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ECOLOGIA DOS ORGANISMOS MULTICELULARES MAGNETOTÁTICOS
Juliana Lopes Martins
Tese de doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto
de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em
Ciências Biológicas (Microbiologia).
Orientador: Ulysses Lins
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2007
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ECOLOGIA DOS ORGANISMOS MULTICELULARES MAGNETOTÁTICOS
Juliana Lopes Martins
Orientador: Ulysses Lins Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas
(Microbiologia).
Aprovada por:
_______________________________________________
Presidente, Prof.
Prof.
Prof.
Prof.
Prof.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2007
ii
Ficha Catalográfica
Martins, Juliana Lopes.
Ecologia dos organismos multicelulares magnetotáticos/ Juliana
Lopes Martins. - Rio de Janeiro: UFRJ/IMPPG, 2007. x, 195f.: il.
Orientador: Ulysses Lins.
Tese. (Doutorado) – UFRJ/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes/ Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), 2007.
Referências Bibliográficas: f. 94-107
1. Bactérias Magnéticas 2. Organismos multicelulares magnetotáticos.
3. Ecologia microbiana – I. Lins, Ulysses. II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes. III. Título.
iii
Trabalho realizado no Laboratório de Biologia e Ultraestrutura de Procariotos do Departamento de Microbiologia Geral do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes sob orientação do Professor Dr. Ulysses Lins.
iv
Este trabalho foi desenvolvido com o apoio financeiro do CNPq, Faperj (Pronex) e Capes (Procad).
v
Dedico este trabalho a minha filha, Maria Clara. Ela é a grande responsável pela pessoa que sou hoje.
vi
Agradecimentos Ao terminar este trabalho tenho de agradecer a todos que de alguma forma
colaboraram para a sua realização. Em particular agradeço:
Primeiramente a Deus, pois foi Ele que permitiu que eu encontrasse no meu caminho
todas as pessoas relacionadas abaixo.
À minha mãe Estela, por sempre me apoiar em todos os momentos, me dar suporte
logístico e emocional durante o desenvolvimento desta tese, principalmente nos momentos
finais.
À minha avó Jurema (in memoriam), enquanto ela esteve de corpo presente ela foi de
fundamental importância no apoio e na torcida. Sei que hoje ela deve estar “lá de cima” ainda
olhando e torcendo por mim.
Ao meu pai Paulo, por me tranqüilizar com seu bom humor e sempre me lembrando
que a vida não é só trabalho.
Às minhas irmãs Bia, Carol e Aninha, adoro vocês.
Ao meu namorado Celso, pelo carinho e pela sua calma e paciência em aturar meus
ataques de mau humor quase sempre vinculados a momentos de crise relacionados à tese.
Agradeço também pelas discussões científicas e pelo auxílio em algumas etapas dessa tese.
Aos meus amigos Carol, Volotão, Aline, Cláudia, Felipe, Júlia, Fábio, Rodrigo,
Bernardo, Lelê, Eduardo, Maíra (espero não ter esquecido de ninguém) por estarem sempre
presentes ajudando pessoal e profissionalmente. Em especial a Carol, Aline, Cláudia e Júlia
minhas amigas mais próxima e ao Eduardo, que por ser o pai da minha filha, me ajudou na
criação dela nos momentos em que eu não podia dar a atenção que ela merecia.
Ao pessoal do laboratório, Herval, Mineiro, Fernando, Virgínia, Karen, Fernanda,
Júlia (mais uma vez), Thaís, Prof. Carolina, pelo clima de companheirismo e ajuda mútua;
poucos são os laboratórios que, como o nosso, as pessoas são tão amigas. Agradecimentos
especiais às pessoas que me auxiliaram na realização das coletas e a Thaís (Thaisinha), nem
sei por onde começar a agradecer a essa menina.
Ao Prof. Alexandre Soares Rosado, por ter cedido a estrutura do seu laboratório e pelo
conhecimento na área de Ecologia Molecular Microbiana.
Ao Prof. Ulysses Lins, não só por ser meu orientador mas pela orientação (no real
sentido da palavra), dedicação, empenho e apoio, fundamentais no desenvolvimento dessa
tese e no meu desenvolvimento profissional.
vii
Ao Prof. Inácio Domingos da Silva Neto e à sua equipe, pelo auxílio no experimento
com os ciliados.
Ao Prof. Alex Enrich Prast, pela ajuda com as medidas com os microeletrodos.
À Profa. Lucy Seldin, pela rapidez e eficiência na revisão desta tese, além de sempre
manter as portas do seu laboratório abertas para qualquer ajuda.
Ao CNPq, pelos quatro anos de bolsa.
À coordenação de pós-graduação do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes,
na pessoa da Prof. Thaís Souto Padrón.
Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, na pessoa da Prof. Agnes Marie de
Sá Figueiredo.
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Resumo
ECOLOGIA DOS ORGANISMOS MULTICELULARES MAGNETOTÁTICOS Juliana Lopes Martins
Orientador: Ulysses Lins Resumo da Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia).
Os Organismos Multicelulares Magnetotáticos (OMMs) são bactérias magnetotáticas pluricelulares gram-negativas, capazes de sintetizar magnetossomos compostos por cristais magnéticos de greigita (Fe3S4) e raramente também magnetita (Fe3O4). A ecologia dos OMMs é pouco compreendida. Por não serem cultivados, os estudos são feitos a partir da sua retirada magnética do sedimento. Neste trabalho, estudamos a diversidade e aspectos ecológicos dos OMMs em ambientes aquáticos do estado do Rio de Janeiro. A presença dos OMMs no ambiente parece estar relacionada com a salinidade, uma vez que locais com salinidade inferior a do mar (30‰) não apresentaram OMMs. Os OMMs encontrados nos diferentes ambientes são morfologicamente similares. A biomineralização de magnetossomos com morfologias distintas de sulfeto de ferro e de óxido de ferro na mesma célula foi observada nos OMMs da lagoa Robalo. Os OMMs encontrados nas lagoas de Araruama e Encantada são possivelmente os mesmos microrganismos, porém na lagoa Robalo não foi possível verificar essa semelhança. Os OMMs da lagoa de Araruama se localizam preferencialmente nas regiões anóxicas do sedimento, indicando que estes microrganismos são provavelmente anaeróbicos, idéia sustentada pela associação filogenética destes às bactérias anaeróbicas. A distribuição sazonal ao longo de um ano demonstrou que possivelmente a introdução de matéria orgânica possa favorecer o aumento na densidade da população de OMMs, mas que diferenças biogeoquímicas também são importantes na determinação dessa densidade. Mudanças na estrutura da comunidade microbiana dos ambientes dos OMMs ocorrem concomitantemente com mudanças bruscas na densidade da dos OMMs. Possivelmente algum fator ambiental possa ter afetado a toda a microbiota (incluindo os OMMs) ou então a própria mudança na comunidade possa estar influenciando diretamente a população de OMMs. Observações feitas nos ambientes e em microcosmos indicam que os OMMs são microrganismos levemente halofílicos. Experimentos de predação mostraram que ciliados oriundos do mesmo local que os OMMs não tiveram dificuldade em ingeri-los. Observações anteriores demonstraram que flagelados não eram capazes de ingerir os OMMs intactos, apesar de ambos os protozoários ingerirem facilmente cocos magnéticos. Essa diferença de resposta à predação sugere que a organização agregada dos OMMs seja uma conseqüência da pressão evolutiva para evitar a predação por protozoários. Os OMMs foram encontrados em estado de extrema deterioração inclusive com a dissolução dos magnetossomos dentro dos compartimentos ácidos do ciliado. Dependendo da taxa do consumo dos OMMs pelos ciliados, parte do ferro imobilizado dentro dos magnetossomos é reciclado ao ambiente em uma forma mais solúvel. Palavras-chave: Bactérias Magnéticas. Organismos multicelulares magnetotáticos. Ecologia
microbiana.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2007
ix
Abstract ECOLOGIA DOS ORGANISMOS MULTICELULARES MAGNETOTÁTICOS
Juliana Lopes Martins
Orientador: Ulysses Lins
Resumo da Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia).
Magnetotactic Multicellular Organisms (MMOs) are gram-negative pluricellular
magnetotactic bacteria, capable of synthesizing magnetosomes composed of magnetic crystals of greigite (Fe3S4) and some times also magnetite (Fe3O4). The ecology of the MMOs is poorly understood. Because they are not cultivated, studies rely on their magnetic extraction from the sediment. In this work, we studied the diversity and ecological aspects of the MMOs in aquatic environments of the Rio de Janeiro state. The presence of MMOs in the environment seems to be related with the salinity, as sites where the salinity was lower than the sea (30‰) did not contain MMOs. MMOs found in the different environments are morphologically similar. We observed the biomineralization of iron sulfide and iron oxide magnetosomes with different morphologies in the same cell in the MMOs from Robalo lagoon, suggesting that these microorganisms may have two sets of independent genes for each type of magnetosome, and the environment can be responsible for the element availability for the formation of each crystal type. MMOs found in Araruama and Encantada lagoon are probably the same microorganism, but in the Robalo lagoon, we could not verify this similarity. MMOs from Araruama lagoon are located preferentially in the anoxic zone of the sediment, indicating that these microorganisms are anaerobic, an idea supported by the phylogenetic association of these microorganisms with anaerobic bacteria. The sazonal distribution along one year demonstrated that possibly the input of organic material increase the population density of MMOs, although biogeochemical differences are also important in the determination of such density. Changes in the microbial community structure in the MMOs environment occur concomitantly with strongl changes in the density of MMOs. Possibly, other environmental factors may have influenced the whole microbiota (including the MMOs) or the change in the community could be directly influencing the population of MMOs. Environmental and microcosm observations indicate that the MMOs are slightly halophilic microorganisms. Predation experiments showed that the ciliates from the same site where MMOs thrive easily ingested the MMOs. Previous observations demonstrated that flagellates did not consume intact MMOs, although both protozoa can easily ingest magnetic cocci. The difference in the predation response indicates that the aggregated organization of the MMOs is a consequence of an evolutionary pressure to prevent predation by protozoa. The MMOs were found in extreme deterioration conditions, along with the dissolution of magnetosomes within the acid compartments of the ciliate. Depending on the rates of MMOs consumption by the ciliates, part of the iron stored within the magnetosomes is recycled to the environment in a more soluble form. Key-words: Magnetic bacteria. Magnetotactic multicellular organisms. Microbial ecology.
Rio de Janeiro Fevereiro de 2007
x
INTRODUÇÃO 4
Bactérias magnéticas 4
Magnetossomos 5
Magnetotaxia 8
Ecologia das bactérias magnéticas 12
Organismos Multicelulares Magnetotáticos (OMMs) 14
Morfologia e movimento 15
Ciclo de vida 18
Multicelularidade 19
Filogenia 21
Ecologia 23
OBJETIVOS 25
MATERIAIS E MÉTODOS 26
Locais de coleta 26
Coleta das amostras 26
Dados abióticos 27
Concentração das bactérias magnéticas 27
Isolamento, cultivo e identificação dos ciliados 29
Observação das bactérias magnéticas por microscopia de luz e vídeo microscopia 29
Contagem dos OMMs 29
Contagem das bactérias totais 30
Experimentos de interação ciliados-OMMs 31
Microscopia eletrônica de varredura 32
Microscopia eletrônica de transmissão 32
Hibridização in situ fluorescente (FISH) 33
Técnicas moleculares 34
Extração de DNA do sedimento 34
Reação em cadeia da polimerase 35
Eletroforese em gel de agarose 35
Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) 36
Coloração por nitrato de prata 36
1
Análise dos géis de DGGE 37
RESULTADOS 38
Distribuição dos OMMs nos ambientes aquáticos do Estado do Rio de Janeiro 38
Lagoa Encantada 38
Lagoa Robalo 39
Diversidade genética dos OMMs encontrados no RJ 40
DGGE dos OMMs da lagoa de Araruama (Iguaba) e Encantada 40
Hibridização in situ com o uso de sondas oligonucleotídicas marcadas fluorescentemente
(FISH) com a sonda MMP 41
Estudos ecológicos dos OMMs da lagoa de Araruama 41
Estudos no ambiente 42
Estudos nos microcosmos 43
Comportamento sazonal no ambiente 44
Testes de salinidade 46
Ensaio de predação 47
Estudo da comunidade microbiana dos mesmos ambientes dos OMMs 49
PRANCHAS 52
Prancha 1: OMMs encontrados na lagoa Encantada 53
Prancha 2: OMMs da lagoa Robalo 55
Prancha 3: Diversidade genética dos OMMs encontrados em diferentes regiões do
estado do Rio de Janeiro 57
Prancha 4: Distribuição espacial dos OMMs na lagoa de Araruama 59
Prancha 5: Comportamento dos OMMs nos microcosmos ao longo do tempo 61
Prancha 6: Dados abióticos do acompanhamento sazonal 63
Prancha 7: Comportamento sazonal dos OMMs no ambiente – importância da
salinidade 65
Prancha 8: Ciliado isolado do sedimento da lagoa de Araruama identificado como
Euplotes vannus 67
Prancha 9: Predação dos OMMs pelos ciliados 69
Prancha 10 – Deterioração dos OMMs e dos magnetossomos nos vacúolos do ciliado 71
Prancha 11 – Vacúolos ácidos e localização do ferro dentro do ciliado 73
2
Prancha 12 – Comunidade microbiana dos ambientes dos OMMs nos meses de
Agosto/2005, Janeiro e Fevereiro/2006 75
DISCUSSÃO 77
Distribuição e diversidade no ambiente 77
Biogeografia dos OMMs 79
Localização no sedimento 80
Variação da densidade da população de OMMs ao longo do tempo em diferentes locais
na lagoa de Araruama 81
Estrutura da comunidade microbiana 82
Salinidade 84
Predação 85
Organização multicelular como forma de evitar a predação 85
Digestão dos magnetossomos e impacto no ambiente 87
Regulação da população dos OMMs 87
CONCLUSÕES 90
REFERÊNCIAS 91
3
Introdução
A constante interação dos seres vivos com o ambiente é um processo dinâmico. A
interação entre o campo magnético terrestre e os seres vivos é um dos exemplos deste
dinamismo (LINS DE BARROS, ESQUIVEL & FARINA, 1990). Este fenômeno tem sido
observado desde a sua descoberta em uma variedade de organismos (FRANKEL, 1984;
WALKER et al., 1988) incluindo algas (TORRES DE ARAÚJO et al., 1986), protozoários
(BAZYLINSKI et al., 2000) e bactérias (BLAKEMORE, 1975).
BACTÉRIAS MAGNÉTICAS
As bactérias magnéticas são procariontes gram-negativos, móveis por meio de flagelos;
a maioria parece ser microaerófila, com alguns indivíduos anaeróbicos. Esse grupo de bactérias
é ubíquo e comum em ambientes aquáticos (BAZYLINSKI et al., 1995) e solos alagados
(FASSBINDER, STANJEK, & VALI, 1990). Essas bactérias sintetizam inclusões
intracitoplasmáticas contendo cristais magnéticos chamadas de magnetossomos. Essas
organelas conferem à bactéria a capacidade de se orientar e migrar ao longo das linhas de um
campo magnético (SCHÜLER & FRANKEL, 1999).
As bactérias magnéticas representam um grupo diversificado no que diz respeito à
morfologia e à filogenia (SPRING & SCHLEIFER, 1995). Com isso o termo “bactéria
magnética” perde o significado taxonômico e esses microrganismos devem ser considerados
como um grupo diverso de procariotos, que compartilham da característica da magnetotaxia
(BLAKEMORE, 1982). O número de bactérias magnéticas em cultura axênica é
extremamente limitado e, por isso, a diversidade morfológica e a filogenia deste grupo têm
sido analisadas por métodos independentes de cultivo.
A filogenia de alguns morfotipos de bactérias magnéticas, incluindo tanto aquelas
4
obtidas em cultura pura quanto as coletadas diretamente do ambiente, tem sido determinada
pelo seqüênciamento do gene que codifica a subunidade menor do RNA ribossomal (16S
rRNA). Até agora, os representantes dos procariotos magnetotáticos estão filogeneticamente
associados a três principais linhagens dentro do domínio Bacteria. Aquelas que se encontram
dentro do grupo das proteobactérias estão distribuídas entre as subclasses
Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria e Gammaproteobacteria (DELONG, FRANKEL
& BAZYLINSKI, 1993; KAWAGUCHI et al., 1995; SPRING & SCHLEIFER, 1995;
SPRING & BAZYLINSKI, 2000; SIMMONS et al., 2004). Apesar de a grande maioria estar
localizada dentro do grupo das Proteobacteria, a bactéria denominada “Magnetobacterium
bavaricum” é afiliada ao filo Nitrospira (SPRING et al., 1993).
A diversidade das bactérias magnéticas é refletida pelo número de diferentes morfotipos
encontrados nas amostras ambientais de água e sedimento. Os morfotipos normalmente
observados incluem células cocóides a ovóides, bastonetes, vibrios e espirilos de várias
dimensões. O mais abundante morfotipo de bactéria magnética presente nas amostras
ambientais, especialmente sedimentos, é células cocóides que possuem dois tufos de flagelos.
Em contraste, duas das bactérias magnéticas morfologicamente mais distintas, regularmente
observadas nas amostras ambientais, mas nunca isoladas em cultura pura, são os procariotos
multicelulares magnetotáticos (PMMs) (FARINA et al., 1983; RODGERS et al., 1990a,
KEIM et al., 2004a; SIMMONS et al., 2004) e o “Candidatus Magnetobacterium
bavaricum”, um grande bastonete contendo muitos magnetossomos em forma de ponta de
lança (VALI et al., 1987; SPRING et al., 1993).
Magnetossomos
Os magnetossomos são organelas envoltas por membranas ou por estruturas similares a
membranas, que contém um cristal magnético em seu interior (GORBY, BEVERIDGE &
5
BLAKEMORE, 1988). Esses cristais, que podem ser tanto de óxido de ferro magnetita
(Fe3O4) ou sulfeto de ferro greigita (Fe3S4), representam a característica distintiva das
bactérias magnéticas. Embora a maioria das bactérias magnéticas produza somente um tipo de
mineral, uma bactéria magnética em forma de bacilo e uma multicelular (PMMs) contêm
ambos os tipos de cristais, magnetita e greigita, cada um com sua morfologia característica
(BAZYLINSKI et al., 1993a e 1995; LINS et al., 2007).
A fase mineral dos magnetossomos nas bactérias magnéticas contém cristais que variam
em tamanho de 35-200 nm (FRANKEL, BAZYLINSKI & SHÜLLER, 1998), mas a grande
maioria possui cristais entre 35-120 nm (BAZYLINSKI, 1995, FRANKEL, BAZYLINSKI &
SHÜLLER, 1998). Dentro dessa faixa de tamanho a maioria dos cristais são monodomínios
permanentes (BUTLER & BANERJEE, 1975). Partículas menores de 35 nm são
superparamagnéticas à temperatura ambiente e com isso não são magneticamente estáveis. Já
partículas maiores tendem a formar múltiplos domínios, reduzindo e até neutralizando a
magnetização da partícula (BAZYLINSKI, 1995).
As morfologias dos cristais dos magnetossomos variam, mas são geralmente uniformes
entre as células de uma mesma espécie ou cepa (BAZYLINSKI, GARRAT-REED &
FRANKEL, 1994). Até mesmo a bactéria que produz magnetita e greigita produz apenas uma
morfologia de cristal para cada um dos minerais (BAZYLINSKI et al., 1995). Geralmente três
morfologias de partículas magnéticas têm sido observadas nas bactérias magnéticas através da
microscopia eletrônica de transmissão (MET). Elas são: cubo-octaedro (cubóides)
(BALKWILL, MARATEA & BLAKEMORE, 1980), prismáticas (TOWE & MOENCH,
1981) e em forma de bala ou ponta de seta (MANN, SPARKS & BOARD 1990). Estudos de
MET de alta resolução têm demonstrado que as partículas de magnetita dentro dos
magnetossomos possuem uma grande perfeição estrutural (BAZYLINSKI, 1999). Nas
partículas de greigita, a morfologia cristalina inclui cristais cubo-octaédricos (cubóides) e
6
prismáticos retangulares (HEYWOOD et al., 1990); partículas pleiomórficas e em forma de
ponta de seta são ocasionalmente encontradas (PÓSFAI et al., 1998b).
Na maioria das bactérias magnéticas, os magnetossomos estão organizados em uma ou
mais cadeias ao longo do eixo longitudinal da célula (BAZYLINSKI, 1999). Nessa
organização, o momento magnético total da célula é a soma dos momentos das partículas
individuais e a cadeia de magnetossomos se comporta como um único dipolo magnético
(FRANKEL & BLAKEMORE, 1980). Essa é a organização magneticamente mais eficiente,
pois o momento magnético final é a soma de todos os momento magnéticos gerados por cada
cristal. Estudos recentes em espécies cultivadas de bactérias magnéticas têm demonstrado a
existência de estruturas similares ao citoesqueleto de células eucarióticas que mantêm a
organização destas cadeias de cristais e que estas estruturas também são responsáveis por
ancorar estas cadeias à membrana das células bacterianas e, com isso, transferir o torque da
cadeia para a célula em caso de mudança do campo magnético (KOMEILI et al., 2006;
SCHEFFEL et al., 2006; MARTINS et al., 2007).
É importante comentar que se sugere que parte das bactérias denominadas
magnetotáticas possa ser somente magnética, ou seja, a presença dos cristais pode ter outra
função diferente da orientação de nado no campo geomagnético (MANN, SPARKS &
BOARD, 1990). Em favor desta hipótese existem observações sobre inúmeras espécies de
bactérias magnéticas nas quais os cristais magnéticos não estão organizados em cadeias, mas
em grupos. A organização aleatória desses cristais, apesar de poder ter sido gerada pelo
processamento das células para a microscopia, resulta em um momento magnético por célula
perto do neutro (MANN, SPARKS & BOARD, 1990). A idéia de que a função primária dos
magnetossomos seja a orientação é a mais aceita, apesar de algumas bactérias apresentarem
mais magnetossomos do que o necessário para sua orientação (SPRING et al., 1993; LINS et
al., 2000, 2005 e 2006).
7
Outras funções sugeridas para o magnetossomo seriam o armazenamento de ferro, a
prevenção à toxicidade do ferro, o uso do ferro como fonte de energia, e a destruição dos
radicais tóxicos do oxigênio produzidos durante a respiração (BLAKEMORE, 1982). Porém,
no caso dos cocos, é improvável que os cristais possam ser usados para a obtenção de energia
ou como estoque de ferro, pois o ferro contido nos cristais não é usado mesmo na ausência de
ferro no meio (COX et al., 2002). Além disso, a perfeição cristalográfica dos cristais, a
regulação do tamanho e da direção do crescimento do cristal sugere que o processo de
formação seja biologicamente controlado (LOWENSTAM & WEINER, 1989) e não um
subproduto do metabolismo bacteriano. Já a bactéria Desulfovibrio magneticus, apesar da sua
fraca resposta a um campo magnético aplicado, foi observada a produção de magnetita e no
interior da célula e sulfetos de ferro e hematita no exterior (SAKAGUCHI, BURGESS &
MATSUNAGA, 1993, PÓSFAI et al., 2006). Estudos filogenéticos demonstraram que esta
bactéria está relacionada a outras que fazem a redução do ferro, sendo que uma delas produz
magnetita extracelularmente (KAWAGUCHI et al., 1995). Com isso os autores comentam a
possibilidade de nessas bactérias as inclusões de magnetita serem derivadas da redução
metabólica do ferro, sem nenhuma função na orientação (KAWAGUCHI et al., 1995). Mais
recentemente, foi observado que essas bactérias quando crescem anaerobicamente na presença
de fumarato e sulfato, os cristais de magnetita produzidos são poucos e pequenos,
insuficientes para a magnetotaxia (PÓSFAI et al., 2006).
Magnetotaxia
O fenômeno de magnetotaxia, ou seja, a resposta passiva de microrganismos a campos
magnéticos foi primeiramente descrita em 1975 (BLAKEMORE, 1975). A teoria original
sobre a magnetotaxia se baseava na suposição de que todas as bactérias magnéticas são
microaerófilas e nativas nos sedimentos. Estudos demonstravam que elas se alinhavam
8
passivamente e nadavam ativamente ao longo do campo geomagnético inclinado. Células
mortas como não nadam, se alinham, mas não se movimentam no eixo do campo magnético.
Com isso, BLAKEMORE propôs que a magnetotaxia ajudava a guiar as células até as regiões
menos oxigenadas dos ambientes aquáticos, o sedimento. Uma vez atingida seu microhabitat
ótimo, as células parariam de nadar e adeririam às partículas de sedimento até as mudanças
nas condições do local, como por exemplo, quando oxigênio adicional fosse introduzido. Essa
hipótese é apoiada pelo fato de que as bactérias que são tipo Norte (nadam para a direção
norte indicada por uma bússola, ou seja, paralelamente ao campo) ocorrem
predominantemente no hemisfério Norte ao passo que as bactérias tipo Sul (nadam
antiparalelo ao campo, ou seja, para o sul da bússola) são encontradas predominantemente no
hemisfério Sul. Devido ao comportamento negativo (para cima) e positivo (para baixo) da
inclinação do campo geomagnético no hemisfério Norte e Sul, respectivamente, as bactérias
magnéticas em ambos os hemisférios, portanto nadam para baixo direcionado para o
sedimento, longe da superfície onde a concentração de oxigênio é alta (BLAKEMORE,
1982).
Recentes descobertas a respeito do comportamento das bactérias magnéticas, motivaram
uma revisão sobre a teoria da magnetotaxia. O modelo tradicional proposto não explicava
completamente como as bactérias da região anóxica das colunas d’água se beneficiavam da
magnetotaxia, nem como cocos magnetotáticos formam bandas microaerofílicas de
crescimento em meio semi-sólido com gradiente de oxigênio. SPORMANN & WOLFE
(1984) demonstraram que a magnetotaxia era de alguma forma controlada pela aerotaxia em
algumas bactérias magnéticas, mas esse fato sozinho não ajudava a explicar todos os efeitos
observados da magnetotaxia.
Ao contrário das bactérias quimiotáticas que possuem mobilidade do tipo “run and
tumble”, a maioria das bactérias magnetotáticas se move bidirecionalmente no campo
9
magnético. No caso dos espirilos magnéticos, que possuem dois flagelos um em cada pólo da
célula, ocorre o alinhamento com o campo magnético e as células nadam para ambos os lados
do campo magnético, sendo por isso conhecidos como “two way swimmers” (figura 1).
Durante o nado usam a aerotaxia para achar a concentração ótima de oxigênio na zona de
transição óxica anóxica (inglês, OATZ) (FRANKEL et al., 1997). Os cocos magnéticos
microaerófilos, que possuem dois tufos de flagelos de um mesmo lado da célula, também
nadam para os dois lados, mas com um comportamento diferente. Quando em ambiente com
oxigênio acima da ideal (estado oxidado) eles nadam para o norte, no caso das bactérias do
hemisfério Norte (paralelo ao campo) e o inverso para as bactérias encontradas no hemisfério
Sul (antiparalelo ao campo) com o flagelo impulsionando o corpo bacteriano. Quando
encontram ambientes com baixas concentrações de oxigênio, a bactéria passa para um estado
reduzido e elas então nadam em sentido contrário através da inversão do sentido de rotação do
flagelo (FRANKEL et al., 1997) com este “puxando” o corpo celular (figura 2).
Figura 1: Ilustração comparando o comportamento, no hemisfério Norte, de cepas dos cocos magnéticos MC-1 e M. magnetotacticum em uma gota d’água (condição de alta tensão de O2) em lâmina. Células da cepa MC-1 nadam persistentemente, paralelo ao campo magnético B (no hemisfério Norte) se acumulando na borda da gota, independentemente do sentido do campo. Células de M. magnetotacticum nadam em ambos os sentidos do eixo na mesma
10
direção do campo magnético independentemente do sentido do campo. Figura modificada de FRANKEL et al. (1997).
Figura 2: Modelo hipotético da magneto-aerotaxia polar (hemisfério Norte). As células se alinham no eixo do campo geomagnético e sua direção de nado depende do estado redox (SPRING & BAZYLINSKI, 2000).
Baseado nessas observações foi proposto que a aerotaxia e a magnetotaxia atuam juntos
nas bactérias magnetotáticas, surgindo a evidência de um comportamento sensorial (magneto-
aerotaxia) que envolve dois tipos diferentes: a representada pelo comportamento dos espirilos
magnéticos, magneto-aerotaxia axial; e a pelos cocos magnéticos magneto-aerotaxia polar
(FRANKEL et al., 1997). No caso da axial, o campo geomagnético fornece somente o eixo
enquanto que na polar o campo fornece o eixo e a direção do nado.
A magneto-aerotaxia é especialmente vantajosa para os microrganismos nativos de
ambientes onde há um gradiente vertical de concentração. Este tipo de comportamento
aumenta a eficiência na localização da concentração ótima em relação ao gradiente. Como as
bactérias se movem ao longo do eixo do campo inclinado geomagnético, esse comportamento
transforma um problema tridimensional em unidimensional (FRANKEL et al., 1997). A
magneto-aerotaxia pode interagir com outros mecanismos sensoriais além da aerotaxia, como
11
por exemplo, a quimiotaxia envolvendo moléculas e íons diferentes do oxigênio como o
sulfeto (BAZYLINSKI, 1999).
A magnetotaxia também já foi descrita em microrganismos eucariotos. A primeira
descrição de um microrganismo eucariótico apresentando o comportamento magnetotático foi
em uma alga do gênero Anisonema (TORRES DE ARAUJO et al., 1986). Posteriormente,
foram também descritos protozoários flagelados e ciliados que apresentavam uma fraca
resposta a campos magnéticos (BAZYLINSKI et al., 2000). Entretanto, não foi determinado
se os cristais magnéticos são originados do próprio protista ou se pertencem a bactérias
magnéticas que esses protozoários possam ter ingerido.
ECOLOGIA DAS BACTÉRIAS MAGNÉTICAS
Como já mencionado, as bactérias magnéticas são comuns em ambientes aquáticos
(BAZYLINSKI et al., 1995). Ainda não foi detectada a presença destas bactérias nos
ambientes extremos, como as fontes hidrotermais (MANN, SPARKS & BOARD, 1990). A
ocorrência de bactérias magnéticas parece ser dependente de um gradiente de compostos
reduzidos e oxidados, normalmente representados pelas espécies reduzidas do enxofre e do
oxigênio.
Bactérias magnéticas se encontram nos sedimentos e em colunas d’água estratificadas
predominantemente na zona de transição aeróbica-anaeróbica (oxic-anoxic transition zone –
OATZ) e na região anaeróbica do habitat. Em muitos ambientes aquáticos, a OATZ se
localiza na interface sedimento-água ou logo abaixo. Entretanto, em alguns ambientes
salobros, a OATZ é localizada permanentemente ou sazonalmente na coluna d’água devido à
difusão ascendente do sulfeto de hidrogênio, produzido pelas bactérias redutoras de sulfato na
região anaeróbica e no sedimento (BAZYLINSKI, 1999). Geralmente as bactérias magnéticas
produtoras de magnetita preferem a OATZ propriamente dita e se comportam como
12
microaerófilos (BAZYLINSKI, 1999). As produtoras de greigita estão em sua maioria
localizadas nas regiões anaeróbicas sulfídricas abaixo da OATZ e se comportam como
bactérias anaeróbicas (BAZYLINSKI et al., 1995).
Tanques de tratamento de esgoto, bacias de sedimentação de purificação de água e
lagoas naturais com acúmulo de sedimento orgânico são aparentemente bons locais para
encontrar bactérias magnéticas (MANN, SPARKS & BOARD, 1990). Certas generalizações
podem ser feitas sobre as condições que aparentemente favorecem o crescimento das bactérias
magnéticas na natureza. Um sedimento rico em matéria orgânica, fino, com pH de neutro a
alcalino e submetido a perturbações periódicas são nichos favoritos para esse grupo de
bactérias (MANN, SPARKS & BOARD, 1990).
Seu papel ecológico ainda não é muito bem conhecido. Sabe-se que a importância deste
grupo de bactérias no ciclo biogeoquímico do ferro é óbvia, uma vez que acumulam grandes
quantidades de ferro intracelularmente na forma de magnetita (Fe3O4) e greigita (Fe3S4)
(BAZYLINSKI, 1995). De acordo com estudos preliminares de cepas de bactérias magnéticas
obtidas em cultura pura, esses microrganismos catalisam muitas transformações químicas
importantes em compostos de nitrogênio, enxofre e carbono, devendo ter papéis significativos
nos ciclos biogeoquímicos desses elementos tanto na coluna d’água quanto no sedimento
(BAZYLINSKI, 1995). Provavelmente, as bactérias magnéticas desempenham um papel
importante na magnetização dos sedimentos. Quando essas células morrem e lisam, elas
liberam os cristais magnéticos (que são em sua maioria monodomínios magnéticos
permanentes) no ambiente em que se encontram (VALI et al., 1987).
O maior obstáculo para o estudo das bactérias magnéticas é que elas são geralmente
muito difíceis de cultivar. Dessa forma, poucos são os representantes em cultura pura. As
bactérias magnéticas cultivadas incluem espécies de espirilos de água doce do gênero
Magnetospirillum (BLAKEMORE, MARATEA & WOLFE, 1979; MATSUNAGA,
13
SAKAGUSHI & TADAKORO, 1991; SCHLEIFER et al., 1991); víbrios marinhos MV-1 e
MV-2 (BAZYLINSKI, FRANKEL & JANNASCH, 1988; MELDRUM et al., 1993b); a
bactéria redutora de sulfato Desulfovibrio magneticus (SAKAGUCHI, ARAKAKI, &
MATSUNAGA, 2002); e os magnetococos MC-1, MC-2 e MC-3 (MELDRUM et al. 1993a,
DEVOUARD et al., 1998).
Vários morfotipos de bactérias magnéticas tem sido isolados de sedimentos e solos
alagados por todo o mundo (MANN, SPARKS & BOARD, 1990), mas como a maioria destas
bactérias é ainda não cultivável, não são acessíveis para uma descrição taxonômica válida.
Conseqüentemente é sugerido o uso de características morfológicas (composição, morfologia
e organização dos cristais) como base para classificação das bactérias magnéticas
(THORNHILL et al., 1994).
ORGANISMOS MULTICELULARES MAGNETOTÁTICOS (OMMS)
Formas multicelulares de bactérias magnéticas foram descritas em diferentes ambientes
salobros, marinhos ou hipersalinos ricos em enxofre nos hemisférios norte e sul, e diferentes
nomes foram propostos (FARINA et al., 1983; RODGERS et al., 1990a, KEIM et al., 2004a;
SIMMONS et al., 2004; SIMMONS & EDWARDS, 2007a). Essas formas multicelulares
foram primeiramente descritas por FARINA e colaboradores em 1983 na lagoa Rodrigo de
Freitas no Rio de Janeiro e foram chamados de agregado multicelular magnetotático (AMM).
RODGERS e colaboradores (1990a) encontraram um microrganismo similar aos AMMs em
ambientes costeiros marinho e salobro em New England e foram chamados de “many-celled
magnetotactic prokaryote” (MMP) e posteriormente de procarioto multicellular magnetotático
(PMM) (RODGERS et al., 1990b). Essas bactérias multicelulares magnetotáticas foram
também encontradas em uma das maiores lagoas hipersalinas permanente do planeta, a lagoa
de Araruama (KEIM et al., 2004a), e foram chamadas de organismo multicelular
14
magnetotático (OMM). De todas as formas multicelulares descritas a que possui uma melhor
caracterização fenotípica é o OMM (KEIM et al., 2004a, 2004b, 2007), por isso essa será a
nomenclatura adotada nesse trabalho.
Morfologia e movimento
Todas as bactérias multicelulares magnetotáticas descritas até então parecem partilhar
de algumas características principais. Os OMMs são microrganismos esféricos, com diâmetro
variando de aproximadamente 3 a 12 µm, composto de aproximadamente 10 a 30 células
gram-negativas, organizadas em uma aparente simetria helicoidal (LINS & FARINA, 1999,
KEIM et al., 2004a e 2007). As células são arranjadas radialmente ao redor de um
compartimento acelular encontrado no centro do microrganismo (figura 3; KEIM et al.,
2004a, 2004b, 2007). Esse arranjo radial das células faz com que as células assumam uma
conformação piramidal (figura 4), com a base sendo a superfície em contato com o meio
externo e o ápice em contato com o compartimento acelular. Esse arranjo de células dos
OMMs não é aleatório, um vez que se somente as leis de tensão superficial estivessem
atuando sobre a organização dos OMMs, era de se esperar que houvessem células internas
nesse arranjo (KEIM et al., 2007). A possível existência de junções intercelulares entre as
células adjacentes do OMM já foi relatada (RODGERS et al., 1990a), e a íntima união entre
as membranas externas entre as células adjacentes indicam a existência de algum mecanismo
específico de ligação célula-célula (KEIM et al., 2007).
15
Figura 3 – Série óptica obtida por microscopia confocal a laser de um OMM corado com o corante lipofílico (FM 1-43) que realça o contorno das células. A barra indica 5 µm. (KEIM et al., 2007).
Figura 4 – Imagem de criofratura dos OMMs mostrando o formato piramidal das células devido ao arranjo radial das mesmas. A barra indica 1 µm. Figura reproduzida de KEIM et al. (2004a).
As células que compõe os OMMs são assimetricamente multiflageladas na sua
superfície externa exposta ao ambiente. Possuem uma cápsula composta por fibras arranjadas
radialmente circundando o agregado, e possuem estruturas subcelulares como inclusões
lipídicas, flagelos e numerosos magnetossomos (em média 31 por célula que compõe o
agregado) (FARINA et al., 1983; RODGERS et al., 1990b; KEIM et al., 2004a; SILVA et al.,
16
2007).
Os magnetossomos consistem de greigita e inúmeros precursores não magnéticos da
greigita (PÓSFAI et al., 1998a). Raramente cristais de magnetita são encontrados, juntamente
com os de greigita, nos OMMs (KEIM, LINS & FARINA, 2003; LINS et al., 2007). Os
magnetossomos variam de 85 a 100 nm de tamanho (LINS DE BARROS, ESQUIVEL &
FARINA, 1990; RODGERS et al., 1990a), são geralmente pleiomórficos e arranjados em
cadeias curtas perto da periferia do microrganismo, paralelo à superfície externa das células
(KEIM et al., 2007). O número de magnetossomos por OMMs pode variar de 300 (LINS,
FARINA & LINS DE BARROS, 1992) a 1000 (FARINA et al., 1983, FARINA, ESQUIVEL
& LINS DE BARROS 1990), podendo ter uma distribuição uniforme nas células (PÓSFAI et
al., 1998b) ou não homogênea (LINS DE BARROS, ESQUIVEL & FARINA, 1990).
O tipo de movimento denominado “ping-pong” ou “movimento de escape” parece ser
uma peculiaridade desses microrganismos (LINS & FARINA, 1999, KEIM et al., 2007).
Neste movimento as células, na presença de oxigênio em um campo magnético uniforme,
nadam na direção preferencial (sul no hemisfério Sul) até encontrarem a borda da gota d’água.
Depois os OMMs ocasionalmente revertem espontaneamente sua direção nadando por curtos
trajetos na direção oposta a da sua polaridade (RODGERS et al., 1990a). Esse movimento
contrário à direção preferencial sofre desaceleração continua com o tempo, enquanto que o
movimento a favor demonstra uma aceleração uniforme (GREENBERG et al., 2005). Na
borda da gota os OMMs rodam ao redor de um eixo que passa no centro do microrganismo
(KEIM et al., 2007). Esse movimento de rotação também é observado quando o OMM
encontra um obstáculo, como grãos de areia e partículas de sedimento (KEIM et al., 2007).
Quando não há nenhum obstáculo (borda da gota ou partículas de sedimento e areia) os
OMMs podem nadar a 90 ± 20 µm/s de velocidades em uma trajetória helicoidal com o eixo
alinhado ao campo magnético (ALMEIDA, FARINA & KEIM, 2005; KEIM et al., 2007). O
17
movimento de “ping-pong” não é observado quando os OMMs são expostos a campos
magnéticos próximos ao da Terra, neste caso os OMMs nadam em velocidade constante com
movimentos de “looping” na interface água-ar (GREENBERG et al., 2005). O “ping-pong”
parece ser dependente da intensidade do campo magnético, quanto maior o campo maior a
probabilidade dos OMMs percorrerem trajetórias contrárias à direção preferencial e, em
seguida, voltarem a borda da gota (GREENBERG et al., 2005).
Ciclo de vida
Apesar da maioria dos OMMs possuírem uma forma esférica, são ocasionalmente
visualizadas formas elípticas (RODGERS et al., 1990a) e parecidas com “oito” (LINS &
FARINA, 1999). A partir dessas observações, foi sugerido que essas formas não freqüentes
poderiam ser estágios do ciclo de vida desses microrganismos (figura 5; KEIM et al., 2004b).
De acordo com o ciclo de vida proposto, os OMMs seriam esféricos a maioria do tempo do
seu ciclo (figura 5a) e primeiramente cresceriam de tamanho por aumentar o volume de suas
células, mas com o mesmo número de células (figura 5b). Posteriormente todas as células
dividiriam sincronicamente permanecendo juntas na esfera, os OMMs então passariam a ter o
dobro do número de células original (figura 5c). Os microrganismos se tornariam elípticos
(figura 5d) e então em formato de “oito” com os dois OMMs filhos aderidos entre si (figura
5e). Ocorreria uma pequena torção entre as duas metades, e a separação dos dois OMMs
filhos (figura 5f), retornando ao início do ciclo. Essa separação por torção resolveria o
problema de manter a organização, a polaridade magnética e o compartimento interno acelular
dos OMMs.
18
Figura 5 – Micrografias de microscopia eletrônica de varredura mostrando o ciclo de vida proposto para os OMMs. Os OMMs pequenos (a) aumentam de tamanho por aumentar o volume de suas células (b) então as células se dividem sincronicamente duplicando o número de células (c). Os OMMs se tornam alongados (d) e através de um torção entre os dois OMMs filhos (e) se separam em dois OMMs iguais (f). A barra indica 4 µm. Figura reproduzida de KEIM et al. (2004b).
O septo da divisão celular parece ocorrer simultaneamente em todas as células dos
OMMs, começando na superfície externa da célula e se direcionando ao compartimento
acelular. Esse mecanismo incomum de divisão celular ajuda a preservar a organização geral
dos OMMs pois mantém todas as células arranjadas radialmente. Além disso, como os
magnetossomos e os flagelos são encontrados na região mais externa da célula, este
mecanismo incomum de divisão celular ajuda a distribuir igualmente essas estruturas nas
células filhas (KEIM et al., 2004b).
Multicelularidade
O ciclo de vida proposto para os OMMs é sustentado pelo fato de que nunca foram
observadas células individuais ativas (que nadam e se orientam no campo magnético)
(FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS, 1990; LINS & FARINA, 1999; KEIM et al.,
2004a). Além disso, quando os OMMs são expostos a diferentes pressões osmóticas, as
19
células desagregam e as células individuais não se movimentam sozinhas (LINS & FARINA,
1999), enfatizando assim o comportamento integrado do sistema. A restauração da
osmolaridade original não restabelece a organização dos OMMs nem a mobilidade celular.
Esses dados sugerem que não existe estágio unicelular nesses microrganismos. Recentemente,
nosso grupo demonstrou que a integridade estrutural dos OMMs é essencial para seu
movimento e viabilidade (ABREU et al., 2006). Foi observado com o uso de corantes de
viabilidade celular, que a saída de algumas células pode induzir a morte de todo o
microrganismo e que as células individuais realmente não estão viáveis, enfatizando a
característica multicelular dos OMMs.
A importância da organização estrutural dos OMM deve ocorrer devido à aparente
polarização das células. A distribuição não aleatória de estruturas como flagelos, cápsula e
magnetossomos (KEIM et al., 2004b) e também a distribuição não homogênea de partículas
intramembranosas (observadas por criofratura), que estão concentradas na região da célula em
contato com o meio externo (KEIM et al., 2004a), demonstram a especialização celular e a
polarização. A ausência de algumas células no OMM, leva a perda desse arranjo estrutural e
conseqüentemente a perda da especialização celular e a coordenação célula-célula (ABREU et
al., 2006).
O alto nível de organização estrutural, a interdependência entre as células, o ciclo de
vida complexo e incomum, e a coordenação celular necessária para o comportamento
natatório e a orientação no campo magnético nos levam a concluir que os OMMs são
realmente um microrganismo multicelular procarioto, coordenando percepção e resposta.
Apesar de não se encaixar no conceito tradicional de definição de organismos multicelulares
(GILBERT, 2003) que incluem a necessidade da existência de tipos celulares diferentes, os
OMMs se encaixam perfeitamente nos conceitos modernos (CARLILE, 1980; SHAPIRO,
1998; KAISER, 2001). Esses novos conceitos propõem que organismos multicelulares devem
20
possuir muitas células intimamente conectadas, forma específica, organização celular,
ausência de autonomia celular e competição, e coordenação de movimento, crescimento e
atividades bioquímicas.
A natureza exclusivamente multicelular dos OMMs pode estar relaciona com a
necessidade de manter o conteúdo do compartimento interno acelular separado do ambiente
externo; outra possibilidade seria a sua sobrevivência no ambiente (KEIM et al., 2004b).
Somente como uma unidade multicelular, os OMMs podem se orientar e navegar ao longo de
um campo magnético, permitindo assim encontrar regiões preferenciais no sedimento. Além
disso, a natureza multicelular pode estar associada à proteção contra a predação pois mantém
o microrganismo grande o suficiente para tentar evitar a predação por protozoários
bacterívoros, algo que não aconteceria nas formas unicelulares.
Filogenia
Poucos estudos existem sobre a relação filogenética dos OMMs. O 16S rDNA de
OMMs coletados em regiões costeiras de New England (EUA), foram seqüenciados e
descritos como pertencentes ao grupo das bactérias redutoras de sulfato dentro das
Deltaproteobacteria, sendo a bactéria Desulfosarcina variabilis a representante cultivável
mais próxima (DELONG, FRANKEL & BAZYLINSKI, 1993). Nosso grupo analisou a
relação filogenética dos OMMs da lagoa de Araruama através do seqüênciamento do 16S
rDNA e os resultados foram muito semelhantes aos descritos anteriormente (ABREU et al.,
2007; ver anexo 4). Os OMMs da lagoa de Araruama pertencem a classe das
Deltaproteobacteria, ordem Desulfobacterales, família Desulfobacteracea e estão
relacionados aos gêneros Desulfonema, Desulfosarcina e Desulfococcus (figura 6) com
similaridades de cerca de 92%.
21
Desulfococcus biacutus AN: AJ277887
Desulfococcus multivorans AN: AF418173
Desulfonema magnum AN: U45989
Desulfosarcina variabilis AN: M26632
MMO AN: 847002
MMP 1991 AN: L06457
Uncultured delta proteobacteria AN: DQ630701
Desulfofaba gelida AN: AF099063
Desulfofaba hansenii AN: AF321820
Desulfofrigus oceanense AN:AF099064
Desulfofrigus fragile AN: AF099065
Desulfotignum balticum AN: AF233370
Desulfotignum phosphitoxidans AN: AF420288
Desulfobacula toluolica AN: X70953
Desulfobacula phenolica AN:AJ237606
Desulfospirajoergensenii Desulfospira joergensenii AN: X99637
Desulfobacter postgatei AN: AF418180
Desulfobacter halotolerans AN: Y14745
Desulfobacter hydrogenophilus AN: M34412
Desulfobacter psychrotolerans AN:DQ057079
Myxococcus xanthus AN: AY724798
82
100
100
100
100
100
98
95
99
68
52
100
100
95
64
95
46
82
0.02
Figura 6 – Árvore filogenética das seqüências do 16S rDNA, construída pelo método
“neighbor-joining”, mostrando a posição filogenética dos OMMs da lagoa de Araruama. Os
números de acesso do GenBank estão ao lado do nome das espécies. Figura reproduzida de
ABREU et al. (2007, ver anexo 4).
SIMMONS & EDWARDS (2007a) recentemente descreveram uma inesperada
diversidade filogenética na população de OMMs coletadas em diferentes épocas em pântanos
marinhos em Little Sippewissett (EUA). O seqüênciamento do rDNA 16S demonstrou a
presença de 5 diferentes linhagens de OMMs separadas por pelo menos 5% de divergência
entre as seqüências, sugerindo que esse grupo de microrganismos morfologicamente
semelhantes deva ser considerado um gênero separado dentro das Deltaproteobacteria e não
uma única espécie como anteriormente pensado (DELONG, FRANKEL & BAZYLINSKI,
22
1993). Foi proposto que esses diferentes filotipos de OMMs possam refletir diferentes
ecotipos, ou seja, que essas diferentes linhagens possam estar ocupando diferentes nichos no
ambiente (SIMMONS & EDWARD, 2007a). Essa diversidade filogenética foi observada
entre os microrganismos, não entre as células que os compõem que expressam o mesmo
rRNA (SIMMONS & EDWARDS, 2007a), confirmando o fato já observado de que os
OMMs são formados por um único filotipo celular (KEIM et al., 2004b). No estudo
filogenético realizado pelo nosso grupo em OMMs da lagoa de Araruama, não foi observado
essa divergência de seqüências que indicassem a presença de diferentes espécies (ABREU et
al., 2007, ver anexo 4). Porém foi verificada uma similaridade de apenas 97% com um dos
clones obtidos dos OMMs de Little Sippewissett por SIMMONS & EDWARDS (2007a) e de
96% com os OMMs obtidos de New England (DELONG, FRANKEL & BAZYLINSKI,
1993), indicando que provavelmente são espécies diferentes pertencentes a um mesmo gênero
(ABREU et al., 2007, ver anexo 4).
Ecologia
Os OMMs tem sido observados em diferentes regiões ao redor do planeta
(BAZYLINSKI et al., 1993b; DELONG, FRANKEL & BAZYLINSKI, 1993; FARINA et
al., 1983, FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS, 1990; GREENBERG et al., 2005;
KEIM, LINS & FARINA, 2003; KEIM et al., 2004a, b; LINS DE BARROS, ESQUIVEL &
FARINA 1990; LINS & FARINA, 1999, 2001; LINS, FARINA, LINS DE BARROS, 1992,
LINS et al., 2000; PÓSFAI et al., 1998a,b; RODGERS et al., 1990a,b; SIMMONS et al.,
2004, 2007a; WINKLHOFER et al., 2007). Seus habitats preferenciais parecem ser ambientes
com salinidade que varia de salobro a hipersalino e ricos em enxofre (FARINA, ESQUIVEL
& LINS DE BARROS, 1990; RODGERS et al., 1990 a, b; LINS & FARINA, 1999, KEIM et
al., 2004a; SIMMONS et al., 2004). Podem ser encontrados nas colunas d’água estratificadas
23
(RODGERS et al., 1990a,b; SIMMONS et al., 2004) ou no sedimento de ambientes com
coluna d’água não estratificada (FARINA et al., 1990; KEIM et al., 2004a; SIMMONS &
EDWARDS, 2007a).
Os OMMs são aparentemente microrganismos de gradiente e são preferencialmente
encontrados na base ou imediatamente abaixo do oxiclina, ou seja, nunca encontrados em
regiões onde o oxigênio é detectável (SIMMONS et al., 2004). Entretanto o estímulo
ambiental que é usado pelos OMMs para seu posicionamento dentro do quimioclina ainda não
é conhecido. Os OMMs podem ter uma resposta quimiotática ao ferro e a compostos de
enxofre, já que eles formam cristais compostos por sulfeto de ferro e estão filogeneticamente
associados ao grupo das bactérias redutoras de sulfato. Em colunas d’água estratificadas, foi
observado que a maior abundância da população de OMMs ocorria na mesma profundidade
onde havia uma maior concentração de ferro oxidado (SIMMONS et al., 2004).
Existem muita informação sobre a morfologia, ultraestrutura e cristalografia dos
OMMs, mas ainda muito pouco se sabe sobre seu nicho ecológico, distribuição e papéis
desempenhados nos ciclos biogeoquímicos de diferentes elementos, principalmente o ferro e
compostos de enxofre. Por não serem cultivados, os estudos são feitos a partir da retirada
magnética destes organismos dos sedimentos. Porém, o estudo dos aspectos ecológicos, e do
comportamento destes microrganismos diretamente no ambiente pode fornecer dados que
ajudem a explicar as informações obtidas in vitro, e com isso interpretar o motivo da
existência de características tão incomuns nesse tipo de microrganismo.
24
Objetivos Este trabalho teve como objetivo geral estudar aspectos ecológicos dos OMMs encontrados
em ambientes aquáticos costeiros do Estado do Rio de Janeiro. Os objetivo específicos foram:
• Verificar a presença desses microrganismos em diferentes lagoas costeiras do estado
do Rio de Janeiro;
• Avaliar a diversidade morfológica por microscopia óptica e eletrônica, e genética
por eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) e hibridização in situ
(FISH), entre os OMMs destes ambientes;
• Determinar a sua distribuição espacial na lagoa de Araruama e localização no
sedimento;
• Avaliar a densidade dos OMMs em microcosmos ao longo do tempo e em diferentes
salinidades;
• Observar o comportamento sazonal dos OMMs no ambiente em diferentes pontos da
lagoa de Araruama, comparando com características abióticas como salinidade, pH,
teor de umidade do sedimento e temperatura;
• Avaliar fatores que possam estar controlando a população dos OMMs no ambiente:
Predação por protozoários
Mudanças na estrutura da comunidade microbiana total
25
Materiais e Métodos
LOCAIS DE COLETA
Os locais de coleta usados nesse estudo foram sete lagoas do Parque Nacional da
Restinga de Jurubatiba - PNRJ (22o-22o30’S x 41o15’- 42oW), com ênfase nas lagoas
Encantada e Robalo, e a lagoa de Araruama (22°50’-22° 57’ S x 42°-42° 30’ W).
O PNRJ é formado por um conjunto de 19 lagoas. Estas lagoas são rasas (profundidade
máxima de 3 m) e estão sujeitas a variações anuais em seu balanço hídrico, térmico e salino, o
que as leva a apresentar valores bastante distintos de salinidade, condutividade elétrica da
água e pH (ESTEVES, 1998; ENRICH-PRAST et al., 2003). As lagoas Robalo e Encantada,
por serem muito rasas, são ecossistemas muito inconstantes devido às variações muito
grandes nos aspectos físico-químicos. Freqüentemente é observado o desaparecimento destas
lagoas nos períodos de seca (ENRICH-PRAST et al., 2003).
A lagoa de Araruama é a maior lagoa com hipersalinidade permanente do Brasil, com
salinidade média de 52 ‰ (KJERFVE et al., 1996). Aparentemente este ambiente tem se
mantido hipersalino, pelo menos, nos últimos 4 ou 5 séculos (KJERFVE et al., 1996). Ela é
rasa (batimetria média de 3m), e possui uma grande variação espacial e temporal na
concentração de nutrientes e de outros parâmetros de qualidade de água (KJERFVE et al.,
1996).
COLETA DAS AMOSTRAS
Para a avaliação da presença dos OMMs, amostras de sedimento e água dos locais
descritos acima foram armazenados em frascos de plástico de 1 L, sendo aproximadamente dois
terços de seu volume preenchidos por sedimento e um terço por água. No laboratório, o
material foi mantido à temperatura ambiente, sob luz indireta.
26
Para os experimentos realizados em microcosmos, amostras de sedimento e água foram
coletadas em potes de aproximadamente 10L e mantidos no laboratório nas mesmas
condições descritas anteriormente, pelos tempos descritos nos experimentos abaixo.
Para avaliações mais representativas do ambiente, as amostras de sedimento e água
foram também coletadas em amostradores cilíndricos de 500 mL, onde cerca os 5 centímetros
superiores do sedimento da lagoa foram coletados e o restante foi preenchido com água.
DADOS ABIÓTICOS
Alguns dados abióticos foram medidos dos pontos de coleta, entre eles pH, salinidade
temperatura e teor de água no sedimento. A salinidade foi medida com a utilização de um
refratômetro manual nos pontos em águas previamente filtradas em filtro Millipore 0,22 µm
de poro. A temperatura da água e do ambiente foi medida nos locais com o uso de um
termômetro de mercúrio comum. O pH foi medido em pHmetro Quimis em água também
previamente filtrada em filtro Millipore 0,22 µm de poro. Para a determinação do teor de
umidade no sedimento, uma determinada quantidade de sedimento (5 g) foi pesada, seca por
72 horas em estufa a 60 °C e novamente pesada. A porcentagem de umidade foi calculada
pela diferença entre o peso úmido e seco.
CONCENTRAÇÃO DAS BACTÉRIAS MAGNÉTICAS
As bactérias foram concentradas magneticamente como descrito por LINS et al. (2003).
Resumidamente, amostras de sedimento e água foram colocadas em um recipiente de vidro
desenvolvido especificamente para este fim. Este recipiente consiste em uma jarra de vidro
com uma entrada para os sedimentos e uma saída para as bactérias em forma de capilar
(figura 7). Estes recipientes foram colocados por 45 minutos no interior de um bobina que
produz um campo magnético que orienta as bactérias magnetotáticas em direção ao
estrangulamento do recipiente de vidro (figura 8). Passados os 45 minutos, as bactérias foram
27
removidas com o auxílio de um tubo capilar.
Para as contagens, volumes e pesos pré-definidos de sedimento foram concentrados
como descrito acima e após a contagem os valores de OMMs foram corrigido para volume ou
peso de sedimento.
Figura 7 - Recipiente para concentração das bactérias magnéticas; a barra indica 2,5 cm.
Figura 8 - (a) Bobina (T) e fonte elétrica (PS) para concentração das bactérias magnéticas
vista lateralmente; b) Recipiente para concentração no interior da bobina; a barra indica 5 cm
em (a) e 2,5 cm em (b). Figura reproduzida de LINS et al., (2003).
28
ISOLAMENTO, CULTIVO E IDENTIFICAÇÃO DOS CILIADOS
Para o cultivo dos ciliados isolados da lagoa de Araruama, a água e o sedimento da
interface sedimento-água de amostradores cilíndricos foram transferidos para placas de Petri
que foram preenchidas com água da lagoa filtrada. Alguns grãos macerados de arroz integral
foram adicionados para promover o crescimento bacteriano que serviu de alimento para os
protozoários. As placas de Petri foram mantidas fechadas, à temperatura ambiente, durante o
crescimento dos ciliados. Estes foram transferidos para novas placas nas mesmas condições
descritas acima, semanalmente. Os protozoários foram isolados das culturas com o uso de
micropipetas.
Para identificação, os ciliados isolados da cultura foram processados para microscopia
eletrônica de varredura (como descrito abaixo) e corados pela técnica de impregnação com
proteinato de prata (Protargol) como descrito por DIECKMAN (1995).
OBSERVAÇÃO DAS BACTÉRIAS MAGNÉTICAS POR MICROSCOPIA DE LUZ E
VÍDEO MICROSCOPIA
As amostras (bactérias magnéticas ou interações ciliados – OMMs) foram colocadas
entre lâmina e lamínula e observado a fresco com o microscópio Zeiss Axioplan 2 equipado
com acessórios para contraste de fase e contraste interferencial diferencial de Nomarski. As
imagens foram obtidas digitalmente com a câmera Color View XS (SYS) e as vídeos-
microscopias analogicamente com câmera e vídeo-cassete JVC.
CONTAGEM DOS OMMS
As quantificações dos OMMs foram feitas em câmara de Neubauer e os valores
corrigidos para o volume ou peso de sedimento usado na concentração magnética da amostra,
29
levando em consideração que todos os OMMs foram retirados da amostra durante a
concentração magnética.
Para o acompanhamento mensal da população dos OMMs, foram coletados
amostradores cilíndricos totalizando 6 réplicas para cada local. Os cinco primeiros
centímetros de sedimento de cada amostrador foram concentrados magneticamente como
descrito acima e os OMMs foram contados.
Para a análise da distribuição espacial dos OMMs, camadas de 1 cm de sedimento
foram removidas (até a profundidade de 5cm), diluídas em água estéril da lagoa (filtrada em
filtro 0,22µm) e colocadas em uma lâmina. A lâmina foi exposta a um campo magnético de
um imã comum por 5 minutos, quando então os OMMs que atingiram a borda da gota foram
diretamente contados em um microscópio Zeiss Axiostar Plus equipado com contraste de fase.
CONTAGEM DAS BACTÉRIAS TOTAIS
Para a quantificação de bactérias totais no sedimento, os cinco primeiros centímetros de
três amostradores cilíndricos foram homogeneizados e alíquotas de 1g foram separadas e
processadas como descrito por GILLAN e colaboradores (2005). Esse processo foi realizado
nos três pontos de coleta do acompanhamento sazonal em três diferentes meses.
Os sedimentos (1g) foram fixados em 4% de paraformaldeído (PBS, pH 7,2), lavados
duas vezes em PBS, pós-fixados em etanol:PBS (1:1) e armazenados a –20°C. No momento
da preparação da lâmina, as amostras foram sonicadas (2 vezes por 30s cada, no modo pulsar
no sonicador Sonifier 250, Branson) com uma ponteira estéril (5mm, “output control” 3,
“duty cycle” 20%). Após a sonicação, as amostras foram deixadas paradas por 3 minutos para
que ocorresse a precipitação das partículas grandes. Uma alíquota da amostra foi misturada
com 10 mL de PBS estéril e filtrada em membrana de policarbonato preta (0,2 µm de poro,
Millipore) colocada sobre uma membrana de 0,45 µm de poro. As membranas foram coradas
30
com uma suspensão de 1 µg/mL de DAPI (4’6’-diamidino-2-fenilindol) por 5 minutos,
lavadas gentilmente em água destilada e etanol 70%, secas ao ar e montadas em lâminas com
meio de montagem (glicerol:PBS, 4:1). Os experimentos foram realizados em triplicata para
cada amostra e as lâminas foram observadas em microscópio de epifluorescência Zeiss
Axioplan 2 (Carl Zeiss, Alemanha) com lâmpada de mercúrio de 100W, conjunto de filtros
para DAPI (02 Carl Zeiss, Alemanha) e equipado com câmera digital (Color View XS,
AnalySiS Co). Foram adquiridos 14 campos aleatórios em 2 transectos a 90o um do outro. Os
valores foram calculados levando em consideração a área total observada e a quantidade de
amostra, e expressos em relação ao peso de sedimento. A fórmula utilizada para o cálculo foi:
B= (N/X) x (A/C) x (1/S) onde; N é n° de bactérias contadas; X é número de campos
contados; A é a área da superfície onde a amostra está espalhada; C é a área do campo e S a
quantidade de amostra aplicada na superfície.
EXPERIMENTOS DE INTERAÇÃO CILIADOS-OMMS
Os OMMs magneticamente concentrados como descrito acima foram expostos aos
ciliados isolados da cultura. As interações foram acompanhadas em um microscópio Axioplan
2 (Carl Zeiss, Germany) equipado com acessórios para contraste de fase e contraste
interferencial diferencial de Nomarski. As imagens foram obtidas digitalmente com a câmera
Color View XS (AnalySiS Co), as vídeos-microscopias analogicamente com câmera JVC e
um videocassete com o qual os filmes foram gravados. Para a microscopia eletrônica de
transmissão, após o período determinado de 30 minutos ou 2 horas, as interações foram
processadas para rotina como descrito abaixo.
Para a observação do caráter ácido dos vacúolos que continham OMMS, os ciliados
foram coradas com 1 µM de Lysotracker Green DND-26 (Molecular Probes) por 5 minutos
após a interação com os OMMs. Em seguida foram fixados em paraformaldeído 4% (na água
da lagoa filtrada), lavados três vezes em PBS (130 mM NaCl, 7mM Na2HPO4, 3mM
31
NaH2PO4; pH 7,2), e observadas em microscópio confocal de varredura a laser LSM 510
Meta Zeiss (Carl Zeiss, Germany), utilizando o sensor Meta nos comprimentos de onda de
505 a 600 nm.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
As amostras foram fixadas por 1 h em solução contendo 2,5% de glutaraldeído em
tampão cacodilato de sódio pH 7,2 (0,1 M) preparado na água da lagoa. Foram realizadas três
lavagens (de 10 minutos cada) na mesma solução tampão. As amostras foram então
depositadas a lamínulas previamente cobertas com polietilenimida ou poli-L-lisina e deixadas
por 40 minutos para permitir a aderência ao polímero. As amostras foram pós-fixadas em
tetróxido de ósmio a 1% em mesmo tampão por 1 h (no escuro), realizando-se outras três
lavagens de 10 minutos cada em tampão. As amostras foram desidratadas em série crescente
de etanol 30, 50, 70, 80, 90, 100% (2X, 5 minutos cada etapa), secas pela técnica de ponto
crítico de CO2 (Bal-Tec CPD 030, Balzer Inc.), cobertas com ouro (Balzer Inc.) e observadas
em microscópio JEOL JSM35 em 10kV.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
As amostras foram depositadas em grades revestidas com filme de formvar 0,3% ou
incluídas em resina como descrito abaixo. Para as amostras depositadas na grade revestidas com
formvar, o excesso de líquido foi removido e as grades foram secas ao ar. Em alguns casos as
amostras foram contrastadas com uma solução de ácido fosfotúngstico 2% pH 7,2 por 1
minuto. O excesso de contrastante foi então removido e as grades secas ao ar.
Para realização de cortes ultrafinos, as amostras foram fixadas por 1h em solução de
glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio, pH 7,2 (0,1M) preparado na água da
32
lagoa, lavadas três vezes no mesmo tampão (10 minutos cada) seguido de pós-fixação em
tetróxido de ósmio a 1% no mesmo tampão por 30 minutos no escuro. As amostras foram
novamente lavadas, e desidratadas em série crescente de acetona (30, 50, 70, 90, três vezes
100%, 15 minutos cada etapa), incluídas em resina epóxi (PolyBed 812) e polimerizadas a 60°C
por 48 h. Cortes ultrafinos foram obtidos com navalhas de diamante em um ultramicrótomo LKB
depositadas em grades de cobre que foram ou não contrastadas em acetato de uranila por 30
minutos e citrato de chumbo por 5 minutos. As amostras foram observadas e fotografadas em
microscópio FEI Morgagni operando em 80kV.
Para a determinação da composição química das estruturas observadas por MET foi
utilizado o microscópio JEOL 2000FX equipado com o sistema Noran de microanálise de
raios X.
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
Todas as hibridizações in situ foram realizadas como descrito por Amann e
colaboradores (1992) com algumas modificações. Resumidamente, as células foram fixadas
em paraformaldeído 4 %, lavadas em PBS 3 vezes e pós fixadas em etanol:PBS (1:1) até o
momento da hibridização. As células foram aplicadas às lâminas previamente recobertas com
gelatina (0,1% de gelatina e 0,01% KCrSO4), deixadas aderindo por 20 minutos a 46°C. As
lâminas foram desidratadas em séries crescentes de etanol (50, 70 e 100%) por 5 minutos em
cada etapa. Para a hibridização, as amostras foram incubadas em tampão de hibridização (0,9
M NaCl; 5 mM Na2EDTA; 20mM Tris-HCl [pH 7,0]; 0,1% dodecil sulfato de sódio [SDS] e
5 ng de sonda) com 30% de formamida. Após a incubação a 46°C por 90 minutos em câmara
úmida, as amostras foram lavadas em tampão de lavagem (5 mM Na2EDTA; 20mM Tris-HCl
[pH 7,0]; 0,1% dodecil sulfato de sódio [SDS]; 112 mM NaCl) pré-aquecido e posteriormente
lavadas gentilmente em água destilada para a retirada do tampão de lavagem. As amostras
33
foram coradas simultaneamente com DAPI (1 µg/mL) por 5 minutos, lavadas gentilmente em
água destilada e etanol 70%, secas ao ar e montadas em meio de montagem (glicerol:PBS,
4:1). As hibridizações foram observadas em microscópio Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss,
Alemanha) com lâmpada de mercúrio de 100W, conjunto de filtros para DAPI, FITC e
TRITC (filtros 02, 10 e 15 respectivamente, Carl Zeiss, Germany) e equipado com câmera
digital Color View XS (AnalySis Co). Foram utilizadas a sonda MMP (5’-
GGACTCACCCTTAAACGG- 3’) descrita por DELONG, FRANKEL & BAZYLINSKI
(1993), marcada com FITC e a sonda OMM (5`- GATTTATACTCTTATAAGT- 3`) marcada
com TRITC descrita por ABREU et al. (2007, ver anexo 4).
TÉCNICAS MOLECULARES
Para as técnicas moleculares, os OMMs foram concentrados magneticamente como
descrito anteriormente. Após a concentração dos OMMs eles foram congelados a –20oC e
descongelados antes do uso direto para a amplificação por PCR.
Para o estudo da estrutura da comunidade microbiana total no sedimento, os cinco
primeiros centímetros de três amostradores cilíndricos foram homogeneizados e foram
separadas alíquotas de 5 gramas. Esse processo foi realizado em triplicata, nos três pontos de
coleta do acompanhamento sazonal e três meses.
Extração de DNA do sedimento
A extração de DNA do sedimento foi realizada através do método de extração direta
com o kit de extração de DNA para solo (FastDNA® SPIN Kit for Soil) da BIO101
(Califórnia, EUA) segundo o protocolo do fabricante. Os DNAs obtidos foram analisados
quanto à pureza e eficiência das extrações através de eletroforeses em gel de agarose e
estocados a –20oC para posterior uso.
34
Reação em cadeia da polimerase
Os iniciadores selecionados foram o U968f-GC1 (“grampo” + 5’ AAC GCG AAG AAC
CTT AC 3') e L1401r (5'GCG TGT GTA CAA GAC CC 3') (NÜBEL et al., 1996). O iniciador
U968f é homólogo à região 968-984 do gene 16S rRNA de Escherichia coli, enquanto que o
iniciador L1401r é homólogo à região 1385-1401 deste mesmo gene. Estes iniciadores
amplificam a região da alça V6-V8 do RNA ribossomal, que é mais variada do que outras
regiões usadas como alvo para outros iniciadores universais descritos na literatura
(WATANABE, KODAMA & HARAYAMA, 2001).
As reações de 50µL foram feitas pela mistura de tampão da enzima Taq polimerase 1x,
2,5mM de MgCl2 (Invitrogen), 0,5 mM de cada dNTP (Invitrogen), 0,2 µM de cada iniciador
(Promicro), 1% de formamida, 5µg de BSA, 2,5U Taq-polimerase (Invitrogen) e água Milli-Q
estéril (q.s.p). Em cada reação foram aplicados 1 µL de DNA extraído.
O programa de PCR utilizado foi iniciado com o ciclo de desnaturação das fitas de
DNA por 2 min a 94ºC, seguidos de 35 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC e 1 min a 72ºC, e
da extensão a 72°C por 10 min.
Eletroforese em gel de agarose
O DNA total extraído das amostras de sedimento e os produtos de PCR foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,9% e 1,2% (respectivamente) em tampão TBE
[Tris-HCl 89mM (pH 7,8), EDTA 2,5 mM, H3BO3 89mM], aplicando-se 10µL da amostra
com 5µL de corante de amostra para eletroforese de DNA [glicerol 50%, EDTA (pH 7,5)
20mM, azul de bromofenol 0,05%, xilenocianol 0,05%]. Os géis foram então submetidos à
corrente elétrica de 80V em tampão TBE durante 4 e 2 horas, respectivamente. Após a
corrida, os géis foram corados com brometo de etídio, visualizados por transiluminação de luz
UV e fotografados com uma câmera Polaroid acoplada a um filtro de UV.
35
Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE)
Os experimentos com eletroforese em gel com gradiente desnaturante (denaturing-
gradient gel electrophoresis – DGGE) foram realizados com um equipamento “Dcode TM
Universal Mutation Detection System” (BIO-Rad Richmond, USA). Os produtos de PCR
obtidos através da utilização dos iniciadores U968f e L1401r foram aplicados em volume de
20µl, com mais 20µl de corante para eletroforese de DNA, diretamente no gel de
poliacrilamida 6 % em tampão TAE 1x [20 mM Tris-acetato (pH 7,4), 10 mM acetato de
sódio, 0,5 mM EDTA], contendo gradiente linear de desnaturantes de 45 a 70 %. Esse
gradiente desnaturante foi formado, de acordo com as instruções do fabricante, pela mistura
das soluções estoques de poliacrilamida, uma com 0% e outra contendo 100% dos agentes
desnaturantes (40% de formamida e 7 M de uréia). Os géis de poliacrilamida foram
polimerizados com a adição de 10 µL de TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamino) e 50
µL de APS (persulfato de amônio) 10 % para cada 12 mL totais de gel.
O gel foi deixado polimerizando por, no mínimo, 4 horas e em seguida, acoplado ao
aparelho de DGGE. Os produtos de PCR foram aplicados como descrito anteriormente e a
eletroforese foi realizada em tampão TAE 1x, com 75V/60ºC/ 17 h. Após a corrida, o gel foi
retirado da placa e corado com nitrato de prata.
Coloração por nitrato de prata
Os géis de DGGE foram revelados segundo protocolo de HERRING e colaboradores.
(1982). Após a corrida, os géis foram banhados em solução fixadora, contendo etanol 10% e
ácido acético a 5% por 30 minutos com baixa agitação, posteriormente a solução foi trocada
por uma contendo nitrato de prata 0,08% onde os géis foram então impregnados por 30
minutos com baixa agitação. A evidência das bandas foi feita banhando o gel em uma solução
36
reveladora contendo NaOH 0,75 M e formaldeído 0,1 M até atingir a coloração desejada. A
coloração foi bloqueada substituindo a solução reveladora por água destilada. Os géis corados
foram mantidos em uma solução estoque, contendo ácido acético glacial (5%), etanol (10%) e
glicerol (1%), por tempo indeterminado. Os géis foram digitalizados em “scanner” Epson
Perfection 3300 (Epson).
Análise dos géis de DGGE
As imagens digitais dos géis foram utilizadas para a construção de uma matriz binária
de presença/ausência de bandas para análise de similaridade. Para isto, as bandas mais
definidas e significantes foram determinadas e selecionadas e verificada sua presença em cada
uma das amostras estudadas. Caso a banda esteja presente será adicionado um “1” na tabela,
caso não será adicionado o “0”. Dendrogramas foram construídos com o programa Statistica
6.0 (Stat Soft Co), para a análise de similaridade dos perfis do DGGE pelo método UPGMA
(unweighted pair group method using arithmetic averages) seguido do cálculo do coeficiente
de Pearson.
37
Resultados
DISTRIBUIÇÃO DOS OMMS NOS AMBIENTES AQUÁTICOS DO ESTADO DO
RIO DE JANEIRO
Foram feitas coletas em diferentes lagoas costeiras do estado do Rio de Janeiro: sete
lagoas do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, Macaé, RJ (Tabela 1), e lagoa de
Araruama. Dentre esses ambientes bem diversos, os OMMs foram encontrados nas Lagoas
Robalo e Encantada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba e na Lagoas de Araruama,
ambiente onde anteriormente já fora descrita a presença dos OMMs (KEIM et al.,2004a).
Tabela 1 – Lagoas do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba onde foi pesquisada a presença de OMMs e suas respectivas salinidades, temperaturas e pH.
Lagoa Salinidade média (‰) Temperatura pH Presença dos
OMMs
Encantada 50** ND ND +
Robalo Variável (oscilando de 18 a 50**) 27,2* 8,48* +
Preta 53,4* 22,6* 8,39* -
Pires 45,1* 21,3* 8,43* -
Comprida 0,4* 22,7* 5,54* -
Carapebus 4,4* 25,6* 7,70* -
Paulista 2,6* 23,4* 6,18* -
* Valores médios de amostras coletadas entre 2001 e 2003 (ENRICH-PRAST et al., 2003). ** Valores obtidos neste trabalho em julho de 2003 (lagoa Encantada e Robalo) e durante o ano de 2005 (lagoa Robalo). ND – Não determinado
Lagoa Encantada
Os OMMs observados na lagoa Encantada eram morfologicamente similares (figura 9),
esféricos, com diâmetro variando de 4,5 (figura 9b) a 7 µm (figura 9d). Ocasionalmente,
38
observamos nas amostras OMMs em formas ovóides e em forma de oito, correspondentes às
diferentes etapas do ciclo de vida desse microrganismo. Os magnetossomos se organizam
radialmente nas células dos OMMs íntegros, na extremidade da célula em contato com o meio
externo (figura 10). Grandes inclusões eletrolucentes e muitos magnetossomos são observadas
nas células que compõe os OMMs (figura 11). Os cristais equidimensionais de cerca de 45 a
55 nm (figura 12), são compostos de ferro e enxofre (figura 13), provavelmente greigita
(Fe3S4).
Os OMMs foram encontrados durante todo o período no qual a lagoa possuía uma
salinidade alta (acima de 30 ‰). Porém no ano de 2004, após um período de muita chuva na
região, acidentalmente houve a formação de um canal que comunicou a lagoa Encantada com
a lagoa Paulista, uma lagoa de água doce (ver tabela 1). A lagoa Encantada, por ser de
dimensões reduzidas quando comparada a Paulista teve sua salinidade drasticamente
diminuída e até hoje, não recuperada. Desde então os OMMs não mais apareceram.
Lagoa Robalo
Durante o período em que nós estudamos a lagoa Robalo ela demonstrou ter uma
salinidade muito variável (tabela 1). Nos meses em que a salinidade estava abaixo de 30 ‰,
não observamos os OMMs nas amostras de sedimento e, mesmo em períodos de altas
concentrações de sais, o número de OMMs encontrados era reduzido se comparado à
densidade de OMMs encontrada na lagoa Encantada e de Araruama. Este fato inviabilizou os
estudos moleculares.
Três morfotipos de bactéria magnetotática foram encontrados na lagoa Robalo, dois
cocos de tamanhos diferentes e poucos OMMs (figura 14). Os cocos maiores possuem cerca
de 2,6 µm de comprimento por 2,1 µm de largura e seus magnetossomos possuem dimensão
de aproximadamente 110 nm (figura 15a). Os cocos menores possuem cerca de 2,1 µm de
39
comprimento por 1,7 µm de largura e os magnetossomos possuem tamanho de
aproximadamente 75 nm (figura 15b). Em ambos os cocos, os magnetossomos estão
organizados em cadeias ao longo do eixo longitudinal da célula, várias inclusões
citoplasmáticas também podem ser observadas nesses cocos magnéticos (figura 15). Os
OMMs encontrados possuem cerca de 5 µm de diâmetro e uma particularidade é a presença
de dois tipos de cristais (figura 16), uma forma equidimensional, composto por sulfeto de
ferro (figura 17a) e um em forma de ponta de lança, composto por óxido de ferro (figura 17b).
DIVERSIDADE GENÉTICA DOS OMMS ENCONTRADOS NO RJ
Apesar da semelhança morfológica entre os OMMs dos diferentes ambientes estudados
foi verificada a diversidade genética desses organismos, e a semelhança destes com outros
microrganismos morfologicamente similares encontrados no Hemisfério Norte, o MMP
(many-celled magnetotactic prokaryote).
DGGE dos OMMs da lagoa de Araruama (Iguaba) e Encantada
Foi usado o DGGE para determinar a variabilidade genética entre as células que
formam o arranjo dos OMMs assim como para comparar os OMMs encontrados nas lagoas
Encantada e Araruama. Foi feita a amplificação do fragmento da região variável do 16S
rDNA dos OMMs encontrados na lagoa Encantada e Araruama (Iguaba), e esses fragmentos
foram submetidos a um DGGE. O perfil observado no PCR-DGGE mostra uma banda única
em todas as amostras analisadas (figura 18), indicando fortemente que as células que compõe
os OMMs são geneticamente idênticas. Além disso, o mesmo padrão de desnaturação, ou seja,
o mesmo comportamento eletroforético observado para os OMMs encontrados na lagoa de
Araruama e Encantada sugere que ambas as lagoas provavelmente contém os mesmos
40
microrganismos (figura 18).
Hibridização in situ com o uso de sondas oligonucleotídicas marcadas
fluorescentemente (FISH) com a sonda MMP
Foram realizados experimentos de hibridização in situ com o uso de sondas
oligonucleotídicas marcadas fluorescentemente (FISH) para confirmar a relação filogenética
encontrada pelo seqüênciamento. A hibridização dos OMMs da lagoa de Araruama (Iguaba)
com a sonda desenvolvida para o 16S rRNA dos MMP confirma que são organismos
similares (figura 19). Posteriormente, o seqüênciamento do 16S rDNA dos OMMs da lagoa
de Araruama (ABREU et al. 2007, ver anexo 4) confirmou que a região onde essa sonda
hibridiza é idêntica nos dois microrganismos (OMM e MMP).
Na lagoa Robalo, os estudos filogenéticos foram dificultados devido à presença de
outras bactérias magnéticas e ao fato de que a lagoa não possui hipersalinidade permanente, o
que faz com que os OMMs não apareçam sempre.
ESTUDOS ECOLÓGICOS DOS OMMS DA LAGOA DE ARARUAMA
A lagoa de Araruama foi escolhida como principal ambiente para estudos ecológicos
mais específicos pois esta lagoa possui algumas vantagens em relação as outras onde os
OMMs também foram encontrados. Primeiramente a lagoa de Araruama é a maior lagoa
hipersalina do Brasil, e a salinidade parece ser um fator importante na determinação da
presença dos OMMs nos outros ambientes aqui estudados. É interessante que o ambiente seja
estável quanto à salinidade permitindo o acompanhamento desta população por longos
períodos, e, neste caso, a lagoa de Araruama possui hipersalinidade permanente. A grande
dimensão da lagoa de Araruama contribui para a formação de diversos microambientes dentro
41
da mesma lagoa, permitindo assim a comparação do comportamento de determinada
população entre esses ambientes. Na lagoa de Araruama, os OMMs são as únicas bactérias
magnéticas encontradas, e estão normalmente em grande número, facilitando enormemente os
estudos pois como são bactérias ainda não cultivadas, os estudos se baseiam na retirada
magnética destes microrganismos do ambiente. Outro fator que influenciou na escolha da
lagoa de Araruama é o fato de que os OMMs isolados deste ambiente já foram
extensivamente caracterizados quanto à morfologia e à ultraestrutura, contribuindo com uma
maior informação para ajudar a interpretar os dados ecológicos que seriam obtidos dos
estudos. Além disso, recentemente nosso grupo realizou um estudo filogenético mais
completo destes microrganismos isolados da lagoa de Araruama (ABREU et al. 2007, ver
anexo 4).
Estudos no ambiente
Para os estudos no ambiente, as amostras de sedimento foram coletadas em
amostradores cilíndricos (figura 20) para que as amostras de sedimento e água coletadas
sejam o mais representativos do observado no local, e assim os dados obtidos possam
corresponder ao que ocorre no ambiente. Os locais escolhidos para essas avaliações foram a
praia de Iguaba Grande (Iguaba Grande, RJ) e a praia da Baleia (São Pedro d’Aldeia), locais
onde já havíamos verificado, possuir grandes números de OMMs.
A localização vertical dos OMMs mostrou que eles são encontrados nos 5 primeiros
centímetros de sedimento, estando preferencialmente entre os 3-4 cm (figura 21). Neste
ambiente, a medida de oxigênio dissolvido no sedimento mostrou que este elemento só está
presente até 0,3 cm (figura 21), sugerindo que os OMMs prefiram pelas regiões anaeróbicas.
Neste trabalho nunca foram observados OMMs na coluna d’água.
Foi verificada a distribuição espacial dos OMMs em diferentes pontos da lagoa de
Araruama e observamos que os OMMs foram encontrados ao redor de quase toda a lagoa
42
(figura 22). Não foi detectado OMMs no ponto de menor salinidade (23,7 ‰), sendo esta
menos da metade da média geral (56,3 ‰) dos locais na margem da lagoa. Nos pontos mais
internos na lagoa, apesar da salinidade ser bem próxima da média, os OMMs quase não foram
encontrados, e quando o foram estavam em baixa densidade populacional. Os locais com
maior número de OMMs foram a praia de Baleia, Iguabinha, Rebolo, e próximo a ponte de
Cabo Frio com salinidades de 56, 60, 51,6 e 46,2 ‰, respectivamente. Provavelmente, a
salinidade é um fator importante para determinar a presença dos OMMs.
Foi realizado um experimento para verificar a distribuição dos OMMs no sedimento a
partir do espelho d’água. Sedimentos foram coletados em amostradores cilíndricos em um
transecto em intervalos de 0,5 m até a profundidade de 6,5 m (figura 23). A posição
preferencial dos OMMs foi a região entre 2,5 e 4,5 m a partir do início espelho d’água (figura
23). Esses resultados explicam a não detecção dos OMMs em pontos no meio da lagoa com
salinidades similares aos pontos onde os OMMs foram encontrados em grandes números, mas
ainda não encontramos um motivo para que ocorra esse comportamento nos OMMs.
Estudos nos microcosmos
Investigamos o comportamento dos OMMs em microcosmos contendo água e
sedimento da praia da Baleia (São Pedro d’Aldeia), local já conhecido por conter grandes
quantidades de OMM. Foi feito um acompanhamento ao longo de 42 dias em 5 diferentes
microcosmos (figura 24). A variação populacional de OMMs nos microcosmos, levando em
consideração a média das 5 réplicas revelou um declínio na sua população desde a primeira
semana, mas mesmo 42 dias após a coleta eles foram detectados (figura 24a). Quando os
dados foram analisados levando em consideração cada um dos microcosmos, o
comportamento populacional em cada um deles foi distinto: a taxa com que a densidade
populacional decaiu foi variável e em alguns momentos até subiu. Como os microcosmos
43
foram montados no local, de maneira independente, provavelmente a estabilização destes
tenha ocorrido de maneira diferente e então eles possuam características bióticas e abióticas
diferentes, indicando que essas variações entre os microcosmos tem grande influência sobre a
população dos OMMs (figura 24b).
A comportamento dos OMMs nos microcosmos também foi avaliado quanto a sua
distribuição vertical no sedimento. Em 7, 15 e 45 dias após a coleta no ambiente, amostras
foram retiradas em amostradores cilíndricos e o sedimento foi fracionado em camadas de 1
cm até 5 cm de profundidade (figura 25a, b e c, respectivamente). Os OMMs foram então
contados na borda da gota após 5 minutos de aplicação de um campo magnético gerado por
um imã comum. Ao longo do tempo foi observado que os OMMs, que inicialmente se
localizavam nas camadas mais profundas (4-5 cm), vão gradativamente subindo para mais
próximo da interface sedimento-água (figura 25), provavelmente devido a migração do
quimioclina (gradiente de oxigênio e enxofre). Conforme os OMMs atingem as camadas mais
superiores, o número de indivíduos decresce (figura 25c).
COMPORTAMENTO SAZONAL NO AMBIENTE
Escolhemos três diferentes pontos da lagoa de Araruama para a realização de um
acompanhamento sazonal de 12 meses (julho/2005 a junho/2006) da população de OMMs no
ambiente levando em consideração alguns aspectos como salinidade e impacto ambiental pela
presença de área urbanizada. Os pontos escolhidos foram:
• Praia da Baleia (Município de São Pedro d’Aldeia, RJ) – local com alta salinidade
(média de 50‰), e impactado pela urbanização da cidade de São Pedro e a vila de
pescadores localizada nesta praia.
• Canal da Companhia Nacional de Álcalis (CNA) (Município de Arraial do Cabo, RJ;
próximo ao aeroporto de Cabo frio) – local com salinidade bem próxima à da praia da
44
Baleia, porém em área não urbanizada e de proteção ambiental (menor impacto).
• Próximo à foz do Rio das Moças (Município de Araruama) – local em região
urbanizada de menor salinidade devido ao aporte de água doce do rio.
Nestes locais, foram coletadas amostras mensais de sedimento e água para a contagem
dos OMMS e alguns fatores abióticos foram medidos: temperatura da água, teor de umidade
no sedimento, salinidade e pH, (figura 26a–d, respectivamente). Dentre os fatores abióticos
mensurados, o que aparentemente mais se correlaciona com o número de OMMs é a
salinidade. Para avaliar a similaridade genética dos OMMs coletados dos três locais da lagoa
de Araruama, foi feito uma marcação de FISH nesses OMMs utilizando as sondas OMM,
desenvolvida para marcar especificamente OMMs coletados na praia da Baleia (ABREU et al.
2007, ver anexo 4) e MMP (DELONG, FRANKEL & BAZYLINSKI, 1993) (figura 27). As
duas sondas marcam regiões variáveis do 16S rRNA desse microrganismo. A dupla
hibridização (sonda OMM – vermelho; sonda MMP – verde) em todos os OMMs coletados
dos três pontos indica provavelmente uma população geneticamente homogênea e que são
microrganismos geneticamente iguais (figura 27).
A figura 28 mostra o número do OMMs e a salinidade para compararmos o quanto essa
correlação procede (figura 28). Podemos observar que os OMMs estão presentes o ano inteiro
nos três locais analisados. O local de coleta próximo à foz do Rio das Moças, com a menor
salinidade em todos os períodos analisados, normalmente possui número de OMMs sempre
abaixo dos outros dois pontos de coleta e tendem a ter um pequeno aumento nos períodos em
que a salinidade é superior a 40 ‰. Na praia da Baleia, no período do mês de outubro/ 2005 a
janeiro/ 2006, houve um aumento significativo no número de OMMs, sendo janeiro o mês
onde o número de OMMs foi o maior. Neste período a salinidade deste local teve uma
diminuição de 61 ‰ (mês de setembro/2005) a 55,7 ‰ (mês de janeiro/2006). No mês de
fevereiro, a população de OMMs na praia da Baleia teve uma forte queda na densidade e a
45
salinidade neste mesmo mês teve um aumento de aproximadamente 9 ‰ (de 50 ‰ a 59 ‰).
Pudemos observar baseados nesses fatos que, provavelmente, tanto as baixas salinidades
quanto as altas salinidades controlam negativamente a população dos OMMs. Esses
microrganismos possivelmente possuem uma faixa de crescimento ótimo. Não sabemos que
outros fatores abióticos interferem nessa regulação.
Entre os pontos de coleta da praia da Baleia e canal da CNA, mesmo em períodos com a
mesma salinidade, a população dos OMMs sempre divergiram em número. A principal
diferença observada entre esses dois locais é a poluição orgânica. Enquanto a praia da Baleia
recebe um grande aporte de matéria orgânica devido a grande urbanização da área e da vila de
pescadores, o canal da CNA está localizado em uma área de preservação ambiental, não
havendo nenhum tipo de urbanização e sendo inclusive de difícil acesso. Talvez essa maior
quantidade de matéria orgânica na praia da Baleia possa, direta ou indiretamente, favorecer o
crescimento dos OMMs no ambiente.
TESTES DE SALINIDADE
Para testar a hipótese da existência de uma faixa de salinidade ótima para o crescimento
dos OMMs, foram montados 4 microcosmos contendo sedimento da praia da Baleia. Na
montagem dos microcosmos foi tomado o cuidado em homogeneizar todo o sedimento
utilizado e após a montagem foram acertadas as salinidades no laboratório com a adição de
água destilada ou NaCl à água da lagoa. Essa homogeneização é importante para permitir que
em todos os microcosmos os mesmos fatores bióticos e abióticos estejam agindo sobre a
população dos OMMs e que somente a salinidade seja o diferencial. Foram testadas 4
diferentes salinidades (figura 29): microcosmo 1, salinidade de 55 ‰ (salinidade normal
encontrada no local no momento da coleta); microcosmo 2, salinidade de 45 ‰; microcosmo
3, salinidade de 30 ‰ e microcosmo 4, salinidade de 65‰. Podemos observar que nas
46
salinidades de 55 e 45 ‰ (microcosmo 1 e 2, respectivamente), a população dos OMMs teve
um ligeiro crescimento 3 dias após a coleta. O baixo número observado no dia seguinte após à
coleta é provavelmente devido à perturbação do sedimento no momento da coleta e montagem
dos microcosmos; após esse distúrbio a população dos OMMs se recuperaria e retomaria seu
crescimento (3 dias após a coleta), decaindo novamente, como observado em outros
experimentos realizados em microcosmo (figura 24). Nas salinidades extremas de 30 e 65 ‰,
aparentemente a população dos OMMs não se recupera e os OMMs não são capazes de
crescer nesses ambientes. Esses resultados confirmam a idéia de que os OMMs prefiram uma
faixa de salinidade para seu crescimento.
ENSAIO DE PREDAÇÃO
Para testar outros fatores que possam estar controlando a população dos OMMs foram
planejados experimentos de interação entre protozoários encontrados na lagoa de Araruama e
os OMMs. Sabe-se que os protozoários são os consumidores primários das bactérias e atuam
controlando a sobrevivência e o crescimento bacteriano no ambiente (PERNTHALER, 2005).
Para isso isolamos um ciliado da interface sedimento-água (figura 30). Esse ciliado de cerca
de 78 x 53 µm de tamanho (figura 31) estava presente em vários pontos da lagoa de
Araruama, inclusive os três pontos de coleta usados no acompanhamento sazonal, e foram
facilmente cultivados em placas de Petri. Com o auxílio do Prof Inácio Domingos Silva Neto
(Instituto de Biologia, UFRJ) esses ciliados foram identificados por imagens de microscopia
eletrônica de varredura e pela técnica da impregnação com proteinato de prata (protargol)
(figura 32-34) como pertencentes à espécie Euplotes vannus.
Para os experimentos de interação os OMMs magneticamente concentrados foram
colocados em contato com os ciliados (proporção de 30 OMMs/E. vannus) e os eventos foram
acompanhados por vídeo microscopia. Aproximadamente 30 minutos após o início da
47
interação observamos o momento no qual os OMMs são ingeridos (figura 35). Após a
ingestão, os ciliados não demonstraram nenhuma resposta ao campo magnético aplicado.
Provavelmente a ausência de resposta ao campo magnético pode ser devido a quantidade de
material magnético ingerido pelo ciliado não ser suficiente para este microrganismo se
orientar no campo aplicado. Essas interações foram observadas em maior aumento e
observamos estruturas no interior do corpo do ciliado muito semelhantes a OMMs danificados
(figura 36 seta). Quando essas estruturas eram observadas em maior aumento, elas tornaram-
se visíveis (figura 37), incluindo, as cadeias de cristais magnéticos (figura 37, inserto). Essas
estruturas não foram visualizadas em ciliados que não foram expostos aos OMMs (figura 31).
As interações de 30 minutos e 1 hora foram processadas para microscopia eletrônica de
transmissão e as imagens confirmaram a presença de OMMs dentro dos vacúolos dos ciliados
(figura 38). Vários OMMs foram encontrados dentro de um mesmo ciliado, e os OMMs
possuíam diferentes graus de decomposição (figura 38 e 39 a-c). Em muitos casos, os cristais
magnéticos também se encontravam bastante deteriorados e, aparentemente, pareciam estar
sendo dissolvidos (figura 40 a, seta). Foram feitos espectros de microanálise de raios-X em
cristais aparentemente íntegros (figura 40a, cabeça de seta) e em cristais muito danificados
(figura 40a, seta); os espectros demonstraram que os cristais íntegros inicialmente contêm
ferro e enxofre, como o esperado para greigita (Fe3S4), mas sofrem então dissolução,
perdendo o aspecto cristalino e passam a conter somente o ferro (figura 40b). Provavelmente
o caráter ácido dos vacúolos é o responsável pela dissolução dos cristais. Para avaliar se os
vacúolos onde os OMMs são encontrados dentro dos ciliados são realmente acídicos usamos
o corante LysoTracker Green DND-26, que é um marcador de compartimentos ácidos (figura
41). Dentro dos vacúolos foi possível visualizar a presença dos OMMs e de suas cadeias de
magnetossomos (figura 41a). Os vacúolos onde os OMMs são encontrados são acídicos como
pudemos observar por microscopia de varredura a laser e análise espectral, quando
48
comparamos a região do vacúolo e do citoplasma (figura 41b e espectros).
Pesquisamos se o ferro contido nos magnetossomos e dissolvido pelo ambiente ácido
dos vacúolos era acumulado em alguma estrutura dentro dos ciliados. Em cortes ultrafinos,
sem contrastante, de interações de 1 hora entre os OMMs e os ciliados, foram feitas
microanálises de raios-X para pesquisar a presença do elemento ferro (figura 42). As
estruturas eletrodensas que poderiam estar armazenando ferro não demonstraram a presença
deste elemento (figura 42a, b e c), bem como no citoplasma não foi detectado este elemento
(figura 42d). Provavelmente, o processamento para microscopia eletrônica de transmissão não
preservou o ferro solúvel dentro da célula do ciliado ou a quantidade de ferro é muito pequena
em relação ao volume celular dos ciliados e não foi detectado pela microanálise.
ESTUDO DA COMUNIDADE MICROBIANA DOS MESMOS AMBIENTES DOS
OMMS
Escolhemos três meses do acompanhamento sazonal para estudar mudanças na
comunidade microbiana que justificassem as diferenças observadas na população dos OMMs.
Estudamos a comunidade microbiana pelo método quantitativo de marcação por DAPI e
qualitativo de avaliação da estrutura da comunidade bacteriana por DGGE. Os meses
escolhidos foram: agosto, que apesar de haver uma diferença na salinidade entre os três locais,
a contagem de OMMs, apesar de baixa, foi muito similar entre eles; janeiro no qual a praia da
Baleia apresentou uma grande contagem (a maior de todo o acompanhamento sazonal) e
houve uma diferença muito grande nos valores de OMMs dos três locais sem que houvesse
uma diferença tão grande nos valores de salinidade; e o mês de fevereiro aonde os OMMs da
praia da Baleia tiveram uma queda drástica em relação ao mês anterior sem que houvesse
variações abióticas bruscas (ver figuras 26 e 28).
Os números de células observados nos cinco primeiros centímetros de sedimento dos
49
locais e períodos avaliados estão mostrados na tabela 2. O ponto de coleta próximo à foz do
Rio das Moças foi o que demonstrou o maior número de bactérias nos três meses estudados,
quando comparado aos outros locais. Porém houve um decréscimo no número de bactérias no
mês de fevereiro (2006) em relação a agosto (2005) e janeiro (2006). Provavelmente a menor
salinidade deste ponto torna este ambiente menos extremo, permitindo uma maior densidade
populacional. Não houve nenhuma mudança importante nos valores de bactérias totais dos
outros dois locais entre os diferentes meses, e em ambos os locais (próximo ao canal da CNA
e praia da Baleia) as contagens foram muito semelhantes (tabela 2), nestes mesmos meses os
valores abióticos destes dois locais foram muito semelhantes (figura 26). Representamos no
mesmo gráfico os valores de bactérias totais e os valores da contagem dos OMMs para
verificar se existe alguma correlação entre esses valores no período estudado (figura 43). Não
observamos nenhuma correlação entre estes dois parâmetros, aparentemente os fatores
(bióticos ou abióticos) que regulam a densidade populacional dos OMMs não afeta a
comunidade microbiana como um todo.
Tabela 2: Número de bactérias totais nos meses de agosto/2005, janeiro/2006 e fevereiro/2006 nos três locais de coleta do acompanhamento sazonal. Valores expressos por grama (peso seco) de sedimento.
Locais
Mês Foz do Rio das Moças Canal da CNA Praia da Baleia
Ago/2005 1,2 x 109 ± 0,1 x 109 6,4 x 108 ± 1,6 x 108 8,4 x 108 ± 3,5 x 108
Jan/2006 1,5 x 109 ± 0,5 x 109 5,4 x 108 ± 1 x 108 6,9 x 108 ± 1,6 x 108
Fev/2006 6,4 x 108 ± 0,3 x 108 4,9 x 108 ± 0,5 x 108 4 x 108 ± 0,5 x 108
Para analisar a estrutura da comunidade microbiana, amplificamos um fragmento de
aproximadamente 430 pb da região da alça V4-V6 do rRNA 16S bacteriano e submetemos
50
esse fragmento ao DGGE. O perfil gerado pelo DGGE mostrou um alto número de bandas
distribuídas pelo gel (figura 44). Um total de 36 bandas diferentes foi observado, sendo que o
menor número de bandas detectado foi de 16 (tira 4 – Rio das Moças em janeiro) e o maior de
26 (tira 5 – canal da CNA em janeiro). Não houve nenhuma banda que fosse comum a todas
as amostras. Os perfis do DGGE foram comparados usando o coeficiente de Pearson e um
dendrograma foi construído utilizando o método UPGMA (unweighted pair group method
using arithmetic average) (figura 45). O dendrograma mostra três grandes grupos associados
normalmente pelo período analisado. A praia da Baleia no mês de fevereiro se agrupou à
amostra do mês de agosto, ao contrário do que ocorreu nos outros locais. Esses dados
mostram que realmente houve uma mudança importante na estrutura da comunidade da praia
da Baleia entre os meses de janeiro e fevereiro e que essa mudança pode ter influenciado a
população dos OMMs ou então o fator que direcionou essa mudança na estrutura possa
também ter influenciado a população dos OMMs.
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Pranchas
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PRANCHA 1: OMMS ENCONTRADOS NA LAGOA ENCANTADA
Figura 9 a-e – Micrografias eletrônicas de varredura dos OMMs da lagoa Encantada (PNRJ,
Macaé, RJ). A barra indica 2 µm para todas as imagens.
Figura 10 – Imagem de microscopia de contraste de fase dos OMMs da lagoa Encantada
mostrando a organização periférica dos magnetossomos nas células (setas). A barra indica 5
µm.
Figura 11 – Micrografia eletrônica de transmissão de células individualizadas dos OMMs da
lagoa Encantada (sem contrastante). Observe os magnetossomos (setas) e os vacúolos
eletrolucentes (asterisco). A barra indica 1 µm.
Figura 12 – Micrografia eletrônica de transmissão (sem contrastante) de uma célula individual
do OMM mostrando muitos magnetossomos. A barra indica 250 nm.
Figura 13 – Espectro de microanálise raios-X de um magnetossomo do OMM da lagoa
Encantada mostrando a grande quantidade de ferro (Fe) e enxofre (S). O pico de cobre (Cu) é
das barras da grade.
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54
PRANCHA 2: OMMS DA LAGOA ROBALO
Figura 14 – Microscopia de contraste interferencial de Normaski onde podem ser observados
3 morfotipos de bactérias magnéticas da lagoa Robalo. Dois cocos, um menor (setas pretas) e
um maior (cabeças de setas), e os OMMs (seta branca). Barra indica 5 µm.
Figura 15 – Micrografia eletrônica de transmissão dos morfotipos cocóides da lagoa Robalo, a
celular maior (a) e a menor (b). Observe o magnetossomos (setas) e os glóbulos (asterisco). A
barra indica 500 nm para ambas as figuras.
Figura 16 – Micrografia eletrônica de transmissão dos OMMs após tratamento com água
destilada e conseqüente desagregação contendo inúmeras cadeias de magnetossomos (setas).
A barra indica 2,5 µm.
Figura 17 – Espectro de microanálise de raios-X do cristal equidimensional (a) e do cristal em
forma de ponta de lança (b) nos OMMs da lagoa Robalo. O sinal de Cu é da barras da grade,
os sinais dos elementos leves são oriundos do citoplasma da célula. O inserto mostra os dois
tipos de magnetossomos analisados (a e b). A barra indica 200 nm.
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PRANCHA 3: DIVERSIDADE GENÉTICA DOS OMMS ENCONTRADOS EM
DIFERENTES REGIÕES DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
Figura 18 – Perfil do DGGE do fragmento do rDNA 16S dos OMMs magneticamente
concentrados das amostras da lagoa Encantada (a-b) e Araruama (praia de Iguaba Grande) (c-
d). A única banda em todas as amostras indica a similaridade genética entre elas.
Figura 19 – Micrografias de epifluorescência dos OMMs da lagoa de Araruama (Iguaba)
corados com DAPI (a) e hibridizados com a sonda MMP (b). Barra indica 5 µm em ambas as
figuras.
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PRANCHA 4: DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DOS OMMS NA LAGOA DE
ARARUAMA
Figura 20 – Amostrador cilíndrico usado nas coletas. A barra indica 2 cm.
Figura 21 – Perfil de oxigênio (medido com um microsensor de oxigênio de 25 µm acoplado a
um micromanipulador) e a distribuição vertical dos OMMs nas camadas do sedimento
coletado em amostradores cilíndricos (ver figura 20). Observe que uma maior densidade é
observada nas regiões anaeróbicas do sedimento.
Figura 22 – Distribuição dos OMMs nos primeiros 5 cm de sedimento da lagoa de Araruama,
coletado em amostradores cilíndricos. Os valores das contagens são OMMs/ mL e os números
entre parênteses são as salinidades (‰) observadas no local no momento da coleta (através de
um refratômetro manual). A barra indica 5 km.
Figura 23 –Transecto da distribuição dos OMMs a partir do inicio do espelho d’água de
amostras coletadas em amostradores cilíndricos (ver figura 20). As barras são a média de 3
réplicas e seus erros padrões.
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PRANCHA 5: COMPORTAMENTO DOS OMMS NOS MICROCOSMOS AO
LONGO DO TEMPO
Figura 24 – Variação do número de OMMs em microcosmos acompanhados por um período
de 42 dias após a coleta. Estão representadas as médias de 5 microcosmos (a) e os erros
padrões, e os valores representados por cada microcosmo (b) mostrando o comportamento
variável entre os diferentes microcosmo.
Figura 25 – Distribuição vertical dos OMMs no sedimento de microcosmos ao longo do
tempo. As barras mostram o comportamento da população de OMMs de 2 amostradores
cilíndricos coletados do mesmo microcosmo em 7 (a), 15 (b) e 45 (c) dias após a coleta. Os
OMMs tendem a se mover para as camadas superiores se aproximando da interface
sedimento-água com o tempo.
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PRANCHA 6: DADOS ABIÓTICOS DO ACOMPANHAMENTO SAZONAL
Figura 26 –Dados abióticos mensurados durante acompanhamento sazonal de 12 meses em
três pontos de coleta da lagoa de Araruama. Os parâmetros medidos foram temperatura da
água, teor de água no sedimento, pH e salinidade (a, b, c e d, respectivamente).
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PRANCHA 7: COMPORTAMENTO SAZONAL DOS OMMS NO AMBIENTE –
IMPORTÂNCIA DA SALINIDADE
Figura 27 – FISH dos OMMs encontrados nos três diferentes pontos da lagoa de Araruama do
acompanhamento sazonal (Rio das Moças – a, b e c; Canal da CNA – d, e e f e Praia da
Baleia – g, h e i) marcados com as sondas OMM (b, e e h) e MMP (c, f e i). A barra indica 5
µm.
Figura 28 – Acompanhamento da densidade populacional dos OMMs por 12 meses em três
diferentes pontos da lagoa de Araruama (barras) comparado com a salinidade (linhas e
quadrados) em partes por mil (‰). As barras são a média de 6 réplicas com o erro padrão.
Figura 29 –Avaliação do efeito de diferentes salinidade em microcosmos por 1, 3 e 7 dias
após a coleta e o ajuste das salinidades. O microcosmo 1 corresponde a salinidade do local
(Praia da Baleia) no momento da coleta (55 ‰), o microcosmo 2, 3 e 4 correspondem às
salinidades de 45‰, 30 ‰ e 65 ‰, respectivamente.
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PRANCHA 8: CILIADO ISOLADO DO SEDIMENTO DA LAGOA DE ARARUAMA
IDENTIFICADO COMO EUPLOTES VANNUS
Figura 30 – Microscopia óptica mostrando a localização na interface sedimento-água (ver
escala) dos ciliados (setas) isolados de amostras da lagoa de Araruama. A barra indica 100
µm.
Figura 31 – Microscopia óptica com contraste de fase interferencial do ciliado obtido da
cultura feita com amostras de sedimento da lagoa de Araruama. A barra indica 20 µm.
Figura 32 – Imagem de microscopia óptica do ciliado corado pela técnica do Protargol para
identificação da espécie. A barra indica 20 µm.
Figura 33 – Microscopia eletrônica de varredura mostrando a região dorsal do Euplotes
vannus. A barra indica 10 µm.
Figura 34 – Microscopia eletrônica de varredura mostrando a região ventral do Euplotes
vannus. A barra indica 10 µm.
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PRANCHA 9: PREDAÇÃO DOS OMMS PELOS CILIADOS
Figura 35 – Imagens da digitalização da vídeo-microscopia da interação entre OMMs (cabeça
de seta) e o E. vannus. Observe o momento exato no qual os OMMs são ingeridos pelo E.
vannus (seta). A barra indica 20 µm.
Figura 36 – Imagem de microscopia de luz com contraste interferencial do E. vannus cerca de
2 horas após a interação com os OMMs. A seta mostra uma estrutura dentro do vacúolo do
ciliado similar a um OMM deteriorado A barra indica 20 µm.
Figura 37 – Imagem de microscopia de luz com contraste interferencial mostrando um maior
aumento de uma região com várias estruturas similares aos OMMs. No inserto observa-se esta
estrutura em maior aumento onde os magnetossomos podem ser visualizados (seta). As barras
indicam 10 µm e 2 µm (inserto).
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PRANCHA 10 – DETERIORAÇÃO DOS OMMS E DOS MAGNETOSSOMOS NOS
VACÚOLOS DO CILIADO
Figura 38 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de E. vannus 2 horas após a
interação com OMMs. Observe os OMMs (setas) em diferentes graus de decomposição dentro
dos vacúolos do ciliado. A barra indica 5 µm.
Figura 39 – Imagem em maior aumento dos OMMs em diferentes graus de decomposição (a-
c) dentro dos vacúolos do E. vannus. Observe em c, um OMM com um alto nível de
degradação A barra indica 500 nm para todas as micrografias.
Figura 40 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão dos magnetossomos dentro do
vacúolo do ciliado (a) e os espectros de microanálise de raios-X desses magnetossomos (b).
Observe os cristais com alto grau de deterioração (setas) e cristais ainda intactos (cabeça de
seta). O espectro dos magnetossomos intactos está representado pela curva vazia e dos
magnetossomos degradados pela curva cheia. Os picos de cobre são oriundos das barras da
grade. A barra indica 250 nm.
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72
PRANCHA 11 – VACÚOLOS ÁCIDOS E LOCALIZAÇÃO DO FERRO DENTRO DO
CILIADO
Figura 41 – Marcação com o corante Lysotracker dos vacúolos digestivos dos ciliados
contendo os OMMs. Imagem de campo claro mostrando os OMMs e seus magnetossomos (a)
e a imagem de fluorescência no comprimento de onda de 510-520 nm (b). O gráfico mostra a
análise espectral entre os comprimentos de onda 505 e 600 nm das áreas indicadas na imagem
(1 e 2). A barra indica 5 µm para ambas as imagens.
Figura 42 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de um ciliado que ingeriu
OMMs mostrando diferentes estruturas eletrodensas dentro do corpo do ciliado e seus
respectivos espectros de microanálise de raios-X. Os picos de cobre são oriundos das barras
da grade. As barras indicam 2 µm para a imagem maior e 150 nm, 300 nm, 500 nm e 200 nm
para os insertos a, b, c e d respectivamente.
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74
PRANCHA 12 – COMUNIDADE MICROBIANA DOS AMBIENTES DOS OMMS
NOS MESES DE AGOSTO/2005, JANEIRO E FEVEREIRO/2006
Figura 43 – Gráfico comparando a contagem de bactérias totais (quadrados) e a contagem do
OMMs (colunas) dos cinco primeiros centímetros de sedimento, nos três pontos de coleta do
estudo sazonal nos meses de agosto/2005, janeiro e fevereiro/2006. Os valores estão
representados por peso seco. As barras são a média de seis réplicas com os respectivos os
erros padrões e os quadrados são a média de três réplicas com os respectivos erros padrões.
Figura 44 – Perfil do DGGE do fragmento do 16S das bactérias dos 5 centímetros de
sedimento das amostras do mês de agosto (1-3), janeiro (4-6) e fevereiro (7-9), dos locais de
coleta próximo a foz do Rio das Moças (1, 4 e 7), próximo ao canal da CNA (2, 5 e 8) e praia
da Baleia (3, 6 e 9).
Figura 45 – Dendrograma obtido do agrupamento pelo método UPGMA a partir do perfil do
DGGE da comunidade microbiana total dos cinco primeiros centímetros de sedimento, nos
três pontos de coleta do estudo sazonal nos meses de agosto/2005, janeiro e fevereiro/2006.
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76
Discussão
Os OMMs são microrganismos magnéticos com inúmeras características singulares,
entre elas podemos citar a multicelularidade (FARINA et al., 1983; RODGERS et al., 1990a;
FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS, 1990; KEIM et al., 2004a, b), o ciclo de vida
incomum (KEIM et al., 2004b) e a coordenação celular para o seu movimento característico e
a magnetotaxia (RODGERS et al., 1990a; KEIM et al., 2004a; GREENBERG et al., 2005).
Muito se sabe sobre as características fenotípicas desses microrganismos, mas a grande
maioria dos trabalhos se baseia na sua retirada do ambiente. Neste trabalho, nós estudamos
vários aspectos ecológicos como distribuição no ambiente, variação da densidade
populacional ao longo do tempo e os fatores que poderiam estar controlando essa população
no ambiente.
DISTRIBUIÇÃO E DIVERSIDADE NO AMBIENTE
Estudamos a presença dos OMMs em diferentes lagoas costeiras próximas à cidade do
Rio de Janeiro, localizada na região de Anomalia Geomagnética do Atlântico Sul (baixa
intensidade do campo geomagnético de cerca de 0,23 Gauss; a média é de 0,5 Gauss).
A presença dos OMMs nos ambientes estudados parece estar relacionada com a
salinidade. Nos locais e/ou períodos onde a salinidade estava abaixo da do mar (30‰) não
encontramos os OMMs. Porém outros fatores também devem estar associados à presença
desses microrganismos, pois, dentre as lagoas hipersalinas estudadas, nem todas possuíam
OMMs. Essas lagoas são conhecidas por possuírem uma grande diversidade nas
características físico-químicas da água (ENRICH–PRAST et al., 2003). Na literatura, os
OMMs são normalmente encontrados em ambientes hipersalinos a salobros (KEIM et al.,
2007 – ver tabela 1 do anexo 2), mas até então não foram descritos em ambientes de água
doce.
77
Os OMMs encontrados nos diferentes ambientes estudados neste trabalho são
morfologicamente similares. Uma característica incomum foi observada nos OMMs da lagoa
Robalo, eles mineralizam tanto cristais de sulfeto de ferro (comum a maioria dos OMMs)
quanto de óxido de ferro na mesma célula, apesar de terem morfologias distintas. Essa
característica pode estar relacionada a fatores ambientais (maior ou menor disponibilidade de
oxigênio molecular ou sulfeto de hidrogênio). Porém, provavelmente estes microrganismos
possuem dois conjuntos de genes independentes para cada tipo de magnetossomo, pois o fato
de existir dois morfotipos de cristais não condiz com a ocorrência de um único processo de
biomineralização sobre a interferência somente ambiental. O ambiente poderia influenciar na
composição dos cristais, mas a morfologia é regulada geneticamente (BAZYLINSKI et al.,
1995). Foi observado em um bastonete magnético também produtor dos dois tipos de
magnetossomos que, dependendo do local onde essas bactérias eram retiradas elas possuíam
uma quantidade diferente de cada cristal. Elas possuíam mais magnetossomos de magnetita
quando coletadas da região óxicas e mais greigita quando coletadas das regiões anóxicas
(BAZYLINSKI et al., 1995), indicando que o ambiente pode ser responsável pela abundância
relativa de cada tipo de cristal. Devido a reduzida quantidade de OMMs na lagoa Robalo, não
foi possível verificar a localização deles no quimioclina nem verificar a existência de
diferenças de abundância de cada tipo de cristal conforme a região de coleta no sedimento.
Recentemente nosso grupo demonstrou um outro OMM coletado da lagoa de Itaipu
(Niterói, RJ) que também mineraliza ambos os cristais, somente magnetita ou somente
greigita (LINS et al., 2007). LINS et al. (2007) propõem que a presença da maquinaria
genética responsável pela produção de magnetita nos OMMs possa ter origem de uma
transferência lateral de genes, já que a grande maioria desses microrganismos, descritos até
então, mineralizam somente greigita (MANN, SPARKS & BOARD, 1990; PÓSFAI et al.,
1998b; LINS & FARINA, 2001; KEIM et al., 2004a). Em ambos os ambientes onde foram
78
encontrados OMMs com os dois tipos de cristais (lagoa de Itaipu e de Araruama), eles não
foram as únicas bactérias magnéticas encontradas (LINS et al., 2005, 2006). Essa diversidade
das bactérias magnéticas nestes locais, inclusive com a presença de bactérias magnéticas
produtoras de magnetita, possa ter facilitado essa transferência lateral.
Os OMMs encontrados na lagoa de Araruama e na lagoa Encantada possuem uma
estreita relação filogenética indicando que possivelmente são os mesmos microrganismos,
porém a presença de outras bactérias magnéticas e o baixo número dos OMMs encontrados na
lagoa Robalo dificultaram o estabelecimento de uma relação filogenética entre este e os outros
OMMs encontrados neste trabalho.
Biogeografia dos OMMs
Apesar de recentemente ter sido descrito uma diversidade filogenética em OMMs
isolados de pântanos salgados em Little Sippewisset (Falmouth, MA, EUA) (SIMMONS &
EDWARDS, 2007a), essa mesma diversidade não foi observada no seqüênciamento completo
do rDNA 16S de clones obtidos de amostras magneticamente concentradas, ricas em OMMs,
da praia da Baleia na lagoa de Araruama (ABREU et al. 2007, ver anexo 4). Também não foi
observada essa diversidade nos locais estudados neste trabalho (próximo à foz do Rio das
Moças e do canal da CNA e praia da Baleia – lagoa de Araruama) tanto através do FISH com
a utilização de duas sondas para regiões variáveis, quanto por DGGE (praia de Iguaba Grande
– Lagoa de Araruama, lagoa Encantada). Porém, somente o seqüênciamento completo do
rDNA 16S pode confirmar a ausência dessa diversidade. Essa diversidade encontrada levou a
proposição de um novo gênero dentro das Deltaproteobacteria (SIMMONS & EDWARDS,
2007a). Os OMMs encontrados na lagoa de Araruama (praia da Baleia) possuem 97% de
similaridade com os OMMs de Little Sippewisset (SIMMONS & EDWARDS, 2007a) e 96%
com os OMMs coletados em New England (DELONG, FRANKEL & BAZYLINSKI, 1993),
logo eles pertenceriam ao mesmo gênero bacteriano (ABREU et al. 2007, ver anexo 4).
79
Se levarmos em consideração o gênero bacteriano como unidade taxonômica, a
presença de OMMs em diferentes regiões do globo indica uma distribuição cosmopolita.
Mesmo com essa distribuição geográfica cosmopolita, a sua distribuição dentro de um mesmo
local parece ser direcionada por fatores intrínsecos do ambiente. Quando observamos a
distribuição dos OMMs em vários pontos da lagoa de Araruama, nós observamos mais uma
vez que a baixa salinidade limita a presença desses microrganismos. Foi visto também que em
pontos localizados no interior da lagoa eles não eram detectados (apesar da salinidade não ser
o fator limitante). Essa observação foi confirmada pelo transecto feito a partir do início do
espelho d’água que indicou uma localização dos OMMs preferencialmente, próxima à
margem. A falta de informação sobre dados bióticos e abióticos dos locais analisados no
transecto não nos permite inferir os fatores que possam estar associados a essa distribuição.
Localização no sedimento
A maioria das bactérias magnéticas são organismos de gradientes, ou seja, eles obtêm
energia para o seu crescimento no ambiente de compostos redutores e oxidantes localizados
em uma interface química (quimioclina), e por isso ocorrem em uma pequena região do
ambiente onde esta interface química ocorre (SIMMONS & EDWARDS, 2007b). Cada tipo
de bactéria magnética parece estar adaptado aos diferentes gradientes físico-químicos no
ambiente estratificado onde elas vivem (SIMMONS et al., 2004). Bactérias produtoras de
greigita (incluindo os OMMs) são encontradas na região anaeróbica, enquanto bactérias
produtoras de magnetita são normalmente encontradas em regiões microaerófilas (oxiclina)
(BAZYLINSKI et al., 1995; SIMMONS et al., 2004). Os OMMs da lagoa de Araruama se
localizam preferencialmente nas regiões anaeróbicas do sedimento, como esperado para
bactérias magnéticas produtoras de greigita. Elas estão distribuídas por uma região de cerca
de 3 cm, tendo uma maior concentração no quarto centímetro do sedimento
(aproximadamente uma ordem de grandeza a mais do que nas outras regiões). Esse
80
comportamento já havia sido observado em OMMs de outros ambientes estratificados
(SIMMONS et al., 2004). Provavelmente estes microrganismos são anaeróbicos, sendo essa
idéia apoiada pelo fato de que estão filogeneticamente associados às bactérias anaeróbicas
heterotróficas que utilizam a redução de sulfato ou ferro na sua respiração (DELONG,
FRANKEL & BAZYLINSKI, 1993; SIMMONS & EDWARDS, 2007a; ABREU et al. 2007,
ver anexo 4). Porém, são microrganismos aerotolerantes, pois sobrevivem à exposição, por
longos períodos, ao O2 quando observados ao microscópio.
VARIAÇÃO DA DENSIDADE DA POPULAÇÃO DE OMMS AO LONGO DO
TEMPO EM DIFERENTES LOCAIS NA LAGOA DE ARARUAMA
Observamos que os OMMs eram encontrados em maior densidade populacional, quase
sempre, no ponto de coleta onde a influência antropogênica era maior (praia da Baleia), sendo
que foram encontrados os maiores valores (ordem de 103 OMMs/cm3 de sedimento) no início
do verão (dezembro/2005 e janeiro/2006), onde o número de habitantes aumenta
consideravelmente a população do local devido ao turismo na região e, conseqüentemente,
aumenta o despejo de esgoto doméstico que é lançado diretamente na lagoa. Essa informação
sugere que a introdução de matéria orgânica possa estar favorecendo o aumento na densidade
da população de OMMs. SIMMONS & EDWARDS (2007a) já haviam observado essa
correlação entre matéria orgânica e a população dos OMMs. A raiz da vegetação encontrada
no local estudado por eles liberava quantidades variáveis de exudatos ricos em carbono
orgânico. Essa liberação era maior durante o verão, período onde foram encontrados também
mais OMMs. Os nossos valores máximos de OMMs foram similares aos valores máximos
encontrados no sedimento de Salt Pond (MA, EUA), na ordem de grandeza de 103
(SIMMONS & EDWARDS, 2007a).
As enormes diferenças nas contagens de OMMs entres os três locais estudados podem
81
ser explicados pelas grandes diferenças biogeoquímicas existentes nesses locais (SOUZA et
al., 2003). Foram medidos mensalmente, por dois anos, diversos fatores abióticos como
fosfato, nitrito, nitrato, amônia, carbono orgânico particulado, entre outros, em 14 diferentes
pontos da lagoa de Araruama, e análises estatísticas separaram esses três locais em diferentes
grupos (SOUZA et al., 2003). Apesar dessas medições terem sido realizadas nos anos de
1991/1992, existe uma relativa homogeneidade dentro de cada região da lagoa de Araruama
(SOUZA et al., 2003). Neste mesmo trabalho, foi verificado que o balanço de nutrientes na
lagoa é resultado de fontes antropogênicas (SOUZA et al., 2003), ou seja, qualquer alteração
nas quantidades de nutrientes na lagoa é oriundo da ação do homem. Logo, caso o aumento da
matéria orgânica tenha sido responsável pelo grande crescimento da população dos OMMs na
praia da Baleia, essa matéria orgânica tem origem no esgoto doméstico. Nos outros dois
pontos de coleta (próximo à foz do Rio das Moças e canal da CNA) não foi observado esse
aumento, pois ambos os locais possuem pouca ou nenhuma urbanização ao redor. No local
próximo a foz do Rio das Moças, apesar de haver urbanização e a entrada da água do rio, este
rio ainda não está poluído (SOUZA et al., 2003). Neste local, a salinidade deve atuar
controlando o crescimento dos OMMs.
Observamos uma queda brusca na contagem de OMMs no mês de fevereiro/2006 na
praia da Baleia, mês no qual ainda haveria um despejo maior de esgoto (e conseqüentemente
matéria orgânica). Essa diminuição na densidade populacional pode ter ocorrido em função de
mudanças bruscas na estrutura da comunidade microbiana causadas pelo excesso de
nutrientes.
Estrutura da comunidade microbiana
Analisamos a estrutura da comunidade microbiana de meses onde verificamos
mudanças importantes no número de OMMs para observar se mudanças bióticas poderiam
estar influenciando a densidade dos OMMs e verificar se a população dos OMMs variava
82
junto com a comunidade microbiana total.
A diversidade de ambientes hipersalinos normalmente é baixa, porém em nossos
experimentos observamos uma densidade bacteriana total na ordem de grandeza de 108 a 109
células por grama de sedimento (peso seco). Existem poucos trabalhos de quantificação de
bactérias totais em sedimentos de ambientes hipersalinos (DANOVARO et al., 2005;
SORENSEN et al., 2005). Nossos valores de bactérias totais foram cerca de três ordens de
grandeza maior do que os encontrados nesses trabalhos. Essa diferença pode estar relacionada
com a diferença de salinidade observada entre a lagoa de Araruama (aproximadamente 55‰)
e os descritos nestes trabalhos (300 e 200‰, DANOVARO et al., 2005; SORENSEN et al.,
2005, respectivamente).
Não houve correlação entre o número de bactérias totais e o número de OMMs e os
valores de bactérias totais não tiveram mudanças importantes entre os meses analisados. Se a
hipótese de ter havido um aporte de matéria orgânica na praia da Baleia, no início do verão,
estiver correta, essa matéria orgânica não influenciou no número de bactérias totais, mas pode
ter influenciado na estrutura da comunidade. Os resultados obtidos pela comparação do perfil
do DGGE sugerem que essa mudança tenha ocorrido entre os meses de janeiro e
fevereiro/2006 na praia da Baleia, onde a amostra da praia da Baleia no mês de fevereiro/2006
se agrupou bem distante da do mês de janeiro/2006. A relação entre mudanças bruscas na
estrutura da comunidade microbiana e mudanças na população dos OMMs pode ser explicada
pela relação filogenética dos OMMs às bactérias redutoras de sulfato (DELONG, FRANKEL
& BAZYLINSKI, 1993; SIMMONS & EDWARDS, 2007a; ABREU et al., 2007, ver anexo
4). Sabe-se que as bactérias redutoras de sulfato utilizam como fonte de energia moléculas
orgânicas de baixo peso molecular que normalmente são produtos de organismos
fermentativos (PURDY, EMBLEY & NEDWELL, 2002), logo é provável que essa mudança
na estrutura da comunidade microbiana tenha influenciado na disponibilidade de fonte de
83
energia usada pelos OMMs.
Quando calculada a proporção dos OMMs em relação ao total de bactérias do mesmo
ambiente foi observada que eles não são numericamente significativos, mesmo nos meses de
pico da densidade populacional (cerca de 0,001% do total de bactérias). Já foi sugerido que a
contagem de bactérias magnetotáticas baseada na concentração magnética possivelmente
subestima a abundância dessas bactérias no ambiente, pois o método se baseia na capacidade
de todas as células nadarem no tempo pré-definido, e células que estejam nadando devagar ou
que estejam presas às partículas de sedimento são perdidas. No sedimento de Salt Pond (MA,
EUA) foi verificado que eles podem corresponder a 1,9% de todas as bactérias (SIMMONS &
EDWARDS, 2007B).
SALINIDADE
Foi verificado que nos meses em com alta salinidade também havia uma baixa
contagem de OMMs, sugerindo que eles possam ser também regulados por salinidades muito
altas. Testamos em microcosmos diferentes salinidades e observamos que os OMMs preferem
uma faixa de salinidade para seu crescimento. Em salinidades extremas não houve aumento
do número de OMMs ao longo do tempo, indicando que não houve crescimento da população
nestas condições. No ambiente, os OMMs são sempre encontrados em salinidades que variam
de 8 a 60‰ (KEIM et al., 2007; tabela 1, anexo 2). Baseado nessas observações é possível
propor que os OMMs sejam microrganismos halofílicos, e levando em consideração a
classificação de acordo com a necessidade de NaCl (MADIGAN, 1996), eles seriam
microrganismos levemente halofílicos (crescimento ótimo entre 10 e 60 ‰ de NaCl). O
estudo filogenético desse microrganismo mostra que eles estão associados aos gêneros
Desulfosarcina, Desulfococcus e Desulfonema. Esses gêneros são considerados levemente
halofílicos, e normalmente são as principais bactérias redutoras de sulfato encontradas em
84
ambientes moderadamente hipersalinos (como é o caso da lagoa de Araruama) (OLLIVIER et
al., 1994).
PREDAÇÃO
Os protozoários são os consumidores primários das bactérias em muitos ambientes,
onde controlam a sobrevivência e o crescimento das populações bacterianas (PERNTHALER,
2005). Baseado nessa informação verificamos se esse tipo de controle na população dos
OMMs poderia estar ocorrendo no ambiente.
Nossos resultados indicam que os OMMs são facilmente ingeridos pelo ciliado E.
vannus. Experimentos realizados anteriormente no nosso laboratório demonstraram que
flagelados de cerca de 20 x 12 µm de tamanho não eram capazes de ingerir OMMs intactos
encontrados em condições normais de salinidade. Porém quando a salinidade no ambiente
diminui, após períodos de muita chuva, por exemplo, são observadas alterações na morfologia
dos OMMs (ver figura 2C, anexo 3), que resultam em uma diminuição na mobilidade e
predação pelos flagelados. Quando bactérias magnetotáticas unicelulares (Itaipu-1; LINS et
al., 2005, 2006) foram expostas a flagelados e ciliados, a predação ocorria facilmente (ver
figura 2A, anexo 3).
Organização multicelular como forma de evitar a predação
Pode se observar baseado nos resultados expostos acima, que existem diferentes
respostas na predação dos cocos unicelulares e nos OMMs. As bactérias unicelulares da lagoa
de Itaipu podem ocorrer em diferentes tamanhos, podendo alcançar até 4 µm, e ainda assim
são consumidos pelos protozoários. Entretanto os OMMs que são maiores (até 10 µm; KEIM
et al., 2004a) são ingeridos somente pelos ciliados. Além disso, os OMMs possuem outras
características que podem evitar a predação pelos protozoários. A grande velocidade de nado
(até 100 µm/s, SILVA et al., 2007), e o “movimento de escape” são características que podem
85
ajudar os OMMs a evitar a predação pelo menos pelos flagelados. Trabalhos anteriores têm
demonstrado que o tamanho é um importante parâmetro para a predação seletiva nos
protozoários (MONGER & LANDRY, 1991; MATZ & KJELLEBERG, 2005). O ciclo de
vida incomum dos OMMs não inclui um estágio de vida unicelular (KEIM et al., 2004b). Em
todos os ciclos reprodutivos, dois novos microrganismos multicelulares são gerados por cada
OMM. A multicelularidade é mantida ao longo das gerações assim como a polaridade
magnética. Foi proposto que a otimização da resposta magnetotática nos OMMs e a
necessidade de transferir a polaridade magnética dos microrganismos parentais para
microrganismos filhos tenham sido as forças seletivas principais para a multicelularidade nos
OMMs (WINKLHOFER et al., 2007). Cada célula separada do OMM perde sua habilidade de
se movimentar e se alinhar no campo magnético. Recentemente demonstramos que uma
célula separada dos microrganismos perde a sua viabilidade e morre (ABREU et al., 2006).
Acreditamos que a organização altamente complexa dos OMMs possa ser um indicativo da
pressão evolutiva contra a predação. A observação de que OMMs parcialmente desagregados
são predados pelos flagelados corrobora esta hipótese. Experimentos em microcosmos
indicam que o comportamento magneto-aerotático dos OMMs pode, a princípio, evitar o
contato entre os OMMs e os ciliados, uma vez que eles estariam em diferentes locais no
sedimento. Porém prováveis mudanças no quimioclina dos microcosmos fazem com que os
OMMs migrem para as regiões superiores do sedimento. Com isso, estes poderiam ser
predados já que entram no mesmo ambiente dos protozoários. A diminuição do número de
OMMs conforme eles vão atingindo as camadas superiores do sedimento fortalece essa idéia.
É razoável imaginar que esta situação de mudança na localização do quimioclina possa
ocorrer no ambiente e possa ser um ameaça em potencial aos OMMs. Logo, sugerimos que as
principais características do OMMs, que incluem o momento magnético otimizado para
magnetotaxia, organização multicellular, alta velocidade de nado e o sofisticado mecanismo
86
da reprodução são uma conseqüência de uma pressão evolutiva para evitar a predação por
protozoário, particularmente nanoflagelados.
Digestão dos magnetossomos e impacto no ambiente
O processo digestivo é bem estudado em ciliados que possuem uma alimentação
baseada na filtração (filter feeder), particularmente no Paramecium e no Tetrahymena
(RAMOINO et al., 1996). Após a formação do vacúolo digestivo, seu conteúdo é levemente
acidificado. Posteriormente, uma maior acidificação ocorre com a fusão dos lisossomos. O
material digerido que não é absorvido é então exocitado através do citoprocto (ALLEN &
WOLF, 1974, 1979). Observamos que os magnetossomos foram parcialmente dissolvidos
provavelmente pelo ambiente ácido do vacúolo digestivo. Não sabemos o impacto da digestão
dos magnetossomos pelos ciliados no ambiente. Está claro, entretanto, que dependendo da
taxa do consumo dos OMMs pelos ciliados parte do ferro imobilizado dentro dos
magnetossomos é reciclado ao ambiente em uma forma mais solúvel. Por outro lado, este
consumo é provavelmente baixo porque os OMMs e os ciliados co-existem em diferentes
camadas do sedimento. No entanto, nossos resultados são a primeira evidência de que a
contribuição dos magnetofósseis à magnetização dos sedimentos após a morte das bactérias
magnetotáticas pode ser superestimada (CHANG & KIRSCHVINK, 1989), já que os
magnetossomos podem ser dissolvidos pela digestão dos protozoários.
REGULAÇÃO DA POPULAÇÃO DOS OMMS
O tamanho de uma população no ambiente é determinada pelo balanço entre seu
crescimento e sua taxa de mortalidade, isso é válido também para as bactérias
(PERNTHALER, 2005). Existem dois mecanismos de controle da população microbiana nos
ambientes: top-down control, no qual a abundância de uma população é, principalmente,
87
determinada pela mortalidade devido a predação; e bottom-up control, no qual a abundância
da população é determinada pela falta de recursos e a mortalidade é devido a estarvação
(PERNTHALER, 2005). Não existe consenso sobre qual dos dois tipos de controle tem mais
influência sobre a população microbiana. Uma das hipóteses é que o tipo de controle
predominante em um ambiente estaria relacionado com a produtividade do ecossistema.
Modelos teóricos e observações diretas em diferentes ecossistemas têm demonstrado que em
ambientes oligotróficos o controle da população microbiana seria conferido pela predação,
enquanto que em ambientes eutróficos o controle seria pela limitação de nutrientes (GASOL,
PEDRÓS-ALIÓ & VAQUÉ, 2002). Apesar dessa hipótese pode não parecer intuitiva, ela tem
explicações no contexto da cadeia alimentar como um todo. Em ambientes oligotróficos, os
protistas bacterívoros são controlados somente pela limitação da presas (bactérias). Já os
ambientes eutrofizados podem sustentar uma comunidade de predadores superiores muito rica
(grandes protistas, zooplancton e larvas de peixes), estes predadores superiores controlariam
(através da predação) a população de bacterívoros, liberando então os procariotos do controle
pela predação (PERNTHALER, 2005). A lagoa de Araruama tem passado por mudanças no
seu estado trófico nos últimos anos. Originalmente era um ecossistema oligotrófico e na
década de 90 houve uma transição para um ecossistema mesotrófico (SOUZA et al., 2003).
Hoje em dia, com o enorme aporte de esgoto recebido, a lagoa de Araruama provavelmente
está mais próxima de um ecossistema eutrófico, principalmente nas regiões urbanizadas.
Apesar de neste trabalho não termos analisado muitos fatores abióticos, aparentemente a
população dos OMMs tem um controle populacional mais fortemente regulado pela
disponibilidade de nutrientes (bottom-up control), como o esperado para ambientes
eutrofizados. Os mecanismos de escape da predação apresentados pelos OMMs parecem
diminuir a importância do tipo de regulação top-down nesta população. Porém, para
determinarmos o grau de regulação da população dos OMMs pela predação é necessária a
88
realização de contagens simultâneas da abundância dos protistas e dos OMMs no ambiente.
89
Conclusões
Os resultados obtidos neste trabalho ampliam significativamente os conhecimentos a
respeito da ecologia dos OMMs, microrganismos com características tão singulares. Baseado
nas nossas observações e comparando com os dados já existentes na literatura, podemos
concluir:
a) A salinidade é um importante fator na determinação da presença dos OMMs nos
ambientes, porém outros fatores abióticos também regulam a densidade destes
microrganismos no ambiente. Estudos mais aprofundados com relação às outras
características biogeoquímicas do ambiente seriam necessários para mapear outros
parâmetros abióticos que possam regular essa população no ambiente estudado.
b) Os OMMs estão amplamente distribuídos em ambientes de moderadamente
hipersalinos a salobros e são filogeneticamente relacionados.
c) Os OMMs são microrganismos levemente halofílicos e anaeróbios.
d) A organização multicelular dos OMMs, alta velocidade de nado e o seu ciclo de vida
incomum podem estar relacionados a uma forma dos OMMs evitarem a predação no
ambiente.
e) Os OMMs quando predados têm seus magnetossomos dissolvidos pelo vacúolo do
ciliado e, conseqüentemente, o ferro pode voltar ao ambiente de uma forma solúvel.
f) Provavelmente a população dos OMMs é regulada pela distribuição de nutrientes.
90
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