ca2+-
ATPases em membranas intracelulares da cepa AA255 S. cerevisiae
59
xiii
8 Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade dos
transportadores de Ca2+ em vesículas de membranas totais da cepa
AA255 de S. cerevisiae obtidas de esferoplastos que não foram
energizados com glicose......................................................................
65
9A
Efeito do crescimento celular na presença de 150 mM Ca2+
extracelular sobre a ativação dos trocadores Ca2+/H+ e o crescimento
celular da cepa AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos não foram
incubados com glicose..........................................................................
69
9B Efeito do crescimento celular na presença de 150 mM Ca2+
extracelular sobre a ativação das Ca2+-ATPases e o crescimento
celular da cepa AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos não foram
incubados com glicose……………………………………………………..
69
10 Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-
ATPases em frações de membranas intracelulares da cepa AA255
S. cerevisiae, cujos esferoplastos não foram incubados com glicose.
70
11 Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade dos
trocadores Ca2+/H+ em frações de membranas intracelulares da cepa
AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos não foram incubados com
glicose...................................................................................................
71
12A Efeito do crescimento com alto Ca2+ sobre a atividade dos
transportadores de Ca2+ em vesículas de membranas totais de S.
cerevisiae isoladas de esferoplasto que foram energizados com
glicose. Células de AA255 crescidas com 150 mM Ca2+ e as
membranas totais foram sedimentadas................................................
77
12B Efeito do crescimento com alto Ca2+ sobre a atividade dos
transportadores de Ca2+ em vesículas de membranas totais de S.
cerevisiae isoladas de esferoplasto que foram energizados com
glicose. Células de K699 crescida com 50 mM Ca2+ e a captação de 45Ca2+ foi feita em vesículas de membranas do homogenato total de
esferoplastos.........................................................................................
77
13 Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-
ATPases em organelas da via secretória de células da cepa AA255
de S. cerevisiae isolados de esferoplastos que foram energizadas
com 100 mM glicose extracelular.........................................................
78
xiv
14 Efeito da alta concentração de Ca2+ (50 mM) no crescimento celular
sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas organelas da via secretória
de células da cepa K699 S. cerevisiae isolados de esferoplastos que
foram energizados com 100 mM glicose extracelular...........................
79
15A Atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ e a
imunoresposta de Pmc1p::HA nas organelas da via secretória da
cepa K699 S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com
glicose. Células que cresceram em meio YEPD (controle)................
80
15B Atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ e a
imunoresposta de Pmc1p::HA nas organelas da via secretória da
cepa K699 S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com
glicose. Células que cresceram em meio YEPD suplementados com
50 mM Ca2+ (Ca)...................................................................................
80
16 Comparação entre a imunodetecção de Pmc1p::HA nas frações de
membranas intracelulares de células da cepa K699 que foram
cultivadas em meio YEPD suplementado ou não com 50 mM Ca2+,
cujos esferoplastos foram energizados com glicose............................
81
17 Efeito da alta concentração de Ca2+ (150 mM) no crescimento celular
sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas organelas da via
secretória da cepa AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram
energizados com glicose extracelular...................................................
82
18 Efeito da alta concentração de Ca2+ (50 mM) no crescimento celular
a atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas organelas da via secretória
da cepa K699 S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados
com glicose extracelular.......................................................................
83
19A Efeito da ausência da calcineurina sobre a captação de Ca2+ em S.
cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com glicose
extracelular. Cepa selvagem (K601) e cnb1(K603). MT foram
precipitadas através de ultracentrifugação...........................................
86
19B Efeito da ausência da calcineurina sobre a captação de Ca2+ em S.
cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com glicose
extracelular. Cepa selvagem (K601) e cnb1(K603). Homogenato
total obtido dos esferoplastos, ou seja, as MT não foram
precipitadas...........................................................................................
86
xv
20 Efeito da inativação da calcineurina sobre a atividade de Ca2+-
ATPases em frações de membranas de S. cerevisiae separadas em
gradiente de densidade de sacarose, cujos esferoplastos foram
energizados pela glicose extracelular...................................................
87
21 Efeito da inativação da calcineurina sobre a atividade dos trocadores
Ca2+/H+ em frações de membranas de S. cerevisiae separadas em
gradiente de densidade de sacarose, cujos esferoplastos foram
energizados pela glicose extracelular...................................................
88
22A Efeito da inativação da Ca2+-ATPase (Pmc1p) e trocador Ca2+/H+
(Vcx1p) vacuolar sobre a atividade das Ca2+-ATPases em
compartimento da via secretória de S. cerevisiae, cujos
esferoplastos foram energizados pela glicose extracelular..................
92
22B Efeito da inativação da Ca2+-ATPase (Pmc1p) e trocador Ca2+/H+
(Vcx1p) vacuolar sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em
compartimento da via secretória de S. cerevisiae, cujos
esferoplastos foram energizados pela glicose extracelular..................
92
23 Efeito do Mn2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas MT de
células de S. cerevisiae AA255, cujos esferoplastos não foram
energizados pela glicose......................................................................
98
24A Efeito do Mn2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas MT de
células de S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados com
glicose extracelular. As células da cepa selvagem AA255 cresceram
em meio YEPD suplementado ou não com 150 mM Ca2+....................
99
24B Efeito do Mn2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas MT de
células de S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados com
glicose extracelular. Na cepa selvagem (K699) e cepa mutante de
calcineurina (K603 – cnb1).................................................................
99
25A Efeito do Mn2+ sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas MT de
células de S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados com
glicose extracelular. As células da cepa selvagem AA255 cresceram
em meio YEPD suplementado ou não com 150 mM Ca2+....................
100
25B Efeito do Mn2+ sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas MT de
células de S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados com
glicose extracelular. Na cepa selvagem (K699) e cepa mutante de
xvi
calcineurina (K603 – cnb1)................................................................. 100
26A Efeito de 100 M Mn2+ total sobre a atividade das Ca2+-ATPases em
membranas intracelulares de células de S. cerevisiae AA255, cujos
esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. As células
cresceram em meio YEPD (controle)...................................................
102
26B Efeito de 100 M Mn2+ total sobre a atividade das Ca2+-ATPases em
membranas intracelulares de células de S. cerevisiae AA255, cujos
esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. As células
cresceram em meio YEPD suplementado com 150 mM de Ca2+.........
102
27A Efeito de 500 M Mn2+ total sobre a atividade das Ca2+-ATPases em
membranas intracelulares de células das cepas selvagem e mutante
de calcineurina de S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram
energizados com glicose extracelular. Na cepa selvagem de S.
cerevisiae (K601)..................................................................................
103
27B Efeito de 500 M Mn2+ total sobre a atividade das Ca2+-ATPases em
membranas intracelulares de células das cepas selvagem e mutante
de calcineurina de S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram
energizados com glicose extracelular. Na cepa mutante de
calcineurina de S. cerevisiae (K603 – cnb1)......................................
103
28A Efeito do Mn2+ na atividade do trocador Ca2+/H+ em membranas
intracelulares de células de cepa selvagem e mutante de
calcineurina de S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados
com glicose extracelular. Cepa selvagem de S. cerevisiae (K601)......
104
28B Efeito do Mn2+ na atividade do trocador Ca2+/H+ em membranas
intracelulares de células de cepa selvagem e mutante de
calcineurina de S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados
com glicose extracelular. Na cepa mutante de calcineurina de S.
cerevisiae (K603 – cnb1)....................................................................
104
xvii
RESUMO
A atividade dos transportadores de Ca2+ de células energizadas ou não com glicose
extracelular de diferentes cepas selvagens e cepas mutantes de Saccharomyces
cerevisiae foram analisadas, dependente de tempo de estresse pelo alto Ca2+ e sem
este estresse. Este trabalho mostra que: a atividade das Ca2+-ATPases e dos
trocadores Ca2+/H+ foi estimulada em células energizadas ou não pela glicose
extracelular. A estimulação da atividade dos transportadores de Ca2+ foi observada
após 2,5 h de incubação das células com alta concentração Ca2+ e quando o Ca2+
esteve presente durante o crescimento da levedura. As Ca2+-ATPase de vacúolos e
de Golgi foram as principais bombas (63% de atividade total das Ca2+-ATPase) em
células que não foram energizadas com glicose e submetidas ao estresse pelo Ca2+
(2,5h), enquanto que as Ca2+-ATPase de RE, MP e EN foram as bombas
dominantes durante o crescimento com alta concentração Ca2+ (63%). A
energização das células não mudou essa interessante dinâmica das respostas das
Ca2+-ATPases de diferentes organelas determinada pelo tempo de estresse.
Também foi encontrado que o grau de ativação dos trocadores Ca2+/H+ determina a
eficiência do crescimento da levedura sobre condições de estresse pelo Ca2+. Juntos
nossos resultados mostram que esses dois tipos de transportadores de Ca2+
respondem de maneira coordenada para reduzir a concentração de Ca2+ livre no
citosol. Isto indica o papel chave de organelas diferentes dos vacúolos na
homeostase de Ca2+. O crescimento com alta concentração de Ca2+ aumentou tanto
a atividade quanto o conteúdo de Ca2+-ATPase vacuolar (Pmc1p) em 1,8 e 8 vezes
respectivamente. Surpreendentemente, o conteúdo de Pmc1p aumentou em 17,5
vezes em outras organelas da via secretória, incluindo vesículas secretórias. Isto
mostra que a Pmc1p foi adicionalmente deslocada para outros compartimentos da
via secretoria e/ou membrana plasmática sobre o estresse pelo Ca2+. Em levedura,
tanto as Ca2+-ATPases, incluindo a enzima do Golgi (Pmr1p), quanto os trocadores
de Ca2+/H+ não transportam Mn2+ em condições fisiológicas. Essa alta afinidade dos
transportadores de Ca2+ pelo Ca2+ não é dependente da atividade de calcineurina. A
inativação de CaN (cnb1) inibiu similarmente a atividade das Ca2+-ATPases e dos
trocadores Ca2+/H+ em todas as organelas da via secretória quando a levedura não
foi submetida ao estresse pelo Ca2+. Isto aponta para uma regulação não seletiva
dos transportadores de Ca2+ pela CaN nessas condições. É importante notar que o
xviii
controle seletivo da CaN sobre os transportadores de Ca2+ nas organelas da via
secretória ocorreu sobre condições de estresse pelo Ca2+. A inativação do gene
PMC1 (pmc1 – Ca2+-ATPase vacuolar) diminuiu a atividade de Ca2+-ATPase de
vacúolos (71%) e em outras organelas (43%) mas a atividade de trocadores Ca2+/H+
reduziu apenas 9%. E, a inativação do gene VCX1 (vcx1::URA3 – trocador Ca2+/H+
vacuolar) inibiu a atividade dos trocadores no vacúolo e em outras organelas em
94% e 83% respectivamente, sem interferir significativamente com a atividade das
Ca2+-ATPases (26% de inibição). Sugerimos que os genes transportadores de Ca2+
vacuolares e\ou os próprios transportadores tem um papel chave na regulação de
transportadores de Ca2+ do mesmo tipo em outras organelas.
xix
ABSTRACT
The activity of Ca2+ transporters of different wild type strains and mutants of
Saccharomyces cerevisiae cells preincubated with or without extracellular glucose
and subjected or not to the Ca2+ stress was analyzed on the time dependent and
without this stress. It is shown that: The activity of both Ca2+-ATPases and Ca2+/H+
exchangers was increased in yeast cells energized or not by extracellular glucose.
The stimulation of the activity of Ca2+ transporters was observed both after 2.5 hours
incubation of cells with high Ca2+ concentration and when Ca2+ was present during
the yeast growth. The Ca2+-ATPases of vacuoles and Golgi were the main pumps
(63% of the total activity of Ca2+-ATPases) in cells which were not energized with
glucose and subjected to the short time Ca2+ stress, while the Ca2+-ATPases of ER,
PM and NE were dominated pumps during the yeast growth with Ca2+ stress (63%).
The energization of the cells didn’t change this interesting time dependent dynamic of
the responses of Ca2+-ATPase from different organelles. It was also found that the
activation degree of Ca2+/H+ exchangers determines the yeast growth efficiency
under Ca2+ stress conditions. Our results taken together show that both type of Ca2+
transporters of all organelles of secretory pathway increase their activities
coordinately to reduce the free Ca2+ concentration of the cytosol. They also show the
key role of organelles different from vacuoles for Ca2+ homeostasis. The yeast growth
with Ca2+ stress increased both the activity and content of vacuolar Ca2+-ATPase
(Pmc1p) at 1.8 and 8 times respectively. Surprisingly, the Pmc1p content increased
in 17.5 times in other organelles of the secretory pathway, including secretory
vesicles. This shows that Pmc1p delocalized additionally to other intracellular
compartments of secretory pathway and/or plasma membrane under Ca2+ stress. In
yeast, both the Ca2+-ATPases, including the enzyme of Golgi (Pmr1p), and Ca2+/H+
exchangers do not transport Mn2+ in physiological conditions. This high affinity of the
Ca2+ transporters for Ca2+ does not dependent from calcineurin activity. The
inactivation of CaN (cnb1) inhibited similarly the activity both of Ca2+-ATPases and
Ca2+/H+ exchangers in all organelles of the secretory pathway when yeast were not
subjected to the Ca2+ stress. It points to the unselective regulation of the Ca2+
transporters by calcineurin in those conditions. It is of note that the organelle
selective control of the calcineurin dependent regulation of Ca2+ transporters was
found under the stress conditions. The inactivation of the PMC1 gene (pmc1 -
xx
vacuolar Ca2+-ATPase) decreased the activity of Ca2+-ATPase both in vacuoles
(71%) and in other organelles (43%) but reduced the activity of Ca2+/H+ exchangers
only by 9%. In the contrast, the inactivation of the VCX1 gene (vcx1::URA3 - vacuolar
Ca2+/H+ exchanger) inhibited the activity of Ca2+/H+ exchangers in vacuole and other
organelles by 94% and 83% respectively. This inactivation decreased weakly the
Ca2+-ATPase activity (inhibition 26%). We suggest that the genes of the vacuolar
Ca2+ transporters and/or the transporters play a key role in the regulation o the same
type of Ca2+ transporters in other organelles.
xxi
ABREVIATURAS
[Ca2+
C] Concentração de Ca2+ livre no citosol [Ca2+
RE] Concentração de Ca2+ no retículo endoplasmático 45Ca2+ Isótopo de Ca2+ Ala Alanina Asn Asparagina ATP Adenosina trifosfato BAPTA N,N,N’,N’-ácido tetraacético 1, 2-bis(aminofenoxi)etano (“1, 2-
bis(aminophenoxy) ethane N,N,N’,N’- tetraacetic acid”) BSA Albumina de soro bovino cADPR Adenosina difosfato ribose cíclica CaM Calmodulina CaN Calcineurina CAX1 Gene que codifica o trocador Ca2+/H+ vacuolar de Arabidopsis CNA1 Gene que codifica subunidade A (catalítica) da calcineurina de S.
cerevisiae CNA2 Gene que codifica subunidade A (catalítica) da calcineurina de S.
cerevisiae CNB Gene que codifica subunidade B (regulatóra) da calcineurina de S.
cerevisiae CpH Ciclofilina CRZ1/TCN1 Gene que codifica o fator de transcrição de S. cerevisiae que é
defosforilada pela calcineurina CsA Ciclosporina A Cys Cisteína DTT Ditiotreitol (“Dithiothreitol”) EDTA Ácido etilenodiamino tetraacético (“ethylenediaminetetraacetic
acid”) EGTA Ácido etileno glicol-bis(b-éter aminoetil tetraacético (“ethtlene
glycol-bis(b-aminoethyl ether tetraacetic acid”) EN Envelope nuclear ENA1 Gene que codifica Na+-ATPase FCCP p-trifluor metoxifenil-hidrazone carbonil cianido (“Carbonyl cyanide
p-trifluoromethoxyphenylhydrazone”) FK506 Droga inibidora de calcineurina FKBP12 Proteína citoplasmática que liga calcineurina ou a droga FK506 FKS2 Gene que codifica 1, 3--Glucano sintase de levedura GDPase Guanosida difosfatase Gln Glutamina HUM1/ VCX1 Gene que codifica trocador Ca2+/H+ do vacúolo de S. cerevisiae IP3 1, 3 – inositol trifosfato Leu Leucina MES Ácido 2-N-morfolino etanosulfônico (“2-[N-morpholino]
ethanesulfonic acid”) MOPS Ácido 2-N-morfolino propanonosulfônico (“2-[N-morpholino]
propanesulfonic acid”) MP Membrana plasmática NFATc Fator de transcrição de linfócitos defosforilada pela calcineurina Pi Fosfato inorgânico
xxii
PMC1 Gene que codifica a Ca2+-ATPase de vacúolo de S. cerevisiae PMG Gene que codifica a fosfoglucomutase PMR1 Gene que codifica a Ca2+-ATPase de Golgi de S. cerevisiae PMSF Fluoreto de fenilmetil sulfonil (“phenylmethylsulfonyl fluoride”) POPOP Bezeno de 1,4-bis[5-fenil-2-oxazolil]; 2, 2’-fenileno bis[5-
feniloxazólico] (“1,4-bis[5-fenyl-2-oxazolyl] benzene; 2,2’-phenylene bis [5-phenyloxazole]”)
PPi Pirofosfato PPiase Pirofosfatase PPO 2, 5-difeniloxazólico (“2,5-diphenyloxazole”) RE Retículo endoplasmático RS Retículo sarcoplasmático SDS Dodecil sulfato de sódio (“Lauryl sufate sodium salt”) Ser Serina TFP Isotiouréia de S-etil N-[4-trifluormetil-fenil (“S-ethyl N-[4-
trifluoromethyl-phenyl] isothiourea”) Thr Treonina TN Tonoplasto Tris Tris- hidroximetil- aminometano (“tris- [hydroxymethyl]
aminomethane”) Vac Vacúolo VCX1/HUM1 Gene que codifica o trocador Ca2+/H+ do vacúolo de S. cerevisiae VMA Gene que codifica a subunidade da V H+-ATPase YEPD Extrato de levedura, peptona e dextrose (“Yeast extract peptone
dextrose”) pH Gradiente de H+ Comprimento de onda
1
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 - Homeostase de íons
Homeostase é a manutenção de um estado de equilíbrio dinâmico por
mecanismos regulatórios que compensa as mudanças externas (Nelson & Cox,
2000). A transição de metais é essencial para muitos processos metabólicos e sua
homeostase é de fundamental importância para a manutenção dos principais
mecanismos fisiológicos e, consequentemente, para a viabilidade celular (Nelson,
1999).
Íons metais são elementos vitais para a vida que participam em muitos
processos metabólicos. Por outro lado esses nutrientes essenciais são tóxicos em
níveis elevados. A estocagem ou excesso desses íons metais podem causar
desordem genética, assim como, a má-nutrição pode levar a morte ou doenças
graves (Nevo & Nelson, 2006). Por exemplo, excesso na captação de ferro está
relacionado com a doença hereditária hemocromatose, a anemia e a arteriosclerose.
O Mn2+ é uma neurotoxina potente e o uso industrial de Mn2+ tem acarretado casos
de “manganismos” que é caracterizado por distúrbios em processos mentais e
sintomas semelhantes ao da doença de Parkison (Pal et al, 1999). Os íons metais,
em gerais, estão sendo associados a doenças neuronais como, doença de
Parkinson e Alzheimer (Nevo & Nelson, 2006).
Os principais íons estudados são os cátions divalentes, como Cu2+, Mn2+, Fe2+
e Zn2+ devido a importância no papel do metabolismo celular. Esses diferentes íons
metais podem ser agrupados de acordo com sua atividade de óxido-redução (redox):
(1) redox ativa inclui os íons Fe2+, Cu2+, Co2+; (2) redox ativa em menor extensão
inclui o íon Mn2+; (3) redox não-ativa inclui os íons Ca2+ e Zn2+. Os íons de atividade
redox não-ativa são co-fatores de transcrição e de outras enzimas envolvidas no
metabolismo do DNA, já os íons de atividade redox ativa funcionam, geralmente, em
enzimas que participam de reações redoxes e na conversão de componentes ativos
que contem oxigênio (Nelson, 1999, Couville et al., 2006; Nevo & Nelso, 2006;
Pittman, 2006). Porém, pouco ainda se conhece sobre os transportadores e a
homeostase da maioria dos íons metais.
2
Nos últimos anos foi descrita uma família de transportadores de íons metais,
NRAMP (proteína natural de macrófago associado à resistência – “Natural
Resistence-Assciated Macrophage Protein”) aparentemente bem conservada de
bactérias a humanos. A família NRAMP funciona como transportadora de íons em
geral, podendo transportar Mn2+, Zn2+, Cu2+, Cd2+, Ni2+ e Co2+ (Nelson, 1999,
Couville et al., 2006; Nevo & Nelso, 2006; Pittman, 2006).
O vacúolo de leveduras serve como principal organela capaz de estocar íons
e possui um papel importante na homeostase de Ca2+ e de outros cátions como o
Mn2+, Zn2+, Mg2+ e Cd2+ (Okorokov et al, 1985a, Okorokov et al, 1985b, Okorokov,
1985, White & Gadd, 1986; Marty, 1999).
1.1.1 - Homeostase de íons Mn2+
O Mn2+ é um importante metal necessário para muitas atividades enzimáticas
como as carboxilases e fosfatases no citosol (Kinnett & Wilcox, 1982; Jabalquinto et
al, 1999), funciona como co-fator de algumas enzimas de glicosilação no Golgi (Durr
et al, 1998; Wiggins & Munro, 1998), no processamento de proteínas e requerido
para a degradação das proteínas no retículo endoplasmático (RE) (Durr et al, 1998).
Funciona como co-fator da enzima superoxido dismutase (SOD2), que é uma
enzima de defesa para a atividade antioxidante, catalisando ânions superoxido para
oxigênio e peróxido de hidrogênio, localizada na mitocôndria. Embora,
individualmente, nenhuma delas seja essencial para o crescimento, é possível que
coletivamente sejam vitais, e inibição de suas atividades através da retirada do Mn2+
resulte no atraso do crescimento (Pittman, 2006).
Em levedura, foram identificados dois transportadores para Mn2+, Smf1p e
Smf2p, esses transportadores medeiam o transporte de Mn2+ acoplado ao transporte
de H+ (Hiromi et al, 1997). A seqüência de aminoácidos dos transportadores Smf1p e
Smf2p mostrou-se 28% idêntica e 46% similar com a seqüência de aminoácidos dos
membros da família de transportadores de metais divalentes (Nramp) em mamíferos
(Portnoy et al, 2000), essa família de transportadores apresenta-se conservada de
bactéria a humanos (Cellier et al, 1995).
O transportador Smf1p possui uma alta afinidade para captação de Mn2+ e
fica localizado na membrana plasmática quando a quantidade de Mn2+ é limitada.
Cepas de leveduras deficientes (mutantes) de smf1 não mostraram nenhuma
3
deficiência na captação de Mn2+ e a atividade de enzimas que requerem Mn2+ teve
redução insignificante, isto sugere que, provavelmente, existe outro transportador de
Mn2+ na superfície celular (Esquema 1) (LuK & Culotta, 2001).
Outro tipo de transportador localizado na membrana plasmática (MP) é o
produto do gene PHO84, que codifica um transportador de fosfato inorgânico de alta
afinidade, possui um papel na homeostase de Mn2+ principalmente quando este íon
está em excesso, funcionando como co-transportador de Mn2+ e Pi de baixa
afinidade para Mn2+ (Esquema 1) (Laran et al, 2003).
O Smf2p está localizado em vesículas intracelulares funcionando como
distribuidor intracelular de Mn2+ tanto para o Golgi como para a mitocôndria (Luk &
Culotta, 2001) enquanto que a captação do Mn2+ pelo vacúolo de leveduras está
acoplada a Ccc1p, um transportador vacuolar de Mn2+ e Fe2+ (Lapinskas et al.,1996;
Li et al., 2001). O transporte do Mn2+ na via secretória também pode ser realizado
pela Pmr1p, inicialmente caracterizada como ATPase responsável em transporte de
Ca2+ (Ca2+ e Mn2+-ATPase) localizada no Golgi (Esquema 1) (Sorin et al., 1997).
A maioria das Ca2+-ATPases pode transportar apenas Ca2+, porém a Ca2+-
ATPase de Golgi (Pmr1p) também pode transportar Mn2+ (Wei et al., 2000). Foram
identificadas mutações em PMR1, que alteram a seletividade para Ca2+ e Mn2+.
Esses autores descreveram os efeitos das mutações na Gln 783, posicionada na
interface citoplasmática da hélice transmembrana M6. Foi verificado que esta Gln
pode ser substituída por resíduos volumosos (Leu, Glu e Thr) no transporte de Ca2+
e Mn2+. Inversamente, a introdução de pequenas cadeias polares (Ser, Asn, Csy)
neste sítio provoca a perda completa do transporte, enquanto que a substituição por
Ala foi a única capaz de conferir uma perda forte e seletiva do transporte de Mn2+
(Wei et al., 2000).
Existe, portanto dois transportadores de Mn2+ localizados em membranas
intracelulares o Smf2p e o Pmr1p. O transportador Smf2p está localizado em
vesículas intracelulares funcionando como distribuidor intracelular de Mn2+ tanto para
o Golgi como para a mitocôndria (LuK & Culotta, 2001). O transportador Pmr1p
(ATPases do tipo P) localizado no Golgi (Rudolph et al, 1989).
CAX1 é determinado como trocador Ca2+/H+ enquanto que sugere que CAX2
transporta outros íons para dentro do vacúolo em plantas. Pois o transporte de Cd2+
e Mn2+ aumentaram em plantas de tabaco quando CAX2 foi superexpresso, além
4
disso, a afinidade do CAX2 pelo Ca2+ (Km > 100 M) é menor que CAX1
(Arabdopsis thaliana) (Hirschi et al., 2000).
Evidências genéticas sugerem que o Vcx1p (trocador Ca2+/H+ do vacúolo) é
negativamente regulada por calcineurina e que esse transportador tem alta afinidade
para transportar Ca2+ e também pode funcionar como transportador de Cd2+, mas
não pode transportar Mn2+ (Cunningham & Fink, 1996). Porém, a construção de um
mutante resultante da troca de um único aminoácido L208P no gene MNR1 conferiu
a essa cepa (Vcx1-M1) uma forte tolerância ao Mn2+ (Del Pozo et al., 1999). Pittman
e colaboradores (2004), utilizando essa cepa (Vcx1-M1, trocador Mn2+/H+),
demonstraram que essa tolerância era independente do Pmr1p e resultava da
atividade do trocador específico para Mn2+ e que é dependente de calcineurina.
Essa intrigante maleabilidade das Ca2+-ATPases em transportar outro íon
diferente de Ca2+ tornou-se um dos nossos objetivos de estudos no presente
trabalho.
Esquema 1: Um diagrama de uma típica célula comparando a via de transporte de Mn2 + na levedura Saccharomyces cerevisiae. Atualmente identificado como transportadores de Mn2+ em leveduras são: SMF1, transportador de Mn2+ Nramp na MP; PHO84, um transportador de fosfato na MPque pode transportar Mn2+ em condições de estresse por alta concentração de Mn2+; PMR1, uma Ca2+ e Mn2+-ATPase de Golgi; SMF2, transportador de Mn2+ Nramp de vesículas intracelulares; CCC1, um transportador vacuolar de Mn2+ e Fe2+; e MTM1, proteína membro família carreadora mitocondrial na membrana interna mitocôndrial, que leva Mn2+ para a superoxido dismutase mitocondrial SOD2 (Fonte: Pittman, 2006).
5
1.1.2 - Homeostase de Ca2+
Todas as células desenvolveram mecanismos específicos e altamente
sensíveis a transdução de sinais para responderem a um conjunto de “sinais” do
ambiente, ou seja, todos os organismos, unicelulares ou multicelulares, possuem a
habilidade de receberem e responderem a sinais extracelulares. As células utilizam
esse apurado sistema de sinalização celular para comunicarem-se umas com as
outras e desencadear processos tais como: reprodução, obtenção de alimento,
determinar funções especializadas e responder a fatores ambientais adversos (pH,
pressão osmótica, alimentos, luz) (Nelson & Cox, 2000, Sanders et al., 2002).
A rede de sinalização que gera respostas celulares apropriadas é variada e
normalmente inclui uma seqüência de receptores, mensageiros não-protéicos,
enzimas e fatores de transcrição. Os mensageiros não-protéicos são relativamente
poucos, mas inclui os nucleotídeos cíclicos, H+, espécies reativas de oxigênio (ROS),
lipídios e principalmente Ca2+ (Sanders et al., 2002).
Em plantas, mudanças na concentração de Ca2+ livre no citosol [Ca2+C]
aparecem durante a transdução de uma alta variedade de sinais abiótico e biótico
(Sanders et al., 2002). Estímulos abióticos incluem luz vermelha, azul ou ultravioleta
(UV) onde cada qual age em receptores diferentes levando a uma distinta resposta
de desenvolvimento como a temperatura baixa e alta, estímulo mecânico (como
toque), estresse hiperosmótico e estresse oxidativo. Estímulos bióticos incluem os
hormônios (ácido abscíssico (ABA) e gibberilina), eliciadores fúngicos e fatores de
nodulação (Nod) (revisado por Sanders et al., 2002).
A concentração de Ca2+ livre no citosol [Ca2+C] em células eucarióticas é
muito baixa, variando de 100 a 200 nM em células animais (Carafoli, 1987), de
aproximadamente 200 nM em células vegetais (revisado por Sanders, 1999), de 100
a 300 nM em fungos (Miller et al., 1990; Halachmi & Eilam, 1989) e de 100 a 200 nM
leveduras (Halachmi & Eilam, 1993; Halachmi & Eilam, 1989). O transporte e o
estoque de Ca2+ são essenciais para a célula manter e regular a baixa concentração
deste íon, fisiologicamente importante, no citosol (Klionsky et al., 1990; Cunningham
& Fink, 1994).
O controle da concentração de Ca2+ livre no citosol é essencial para as
células. A mudança da concentração de Ca2+ afeta diversos processos celulares,
incluindo: transdução de sinais, controle da secreção de proteínas ou controle do
6
ciclo celular (Campbell, 1983; Johannes et al., 1991; Bush, 1995). O Ca2+ ativa
várias proteínas e enzimas reguladoras, tais como: calmodulina, proteínas quinases
e proteínas fosfatases (Gadd, 1994).
O Ca2+ possui uma versatilidade nas vias de transdução de sinal, pois este
participa de diversas vias de transdução de sinais e ainda conduz estímulo
específico dentro dessas vias. Isso é possível devido a conjunto de características
do Ca2+ e/ou da via de sinalização utilizada, como: (1) a especificidade pode ser
codificada por propriedade espacial do sinal de Ca2+, ou porque o sinal é local (por
exemplo: é para núcleo, ao invés de ser para o citosol) ou por causa da fonte do
sinal de Ca2+ (do meio extracelular ou dos estoques intracelulares); (2) a dinâmica
das propriedades do sinal de Ca2+ pode determinar a eficácia com que a resposta é
provocada; (3) no caminho, elementos de resposta apropriados podem estar
presentes em um tipo específico de célula no qual o sinal de Ca2+ aparece; (4) o
Ca2+ pode ser um alvo necessário, mas insuficiente para a resposta, necessitando
de outro sinal paralelo ocorra para que a transdução do sinal seja efetiva (Sanders et
al., 2002).
Em leveduras, a regulação de Ca2+ é mantida através dos transportadores de
Ca2+ que estão inseridos nas membranas de compartimentos intracelulares e da
membrana plasmática. Existem três tipos de transportadores de Ca2+: (1) os canais
de Ca2+, também conhecido como transportador passivo, que realiza o transporte a
favor de um gradiente de concentração, ou seja, o Ca2+ é transportado do ambiente
onde ele está mais concentrado para o ambiente onde é menos concentrado; (2)
Ca2+-ATPases, também conhecidos como bombas de Ca2+ ou transportadores ativos
de Ca2+, realiza o transporte de Ca2+ contra a um gradiente de concentração, ou
seja, o Ca2+ é transportado do ambiente onde ele está menos concentrado para o
ambiente onde está mais concentrado para realizar esse tipo de transporte é
utilizado diretamente a energia da hidrólise do ATP; (3) trocadores de Ca2+/H+,
também conhecidos como transportadores ativos secundários de Ca2+, também
realiza o transporte de Ca2+ contra a um gradiente de concentração, porém para
realizar esse tipo de transporte utiliza a energia armazenada sobre um gradiente de
concentração de H+ feito anteriormente por bomba de H+, que utilizou a energia do
ATP para criar o gradiente de concentração de H+ (Esquema 2).
7
Portanto, a regulação da concentração de Ca2+C livre é realizada pela
coordenação da atividade de vários transportadores de Ca2+, que são: Ca2+-
ATPases, H+-ATPases (bombas), trocadores de Ca2+/H+ (transportadores
secundários) e canais de Ca2+ (Bush, 1995) (Esquema 2).
A transdução de sinal inicia com a abertura de canais permeáveis a Ca2+, de
compartimentos intracelulares (ex.: RE) e/ou membrana plasmática, aumentando
consequentemente a concentração de Ca2+ livre no citosol [Ca2+C]. Devido à alta
[Ca2+C] ser tóxica a célula, é necessário que a [Ca2+
C] retorne a concentração normal
citosólica, os transportadores responsáveis em realizar o tamponamento (“limpeza”)
do excesso da [Ca2+C] são as Ca2+-ATPases e os trocadores Ca2+/H+.
A concentração total de Ca2+ no lúmen do retículo endoplasmático (RE) é
estimado em 1 a 3 mM. Uma porção do Ca2+ é livre, mas a concentração de Ca2+
livre no RE é extremamente difícil de medir e ainda é ponto de grande controvérsia,
Esquema 2: Homeostase do Ca2+ em células de levedura. Transportadores do influxo de Ca2+ (entrada de Ca2+ no citosol): Canal de Ca2+ de MP (Cch1p/Mid1p e LACS) e de vacúolo (Yvc1p); Transportadores de efluxo de Ca2+ (saída do Ca2+ do citosol): Ca2+-ATPase de membranas do RE
(Spf1p), Golgi (Pmr1p) e vacúolo (Pmc1p); trocador Ca2+/H+ de vacúolo (Vcx1p) e atividade do
trocador Ca2+/H+ em todas as organelas e as H+-ATPases (V H+-ATPase) responsável em gerar o
gradiente de H+ para o trocador Ca2+/H+. Esquema criado de acordo com os nossos dados,
CsA, FK506
ATP ADP + Pi
Ca+2
RE
Spf1p
Golgi
Ca+2
ATP ADP + Pi
Calcineurina
Calmodulina
Crz1p
PMC1 PMA1
Núcleo
Pmr1p
MP
Ca+2H+
ATP
ADP + Pi
Pmc1p
ATP ADP + Pi
H+
V ATPase
Vacúolo
Vcx1p
SPF1VPH1STV1PMR1
H+
Pma1p
FT ?
H+
ATP ADP + PiCa+2
Ca+2
Ca2+-ATPase?
Ca+2
Cch1/Mid1p
Ca+2
Yvc1p
Ca+2ATP
ADP + Pi
Ca2+-ATPase?
H+
Ca+2
Ca2+/H+
trocador ?
H+
Ca+2
H+
Ca+2
Ca2+/H+
trocador ?
Ca2+/H+
trocador ?
Meio extracelular
Meio intracelular
LACS
[Ca+2] ~ 1 M (YEPD)
[Ca+2] = ~100 nM
CsA, FK506
ATP ADP + Pi
Ca+2
RE
Spf1p
Golgi
Ca+2
ATP ADP + PiATP ADP + Pi
Calcineurina
Calmodulina
Crz1p
PMC1 PMA1
Núcleo
Pmr1p
MP
Ca+2H+
ATP
ADP + Pi
Pmc1p
ATP ADP + Pi
H+
V ATPase
Vacúolo
Vcx1p
SPF1VPH1STV1PMR1
H+
Pma1p
FT ?
H+
ATP ADP + PiATP ADP + PiCa+2
Ca+2
Ca2+-ATPase?
Ca+2
Cch1/Mid1p
Ca+2
Yvc1p
Ca+2ATP
ADP + Pi
Ca2+-ATPase?
H+
Ca+2
Ca2+/H+
trocador ?
H+
Ca+2
H+
Ca+2
Ca2+/H+
trocador ?
Ca2+/H+
trocador ?
Meio extracelular
Meio intracelular
LACSLACS
[Ca+2] ~ 1 M (YEPD)
[Ca+2] = ~100 nM
8
pois dependendo do método aplicado estes valores podem ter grandes variações, de
1M a 3 mM (Tabela 1) (Meldolisi & Pozzan, 1998).
Tabela 1: Concentração de Ca2+ livre estimada no retículo endo e sarcoplasmático.
Fonte: Meldolesi & Pozzan, 1998.
[Ca2+] (M) Organela e métodos
1-5 RE – aequorina (“aequorin”)
5 RE – compartimentalizado com fura-2
12 RE – titulação de ponto nulo
60 – 230 RE – compartimentalizado com mag-indo-1
100 RE – compartimentalizado com mag-fura-2
150 RE – compartimentalizado com mag-fura-2
200 RE – compartimentalizado com mag-fura-2
200 – 600 RE – compartimentalizado com mag-fura-2
250 RE – compartimentalizado com cálcio verde (“calcium green”)
400 RE – com camaleão (“cameleon”)
630 RE – mag-fura-2
600 – 700 RE – com aequorina (“aequorin”) com coelentarazina sintética
700 RE – compartimentalizada com cálcio verde
1 – 3 x 103 RE – aequorina (“aequorin”) mutada (Sr2+)
1 – 2 x 103 RS – aequorina (“aequorin”) mutada (Sr2+)
1 – 5 x 103 RS – compartimentalizada com 19F-BAPTA
A rápida liberação dos estoques de Ca2+ requer um grande gradiente de
concentração deste íon. Tem sido considerada a existência de uma matrix
polianiônica capaz de tamponar o Ca2+ nas organelas que são capazes de
sequestrá-lo. Por exemplo, o RE de células ciliadas pode gerar flutuações periódicas
na concentração de Ca2+ em seu lúmem, o que resulta em liberações oscilatória
para o citosol e oscilação local da [Ca2+] no citosol que precede o aumento dos
batimentos ciliares induzido pelo ATP. Nguyen e colaboradores (1998) descreveram
que quando o inositol trifosfato (IP3) está ligado ao seu receptor nos canais de Ca2+
do RE, estes liberam Ca2+ para o citosol. O aumento do Ca2+ no citosol ativa o canal
de K+ estimulado por Ca2+ e sensível a apamina (ASKCa) ocasionando o influxo do
9
K+ para o RE. Isto vai ocasionar o aumento da concentração de Ca2+ livre no RE, por
meio de troca Ca2+ por K+ da matriz do lúmem do RE e a ampliação marcante do
gradiente difusional de Ca2+ do lúmem do RE/citosol para liberação local no citosol.
O K+ liga-se a matriz polianiônica do lúmem de organelas, isto é importante
para acumular outros cátions dentro das organelas, sendo o mecanismo de troca do
K+ para Cat2+ (cations divalentes) muito conhecido. Foi mostrado, anteriormente, que
o acúmulo de Mg2+ ou Mn2+ nos vacúolos de levedura estava acoplado a saída de K+
ligado à matriz desta organela. E mais, o acúmulo de Mn2+ ou Mg2+ é diretamente
dependente do conteúdo de polifosfatos e K+ ligado a matriz do lúmen dos vacúolos
(Lichko et al., 1982).
O Ca2+ não é apenas um íon sinalizador do citosol, mas também tem se
mostrado de importância central na função das proteínas residentes no RE (Cobertt
& Michalak, 2000) e Golgi (Rudolph et al., 1989; Antibi & Fink, 1992). Assim o Ca2+
também é o íon sinalizador do RE e Golgi e provavelmente de todas as organelas
armazenadoras de Ca2+.
Recentes evidências indicam que a concentração de Ca2+ livre no RE [Ca2+RE]
muda devido à alta capacidade da calreticulina ligar-se ao Ca2+. Oscilações nos
níveis de Ca2+RE de células animais tem controlado diversos processos, incluindo a
síntese protéica, função das chaperonases no processamento de glicoproteínas
(Cobertt & Michalak, 2000). Cepas de levedura deficientes do gene PMR1, que
codifica Ca2+-ATPase de Golgi (Sorin et al., 1997; Okorokov et al., 1993),
manifestam defeitos no processamento do fator pró- e a glicosilação incompleta da
cadeia externa da invertase (Rudolph et al., 1989). Porém, a adição de Ca2+
extracelular a níveis micromolares foi capaz de reverter os defeitos provocados pela
cepa mutante deficiente de Pmr1p, mostrando a importância do Ca2+ no processo de
glicosilação de proteínas (Antibi & Fink, 1992).
S. cerevisiae pode crescer em baixíssima concentração de Ca2+ (<10-9 M)
desde que haja uma disponibilidade de Mn2+ livre. O contrário também é verdadeiro,
ou seja, o crescimento em baixa concentração de Mn2+ (< 10-12 M) só é possível se
for sustentado por uma fonte disponível de Ca2+ livre (Loukin & Kung, 1995). A
aparente habilidade de intercâmbio entre o Ca2+ e o Mn2+ é devido a ambos os íons
possuírem um acesso previsível às organelas da via secretória, já que processos
vitais dependem de um dos dois cátions. Foi visto que a ausência do Mn2+ in vivo ou
o uso de tapsigargina, um potente inibidor de Ca2+-ATPases do tipo SERCA,Ca2+-
10
ATPAse de retículo sarcoplasmático, inibe a glicosilação protéica em células animais
(Kaufmam et al, 1994).
1.2 – Transportadores de Ca2+
1.2.1 - Canais de Ca2+
Em células eucarióticas a sinalização por Ca2+ tem início pela abertura de
canais de Ca2+ localizados na membrana plasmática (MP) e/ou em membranas de
algumas organelas (Esquema 2) como o RE (Cunningham & Fink, 1994; Bush, 1995;
Sanders et al., 2002). Esse processo é iniciado por um estímulo que aumenta a
[Ca2+]C de 10 a 100 vezes (Cunningham & Fink, 1994). Após esse efeito, a [Ca2+]C
retorna rapidamente para o nível inicial, aproximadamente 100 nM, pela atividade
dos transportadores de efluxo de Ca2+ (Esquema 2).
Essa mudança na dinâmica da [Ca2+]C é controlada efetivamente e representa
a base da sinalização pelo Ca2+. Já foram descritos os seguintes canais de Ca2+:
Canais de Ca2+ voltagem-dependente: canais permeáveis a Ca2+ presentes
na membrana plasmática de planta são ativados pela despolarização da membrana
(White, 2000). Na membrana plasmática de cultura de células de tomate (Gelli &
Blumwald, 1997) e em raiz de Arabidopsis (Kiegle et al., 2000) foram encontrados
canais permeáveis a Ca2+ ativados pela hiperpolarização da membrana. Na
membrana do tonoplasto de plantas, dois tipos de canais de Ca2+ dependentes de
voltagem foram encontrados, um que responde a hiperpolarização da membrana e o
outro a despolarização da membrana, este também é conhecido como canal
vacuolar ativado lentamente (SV) (Hedrich & Neher, 1987). Esse é ativado em
resposta a mudança fisiológica pelo aumento da [Ca2+]C. Esta resposta
potencialmente capacita o canal de catalisar a liberação de Ca2+ induzida por Ca2+
(Ward & Schroeder, 1994). Na MP de levedura existem dois canais de Ca2+, um de
alta afinidade pelo Ca2+ (HACS – “high –affinity Ca2+ influx system”) e o outro de
baixa afinidade pelo Ca2+ (LACS – “Low- affinity Ca2+ influx system”). Estes possuem
via de influxo de Ca2+ que são independente e diferencialmente ativados em
resposta a ferormônio de levedura (Muller et al, 2001). O canal de Ca2+ HACS é
formado pela interação do produto dos genes CCH1 e MID1 (Fischer et al., 1997;
Lolke et al., 2000). Cch1p interage com a segunda subunidade, Mid1p para catalisar
11
o influxo de Ca2+ com alta afinidade na levedura. Consequentemente a abertura
desse canal causa um aumento citoplasmático de Ca2+ que ira causar a ativação da
expressão de genes de transportadores de Ca2+ através da via
calmodulina/calcineurina/Crz1p (Locke et al, 2000). Cch1p/Mid1p além de possuir
alta homologia com a subunidade 1 formadora do poro de canais Ca2+ voltagem
dependentes (VGCC) do tipo L células animais (Paidhungat & Garret, 1997) também
é farmacologicamente similar ao VGCC do tipo L (Teng et al., 2008). O canal de
Ca2+ Cch1/Mid1 em levedura é essencial para tolerância a baixas temperaturas e a
toxicidade pelo ferro (Peiter et al., 2005). Já a atividade do canal LACS é insensível
à atividade da calcineurina, independente do canal HACS (Mid1p/Cch1p) e suficiente
para aumentar a concentração de Ca2+ livre no citosol.
Canais permeáveis a Ca2+ controlados por ligantes: têm dois canais
permeáveis a Ca2+ em membranas do tonoplasto de plantas que podem ser abertos
em resposta a ligação do IP3 ou do ADP-ribose ciclico (cADPR). As propriedades
farmacológicas dos canais de plantas gerados por cADPR assemelham-se a dos
receptores rianodino, que junto com os receptores IP3, são responsáveis pela
mobilização do Ca2+ do RE durante a sinalização em células animais (revisado por
Sanders et al., 1999).
Canais permeáveis a Ca2+ mecano-sensíveis: estes foram encontrados em
plantas e leveduras. Em levedura esse canal foi encontrado na membrana vacuolar
e é codificado pelo gene YVC1 (Palmer et al., 2001). Existem indicações de que este
tipo de canal está envolvido na resposta à mudança osmótica do meio (Bush, 1995;
Palmer et al., 2001; Sanders et al., 2002; Zhou et al., 2003; Denis & Cyert 2003).
Quando há um estresse por choque hiperosmótico há um aumento na concentração
de Ca2+ no citosol que é liberado do vacúolo através deste canal, a célula utiliza os
transportadores de Ca2+ presentes nas organelas da via secretória para detoxificar o
citosol (Denis & Cyert, 2003). Em plantas, há indicações de que este tipo de canal
está envolvido na resposta de regulação do tugor, da toxicidade pelo alumínio, da
temperatura e de hormônios (revisado por Bush, 1995).
1.2.2 - Ca2+-ATPases de leveduras
As ATPases do tipo P, transportadores de íons, são enzimas que utilizam
diretamente a energia da hidrólise do ATP para transportar Ca2+, H+, K+, Na+ ou
12
outros íons como, Cu2+ e Mn2+, possuindo o complexo ATP-Mg2+ como principal
substrato (Carafoli, 1987; Pedersen & Carafoli, 1987).
As ATPases do tipo P são assim classificadas por formarem o intermediário
aspartil--fosfato, quando o -fosfato do ATP reage com o -carboxila do ácido
aspártico (Pedersen & Carafoli, 1987). Uma característica comum de todas as
ATPases do tipo P é a inibição por ortovanadato (Bowman & Bowman, 1986;
Pedersen & Carafoli, 1987). Outros exemplos desse tipo de ATPases são as H+-
ATPases de membrana plasmática de leveduras, fungos e plantas (Bowman &
Bowman, 1986; Pedersen & Carafoli, 1987) e Na+/K+-ATPases de células animais
(Pedersen & Carafoli, 1987).
A análise filogenética mostrou que as ATPases do tipo P pode ser dividida
em cinco subfamílias, baseado estritamente em um “kernel” de seqüências
conservada excluindo as regiões do N e C terminal que são altamente variáveis
(Axelsen & Palmgren, 1998). As P-ATPases podem ser:
- Tipo I consiste de ATPases que transportam metais de transição e pesados.
Esta se subdivide no tipo: IA (envolvidas na importação do K+); IB (são elementos
chave para resistência a íons metais e estão envolvidas no transporte de Cu+, Ag+,
Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+ e Co2+).
- Tipo II é dividido em quatro grupos: IIA (transportadores de Ca2+ do tipo
SERCA1); IIB (transporta Ca2+); IIC (consiste Na+/K+ -ATPases e H+/K+-ATPases de
células animais); IID (inclui um pequeno número de ATPases fúngica de função
desconhecida).
- Tipo III consiste de H+-ATPases de membrana plasmática de plantas e
fungos (tipo IIIA) e uma pequena subdivisão com Mg2+-ATPases de bactérias (tipo
IIIB).
- Tipo IV são ATPases que estão envolvidos no transporte de fosfolipídios.
Entretanto a especificidade do transporte da P-ATPase do tipo IV continua
desconhecida
- Tipo V são ATPases de especificidade desconhecida. Este grupo é
encontrado apenas em eucariontes e acredita-se que estar envolvido no transporte
de cátions no retículo endoplasmático.
As Ca2+-ATPases podem ser encontradas em MP de plantas (Dixon, 1984;
Bush,1995) e de células animais, no retículo sarcoplasmático (RS) de células
animais (Pedersen & Carafoli, 1987; Carafoli, 1987; Carafoli & Klee, 1999) e no RE
13
de levedura (Okorokov, 1997; Okorokov & Lelhe, 1998; Cronim et al., 2002;
Okorokova Façanha et al., 2002), no Golgi de leveduras (Okorokov et al, 1995;
Sorin et al., 1997;) e vacúolo de levedura (Cunningham & Fink, 1994; Okorokov &
Lehle, 1998).
Em S. cerevisiae, dezesseis genes codificam ATPases do tipo P (Catty et al.,
1997). Porém, até agora, somente o produto de dois genes foi identificado
bioquimicamente como Ca2+-ATPase, o gene PMR1, que codifica a Ca2+-ATPase de
Golgi e o gene PMC1, que codifica a Ca2+-ATPase de vacúolo (Rudolph et al., 1989,
Okorokov et al, 1995; Sorin et al., 1997; Okorokov & Lehle, 1998, Cunningham &
Fink, 1994). Vem sendo proposto que os gene SPF1/COD1 e CTA4 de S. cerevisiae
e de S. pombe respectivamente são prováveis candidatos a Ca2+-ATPase de RE, por
estes estar envolvidos na homeostase de Ca2+ desses organismos (Cronim et al.,
2002; Okorokova Façanha et al., 2002).
Em concordância com a opinião de que mais de dois genes codificam Ca2+-
ATPases em S. cerevisiae (Catty & Goffeau, 1996), foi mostrado atividade das Ca2+-
ATPases em cada compartimento da via secretória de S. cerevisiae, sugerindo que
cada compartimento da via secretória possui sua própria Ca2+-ATPase (Okorokov,
1994; Okorokov, 1997). Esta hipótese recebeu mais evidências bioquímicas que
mostraram a existência de no mínimo quatro Ca2+-ATPases em S. cerevisiae
localizadas, uma no RE, duas Ca2+-ATPases no Golgi e em membranas que
comigram com as membranas do Golgi e uma no vacúolo (Okorokov & Lehle, 1998).
Adicionalmente, as Ca2+-ATPases foram encontradas em diversas frações de
membranas, representativa de várias organelas, separadas em gradiente de
densidade de sacarose e mostraram diferentes sensibilidades para o ortovanadato.
Foi verificado que 50% do transporte de Ca2+ foram inibidos nas seguintes
concentrações de ortovanadato: 30 M nas membranas vacuolares; 150 e 400 M
nas membranas do Golgi e em membranas que comigram com membranas do
Golgi; 610 – 650 M e 230 M nos subcompartimentos do RE; 15 M nas
membranas mais densas do que as membranas do RE (Okorokov et al., 1996;
Okorokov, 1997). Reforçando essa hipótese, dois grupos diferentes descreveram a presença de
uma ATPase da família P5 localizada no RE das leveduras S. pombe e S.
cerevisiae, a Cta4p e a Cod1p, respectivamente como prováveis Ca2+-ATPases
(Okorokova Façanha et al., 2002; Cronim et al., 2002). Em S. pombe foi mostrado
14
pela primeira vez a atividade das Ca2+-ATPases e em mutante nulo de cta4 a
atividade das Ca2+-ATPases encontrada no RE foi duas vezes menor que na cepa
selvagem (Lustoza, 2005, comunicado em congresso de Okorokova-Façanha et al.,
2007)
As informações sobre Ca2+-ATPase(s) de MP de leveduras e fungos são
limitadas. Uma ATPase de MP de S. cerevisiae foi solubilizada e parcialmente
purificada por cromatografia de afinidade para calmodulina (Hiraga et al.,1991). Essa
ATPase foi estimulada por Ca2+ e calmodulina e inibida por altas concentrações de
ortovanadato, porém o transporte de Ca2+ não foi mostrado. A ausência de genes
que tenha alta homologia com os genes de Ca2+-ATPase de MP de células animais
e ausência de outras publicações sobre Ca2+-ATPase de MP de S. cerevisiae (Catty
et al., 1997) tem sugerido, até o momento, que MP de S. cerevisiae não possui Ca2+-
ATPase.
Também há indicações, em S. cerevisiae, de que a Ca2+-ATPase de
membrana plasmática in vitro não contribui significativamente para o transporte de
Ca2+ em membranas totais, indicando que este transporte é realizado principalmente
por membranas intracelulares (Okorokov et al., 1997). A atividade do transporte de
Ca2+ foi caracterizada após a remoção da membrana plasmática com o auxílio da
concanavalina A. Foi verificado que somente altas concentrações de TFP e
calmidazolio (inibidores de Ca2+-ATPases de MP) bloquearam o transporte de Ca2+
nessas membranas. Adicionalmente, averiguaram que a formação do acil-fosfato
pode ser inibida por ácido ciclopiazônico e pelo La3+ (Okorokov et al, 1997).
Okorokov e colaboradores (1997), acreditam que a inativação ou a redução da
atividade de Ca2+-ATPase(s) de MP de S. cerevisiae foi decorrente das condições do
tratamento das membranas.
Muitas células eucarióticas expressam uma Ca2+-ATPase na membrana
plasmática (PMCA) que é responsável pela manutenção dos baixos níveis de [Ca2+c]
(Carofoli, 1992). O gene PMC1 de S. cerevisiae apresentou 40% de identificação
gênica com a Ca2+-ATPase de membrana plasmática de células animais. Porém foi
mostrado que a Pmc1p está localizada na membrana vacuolar de levedura. O
crescimento do mutante nulo pmc1 é inibido em meio de cultivo que contenha alta
concentração de Ca2+, estes dados indicam o papel da Pmc1p na tolerância ao Ca2+
(Cunningham & Fink, 1994). O gene PMC1, que codifica a Ca2+-ATPase de vacúolo,
foi clonado e seqüenciado, entretanto o transporte de Ca2+ não foi mostrado
15
diretamente nas membranas vacuolares. Essa análise foi realizada através do
transporte de Ca2+ feito nas células (Cunningham & Fink, 1994).
No conjunto de dados do genoma de Aspergillus nidulans treze proteínas
foram identificadas como ATPases do tipo P, no qual cinco apresentaram
similaridades com os membros da família de Pmc1p, três com os da família de
Ena1p e um foi homólogo da Pmr1p (Hagiwara et al., 2008).
1.2.2.a - Pmr1p, Ca2+- e Mn2+- ATPase
O gene PMR1 (“Plasma Membrane Related”) foi descoberto inicialmente
como um gene e apresentava similaridade com as Ca2+-ATPases de MP e RS de
células animais (Rudolph et al., 1989). Mais tarde, o transporte de Ca2+ PMR1-
dependente foi mostrado confirmando que o gene PMR1 codifica uma Ca2+-ATPase
(Okorokov et al, 1995; Sorin et al., 1997; Okorokov & Lehle, 1998). A localização de
Pmr1p (Ca2+-ATPase) foi indiretamente determinada no Golgi através de estudos de
imunolocalização e verificou-se que esta ATPase é necessária para as funções do
Golgi, como endereçamento e glicosilação de proteínas (Antebi & Fink, 1992).
Evidências bioquímicas diretas mostraram que esta Ca2+-ATPase está localizada
em, no mínimo, dois subcompartimentos do Golgi e em compartimento intermediário
entre o RE e o Golgi (Okorokov et al., 1993; Okorokov et al., 1995; Okorokov &
Lehle, 1998).
A maioria das Ca2+-ATPases pode transportar apenas Ca2+, porém alguns
estudos tem sugerido que a Ca2+-ATPase de Golgi (Pmr1p) também pode
transportar Mn2+ (Sorin et al., 1997; Wei et al., 1999). Foram identificadas algumas
mutações no PMR1, que alteram a seletividade para Ca2+ e Mn2+ (Wei et al., 1999).
Esses autores descreveram os efeitos das mutações na Gln 783, posicionada na
interface citoplasmática da hélice transmembrana M6. Foi verificado que esta Gln
pode ser substituída por resíduos volumosos (Leu, Glu e Thr) no transporte de Ca2+
e Mn2+. Inversamente, a introdução de pequenas cadeias polares (Ser, Asn, Csy)
neste sítio provoca a perda completa do transporte, enquanto que a substituição por
Ala foi a única capaz de conferir uma perda forte e seletiva do transporte de Mn2+
(Wei et al., 2000).
16
1.2.3 - Trocadores de Ca2+/H+
Os trocadores de H+ são transportadores ativos secundários, que não
requerem diretamente a energia da hidrólise do ATP para transportar íons. Os
trocadores utilizam energia reservada em forma de gradiente eletroquímico de H+,
criado por uma H+-ATPase de membrana (Stroobant & Scarborough, 1979; Ohsumi
& Anraku, 1983; Okorokov et al., 1985a, Okorokov et al.,1985b; Okorokov et al.,
1988; Bush, 1995). Os trocadores acumulam vários cátions em organelas e
vesículas intracelulares como resultado da troca com prótons. Como exemplo pode
ser citado, o trocador Ca2+/H+ vacuolar que transporta, simultaneamente, o Ca2+ para
dentro do vacúolo e H+ para fora desta organela (Ohsumi & Anraku, 1983).
Outros tipos de trocadores protônicos, além de Ca2+/ H+, são conhecidos em
leveduras como: arginina+/H+ (Ohsumi & Anraku, 1981), Zn2+/H+, Mg2+/H+, Mn2+/H+,
Cd2+/H+ de membranas vacuolares (Okorokov et al., 1985a; Okorokov et al., 1985b;
Okorokov, 1985; White & Gadd, 1986) e/ou Na+/H+ em Candida albicans (Soong et
al., 2000) e Ca2+/H+ de membrana plasmática de Neurospora crassa (Stroobant &
Scarborough, 1979).
O trocador Ca2+/H+ foi encontrado em membranas do vacúolo de S. cerevisiae
(Ohsumi & Anraku, 1983), S. carlsbergensis (Okorokov et al., 1985), Yarrowia
lipolitica (Kulakovskaya et al., 1993), Candida albicans (Calvert et al., 1995) e em
membrana plasmática em N. crassa (Stroobant & Scarborough, 1979). Em S.
cerevisiae (Okorokov et al., 1995, Okorokov, 1997) e em S. pombe (Silva, 1998;
Okorokov et. al., 2001) a atividade do trocador foi evidenciada em diferentes
organelas da via secretória.
Em Dictyostelium discoideum, foi encontrada uma Ca2+/nH+-ATPase que
utiliza a energia liberada da hidrólise do ATP para transportar simultaneamente o
Ca2+ para dentro de vesículas ácidas e H+ na direção contrária (Rooney & Gross,
1992). A utilização direta da energia liberada da hidrólise do ATP é que diferencia a
Ca2+/nH+-ATPase do trocador Ca2+/H+, pois o trocador necessita que um gradiente
eletroquímico de H+ seja criado por uma H+-ATPase. É importante ressaltar que
assim como todas as ATPases do tipo P, Ca2+/H+-ATPase também é inibida por
ortovanadato (Bowman & Bowman, 1986; Pedersen & Carafoli, 1987) e o trocador
Ca2+/H+ por protonóforos (Kakinuma et al., 1981; Okorokov et al., 1985a; Okorokov
et al., 1985b; Schumaker & Sze, 1986; Banta et al., 1988).
17
A atividade do trocador Ca2+/H+ pode ser desfeita por protonóforos, como o
FCCP (Carbonil cianeto p-trifluorometoxifenil hidrozona). Os protonóforos são
capazes de colapsar o pH gerado pela H+-ATPase, permitindo um equilíbrio de H+
através da membrana (Kakinuma et al., 1981; Okorokov et al., 1985a; Okorokov et
al., 1985b; Schumaker & Sze, 1986; Banta et al., 1988). O colapso do pH
provocado pelo FCCP (protonóforo), pela nigericina (ionóforo como maior
seletividade para K+) ou pela monensina (ionóforo de Na+) induz a saída de Ca2+ que
foi acumulado pelas vesículas dos vacúolos, porém o SCN-, um anion permeável,
que destrói o potencial de membrana não inibiu o transporte de Ca2+. Isto indica a
importância do pH para o acúmulo e retenção do Ca2+ nas vesículas de
membranas (Okorokov et al., 1988; Silva, 1998; Okorokov et al., 2001).
Tentativas da avaliação do papel do trocador na regulação do Ca2+ citosólico
in vivo foram obtidas em N. crassa (Miller et al., 1990). Neste caso o protonóforo
FCCP desfez o gradiente de H+ através da membrana vacuolar provocando a saída
do Ca2+ desta organela (Okorokov et al., 1988; Okorokov et al., 2001). O cianeto de
potássio, inibidor da enzima citocromo oxidase responsável pela transferência de
elétrons para o oxigênio na fosforilação oxidativa, não aumentou o nível de Ca2+
citosólico, pois este não pode destruir o gradiente de H+ através do tonoplasto ou
inibir a glicólise (Miller et al., 1990).
Os distúrbios na homeostase de Ca2+ foram detectados em mutantes de S.
cerevisiae com defeitos na V H+-ATPase. Estes distúrbios foram interpretados pela
incapacidade da V H+-ATPase defeituosa dos mutantes de criar o gradiente de H+
através do tonoplasto (membrana vacuolar), e por isso suportar a atividade do
trocador Ca2+/H+ destas membranas (Ohya et al., 1991).
O gene que codifica para o trocador Ca2+/H+ de membrana vacuolar de S.
cerevisiae foi independentemente clonado por dois laboratórios e foi chamado de
VCX1 (Cunningham & Fink, 1996) ou HUM1 (Pozos et al., 1996).
Em células vegetais, a atividade do trocador Ca2+/H+ utiliza o gradiente de H+
gerado pela V H+-ATPase e por outra bomba de H+ presente no tonoplasto, H+-
PPase (H+ pirofosfatase) (Sze et al., 1999; Maeshima, 2001).
Em Arabidopsis thaliana, os genes CAX1 e CAX2 codificam o trocador
Ca2+/H+ e provavelmente, trocador Me2+/H+ para cátions de metais pesados,
respectivamente. Os produtos dos genes CAX1 (Cax1p) e CAX2 (Cax2p) possuem
18
homologia em 33% e 38% respectivamente e cada um possui similaridade de 53%
com o produto do gene VCX1 (Vcx1p) de levedura.
Em plantas, a membrana plasmática (Kasai & Muto, 1990), o tonoplasto (TN)
e a membrana do Golgi têm sido considerados como prováveis localizações para os
trocadores, pois todas essas membranas possuem ATPases protônicas, do tipo P na
MP e do tipo V no tonoplasto e na membrana do Golgi (Matsuoka et al., 1997).
O CAX1 foi o primeiro gene para o trocador Ca2+/H+ de planta (Arabdopsis)
clonado e funcionalmente expresso em levedura (Hirschi et al., 1996). Cax1p foi
identificado pela sua capacidade de restaurar o crescimento de mutante de levedura,
com defeito no transporte vacuolar, em meio contendo altas concentrações de Ca2+
(Hirschi et al, 1996). A atividade do Cax1p foi semelhante à encontrada para o
trocador Ca2+/H+ em vacúolos de raiz de aveia (Schumaker & Sze, 1986). Embora
seja razoável especular que Cax1p esteja localizado no vacúolo, há evidências da
existência de trocadores em outras membranas, tal como na membrana plasmática
de plantas (Kasai & Muto, 1990).
CAX1 é determinado como trocador Ca2+/H+, já o CAX2 sugere-se que este
transporta outros íons para dentro do vacúolo em plantas. Pois o transporte de Cd2+
e Mn2+ aumentaram em plantas de tabaco quando CAX2 foi superexpresso, além
disso, a afinidade do CAX2 pelo Ca2+ (Km > 100 M) é menor que do CAX1 (Km
entre 9,5 – 25 M) (Arabdopsis thaliana) e a expressão de RNAm de CXA2 não foi
induzida pelo Ca2+ contrário de CAX1 (Hirschi et al., 1996; Ueoka-Nakinishi et al.,
1999; Hirschi et al., 2000; Kamiya and Maeshima, 2004).
Dois outros CAXs, CAX3 e CAX4 foram isolados de Arabidopsis (Shigaki &
Hirsch, 2000; Cheng et al., 2002). Em outras espécies de plantas como Vigna radiata
e Oryza sativa foram clonados os trocadores o VCAX1 e OsCAX respectivamente
(Ueoka-Nakinishi et al., 1999; Kamiya and Maeshima, 2004, Kamiya et al., 2006) e
todos estão localizados nas membranas vacuolares.
Em leveduras, a atividade do trocador Ca2+/H+ de MP ainda não foi
demonstrada. Entretanto essa atividade foi encontrada em vesículas de MP dos
fungos N. crassa (Stroobant & Scarborough, 1979) e Phytophtora megasperma
(Giannini et al., 1988). Neste caso, o gradiente protônico é formado pela H+-ATPase
do tipo P. Esta enzima possui alta sensibilidade para ortovanadato. Desta forma, a
atividade do trocador Ca2+/ H+ de MP pode ser inibida por protonóforos ou por
ortovanadato (Stroobant & Scarborough, 1979) e não pode ser inibida por
19
bafilomicina A1 (Bowman et al.,1988) ou por concanamicina A, inibidores específicos
da ATPase do tipo vacuolar. Portanto, as atividades dos trocadores Ca2+/ H+ de MP
e de membranas das organelas da via secretória podem ser diferenciadas pelo uso
de inibidores específicos como o ortovanadato para H+-ATPase de MP e a
bafilomicina A1 ou concanamicina A para H+-ATPases intracelulares.
A maioria das publicações concorda com a hipótese de que o vacúolo é a
principal organela armazenadora de Ca2+ em leveduras, fungos e plantas (Halachmi
& Eilam, 1989; Klionsky et al., 1990; Cunningham & Fink, 1994; Calvert & Sanders,
1995; Pozos et al., 1996, Tanida et al., 1996; Cunningham & Fink, 1996) e que o
trocador Ca2+/H+ está localizado somente em membranas vacuolares (Dunn et al.,
1994; Pozos et al., 1996; Cunningham & Fink, 1994). Porém, a atividade do trocador
foi demonstrada em várias membranas de organelas da via secretória de S.
cerevisiae, separadas em gradiente de densidade de sacarose e essas membranas
também apresentaram atividade de Ca2+-ATPases. Sugerindo que cada
compartimento da via secretória de leveduras possui seus próprios trocadores
Ca2+/H+ e Ca2+-ATPases (Okorokov, 1995; Okorokov, 1997).
Até o momento, apesar da existência da atividade dos trocadores Ca2+/H+ter
sido encontrada em membranas intracelulares distintas das membranas vacuolares
de S. cerevisiae apenas um único gene foi determinado, o VCX1. Porém,
comprovação adicional foi encontrada no mutante duplo pmr1 vcx1 (cepa deficiente
da Ca2+-ATPase de golgi e do trocador Ca2+/H+ vacuolar), quando Marchi e
colaboradores (1999) mostraram o aumento da atividade do trocador Ca2+/H+ em
vesículas de membranas que migram com membranas do RE, sugerindo que este
trocador é codificado por um gene diferente de VCX1. Em S. pombe, o transporte de
Ca2+ foi completamente realizado pela atividade do trocador Ca2+/H+, utilizando a
energia do gradiente eletroquímico de H+ criado pelas V H+-ATPases. (Okorokov, et
al., 2001). E mais recentemente, a presença de três proteínas homólogas ao Vcx1p
de S. cerevisiae foi mostrada em A. nidulans e a expressão da proteína AN5821.3 é
modulada de maneira dependente de Ca2+/CrzA diferente do que ocorre com Vcx1p
em S. cerevisiae (Hagiwara et al., 2008)
1.3 - Calcineurina
A calcineurina (CaN), é uma proteína fosfatase dependente de
Ca2+/calmodulina que participa de vários processos celulares das vias de transdução
20
de sinais, que é bem conservada de leveduras a humanos. Esta proteína, é um
heterodímero que consiste de uma subunidade catalítica de 61 kDa, calcineurina A,
e outra regulatória de 19 kDa, calcineurina B (Cohen, 1989). A subunidade catalítica
é caracterizada por possuir três domínios: um de ligação com a calcineurina B; um
de ligação com calmodulina; um auto-inibitório (Perrino et al.,1995; Rusnak & Mertz,
2000). Já o sítio de ligação para Ca2+ encontra-se na subunidade regulatória (Aitken
et al, 1984). Os genes para as subunidades A e B da calcineurina têm sido
identificados em leveduras, fungos filamentosos, protozoários, insetos e mamíferos
(Rusnak & Mertz, 2000).
Em S. cerevisiae, há dois genes para a subunidade A (CNA1 e CNA2) e um
para a subunidade B (CNB1) da calcineurina (Rusnak & Mertz, 2000). Homólogos
funcionais da subunidade A da calcineurina tem sido relatado em S. pombe, ppb1+
(Yoshida, et al., 1999; Plochocka-Zulinska et al., 1995) e outros microorganismos
como, Dictyostelium discoideum, cnaA (Dammann et al., 1996), Aspergillus nidulans,
cnaA+ (Rasmussen et al., 1994). Já Arabidopsis thaliana possui apenas o homólogo
funcional da calcineurina B, SOS3 (Liu & Zhu, 1998).
A ação da CaN é inibida pelas drogas imunossupressoras como ciclosporina
A (CsA) e FK506 quando complexada com seus respectivos receptores
citoplasmáticos ciclofilina (CpH) e FKBP12 (Bierrer et al., 1993) (Esquema 3).
A resposta transcricional da calcineurina requer o fator de transcrição
Crz1p/Tcn1p1. A CaN ativada defosforila o fator de transcrição Crz1p/Tnc1p, no
resíduo de serina do N-terminal, provocando o deslocamento do fator de transcrição
do citoplasma para o núcleo (Stathopoulos et al, 1999). O mecanismo de ação da
CaN foi mais bem estudado em linfócitos, porém esta sinalização em levedura
assemelha-se a do linfócito (Esquema 3) (Crabtree, 2001). Isto sugere um
mecanismo conservado pelo qual a calcineurina regula a expressão de gene em
resposta a estímulo pelo Ca2+ (revisado por Sigiura et al., 2001).
Além da grande similaridade na seqüência de aminoácidos, pois existe um
grupo conservado de serina no domínio de translocação no N-terminal de ambos os
fatores de transcrição existe também uma grande semelhança no mecanismo de
ação do fator de transcrição Crz1p/Tcn1p de levedura com o fator de transcrição
NFATc dos linfócitos, porém, a ligação dos fatores de transcrição com o DNA ocorre
diferentemente em cada caso, ou seja, enquanto o Crz1p/Tcn1p utiliza a estrutura
21
dedo de zinco (“zinc finger”) para ligar-se ao DNA o NFATc usa o domínio Rel
(Crabtree, 2001).
A calcineurina, em levedura, esta envolvida na regulação da síntese de
glucano, homeostase iônica e controle do ciclo celular. Uma vez disparado o sinal
por ferormônio ou outro agente que aumenta a concentração de Ca2+ intracelular
ativa a transcrição e um de dois genes que codifica 1,3--glucano sintase (FKS2),
enzima que catalisa o principal componente da parede celular), PMR2 (gene que
codifica Na+-ATPase), PMC1 (gene que codifica Ca2+-ATPase de vacúolo), PMR1
(gene que codifica Ca2+-ATPase de Golgi) e outros genes (Cunningham & Fink,
1994; Stathopoulos & Cyert, 1997; Matheos et al., 1997; Yoshimoto et al., 2002).
Além de regular o estado de baixa/alta afinidade do canal de K+ (Trk1p) (Mendonza
et al., 1994), e inibir o trocador Ca2+/H+ vacuolar (Vcx1p) por mecanismo pós-
transcricional (Cunningham & Fink, 1996).
A contribuição da CaN na homeostase de Ca2+, foi demonstrada pela adição
de FK506 na cepa mutante vma (cepa deficiente de V H+-ATPase de vacúolo) e no
mutante duplo cnb1 vma (cepa deficiente de calcineurina e V H+-ATPase de
vacúolo). Nos experimentos com o mutante vma, tanto a ausência da proteína
(Cnb1p) quanto na inibição da CaN pelo FK506 foi observado a redução da
tolerância a altas concentrações de Ca2+ nessas cepas de levedura (Tanida et al.,
1995). O mesmo resultado foi encontrado para o mutante de PMC1 (cepa deficiente
de Ca2+-ATPase de vacúolo) (Cunningham & Fink, 1994).
Esquema 3: Mecanismo de ação da calcineurina (CaN) na regulação da transcrição de células de mamíferos e levedura. AKAP-79, DSCR1, Cain, CHP são outros inibidores da CaN. Fonte Crabtree, 2001.
22
1.4 - Regulação dos transportadores de Ca2+
1.4.1 - Efeito de altas concentrações de Ca2+ sobre a homeostase de Ca2+ e H+ em levedura.
Cepas selvagens de levedura podem crescer em meios contendo mais de 100
mM de Ca2+. Estas células quando foram expostas a concentração de 50 mM de
Ca2+ extracelular apresentaram uma elevação da concentração de Ca2+ no citosol de
100 a 150 nM para 270 nM (Halachmi & Eilam, 1993; Miseta et al, 1999). Foi
observado que alguns tipos de mutações, como a mutação do gene PMR1, Ca2+-
ATPase de Golgi (Rudolph et al., 1989), ou mutações que inativam subunidades da
V H+-ATPase ou outros fatores necessários para a acidificação do lúmem do
vacúolo, também causam o aumento na concentração de Ca2+ livre no citosol e
também extrema sensibilidade à adição de CaCl2 ao meio de cultivo (Ohya et al.,
1991).
Em levedura a calcineurina é dispensável para o crescimento em condições
“normais”, entretanto em condições de estresse a deleção da calcineurina promove
inibição do crescimento celular (Sigiura et al., 2001; Cyert, 2001).
O aumento da concentração do Ca2+ no citosol, ativa a calcineurina. A
calcineurina ativada induz a expressão do gene PMC1 (codifica Ca2+-ATPase
vacuolar) e inibe a atividade do trocador Ca2+/H+ vacuolar (Vcx1p) pós-
transcricionalmente (Cunningham & Fink, 1994; Mendoza et al., 1996) (Esquema 4).
Esquema 4: Modelo de regulação da calcineurina (CaN) sobre os transportadores em levedura. CaN é ativada por Ca2+ e calmodulina. A CaN ativada causa aumento da transcrição Ca2+-ATPase vacuolar (PMC1) e inibi a atividade do trocador Ca2+/H+ (VCX1p). A ativação é simbolizada por seta e a inibição por uma barra. Fonte: Hirschi, 2001.
23
Porém, a inativação do trocador Ca2+/H+ não é imediata, pois quando o
mutante pmc1 é exposto a um choque instantâneo de Ca2+, o Vcx1p é o responsável
pela eliminação rápida do Ca2+ do citosol (Esquema 5), porém quando pmc1 é
exposto por um período prolongado a altas concentrações de Ca2+ (400 mM) esse
mutante sobrevive no máximo dois ciclos de divisão celular (Miseta et al., 1999).
Esses dados levaram seus autores a sugerirem que uma eventual regulação
negativa da Vcx1p no mutante de pmc1 poderia, em última instância, reduzir a
habilidade da célula em seqüestrar Ca2+ citosólico resultando na interrupção gradual
do crescimento.
Esses dados são contraditórios aos pensamentos de alguns pesquisadores
que estudaram a homeostase de Ca2+, no passado, pois estes determinaram que a
afinidade do trocador Ca2+/H+ pelo Ca2+ era baixa, porém os dados obtidos foram
superestimados, pois a análise ocorria levando em consideração o conteúdo total de
cátions (Ohsumi & Anraku, 1983; Okorokov et al., 1985; Schumarker & Sze, 1986).
Esse pensamento vem mudando, atualmente admite-se que o trocador Ca2+/H+ de
levedura (Vcx1p) possui baixa afinidade pelo Ca2+ entretanto apresentam uma alta
velocidade para transportar o Ca2+ para o vacúolo (Miseta, et al., 1999; Kellermayer
et al., 2003). Recentemente, nosso grupo mostrou, em membranas totais de
levedura, que o trocador Ca2+/H+, na ausência de glicose, possui o Km (61 nM)
semelhante ao da Ca2+-ATPases (45 nM) porém possui quase o dobro da velocidade
máxima. Já em condições em que os esferoplastos foram incubados com glicose o
Km do trocador Ca2+/H+ foi de 100 nM enquanto que o Km das Ca2+-ATPases foi de
51 nM, mas em compensação a velocidade dos trocadores Ca2+/H+ nessas
condições aumentou 3,5 vezes quando comparado a velocidade de transporte de
Ca2+ das Ca2+-ATPases (Ribeiro, 2007; artigo em preparação). Portanto podemos
concluir que o trocador Ca2+/H+ possui papel fundamental para a homeostase de
Ca2+.
A CaN ativada confere o aumento da tolerância a altos níveis tóxicos de Ca2+,
Mn2+ (Cunningham & Fink, 1996), Na+ e Li+ (Mendoza et al., 1996). Porém, reduz a
tolerância a 200 mM de Ca2+ extracelular no mutante pmc1. Embora a inativação das
duas isoformas da subunidade A (catalítica) ou da subunidade B (regulatória) da
Calcineurina restaura esta tolerância (Cunningham & Fink, 1994).
24
A cepa deficiente de três transportadores simultaneamente (mutante triplo
vcx1 pmr1 pmc1), VCX1 (trocador Ca2+/H+ de vacúolo), PMC1 (Ca2+-ATPase de
vacúolo) e PMR1 (Ca2+-ATPase de Golgi) é inviável. Embora a presença funcional
do Vcx1p ou Pmc1p neste mutante seja o suficiente para promover e manter o papel
relativo de cada transportador e seus reguladores (Cunningham & Fink, 1996).
Entretanto a viabilidade do mutante duplo pmr1 pmc1 (deficientes de Ca2+-ATPases
de Golgi e vacúolo respectivamente) só é restaurada quando a atividade da CaN for
inativada pela deleção do gene CNB1 ou inibida por CsA ou FK506 (Cunningham &
Fink, 1996).
Cunningham e Fink (1996), baseados em dados experimentais, propuseram
um modelo, pelo mecanismo de “feedback”, da homeostase de Ca2+ no citosol em
levedura, que envolve pelo menos a calmodulina (CaM), CaN e três transportadores
de Ca2+. Juntos esses transportadores controlariam a concentração de Ca2+ e
preveniriam o acumulo tóxico de Ca2+ no citosol, isto é extremamente importante em
condições de alta concentração de Ca2+ extracelular. A CaN é ativada por alta
concentração de Ca2+ no citosol e pela CaM. A CaN ativa vai ocasionar o aumento
da expressão do gene PMC1, e possivelmente do PMR1, porém irá promover a
inibição da atividade do trocador Ca2+/H+ vacuolar, Vcx1p, por um mecanismo pós-
transcricional ainda desconhecido (Cunningham & Fink, 1996).
Estudos da expressão gênica mostraram que os genes PMR1, CRZ1 e FKS2
são menos dependente de CaN do que os genes PMC1 e ENA1 (Stathopoulos &
Esquema 5: Medições dos níveis de Ca2+ citosólico por aequorina. Os níveis de Ca2+ foram medidos após a exposição de Ca2+ extracelular. A emissão de luz dependente de Ca2+ foi gravado durante 10 s em baixo Ca2+. CaCl2 foi adicionado nas concentrações de (A) 50 mM ou (B) 400 mM e as mudanças no Ca2+ citosólico foi monitorada por um tempo adicional de 150 s. Fonte: Miseta et al., 1999
25
Cyert, 1997, Matheos et al., 1997). Análise da expressão gênica, regulada por
Calcineurina/Crz1p na via de sinalização em S. cerevisiae, utilizando a técnica do
“DNA microarray” seguido da adição de 200 mM de Ca2+ não identificou PMR1,
CRZ1 e FKS2 como genes dependentes de CaN, pois as magnitudes destes
transcritos mudaram para níveis pouco abaixo de 2, limite mínimo definido como
significativo pelos autores (Yoshimoto et al., 2002).
1.4.2 - Efeito da glicose sobre a homeostase de Ca2+ e H+ em
levedura.
A presença da glicose induz modificações nas propriedades cinéticas das H+-
ATPases de MP, resultando no aumento da atividade enzimática (Serrano, 1983) e
no aumento na transcrição do gene PMA1, que codifica esta enzima (Rao et al.,
1993). Supply e colaboradores (1993) mostraram que esta ativação pode ser de 2 a
3 vezes, porém a adição de frutose (Kotyk & Georghiou, 1994) pode proporcionar
uma ativação da H+-ATPase da MP maior que a adição da glicose, sugerindo que a
ativação da H+-ATPase da MP pode ser por meio da frutose-6-fosfato.
A V H+-ATPase, é uma enzima responsável em transportar H+ nos
compartimentos intracelulares de células de leveduras. Essa enzima é formada por
dois complexos, o complexo catalítico V0 e o complexo regulatório V1. O transporte
de H+ realizado pela V H+-ATPases ocorre somente quando os complexos V1 e V0 se
associam de forma funcional, ou seja, o complexo V0 não transporta prótons quando
o complexo V1 está desassociado (Zhang et al., 1992). Em levedura, a ausência da
glicose promove a desassociação de aproximadamente 70% dos complexos V1 e V0,
porém a readição da glicose induz, a uma rápida e eficiente, reassociação dos
subcomplexos previamente sintetizados. Isto também ocorre na presença de
ciclohexamida (substâcia que bloqueia a síntese de novas proteínas), sugerindo que
este mecanismo ocorre pós-traducionalmente (Kane, 1995).
Parra e Kane (1998) verificaram que as vias de sinalização de Ras-cAMP,
Snf1p, proteína quinase C ou Rts1p (que responde a estresse de forma geral) e o
acúmulo de glicose-6-fosfato foram insuficiente para manter ou induzir a associação
da V H+-ATPase. Sugerindo que a associação da V H+-ATPase dependente da
glicose ocorre por um mecanismo que requer o metabolismo da glicose além da
26
formação da glicose-6-fosfato e que este mecanismo gera um sinal que pode ser
percebido somente por V H+-ATPase cataliticamente competente.
Mutações que inativam as subunidades da V H+-ATPase ou outros fatores
necessários à acidificação do lúmem do vacúolo, causam o aumento de
aproximadamente seis vezes na concentração de Ca2+ livre no citosol (Ohya et al.,
1991). Este distúrbio foi interpretado pela incapacidade da V H+-ATPase de criar o
gradiente de H+ para suportar a atividade do trocador Ca2+/H+, Vcx1p, que promove
o seqüestro intracelular de Ca2+ através da troca com o H+ em membranas de
mutante da V H+-ATPase (Ohya et al., 1991).
A V H+-ATPase foi a enzima responsável em gerar o gradiente de H+ para o
transporte de Ca2+ em membranas intracelulares de S. pombe, que foi realizado pela
atividade dos trocadores de Ca2+/H+ (Silva, 1998; Okorokov et al., 2001). Na
membrana plasmática de N. crassa, foi encontrado um trocador Ca2+/H+, que utiliza
o gradiente eletroquímico gerado por uma H+-ATPase de tipo P (Stroobant &
Scarborough, 1979). Em membrana plasmática de D. discoideum foi encontrado
uma Ca2+/nH+-ATPase que troca simultaneamente Ca2+ pelo H+, utilizando a energia
direta da hidrólise do ATP (Rooney & Gross, 1992). Isto mostra que a homeostase
de H+ está intimamente relacionada com a homeostase de Ca2+.
Fu e colaboradores (2000) propuseram que a perda da principal isoforma da
fosfoglucomutase (PGM), enzima que catalisa a transferência do fosfato da posição
1 (glicose-1-fosfato) para a posição 6 da glicose (glicose-6-fosfato) em S. cerevisiae,
causa algumas alterações na homeostase de Ca2+ celular e na sinalização das
células que crescem em meio contendo galactose. A cepa pgm2 (mutante
deficiente na isoforma da PGM2) exibe maior taxa de captação e maior
concentração de Ca2+ celular total quando comparada à cepa selvagem (Sc252). O
crescimento desta cepa é inibido na presença de 10 g/mL de ciclosporina A (CsA),
sugerindo que a ativação dos transportadores de Ca2+ que ocorre via sinalização
pela CaN é crucial para a sobrevivência deste mutante, realizando uma rápida
remoção do Ca2+ do citosol. Porém, estes efeitos não são visualizados no mutante
pgm2, quando este cresce na presença de glicose ou lactose. Os vários efeitos
relatados por Fu e colaboradores (2000) na cepa pgm2 crescendo na presença de
galactose, também foram encontrados por Halachmi & Eilam (1996) na cepa pmr1,
incluindo a acumulo de Ca2+.
27
Aielo e colaboradores (2002) mostram que o mutante pgm2 acumula mais
Ca2+ que a cepa selvagem, ou pfk2 ou pgm2/pfk2 quando essas cepas crescem
em meio de cultura contendo galactose (YEPgal), isso ocorre devido ao aos níveis
relativos de Glc-1-P, Glc-6-P e/ou a razão entre Glc-6-P/Glc-1-P. Porém quando
essas cepas cresceram em meio contendo glicose (YEPD) não ocorreu mudança na
captação/acúmulo de Ca2+ entre as cepas, esses resultados a interferência da fonte
de carbono na homeostase de Ca2+ (Aielo et al., 2002). Foi mostrado que a Ca2+-
ATPase de vacúolo (Pmc1p) é responsável pelo aumento captação de Ca2+ na cepa
pgm2 em meio YEPgal e que o aumento da captação de Ca2+ vacuolar coincide
com o aumento da indução da resposta a proteínas mal enovelada (UPR – “unfolded
protein response”), os autores sugerem que a Pmc1p capta Ca2+ exacerbadamente
impedindo que o RE/Golgi mantenha a concentração de Ca2+ em seus
compartimentos necessária para uma correto processamento protéico (Aielo et al.,
2004).
Foi demonstrado na levedura S. cerevisiae que a adição de glicose após um
período de ausência de glicose, ocasiona um aumento transiente da concentração
de Ca2+ no citosol (Tisi et al., 2002), e também a diminuição do pH citoplasmático
devido a glicólise (Souza et al., 2001;). Vem sendo mostrado que essa condição
ativa as H+-ATPase vacuolar (V H+-ATPase) (Parra & Kane, 1998; Kane et al., 1999)
e também da P H+-ATPase de MP (Serrano, 1983; Chang & Slayman, 1991). Foi
mostrado, em levedura, que a glicose também pode estimular a atividade das Ca2+-
ATPases em 2 vezes e dos trocadores Ca2+/H+ em 6 vezes (Ribeiro, 2007; artigo em
preparação).
28
2. OBJETIVOS Objetivo Principal:
Diante do exposto na revisão bibliográfica, o presente trabalho tem como
objetivos gerais:
Avaliar a homeostase de Ca2+ na levedura S. cerevisiae em diferentes
condições fisiológicas através da determinação das atividades das Ca2+-ATPases e
dos trocadores Ca2+/H+ das organelas de via secretória.
Estimar o papel da calcineurina sobre as atividades dos transportadores de
Ca2+ em condições normais e durante de estresse por alto Ca2+.
Objetivos Específicos: Isolar as populações das vesículas de membranas enriquecidas por
membranas das organelas da via secretória de S. cerevisiae usando a centrifugação
em gradiente de densidade de sacarose. Avaliar o nível da suposta contaminação
das membranas do Golgi, RE/MP e EN por membranas vacuolares.
Determinar as mudanças das atividades dos transportadores de Ca2+ nas
organelas da via secretória sobre o estresse por alto Ca2+ dependente do tempo.
Avaliar o papel da calcineurina nas mudanças das atividades dos
transportadores de Ca2+ nestas condições.
Reanalisar a contribuição da Ca2+-ATPase de Vacúolo (Pmc1p) em condições
de estresse por alta concentração de Ca2+.
Caracterizar o efeito da mutação do gene CNB1 da calcineurina sobre as
atividades dos transportadores de Ca2 + em S. cerevisiae na ausência de estresse
por alto Ca2+.
Avaliar a influência da inativação dos genes da Ca2+-ATPase de vacúolo
(pmc1) ou do trocador Ca2+/H+ vacuolar (vcx1::URA3) sobre a atividade dos
transportadores de Ca2+ de outras organelas.
Analisar se somente a Ca2+-ATPase do Golgi pode transportar Mn2+ ou se
diferentes Ca2+-ATPases e/ou trocadores Ca2+/H+ da via secretória de levedura
também transportam Mn2+. Determinar se a calcineurina pode aumentar a afinidade
das Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+ ao Mn2+.
29
3. MATERIAIS & MÉTODOS
3.1 Cepas de levedura
As cepas usadas nesse trabalho foram:
(1) cepas selvagens (“wild type strain”) de Saccharomyces cerevisiae: AA255,
K601, K699 (PMC1::HA – o gene PMC1, Ca2+-ATPase de vacúolo conjugado com
hemoaglutinina A);
(2) cepas mutantes: K699 (PMC1::HA – o gene PMC1, Ca2+-ATPase de
vacúolo conjugado com hemoaglutinina A); K603 (cnb1 – mutante nulo da
subunidade B da calcineurina), K605 (pmc1 – mutante nulo de Ca2+-ATPase de
vacúolo), K617 (vcx1::URA3 – mutante que não expressa a proteína Vcx1p, trocador
Ca2+/H+).
As cepas K601, K603, K605, K617 e K699 foram gentilmente cedidas pelo
Professor K.W. Cunningham (Johns Hopkins University). As cepas AA255 e X-2180
foram cordialmente fornecidas pelo Professor L. Lehle (Regensburg University).
3.2 Meio de cultura e manutenção da cepa
Foi utilizado o meio de cultura contendo: 1% de extrato de levedura
(Difco/Oxoid); 2% de glicose (Vetec); 2% de bactopeptona (Difco/Oxoid).
O meio YEPD sólido continha adicionalmente 2% de agar (Vetec). Os meios
foram autoclavados a 0,5 atm (marcados no nanômetro), 110 °C por 30 min. O meio
sólido foi vazado em placas de Petri e levado à estufa a 37 °C durante 24 horas para a
realização do controle de esterilidade. Após este procedimento, algumas colônias S.
cerevisiae foram retiradas do meio YEPD sólido de estocagem e semeadas em um
novo meio YEPD sólido, essas células cresceram a 30 °C por 72h.
3.3 Preparo do pré-inóculo
Algumas colônias de levedura foram retiradas do meio sólido YEPD e foram
inoculadas em 40 mL do meio YEPD líquido, de forma que a absorbância a 600 nm
(DO600nm) inicial do pré-inóculo no espectrofotômetro ficasse em torno de 0,1. As células
cresceram a 30 °C sob agitação constante de 250 rpm até a fase estacionária.
30
3.4 Preparo da levedura para o isolamento
O volume do pré-inóculo a ser adicionado em 200 mL do meio YEPD
(Erlenmeyers de 1000 mL) foi calculado, considerando o tempo de geração de cada
cepa utilizada, de acordo com a curva de crescimento. De forma que, após
aproximadamente 17 h a 30 °C em agitação de 250 rpm as células crescessem até o
meio da fase logarítimica (~ 3,0 DO600nm/mL). Após o cultivo celular, foi realizado o
isolamento das vesículas de membranas de S. cerevisiae.
3.5 Isolamento de membranas e fracionamento subcelular
O isolamento foi feito de acordo com o método descrito por Okorokov & Lehle
(1998) com modificações. O isolamento de membranas foi feito em três condições
diferentes ou com combinação entre elas:
(I) Com e sem pré-incubação dos esferoplastos com glicose, ou seja, antes que
estes fossem rompidos mecanicamente. Os esferoplastos foram incubados com
solução de glicose (50 mM Tris-HCl pH 7,2; 1,2 M Sorbitol; 10 mM KH2PO4, 3 mM
MgSO4; 100 mM glicose) por 10 min. (esquema 6). (II) As células foram pré-incubadas em meio YEPD (controle), em meio YEPD
complementado com 100 mM CaCl2 e em meio YEPD complementado com 100 mM
CaCl2 e 10 g/mL de ciclosporina A (CsA) por 2,5 horas a 30 °C em 250 rpm, a
ciclosporina A foi adicionada 2 h antes da adição do 100 mM CaCl2. Esse
experimento foi feito apenas com a cepa AA255 e os esferoplastos não foram
incubados com a solução de glicose (esquema 7). (III) As células cresceram com meio YEPD ou com meio YEPD com 150 ou 50 mM
CaCl2 a 30 °C na agitação de 250 rpm. Os experimentos cujos esferoplastos foram
incubados com a solução de glicose foram feitos separadamente (esquema 8).
31
3.5.1) Isolamento de membranas para a condição I (com e sem glicose)
As células cresceram até o meio da fase logarítmica.
Todos os procedimentos foram realizados no gelo. Soluções, tubos, rotores e
interior das centrífugas foram previamente resfriados.
3.5.1a) Obtenção de células
A cultura de suspensão celular foi centrifugada a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a
4 °C (centrifuga Himac CR21, rotor 29). Em seguida foi feito o descarte do meio e
determinado o peso úmido das células.
3.5.1b) Obtenção dos esferoplastos
Para cada 1 g de peso úmido de células foi adicionado 5 mL de tampão de
esferoplastos (1,2 M sorbitol, 10mM Tris, pH 7.4), de 1 a 4 mg do complexo
enzimático lítico (liticase (sigma), proporção 1 mg de liticase: 1g de peso úmido das
células), 12 µL -mercaptoetanol (concentração final 30 mM). Esta suspensão
celular em tampão de esferoplasto foi incubada a 37 °C sob fraca agitação.
O monitoramento cinético da hidrólise da parede celular foi realizado
espectrofotometricamente a DO600 nm, misturando 10 L desta suspensão celular em
990 L H2O. Este monitoramento foi feito a cada 5 ou 10 min a partir do tempo igual
a zero (tempo 0) de incubação até o tempo máximo de 50 min ou até que a
absorbância chegasse ao valor entre 20 a 10% do valor inicial (Tabela 2).
Após o término do monitoramento da hidrólise da parede celular, o tubo que
continha a suspensão de esferoplastos foi imediatamente transferido para o gelo e a
reação de hidrólise da parede celular foi finalizada pela adição da solução de parada
(“stop solution”), nas concentrações finais de 10 mM de Tris-HCl pH 7,4 e 1 mM de
Células de leveduras
Incubados por 10 min à 300C
Isolamento dos esferoplastoshidrólise enzimática da parede celular
Exp 1s/ 100 mM Glicose
Sedimentação de “debris”
Sedimentação das membranas totais
Fracionamento da membanas totais emgradiente de sacarose
Exp 2c/ 100 mM Glicose
Células de leveduras
Incubados por 10 min à 300C
Isolamento dos esferoplastoshidrólise enzimática da parede celular
Exp 1s/ 100 mM Glicose
Sedimentação de “debris”
Sedimentação das membranas totais
Fracionamento da membanas totais emgradiente de sacarose
Exp 2c/ 100 mM Glicose Esquema 6: Diagrama do isolamento
de membrana na condição I.
32
EDTA (1,2 M Sorbitol, 200 mM Tris-HCl pH 7,4, 20 mM EDTA estoque 20 vezes
concentrado), concentração final de 1 mM Benzamidina (200 mM estoque dissolvido
em etanol) e concentração final de 1 mM PMSF (200 mM estoque dissolvido em
metanol).
A suspensão de esferoplastos (~15 mL) foi adicionada sobre 30 mL de
camada da solução 1,4 M Sorbitol, 50 mM Tris-HCl pH 7,4 (“cushion solution”) no
tubo de centrifuga. A adição da suspensão de esferoplastos foi feita devagar e com
o auxílio de uma pipeta numa posição inclinada, para evitar a mistura da suspensão
de esferoplasto com a solução (cushion solution). Este material foi centrifugado a
5000 rpm (3000 x g) por 5 min a 4 °C (centrifuga Beckman coulter AllegraTM 6R).
Este passo de procedimento foi realizado com o objetivo de eliminar os resíduos de
enzimas líticas.
O sobrenadante foi cuidadosamente descartado e as paredes dos tubos
foram secas com papel filtro para evitar que possíveis enzimas líticas atuem nos
esferoplastos.
DO600nm Tempo
(min) 1a leitura
(imediatamente)
2a leitura
(após ~ 1min)
0 0,395 0,366
5 0,405 0,369
10 0,394 0,333
20 0,300 0,197
30 0,276 0,116
35 0,234 0,082
3.5.1c) Pré-incubação dos esferoplastos com glicose
O sedimento (esferoplastos) foi dividido em duas partes. Uma foi incubada
com a solução de glicose (50 mM Tris-HCl pH 7,2; 1,2 M Sorbitol; 10 mM KH2PO4, 3
mM MgSO4, 100 mM glicose) e a outra foi incubada com a mesma solução só que
na ausência de 100 mM glicose por 10 min a 30 °C.
Tabela 2: Exemplo de como se controla cineticamente o rompimento da
parede celular de leveduras por hidrólise enzimática.
33
Após a incubação, a suspensão de esferoplastos incubada com solução de
glicose foi centrifugada a 5000 rpm (3000 x g) por 5 min a 4 °C (centrifuga Beckman
coulter AllegraTM 6R).
O sedimento de esferoplastos de ambas as versões foram ressuspensas em
20 mL de tampão de lise (12,5% de sacarose, MOPS 20 mM pH7,4); 1 mM DDT,
1g/mL coquetel de inibidores de proteases (solução estoque do coquetel de
inibidores de proteases é composta por: quimistatina, pepstatina, antipaina,
leupeptina, aprotinina na concentração de 1 mg/mL cada um), 1 mM benzamidina
(200 mM estoque), 1 mM PMSF (200 mM estoque).
3.5.1d) Obtenção de membranas totais
A ressuspensão foi homogeneizada, em homogeneizador de vidro com pistilo
de teflon (“potter”), com 21 ciclos completos (“strokes”). O homogeneizado foi
transferido para o tubo de centrífuga (centrifuga Beckman coulter AllegraTM 6R) e
centrifugado a 5000 rpm (3000 x g) por 5 min a 4 °C.
O sedimento foi desprezado e o sobrenadante (suspensão de membranas
totais) foi transferido para o tubo da ultracentrífuga (Himac 75, rotor P50A2) e
centrifugada a 30000 rpm (45000 x g) por 45 min a 4 °C.
O sedimento (membranas totais) foi ressuspenso em aproximadamente 1,5
mL (dependente do conteúdo de membranas) da solução de membranas totais (MT)
(10 mL de solução de lise, na presença de 1 g/mL de coquetel de inibidores de
proteases. E em tentativa de evitar choque osmótico foi adicionado 1,17 g de glicerol
a solução de MT. Este volume foi adicionado gradativamente, ou seja, o volume foi
transferido aos poucos, geralmente de 300 em 300 L misturando bem, até que o
volume final determinado fosse atingido. A ressuspensão de membranas totais foi
colocada no homogeneizador de vidro com o pistilo de teflon (“potter”) e
homogeneizada com 7 ciclos completos (“strokes”).
3.5.1e) Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente de densidade de sacarose
Foi colocado de 1 a 1,3 mL de ressuspensão de membranas totais sobre um
gradiente descontínuo de sacarose entre as concentrações de 20 a 56% (cada
concentração de sacarose foi diluída peso/peso (p/p) em solução de sacarose (10
mM MOPS-NaOH pH 7,2). O gradiente foi centrifugado a 27000 rpm (140000 x g)
34
por 2 horas e 45 minutos a 4°C (centrífuga Himac 75, rotor P28S). O volume de
membranas totais restante foi aliquotado em tubo cônicos de 1,5 mL (“eppendorfs”),
congelado em nitrogênio líquido e armazenado no freezer a temperatura de 70 °C
negativos (Freezer –70 °C) até que as análises fossem realizadas.
As vesículas de membranas que foram separadas no gradiente descontínuo
de sacarose foram fracionadas pela introdução de um capilar de vidro até o fundo do
tubo de centrífuga, onde as membranas separadas no gradiente descontínuo de
sacarose se encontravam. Foram coletadas 10 gotas de vesículas de membranas
separadas em gradiente de sacarose. Esta coleta foi realizada do fundo para a
superfície do tubo com o auxílio de uma bomba peristáltica e um coletor de frações,
ou seja, as primeiras frações de vesículas de membranas representam as vesículas
de membranas mais densas e as últimas frações foram às vesículas de membranas
menos densas. Após o fracionamento, as frações de vesículas de membranas foram
congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas no freezer a temperatura de 70 °C
negativos (Freezer –70 °C) até que essas amostras fossem analisadas.
3.5.2) Isolamento de membranas para a condição II (com YEPD; comYEPD+CaCl2; com YEPD+CaCl2+CsA)
A condição II para o isolamento de membranas só foi feita com as células da
cepa AA255 de S. cerevisiae, que cresceram até o meio da fase logarítmica.
Isolamento dos esferoplastoshidrólise enzimática da parede celular
Sedimentação de “debris”
Sedimentação das membranas totais
Fracionamento das membanas totais emgradiente de sacarose
Lavagem das células
Exp 1 Exp 2 Exp 3YEPD YEPD YEPD
10g/mL CsA
Células de leveduras
2,5 h, 30 oC, 250 rpm
Exp 1 Exp 2 Exp 3Adição de: H2O 100mMCaCl2 100mMCaCl2
2,5 h, 30 oC, 250 rpm
Isolamento dos esferoplastoshidrólise enzimática da parede celular
Sedimentação de “debris”
Sedimentação das membranas totais
Fracionamento das membanas totais emgradiente de sacarose
Lavagem das células
Exp 1 Exp 2 Exp 3YEPD YEPD YEPD
10g/mL CsA
Células de leveduras
2,5 h, 30 oC, 250 rpm
Exp 1 Exp 2 Exp 3Adição de: H2O 100mMCaCl2 100mMCaCl2
2,5 h, 30 oC, 250 rpm
Esquema 7: Diagrama do isolamento de membrana na condição II.
35
A cultura de suspensão celular foi centrifugada a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a
4 °C (centrifuga Beckman coulter AllegraTM 6R). O meio foi desprezado e as células
(sedimento) foram ressuspensas em três Erlenmeyers contendo cada um 200 mL de
meio YEPD. O primeiro (controle) com 200 mL de meio YEPD; o segundo
(CsA/Ca2+) com 200 mL de meio YEPD complementado com 10 g/mL de
ciclosporina A (CsA - antagonista da calcineurina) e o terceiro (Ca2+) com 200 mL de
meio YEPD foram incubados por 2 a 2,5 h a 30 °C sobre agitação constante de 250
rpm. Após esse tempo de incubação foi adicionado ao segundo e terceiro frasco
(CsA/Ca2+ e Ca2+) 100 mM de CaCl2. A partir deste momento as 3 versões foram
incubadas por mais 2,5 horas a 30 °C sobre agitação de 250 rpm.
3.5.2a) Obtenção de células
Após o tempo de incubação com o CaCl2 (estresse pelo Ca2+), os meios com
suspenção de células “controle”, células incubadas com CaCl2 e as células
incubadas com CsA/Ca2+, foram centrifugadas a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a 4 °C
(centrifuga Beckman coulter AllegraTM 6R).
As células controle (incubadas somente com YEPD) foram mantidas no gelo.
Enquanto que as células incubadas com CaCl2 ou com CsA/Ca2+ foram lavadas com
solução de lavagem I (100 mM EDTA-NaOH pH 7,2) e centrifugadas a 5000 rpm
(4000 x g) 5 min a 4 °C (centrifuga Beckman coulter AllegraTM 6R). A segunda
lavagem foi feita com a solução de lavagem II (25 mM EDTA, 1 mM EGTA pH7,2) e
centrifugada a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a 4 °C (centrifuga Beckman coulter
AllegraTM 6R).
A terceira lavagem foi feita com a solução III (5 mM Tris-HCl pH 7,2) tanto nas
células que foram incubadas com CaCl2, tanto nas que foram incubadas com
CsA/Ca2+ quanto nas que foram incubadas somente com o meio YEPD (“células
controle”) e centrifugadas a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a 4 °C (centrifuga Himac
CR21, rotor 29). Em seguida a solução de lavagem III foi descartada e o peso úmido
das células foi determinado.
3.5.2b) Obtenção dos esferoplastos
Este passo seguiu o protocolo descrito no item 3.5.1b.
36
3.5.2c) Obtenção de membranas totais
O sedimento (esferoplastos) que não foi pré-incubado com glicose, foi re-
suspenso com 20 mL de tampão de lise (12,5% de sacarose, MOPS 20 mM pH7,4);
1 mM DTT, 1 g/mL coquetel de inibidores (solução estoque do coquetel de
inibidores: aprotinin, quimistatina, pepstatina, antipaina, leupeptina, cada 1 mg/ml), 1
mM benzamidina (200 mM estoque), 1 mM PMSF (200 mM estoque). Seguido do
passo descrito no item 3.5.1d.
3.5.2d) Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente
de sacarose
Este passo seguiu o protocolo descrito no ítem 3.5.1e.
3.5.3) Isolamento de membranas para a condição III (crescimento das células com: YEPD; YEPD+CaCl2)
As células cresceram em meio YEPD complementado ou não com 150 ou 50
mM de CaCl2 até o meio da fase logarítmica.
3.5.3a) Obtenção de células
Após o crescimento celular com ou sem CaCl2, a suspensão celular foi
centrifugada a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a 4 °C (centrifuga Beckman coulter
AllegraTM 6R).
As células que não cresceram com CaCl2 foram mantidas no gelo, enquanto
que as células que cresceram com CaCl2 foram lavadas com solução de lavagem I
Incubação por 10 min à 300C c/ 100 mM Glicose
Lavagem das células
Isolamento dos esferoplastos
Homogeneização dos esferoplastos
Sedimentação das membranas totais
Fracionamento das membanas totais emgradiente de sacarose
Versão 1 Versão 2crescimento em YEPD crescimento em YEPD
+150 ou 50 mMCaCl2
Incubação por 10 min à 300C c/ 100 mM Glicose
Lavagem das células
Isolamento dos esferoplastos
Homogeneização dos esferoplastos
Sedimentação das membranas totais
Fracionamento das membanas totais emgradiente de sacarose
Versão 1 Versão 2crescimento em YEPD crescimento em YEPD
+150 ou 50 mMCaCl2
Esquema 8: Diagrama do isolamento de membrana na condição III.
37
(100 mM EDTA-NaOH pH 7,2) e centrifugadas a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a 4 °C
(centrifuga Beckman coulter AllegraTM 6R). Após a primeira lavagem, as células
foram lavadas com solução de lavagem II (25 mM EDTA, 1 mM EGTA pH7,2) e
centrifugado a 5000 rpm (4000 x g) 5 min a 4 °C (centrifuga Beckman coulter
AllegraTM 6R).
A terceira lavagem foi feita com a solução IV (água destilada pH 7,0) tanto
nas células que cresceram ou não com CaCl2 e centrifugadas a 5000 rpm (4000 x g)
5 min a 4 °C (centrifuga Beckman coulter AllegraTM 6R). Em seguida foi feito o
descarte da solução de lavagem IV e determinado o peso úmido das células.
3.5.3b) Obtenção dos esferoplastos Este passo seguiu o protocolo descrito no item 3.5.1b.
3.5.3c) Pré-incubação dos esferoplastos com glicose
A supensão de esferoplastos incubada com a solução de glicose repete o
protocolo descrito no item 3.5.1c. E os experimentos cujos esferoplasto não foram
incubados com glicose, seguem a seqüência experimental de obtenção de MT.
3.5.3d) Obtenção de membranas totais Este passo seguiu o protocolo descrito no item 3.5.1d.
3.5.3e) Obtenção de membranas intracelulares fracionadas em gradiente de sacarose
Este passo seguiu o protocolo descrito no item 3.5.1e.
3.6) Determinação do transporte de 45Ca+2
O ensaio de captação de 45Ca2+ em membranas de levedura foi realizado
seguindo o protocolo descrito por Okorokov & Lehle (1998) com modificações. Para a
determinação da cinética de captação de 45Ca2+ foi utilizado a solução de incubação (10
mM MOPS-KOH, pH 7,2, 160 mM de KCl, 5 mM de MgSO4; 9,8 M EGTA; 10,3 M
CaCl2; 0,5 Ci 45Ca2+) nas seguintes condições: (1) na ausência de 1 mM ATP-Mg
(s/ATP); (2) na presença de 1 mM ATP-Mg (ATP-FCCP); (3) na presença de 1 mM
ATP-Mg e diversas concentrações totais de MnCl2 (ATP+Mn2+); (4) na presença de 1
mM ATP-Mg e 1 M de FCCP (ATP+FCCP); (5) na presença de 1 mM ATP-Mg e 1 M
38
de FCCP (ATP+FCCP) (usado para bloquear a atividade do trocador Ca2+/H+) e
diversas concentrações totais de MnCl2 ((ATP+FCCP+Mn2+).
No ensaio de cinética, a captação de Ca2+ foi analisada nos tempos de 1, 3, 5,
10, 15 e 30 min. Foi adicionado em 20 L de suspensão de membranas totais 1,1 mL
dos respectivos meio de incubação com 45Ca2+ e incubado a 30 ºC. Aproximadamente
15 segundos antes de terminar cada tempo de incubação, uma alíquota de 150 L da
solução incubada com a amostra foi retirada e exatamente ao terminar o tempo de
incubação esta alíquota foi injetada em aproximadamente 18 ml do solução de lavagem
(10 mM MOPS-KOH, pH 7,2; 342 mM de KCl; 5 mM de MgSO4) gelado, que já se
encontrava dentro do sistema de filtração. Na tentativa de deixar as vesículas de
membranas mais estáveis, evitando choques osmótico, foi adicionado a solução de
lavagem 345 mM de sorbitol.
As amostras foram então filtradas através de filtros de nitrocelulose (0,45 m)
com o auxílio de uma bomba de vácuo, imediatamente ao fim da filtração foi adicionado
aproximadamente o mesmo volume do tampão de lavagem anterior num processo de
lavagem das paredes do sistema de filtração. Após a lavagem, os filtros foram retirados
secos e colocados em frasco apropriados para o cintilador (“vial”) contendo
aproximadamente 4 mL de líquido de cintilação (27 mM PPO, 55 M POPOP
dissolvidos em 1 L de tolueno) e a radioatividade associada ao filtro de nitrocelulose foi
quantificada por contagem no cintilador (1600 TR Liquid Scintillation Analyzer –
PAKARD) em meio líquido de cintilação, ou seja, o que foi quantificado foi 45Ca2+
captado nas vesículas de membranas que se associaram com o filtro nitrocelulose.
O mesmo procedimento foi utilizado para as membranas fracionadas em
gradiente de sacarose, porém 30 L de vesículas de membranas fracionadas foram
usados para 180 L de solução de incubação de 45Ca2+, esta solução de incubação foi
incubada a 30 °C por 10 min. Após este tempo, 180 L da solução incubada foi retirado
e filtrado. E procederam-se as lavagens como descrito acima para membranas totais.
A atividade das Ca2+-ATPases foi determinada pelos valores encontrados na
captação de 45Ca2+ feito na presença de 1 mM de ATP e 1 M de FCCP (ATP+FCCP).
A atividade do trocador Ca2+/H+ foi determinada subtraindo valores obtidos na captação
de 45Ca2+ feita na presença de 1 mM de ATP (ATP-FCCP) dos valores obtidos na
captação de Ca2+ feito na presença de FCCP (ATP+FCCP). A adição de MnCl2, na
determinação das Ca2+-ATPases e trocador Ca2+/H+, foi utilizada como estratégia de
análise para verificar se os transportadores de Ca2+ podem ou não transportar o Mn2+.
39
Dessa forma o Mn2+ iria competir com o Ca2+ pelo mesmo sítio de ligação nos
transportadores de Ca2+, a captação de 45Ca2+ na presença de MnCl2 foi determinada
no tempo de 10 e/ou 15 min com no mínimo três repetições para cada determinação.
3.7) Determinação do conteúdo de proteína
O conteúdo de proteína foi determinado seguindo o protocolo descrito por
Bradford (1976) e modificado por Read & Northcote (1981) usando BSA como padrão.
O reagente de Bradford foi preparado a partir da adição de 12 mL de etanol
absoluto a 28 mg de Comassie Brilliant Blue G 90%, que foi deixado sob agitação
por 1 hora, protegido da luz. Após este tempo foi adicionada à solução 25 mL de
ácido ortofosfórico 85%, que foi homogeneizado. Após homogeneização, o volume
foi completado para 250 mL com água destilada e a solução foi misturada. Esta
solução foi filtrada por 4 vezes em filtro de papel. A solução de Bradford foi
armazenada em vidro âmbar na geladeira. 1 mg/mL de albumina de soro bovino foi
utilizado como padrão de proteína.
Para determinar a curva padrão de proteína, foram retirados volumes entre 2
a 20 L da solução de albumina (1 mg/mL) e estes foram completados com
quantidade suficientes para 100 L de volume final com água destilada. Após este
procedimento foi adicionado 1 mL da solução de Bradford. Cada reação permaneceu
a temperatura ambiente 10 min exatos (isto é, havia um intervalo de 30 segundo
entre os tubos onde ocorriam as reações). Após este tempo, procederam-se as
leituras de cada amostra no espectrofotômetro no 595 nm com mesmo intervalo de
30 segundos.
O conteúdo de proteína foi determinado tanto nas membranas totais quanto
nas membranas fracionadas utilizando 5 a 15 L de suspensão de membranas e
completando o volume para 100 L com água destilada e adicionando 1 mL da
solução de Bradford. Aguardando exatamente 10 min e procedendo as leituras no
espectrofotômetro no 595 nm. Para os valores do conteúdo de proteína que
ficaram fora da faixa de linearidade ou próximo a extremidade da curva padrão,
foram realizados os seguintes procedimentos: (1) ou aumentou-se o conteúdo de
membranas; (2) ou as membranas foram diluídas com água destilada; a fim de que
suas leituras permanecessem, preferencialmente, entre os valores médios
estabelecidos na curva padrão.
40
3.8) Curva padrão de fosfato inorgânico (Pi) para as determinações
fosfohidrolíticas de pirofosfato (PPi) e GDP.
A solução estoque de 0,5 mol/mL de KH2PO4 (este sal foi previamente
desidratado a uma temperatura entre 40 °C a 60 °C por 2 – 3 h) foi usado como padrão
do conteúdo de fosfato inorgânico (Pi). Volumes entre 50 e 1000 L dessa solução
foram utilizados para determinar a curva padrão. Os volumes abaixo de 1000 L foram
completados com quantidade suficiente de água destilada para completar o volume final
de 1 mL. A solução de Pi foi incubada a 30 °C por 30 min. Após esta incubação, 2,0 mL
da solução C (descrita logo abaixo) foram adicionados (com 30 s de intervalo de um
tubo de reação para outro). Cada amostra foi incubada por exatamente 10 min a 30 ºC
seguida imediatamente da leitura no espectrofotômetro no 750 nm.
A solução C consiste de uma mistura 100:1 da solução A e a solução B, que
deve ser preparada próximo à adição desta na reação (solução A: 0,5% molibdato de
amônio, 0,5% SDS, 2% H2SO4; solução B: 10% ácido ascórbico). A solução C foi
utilizada em iguais condições e proporções para as determinações de hidrólise do ATP,
PPi, GDP.
Todas as determinações de fosfohidrolases foram feitas com os respectivos
controles, que continham iguais meios de reação, porém na ausência de proteínas
(vesículas de membranas). Portanto, o resultado das atividades fosfohidrolíticas
encontrado em cada fração de membranas, foi referente à diferença entre as atividades
“brutas” de cada fração com a atividade de seu respectivo controle.
3.9) Determinação hidrolítica do pirofosfato (PPi) (Pirofosfatase de membrana
(PPiase) – enzima marcadora de membranas do vacúolo)
Existem dois tipos de pirofosfatases (PPiase), solúvel e ligada à membrana. Para
determinar a atividade da PPiase de membrana, a medida da atividade hidrolítica dessa
enzima foi feita na presença de 100 mM de sorbitol a fim de manter a osmolaridade e
integridade das vesículas de membranas.
A atividade pirofosfatásica de membrana foi detectada pelo aumento da
quantidade de fosfato inorgânico (Pi) resultante da hidrólise do pirofosfato inorgânico
(PPi), na presença de 100 mM sorbitol.
O preparo dos ensaios de hidrólise de PPi foi feito no gelo, colocando nos tubos
20 L suspensão de vesículas membranas em 670 L da solução D (30 mM MOPS-
KOH pH 7,2; 3,75 mM MgSO4; 262 M Molibdato de amônio; solução estoque para
41
obter as concentrações finais de 21,6 mM MOPS-KOH pH 7,2, 1,98 mM MgSO4, 180
M Molibdato de amônio), 200 L Sorbitol 500 mM (concentração final 100 mM) e 50
L PPi pH 7,2 (concentração final 1 mM). As amostras foram incubadas por 30 min a
30 °C. Após esta incubação, os tubos nos quais ocorriam a reação (amostras) foram
recolocados no gelo e 2,0 mL da solução C foram adicionados a cada um destes (com
30 s de intervalo de um tubo de reação para outro). Cada amostra foi incubada por
exatamente 10 min a 30 °C seguida imediatamente da leitura no espectrofotômetro no
750 nm.
3.10) Determinação de GDPase (enzima marcadora de membranas do Golgi)
A atividade GDPásica foi detectada pelo aumento da quantidade de fosfato
inorgânico (Pi) resultante da hidrólise de GDP seguindo o método descrito por Albeijon
et al. (1989). A preparação da determinação de GDPase foi feita no gelo, colocando 10
L de 200 mM imidazol pH 7,4; 10 L de 1% triton X-100; 2L de 40 M CaCl2; 10 L
de 70 mM GDP; 48 L de água destilada; 20 L de suspensão de membranas. As
amostras foram incubadas a 37 °C por 30 min. Após este tempo, as amostras
retornaram ao gelo e foram adicionados 10 L de 5% SDS (resfriado) a fim de paralisar
a reação e 880 L de água destilada gelada. Após a adição da água, 2,0 mL da solução
C foram adicionados (com 30 s de intervalo entre um tubo de reação para outro).
Cada reação foi incubada por exatamente 10 min a 30 °C seguida imediatamente da
leitura da absorbância no 750 nm.
3.11) Determinação de NADP-H citocromo “c” oxido-redutase (enzima marcadora do retículo endoplasmático, RE)
A atividade da NADP-H citocromo “c” oxido-redutase foi determinada segundo o
método de Feldman e colaboradores (1987). A analise é realizada por uma reação de
cinética enzimática. A determinação foi feita diretamente na cubeta com 900 L da
solução de citocromo “c” na presença de KCN (0,6 M Sorbitol; 50 mM KH2PO4 pH 7,4;
400 M KCN; 1 mg/mL citocromo “c”) pré-aquecida a 30 °C, 100 L da solução de
NADP-H (0,6 M Sorbitol; 50 mM KH2PO4 pH 7,4; 1 mM NADP-H) e 30 L de frações de
vesículas de membranas separadas em gradiente de sacarose. O tempo da reação foi
iniciado quando as frações de vesículas de membranas foram adicionadas na solução a
cubeta foi invertida aproximadamente 3 vezes (para misturar os componentes da
reação). A primeira leitura da cinética foi feita no tempo de 10 s após a introdução das
42
vesículas de membranas. As leituras da absorbância foram feitas no 550 nm com
intervalos de 5 s até completar o tempo de 180 s.
As absorbâncias encontradas no 550 nm foram tratadas da seguinte forma: (1)
cada DO encontrada no 550 nm entre os intervalos de 5 s foi colocada no papel
milimetrado; (2) os pontos lineares da curva foram considerados (geralmente os
primeiros pontos); (3) foi traçado uma reta de tendência, que foi utilizada para o cálculo
da atividade; (4) foi encontrado o s (a diferença entre o ponto inicial e o ponto final na
reta de tendência) para o tempo de 1 min; (5) a velocidade enzimática foi determinada
pela razão do s e o t (1 min). A unidade da velocidade enzimática desta enzima foi
especificada como, unidades relativas/min.
3.12) Determinação da fosfatase alcalina (enzima marcadora do vacúolo)
A atividade da fosfatase alcalina foi determinada segundo o método de Mitchell e
colaboradores (1981). A preparação da determinação da fosfatase alcalina foi feita no
gelo, colocando 465 L da solução de reação (250 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,4% triton X-
100, 100 mM MgCl2, 1 mM pNPP (substrato fosfatase – Sigma) e 20 L de suspensão
de membranas separada em gradiente de densidade de sacarose. O volume final da
reação é de 500 L, portanto foi adicionado mais 15 L de água destilada a reação. As
amostras na solução de reação foram incubadas a 30 °C por 5 min. Após este tempo,
as amostras retornaram ao gelo e foram adicionados 500 L de solução de parada (1 M
glicina-KOH pH 11). Após a adição da solução de parada, a absorbância de cada
reação determinada espectrofotometricamente no 400 nm.
3.13) Imunoensaio (Imunoresposta de Pmc1p::HA por dot blotting)
Em um pedaço de membrana de nitrocelulose foram marcados quadrantes de
1 cm2. Essa membrana de nitrocelulose foi embebida em tampão PBS (10 mM de
Na2HP04, pH 7,6 contendo 0,9% NaCI) por alguns minutos até que estivesse
completamente umedecida. A membrana de nitrocelulose ficou reservada sobre um
papel de filtro em local limpo e seco por algumas horas, até que a membrana de
nitrocelulose estivesse completamente seca.
O gene da Ca2+-ATPase de vacúolo, PMC1, da cepa K699 foi conjugada com
o gene da hemoaglutina A. Portanto, o critério de seleção das frações para o imuno
ensaio foi feita de acordo com o pico de atividade das Ca2+-ATPases encontrada ao
longo da distribuição das membranas em gradiente de densidade de sacarose. Em
43
cada quadrante de 1 cm2 foram aplicadas 10 L de membranas de levedura
separadas em gradiente de sacarose da cepa K699. A aplicação dos 10 L de
membranas da cepa K699, ocorreu de forma que fossem gotejadas
perpendicularmente sobre um dos quadrantes marcado na membrana de
nitrocelulose e se espalhassem uniformemente, formando um círculo com bordas
regulares. Aguardou-se o tempo suficiente para que as amostras ficassem secas
completamente.
Após a secagem das amostras, a membrana de nitrocelulose foi embebida
em tampão PBS + 5 % leite comercial desnatado (Molico), em temperatura ambiente
por 1 h, a fim de bloquear a região da membrana que não contém a proteína
aplicada.
A membrana de nitrocelulose foi colocada em uma placa de Petri de modo a
ficar imersa em tampão PBS, contendo anticorpo primário monoclonal contra a
hemoaglutinina A (HA) (IgG de camundongo contra HA - Amersham Pharmacia
Biotech) que está conjugada ao gene da Ca2+-ATPase de vacúolo, PMC1. O
anticorpo contra HA foi diluído na proporção de 1:1000, 1:2500 ou 1:5000 v/v. A
membrana de nitrocelulose ficou em agitação por 30 minutos na presença do
anticorpo primário e após os 30 min. a placa de Petri contendo as amostras retidas
na membrana de nitrocelulose embebida com o anticorpo primário foi armazenado
durante a noite na geladeira.
No dia seguinte, a placa de petri que incubou as amostras na presença do
anticorpo primário foi retirada da geladeira e colocada em agitação por 30 min. a
temperatura ambiente. Logo em seguida, iniciou-se o procedimento de lavagem da
membrana de nitrocelulose com tampão PBS + 5% de leite por 1 h, trocando a cada
15 min. em agitação.
Após esse procedimento, a membrana de nitrocelulose foi incubada por 1 h
em agitação a temperatura ambiente com o anticorpo secundário (anti-camundongo
conjugado com peroxidade - Amersham Pharmacia Biotech) na proporção de 1:1000
v/v em tampão PBS + 5 % de leite.
Após a incubação, a solução que continha o anticorpo secundário foi
descartada e a membrana de nitrocelulose foi lavada em tampão comercial
desnatado em agitação por 30 minutos, a troca dessa solução foi efetuada a cada 10
min. Após a lavagem da membrana de nitrocelulose em tampão PBS + 5 % de leite,
44
essa membrana de nitrocelulose foi lavada em tampão PBS por 30 min efetuando a
troca dessa solução a cada 5 min.
A imunoresposta foi revelada através da imersão da membrana de
nitrocelulose na solução de revelação (1 mM Tris-HCI pH 7,4, contendo 0,1 M
Imidazol, 4,7 mM DAB, 30% H202 e H20) em local escuro por alguns minutos, sob
vigilância constante, até que se pudesse observar “as gotas” de aplicação da
amostra. A partir desse momento a membrana de nitrocelulose foi retirada da
solução de revelação e imediatamente lavada com água destilada em abundância e
colocada para secar.
A quantificação do conteúdo de HA foi analisada pelo Professor Cláudio
Retamal, pela quantificação das manchas (“dot”) e desprezando o “background”
(Retamal et aI, 1999).
3.14) Determinação da concentração de sacarose
A determinação da concentração de sacarose foi feita no refratômetro
(Milton Roy Company), este aparelho teve com padrão a densidade da água. O
aparelho foi calibrado da seguinte maneira: (1) foram colocados aproximadamente 20
L de água destilada; (2) o aparelho foi acertado para densidade da água 1 g/L. Após a
calibração do aparelho, foram colocados aproximadamente 20 L de frações de
vesículas de membranas separadas em gradiente de densidade de sacarose e a leitura
indicada no aparelho foi anotada. O refratômetro oferece duas unidades de medida, o
índice de refração e a concentração em porcentagem. As leituras foram feitas à
temperatura ambiente de 26 a 28 °C.
45
4. RESULTADOS
4.1 - Identificação das membranas intracelulares da via secretória de S.
cerevisiae
Nosso trabalho visa, principalmente, o estudo do transporte iônico.
Primeiramente, as análises dos transportes de Ca2+ foram realizadas nas frações de
membranas separadas em gradiente descontínuo de densidade de sacarose (Fig. 1;
Figs dos capítulos posteriores) seguida de posterior análise de identificação das
frações de membranas enriquecidas por membranas do vacúolo, Golgi e retículo
endoplasmático (RE).
A atividade do transporte de 45Ca2+ foi a primeira análise feita nas frações de
membranas separadas em gradiente de densidade de sacarose, que foram
congeladas e armazenadas no freezer a temperatura de menos 70 °C. Pois essas
enzimas podem ser mais sensíveis que as enzimas marcadoras e, portanto, a
análise realizada após um segundo descongelamento poderia promover a perda da
atividade dos transportadores de Ca2+ (Fig. 1, outras Fig. subseqüentes).
Posteriormente, ocorrem as análises de identificação das frações de membranas do
vacúolo, Golgi e retículo endoplasmático (RE).
A atividade dos transportadores de Ca2+, Ca2+-ATPases e trocador Ca2+/H+,
foi encontrada em todos os compartimentos intracelulares da via secretória de
levedura (Fig. 1; Figs dos próximos capítulos) (Okorokov et al., 1995a; Okorokov et
al., 1995b; Okorokov &Lehle, 1998; Okorokov et al, 2001; Silva, 2003; Ribeiro,
2007). Apenas dois genes foram identificados para Ca2+-ATPase, PMR1 (Ca2+-
ATPase de Golgi) e PMC1 (Ca2+-ATPase de vacúolo) e apenas um único gene foi
identificado como trocador Ca2+/H+, VCX1 (trocador Ca2+/H+ de vacúolo)
(Cunningham & Fink, 1994; Okorokov et al, 1995; Cunningham & Fink, 1996; Sorin et
al, 1997 Catty et al , 1997). Entretanto, o gene SPF1/COD1 esta sendo proposto
como uma provável Ca2+-ATPase de RE (Cronim et al., 2002).
Devido a ausência de identificação de outros genes tanto para as Ca2+-
ATPases como para trocadores Ca2+/H+ levaram alguns pesquisadores sugerirem
que a atividade dos transportadores de Ca2+ em outras membranas é devido a
contaminação desta por membranas do vacúolo e/ou Golgi. Por este motivo, a
identificação das membranas é tão importante.
46
A atividade da GDPase foi utilizada para identificar as frações de vesículas de
membranas enriquecidas por membranas do Golgi (Fig. 2) uma vez que esta enzima
é uma das responsáveis pelo processo de glicosilação no Golgi (Albeijon et al.
1989). Na Figura 2A pode ser observado que a atividade da GDPase foi encontrada
entre as frações 30 e 47 de vesículas de membranas de células que não foram
incubadas com Ca2+. Essa atividade também foi encontrada entre as frações 29 e 45
de vesículas de membranas isoladas de esferoplastos, cujas células foram
incubadas com Ca2+ (Fig. 2B). Ainda vale a pena enfatizar, que apesar da atividade
GDPase ter sido encontrada em intervalos diferentes de frações de vesículas de
membranas, estas migraram entre as mesmas concentrações de sacarose de 25 e
39% (Fig. 2, Tabela 3). Juntos estes resultados mostram que estas frações de
vesículas de membranas correspondem às frações de vesículas de membranas
enriquecidas pelas membranas do Golgi.
Para identificar as frações de membranas enriquecidas por membrana do RE,
a cinética enzimática da NADPH citocromo c oxiredutase foi utilizada como enzima
marcadora (Fig. 2) (Feldeman et al., 1987; Antebi & Fink, 1992; Okorokov &
Lehle,1998; Okorokov et al., 2001; Okorokova-Façanha et al., 2002; Martin et al.,
2005), embora tenhamos o conhecimento que as frações de vesículas da MP
comigram com as vesículas de membranas do RE (Okorokov et al., 1997). O pico de
atividade da NADPH citocromo c oxiredutase foi de 55% encontrada entre as frações
11 – 30 que migraram entre a concentração de sacarose de 39 - 50% (p/p) em
frações de membranas enriquecidas por membranas do RE de células que não
foram estressadas com Ca2+ extracelular (Fig. 2A). Já 52% da atividade de NADPH
citocromo c oxiredutase foi encontrada entre as frações 11 – 28 de células
estressadas com Ca2+ extracelular (Fig. 2B) que também migram entra o mesmo
intervalo de concentração de sacarose de células não estressadas por Ca2+
extracelular. Aproximadamente 55% da atividade de NADPH citocromo c oxiredutase
também foi encontrada entre as frações membrana 11 – 32 de cada uma das cepas,
selvagem (K601; Fig. 2C) e na mutante de calcineurina (cnb1 - K605; Fig. 2D)
migrando no mesmo intervalo de concentração de sacarose. Faz-se necessário
relembrar que, independente do número de frações estas vesículas de membranas
migraram no mesmo intervalo de concentração de sacarose, de 39 a 50% (Tabela 1;
Samarão et al., 2009).
47
Vale a pena observar que a atividade de NADPH citocromo c oxiredutase não
apresentou um pico bem significativo, pois provavelmente essa atividade pode ser
encontrada em outras membranas. Portanto, lembramos que manosil transferase é
uma enzima específica das membranas do RE e migra na concentração de sacarose
entre 39 – 49%, porém seu custo é alto (Strahl-Bolsinger et al., 1993; Samarão et al.,
2009).
A atividade da fosfatase alcalina analisada foi utilizada para identificar as
frações de vesículas de membranas enriquecidas por membranas do vacúolo. O
pico da atividade da fosfatase alcalina foi encontrado entre as frações 35 e 43 de
membranas isoladas de células da cepa selvagem K699 de S. cerevisiae (Fig. 3).
Cabe aqui destacar que nesse experimento não foi realizado a sedimentação das
MT, ou seja, a separação membranar foi feita a partir do homogenato de
esferoplastos. Foi adicionado 3 mL desse homogenato sobre o gradiente de
densidade de sacarose e por esse motivo as 10 últimas frações do gradiente
aproximadamente, refere-se as vesículas de membranas menos densas que o
vacúolo, provavelmente, vesículas secretórias e/ou endossomas.
Para confirmar que o processo de fracionamento celular separou
eficientemente duas populações de vesículas de membranas menos densas,
membranas do Golgi e vacúolo, foi determinado a imunoresposta da Pmc1p::HA
(Ca2+-ATPase de vacúolo). Tanto a atividade da Ca2+-ATPase quanto a do trocador
Ca2+/H+ vacuolar comigra com o pico da imunoresposta do Pmc1p::HA entre as
frações 35 - 43 que são enriquecidas por membranas vacuolares (Fig. 4).
Após a determinação da concentração da densidade de sacarose das frações
de membranas e a identificação das membranas pela atividade das enzimas
marcadoras e por imunodetecção do Pmc1p::HA podemos determinar que as
frações de membranas enriquecidas por membranas do vacúolo, Golgi, retículo
endoplasmático/membrana plasmática (RE/MP) e membranas mais pesadas que o
RE/MP, provavelmente membranas do envelope nuclear/retículo
endoplasmático/membrana plasmática (EN) migram entre as seguintes
concentrações de sacarose, respectivamente: 14 a 25, 25 a 39, 39 a 50 e 50 a 56
(Tabela 2; Okorokov et al., 2001; Samarão et al., 2009).
A Tabela 3 serve para destacar a concentração de sacarose em que as
vesículas de membranas de diferentes compartimentos migraram durante o
processo de fracionamento. Pois isolamentos de membranas independentes variam
48
quanto ao número de frações, mas a concentração de sacarose em que essas
frações de vesículas de membranas comigraram permanecem as mesmas
(Maeshima & Yoshida, 1989; Okorokov et al., 2001; Samarão et al., 2009).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Ca2+
-ATP
ases
Ca-ATPases (s/Ca)
Ca-ATPases (c/Ca)
Vac
Vac
Golgi
Golgi
RE/MP
RE/MP
EN
EN
Fig. 1 – Efeito do Ca2+ extracelular sobre a atividade da Ca2+-ATPase em membranas celulares da cepa X-2180 de S. cerevisiae. As vesículas de membranas totais isoladas, de esferoplastos que foram energizados pela glicose, de células que foram (c/Ca) ou não (s/Ca) pré-incubadas com 100 mM CaCl2 por 2,5 h foram separadas em gradiente de densidade de sacarose. As frações de vesículas de membranas foram submetidas à análise de captação de 45Ca2+ na presença de 1mM ATP e 2,5 M de FCCP incubados por 10 min. Os resultados foram normalizados para 1 mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente (Silva, 2003).
pmol
Ca2+
/mg
de p
rote
ína
49
Fig. 2 – Atividades da GDPase, PPiase de membrana, NADPH citocromo “c” oxi-redutase. Frações de vesículas de membranas de diferentes organelas da via secretória isoladas de células que foram ou não pré-incubadas com 100 mM de CaCl2 por 2,5 horas foram submetidas à análise da atividade da PPiase de membrana (enzima marcadora do vacúolo), GDPase (enzima marcadora do Golgi) e NADPH cit “c” oxiredutase (enzima marcadora do RE). A: vesículas de membranas isoladas de células que não foram pré-incubados com Ca2+; B: vesículas de membranas isoladas de células que foram pré-incubados com Ca2+. Os resultados foram normalizados para 1 mg de proteína de MT aplicado no gradiente. (Silva, 2003)
A
B
0
10
20
30
40
50
60
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
Frações
Con
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sac
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prot
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)
NADPH Sacarose GDPase
0
10
20
30
40
50
60
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1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
Frações
Con
cent
raçã
o de
sac
aros
e (%
p/p
), N
ADP-
H c
it "c
" oxi
-red
utas
e (u
inid
ades
re
lativ
as/m
in.)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
GD
Pase
( m
ol P
i/mg
prot
eína
)
NADPH Sacarose GDPase
50
Fig. 2 – Atividades da GDPase, NADPH citocromo “c” oxi-redutase. Frações de membranas de diferentes organelas da via secretória isoladas de células de levedura do tipo selvagem e mutante de calcineurina foram submetidas à análise da atividade da GDPase (enzima marcadora do Golgi) e NADPH cit “c” oxiredutase (enzima marcadora do RE). C: Células do tipo selvagem (K601); D: células cnb1 (mutante de calcineurina). Os resultados foram normalizados para um mg de proteína de MT aplicado no gradiente.
C
D
0
50
100
150
200
250
300
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49
Frações
GD
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3
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rote
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GDPase (K601)NADPH (K601)
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50
100
150
200
250
300
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49
Frações
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0
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min
./mg
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rote
ína)
GDPase (K603)NADPH (K603)
51
Fig. 3 – Atividade das enzimas marcadoras do Vacúolo (Fosfatase Alcalina e Vcx1p) e imunoreatividade da Pmc1p::HA (Ca2+-ATPase do vacúolo) em membranas intracelulares de S. cerevisiae. A atividade das Ca2+-ATPases e do Vcx1p (trocador Ca2+/H+ (pmol Ca2+/mg de proteína do homogenato de MT) foi normalizada para um mg de proteína aplicado sobre o gradiente. Atividade da fosfatase alcalina (DO400nm/10 L de amostra) e imunodetecção de Pmc1p::HA (unidades relativas/10 L de amostra) foram determinada pelo volume de 10 L de amostra de células (K699) que cresceram em condições controle.
0
20
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1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
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Ca2+-ATPase Trocador Anti-HA Fosfatase Alcalina
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1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
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Ca2+-ATPase (K699)Trocador (K699)Anti-HA (s/Ca)
Fig. 4 – Atividade das Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+ e imunoresposta da Pmc1p::HA (Ca2+-ATPase do vacúolo) em membranas intracelulares de S. cerevisiae K699 de esferoplastos que foram energizadas pela glicose. A atividade de Vcx1p (trocador Ca2+/H+ foi normalizada para um mg de proteína do homogenato de MT aplicado sobre o gradiente. Atividade da fosfatase alcalina e imunoreatividade de Pmc1p::HA foram determinada pelo volume de 10 L de fração de vesícula de membrana.
53
Data do isolamento
Organela Frações do grad.
(s/Ca2+)
[ sac] (%) nas frações
(s/ Ca2+)
Frações do grad.
(c/ Ca2+)
[sac ] (%) nas frações (c/ Ca2+)
EN 1 – 10 58 – 50.2 1 – 10 51 – 48 RE 11 – 25 47 – 38.2 11 – 21 47 – 38.4
Golgi 26 – 39 36.8 – 27.6 22 – 36 37.8 – 29.2
10/07/01
Vac 40 - 46 24.6 – 16.8 37 – 44 28.2 – 14.4
EN 1 – 11 55.2 – 51.2 1 – 10 54.2 – 52 RE 11 – 30 51.6 – 38.4 11 – 28 51 – 40.4
Golgi 30 – 47 37.8 – 24 29 – 45 39.2 – 24.2
01/05/02
Vac 48 - 54 23 – 14.4 46 - 52 22.8 - 16
Média da concentração de sacarose (%) EN 56 – 50 RE 50 – 39
Golgi 39 – 25
Média dos
isolamentos Vac 25 – 14
Tabela 3: Localização das frações de membranas de compartimentos da via secretória de S. cerevisiae
separados em gradiente de densidade de sacarose (Silva, 2003).
54
4.2 - Efeito do estresse por altas concentrações de Ca2+ extracelular sobre as
atividades dos transportadores de Ca2+ em S. cerevisiae
4.2.1 – Estresse de curto tempo pelo alto Ca2+ em células não energizadas pela glicose extracelular
O aumento da concentração de Ca2+ extracelular promove conseqüentemente
o aumento da concentração de Ca2+ no citosol [Ca2+]C (Halachmi & Eilam, 1993) que
ativa a calcineurina (CaN). A CaN ativada estimula a expressão do gene PMC1 e
PMR1, Ca2+-ATPase vacuolar e Ca2+-ATPase de Golgi respectivamente e inibição
da atividade do trocador vacuolar, Vcx1p (Cunningham & Fink, 1994; Cunningham &
Fink, 1996; Mendoza et al., 1996; Yoshimoto et al., 2002). Os estudos do efeito de
altas concentrações de Ca2+ extracelular sobre a atividade das Ca2+-ATPases foram
iniciadas durante a tese de mestrado, onde analisamos o efeito da incubação das
células de leveduras com alto Ca2+ sobre as atividades das Ca2+-ATPases em duas
cepas selvagens de S. cerevisiae diferentes, cepa X-2180 e cepa AA255. Mostramos
que a incubação das células de ambas as cepas com 100 mM de Ca2+ extracelular
no meio YEPD por 2,5 h estimula a atividade das Ca2+-ATPases em
aproximadamente três vezes (Silva, 2003).
O objetivo geral desta parte do trabalho foi revelar as respostas da levedura
ao estresse por altas concentrações de Ca2+ e o papel da calcineurina sobre a
atividade dos transportadores de Ca2+.
A CaN, proteína fosfatase Ca2+/calmodulina dependente, é uma das principais
proteínas regulatórias envolvida em condições de estresse (Cunningham & Fink,
1994; Mendoza et al., 1996; Yoshimoto et al., 2002). Com base neste conhecimento,
analisamos o efeito da ciclosporina A (CsA - antagonista da CaN) sobre a atividade
dos transportadores do efluxo de Ca2+ em células estressadas com 100 mM de Ca2+
por 2,5 h para avaliar o envolvimento da CaN, além de reavaliar o efeito do alto Ca2+
sobre a atividade das Ca2+-ATPases na cepa selvagem AA255.
A Figura 5 mostra que o transporte de 45Ca2+ é dependente de ATP. Quando
as células foram incubadas com 100 mM CaCl2 por 2,5 h a captação total de Ca2+
pelas membranas totais (MT) foi estimulada aproximadamente 2,5 vezes (Fig. 5).
Interessante que essa estimulação foi parcialmente diminuída pela ciclosporina A
(CsA), antagonista da CaN (Fig. 5).
55
A análise do estresse por 100 mM Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases
(Fig. 6; Tabela 4) e dos trocadores Ca2+/H+ (Tabela 5) revelou o aumento da
atividade em média de 2,7 e 2,0 vezes respectivamente (Tabela 4 e 5).
A adição de 10 g/mL CsA no momento do estresse pelo alto Ca2+ não foi
capaz de prevenir a estimulação da atividade das Ca2+-ATPases causada pelo alto
Ca2+, sugerindo que uma prévia incubação da CsA ou o uso do mutante de CaN
seria possível detectar o efeito da CaN sobre a atividade dos transportadores de
Ca2+ (Silva, 2003).
Verificamos que a prévia incubação por 2 h das células com 10 g/mL CsA
antes do estresse por alto Ca2+ preveniu a atividade das Ca2+-ATPases em média de
50% em vesículas de MT (Fig. 6A, Tabela 4). Porém, em nossas condições
experimentais não foi possível detectar qualquer alteração significativa do efeito da
CsA sobre a atividade do trocador Ca2+/H+ que foram estimulados pelo Ca2+
extracelular (Tabela 5).
O fracionamento das membranas totais em gradiente de densidade de
sacarose confirmou as observações feitas nas membranas totais e ainda revelou a
estimulação seletiva das Ca2+-ATPases em diferentes organelas da via secretória de
levedura (Fig. 7).
A atividade das Ca2+-ATPases foi encontrada em todas as populações de
membranas derivadas das diferentes organelas. A incubação com 100 mM de CaCl2
extracelular por 2,5 h estimulou a atividade das Ca2+-ATPases em todas as frações
de membranas e a pré-incubação das células com 10 g/mL CsA por 2 h antes do
estresse pelo Ca2+ preveniu essa estimulação (Fig. 7).
O estresse com 100 mM Ca2+ extracelular por 2,5 h estimulou a atividade das
Ca2+-ATPases em aproximadamente 2, 1,5 e 4 vezes nas membranas enriquecidas
por membranas do RE/MP, Golgi e vacúolo respectivamente. A CsA, adicionada 2 h
antes do estresse pelo Ca2+, reduziu essa estimulação em aproximadamente 40, 25
e 45% nessas mesmas membranas respectivamente. Os efeitos do alto Ca2+ assim
como o da CaN não foram revelados em membranas do EN/RE/MP. Mas a
incubação das células de cepas selvagem de leveduras AA255 e X-2180 (Silva,
2003; Ribeiro, 2004) com 100 mM de Ca2+ extracelular por 2,5 h estimulou a
atividade das Ca2+-ATPases em todas as organelas da via secretória em média 2, 2,
2 - 2,5 e 4,5 vezes nas membranas do EN/RE/MP, RE/MP, Golgi e vacúolo
respectivamente.
56
A média entre 2 experimentos mostra que a incubação das células com 100
mM de Ca2+ extracelular por 2,5 h estimulou a atividade das Ca2+-ATPases em todas
as organelas da via secretória em 1,6, 2,0, 1,7 e 3,7 vezes para vesículas de
membranas enriquecidas por membranas do EN/RE/MP, RE/MP, Golgi e vacúolo
respectivamente.
Podemos observar que esses resultados estão em concordância com os
dados encontrados na literatura, ou seja, o aumento da concentração de Ca2+
extracelular e consequentemente a ativação da calcineurina (CaN) estimula entre 5 -
7 vezes a expressão do gene PMC1, que codifica a Ca2+-ATPase vacuolar
(Cunningham & Fink, 1994; Mendoza et al., 1996; Yoshimoto et al, 2002) e em 1,2
vezes do gene PMR1, que codifica a Ca2+-ATPase de Golgi (Yoshimoto et al, 2002).
A estimulação da atividade das Ca2+-ATPases, pelo Ca2+ extracelular, encontrada no
Golgi e vacúolo (Fig. 4) (Silva, 2003, Ribeiro, 2003) foi proporcional ao aumento da
expressão gênica de PMR1 e PMC1. Porém, nós mostramos que o Ca2+ extracelular
não ativa somente as Ca2+-ATPases de Golgi e de vacúolo mas também as Ca2+-
ATPases de membranas do RE/MP e EN/RE/MP. Esses resultados corroboram com
os dados de Silva (2003) e Ribeiro (2003) que todas as Ca2+-ATPases respondem
ao estresse por alta concentração de Ca2+ extracelular e mais, que essas Ca2+-
ATPases estão sobre a regulação da calcineurina.
A estimulação pelo Ca2+ extracelular foi relativamente alta para a atividade do
trocador Ca2+/H+ em MT (Fig. 6B), porém gostaríamos de fazer algumas
observações com relação a esse experimento: (1) a Figura 6A mostra que após 30
min de captação de Ca2+ a atividade das Ca2+-ATPases fica estabilizada enquanto
que a atividade do trocador após 10 min de captação teve a tendência de sofrer
decaimento na atividade (Fig. 6B); (2) a atividade do trocador foi baixa quando
comparada com outros resultados mostrados na tabela 4. Devido a essas
“dificuldades” técnicas iniciais de manter a atividade do trocador Ca2+/H+, não foi
possível mostrar o efeito do Ca2+ extracelular sobre a atividade do trocador nas
membranas da via secretória.
Nossos resultados mostram que o estresse por 100 mM Ca2+ durante
aproximadamente um ciclo de divisão celular (2,5 h) podem causar mudanças
significativas das atividades de ambos os tipos de transportadores de Ca2+, Ca2+-
ATPases e trocadores Ca2+/H+.
57
Figura 5: Efeito do Ca2+ extracelular e da CsA sobre a captação de 45Ca2+ em membranas totais (MT) da cepa AA255 de S. cerevisiae. As células que não foram pré-incubadas (cont), as
que foram incubadas com 100 mM CaCl2 por 2,5 h (Ca) e as que foram pré-incubadas com 10
g/mL de CsA por 2 h e posteriormente incubadas por mais 2,5 h com 100 mM CaCl2 (Ca/CsA).
O acúmulo de Ca2+ foi normalizado para pmol Ca2+/mg de proteína de MT. Dados de um
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Acúm
ulo
de C
a2+ (p
mol
Ca2+
/mg
de p
rote
ína)
s/ ATP (cont; Ca; Ca/CsA)
cont
Ca
Ca/CsA
58
B
A
Figura 6: Efeito do Ca2+ extracelular e da CsA sobre os transportadores de Ca2+ em vesículas de membranas totais da cepa AA255 de S. cerevisiae de esferoplastos não energizados pela glicose. As células que não foram
pré-incubadas (cont), as que foram incubadas com 100 mM CaCl2 por 2,5 h (Ca) e as que foram pré-incubadas com
10 g/mL de CsA por 2 h e posteriormente incubadas por mais 2,5 h com 100 mM CaCl2 (Ca/CsA). (A) Atividade das
Ca2+-ATPases; (B) atividade dos trocadores Ca2+/H+. A atividade dos transportadores de Ca2+ foi normalizada para
pmol Ca2+/mg de proteína de MT. Dados de um experimento (exp. I) representativo de 5 (ver Tabela 4 e 5).
0
500
1000
1500
2000
2500
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
Ca2+-ATPase (Cont)
Ca2+-ATPase (Ca2+)
Ca2+-ATPase (Ca2+/CsA)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min)
Ativ
idad
e do
s tro
cado
res
Ca2+
/H+
Trocador (Cont)Trocador (Ca2+)Trocador (Ca2+/CsA)
59
Figura 7: Efeito do Ca2+ extracelular e da CsA sobre a atividade das Ca2+-ATPases em membranas intracelulares da cepa AA255 S. cerevisiae. As células que não foram incubadas (cont), as que foram incubadas com 100 mM CaCl2 por 2,5 h (Ca) e as que foram pré-incubadas com 10 g/mL de CsA por 2 h e posteriormente incubadas por mais 2,5 h com 100 mM CaCl2 (Ca/CsA). Os esferoplastos, não energizados com glicose, foram isolados e separados em gradiente de densidade de sacarose. (A) determinação da atividade das Ca2+-ATPases em cada fração de membrana. (B) atividade das Ca2+-ATPases de diferentes organelas. As atividades das Ca2+-ATPases foram normalizadas em pmol Ca2+/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente. Dados de um experimento (exp. I) representativo de 2 (ver Tabela 4). O índice acima das colunas indica o efeito do Ca2+ extracelular sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ e da CsA sobre o efeito estimulatório do Ca2+ extracelular. As setas direcionadas para baixo indicam inibição da atividade e as direcionadas para cima estimulação.
B
A
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
ControleCa2+Ca2+/CsA
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
EN. RE/MP Golgi Vacúolo
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
ControleCa2+Ca2+/CsA
2,4
0,24
2,2
0,42
0,42
Frações (1 -10) (11 – 32) (33 – 45) (45 – 52)
60
N° do
Experimento
DO 600nm/mL
atividade (controle)
(pmol/mg de proteína)
atividade (Ca)
(pmol/mg de proteína)
atividade (Ca/CsA)
(pmol/mg de proteína)
Estimulação pelo alto Ca2+
(vezes)
Efeito da CsA sobre o alto
Ca2+ (vezes)*
I 2,5 MT 739 1837 1131 2,5 1,6 II 4,9 MT 1753 4258 3726 2,4 1,1 III 2,9 MT 1440 6644 2474 4,6 2,7 IV 3,0 MT 1415 3814 2575 2,7 1,5 V 1,4 MT 864 1035 736 1,2 1,4
Média 2,9 MT 1248 ± 191 3518 ± 985 2128 ± 539 2,7± 0,53 1,7 ± 0,27
N° do Experimento
DO 600nm/mL
Org. das atividade (controle)
**
das atividade
(Ca) **
das atividade (Ca/CsA)
**
Estimulação pelo alto Ca2+
(vezes)
Efeito da CsA sobre o alto
Ca2+ (%)
EN 110 245 250 2,2 0,98 RE 180 325 420 1,8 0,78
Golgi 430 910 900 2,1 1,01
I
4,9
Vac 105 540 555 5,1 0,97
EN 63 69 70 1,0 0,98 RE 168 403 233 2,4 1,7
Golgi 240 242 184 1,0 1,3
II
2,5
Vac 34 74 43 2,2 1,7 Média das estimulações pelo alto Ca2+ entre os experimentos e do efeito da CsA
EN 87 157 160 1,8 0,98 RE 174 364 327 2,1 1,1
Golgi 335 576 542 1,7 1,1
Média
3,7
Vac 70 307 299 4,4 1,0 * Diminuição de estimulação pelo estresse por alta concentração de Ca2+ extracelular. ** da atividade dos das Ca2+-ATPases em frações de membranas enriquecidas por organelas da via secretória é expresso em pmol/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente
Tabela 4: Efeito da pré-incubação com 100 mM Ca2+ extracelular e da CsA na atividade das Ca2+-ATPases
em MT e nas organelas da via secretória de S. cerevisiae AA255 cujos esferoplastos não foram
energizados com glicose
61
N° do
Experimento
DO 600nm/mL
atividade (controle)
(pmol/mg de proteína)
atividade (Ca)
(pmol/mg de proteína)
atividade (Ca/CsA)
(pmol/mg de proteína)
Estimulação pelo alto
Ca2+ (vezes)
Efeito da CsA sobre o
alto Ca2+ (vezes)
I * 2,5 MT 192 552 654 2,9 0,84
IV * 3,0 MT 1206 1639 1639 1,4 1,0 V * 1,4 MT 719 1075 778 1,5 1,38 VI 5,9 MT 749 1654 1609 2,2 1,03
Média 3,2 MT 717 ± 270 1230 ± 263 1170 ± 263 2,0 ± 0,25 1,1± 0,11
* Nesses experimentos significa que também foi feito atividade de Ca2+-ATPase em MT (Tabela 4)
Tabela 5: Efeito da pré-incubação com 100 mM Ca2+ extracelular e da CsA na atividade dos trocadores
Ca2+/H+ em MT da cepa selvagem AA255 de S. cerevisiae cujos esferoplastos não foram energizados
com glicose
62
4.2.2 – Estresse permanente pelo alto Ca2+ em células não energizadas pela
glicose extracelular
Em experimentos descritos na literatura sobre estresse pelo alto Ca2+, as
células de S. cerevisiae foram cultivadas em meio YEPD na presença de alto Ca2+
por aproximadamente 7 - 9 h (Cunningham & Fink, 1994; Marchi, et al, 1999). Com
base nestes dados, cultivamos as células de leveduras AA255 em meio YEPD com e
sem 150 mM de Ca2+ por cerca de 14 – 12 h.
Verificamos que o crescimento das células de S. cerevisiae com 150 mM
CaCl2 estimulou a atividade dos transportadores de Ca2+ em membranas totais
dessas células.
O crescimento com 150 mM Ca2+ estimulou a atividade das Ca2+-ATPases
(Fig. 8, Tabela 6) e dos trocadores Ca2+/H+ (Fig. 8, Tabela 7) em aproximadamente
2,2 e 1,8 vezes respectivamente.
Interessante observar que a estimulação de atividade de trocadores Ca2+/H+
de MT apresenta-se como uma característica chave para sobrevivência de células
de levedura durante o estresse permanente por alto Ca2+ extraceluar (Fig. 9A;
Tabela 7). As células cuja atividade dos trocadores Ca2+/H+ foi ativada entre 1,8 - 1,9
vezes apresentam fraca inibição do crescimento (~10%). E o contrário, quando a
inibição do crescimento foi de 54% observou-se que a atividade dos trocadores
Ca2+/H+ decaiu aproximadamente 80%. Esses novos dados indicam a importância
dos trocadores na homeostase de Ca2+ em leveduras.
Existe uma correlação similar entre a resistência de levedura ao estresse
permanente por alto Ca2+ e a estimulação da atividade das Ca2+-ATPases em um
limitado intervalo de estimulações (Fig. 9B). Mas, em dois experimentos essa
correlação não foi observada. A ativação das Ca2+-ATPases foi de 2,1 e 3,8 vezes,
acompanhado por 68 e 80% do crescimento das células respectivamente em
comparação ao controle (Tabela 6A).
O fracionamento das MT em gradiente de densidade de sacarose revelou a
estimulação das atividades das Ca2+-ATPases (Fig. 10) e dos trocadores Ca2+/H+
(Fig. 11) em todas as frações de membranas.
O crescimento com 150 mM de Ca2+ estimulou a atividade das Ca2+-ATPases
em média de seis experimentos foi de aproximadamente 4, 2,5, 3,5, e 2 vezes nas
vesículas de membranas enriquecidas por membranas EN, RE/MP, Golgi e vacúolo
63
respectivamente (Fig. 10; Tabela 6B). Nessas condições a atividade dos trocadores
Ca2+/H+ foi também estimulada em 1,8, 1,5, 1,8 e 1,2 vezes nas vesículas de
membranas enriquecidas por membranas EN, RE/MP, Golgi e vacúolo
respectivamente (Fig. 11; Tabela 7).
Devemos relembrar que as membranas do envelope nuclear (EN) comigram
parcialmente com as membranas do RE e MP, porém os dados mostram que as
resposta dos transportadores de Ca2+ no EN são diferentes das respostas do
RE/MP.
Nossos experimentos indicam que a determinação da atividade do trocador
Ca2+/H+ mostrou ser muito mais sensível a variações experimentais que a atividade
das Ca2+-ATPases. Portanto, de cinco experimentos que no qual o crescimento das
células com alta concentração de Ca2+ estimulou a atividade do trocador Ca2+/H+ em
vesículas de MT. Apenas dois destes, após o fracionamento das MT em gradiente
de densidade de sacarose, mantiveram a estimulação enquanto que nos três outros,
o crescimento de S. cerevisiae com alto Ca2+ não alterou atividade do trocador
(Tabela 7).
O crescimento das células de levedura com 150 mM Ca2+ estimulou a
atividade das Ca2+-ATPases em aproximadamente 4, 2,5, 2 e 2 vezes nas
membranas do EN, RE/MP, Golgi e vacúolo respectivamente (média de 6
experimentos; Tabela 6B) e também estimulou a atividade dos trocadores Ca2+/H+
em aproximadamente 2,5, 1,5 e 1,5 vezes nas membranas do EN, RE/MP e Golgi
respectivamente (média de 2 experimentos, Tabela 7). O estresse permanente com
150 mM Ca2+ extracelular teve a tendência a estimular fracamente a atividade do
trocador Ca2+/H+ nas membranas vacuolares (Fig. 11).
Analisamos o estresse por alto Ca2+ extracelular aplicado por curto tempo
(incubação com 100 mM Ca2+ por 2,5 h) ou permanente (crescimento com 150 mM
Ca2+).
Podemos observar que, em ambos os tipos de estresse, o alto Ca2+
extracelular estimulou a atividade das Ca2+-ATPases em aproximadamente 2,5 a 3
vezes em MT de S. cerevisiae AA255 (Tabelas 3 e 6A). Porém, quando essas
membranas totais foram fracionadas em gradiente descontínuo de densidade
sacarose, observamos que a estimulação da atividade das Ca2+-ATPases pelo alto
Ca2+ nos diferentes tipos de estresse foi diferenciada (Fig. 7 e 10, Tabelas 4, 6B e
64
8). O efeito do Ca2+ em diferentes condições não foi observado na atividade
encontrada nas MT.
A ausência da variação na captação de Ca2+ em MT também foi encontrada
na caracterização do mutante pmr1, mutante nulo da Ca2+-ATPase do Golgi, neste
caso, a inibição da atividade da Ca2+-ATPase só foi perceptível quando as MT foram
fracionadas e essa inibição foi detectada nas membranas do Golgi (Okorokov, 1985).
No estresse de curto tempo (incubação das células por 2,5 h com 100 mM de
Ca2+) as Ca2+-ATPases localizadas no vacúolo e nas membranas mais densas que o
RE/MP foram estimuladas pelo alto Ca2+ em aproximadamente 4 e 1,5 vezes
respectivamente. Enquanto que, na condição de adaptação ao estresse pelo alto
Ca2+, o Ca2+ estimulou a atividade das Ca2+-ATPases localizadas no vacúolo e nas
membranas mais densas que o RE/MP em aproximadamente 2 e 4 respectivamente
(Tabela 6B).
Esses resultados mostram que independente do tempo de estresse por alto
Ca2+ a atividade das Ca2+-ATPases são estimuladas em todos os compartimentos da
via secretória, porém a contribuição dessas Ca2+-ATPases ocorre diferentemente em
cada compartimento e em cada tipo de estresse.
Juntos nossos resultados indicam a existência de pelo menos um mecanismo
de detoxificação de Ca2+ nas células de leveduras para cada tipo de estresse pelo
Ca2+ sofrido pela célula.
65
Figura 8: Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ em vesículas de membranas totais da cepa AA255 de S. cerevisiae obtidas de esferoplastos que não foram energizados com glicose. O acúmulo de Ca2+ foi determinado no tempo de 10 min e normalizado para pmol Ca2+/mg de proteína de MT. Dados de um experimento (exp. I) representativo de 6. (ver Tabela 6A). O índice acima das colunas indica a estimulação da atividade dos transportadores de Ca2+ pelo estresse de Ca2+.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Captação total Ca2+-ATPase trocadorCa2+/H+
Acúm
ulo
de C
a2+
Controle Ca2+
1,9
2,2
1,8
66
Efeito do alto Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases em MT
N° do experimento
DO 600nm/mL
% de inibição do
crescimento pelo Ca2+
Local
atividade (controle)
(pmol/mg de proteína)
atividade (Ca)
(pmol/mg de proteína)
Estimulação do alto Ca2+
(vezes)
Cont Ca2+ I 3,8 3,5 8 MT 322 724 2,2 II 2,9 2,5 14 MT 305 509 1,7 III 3,8 3,4 10 MT 754 1561 2,1 IV 3,3 2,8 15 MT 386 606 1,6 V 4,5 3,6 20 MT 433 1670 3,8 VI 3,7 2,5 32 MT 971 1997 2,1
Média 3,7 3,1 16,5 MT 529 ± 111 1178 ± 261 2,3 ± 0,3
Tabela 6A: Efeito do estresse permanente por 150 mM Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas MT de S. cerevisiae AA255, cujos esferoplastos não foram energizados com glicose extracelular
67
Efeito do alto Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases em membranas intracelulares
N° do experimento
DO 600nm/mL
Local das atividade (controle)
*
das atividade (Ca)
*
Efeito do alto Ca2+ (vezes)
Cont Ca2+ EN 79 334 4,2 RE 231 621 2,7
Golgi 165 556 3,4
I
3,8
3,5
Vac 13 31 2,4
EN 39 226 5,8 RE 80 285 3,7
Golgi 87 182 2,1
II
Obs.: captação feita em 3 min
2,9
2,5
Vac 7 18 2,6
EN 61 214 3,5 RE 149 296 2,0
Golgi 154 207 1,3
III
3,8
3,4
Vac 16 17 1,1
EN 51 157 3,1 RE 97 215 2,2
Golgi 99 217 2,2
IV
3,3
2,8
Vac 15 25 1,7
EN 18 52 2,9 RE 110 145 1,3
Golgi 125 270 2,2
V
4,5
3,6
Vac 7 19 3,0
EN 64 242 3,8 RE 279 705 2,5
Golgi 240 470 2,0
VI
3,7
2,5
Vac --- --- ---
EN 52 ± 8,7 204 ± 38,4 3,9 RE 158 ± 32,7 378 ± 93,5 2,4
Golgi 145 ± 22,6 317 ± 64,0 2,2
Média
3,7
3,1
Vac 12 ± 1,9 22 ± 2,6 1,8 * da atividade dos das Ca2+-ATPases em frações de membranas enriquecidas por organelas da via secretória é expresso em pmol/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente.
Tabela 6B: Efeito do estresse permanente por 150 mM Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas
organelas da via secretória de S. cerevisiae AA255, cujos esferoplastos não foram energizados com
glicose extracelular
68
Efeito do alto Ca2+ sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em MT
N° do experimento
DO 600nm/mL
% de inibição do
crescimento pelo Ca2+
Local
atividade (controle)
(pmol/mg de proteína)
atividade (Ca)
(pmol/mg de proteína)
Estimulação pelo alto Ca2+
(vezes)
Cont Ca2+ I 3,8 3,5 8 MT 1004 1759 1,8
III 3,8 3,4 11 MT 492 919 1,9 IV 3,3 2,8 15 MT 662 1265 1,9 V 4,5 3,6 20 MT 968 1133 1,2 VI 3,7 2,5 32 MT 2692 2885 1,1 VII 4,7 2,2 53 MT 709 318 0,4
Média 3,9 3,0 23 MT 1088 ± 330 1380 ± 357 1,4 ± 0,2
Efeito do alto Ca2+ sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em membranas intracelulares N° do
experimento DO
600nm/mL Org. das
atividades (controle)
*
das atividades
(Ca) *
Estimulação pelo alto Ca2+
(vezes)
Cont Ca2+ EN 83 151 1,8 RE 241 397 1,6
Golgi 396 697 1,8
I
3,8
3,5
Vac 38 46 1,2
EN 40 114 2,9 RE 241 327 1,4
Golgi 444 556 1,3
VI
3,7
2,5
Vac 610 170 0,3 * da atividade dos trocadores Ca2+/H+ em frações de membranas enriquecidas por organelas da via secretória é expresso em pmol/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente.
Tabela 7: Efeito do estresse permanente por 150 mM Ca2+ sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em MT e nas organelas da via secretória de S. cerevisiae AA255, cujos esferoplastos não foram
energizados com glicose extracelular
69
Figura 9: Efeito do crescimento celular na presença de 150 mM Ca2+ extracelular sobre a ativação dos transportadores de Ca2+ e o crescimento celular da cepa AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos não foram incubados com glicose. (A) inibição do crescimento celular relacionado a
ativação das Ca2+-ATPAses. (B) inibição do crescimento celular correlacionado a ativação dos trocadores
Ca2+/H+ (ver Tabela 5A e 6).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
5 7 9 11 13 15 17
Inibição do crescimento celular (%)
Estim
ulaç
ão d
as C
a2+-A
TPas
es (v
ezes
)
B
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
5 15 25 35 45 55
Inibição do crescimento celular (%)
Estim
ulaç
ão d
os tr
ocad
ores
Ca2+
/H+ (v
ezes
)
70
Figura 10: Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases em frações de membranas intracelulares da cepa AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos não foram incubados com glicose. A análise de captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C. (A) atividade das Ca2+-
ATPases nas frações de membranas. (B) atividades das Ca2+-ATPases de diferentes organelas. Os resultados
foram normalizados para pmol Ca2+/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente. Dados de um
experimento (exp. I) representativo de 6 (ver Tabela 6A). O índice acima das colunas indica a estimulação da
atividade das Ca2+-ATPases pelo estresse de Ca2+.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
esCa2+-ATPase (cont)
Ca2+-ATPase (Ca)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
EN/MP RE/MP Golgi Vac
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPA
ses
s/Cac/Ca
4,2
2,73,4
2,4
B
A
Frações (1 -11) (12 – 29) (30 – 44) (45 – 49)
71
B
A
Figura 11: Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em frações de membranas intracelulares da cepa AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos não foram incubados com glicose A análise de captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C. (A) atividade dos trocadores
Ca2+/H+ nas frações de membranas. (B) atividade dos trocadores Ca2+/H+ de diferentes organelas. Os resultados
foram normalizados para pmol Ca2+/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente. Dados de um experimento
(exp. I) representativo de 6 (ver Tabela 7). O índice acima das colunas indica a estimulação da atividade dos
trocadores Ca2+/H+ pelo estresse de Ca2+.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Frações
Ativ
idad
e do
s tro
cado
res
Ca2+
/H+
trocador Ca2+/H+ (cont)
trocador Ca2+/H+ (Ca)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
EN/MP RE/MP Golgi Vac
Ativ
idad
e do
s tro
ador
es C
a2+/H
+
s/Cac/Ca
1,8
1,6
1,8
1,2
Frações (1 -11) (12 – 29) (30 – 44) (45 – 49)
72
Estimulação da atividade das Ca2+-ATPase das organelas da via secretória de S.
cerevisiae AA255
Tipo de estresse EN RE /MP Golgi Vacúolo
Curto tempo 1,6 2,1 1,6 3,7
Permanente 3,9 2,4 2,2 1,8
Estimulação da atividade dos trocadores Ca2+/H+ das organelas da via secretória de S. cerevisiae AA255
Tipo de estresse EN RE /MP Golgi Vacúolo
Permanente 1,8 - 2,9 1,5 1,5 1
Tabela 8: Estimulação da atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ no
estresse por alto Ca2+ aplicado por curto tempo (incubação com 100 mM Ca2+ por 2,5 h)
ou permanente (crescimento com 150 mM Ca2+).
73
4.2.3 – Estresse permanente pelo alto Ca2+ em células energizadas pela glicose
extracelular
Durante a preparação das células para o isolamento de membranas as
células ficam privadas de fonte de carbono por um período e quando esta é
readicionada estimula a atividade das bombas protônicas (Serrano, 1983; Kane,
1995). A glicose também estimula a atividade dos transportadores de Ca2+ em S.
cerevisiae (Ribeiro, 2006), além disso, a presença da glicose extracelular possibilita
que as condições experimentais aproximem-se das condições que ocorrem in vivo.
Por esse motivo, analisamos as membranas isoladas de esferoplastos que foram
incubados com 100 mM glicose (solução de glicose contêm: 100mM glicose, 3 mM
MgSO4, 100 mM K2HPO4) (ver Materiais & Métodos).
O crescimento celular com alto Ca2+ estimulou a atividade das Ca2+-ATPases
em aproximadamente 2 e 1,5 vezes nas membranas totais de esferoplastos
incubados com glicose em duas diferentes cepas AA255 e K699 (cepa selvagem
com Pmc1p::HA) respectivamente (Fig. 12). Podemos observar que o nível de
captação de 45Ca2+ entre esses dois experimentos é bem diferente. A explicação
para esse fato vem no processo de isolamento de membranas, pois em AA255 (Fig.
12A) as MT foram sedimentadas enquanto que na cepa K699 (Fig. 12B) essa
sedimentação não ocorreu. Portanto, nos resultados encontrados em K699 ficam
mais baixos que o encontrado normalmente, pois nesse caso as atividades são
divididas pelo conteúdo total de proteína, ou seja, proteína de membrana e proteína
solúvel. Já nos casos que as membranas foram sedimentadas as atividades são
padronizadas somente pelo conteúdo de proteína de membrana.
Para determinar se as Ca2+-ATPases de diferentes organelas foram ativadas
igual ou seletivamente, analisamos estas MT após o fracionamento das membranas
em gradiente de densidade de sacarose, a Figura 13 corresponde ao fracionamento
das MT de AA255 (Fig. 12A) e a Figura 14 ao fracionamento das MT de K699 (Fig.
12B).
Acreditamos que o crescimento com 150 mM ou 50 mM de Ca2+ extracelular
estimulou a atividades das Ca2+-ATPases na maioria das frações de membranas
isoladas de esferoplastos que foram incubados com glicose (Fig. 13 e 14).
A atividades das Ca2+-ATPases das frações enriquecidas por membranas do
vacúolo, Golgi, RE/MP e membranas EN (Fig. 13B e 14B) revelou que na cepa
74
AA255 150 mM Ca2+ extracelular estimulou a atividade das Ca2+-ATPases em 5,1,
1,5 e 1,8 vezes nas membranas do EN, RE/MP e vacúolo respectivamente. Assim
como na cepa K699, 50 mM Ca2+ estimulou a atividade das Ca2+-ATPases em 2,7,
2,8, e 1,6 vezes nessas mesmas membranas e 2,3 vezes nas membranas do Golgi
(Fig. 14).
Para analisar o conteúdo de Pmc1p::HA por “dot blotting”, foram selecionadas
25 frações de membranas que foram energizadas com glicose extracelular de
células que cresceram com ou sem 50 mM Ca2+. O critério de seleção da fração de
membrana foi os picos de atividade das Ca2+-ATPases (Fig. 14).
Analisamos a imunoresposta da Pmc1p::HA por “dot blotting” nas frações de
membranas de células que cresceram em meio YEPD (controle). Podemos observar
que, quando essa células não foram estressas com Ca2+ extracelular, o pico de
atividade das Ca2+-ATPases encontrada entre as frações 37 a 41 comigrou com
imunodetecção de Pmc1p::HA (Fig. 15A). Assim como também nessas mesmas
frações foi encontrada o pico principal de atividade da fosfatase alcalina, enzima
marcadora do vacúolo (Fig. 4) confirmando que estas frações correspondem às
membranas vacuolares.
Entretanto, o cultivo das células em meio YEPD suplementado com 50 mM de
Ca2+ estimulou a atividade das Ca2+-ATPases em todas as frações de membranas
do gradiente (Fig 14). A imunoresposta da Pmc1p::HA também foi analisada.
Observamos que a Pmc1p foi encontrada não apenas nas membranas vacuolares,
mas em todas as frações de membranas do gradiente, ou seja, nas membranas
mais densas que o vacúolo e nas membranas de vesículas secretória (VS) (Fig.
15B).
Resultados semelhantes foram encontrados por Marchi e colaboradores
(1999), porém eles não mostraram nenhuma detecção de Pmc1p nas membranas
vacuolares. Os autores explicaram esse fato sugerindo a existência de subdomínios
de diferentes densidades na membrana vacuolar e que durante o processo de
fracionamento os subdomínios mais densos carreariam essa enzima para as frações
de membranas mais densas do gradiente.
Nós, porém, sugerimos que essa enzima poderia modificar sua localização
para a MP e/ou outras membranas intracelulares além do vacúolo em resposta
condições de estresse por alta concentração de Ca2+, uma vez que a Pmc1p (Ca2+-
75
ATPase de vacúolo) é conhecida como a enzima responsável pela tolerância a altas
concentrações de Ca2+ (Cunningham & Fink, 1994).
A partir desses resultados, resolvemos analisar: (1) se a atividade das Ca2+-
ATPases encontradas nas vesículas de membranas mais densas do gradiente em
condições estresse por alta concentração de Ca2+ no crescimento celular poderia ser
realmente devido a atividade da Pmc1p (Ca2+-ATPase de vacúolo); (2) e se a Pmc1p
encontra-se nessas membranas apenas em condições de estresse por alto Ca2+.
Podemos observar que 41 e 32% do conteúdo total de Pmc1p::HA foram
encontrados nas membranas vacuolares (37 - 41) e nas membranas das VS, porém,
27% do restante do conteúdo de Pmc1p foi distribuído entre as frações 1 – 36, que
correspondem as frações de membranas do EN, RE/MP e Golgi (Fig. 15A).
Em células de levedura que cresceram estressadas com 50 mM de Ca2+,
encontramos que 44 e 14% do conteúdo total analisado correspondem as
membranas vacuolares e membranas da VS respectivamente e 42% do conteúdo de
Pmc1p::HA foi encontrado nas frações de membranas do EN, RE/MP e Golgi (Fig.
15B).
A suplementação de 50 mM de Ca2+ ao meio de cultivo estimulou o conteúdo
total de Pmc1p em 13 vezes. Nas membranas vacuolares e nas membranas,
provavelmente, da vesícula secretória essa estimulação foi de aproximadamente 8 e
6,5 vezes respectivamente, enquanto que nas frações de membranas que
corresponde ao EN, RE, MP e Golgi esse aumento foi de 26,5 vezes (Fig. 16).
Esse resultado está em concordância com nossa sugestão inicial, de que
estaria ocorrendo uma “co-localização” da Pmc1p em condição de estresse por alto
Ca2+, além de concordar com dados existentes na literatura que o alto Ca2+
extracelular aumenta a expressão de PMC1 em mais de 8 vezes (Cunningham &
Fink, 1994; Yoshimoto et al., 2002).
Porém, embora 50 mM de Ca2+ tenha estimulado um aumento significativo de
Pmc1p nas membranas mais densas do gradiente, membranas do EN e RE/MP,
também podemos observar que a atividade das Ca2+-ATPases em cada uma dessas
organelas dobrou quando comparamos com a atividade encontrada no vacúolo (Fig.
14).
Portanto, já podemos fazer algumas conclusões para o efeito de alto Ca2+
quando as células estão em condições mais energéticas. A atividade das Ca2+-
ATPases teve um efeito sinérgico, ou seja, a glicose extracelular estimulou ainda
76
mais a captação de Ca2+ quando as células foram estressadas com alto Ca2+. O
aumento da atividade das Ca2+-ATPases nas frações de membranas além do
vacúolo se deve, provavelmente, por dois motivos: (1) a presença da Pmc1p ativa
nessas membranas e (2) a ativação de Ca2+-ATPase de MP ou de RE.
Surpreendentemente, as células submetidas ao estresse de 150 mM e 50 mM
Ca2+ durante o crescimento celular, cepas AA255 e K699 respectivamente,
apresentaram inibição da atividade dos trocadores Ca2+/H+ quando estas foram
energizadas com 100 mM de glicose extracelular (Fig. 12). Vale destacar que a
glicose extracelular significativamente aumentou o conteúdo de Ca2+ captado pelos
trocadores Ca2+/H+.
Essas MT foram fracionadas em gradiente de densidade de sacarose. O
crescimento de AA255 com 150 mM Ca2+ inibiu a atividade dos trocadores Ca2+/H+
em aproximadamente 0,5 vezes as membranas do RE/MP e do vacúolo e em 0,3 e
0,1 vezes as membranas do EN e do Golgi respectivamente (Fig. 17).
Na cepa K699 (Pmc1p::HA) o crescimento com 50 mM Ca2+ inibiu a atividade
do trocador Ca2+/H+ em aproximadamente 0,45 e 0,65 vezes nas membranas do
Golgi, vacúolo/VS, porém esta atividade foi estimulada em 2,0 e 1,3 vezes nas
membranas do EN e RE/MP respectivamente (Fig. 18).
Os resultados obtidos com o trocador foram inesperados, uma vez que a
glicose extracelular é capaz de estimular a atividade do trocador Ca2+/H+ (Ribeiro,
2006) assim como também é capaz de estimular a atividade das V H+-ATPases
(Kane, 1995; Samarão et al, 2008), enzima responsável em criar o gradiente
protônico para o funcionamento do trocador de Ca2+/H+. Ainda não se tem
conhecimento se a glicose pode ativar diretamente o trocador Ca2+/H+ ou o faz de
maneira indireta aumentando a atividade da V H+-ATPase e consequentemente
estimulando a atividade do trocador Ca2+/H+. Com base nesses conhecimentos,
esperávamos que a glicose extracelular fizesse um efeito somatório sobre o efeito do
estresse pelo alto Ca2+ extracelular em MT e em outras organelas da via secretória
além do vacúolo. Porém, a inibição do trocador Ca2+/H+ ao alto Ca2+ estão em
concordância com a hipótese de Cunningham e Fink (1996) que mostraram de
maneira indireta, através do “pool” de Ca2+ não trocável na cepa pmc1 e na cepa
pmc1 cnb1, que a ativação da calcineurina (CaN), por alta concentração Ca2+,
diminuiu a contribuição do Vcx1p (trocador de Ca2+/H+ vacuolar) na captação de
Ca2+.
77
Figura 12: Efeito do crescimento com alto Ca2+ sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ em vesículas de membranas totais de S. cerevisiae isoladas de esferoplasto que foram energizados com glicose. (A) Células de AA255 crescidas com 150 mM Ca2+ e as membranas totais foram sedimentadas; (B) Células de K699 crescida com 50 mM Ca2+ e a captação de 45Ca2+ foi feita em vesículas de membranas do homogenato total de esferoplastos. A captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C e normalizada para pmol Ca2+/mg de proteína de MT ou do homogenato de esferoplasto. O índice acima das colunas indica o efeito do Ca2+ extracelular sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ e as setas direcionadas para baixo ou para cima indicam inibição ou estimulação da atividade dos transportadores respectivamente.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
Captação total Ca2+-ATPase trocadorCa2+/H+
Cap
taçã
o de
Ca2+
Controle Ca2+
0,8
1,9
0,3
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Captação total Ca2+-ATPase trocadorCa2+/H+
Cap
taçã
o de
Ca2+
Controle Ca2+1,2
1,6 0,8
B
A
78
Figura 13: Efeito do crescimento com 150 mM Ca2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases em organelas da via secretória de células da cepa AA255 de S. cerevisiae isolados de esferoplastos que foram energizadas com 100 mM glicose extracelular. (A) atividade das Ca2+-ATPases nas frações de membranas do gradiente; (B) da atividade das Ca2+-ATPases de diferentes organelas. A captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C e normalizada para pmol Ca2+/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente. O índice acima das colunas indica o efeito do Ca2+ extracelular sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ e as setas direcionadas para baixo ou para cima indicam a inibição ou estimulação da atividade dos transportadores respectivamente.
0
500
1000
1500
2000
2500
EN/MP RE/MP Golgi Vac
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
cont Ca2+
5,1
1,5
0,8
1,8
B
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
Ca2+-ATPase (cont)Ca2+-ATPase (Ca)
A
Frações (1 -10) (11 – 28) (29 – 47) (48 – 53)
79
Figura 14: Efeito da alta concentração de Ca2+ (50 mM) no crescimento celular sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas organelas da via secretória de células da cepa K699 S. cerevisiae isolados de esferoplastos que foram energizados com 100 mM glicose extracelular. (A) atividade das Ca2+-ATPases nas frações de membranas do gradiente. (B) atividade das Ca2+-ATPases de diferentes organelas. A captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C e normalizada para pmol Ca2+/mg de proteína de homogenato de esferoplasto aplicado sobre o gradiente. O índice acima das colunas indica o efeito estimulatório do Ca2+ extracelular sobre a atividade dos transportadores de Ca2+.
B
A
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
K699 K699 (50mM Ca)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
EN/MP RE/MP Golgi Vac/VS
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
K699 K699 (50mM Ca)
2,7
2,8
2,31,6
Frações (1 -10) (11 – 24) (25 – 36) (37 – 52)
80
0
20
40
60
80
100
120
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
Frações
Ativ
idad
e do
s tra
nspo
rtado
res
de C
a2+
0
200
400
600
800
1000
1200
Imun
ores
post
a de
Pm
c1p:
:HA
Ca2+-ATPase TrocadorAnti-HA
Figura 15: Atividade das Ca2+-ATPases e dos trocadores Ca2+/H+ e a imunoresposta de Pmc1p::HA nas organelas da via secretória da cepa K699 S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com glicose. (A) células que cresceram em meio YEPD (controle); (B) células que cresceram em meio YEPD suplementados com 50 mM Ca2+ (Ca). A captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C. A atividade dos transportadores de Ca2+ foram normalizados por pmol Ca2+/mg de proteína do homogenato de esferoplastos aplicado sobre o gradiente e a imunoresposta (Unidades relativas/10 L de amostra)
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52
Frações
Ativ
idad
e da
s C
a2+-A
TPas
es
-100
100
300
500
700
900
1100
1300
1500
Imun
odet
ecçã
o de
Pm
c1p:
:HA
Ca2+-ATPase (Ca)
Anti-HA (Ca)
81
Figura 16: Comparação entre a imunodetecção de Pmc1p::HA nas frações de membranas intracelulares de células da cepa K699 que foram cultivadas em meio YEPD suplementado ou não com 50 mM Ca2+, cujos esferoplastos foram energizados com glicose. A imunoresposta foi normalizada por Unidades relativas em 10 L de amostra/mg de proteína do homogenato de.esferoplastos.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Imun
odet
ecçã
o de
Pm
c1p:
:HA
s/Ca
c/Ca
82
Figura 17: Efeito da alta concentração de Ca2+ (150 mM) no crescimento celular sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas organelas da via secretória da cepa AA255 S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. (A) atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas frações de membranas do gradiente. (B) atividade dos trocadores Ca2+/H+ de diferentes organelas. A captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C e normalizada para pmol Ca2+/mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente. O índice acima das colunas indica o efeito inibitório do estresse pelo alto Ca2+ extracelular sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+.
B
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Ativ
idad
e do
s tro
cado
res
Ca2+
/H+
Trocador (cont)
Trocador (Ca)
A
Frações (1 -10) (11 – 28) (29 – 47) (48 – 53)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
EN/MP RE/MP Golgi Vac
Ativ
idad
e do
troc
ador
Ca2+
/H+
cont Ca2+
0,3
0,55
0,1
0,55
83
B
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
EN/MP RE/MP Golgi Vac/VS
Ativ
idad
e do
troc
ador
Ca2+
/H+
K699 (cont)
K699 (50mM Ca)
2,01,3
0,45
0,65
Figura 18: Efeito da alta concentração de Ca2+ (50 mM) no crescimento celular a atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas organelas da via secretória da cepa K699 S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. (A) atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas frações de membranas do gradiente. (B) atividade dos trocadores Ca2+/H+ de diferentes organelas. A captação de 45Ca2+ foi feita após 10 min de incubação a 30 °C e normalizada para pmol Ca2+/mg de proteína do homogenato de esferoplastos aplicado sobre o gradiente. O índice acima das colunas indica o efeito do alto Ca2+ extracelular sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ e as setas direcionadas para baixo ou para cima indicam a inibição ou estimulação da atividade dos trocadores respectivamente.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Ativ
idad
e do
s tro
cado
res
Ca2+
/H+
K699 (cont)
K699 (50mM Ca)
A
Frações (1 -10) (11 – 24) (25 – 36) (37 – 52)
84
4.3 – O papel da calcineurina (CaN) na regulação dos transportadores de Ca2+
em S. cerevisiae em condições fisiológicas
A calcineurina é uma proteína fosfatase conservada de leveduras a humanos.
Em leveduras está envolvida na síntese de glucano, controle do ciclo celular e
homeostase iônica. Essa proteína vem sendo descrita como uma proteína central no
processo de sinalização pelo Ca2+, principalmente em condições de estresse como
estresse salino, por alto Ca2+, choque hipertônico, choque térmico.
Até o momento nada havia sido descrito sobre o efeito da CaN na atividade
dos transportares de Ca2+ em condições “normais” de laboratório, ou seja, em
condições em que as células de levedura crescem em meio YEPD (nas ausência de
qualquer tipo de estresse).
Analisamos a atividade dos transportadores de Ca2+ em membranas totais e
membranas das organelas da via secretória de células que cresceram em meio
YEPD a 30 °C sob agitação constante cujos esferoplastos foram energizado com
glicose. Entretanto, a energização dos esferoplastos foi realizada de maneira mais
próxima do meio YEPD, ou seja, a solução contêm 100 mM glicose, 50 mM MgCl2,
100 mM K2HPO4 (ver Materiais e Métodos).
A Figura 19 mostra o transporte de Ca2+ em membranas totais entre a cepa
selvagem (K601) e a mutante de calcineurina (CaN - cnb1) de S. cerevisiae.
Podemos observar que vesículas de membranas totais da cepa mutante cnb1
captam em média 46% menos que a cepa selvagem. A mutação causou uma
inibição em média 53% da atividade das Ca2+-ATPases nas membranas totais de S.
cerevisiae (Fig. 19).
O resultado encontrado para a atividade das Ca2+-ATPases, em condições
“normais” de laboratório, refletiram os dados publicados na literatura que determinam
que a CaN/Crz1 regulam transcricionalmente Pmc1p, Pmr1p (Ca2+-ATPases de
vacúolo e de Golgi respectivamente) em condições de alto Ca2+ quando a
calcineurina é ativada (Cunningham e Fink, 1994; Yshimoto et al, 2002).
Resultado semelhante ao da Ca2+-ATPase foi encontrado para atividade do
trocador Ca2+/H+, ou seja, a inativação da CaN inibiu a atividade dos trocadores
Ca2+/H+ em média 37% em membranas totais de S. cerevisiae (Fig. 19).
Foi descrito na literatura que quando a CaN é ativada por alto Ca2+, essa
regula negativa e pos-transcrionalmente a atividade do trocador Ca2+/H+ vacuolar
85
(Vcx1p). Portanto, teoricamente, o resultado esperado seria a estimulação da
atividade do trocador Ca2+/H+ vacuolar (Cunningham e Fink, 1996; Kingsbury &
Cunningham, 2000; Yshimoto et al, 2002). Mas, para nossa surpresa, na ausência
do estresse pelo alto Ca2+, a inibição da atividade do trocador ocorreu junto com a
inibição das Ca2+-ATPases.
A fim de verificar se a ausência da CaN (cnb1) promove a inibição da
atividade das Ca2+-ATPases e do trocador Ca2+/H+ apenas no vacúolo ou se também
causa inibição desses transportadores de Ca2+ em outros compartimentos da via
secretória de S. cerevisiae, realizamos o fracionamento das membranas totais em
gradiente de densidade de sacarose.
As Figuras 20 e 21 mostram que o fracionamento de membranas totais
corrobora com o resultado encontrado para a atividade das Ca2+-ATPases e dos
trocadores Ca2+/H+ nas MT.
A inativação da calcineurina inibiu a atividade das Ca2+-ATPases em todos os
compartimentos da via secretória (Fig. 20). Achamos que o desligamento da CaN
inibiu a atividade das Ca2+-ATPases em aproximadamente 51, 65, 64 e 62% nas
membranas do EN, RE/MP, Golgi e vacúolo respectivamente (Fig. 20B).
A inativação da CaN inibiu a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em todos os
compartimentos da via secretória (Fig. 21). Isto inibiu a atividade dos trocadores
Ca2+/H+ em aproximadamente 55, 73, 51 e 71% nas membranas do EN, RE/MP,
Golgi e vacúolo respectivamente.
Esses resultados mostram que não apenas a atividade da Ca2+-ATPase e do
trocador Ca2+/H+ vacuolar (Pmc1p e Vcx1p respectivamente) estão regulados pela
CaN mas todos os transportadores de Ca2+ da via secretória estão sob sua
regulação quando a levedura não está submetida ao estresse por alto Ca2+. O fato
interessante é que o controle da CaN é muito similar tanto entre as diferentes
organelas das via secretória quanto entre os transportadores de Ca2+, ou seja, essa
regulação não é seletiva.
86
Figura 19: Efeito da ausência da calcineurina sobre a captação de Ca2+ em S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. Cepa selvagem (K601) e cnb1(K603). (A) MT foram precipitadas através de ultracentrifugação; (B) Homogenato total obtido dos esferoplastos, ou seja, as MT não foram precipitadas.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
s/ATP Captação total Ca2+-ATPases
TrocadorCa2+/H+
Cap
taçã
o de
Ca2+
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a de
MT)
K601 (Selv)
K603 (cnb1)
32%
36%
21%
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
s/ATP Captação total Ca2+-ATPases
TrocadorCa2+/H+
Cap
taçã
o de
Ca2+
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a do
hom
ogen
ato
de M
T) K601 (Selv) K603 (cnb1)
61%
71%
54%
B
A
87
0
50
100
150
200
250
300
EN/RE/MP RE/MP Golgi Vac
Ca2+
-ATP
ases
(pm
ol C
a2+/
mg
de p
rote
ína
do h
omog
enat
o de
esf
erop
last
os)
K601 (Selv)
K603 (cnb1)
51%
65% 64%
62%
Frações (1 – 11) (12 – 23) (24 – 37) (38 – 51)
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Ca2+
-ATP
ases
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a do
hom
ogen
ato
de
esfe
ropl
asto
s)
K601 (Selv)K603 (cnb1)
Figura 20: Efeito da inativação da calcineurina sobre a atividade de Ca2+-ATPases em frações de membranas de S. cerevisiae separadas em gradiente de densidade de sacarose, cujos esferoplastos foram energizados pela glicose extracelular. (A) atividade das Ca2+-ATPases nas frações de vesículas de membranas. (B) atividade das Ca2+-ATPases de diferentes organelas. Os resultados foram normalizados para um mg de proteína do homogenato de esferoplastos aplicado sobre o gradiente. Experimento em MT apresentado na Fig. 19B.
B
A
88
B
A
0
50
100
150
200
250
300
350
EN/RE/MP RE/MP Golgi Vac
Troc
ador
es C
a2+/H
+
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a do
hom
ogen
ato
de e
sfer
opla
stos
)
K601 (Selv)
K603 (cnb1)
55%
73%
51% 71%
Figura 21: Efeito da inativação da calcineurina sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em frações de membranas de S. cerevisiae separadas em gradiente de densidade de sacarose, cujos esferoplastos foram energizados pela glicose extracelular. A) atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas frações de vesículas de membranas. (B) atividade dos trocadores Ca2+/H+de diferentes organelas. Os resultados foram normalizados para um mg de proteína do homogenato de esferoplastos aplicado sobre o gradiente. Experimento em MT apresentado na Fig. 19B.
Frações (1 – 11) (12 – 23) (24 – 37) (38 – 51)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Troc
ador
es C
a2+/H
+
(pm
ol C
a2+/
mg
de p
rote
ína
do h
omog
enat
o de
es
fero
plas
tos)
K601 (Selv)
K603 (cnb1)
89
4.4 - Caracterização da inativação dos transportadores de Ca2+ vacuolares
sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ em outras organelas em S.
cerevisiae isolados de esferoplastos energizados pela glicose
A levedura é um excelente modelo de estudo científico, por vários motivos
como fácil de manipulação, não é patogênica, relativamente fácil de criar cepas
mutantes e cepas com genótipo marcado, além do seu material genético ter sido
completamente seqüenciado desde 1996.
Muitos laboratórios têm construído cepas mutantes, mas nem sempre essas
cepas são caracterizadas. Até o momento, em levedura, apenas o produto de dois
genes foram identificados bioquimicamente como Ca2+-ATPases. Os genes PMR1 e
PMC1 que codificam as Ca2+-ATPases de Golgi e de vacúolo respectivamente e o
gene SPF1/COD1 que provavelmente codifica uma Ca2+-ATPase de RE. Entretanto,
bioquimicamente, foi descrito que cada compartimento da via secretória é equipado
com sua própria Ca2+-ATPase e trocador Ca2+/H+ (Okorokov & Lehle, 1998;
Okorokov et al, 2001; Silva, 2003; Ribeiro; 2006).
A atividade da Pmc1p foi determinada através do seqüestro de 45Ca2+
dependente de ATP em células, medindo-se o “pool” de Ca2+ que pode ser
associado à célula (não trocável) e o que não pode (trocável). Assim como a
determinação bioquímica a localização de Pmc1p também foi feita indiretamente por
imunolocalização (Cunningham & Fink, 1994).
Nosso objetivo nesta parte do trabalho foi: (1) avaliar a influência da
inativação independente da Ca2+-ATPase e trocador Ca2+/H+ vacuolar (pmc1 e
vcx1 respectivamente) sobre os transportadores de Ca2+ das diferentes organelas
da via secretória; (2) determinar a existência de outros trocadores além do trocador
Ca2+/H+ vacuolar (Vcx1p). Pois, até o momento, na literatura é aceito a existência
Apenas do Vcx1p; (3) caracterizar diretamente esses mutantes através da
comparação da atividade de seus respectivos transportadores Ca2+ com a atividade
encontrada na cepa selvagem nas membranas vacuolares.
Para alcançar nosso objetivo foi feito isolamento das membranas fracionadas
em gradiente de densidade de sacarose. A determinação da captação de 45Ca2+ foi
feita nessas membranas na presença de ATP (captação total dependente de ATP) e
na presença de ATP e FCCP, protonóforo (atividade das Ca2+-ATPases). A
90
determinação da atividade do trocador foi determinada pela diferença entre a
captação total e a atividade das Ca2+-ATPases.
A atividade das Ca2+-ATPases foi encontrada em todas as frações de
membranas separadas em gradiente de densidade de sacarose na S. cerevisiae
cepa selvagem com o gene PMC1 conjugado com hemoaglutinina A (PMC1::HA).
Podemos observar que a inativação do gene PMC1 (pmc1 – K605) causou uma
inibição da atividade das Ca2+-ATPases em 58, 41, 37 e 71% nas membranas do
EN/RE/MP, RE/MP, Golgi e vacúolo respectivamente quando comparadas com a
atividade encontrada na cepa selvagem (Fig. 22A).
Já a inativação do gene VCX1 (vcx1::URA3 – K617), trocador de Ca2+/H+,
inibiu em aproximadamente 30 e 64 % da atividade nas membranas vacuolares e no
EN respectivamente (Fig. 22A).
Da mesma forma que vem sendo mostrado a existência de no mínimo uma
Ca2+-ATPase para cada compartimento da via secretória, o mesmo também vem
sendo descrito para o trocador Ca2+/H+ (Okorokov & Lehle, 1998; Okorokov et al,
2001, Silva, 2003; Ribeiro, 2007). Portanto, analisamos a atividade do trocador
Ca2+/H+ nas cepas selvagem, pmc1 e vcx1::URA3 de S. cerevisiae (Fig. 22B).
A atividade do trocador foi encontrada em todas as frações de vesículas de
membranas separadas em gradiente de densidade de sacarose nas cepas selvagem
PMC1::HA e na cepa mutante de PMC1 (pmc1 -K605). Inclusive o mutante pmc1
não mostrou alteração significativa nessa atividade quando comparada a cepa
selvagem. Porém a atividade do trocador foi inibida, significativamente, em todas as
frações de vesículas de membranas separadas em gradiente de densidade de
sacarose na cepa mutante de Vcx1p (trocador vacuolar - vcx1::URA3 - K617), sendo
a média de inibição na contribuição de todos os compartimentos foi de
aproximadamente 85% (Fig. 22B).
Os resultados sobre o efeito da inativação da CaN, proteína fosfatase
reguladora, sobre a atividade Ca2+-ATPases (Fig. 20) e sobre os trocadores Ca2+/H+
(Fig. 21) são semelhantes aos resultados encontrados no efeito das inativações da
Ca2+-ATPase de vacúolo (Pmc1p) (Fig. 22A) e do trocador Ca2+/H+ vacuolar (Vcx1p)
(Fig. 22B) sobre seus respectivos transportadores em outras organelas da via
secretória. Esses resultados sugerem que, possivelmente, a Pmc1p e o Vcx1p, ou
seja, os transportadores de Ca2+ vacuolares podem possuir uma função regulatória
91
(transcricional e/ou pós-transcricionalmente) nas Ca2+-ATPases e trocadores
Ca2+/H+ de outras organelas da via secretória, assim como a calcineurina.
Visto a importância do Ca2+ e da Pmr1p (Ca2+-ATPase de Golgi) para o
correto enovelamento (“folding”) protéico (Rudolph et al., 1989; Antibi & Fink, 1992)
somado a nossa sugestão de uma provável função regulatória da Pmc1p sobre
outras Ca2+-ATPases e do Vcx1p sobre outros trocadores Ca2+/H+ justificaria a
inviabilidade do mutante triplo pmc1vcx1pmr1 (Cunningham e Fink, 1996) e não a
inexistência de outros transportadores de Ca2+.
92
0
200
400
600
800
1000
1200
EN/RE/MP RE/MP Golgi Vac
Ca2+
-ATP
ases
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a de
MT)
PMC1::HÁpmc1vcx1
58 64
41
18
37
6
71
30
0
100
200
300
400
500
600
EN/RE/MP RE/MP Golgi Vac
Troc
ador
es C
a2+/H
+
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a de
MT)
PMC1::HÁpmc1vcx1
16
83
15
90
30
70
21
94
A
B
Figura 22: Efeito da inativação da Ca2+-ATPase (Pmc1p) e trocador Ca2+/H+ (Vcx1p) vacuolar sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ em compartimento da via secretória de S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados pela glicose extracelular. (A) Atividade das Ca2+-ATPases; (B) Atividade dos trocadores Ca2+/H+. Os resultados foram normalizados para 1 mg de proteína de MT aplicado sobre o gradiente. Os valores acima de cada coluna indicam o índice de inibição ou estimulação (%), ou seja, a razão entre as atividades dos transportadores da cepa selvegem e cepa mutante. Em vermelho para o mutante de PMC1 e em verde para o mutante VCX1.
93
4.5 – Transportadores de Ca2+ não possuem afinidade pelo Mn2+ em S.
cerevisiae
O Mn2+ é um cátion essencial em todos os organismos, assim como o Ca2+,
altas concentrações Mn2+ no citosol são tóxicas (Kinnett & Wilcox, 1982; Jabalquinto
et al, 1999). Em leveduras e plantas, o vacúolo é considerado o principal reservatório
intracelular de Mn2+ (Okorokov et al, 1985a, Okorokov et al, 1985b, Okorokov, 1985,
White & Gadd, 1986; Marty, 1999). No citoplasma, o Mn2+ funciona como co-fator
para várias enzimas, no RE e Golgi, ele é um dos responsáveis pela correta
glicosilação protéica da via secretória (Kinnett & Wilcox, 1982; Durr et al, 1998;
Wiggins & Munro, 1998; Jabalquinto et al, 1999).
Wei e colaboradores (2000) declararam que a Ca2+-ATPase de Golgi, Pmr1p,
pode transportar Mn2+. Alguns questionamentos surgem: se o Mn2+ é um importante
co-fator enzimático em diferentes organelas, se o vacúolo é o principal reservatório
de Mn2+; e se cada compartimento da via secretória possui sua própria Ca2+-
ATPase, por que somente a Ca2+-ATPase do Golgi pode transportar Mn2+?
O objetivo desta parte do trabalho foi verificar se somente as Ca2+-ATPase do
Golgi pode transportar Mn2+ ou se diferentes Ca2+-ATPases e/ou trocadores Ca2+/H+
da via secretória de levedura também podem transportar Mn2+ e se a calcineurina
(CaN) pode modificar a afinidade das diferentes Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+
pelo Mn2+.
Para alcançar nosso objetivo, isolamos membranas de esferoplastos de
células que cresceram: (1) “em condição controle”, ou seja, cresceram em meio de
cultura YEPD; (2) após a ativação da CaN pelo crescimento celular com alto Ca2+;
(3) na ausência da CaN, ou seja, crescimento das células mutante deficiente da
subunidade B da CaN (cnb1) em meio YEPD.
Nossos experimentos foram baseados na seguinte idéia: se as Ca2+-ATPases
podem transportar também Mn2+, significa que este, in vitro, funciona como inibidor
da captação de Ca2+. Portanto, as análises para determinar o efeito de diferentes
concentrações de Mn2+ no transporte de Ca2+ foram feitas adicionando
concentrações totais de Mn2+, que variaram de 2 a 500 µM, na determinação do
transporte de 45Ca2+.
94
O efeito das diferentes concentrações de Mn2+ sobre a atividade das Ca2+-
ATPases e trocadores Ca2+/H+ foram analisados em membranas totais (MT) e em
membranas separadas em gradiente descontínuo de densidade de sacarose.
As concentrações de Mn2+ total de 2 a 50 µM, in vitro, não inibiu a atividade
tanto das Ca2+-ATPases como dos trocadores Ca2+/H+ nas membranas totais das
células da cepa selvagem AA255 de S. cerevisiae não energizada pela glicose
extracelular (Fig. 23).
Apesar de Wei e colaboradores (2000) informarem que 10 M de Mn2+ total
inibi 50% da atividade Ca2+-ATPase de Golgi (Pmr1p), resolvemos aumentar a
concentração total de Mn2+ in vitro, ou seja, na determinação do transporte de 45Ca2+. Este experimento foi feito em células energizadas pela glicose extracelular,
principalmente, pelo fato dessas condições aproximarem o experimento das
condições in vivo.
Apenas concentrações totais de Mn2+ acima de 100 µM podem inibir,
parcialmente, transporte de 45Ca2+ mediado pelas Ca2+-ATPases (Fig. 24). As
concentrações de 200 e 500 µM de Mn2+ inibiram a atividade das Ca2+-ATPases em
aproximadamente 30 e 65% em membranas totais da cepa selvagem AA255 de S.
cerevisiae (Fig. 24A). Em outra cepa selvagem, k601, 500 µM de Mn2+ inibiu a
atividade das Ca2+-ATPases em aproximadamente 50%.
Resultados semelhantes também foram encontrados para o transporte de
Ca2+ mediado pelos trocadores Ca2+/H+ em membranas totais de células de
leveduras. Ou seja, somente concentrações totais de Mn2+ acima de 100 µM pode
inibir, parcialmente, a atividade dos trocadores Ca2+/H+. Mn2+ total nas
concentrações de 200 e 500 µM total inibiu a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em
aproximadamente 25 e 65% respectivamente em membranas totais da cepa
selvagem AA255 de S. cerevisiae (Fig. 25A). Na cepa k601 (cepa selvagem), 500
µM de Mn2+ total inibiu a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em aproximadamente
30% (Fig. 25B).
O efeito do Mn2+ sobre a atividade dos transportadores de Ca2+ também foi
analisado nas condições em que as células haviam crescido na presença de alto
Ca2+, ou seja, onde a calcineurina (proteína fostatase Ca2+/calmodulina dependente)
encontra-se ativada.
O Mn2+ total, somente, em concentrações acima de 100 µM inibiu
parcialmente a atividade das Ca2+-ATPases e trocadores Ca2+/H+ em membranas
95
totais em de células que cresceram com 150 mM de Ca2+ (Fig. 24 e 25). A
concentração de 500 µM Mn2+ no meio da determinação do transporte de 45Ca2+
inibiu respectivamente em aproximadamente 30% a atividade das Ca2+-ATPases
(Fig. 24A) e em 75% a atividade trocador Ca2+/H+ respectivamente (Fig. 25A).
Até o presente momento, apresentamos a concentração de Mn2+ total,
entretanto, vale a pena fazer uma relação das concentrações totais de Mn2+ usados
e seu conteúdo livre equivalente, além de avaliar o quanto à concentração de Mn2+
livre é maior que a concentração de Ca2+ livre no experimento (Tabela 9). Por
exemplo, 100 µM Mn2+ total corresponde a 41 µM de Mn2+ livre, que por sua vez é
4,8 vezes maior que a concentração de Ca2+ livre (8,6 µM) no experimento. Os
cálculos das concentrações de Mn2+ e Ca2+ livres nos experimentos foram feitos pelo
programa BAD (Bound And Determined) (Brooks & Storey, 1992).
Esses resultados nos permite fazer a conclusão preliminar, que tanto as Ca2+-
ATPases como os trocadores têm baixa afinidade pelo Mn2+ e que essa afinidade
não é modulada pela CaN em membranas totais (MT) de S. cervisiae.
Entretanto, as determinações feitas em MT poderiam “mascarar” a
contribuição da Ca2+-ATPase do Golgi no transporte de Mn2+. Para resolver esta
questão foi feito o fracionamento dessas MT em gradiente descontínuo de
densidade de sacarose, esperando que provável inibição fosse encontrada no
mínimo nas membranas enriquecidas por membranas do Golgi, uma vez que o
produto do gene PMR1 encontra-se nessa organela, descrito como uma Mn2+-Ca2+-
ATPase (Wei et al., 2000).
A Figura 26 mostra o efeito de 100 µM Mn2+ total sobre a atividade das Ca2+-
ATPases da via secretória de células da cepa selvagem AA255 de S. cerevisiae que
cresceram (Fig 26B) ou não na presença de 150 mM de Ca2+ (Fig. 26A).
Podemos observar que 100 M total de Mn2+ (41 M livre de Mn2+, ou seja,
4,8 vezes mais concentrado que o Ca2+ livre) inibiu apenas 12% a atividade das
Ca2+-ATPases nas vesículas de membranas enriquecidas por membrana do Golgi
(Fig. 26A) nas células que cresceram sem Ca2+ extracelular. A inibição ocasionada
nessas membranas pelo Mn2+ pode ser considerada como variação experimental. Já
nas células que cresceram com 150 mM de Ca2+ (Fig. 26B), quando a CaN está
ativada, não foi observada qualquer alteração na atividade das Ca2+-ATPases de
vesículas de membranas da via secretória de levedura, nem na Ca2+-ATPase de
vesículas de membranas do Golgi. Esse resultado confirma a
96
especificidade/preferência das Ca2+-ATPases pelo Ca2+, principalmente em
condições de estresse por altas concentrações de Ca2+ extracelular.
Os resultados encontrados, até o momento, vão contra os dados da literatura
que mostram que 10 M de Mn2+ inibi 50% da atividade da Ca2+-ATPase de Golgi
(Wei et al., 2000). Portanto, reavaliamos todos os nossos procedimentos e os dados
dos artigos sobre o transporte de Mn2+ realizado pela Ca2+-ATPase de Golgi (Pmr1p)
publicados por esse grupo de pesquisa. Um fato nos chamou atenção, esses
autores fizeram a superexpressão de Pmr1p no mutante triplo de pmc1 pmr1 cnb1
(mutante deficiente em Ca2+-ATPase de vacúolo, Ca2+-ATPase de Golgi e
Calcineurina respectivamente; cepa K616). Isso nos levou a acreditar que a
afinidade da Ca2+-ATPase do Golgi (Pmr1p) ao Mn2+, conseguida por eles, foi
promovida pela ausência da CaN, uma importante proteína reguladora envolvida na
homeostase de diversos íons e talvez até metais pesados.
Portanto, para testar esta hipótese, isolamos as MT de esferoplastos
originado das células da cepa deficiente da subunidade B da CaN (cnb1 - cepa
K603) e posteriormente, essas membranas foram fracionadas em gradiente de
densidade de sacarose.
Os resultados encontrados foram similares aos encontrados em MT de células
de cepas selvagens crescida em meio YEPD sem alto Ca2+ (condições “normais”) e
crescida em meio YEPD com alto Ca2+ (CaN ativada). A concentração de 500 µM
Mn2+ totais na determinação de 45Ca2+ inibiram a atividade das Ca2+-ATPases em
aproximadamente 30% em MT (Fig. 24B) isoladas de esferoplastos de células da
cepa mutante de CaN. Essa concentração de Mn2+ inibiu a atividade do trocador
Ca2+/H+ em aproximadamente 45% em MT (Fig. 25B) isoladas de esferoplastos de
células da cepa mutante de CaN.
O efeito de 500 µM Mn2+ totais (242 µM Mn2+ livre), ou seja, 27,2 vezes maior
que a concentração de Ca2+ no experimento (8,9 µM) inibiu a atividade das Ca2+-
ATPases apenas em 44, 35, 24 e 38% nas membranas do vacúolo, Golgi, RE/MP e
do EN da cepa mutante de calcineurina (cnb1; Fig. 27B).
Esses dados mostram que a mutação/inativação da calcineurina não
aumentou a sensibilidade das Ca2+-ATPases ao Mn2+. Nossos resultados cancelam
o possível papel da calcineurina em modular a afinidade das Ca2+-ATPases ao Mn2+
e não confirmam os dados de Wei e colaboradores (2000).
97
A Figura 28B mostra o efeito de 500 µM Mn2+ totais sobre a atividade do
trocador Ca2+/H+. Essa concentração de Mn2+ total inibiu a atividade do trocador em
48, 44, 41 e 17% nas frações de membranas do vacúolo, Golgi, RE/MP e do EN da
cepa mutante de calcineurina (cnb1).
Embora nossos resultados mostrem que Mn2+ pode promover uma baixa
inibição da atividade dos transportadores de Ca2+ devemos destacar que as
concentrações que utilizamos em todos os experimentos equivalem a uma
concentração livre Mn2+ elevadíssima (Tabela 9), muito acima das concentrações
fisiológicas.
Esses resultados juntos mostram que as Ca2+-ATPases assim como o
trocador Ca2+/H+ possuem baixíssima afinidade pelo Mn2+. A calcineurina não
modula a baixa afinidade dos transportadores de Ca2+ ao Mn2+, porque na sua
ausência observamos inibição da atividade dos transportadores de Ca2+ somente em
concentrações totais e livres de Mn2+ altíssimas.
Sugerimos que, provavelmente, outros transportadores específicos de Mn2+ e
não os transportadores de Ca2+ estariam envolvidos na homeostase de Mn2+ em
condições fisiológicas ou sobre condições de estresse por alto Ca2+ extracelular.
Esses resultados foram apresentados durante o Congresso Internacional de
transporte e energética em leveduras (25th SMYTE) e em discussão com o Professor
N. Nelson, este nos informou que resultados genéticos encontrados por sua equipe
concordam com os nossos dados bioquímicos e indicam a existência de
transportadores específicos para o Mn2+ (Comunicação pessoal) e fortalecendo
ainda mais nossa sugestão.
98
Fig. 23 - Efeito do Mn2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas MT de células de S. cerevisiae AA255, cujos esferoplastos não foram energizados pela glicose. Captação de Ca2+ (pmol Ca2+/mg de proteína de MT). O transporte foi determinado com 10 min de captação de 45Ca2+.
0
200
400
600
800
1000
1200
0 2 10 25 50
Concentração total de Mn2+ (M)
Cap
taçã
o de
Ca2+
Ca2+-ATPase Trocador
99
A
B
Fig. 24 - Efeito do Mn2+ sobre a atividade das Ca2+-ATPases nas MT de células de S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. (A) Células da cepa selvagem AA255 cresceram em meio YEPD suplementado ou não com 150 mM Ca2+; (B) Cepa selvagem (K699) e cepa mutante de calcineurina (K603 – cnb1). O transporte foi determinado com 10 min de captação de 45Ca2+. Esses são gráficos representativos de 3 experimentos.
0
2
4
6
8
10
12
0 0.1 0.2 0.5Concentração total Mn2+ (mM)
Ca2+
-ATP
ases
(nm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a) controle Ca2+
0
1
2
3
4
5
0 0.1 0.5
Concentração total Mn2+ (mM)
Ca2+
-ATP
ases
(nm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a)
K601 (Selv) K603 (cnb1)
100
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 0.1 0.5
Concentração total Mn2+ (mM)
Troc
ador
es C
a2+/H
+ (nm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a)
K601 (Selv)K603 (cnb1)
Fig. 25 - Efeito do Mn2+ sobre a atividade dos trocadores Ca2+/H+ nas MT de células de S. cerevisiae cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. (A) Células da cepa selvagem AA255 cresceram em meio YEPD suplementado ou não com 150 mM Ca2+; (B) Cepa selvagem (K699) e cepa mutante de calcineurina (K603 – cnb1). O transporte foi determinado com 10 min de captação de 45Ca2+. Esses são gráficos representativos de 3 experimentos.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 0.1 0.2 0.5
Concentração total Mn2+ (mM)
Troc
ador
es C
a2+/H
+ (nm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a) controle Ca2+
A
B
101
Mn2+ Total
(µM)
Ca2+ Total
(µM)
Mn2+ livre
(µM)
Ca2+ livre
(µM)
Excesso em
vezes de
Mn2+ livre
(Mn2+/Ca2+)
0 10,3 0 1,7 ----
2 10,3 0,00004 2,9 1,4x10-5
10 10,3 1,2 7,0 0,14
25 10,3 7,2 8,3 0,87
50 10,3 18 8,5 2,1
100 10,3 41 8,6 4,8
200 10,3 81 8,7 9,3
500 10,3 242 8,9 27,2
Tabela 9: Concentração total e livre dos íons Ca2+ e Mn2+ nos experimentos de captação de 45Ca2+. Os cálculos foram feitos utilizando o programa BAD (Bound And Determined; Brooks
& Storey, 1992)
102
Fig. 26 - Efeito de 100 M Mn2+ total sobre a atividade das Ca2+-ATPases em membranas intracelulares de células de S. cerevisiae AA255, cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. (A) As células cresceram em meio YEPD (controle); (B) as células cresceram em meio YEPD suplementado com 150 mM de Ca2+. Os resultados foram padronizados por 1 mg de proteína aplicado sobre o gradiente.
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Frações
Ca2+
-ATP
ases
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a) - Mn2+
+ 0.1 mM Mn2+
0
50
100
150
200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Frações
Ca2+
-ATP
ases
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a)
- Mn2+
+ 0.1 mM Mn2+
A
B
103
Fig. 27 - Efeito de 500 M Mn2+ total sobre a atividade das Ca2+-ATPases em membranas intracelulares de células das cepas selvagem e mutante de calcineurina de S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. (A) cepa selvagem de S. cerevisiae (K601) (B) cepa mutante de calcineurina de S. cerevisiae (K603 – cnb1). Os resultados foram padronizados por 1 mg de proteína aplicado sobre o gradiente.
0
50
100
150
200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Frações
Ca2+
-ATP
ases
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a) - Mn2+
+ 0.5 mM Mn2+
0
30
60
90
120
150
180
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Frações
Ca2+
-ATP
ases
(pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a)
- Mn2+
+ 0.5 mM Mn2+
A
B
104
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Troc
ador
es C
a2+/H
+ (pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a) - Mn2+
+ 0.5 mM Mn2+
0
25
50
75
100
125
150
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Frações
Troc
ador
es C
a2+/H
+ (pm
ol C
a2+/m
g de
pro
teín
a)
- Mn2+
+ 0.5 mM Mn2+
Fig. 28 - Efeito do Mn2+ na atividade do trocador Ca2+/H+ em membranas intracelulares de células de cepa selvagem e mutante de calcineurina de S. cerevisiae, cujos esferoplastos foram energizados com glicose extracelular. (A) cepa selvagem de S. cerevisiae (K601) (B) cepa mutante de calcineurina de S. cerevisiae (K603 – cnb1). Os resultados foram padronizados por um mg de proteína aplicado sobre o gradiente.
A
B
105
5. DISCUSSÃO
A comparação da captação de Ca2+ pela MT revela que tanto as Ca2+-
ATPases quanto os trocadores Ca2+/H+ foram ativados independente do tempo de
estresse por alto Ca2+. Esta observação vale para MT isoladas de esferoplastos
energizados ou não com glicose. Essa ativação dos transportadores de Ca2+ reflete
a mobilização total, e até esperada, dos sistemas transportadores de Ca2+ que
funcionam, coordenadamente, para controlar a baixa concentração de Ca2+ no
citosol, mantendo-os em níveis basais. Interessante notar que a estimulação da
atividade dos trocadores Ca2+/H+ de MT apresenta-se como característica chave
para sobrevivência de células de levedura durante o estresse permanente por alto
Ca2+ extracelular (Fig. 9A, Tabela 8), ou seja, quanto maior a inibição do crescimento
menor é a ativação dos trocadores Ca2+/H+. Não sabemos o que determina a
inibição do crescimento celular, mas uma das conseqüências e\ou razões foi a baixa
ativação dos trocadores. É lógico sugerir que provavelmente a V H+-ATPase, que
fornece a energia de gradiente químico de H+, pH, pode diminuir sua atividade em
resultado de estresse pelo Ca2+. Achamos, portanto, que quando a inibição de
crescimento e do trocador por estresse foi máxima, o gradiente de H+ feito pela V H+-
ATPase ainda aumentou (dados não apresentados). Isto significa que tanto a
inibição das V H+-ATPases quanto o aumento da permeabilidade das membranas
intracelulares para H+ não são candidatos para explicar a diminuição de atividade de
trocadores quando as células foram estressadas por alto Ca2+.
O fracionamento das MT e posterior análise dos transportadores de Ca2+ das
organelas da via secretória revelou que a estimulação das Ca2+-ATPases foi mais
alta no vacúolo com a tendência a diminuição na ordem vacúolo, Golgi, RE e EN
quando as células foram submetidas ao estresse por alta concentração de Ca2+ por
2,5 h (estresse de curto tempo) (Tabela 4). Quando elas tiveram mais tempo para
adaptação (crescimento celular com alto Ca2+ - estresse permanente) a preferência
de ativação encontrada para as Ca2+-ATPases de RE/MP e EN (Tabela 6), ou seja, a
tendência de ativação foi invertida seguindo a ordem EN, RE, Golgi e vacúolo (Figs 7
e 10; Tabelas 4 e 6B). Podemos sublinear também a contribuição dominante de
Ca2+-ATPases nas membranas do Golgi e Vacúolo (63% de captação de Ca2+) em
resposta ao estresse por curto tempo e quando as células tiveram mais tempo de
adaptação, as Ca2+-ATPases do RE/MP e EN passam a ser dominantes
106
contribuindo juntas com 63% e deixando para Golgi e vacúolo somente 37%. Vale a
pena notificar que o estresse de curto tempo por 2,5 h já fica provavelmente na
fronteira com estresse permanente (Fig. 7).
Interessantemente, observamos que a mesma tendência da ordem de
ativação para trocadores Ca2+/H+ quando a levedura foi exposta ao estresse
permanente por alto Ca2+ (Fig.11). Interpretamos estes resultados como indicação
do papel importante, se não dominante, do RE/MP e EN na homeostase de Ca2+ no
estresse permanente por alta concentração de Ca2+. Não sabemos, infelizmente, o
que aconteceu com a atividade dos trocadores Ca2+/H+ da via secretória quando o
estresse pelo alto Ca2+ foi de curto tempo. Experimentos futuros poderão completar
um quadro mais exato, mas sugerimos que a contribuição de trocadores do vacúolo
e Golgi foi similar ao das Ca2+-ATPases dessas organelas. Entretanto, esta sugestão
está de acordo com os dados publicados por outros pesquisadores que mostraram o
papel chave de trocador Ca2+/H+ vacuolar, Vcx1p, em resposta imediata ao aumento
de Ca2+ extracelular (Miseta et al., 1999).
Nossos resultados (sub-capitulo 4.1) evidenciam, claramente, que as
membranas celulares foram bem separadas durante o procedimento de isolamento
de membranas. Observamos que as frações de membranas do vacúolo comigraram
com o pico de atividade do trocador Ca2+/H+ (Fig. 15) e também com o pico principal
de atividade da fosfatase alcalina e -manosidase, as enzimas marcadoras do
vacúolo (Fig. 4) (Samarão et al., 2009).
No presente momento, todos os pesquisadores ainda consideram que o
aumento de Pmc1p em resposta ao estresse por alto Ca2+ ocorria apenas nas
membranas vacuolares (Cunningham & Fink, 1994; Marchi et al., 1999; Yoshimoto et
al., 2002), Entretanto, em estresse permanente por alto Ca2+, revelamos que o
aumento do conteúdo da Ca2+-ATPase de vacúolo (Pmc1p) foi encontrada não
somente no vacúolo mas também em outras organelas da via secretória, inclusive a
população de vesículas secretórias mais leves que vacúolo (Fig.15B). O aumento da
Pmc1p no vacúolo foi de 8 vezes enquanto de nas outras organelas foi de 17,5
vezes (Fig. 15).
O gene PMC1 foi inicialmente identificado como um homologo de Ca2+-
ATPase de membrana plasmática de células animais, entretanto em levedura foi
mostrado que essa enzima esta localizada no vacúolo e é de extrema importância
para a tolerância a altas concentrações de Ca2+. Portanto, sugerimos que em
107
condições de estresse por alta concentração de Ca2+ a Pmc1p poderia sofrer uma
modificação (transcricional e/ou pós-transcricional) que a direcionasse
adicionalmente para a MP.
Devemos também nos ater ao fato que a cepa K699 (cepa que teve o gene
PMC1 conjugado com o gene da hemoaglutina A) é uma cepa transformada. E que
ainda não se conhece o efeito da transformação gênica sob a cinética enzimática.
Os dados do nosso grupo mostra que o Km de Ca2+-ATPase de MT de cepa
selvagem de S. cerevisiae (X-2180) na ausência e presença de glicose é de 45 e
51 nM respectivamente (Ribeiro, 2006), entretanto o Km da Ca2+-ATPase em
membranas isoladas de vacúolo da cepa Pmc1::HA foi de 4,3 µM (Takita et al.,
2001). Com base nesses dados, observamos que o Km para Ca2+-ATPase da cepa
transformada é de aproximadamente 100 vezes maior que para a cepa selvagem, ou
seja, a transformação gênica no processo da conjugação de PMC1::HA reduziu a
afinidade da enzima ao substrato.
Portanto, sugerimos que o aumento abrupto do conteúdo de Pmc1p quando
as células de K699 (cepa PMC1::HA) cresceram estressadas com alta concentração
de Ca2+ se deve a tentativa fisiológica de compensar a inibição da afinidade da
enzima ao substrato.
Essa hipótese é baseada no conhecimento da distribuição da MP em
gradiente da sacarose, geralmente, entre as frações 10 a 27-29 (Samarão, 2003;
Samarão et al., 2009). Ela também está de acordo com existência de um pico de alto
conteúdo de Pmc1p nas vesículas secretórias, que transportam as proteínas para a
MP. Já planejamos, experimentalmente, avaliar se esse transportador realmente se
deslocou ou não para a MP em condições de estresse por alto Ca2+. Para isso,
iremos modificar a MP com concanavalina A isolando-as das membranas
intracelulares. Posteriormente, realizaremos a separação de membranas
intracelulares. E por fim será analisado de conteúdo de Pmc1p nessas MP e nas
membranas intracelulares.
A contribuição da Pmc1p em outras organelas da via secretória e/ou MP não
descarta a possibilidade a ativação de Ca2+-ATPases do RE, e da própria MP em
resposta ao estresse por alto Ca2+. Visto que em condições sem estresse pelo Ca2+,
cada compartimento é equipado com sua própria Ca2+-ATPase (Okorokov ,1997;
Okorokov, Lehle,1998, Okorokov et al., 2001; Silva, 2003, Ribeiro, 2007).
108
Embora ausência de um gene com alta homologia para Ca2+-ATPases de RE
de outros organismos em levedura, alguns pesquisadores sugeriram que a
homeostase de Ca2+ do RE de levedura era suportado pela Ca2+-ATPase do Golgi
(Pmr1p) (Durr et al.,1998), entretanto vale a pena destacar que a ausência do gene
PMR1 promoveu o aumento da atividade das Ca2+-ATPases nessas membranas e
não a redução (Okorokov & Lehle, 1998). Foi proposto como provável candidato a
Ca2+-ATPase de RE o produto dos genes SPF1 e CTA4 em S. cerevisiae e S.
pombe respectivamente, pois estes estão envolvidos na homeostase de Ca2+
(Cronim et al., 2002; Okorokova-Façanha et al., 2002). Em 2007, o grupo da Prof.
Okorokova-Façanha fez uma comunicação no congresso internacional (SMYTE
2007) onde mostrou atividade de Ca2+-ATPase na cepa selvagem de S. pombe
comparando esse transporte ao encontrado na cepa mutante de Cta4p, descrevendo
a Cta4p como uma Ca2+-ATPase de RE em S. pombe (Okorokova-Façanha et al.,
2007). Portanto, podemos sugerir que a atividade da Ca2+-ATPase encontrada nas
membranas enriquecidas de membranas do RE/MP em S. cerevisiae são referentes
a atividade do produto do gene de SPF1.
Para explicar o aumento da atividade das Ca2+-ATPases nas membranas do
RE/MP e nas membranas do EN/RE/MP, o outro candidato pode ser Ca2+-ATPase
de MP. Apesar de nunca ter sido encontrado: (1) gene homólogo Ca2+-ATPase de
MP de outros organismos localizado na MP e (2) o transporte de Ca2+ em
membranas purificadas, sugerimos que a Ca2+-ATPase de MP pode ser ativada
significativamente e exclusivamente em resultado ao estresse por alta concentração
de Ca2+.
A CaN pode ser ativada pelo aumento da concentração de Ca2+ no citosol e
esta, consequentemente, estimula a expressão do gene PMC1 (Ca2+-ATPase
vacuolar) (Cunningham e Fink, 1994; Yoshimoto et al., 2002) e PMR1 (Yoshimoto et
al., 2002). Portanto, para analisar o efeito da CaN sobre a atividade das Ca2+-
ATPases utilizamos seu antagonista, a ciclosporina A (CsA). A CsA diminuiu a
estimulação das Ca2+-ATPases pelo alto Ca2+ extracelular em 50% nas membranas
totais isoladas de células estressadas por curto tempo e não energizadas. O
fracionamento das membranas revelou que a CsA reduziu a estimulação de Ca2+-
ATPases em 42, 24 e 42% vezes na membranas do RE, Golgi e vacúolo
respectivamente (Fig. 7; Tabela 5).
109
O estresse permanente por alto Ca2+ em células não energizadas pela glicose
estimulou a atividade dos trocadores Ca2+/H+ em 1,8, 1,5, 1,8 e 1,2 vezes nas
vesículas de membranas enriquecidas por membranas de EN/RE/MP, RE/MP, Golgi
e vacúolo respectivamente (Fig. 11; Tabela 7). É a primeira vez que é mostrada a
ativação do trocador ao estresse por alta concentração de Ca2+ extracelular. A
opinião amplamente aceita pelos pesquisadores na área é que o estresse por alto
Ca2+ ativa a CaN e esta ativada inibi a atividade do trocador Vcx1p (trocador Ca2+/H+
vacuolar) (Cunningham e Fink, 1996). Entretanto, os experimentos feitos por
Cunningham e Fink (1996) não mostram a atividade direta dos trocadores Ca2+/H+
mas a captação de Ca2+ não-trocável nas células. Eles utilizaram como controle a
cepa selvagem crescida na presença de 5 mM de Ca2+ assim como os mutantes
duplos, vcx1pmc1 e pmc1cnb1. Portanto, trata-se do efeito da calcineurina
durante uma condição de estresse “brando” por Ca2+ extracelular em nenhum
momento foi analisado apenas o efeito do estresse por alto Ca2+ (com e sem Ca2+
extracelular) diretamente sobre a atividade do trocador Ca2+/H+.
Entretanto nossos resultados corroboram com a opinião de que cada
compartimento da via secretória é equipado com seu próprio transportador de Ca2+
(Ca2+-ATPase e trocador Ca2+/H+) (Okorokov et al., 1995, Okorokov, 1997; Okorokov
et. al., 2001). Além de mostrar que esses trocadores respondem de forma positiva
ao estresse por alto Ca2+ e que provavelmente os trocadores Ca2+/H+ localizados
nas membranas do Golgi, RE/MP e EN/RE/MP são regulados positivamente pela
calcineurina. Para fortalecer ainda mais esse fato, Miseta e colaboradores (1999)
mostraram que em estresse instantâneo de Ca2+, o responsável pela eliminação
rápida do Ca2+ do citosol é o Vcx1p (Esquema 5). Em plantas, o Ca2+ extracelular
estimula a expressão do RNAm de OsCAX1 provável trocador Ca2+/H+ em O. sativa
(Kamiya et al., 2006). E em A. nidulans, um dos prováveis trocadores Ca2+/H+,
AN5821.3 é controlado pelo fator de transcrição CrzA (regulado pela CaN em A.
nidulans) em resposta ao Ca2+ externo (Hagiwara et al., 2008). Sugerimos que
estudos adicionais podem aprofundar nossos conhecimentos sobre a atividade do
trocador e o papel de calcineurina em condições de estresse por alto Ca2+. Mas,
agora, juntos nossos resultados ilustram que não apenas o aumento das atividades
das Ca2+-ATPAses mas também o aumento de atividade dos trocadores em células
estressadas e chave para a detoxificação do Ca2+ em citosol de levedura e
crescimento normal.
110
Até o momento, nada foi descrito na literatura sobre o efeito da CaN na
atividade dos transportares de Ca2+ em condições fisiológica, ou seja, as células
crescendo em meio YEPD na ausência de estresse por alto Ca2+.
A inativação da CaN inibiu em 45% e 55% a atividade das Ca2+-ATPases e
dos trocadores Ca2+/H+ respectivamente em MT isoladas de células não estressadas
(Fig. 19). E mais, a inibição de cada tipo de transportador Ca2+ foi achada em todas
as organelas da via secretória (Fig. 20 e 21). Portanto, nossos dados mostram que
CaN regula positivamente as Ca2+-ATPases não somente em condições de estresse
por alto Ca2+ (Cunningham and Fink, 1994; Yoshimoto et al., 2002) mas também em
condições “normais”, sem esse estresse.
Um dos fatos novos achados nesse trabalho foi a inibição da atividade do
trocador Ca2+/H+ na ausência da CaN. Esse fato muda o paradigma de que os
trocadores Ca2+/H+, incluindo Vcx1p são controlados negativamente pela CaN
(Cunningham e Fink, 1996). Nossos dados mostram, claramente, a necessidade da
CaN para funcionamento normal dos trocadores Ca2+/H+ , ou seja, que CaN regula
positivamente a atividade dos trocadores Ca2+/H+.
Nossos dados evidenciam que não apenas a atividade da Ca2+-ATPase e do
trocador Ca2+/H+ vacuolar (Pmc1p e Vcx1p respectivamente) estão sobre o controle
da CaN, mas todos os transportadores de Ca2+ das organelas da via secretória estão
sob sua regulação quando as leveduras não foram estresse por alto Ca2+.
Interessantemente, a CaN controla a atividade de cada tipo de
transportadores de Ca2+ em todas compartimentos, similarmente, ou seja, a
regulação é não seletiva em condições em que as células não são estressadas.
Em concordância com opinião atual os vacúolos são organelas dominantes
em captação e armazenamento de Ca2+ em leveduras e fungos (Okorokov et al,
1985a, Okorokov et al, 1985b, Okorokov, 1985, White & Gadd, 1986; Marty, 1999).
Entretanto, nosso trabalho revela que as outras organelas (EN, RE/MP e Golgi)
contribuem mais para a captação de Ca2+ em condições com ou sem estresse por
alta concentração de Ca2+ que o vacúolo.
Mas, o vacúolo também é importante, pois fizemos duas descobertas,
importantíssimas, para uma nova visão sobre seu papel em homeostase de Ca2+.
Sem estresse por alto Ca2+, a ausência do gene PMC1 (pmc1 – Ca2+-ATPase de
vacúolo – K605) inibiu a atividade das Ca2+-ATPases em 58, 41, 37 e 71% nas
membranas do EN/RE/MP, RE/MP, Golgi e vacúolo respectivamente (Fig. 22A). Já a
111
inativação do gene VCX1 (vcx1::URA3 – trocador Ca2+/H+ vacuolar – K617), trocador
de Ca2+/H+, inibiu em aproximadamente 30 e 64 % da atividade nas membranas
vacuolares e no EN respectivamente (Fig. 22B).
A atividade do trocador no mutante pmc1 não apresentou alteração
significante. Porém, a inativação do trocador Ca2+/H+ vacuolar inibiu
significativamente a atividade do trocador não apenas nas membranas do vacúolo
(92%), mas em todas as outras organelas da via secretória em média 80% (Fig. 22).
Portanto nossos resultados revelam que a deleção do gene PMC1 causa
inibição da atividade das Ca2+-ATPases de outras organelas, assim como a
inativação do gene VCX1 causa inibição da atividade dos trocadores Ca2+/H+ de
outras organelas. Interessantemente, que resultados semelhantes foram
encontrados quando a CaN foi anulada, ou seja, diminuição da atividade dos dois
transportadores de Ca2+.
Foi descrito na literatura que o mutante triplo pmr1pmc1vcx1 (Ca2+-ATPase
de Golgi, Ca2+-ATPase e trocador Ca2+/H+ vacuolar respectivamente) é inviável
(Cunningham e Fink, 1996). Entretanto, hoje, podemos sugerir que a inviabilidade
desse mutante triplo é devido ao papel regulatório da Pmc1p e do Vcx1p e da
importância da Ca2+-ATPases do Golgi em fornecer ao Golgi a concentração de Ca2+
necessária para o correto empacotamento protéico. Essa sugestão está de acordo
com a existência de outras Ca2+-ATPases e de trocadores Ca2+/H+ nas organelas da
via secretória além dos vacuolares (Okorokov & Lehle, 1998; Okorokov et al, 2001,
Silva, 2003; Ribeiro, 2007).
Nossos resultados evidenciam que o gene PMC1 e o VCX1 são necessários
para a atividade dos transportadores de Ca2+ nas outras organelas. Isto indica que
seus genes e/ou os próprios transportadores Ca2+ vacuolar funcionam como “líderes”
ou “sinalizadores” ou “determinadores” na homeostase de Ca2+.
Recentes trabalhos têm mostrado que a Ca2+-ATPase de Golgi, Pmr1p, pode
transportar também Mn2+. Essa intrigante maleabilidade da Pmr1p em transportar
outro íon diferente de Ca2+ fez com que surgissem diversas questões como: (1) O
Ca2+ é conhecido como o principal íon sinalizador intracelular, mas para exercer
essa função, seus transportadores não precisam ser específicos? (2) Por que a
Ca2+-ATPase do vacúolo não foi analisada como possível candidata a transportar
Mn2+, uma vez que o vacúolo é estabelecido como principal organela-armazenadora
de diversos íons, incluindo Mn2+. (3) Se cada compartimento da via secretória possui
112
sua própria Ca2+-ATPase, estas também podem transportar Mn2+? 4) Trocadores
Ca2+/H+, considerados pela maioria de pesquisadores como transportadores de
baixa afinidade para Ca2+, podem transportar Mn2+?
Nossos resultados mostram que apenas concentrações totais de Mn2+ acima
de 100 µM, ou seja, de 200 e 500 M podem inibir tanto a atividade das Ca2+-
ATPases quanto do trocador Ca2+/H+ em MT, esses resultados foram encontrados
em duas cepas selvagens diferentes, AA255 e K699 (Fig. 24, Fig. 25).
Precisamos chamar atenção para as concentrações totais de Mn2+ de 200 e
500 µM correspondem a 81 e 242 M de Mn2+ livre respectivamente, ou seja, essas
concentrações livres de Mn2+ são maiores em 9,3 e 27,2 vezes que a concentração
de Ca2+ livre. Isto significa que essas concentrações estão muitíssimo acima da
concentração fisiológica de Mn2+ livre, que segundo Professor N. Nelson, essa
concentração é bem menor que a concentração livre de Ca2+ (100 nM)
provavelmente, em nível de pM (comunicação pessoal no SMYTE – 2007).
Nossos resultados não concordam com os dados da literatura que indicam
que 10 µM de Mn2+ inibi 50% da atividade das Ca2+-ATPases nas membranas do
Golgi (Wei et al., 2000). Esses autores ainda apresentam que mutação na Gln 783,
localizada na interface citoplasmática da hélice transmembrana M6, pode alterar a
seletividade para o Ca2+ e o Mn2+, como por exemplo, a substituição desse resíduo
por Ala confere a perda forte e seletiva do transporte de Mn2+ pela Pmr1p. Mas, esse
grupo de pesquisa fez essas determinações a partir da super-expressão de Pmr1p
no mutante triplo de pmc1pmr1cnb1 (mutante deficiente em Ca2+-ATPase de
vacúolo, Ca2+-ATPase de Golgi e Calcineurina respectivamente; cepa K616 - (“não
viável”).
Inicialmente, acreditamos que a afinidade aumentada para Mn2+ conseguida
em seus experimentos foi promovida pela ausência da CaN, uma importante
proteína reguladora envolvida na homeostase de diversos íons, talvez até metais
pesados.
Nossos resultados mostraram o contrario, pois nem na ativação da CaN pelo
estresse de alto Ca2+ nem na inativação da mesma, as Ca2+-ATPases e os
trocadores Ca2+/H+ possuem baixa afinidade pelo Mn2+. Entretanto, o resultado
obtido com as MT poderia mascarar a contribuição de um único compartimento da
via secretória, o Golgi. Foi feito, portanto, o fracionamento dessas MT em gradiente
descontínuo de densidade de sacarose, esperando que esta inibição fosse
113
encontrada no mínimo nas membranas do Golgi, já que o produto do gene PMR1,
descrito como uma Mn2+-Ca2+-ATPase está localizada nesta organela (Wei et al.,
2000).
A concentração total de 100 M Mn2+ (43 M Mn2+ livre e 4,8 vezes maior que
a concentração de Ca2+ livre) inibiu em aproximadamente 15% da atividade das
Ca2+-ATPase nas membranas do Golgi quando a CaN não foi ativada, essa inibição
pode ser apenas uma variação experimental (Fig. 26A), e quando a CaN foi ativada
pelo estresse de Ca2+ não ocorreu nem a inibição nem nas membranas do Golgi.
Esses resultados confirmam a especificidade das Ca2+-ATPases pelo Ca2+,
principalmente em condições de estresse por altas concentrações de Ca2+
extracelular.
Os resultados encontrados até o momento não estão de acordo os dados da
literatura que mostram que 10 µM livre de Mn2+ inibi 50% da atividade da Ca2+-
ATPase de Golgi (Wei et al., 1999). A mutação/inativação da calcineurina não
aumentou a sensibilidade das Ca2+-ATPases ao Mn2+. Nossos resultados cancelam
o possível papel da calcineurina em modular a afinidade das Ca2+-ATPases ao Mn2+
e não estão de acordo com a publicação de Wei e colaboradores (2000).
Um fato importante, é que os estudos que determinaram que a PMR1 (gene
de Ca2+-ATPase de Golgi de levedura), SPCA1 (gene de Ca2+-ATPAse da via
secretória de células humanas) e ECA1 (gene de Ca2+-ATPAses de RE de planta)
podem transportar Mn2+ com alta afinidade foi realizado a partir da super-expressão
dos respectivos genes no mutante triplo de pmc1pmr1cnb1 (mutante deficiente em
Ca2+-ATPase de vacúolo, Ca2+-ATPase de Golgi e Calcineurina respectivamente;
cepa K616)
Vale a pena também sublinear que os experimentos de Wei e colaboradores
(1999) foram realizados com construção de genes muito artificial o que não permite
no momento de saber as conseqüências destas combinações sobre homeostase
iônico. Já nossos dados alarmam sobre uma ligação ainda não explicável entre
genes de transportadores de Ca2+ e/ou os próprios transportadores quando somente
um gene foi destruído (olhar acima). E mais, não existem ainda trabalhos que
mostram o transporte de Mn2+ em membranas purificadas de cepa selvagem e do
mutante pmr1 em condições fisiológicas de Mn2+ e Ca2+ presentes simultaneamente.
Somente este tipo de experimento pode verificar a hipótese\especulação que Pmr1p
pode transportar Mn2+
114
Nossos resultados sobre a inativação do gene PMC1 sugere um possível
papel regulatório da Ca2+-ATPase vacuolar sobre a atividades das Ca2+-ATPases de
outras organelas. Visto esse novo conceito, realmente, não podemos prever o que
aconteceria com a Ca2+-ATPase de Golgi na ausência de duas enzimas regulatórias
(CaN e a Ca2+-ATPase vacuolar).
Esses resultados juntos sugerem que as Ca2+-ATPases assim como o
trocadores Ca2+/H+ possuem baixíssima afinidade pelo Mn2+ em cepas selvagem. A
calcineurina não modula a baixa afinidade dos transportadores de Ca2+ ao Mn2+,
porque na sua ausência (cnb) não observamos inibição da atividade dos
transportadores de Ca2+ pelo Mn2+ ainda que com concentrações totais e livres
elevadíssimas de Mn2+.
Concluímos que tanto as Ca2+-ATPases, incluindo a bomba de Golgi, Pmr1p,
quanto os trocadores Ca2+/H+ não transportam Mn2+ em condições fisiológicas em S.
cerevisiae. Sugerimos que, provavelmente, outros transportadores específicos de
Mn2+ e não os transportadores de Ca2+ estariam envolvidos na homeostase de Mn2+
em condições fisiológicas ou sobre condições de estresse por alto Ca2+ extracelular.
No SMYTE (2007), o Professor N. Nelson nos informou que resultados genéticos
encontrados por sua equipe concordam com os nossos resultados bioquímicos e
indicam a existência de transportadores específicos para o Mn2+ (comunicação
pessoal)
115
6. CONCLUSÕES
A atividade dos transportadores de Ca2+ de células energizadas ou não com
glicose extracelular de diferentes cepas selvagens e cepas mutantes de
Saccharomyces cerevisiae foram analisadas, dependente de tempo de estresse pelo
alto Ca2+ e sem este estresse. Concluímos que:
(1) As populações de membranas das organelas da via secretória não são
contaminadas por membranas vacuolares. A atividade das Ca2+-ATPAses e dos
trocadores Ca2+/H+ em outras organelas da via secretória não é devido a
contaminação por membranas vacuolares.
(2) Independente do tempo de estresse por alto Ca2+ as células de levedura
energizadas ou não por glicose extracelular aumentaram a captação de Ca2+
ativando tanto as Ca2+-ATPases quanto os trocadores de Ca2+/H+.
(3) As Ca2+-ATPases do vacúolo e do Golgi foram as maiores contribuintes
(63%) na captação de Ca2+ pelas Ca2+-ATPases em células não energizadas e
estressadas pelo Ca2+ por curto tempo. Mas durante o estresse permanente as
enzimas de RE, MP e EN dominaram nesse processo (63%). A energização das
células não mudou essa interessante dinâmica das respostas de Ca2+-ATPase de
diferentes organelas determinada pelo tempo de estresse.
(4) A efetividade da ativação dos trocadores Ca2+\H+ e das Ca2+-ATPases é
um importante fator para diminuir a inibição do crescimento da levedura durante ao
estresse permanente por Ca2+. Juntos nossos resultados indicam que todos os
transportadores de Ca2+ respondem de maneira coordenada para reduzir o nível
tóxico de Ca2+ livre no citosol e indicam a grande importância das organelas
diferentes dos vacúolos na homeostase de Ca2+.
(5) O estresse pelo alto Ca2+ aumentou simultaneamente tanto atividade
quanto o conteúdo de Ca2+-ATPase de vacúolo (Pmc1p) nas membranas vacuolares
em 1,8 e 8 vezes respectativamente. Surpreendentemente, seu conteúdo cresceu
ainda mais (17,5 vezes) nas outras organelas da via secretória, incluindo vesículas
116
secretórias. Isto mostra que a Pmc1p é deslocada para outras organelas de via
secretoria e/ou membrana plasmática em condições de estresse pelo alto Ca2+.
(6) Na ausência de estresse a inativação da CaN inibiu a atividade das Ca2+-
ATPases e dos trocadores Ca2+/H+, semelhantemente, em todas as organelas da via
secretória. Portanto, a CaN controla a atividade dos transportadores de Ca2+ e sua
contribuição nas organelas da via secretória de maneira similar, ou seja, essa
regulação não é seletiva.
(7) A deleção do gene PMC1 (pmc1 – Ca2+-ATPase de vacúolo) diminuiu a
atividade das Ca2+-ATPases tanto no vacúolo (71%) quanto em outras organelas
(43%) mas a atividade dos trocadores Ca2+/H+ reduziu somente 9%. A inativação do
gene VCX1 (vcx1::URA3 – trocador Ca2+/H+ vacuolar) inibiu a atividade de trocador
em 94% e 83% no vacúolo e em outras organelas da via secretória,
respectivamente, sem interferir significativamente com a atividade das Ca2+-
ATPases (26% de inibição). Sugerimos um papel chave dos genes dos
transportadores de Ca2+ vacuolares e\ou mesmos os próprios transportadores na
regulação de transportadores de Ca2+ do mesmo tipo em outras organelas.
(8) Tanto as Ca2+-ATPases de levedura, incluindo a enzima do Golgi, quanto
os trocadores Ca2+/H+ não transportam Mn2+ quando a sua concentração não está
acima da concentração fisiológica, mais ou menos 500.000 vezes. Essa alta
afinidade de transportadores de Ca2+ pelo Ca2+ não tem dependência da
calcineurina.
117
7. REFERÊNCIAS
Abeijon, C.; Orlean, P.; Robbins, P.W. & Hirschberg, C.B. (1989) Topografia of
glycosylation in yeast: Characterization of GDP mannose transport and luminal
guanosine diphosphatase activities in Golgi-like vesicles. Proc Natl. Acad. Sci.USA
86, 6935 – 6939.
Aitken A, Klee CB & Cohen P (1984). The structure of the B subunit of
calcineurin. Eur J. Biochem 139, 663-671.
Aiello, D.P., Fut, L., Misetas, A., Sipos, K. & Bedwell, D. M. (2004) The Ca²+
homeostasis defects in a pgm2� strain of saccharomyces cerevisiae are caused by
excessive vacuolar Ca²+ uptake mediated by the Ca²+- ATPase Pmc1p. The Journ.
Biolog. Chemist. 279:37, 38495 – 38502.
Aiello, D.P., Fut, L., Misetas, A. & Bedwell, D. M. (2002) Intracellular Glucose
1-Phosphate and Glucose 6-Phosphate Levels Modulate Ca²+ Homeostasis in
Saccharomyces Cerevisiae. The Journ. Biolog. Chemist. 277:48, 45751 – 45758.
Anraku, Y. (1995). Vacuolar proton pump. 10th International Workshop on
Plant Membrane Biology, Regensburg, L 01.
Antebi, A. & Fink, G.R. (1992). The yeast Ca2+-ATPase homologue, PMR1 is
required for normal Golgi function and localizes in novel Golgi-like distribution. Molec.
Biol. Cell. 3, 633-654.
Banta, L.M., Robinson, J. S., Klionsky, D. J. & Emr, S.D. (1988). Organelle
assembly in yeast: characterization of yeast mutants defective in vacuolar biogenesis
and protein sorting. J. Cell Biol. 107, 1369 – 1383.
Bierer BE, Hollander G, Fruman D & Burakoff SJ (1993). Cyclosporin A and
FK506: molecular mechanism of immunosupression and probes for transplantion
biology. Curr Opin Immunol 5, 763-773.
118
Bowman, B.J. & Bowman, E.J. (1986). H+-ATPases from mitochondria,
plasma membranes, and vacuoles of fungal cells. J. Memb. Biol. 94, 83 – 97.
Bowman, E.J., Siebers, A. & Altendorf, K. (1988). Bafilomycins: a class of
inhibitors of membranes ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7972 –7976.
Brooks e Storey (1992) Bound and Determined: A computer programmer for
making buffer of defined ion concentration. Anal. Biochem 201: 119 -126.
Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quatitaties of protein utilizing principal of dye binding. Ann. Biochem. 72,
248 - 254.
Bush, D.S. (1995) Calcium regulation in plant cells and its role in signaling.
Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 46, 95 – 122.
Calvert, M.C. & Sanders, D. (1995). Inositol Trisphosphate-dependent and –
independent Ca2+ mobilization pathways at the vacuolar membrane of Candida
albicans. J. Biol. Chem 270, 7272 -7280.
Campbell, A.K. (1983). Intracellular calcium, its universal role as regulator,
John Wiley & Sons Limited, Chichester.
Carafoli, E. (1992) The Ca2+ pump of the Plasma membrane. J. Biol. Chem
297 (4): 2115 - 2118
Carafoli, E. (1987). Intracellular calcium homeostasis. Annu. Rev. Biochem.
56, 395 – 433.
Catty, P. & Goffeau, A. (1996). Identification and phylogenetic classification of
eleven putative P-type calcium transport ATPase genes in the yeasts
Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Biosci. Reports 16, 75
– 85.
119
Catty, P., d’Exaerde, A. K. & Goffeau, A. (1997).The complete inventory of the
yeast Saccharomyces cerevisiae P-type transport ATPases. FEBS Lett. 409, 325 –
332.
Chang, A & Slayman, C.W. (1991) Maturation of the yeast plasma membrane
H+-ATPase involves phosphorilation during intracellular transport. J. Cell Biol. 115,
289 – 295.
Cellier, M., G. Prive, A. Belouchi, T. Kwan, V. Rodrigues, W. Chia, and P.
Gros. (1995). Nramp defines a family of membrane proteins. Proc. Natl. Acad.
Cheng, N.H., Pittman, J.K., Shigaki, T. & Hirschi, K.D. (2002) Characterization
of CAX4, an arabidopsis H+/cation antiporter. Plant Physiol. 128:1245-1254.
Chen XZ, Peng JB, Cohen A, Nelson H, Nelson N, Hediger MA. (1999) Yeast
SMF1 mediates H(+)-coupled iron uptake with concomitant uncoupled cation
currents. J Biol Chem., 274 (49): 35089-94.
Clipstone, NA & Crabtree GR (1992) Identification of calcineurin as a key
signal enzyme in T-lymphocyte activation. Nature 357, 695-697.
Cohem P (1989) The struture and regulation of protein phosphatase. Annu Ver
Biochem 58, 453-508.
Corbett, E.F. & Michalak, M (2000). Calcium, a signaling molecule in the
endoplasmic reticulum? TIBS 25, 307 – 311.
Crabtree, G.R. (2001).Calcium, calcineurin, and the control of transcription. J
Biol Chem. 276, 2313 - 2316.
Cronin,S.R., Rao, R. & Hampton, R.Y. (2002). Cod1p/Spf1p is a P-type
ATPase involved in ER function and Ca2+ homeostasis. J Cell Biol., 157, 1017 - 28.
120
Cunningham, K. W. & Fink, G. R. (1996). Calcineurin inhibits VCX1–
dependent H+/Ca2+ exchange and induces Ca2+-ATPases in Saccharomyces
cerevisiae. Mol. Cel. Biol. 16, 2226 – 2237.
Cunningham, K.W. & Fink, G.R. (1994). Ca2+ transport in Saccharomyces
cerevisiae. J. Exp. Biol. 196, 157 – 166.
Cunningham, K.W. & Fink, G.R. (1994). Calcineurin-dependent growth control
in Saccharomyces cerevisiae mutants lacking PMC1, a homolog of plasma
membrane Ca2+-ATPase. J. Cell Biol 124, 351-363.
Cyert Ms, (2001) Genetic analysis of calmodulin and its targets in
saccharomyces cerevisiae. Annu Rev Genet 35:647-672.
Dammann, H., Hellstern, S., Husain, Q. e Mutzel, R. (1996) Primary struature,
expression and developmental regulation of a dictyostelium calcineurin a homolog.
Eur J. Biochem 238:391-399.
Dixon, D., Brandt, N. & Haynes, D. H. (1984). Chlorotetracycline fluorescence
is a quantitative measure of the free internal Ca2+ concentration achieved by active
transport. J. Biol. Chem. 256, 13737 – 13741.
Denis, V. & Cyert, M.S. (2002) Internal Ca²+ release in yeast is triggred by
hypertonie shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell Biolog. 156:29-
34.
Dunn, T., Gable, K. & Beeler, T. (1994). Regulation of cellular Ca2+ by yeast
vacuoles. J. Biol. Chem. 269, 7273 – 7278.
Durr, G., Strayle, J., Plemper, R., Elbs, S., Klee, S.K., Catty, P., Wolf, D. and
Ruldolph, H.K. (1998) Mol. Biol. Cell 9, 1149 -1162.
121
Feldman, R.I., Bernstein, M. & Schekman, R. (1987). Product of SEC53 is
required for folding and glycosylation of secretory proteins in the lumen of the yeast
endoplasmic reticulum.J Biol Chem. 262, 9332 - 9339.
Fischer, M., Schnell, N., Chattaway, J., Davies, P., Dixon, G. & Sanders, D.
(1997) The saccharomyces cerevisiae CCH1 gene is involved in calcium influx and
mating. FEBS Lett. 419:259-262.
Fu L, Miseta A, Hunton D, Marchase RB & Bedwell (2000) Loss of the major
isoform of phosphoglucomutase results in altered calcium homeostasis in
Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem 275, 5431-5440.
Gadd, G.M. (1994) Signal transduction in fungi. The Growing Fungus. Edited
by Neil A. R. Grow and Geoffrey M. Gadd. Chapman & Hall, London, 183 - 210.
Gelli, A. & Blumwald, E. (1997). Hyperpolarization-activated Ca2+-permeable
channels in the plasma membrane of tomato cells. J Membr Biol. 155, 35 - 45.
Giannini, J.L., Holt, J.S. & Briskin, D.P. (1988). Isolation of sealed plasma
membrane vesicles from Phytophthora megasperma f. sp glycines. II. Partial
characterization of Ca2+ transport and glyceollin effects. Arch. Biochem. Biophys.
266, 644 – 649.
Hagiwara, D., Kondo, A., Fujioka, T. & Abe, K. (2008) Functional analysis of
C2H2 zinc finger transcription factor CrzA involved in calcium signaling in Aspergillus
nidulans. Curr. Genet. 54:325-338.
Halachmi, D. & Eilam, Y. (1989). Cytosolic and vacuolar Ca2+ concentrations
in yeast measured with Ca2+-sensitive dye Indo-1. FEBS Lett. 256, 55 – 61.
Halachmi, D. & Eilam, Y. (1993). Calcium homeostasis in yeast cells exposed
to high concentrations of calcium, roles of vacuolar H+-ATPase and cellular ATP.
FEBS letters 316, 73 – 78.
122
Halachmi, D. & Eilam, Y. (1996) Elevated cytosolic free Ca2+ concentrations
and massive Ca2+accumulation within vacuoles, in yeast mutanat lacking PMR1, a
homolog of Ca2+-ATPase. FEBS Letters 392, 194 –200.
Hedrich, R & Neher,E (1987). Cytoplasmic calcium regulates voltage
dependent ion channels in plant vacuoles. Nature 329, 833 – 836.
Hiraga, K., Tahara, H., Taguchi, Tsuchiya, E., H., Fukui, S. & Miyakawa, T.
(1991). Inhibition of membrane Ca2+-ATPase of Saccharomyces cerevisiae by
mating pheromone alpha-factor in vitro. J. Gen. Microbiol. 137, 1– 4.
Hiromi Gunshin, Bryan Mackenzie, Urs V. Berger,Yoshimi Gunshin*, Michael
F.Romero, Walter F. Boron, Stephan Nussberger, John L. Gollan & Matthias A.
Hediger (1997) Cloningandcharacterizationof amammalian proton-coupled metal-ion
transporter. NATURE 388, 482 – 488.
Hirschi, K. (2001) Vacuolar H+/Ca²+ transport: who’s directing the traffic? Plant
Sci. 6:1360-1385.
Hirschi, K.D., Korenkov, V.D., Wilganowswi, N.L.,& Wagner, G.J. (2000)
Expression of Arabidopsis CAX2 in tobacco. Altered mental accumulation and
increased manganese tolerance. Plant Physiol. 124:125-133.
Hirschi, K.D., Zhen, R.G., Cunningham, K.W., Rea, P.A. & Fink, G.R. (1996).
CAX1, an H+/Ca2+ antiporter from Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8782 -
8786.
Iida, H., Yagawa, Y. & Anraku, Y. (1990). Essential role for induced Ca2+ influx
followed by [Ca2+]i rise in maintaining viability of yeast cells late in the mating
pheromone response pathway. J. Biol. Chem. 265, 13391 – 13399.
Jabalquinto, A. M., Laivenieks, M., Zeikus, J. G., and Cardemil, E. (1999)
J.Protein Chem. 18, 659–664
Jensen,L.T., Ajua-Alemanji, M. and Culotta, V.C (2003) The Saccharomyces
cerevisiae High Affinity Phosphate Transporter Encoded by PHO84 Also Functions in
123
Manganese Homeostasis The Journal of Biological Chemistry, 278, 43, 42036 –
42040.
Johannes, E., Brosnan, J. & Sanders, D. (1991).Calcium channels and signal
transduction in plant cells. BioEssays 13, 331 – 336.
Kakinuma, Y., Ohsumi,Y. & Anraku, Y. (1981). Properties of H+-translocating
adenosine triphosphatase in vacuolar membranes of Saccharomyces cerevisiae. J.
Biol. Chem. 256, 10859 – 10863.
Kane, P.M. (1995) Disassembly and reassembly of the yeast vacuolar H(+)-
ATPase in vivo.J Biol Chem. 270, 17025 - 17032.
Kasai, M. & Muto, S. (1990). Ca2+ pump and Ca2+/H+ antiporter in plasma
membrane vesicles isolated by aqueous two-phase partitioning from corn leaves. J.
Memb. Biol. 114, 133 –142.
Kaufman, R.J., Swaroop, M. & Murtha-Riel, P. (1994) Depletion of manganese
within the secretory pathway inhibits O-linked glycosylation in mammalian cells.
Biochemistry 33: 9813-9819.
Kamiya, T., Akahori, T., Ashikari, M. & Maeshima, M. (2006) Expression of the
vacuolar Ca²+/H+ exchanger, OsCAX1a, in Rice: Cell and Age Specificity of
expression, and enhancement by Ca+. Plant Cell Physiol. 47:96-106.
Kamiya, T. & Maesahima, M. (2004) Residues in internal repeats of the rice
cation/H+ exchanger are involved in the transport and selection of cations. J. Biol.
Chem. 279:812-819.
Kellenayer, R. Aiello, D.P., Miseta, A. & Bedwell, D.M. (2003) Extracellular Ca
(2+) sensing contributes to excess Ca(2+) accumulation and vacuolar fragmentation
in a pmr1 delta mutant of s. cerevisiae. J. Cell Sci. 116:1637-1646.
124
Kiegle, E., Moore, C.A., Haseloff, J., Tester M.A. & Knight M.R.(2000). Cell-
type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.
Plant J. 2000 Jul;23(2):267-78.
Kingsbury, T.J. & Cunningham, K.W. (2000) A Conserved family of calcincurin
regulators. Genes Dev. 14:1595-1604.
Kinnett, D. G., and Wilcox, F. H. (1982) Int. J. Biochem. 14, 977–981.
Klionsky, D.J., Herman, P.K. & Emr, S.D. (1990) The fungal vacuole:
composition, function, and biogenesis. Microbiol. Rev. 54, 266 -292.
Kotyk, A. & Georghiou, G. (1994) Both glucose-type monosaccharides and
one of their metabolites are required for activation of yeast plasma membrane H+-
ATPase. Cell Biol Int. 18, 813 - 817.
Kulakovskaya, T.V., Matyashova, R.N., Shishkanova, N.V., Finogenova, T.V.
& Okorokov, L.A. (1993). Change in transport activities of vacuoles of the yeast
Yarrowia lipolytica during its growth on glucose. Yeast 9, 121 – 126.
Lapinskas, P. J., S. J. Lin, and V. C. Culotta. (1996). The role of the
Saccharomyces cerevisiae CCC1 gene in the homeostasis of manganese ions. Mol.
Microbiol. 21:519–528.
Li, L., Chen, O.S., Ward, DD.M. and Kaplan, J. (2001) J. Biol.Chem. 21, 519 –
528.
Lichko LP, Okorokov LA & Kulaev IS.(1982). Participation of vacuoles in
regulation of KC, Mg2C and orthophosphate ionsin cytoplasm of the yeast
Saccharomyces carlsbergensis. Arch. Microbiol. 132, 289 – 293.
Locke, E.G., Bonilla, M., Takita, Y. & Cunningham, K.W. (2000) A homolog of
voltage-gated Ca²+ channels stimulared by depletion of secretory Ca²+ in yeast. Mol.
Cell. Biol. 20:6686-94.
125
Loukin, S., and Kung, C. (1995) Manganese effectively supports yeast cell-
eyele progression in place of calcium. J. Cell Biol. 131, 1025–1037
Lustoza, ACDM (2005) Homeostase de cálcio na levedura de fissão e no seu
retículo endoplasmático: papel da P5 cta4 ATPase. CBB/UENF – Tese de mestrado.
Luk, E.E. & Culotta, V.C. (2001)Manganese superoxide dismutase in
saccharomyces cerevisiae aequires its metal co-factor through a pathway involving
the Nramp metal transporter, Smf2p. J. Biol. Chem. 276:47556-47562.
Marchi, V., Sorin, A, Wei, Y. & Rao, R. (1999). Induction of vacuolar Ca2+-
ATPase and H+/Ca2+ exchange activity in yeast mutants lacking Pmr1, the Golgi
Ca2+-ATPase. FEBS Letters 454, 181 – 186.
Matheos, D.P., Kingsbury, T.J., Ahsan, S & Cunningham, K.W. (1997).
Tcn1p/Crz1p, a calcineurin-dependent transcription factor that differentially regulates
gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Genes & Development, 11, 3445 –
3458.
Maeshima, M. (2001) H+-ATPase in the vacuolar membrane: physiology and
molecular biology. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 52:469-497.
Maeshima, M & Yoshida, S. (1989) Purification and properties of vacuolar
membrane proton-translocating inorganic pyrophosphatase from mug bean. J. Biol.
Chem. 264:20086-20073.
Matsuoka, K., Higuchi, T., Maeshima, M., & Nakamura, K.(1997) A Vacuolar-
Type H+-ATPase in a Nonvacuolar Organelle Is Required for the Sorting of Soluble
Vacuolar Protein Precursors in Tobacco Cells. Plant Cell. 9, 533 - 546.
Meldolesi, J & Pozzan (1998). The endoplasmic reticulum Ca2+ store: a view
from the lumen. TIBS 23, 10 –14.
126
Mendoza, I., Quintero, F.J., Bressan, R.A., Hasegawa, P.M. & Pardo, J.M.
(1996) Activated calcineurin confers high tolerance to ion stress and alters the
buddind pattern and cell morphology of yeast cells. J. Biol. Chem. 271:23061-23067.
Mendoza I, Rubio F., Rodrigues-Navarro A & Pardo JM (1994) Activated
calcineurin confers high tolerance to ion stress and alters the budding pattern and
cell morphology of yeast cells. J. Biol Chem 271, 23061-23067.
Miller, A.J., Vogg, G. & Saunders, D. (1990). Cytostolic calcium homeostasis
in fungi: roles of plasma membrane transport and intracellular sequestration of
calcium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9348 – 9352.
Miseta, A., Kellermayer, R., Aiello, PD, Fu, L. & Bedwell, D.M. (1999). The
vacuolar Ca2+/H+ exchanger Vcx1p/Hum1p tightly controls cytosolic Ca2+ levels in S.
cerevisiae. FEBS Letters 451, 132 –136.
Mukai H, Kuno T, Chang CD, Lane B, Luly JR, Tanaka C (1993) FKBP12-
FK506 complex inhibits phosphatase activity of two mammalian isoforms of
calcineurin irrespective of their substrates or activation mechanisms.
Nelson, N. & Harvery, W.R. (1999) Vacuolar and plasma membrane V-
ATPases. Phys. Rev. 79:361-385.
Nevo, Y. & Nelson, N. (2006) The NRAMP family of metal-ion transporters.
BBA 1763:609-620.
Nguyen, T., Chin, W-C & Verdugo, P. (1998). Role of Ca2+/K+ ion exchange in
intracellular storage and release of Ca2+. Nature, 395, 908 – 912.
Novick,P., Ferro, S. and Schekman, R. (1981) Order of events in yeast
secretory pathway. Cell. 25: 461 – 469.
Ohsumi, Y. & Anraku, Y. (1981). Active transport of basic amino acids driven
by a proton motive force in vacuolar membrane vesicles of Saccharomyces
cerevisiae. J. Biol. Chem. 256, 2079 – 2082.
127
Ohsumi, Y. & Anraku, Y. (1983). Calcium transport driven by a proton motive
force in vacuolar membrane vesicles of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem.
258, 5614 – 5617.
Ohya, Y., Umemoto, N., Tanida, I.,Ohta, A., Iida, H. & Anraku, Y. (1991).
Calcium-sensitive cls mutants of Saccharomyces cerevisiae showing a Pet-
phenotype are ascribable to defects of vacuolar membrane H+ATPase activity. J.
Biol. Chem. 266, 13971 –13977.
Okorokov, L. A. (1994). Several compartments of Saccharomyces cerevisiae
are equipped with Ca2+-ATPase(s). FEMS Microbiol. Lett. 117, 311 – 318.
Okorokov, L.A. & Lehle, L. (1998). Ca2+-ATPases of Saccharomyces
cerevisiae: diversity and possible role in protein sorting. FEMS Microbiol. Lett. 162,
83 – 91.
Okorokov, L.A. (1985). Main mechanisms of ion transport and regulation of ion
concentration in the yeast cytoplasm. In Environmental Regulation of Microbiol.
Metabolism, Eds. I.S.Kulaev, E.A. Dawes, D.W. Temtest, Acad. Press 339 – 349.
Okorokov, L.A. (1995). Various compartments of the protein secretory
pathway of yeast possess Ca2+/H+ antiporter(s) and V1V0 H+-ATPase(s). 10th
International Workshop on Plant Membrane Biology, Regensburg, P56.
Okorokov, L.A. (1997). Diversity of Ca2+-transporters and Ca2+ store
compartments in yeast: possible role in protein targeting and in signal transduction.
Folia Microbiol. 42, 244 –245.
Okorokov, L.A., Kulakovskaya, T.V., Lichko, L.P. & Polorotova, E. V. (1985a)
H+/ion antiport as the principal mechanism of transport systems in the vacuolar
membrane of the yeast Saccharomyces carlsbergensis. FEBS lett. 192, 303 –
306,1985.
128
Okorokov, L.A., Kuranov, A.J., Kuranova, E.V. & Silva, R.S. (1997). Ca2+-
transporting ATPase(s) of the reticulum type in intracellular membranes of
Saccharomyces cerevisiae biochemical identification. FEMS Microbiol. Lett. 146, 39
– 46.
Okorokov, L.A., Lichko, L.P. & Kulakovskaya, T.V. (1985b). H+-ATPase and
H+/ion antiporters of the vacuolar membrane of Saccharomyces carlsbergensis yeast.
In Biochemistry and Function of Vacuolar Adenosine Triphosphate in Fungi and
Plants. Ed. B. Marin, Springer Verlag, 203 - 212.
Okorokov, L.A., Martinez, E., Lichko, L.P., Kulakovskaya, T.V. & Predeina,
E.A. (1988). Ca2+/H+- antiporter of vacuolar membrane of Saccharomyces
carlsbergensis yeast. Biologicheskie Membrany, 5, 1156-1160.
Okorokov, L.A., Prasad, R., Zwjagilskaya, R.A., Lichko, L.P., Kulakovskaya,
T.V., Yurina, N.P. & Odintzovz, M.S. (1996). Isolation of pure membrane fraction for
lipid analysis. In Manual on Membrane Lipids. Ed. R. Prasad, 16 - 31.
Okorokov, L.A., Tanner, W. & Lehle, L. (1993). A novel primary Ca2+ transport
system from Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 216, 573 – 577.
Okorokov, LA, Silva, FE & Okorokova Façanha, AL (2001). Ca2+ and H+
homeostasis in fission yeast: a role of Ca2+/H+ exchange and distinct V-H+-ATPases
of secretory pathway organelles. FEBS Letters 505, 321-324.
Okorokova-Façanha, A.L., Appelgren,H., Tabish, M, Okorokov, L.A. & Ekwall,
K (2002). The endoplasmic reticulum cation P-type ATPase Cta4p is requered for
control of cell shape and microtubule dynamics. J. Cell Biol., 157, 1029 –1039.
Okorokova-Façanha, A.L., Okorokov, L.A., & Lustoza, A.C. (2007) Cta4
AtPase, tehe member of P5 sub-family of P-type ATPases, is required for
endoplasmic reticulum function and calcium transport in membranes of fission yest.
Smyte 25th Arraial d’Ajuda, Bahia-Brazil.
129
Paidhungat, M. & Ganet, S. (1997) A homolog of mammalian, voltage-gated
calcium channels mediates yeast pheromone-stimulated Ca²+ uptake and
exacerbates the cdc1 (Ts) growth defect. Mol. And Cel. Biol. 17:6339-6347.
Pal, P. K., Samii, A., and Calne, D. B. (1999) Manganese neurotoxicity: a
review of clinical features, imaging and pathology. Neurotoxicology 20, 227–238.
Palmer, C.P., Zhou, X.L., Lin, J., Loukin, S.H., Kung, C. & Saimi, Y. A. (2001)
TRP homolog in saccharomyces cerevisiae forms an intracellular Ca²+-permeable
channel in the yeast vacuolar membrane. Proc Natl Acad Sci USA 98:7801-7805.
Parra, K.J. & Kane, P.M. (1998) Reversible association between the V1 and
V0 domains of yeast vacuolar H+-ATPase is an unconventional glucose-induced
effect. Mol Cell Biol. 18, 7064-7074.
Pedersen, P.L. & Carafoli, E. (1987). Ion motive ATPases. I. Ubiquity,
properties, and significance to cell function. TIBS 12, 146 – 150.
Peiter, E., Fischer, M., Sidaway, K., Roberts, S.K. & Sanders, D. (2005) The
saccharomyces cerevisiae Ca²+ channel Cch1pMid1p is essential for tolerance to
cold stress and iron toxicity. FEBS Letters 579:5697-5703.
Perrino BA, Ng LY & Soderling Tr (1995) Calcium regulation of calcineurin
phosphatase activity by its B subunit and calmodulin. J.Biol Chem 270, 340-346.
Pittman JK, Cheng NH, Shigaki T, Kunta M, Hirschi KD. (2004) Functional
dependence on calcineurin by variants of the Saccharomyces cerevisiae Ca2+/H+
exchanger Vcx1p. Molecular Microbiology 54: 1104–1116.
Pittman, J.K. (2006) Managing the manganese: molecular mechanisms of
manganese transport and homeostasis. New Phytoogist. 167:733-742.
130
Portnoy, M. E., Liu, X..F. and Culotta, V.C. (2000) Saccharomyces cerevisiae
Expresses Three Functionally Distinct Homologues of the Nramp Family of Metal
Transporters Mol and Cell Biol, 20, 21, 7893–7902
Plochocka, Z., Rasmussen, G. & Rasmussen, C. (1995) Regulation of
calcineurin gene expression in schizosaccharomyces pombe: dependence on the ste
11 transcription factor. J. Biol. Chem. 270:24794-24799.
Pozos, T.C., Sekler, I. & Cyert, M.S. (1996). The product of HUM1, a novel
yeast gene, is required for vacuolar Ca2+/H+ exchange and is related to mammalian
Na+/Ca2+ exchangers. Mol. Cel. Biol. 16, 3730 –3741.
Read S.M. & Northcote D.H. (1981). Minimization of variation in the response
to different proteins of the Coomassie blue G dye-binding assay for protein. Anal
Biochem. 1981 Sep 1;116(1):53-64.
Retamal, C.A., Thiebaut, P. & Alves, E.W. (1999) Protein purification from
polyacrylamide gels by sonication extraction, Anal. Bioch. 268:15-20.
Ribeiro, C. (2004) Efeito da alta concentração de Ca²+ nas atividades das
Ca²+-ATPase e H+-ATPases da levedura Saccharomyces cerevisiae. CBB-UENF-
Monografia. p.65.
Ribeiro, C. (2006) A regulação da atividade das Ca²+-ATPases e dos
trocadores Ca²+/H+ pela glicose extracelular na levedura Saccharomyces cerevisiae.
CCB-UENF-Tese de Mestrado. p.82.
Rooney, E.K. & Gross, J.D. (1992). ATP–driven Ca2+/H+ antiport in acid
vesicles from Dictyostelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8025 – 8029.
Rudolph, H.K., Antebi, A., Fink, G.R., Buckley, C.M., Dorman, T.E., Le Vitre,
J., Davidow, L.S., Jen-i-Mao & Moir, D.T. (1989). The yeast secretory pathway is
perturbed by mutation in PMR1, a member of Ca2+-ATPase family. Cell 55, 133 –
145.
131
Rusnak, F & Mertz, P (2000). Calcineurin: form and function. Physiol. Review
80, 1483-1521.
Samarão, S. S., Granato, T.M., Okorokova-Façanha, A.L. & Okorokov, L. A.
(2002). H+ homeostasis in yeast: a contribution of different organelles and various H+
pumps. XXXI Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia
Molecular, A 37, p.7.
Samarão, S. S., Teodoro, C.E.S., Silva, F.E., Ribeiro, C.C., Granato, T.M.,
Bernardes, N.R., Retamal, C.A., Façanha, A.R., Okorokova-Façanha, A.L. &
Okorokov, L.A. (2009) V H+-TPase along the yeast secretory pathway: energization
of the ER and golgi membranes. BBA Biomembranes. 1788:303-313.
Sanders, D., Brownlee, C. & Harper, J.F. (1999). Communicating with calcium.
The Plant Cell, 11, 691 –706.
Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C. & Haper, J.F. (2002). Calcium at the
crossroad of signaling. The Plant Cell, 3401 – 3417.
Schumaker, K.S. & Sze, H. (1986). Calcium transport into the vacuole of oat
roots. J. Biol. Chem. 261, 12172 – 12178.
Serrano, R. (1993). Structure, function and regulation of plasma membrane
H+-ATPase. FEBS Lett. 325(1-2),108 - 111.
Sigiura, R., Sio, S.O., Shuntoh, H. & Kuno, T. (2001) Molecular genetic
analysis of the calcineurin signaling pathways. Cell. Mol. Life Sci. 58: 278-288.
Silva, F.E. (1998) A participação da via secretória da levedura
Schizosaccharomyces pombe 972 h- na homestase dos íons Ca2+ e H+ : o papel de
Ca2+/H+ antiportador(s) e V1V0 H+-ATPase(s). Monografia em Biociências e
Biotecnologia, Campos dos Goytacazes-RJ, Universidade Estadual do Norte
Fluminense-UENF.
132
Silva, F.E. (2003) O efeito de altas concentrações de calico e glicose sobre a
atividade das Ca²+-ATPases em membranas intracelulares de Saccharomyces
cerevisiae. CBB-UENF-Tese de Mestrado. p.95.
Soong, T W; Yong, T F; Ramanan, N & Wang, Y (2000) The Candida albicans
antiporter gene CNH1 has a role in Na+ and H+ transport, salt tolerance, and
morphogenesis 146, 1035-1044.
Souza, M.A.,Tropia, M.J. & Brandão, R.L. (2001) New aspects of the glucose
activation of the H+-ATPase in the yeast saccharomyces cerevisiae. Microbiology
147:2849-2855.
Sorin, A., Rosas, G. & Rao, R. (1997). PMR1, a Ca2+-ATPase in yeast Golgi,
has properties distinct from Sarco/endoplasmic reticulum and plasma membrane
calcium pumps. J. Biol. Chem. 272, 9895 –9901.
Stathapoulos, A.M. & Cyert, M.S. (1997) Calcineurin acts through the
CRZ1/TCN1-encoded transcription factor to regulate gene expression in yeast.
Genes Dev. 11, 3432 - 3444.
Stathopoulos, G.A., Guo, J.J. & Cyert, M.S. (1999) Yeast Calcineurin
regulates nuclear localization of the Crz1p transcription factor through dephorylation.
Genes Dev. 13:798-803.
Strahl-Bolsinger, S., Immervoll, T., Deutzmam, R. & Tanner, W. (1993) PMT1,
the gene for a key enzyme of protein o-glycosylation in saccharomyces cerevisiae.
Proc. Nalt Acad. Sci. USA. 90: 8164-8168.
Stroobant, P. & Scarborough, G.A. (1979). Active transport of calcium in
Neurospora crassa plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3102
– 3106.
Sze, H., Li, X. & Palmgren, M.G. (1999)Energization of plant cell membranes
by H+-pumping ATPase: regulation and biosynthesis. Plant Cell. 11:677-689.
133
Tanida, I., Hasegawa, A., Iida, H., Ohya, Y. & Anraku, Y. (1995). Cooperation
of calcineurin and vacuolar H+-ATPase in intracellular Ca2+ homeostasis of yeast
cells. J. Biol. Chem. 270, 10113 -–10119.
Takita, Y., Engstrom,L., Ungermann, & Cunningham, K.W. (2001). Inhibition of
the Ca2+-ATPase Pmc1p by the v-SNARE Protein Nyv1p. J. Biol. Chem. 276, 6200-
6206.
Teng, J., Goto, R., Lida, K., Kojima, L. & Lida, H. (2008) Lon-channel Blocker
sensitivity of voltage-gated calcium-channel homologue Cch1 in saccharomyces
cerevisiae. Microbiology 154:3775-3781.
Tisi, R., Baldassa, S., Belotti, F. & Martegani, E (2002) Phospholipase C is
required for glucose-induced calcium infux inbudding yeast. FEBS Letters 520, 133 -
138.
Ward, J.M. & Schroeder, J.I. (1994). Calcium-Activated K+ Channels and
Calcium-Induced Calcium Release by Slow Vacuolar Ion Channels in Guard Cell
Vacuoles Implicated in the Control of Stomatal Closure. Plant Cell. 6, 669 - 683.
Wei, Y., Chen, J., Rosas, D., Holt, A.P. & Rao, R (2000). Phenotypic
Screening of mutantions in Pmr1, the yeast secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase,
reveals residues critical for selectivity and transport. J. Biol. Chem. 275, 23927 –
23932.
White, C. & Gadd, G.M. (1987). Uptake and cellular distribution of copper,
cobalt and cadmiun in strains of Saccharomyces cerevisiae cultured on elevated
levels of these metals. FEMS Microbiol. Ecol. 38, 277 – 283.
White, P.J. (2000). Calcium channel in higher plants. Biochem. Biophys. Acta.
1465, 171 – 189.
134
Wiggins, C. A., and Munro, S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 7945–
7950
Xu, T. & Forgac M. (2001) Microtubules are involved in glucose-dependent
dissociation of the yeast vacuolar H+-ATPase in vivo. J Biol Chem. 276, 24855 -
24861.
Yoshimoto, H., Saltsman, K., Gasch, A.P., Li, H.X., Ogawa, N., Botstein, D.
Brown, P.O. & Cyert, M.S. (2002). Genome-wide analysis of gene expression
regulated by the calcineurin/Crz1p signaling pathway in Saccharomyces cerevisiae.
J. Biol. Chem. 277, 31079 – 31088.
Zhang, J.,Myers, M. & Forgac, M. (1992). Characterization of the V0 domain of
the coated vesicle H+-ATPase. J Biol Chem. 267, 9773-9778.
Zhou, X.L., Batiza, A.F., Loukin, S.H., Palmer, C.P., Kung, C. & Saimi, Y.
(2003) The transient receptor potencial channel on the yeast vacuole is
mechanosensitive. Proc Natl Sci. USA 100: 7105-7110.