UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLAROunesp

Aula Prática 5: Contagem de células de leveduras em câmara de Neubauer

Uma das formas mais comuns de se determinar a viabilidade de células de levedura é através do uso da câmara de Neubauer, também conhecida como hemacitômetro.

A câmara de Neubauer consiste de uma lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâmina normal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se ao microscópio, percebe-se que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, que juntos formam um quadrado maior.

Pode-se notar que estes quadrantes têm sub-divisões diferentes, fazendo com que o critério para escolha do quadrante onde serão contados as células, seja o tamanho dos células a serem quantificados. Assim, usualmente, células muito pequenas são contados no quadrante C, as de tamanho intermediário no quadrante B, enquanto células grandes são contados no quadrante A. A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C) são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamínula (especial para ser usada na câmara de Neubauer) a distância da lamínula até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante.

A técnica de coloração consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra), adequadamente diluída, e da solução corante (azul de metileno ou eritrosina). As células com alta atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-ão coloridas de azul (azul de metileno) ou rosa (eritrosina). A porcentagem ou o número de células viáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a câmara de Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1 mm2 de área;

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a lâmina é coberta com uma lamínula,que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3 .

0.1 mm3 – 0.0001 cm3 – 0.0001 mL ou 10-4 mL

Procedimento1- Transferir 1 mL para um tubo de ensaio e adicionar 1 mL da solução de eritrosina.3- Agitar a mistura.4- Colocar a lamínula na Câmara de Neubauer e com auxílio da pipeta Pasteur,coleta-se uma pequena alíquota da suspensão preparada e deposita-se em um dos canais laterais ao campo central, a amostra, até que todos os canais interligados estejam completos. 5- Levar ao microscópio óptico e com a objetiva de 40X, fazer a contagem das células nos campos : 6- Escolher o quadrante que irá contar as células.6- Marcar o número de células viáveis (células que não se colorem com eritrosina) e células inviáveis (rosa).

Como proceder a contagem: Regras de contagem:

1) Conte as células usando o quadrado grande do centro.2) Conte as células dos quadrados médios e as células que estiverem tocando as linhas

superiores e as linhas à direita.3) Conte cerca de 200 à 250 células antes de determinar o número/cm3

No quadrante C - contar o número de células em 5 sub-quadrantes (c) de C, os 4 dos cantos e o sub-quadrante central.

Exemplo: 210 células em 5 quadrados médios (cada um medindo 0,2 x 0,2 mm). Quantas células há por cm3?210/5 = 42 células/quadrado médio42 x 25 = 1050 em 0,1 mm3

1050 x 104 = 10.500.000 ou 1,05 x 107 cels/cm3

% de viabilidade= (células vivas x 100)/ (células vivas + células mortas)

% de brotamento = (brotos x 100)/ (vivas+mortas)

% de viabilidade dos brotos = (brotos x 100)/ (brotos vivos + brotos mortos)