(21) BR 1 O 2012 019095-8 A2 111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 * B R 1 O 2 O 1 2 O 1 9 O 9 5 A 2 *

Repúhfit.8: Fed~rntiV8: Üi'J Btt-JSti t'-,.1:-;•:G:<•::•:i {;l, :J~~G-t-.:•'l<:•::-'\.·i:.;,~X•l(•. t•;:I'~~·:.:';;-::

(22) Data de Depósito: 31/07/2012

(43) Data da Publicação: 13/01 /2015 (RPI 2297)

(54) Título: COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­ACILIDRAZONAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZINA-N­ACILIDRAZONAS PARA TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE E DOENÇA DE CHAGAS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS OBTIDAS

(51) lnt.CI.: C07D309/38; C07D307/76; C07D317/64; C07C281 /14; A61 K31 /165; A61 K31 /175; A61 K31 /345; A61 K31/36; A61 P33/02

(73) Titular(es): Universidade Federal de Alagoas, Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

(72) lnventor(es): Aline Cavalcante de Queiroz, Amilcar Tanuri, Eliezer Jesus de Lacerda Barreiros, Hugo Eduardo Cerecetto Meyer, Magda Susana Alexandre Moreira, Maria Mercedes González Hormaizteguy, Marina Amaral Alves

Outros Medicamentos

1.535

(57) Resumo: COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­ACILIDRAZONAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZINA-N-ACILIDRAZONAS PARA TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE E DOENÇA DE CHAGAS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS OBTIDAS. Particularmente descreve a obtenção de inibidores de cisteína proteinases envolvidas nos processos infecciosos causados pelos parasitas trypanossoma cruzi e leishmania sp. Ou seja, a invenção trata do planejamento da série de compostos hidrazida-N­acidrazonas com o objetivo de gerar um princípio ativo para composições farmacêuticas voltadas ao tratamento de leishmaniose e doenças de chagas;oplanejamentodasériedederivadoshidrazida-N­acilidrazona funcionalizados (série Ili e IV) é realizado madiante hibridação molecular entre os protótipos LASSBio-1111 (leishmanicida) e LASSBio-1064 (tripanomicida) mediante hibridação da subunidade aril­hidrazida de LASSBio-1111 com a acilidrazona funcionalizada de LASSBio-1064, Obtendo-se um novo padrão molecular que conjugando as propriedades leishmanicida e tripanomicida.

18 Doenças Tropicais

1,3%

1/75

COMPOSTOS HIDRAZIDARN-ACILIDRAZONAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE

COMPOSTOS HIDRAZIDA-NRACILIDRAZONAS, USO DE COMPOSTOS A

PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS PARA TRATAMENTO DE

LEISHMANIOSE E DOENÇA DE CHAGAS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

s OBTIDAS

10

DESCRIÇÃO RESUMIDA

A presente solicitação de patente de invenção descreve a obtenção de inibidores de

cisteína proteinases envolvidas nos processos infecciosos causados pelos parasitas

Trypanossoma cruzi e Leishmania sp.

INTRODUÇÃO

A introdução tem por pretensão apresentar o escopo principal da invenção. Uma vez

que a invenção se desdobra em aplicações terapêuticas para dois tipos de

parasitose e, ainda, no desenvolvimento de novos compostos com atividade

1s específica, serão dedicadas subseções para cada um dos temas aqui sublinhados.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Doença de Chagas e Leishmaniose:

Cerca de três mil pessoas diariamente morrem no mundo vítimas de doenças

20 negligenciadas como leishmaniose, doença de Chagas, malária, e doença do sono.

São mais de 1 milhão de mortes por ano, de acordo com dados da FINEP. Esse

número elevado de óbitos é reflexo da precariedade no diagnóstico e tratamento

destas doenças. Os mais afetados por essa negligência são as populações mais

empobrecidas dos países menos desenvolvidos, e, portanto, não constituindo um

2s mercado lucrativo para as indústrias farmacêuticas. Apenas 1,3% dos medicamentos

2175

disponibilizados entre 1975 e 2004 foram para as doenças negligenciadas, o que

representa 21 medicamentos, apesar de representarem 12% da carga global de

doenças.

O Gráfico 1 representa o Percentual de medicamentos desenvolvidos entre 1975 e

5 2004.

De acordo com estudos realizados pelo Instituto George para Saúde Internacional,

os investimentos de instituições privadas na área de doenças negligenciadas

correspondem a apenas 5% dos recursos globais para pesquisa e desenvolvimento

(P&D), sobrando para as instituições filantrópicas (54%), e públicas (41%), que não

10 conseguem, na maioria das vezes, dar sustentabilidade a esses investimentos ao

longo dos anos.

No Brasil, em torno de R$ 75 milhões ao ano vem sendo gasto com incentivos

governamentais para P&D em doenças negligenciadas, devido aos incentivos feitos

pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, por meio de suas duas principais agências

15 de fomento: o CNPq e a FINEP. Em 2008, elas investiram mais de R$ 25 milhões

em projetos de P&D para as doenças negligenciadas.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, teve

como seu descobridor o pesquisador brasileiro Carlos Chagas. É uma doença

parasitária causada pela infecção do protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi,

20 cujos insetos triatomíneos são seus vetores. As formas mais importantes de

transmissão da doença de Chagas ainda são as vetoriais, que são aquelas ligadas

diretamente ao vetor, à transfusão de sangue, à via congênita, e mais recentemente,

as que ocorrem via oral, pela ingestão de alimentos contaminados, pela picada na

mucosa ocular ou oral, contudo apresentam também importância epidemiológica a

25 transmissão transfusional e congênita.

3/75

Dados da OMS indicam a existência de 16-18 milhões de infectados pelo T. cruzi,

dentre eles, 12-14 milhões de indivíduos na América Latina, sendo ainda

encontrados indivíduos contaminados em países da Europa e América do Norte, na

maioria das vezes resultante da migração de indivíduos infectados em busca de

5 melhores condições de vida.

Entre as mais de 120 espécies de insetos vetores, 12 espécies da subfamília

Triatominae, são as mais importantes para a infecção humana, devido a sua

capacidade de invasão e procriação dentro das casas.

O diagnóstico, tanto na fase aguda quanto nas formas crônicas da doença de

10 Chagas, é realizado pela detecção do parasito por métodos parasitológicos (diretos

ou indiretos) e pela presença de anticorpos no soro, através de testes sorológicos

sendo os mais utilizados a imunofluorescência indireta (IFI), hemaglutinação (HAI) e

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Poderão ser realizados também

testes moleculares, utilizando polymerase chain reaction (PCR) acoplado à

15 hibridização com sondas moleculares, e o Western blot (WB), como teste

confirmatório tanto na fase aguda como nas formas crônicas da doença. Após a

infecção, a maioria dos indivíduos apresenta fase aguda assintomática. Pacientes

desenvolvem formas sintomáticas da fase crônica da doença anos, ou mesmo

décadas, após a fase aguda da infecção em aproximadamente 40% dos pacientes.

20 O caso crônico pode permanecer assintomático durante dez a vinte anos. No

entanto, neste período, o parasita está se reproduzindo continuamente em baixos

números, causando danos irreversíveis em orgãos como o sistema nervoso e o

coração. Ja o fígado, por ser capaz de se regenerar, os problemas são raros. As

conseguencias poderão ser observadas após uma ou duas décadas de progressão,

25 com aparecimento gradual de demência (3% dos casos iniciais), cardiomiopatia (em

4175

30% dos casos), ou dilatação do trato digestivo (megaesófago ou megacólon (6%),

devido à destruição da inervação e das células musculares destes orgãos,

responsável pelo seu tónus muscular. No cérebro há frequentemente formação de

granulomas. Neste estágio a doença é frequentemente fatal, mesmo com

s tratamento, geralmente devido à cardiomiopatia (insuficiência cardíaca). No entanto

o tratamento pode aumentar a esperança e qualidade de vida.

1 - Doença de Chagas

A doença de Chagas constitui-se pela sua vasta distribuição, altos índices de

10 prevalência e gravidade de evolução, um dos maiores problemas de Saúde Pública

em países do cone sul das Américas (DIAS, 2001; REY, 2001). A tripanossomíase

americana, denominada doença de Chagas, é uma importante doença parasitária

resultante da infecção pelo protozoário parasito hemoflagelado. As formas mais

importantes de transmissão da doença de Chagas ainda são as vetoriais (seja via

15 lesão resultante da picada, seja por mucosa ocular ou oral), contudo apresentam

também importância epidemiológica a transmissão transfusional e congênita

(MINISTÉRIO DA SAÜDE, 2008). A doença é uma zoonose endêmica em 21 países,

com estimativa de 16 a 18 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi.

A etapa mais importante de transmissão do T. cruzi é efetuada por insetos da família

20 Reduviidae, incluindo as espécies Panstrongylus megistus, Triatoma infestans e

Rhodnius prolixus. No Brasil, o transmissor T. infestans é conhecido vulgarmente

como "barbeiro".

O ciclo de vida do T. cruzi compreende três estágios ou formas principais, dotadas

de características morfológicas e biológicas distintas: epimastigota (encontrada no

25 tubo digestivo do vetor), tripomastigota (encontrada no vetor e no sangue e espaço

5175

intercelular do hospedeiro vertebrado) e amastigota (encontrada no interior de

células do hospedeiro vertebrado) definidas com base na forma geral da célula

(esférica, piriforme, alongada), na posição relativa entre o núcleo e o cinetoplasto

(anterior, lateral e posterior) e na maneira da saída do flagelo da bolsa flagelar

s (central ou lateral) (SOUZA, 1999).

O ciclo biológico do T. cruzi no hospedeiro invertebrado inicia-se quando o sangue

de animais infectados é ingerido durante o repasto sanguíneo. Ao chegar ao

estômago, a forma tripomastigota transforma-se gradualmente em formas

arredondadas, algumas com um longo flagelo colado ao corpo e outras com um

10 curto flagelo, chamadas de esferomastigotas e epimastigotas respectivamente.

Em seguida, os parasitas migram para o intestino, onde se multiplicam como formas

epimastigotas. Após, migram para a parte mais posterior, atingindo o reto, e

transformam-se em tripomastigotas metacíclicos, que são eliminados junto com as

fezes e urina do triatomíneo (SOUZA, 1999). A infecção pelo T. cruzi no hospedeiro

1s vertebrado inicia-se quando os parasitas eliminados pelo inseto na forma

tripomastigota metacíclico, são inoculados na pele ou mucosas do vertebrado. A

maneira mais comum é a vetorial, através da picada do barbeiro, que, durante o

processo de ingestão do sangue, deposita suas fezes próximas ao local da picada

(SOUZA, 1999).

20 A doença de Chagas pode se manifestar de forma aguda, indeterminada e crônica.

Os primeiros sintomas da fase aguda se apresentam, geralmente, entre 7 a 1 O dias

após a infecção pelo parasita. No local de entrada do parasita ocorre um processo

inflamatório, nem sempre visível. No entanto, em infecções pela mucosa ocular,

observa-se um sinal característico da fase aguda da doença de Chagas,

6175

denominado sinal de Romanã que consiste no inchaço de ambas as pálpebras do

olho infectado (NEVES, 2002).

A fase aguda da doença pode durar de um mês a um ano, podendo o paciente

evoluir para a fase crônica ou indeterminada. A fase indeterminada trata-se de uma

s fase crônica com baixa parasitemia e alto teor de anticorpos, assintomática e sem

manifestações clínicas. Após a fase aguda, a maioria dos pacientes evolui durante

uma ou duas décadas nesta forma indeterminada, na qual, embora exista a infecção

ativa, praticamente não há lesões clinicamente demonstráveis e os órgãos e

sistemas se encontram preservados em sua anatomia e sua reserva funcional

10 (DIAS, 2001 ). Cerca de um terço dos casos agudos da doença de Chagas evolui

para a fase crônica. A fase crônica da doença em alguns casos segue

imediatamente o período agudo; em outros, instala-se depois de um intervalo

assintomático de duração variável (REY, 2001; BLACK, 2002).

A forma crônica da doença de Chagas é representada por diversas formas clínicas,

15 afetando um ou mais órgãos de forma irreversível, destacando-se as alterações

cardíacas como as principais. A cardiopatia crônica e o aparecimento dos megas,

megaesôfago e megacólon, principalmente, representam formas clínicas de

considerável gravidade (SZAJNMAN et ai., 2000; CAZZULO et al., 2001;

MONCAYO, 2003).

20 A prevalência das manifestações digestivas ou cardíacas na doença de Chagas

depende principalmente da região endêmica. É comum encontrar casos de

megaesôfago na região central do Brasil, sendo essa manifestação rara em outras

áreas. A forma cardíaca apresenta como principais sintomas a arritmia (75.000

casos/ano), a insuficiência cardíaca e o tromboembolismo. As manifestações

25 digestivas ocorrem pelo comprometimento das funções do órgão afetado. No caso

7175

do megaesôfago (45.000 casos/ano), observa-se o aumento do diâmetro do órgão e

alterações na motilidade, além de sintomas como dores epigástricas, regurgitação e

hipertrofia das glândulas salivares. O megacólon (30.000 casos/ano) apresenta

como principal característica a obstipação do órgão, que pode durar semanas

s (WENDEL et ai., 1992; MONCAYO, 2003).

2 - Leishmaniose

As leishmanioses são antropozoonoses consideradas um grande problema de saúde

pública, representam um complexo de doenças com importante espectro clinico e

10 diversidade epidemiológica.

Observa-se a existencia de tres perfis epidemiologicos: a) Silvestre - em que ocorre

a transmissão em áreas de vegetação primária (zoonose de animais silvestres); b)

Ocupacional ou lazer - em que a transmissão está associada a exploração

desordenada da floresta e derrubada de matas para construção de estradas,

15 extração de madeira, desenvolvimento de atividades agropecuárias, ecoturismo;

(antropozoonose) e e) Rural ou periurbana - em áreas de colonização (zoonose de

matas residuais) ou periurbana, em que houve adaptação do vetor ao peridomicilio

(zoonose de matas residuais e/ou antropozoonose).

Protozoários do gênero Leishmania apresentam duas formas durante o seu ciclo

20 evolutivo, as amastigotas que não possuem flagelo livre e são parasitas

intracelulares obrigatórios preferencialmente do sistema fagocítico mononuclear de

hospedeiros vertebrados, onde se dividem por divisão binária simples e nas formas

flageladas promastigotas que são encontradas no trato digestivo dos hospedeiros

invertebrados.

8/75

As formas promastigotas possuem o cinetoplasto anteriormente à porção livre do

flagelo, que tem o mesmo comprimento do corpo. Outras organelas peculiares em

tripanossomatídeos são os glicosomas e os megasomas, que são encontradas em

ambas as formas. Os glicosomas compartimentalizam as enzimas da via glicolítica,

s enquanto que em eucariotos normalmente estão localizados no citoplasma. Os

megasomas são corpúsculos arredondados com pH ácido onde estão localizadas,

dentre outras enzimas, as cisteíno-proteinases e são abundantes nas formas

amastigotas. Estes parasitas pertencem à ordem Kinetoplastida, família

Trypanosomatidae e gênero Leishmania.

10 As Leishmanias diferem nos padrões de desenvolvimento nos hospedeiros

invertebrados naturais, o que foi usado de base para a revisão proposta por Lainson

e Shaw, permitindo a divisão do gênero Leishmania em dois grupos: o subgênero

Viannia e o subgênero Leishmania. As principais espécies do subgênero Viannia

estão distribuídas apenas no Novo Mundo e são L. braziliensis, L. guyanensis, L.

15 panamensis, L. peruviana, L. naiffi, L. lainsoni, L. shawi, L. colombiensis, L.

eq uatorensis.

As espécies do subgênero Leishmania distrubuídas no Novo Mundo são L.

amazonensis, L. mexicana, L. chagasi L. venezuelensis, L. pifanoi, L. hertigi, L.

enriettii, L. deanei, L. aristidei, L. garnhami, L. forattiniii, e as espécies do Velho

20 Mundo são L. donovani, L. tropica, L. infantum, L. major, L. aethiopica, L. arabica e

L. turanica.

A diferenciação entre as várias espécies de Leishmania dentro de um subgênero

inclui a morfologia na microscopia ótica e eletrônica, o comportamento nos

hospedeiros, a identificação tanto por anticorpos monoclonais como por isoenzimas

25 e a análise de DNA. Os hospedeiros invertebrados parecem estar limitados

9175

estritamente a insetos hematófagos. Os dípteros do gênero Lutzomya são os vetores

de transmissão de Leishmanias nas Américas e os dípteros do gênero Phlebotomus

estão envolvidos com a transmissão no Velho Mundo. Mais de 20 espécies de

Leishmania têm sido identificadas como causadoras de doenças em humanos e

5 cada uma apresenta fontes de infecção específicas.

A infecção do hospedeiro invertebrado ocorre quando a fêmea do vetor pica um

vertebrado infectado durante o repasto sanguíneo e, juntamente com o sangue,

ingere macrófagos parasitados. Durante o trajeto pelo trato digestivo, os macrófagos

se rompem liberando as amastigotas que se transformam em promastigotas,

10 multiplicam-se ainda no sangue ingerido que é envolto pela membrana peritrófica

secretada pelas células do estômago do inseto. Após a digestão do sangue, a

membrana peritrófica se rompe e as formas promastigotas ficam livres, dividem-se

intensamente e transformam-se em promastigotas metacíclicas sem a capacidade

de divisão binária, migrando então para a probóscida do inseto. Com a probóscida

15 bloqueada pelas Leishmanias, o inseto tem dificuldade de se alimentar e, quando

pica, regurgita os parasitas para o interior da pele do hospedeiro vertebrado,

inoculando-os no local da picada, ocorrendo assim a transmissão. Os flagelados

inoculados são fagocitados por macrófagos teciduais do hospedeiro formando,

assim, o vacúolo parasitóforo. Rapidamente os promastigotas diferenciam-se em

20 amastigotas e multiplicam-se no interior destes vacúolos, até que o macrófago se

rompe, liberando amastigotas no tecido, sendo novamente fagocitadas, iniciando no

local um novo ciclo intracelular e causando, assim, as leishmanioses.

Os parasitas do gênero Leishmania determinam doenças do sistema fagocítico

mononuclear que apresentam características clínicas e epidemiológicas diversas,

25 por isso foram reunidas em quatro grupos (Tabela 1):

10/75

Tabela 1

Leishmaníase Tegumentar Americana Leíshmaníase Visceral

Cutânea Cutâneo-mucosa Cutâneowdífusa Americana

ComplexoBraziliensis ComplexoBrazlfiensis Complexomexicana ComplexoDonovan

L {V) braziliensis :1: L {V) brazlliensis.t: L (L) mexicana L (L) chagasi'r

L {V) pemviana L (L) pifanoí L {L) donovam·

L (V.) guyanensis.t: L L (L) infantum {L)amazonensis.t:

L {V) panamensis

Complexo.Mexicana

L. (L) mexicana

L (L) pifanoi

L (L) amazonensis z

L. (L.) wmezuelensts

-

• Leishmaníase cutânea - produz exclusivamente lesões cutâneas limitadas.

• Leishmaníase cutâneo-mucosa - freqüentemente se complicam pelo

aparecimento de lesões destrutivas em algumas mucosas.

5 • Leishmaníase visceral ou Calazar - o parasito tem tropismo pelo sistema

fagocítico mononuclear de órgãos como o fígado, o baço e a medula, que se tornam

hipertrofiados.

• Leishmaníase cutânea difusa - formas cutâneas disseminadas.

Os antimoniais pentavalentes (Sb5+) têm sido utilizados no tratamento das

10 leishmanioses humanas desde o início do século XX e continuam sendo as drogas

de escolha para a doença cutânea e visceral. Em 1937, o estibogluconato de sódio

(A, Pentostan®, um derivado do ácido estibônico complexado ao Sb5+) foi utilizado,

também por via intramuscular, reduzindo os efeitos colaterais e a toxicidade e no

11/75

Brasil, atualmente, o fármaco utilizado é o antimoniato de meglumina {B,

Glucantime®). O mecanismo de ação destes compostos é a inibição das enzimas da

via glicolítica e da j3-oxidação em amastigotas, mas sendo um metal pesado,

acredita-se que interfira em outras vias metabólicas da Leishmania, bem como com

s a do hospedeiro. Também foi observado que são capazes de inibir a topoisomerase

li de L. panamensis e de L. donovani.

Além das dificuldades de administração e do alto custo, os antimoniais

pentavalentes apresentam importantes efeitos colaterais que incluem mialgia,

artra!gia, aumento sérico das enzimas hepáticas, pancreatite, disfunção

10 gastrintestinal, dores musculares difusas, enrijecimento das articulações, arritmias,

pancitopenia, insuficiência renal reversível e cardiotoxicidade. A cura clínica não é

acompanhada de cura parasitológica, pois têm sido observados parasitas na cicatriz

de indivíduos clinicamente curados após tratamento. A anfotericina B, a

pentamidina, o miltefosine e a paramomicina têm sido as drogas alternativas nos

15 casos de resistência aos antimoniais, mas não possuem um índice terapêutico tão

favorável e também apresentam importantes reações adversas. A tabela 2 resume

as opções terapêuticas supra mencionadas.

Pcntíwafcnt antimony lntralcional íor CL"1

Parcnt~ralt'"1 •11 · ~"

ParOrllMlYCin Topk;ilfor CL

ParcntcralforVLm Miltcfainctic..i !>

A mphotericln a forVL''~')(

12/75

R$tionsin paticrÍÜ 'iYith . . Commentst ~oovs or vlswal le~nb$1$

P.:in, etytrema, oe:l(!ma Raised arrtf lasc/lip.l~ OI' lJT S

M~algias a<td anhnlgias AbdomíM pain, nwsea Thombocytopeni;i or lcuc·;)pct'lfa

E<G cha1193 orc;udiotoxitity

Ototoxkft1t

N~vse:a, ~miting ~ od/or diarrhoea R~<rc~tioine

Raised lf1s

Naus.ea, vomiting Ofdiarrll:>ea 1-l)~rg~c~em ia Card iot cr.d.:ity

lnfusion.rdatedS Azotae:mi<S Anae:mia e< hjpok.ikvimía)

F~nt. t-ansícnt Vruyfrequent. Panaeatitis oftcn <!S)'mptonutk Fr!::1uent. Mild-mo:itrate frc~uem.1\Hld-mo:lerate

lnfiequent.Mild dc.::reascs lnf~tMild in O:L, mi!dto ~re(~en faul} inVL

!n fiequent, transient. R<.'.act ons vary by forrn1Jlatiot1 lnfre.qvcot.Nf:phrotO);idr;; notobservedt

Fre:t\.lcnt. ls.ua lly mild and :iansien: Fre;iuent Mild íncr~ Ü, infrcqu~nt; Vt, fr«jUMtMifd ln:reascs

Very freq umt lnf1cqucnt.Can be severe inVL lnf1cquent Can be: severc in VL

Véry rreq U<?nt

Fre:iuent lnf1c:qucnt

Adaptado de Lainson; Shaw, 1987; Mazorchi, 1989.

3. Tratamento da doença de Chagas/Leishmaniose e Desenvolvimento de

novas drogas

s Drogas para o tratamento da doença de Chagas não são do interesse de indústrias

farmacêuticas, estando na raiz do problema o alto custo dos investimentos e a falta

de um mercado potencial e seguro nos países em desenvolvimento. De um modo

geral, o desenvolvimento de uma quimioterapia antiparasitária ocorre (i) pelo

estabelecimento de princípios ativos de plantas utilizadas na medicina popular, (ii)

10 pela investigação de drogas já aprovadas para o tratamento de outras doenças, uma

vez que elas já foram submetidas a ensaios clínicos muito dispendiosos, ou, (iii)

13175

através da determinação de alvo(s) específico(s) identificado(s) em vias metabólicas

chave para o parasito.

Estudos recentes têm permitido a identificação de alvos potenciais em T. cruzi e que

incluem o metabolismo de esteróis, o DNA e diferentes enzimas.

5 Nifurtimox e benznidazol foram introduzidos na clínica no tratamento da doença de

Chagas nas décadas de 60-70, mas atualmente somente o benznidazol se encontra

disponíveis comercialmente no Brasil, apesar de apresentar sérios efeitos colaterais

e requererem administração por longos períodos de tempo sob supervisão médica.

Nas formas visceral e mucocutânea de leishmaniose, o tratamento medicamentoso é

10 indicado principalmente nos casos de lesões incapacitantes ou desfigurantes.

Existem vários esquemas terapêuticos baseados de forma geral em Antimônios,

Anfotericina B, Paromomicina, lmunoterapia e Pentamida. Cetoconazol e

ltraconazol, entre outros, também são usados.

3.1 Resposta imune nas infecções causadas por protozoários.

15 Os protozoários são agentes infecciosos intracelulares que habitualmente infectam o

hospedeiro por longo período de tempo, em virtude de possuir mecanismos que lhes

permitem escapar das agressões mediadas pelo sistema imune. Já foi observado

que as infecções causadas por protozoários não atingem toda a parcela da

população infectada, tendo o sistema imune um papel fundamental, impedindo a

20 multiplicação e a disseminação do vetor. A não ser que ocorra uma depressão

imune, onde seria desencadeado uma resposta imunológica, esses agentes podem

permanecer no hospedeiro por toda a vida.

Vários componentes da resposta imune inata podem participar do mecanismo de

defesa contra os protozoários, mas esses microorganismos escapam dessa defesa.

25 O Tripanosoma cruzi tem a propriedade de impedir ativação do complemento, desde

14/75

que se encubra com moléculas do hospedeiro como o fator acelerador da

degradação (DAF). Da mesma forma, as formas infectantes de Leishmania resistem

a sua ação do complemento, embora invitro as promastigotas de Leishmania sejam

altamente sensíveis ao complemento,. As leishmanias são também susceptíveis à

s ação de neutrófilos, células com grande potencial de produzir peróxido de hidrogênio

e NO, mas que, ao penetrar o hospedeiro, infectam os macrófagos, livrando-se do

ataque dos neutrófilos.

A resposta adaptativa contra os protozoários ocorre após a apresentação de

antígenos por macrófagos e células dendríticas, via MHC classe li para as células T.

10 Como outras células podem ser infectadas, e os macrófagos e células dendríticas

15

também expressam moléculas de MHC classe 1, nas infecções por protozoários há

também ativação das células TCD8+. A tabela 3 mostra os mecanismos

imunológicos de defesa contra alguns protozoários de importância clínica.

Tabela 3: Principais mecanismos de defesa contra protozoários.

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Células do SNC, alhos, rnúsculas, outro• SNC c•eib:~ eye.i.·. nws~.:le_.,._ r.Jlht:r.\'

Cy·tomxicity hrv CDS ceíJ~·? tU!tlwr.ti.fJ'n '?fnrt.tc·ri1plrages h~v CD4 celb: a1rd ."'10 pr•-üdut.11ion

Pr<><luçãa t.lo NO por macrófagos ativad<>s pda$ c<!lulas TCD4._ e TCD8+ J\:'O /H·oducrfon by nra.cr.opJiag.tNi acliv"t.ed by 'TCD4.J.. cuu.! TCDll+ c•edl.v

Cilotoxici.dade por co!ilulas TCD8+ e produçã<> de WN-y, TNF-o:e NO Cyu.tto.-d.ei~· by TCD.8- ~.,._,.n,., arid pn·Wv{:tlón t:J:( q( !F/\1

-

a!pha, TNF-afplw aml .VO

É fundamental a resposta imune celular na defesa contra infecções causadas por

protozoários. Embora uma resposta imune desviada para o pólo Th2 seja maléfica,

porque aumenta a susceptibilidade às infecções e permite a multiplicação e

15/75

disseminação do parasito, o conceito de que uma potente resposta Th1 seja

protetora deve ser visto com cautela. Em várias protozooses, é verificado que a

resposta imune exacerbada está envolvida no dano tecidual: na doença de Chagas

é mediado por células CD4+ e CDS+; uma maciça produção de TNF-a e NO, é

s observada na patogenia da malária cerebral. Tais fatos confirmam que uma atuação

equilibrada do sistema imunológico é muito importante para a contenção do parasita

sem destruição tecidual, fazendo com que, embora possa continuar presente, o

agente infectante não cause doença no homem. A patogênese das diversas formas

clínicas da leishmaniose exemplifica bem a importância da resposta Th1 tanto no

10 controle como na gênese da lesão tecidual. Após a inoculação da Leishmania na

pele e invasão macrofágica, nos indivíduos que não têm a capacidade de produzir

IFN-y e ativar macrófagos, a Leishmania dissemina-se e, na dependência da

espécie, causa a leishmaniose visceral (L. chagasi) ou a leishmaniose cutânea

difusa (L amazonensis). Devido a deficiência de IFN-y e alta produção de IL-10

1s ocorre o desenvolvimento da doença. A restauração da resposta imune in vitro na

leishmaniose visceral pode ser observada pela neutralização de IL-1 O ou pela adição

de IL-12 às culturas de células mononucleares de sangue periférico (CMSP).

Já na leishmaniose cutânea e na leishmaniose mucosa, onde é observado um forte

desvio Th1 e, embora o número de parasitas no tecido seja escasso ou até ausente,

20 há desenvolvimento de lesão. CMSP de indivíduos com leishmaniose cutânea e

leishmaniose mucosa estimuladas com antígeno de Leishmania produzem grande

quantidade de IFN-y, IL-2 e TNF-a, e pouca IL-10. Como habitualmente o sistema

imune não consegue destruir completamente as leishmanias, essa forte resposta

Th1 termina por levar a ocorrência de uma reação inflamatória muito intensa e a

2s dano aos tecidos próprios, resultando no aparecimento de úlceras na pele e na

16175

mucosa. Tem participação importante nesse dano tecidual a produção acentuada de

TNF-a e de NO. Evidências de que a resposta imune celular participa da patogenia

da leishmaniose cutânea e leishmaniose mucosa inclui: 1) o tratamento precoce da

infecção não impede o aparecimento da lesão; 2) existência de forte reação

5 inflamatória no tecido com expressão aumentada de TNF-a, IFN-y e poucos

parasitas na lesão; 3) associação de antimonial com droga inibidora de TNF-a cura

pacientes com leishmaniose mucosa que são refratários ao tratamento com

antimonial.

3.2: Relação parasita-hospedeiro:

10 Os cinetoplastídeos distinguem-se dos outros grupos principalmente pela presença

de cinetoplastos, um grânulo que contém ADN, o "kDNA". Tal estrutura está

localizada na mitocôndria, que é única nesse grupo de organismos, e está associada

com a base dos flagelos.

Trypanosomatidae possui citosomas reduzidos ou ausentes, alimentando-se

15 inteiramente por absorção, e cinetoplastos menores que os de outras espécies.

Normalmente possui complexos ciclos de vida, que compreendem mais de um

hospedeiro e com várias etapas morfológicas. A mais distintiva destas, é a fase de

Tripomastigota, cujo flagelo se estende ao longo do comprimento da célula e

conecta-se a membrana celular, formando uma membrana ondulante. As doenças

20 causadas pelos Trypanosomatidae incluem a doença do sono e a doença de

Chagas, causadas por espécies de Trypanosoma, e a leishmaniose, por espécies de

Leishmania.

A seqüência completa do genoma dos cinetoplastídeos T.brucei, T. cruzi e L. major,

foram publicadas em 2005. Como protozoários, Leishmania e Trypanosoma têm

25 genomas relativamente grande de 25-55 Mb, a codificação para 8-12,000 genes. A

17/75

principal característica é que seus genomas possuem um nível excepcionalmente

elevado de conservação entre eles, apesar de uma divergência evolutiva estimado

2.500 anos atrás. Na verdade, Leishmania e Trypanosoma compartilham cerca de

80-93% de seus genes, e apenas um número limitado de genes são espécie-

s específicos. Isto é ainda mais notável quando se comparam as três espécies de

Leishmania, que compartilham mais de 99% de seus genes, de modo que apenas 5

genes são específicos para L. major, L. infantum para 27 e 49 L. brasiliensis.

3.3 O papel das peptidases na biologia do parasita e na patogênese

Todos os parasitas devem infectar seu hospedeiro (s) para sobreviver e se propagar,

10 e as peptidases são componentes essenciais nestes processos.

Historicamente, peptidases são citadas como proteases, e são profundamente

estudadas em parasitologia por várias décadas. Peptidases permitem que os

parasitas perfurem barreiras celular, tecidual e a degradação de proteínas do

hospedeiro para a alimentação. Também são usados para manipular o sistema

15 imune de o hospedeiro e iludir a resposta imune. Além disso, peptidases parasitais

estão envolvidas no processamento de proteína que fazem modificações

secundárias e são usados como marcadores de imunodiagnóstico de infecção.

Tripanossomas e Leishnania contêm uma abundância de cisteína proteinases (CPs)

que são membros da superfamília da papaína. As enzimas com maior atividade

20 foram designados Tipo 1 CPs. Uma característica que distingue enzimas do tipo 1 de

tripanossomatídeos a partir de outros CPs da superfamília da papaína, é a presença

de uma extensão terminal carboxi-incomuns, a função dos quais ainda é

desconhecida. Em Leishmania mexicana esses CPs Tipo 1 são codificadas pelos

genes RPB, e tem sua expressão máxima na forma amastigota do parasita que vive

25 nos macrófagos do hospedeiro.

18/75

As CPs do Trypanossoma cruzi são geralmente conhecido pelo nome comum (ou os

sinônimos cruzipaína e gp57/51) e são expressos em todo o ciclo de vida do

parasita, embora sejam mais abundantemente expressas na fase de multiplicação,

especialmente na epimastigota.

s Os inibidores da cruzipaína provocam mudança na localização da enzima dentro do

complexo de Golgi, reduzindo em 70% o transporte desta para os lisossomos. Com

a diminuição da catalise e digestão desta, há acúmulo de cruzipaína no interior da

célula, diminuindo a mobilidade das membranas do complexo de Golgi, resultando

em distensões periféricas de suas cisternas. Tais alterações provocariam a morte do

10 parasita.

Estudos indicam que a catepsina, uma outra cisteína-protease presente em

Leishmania sp teria importância similar ao da cruzipaína, no ciclo de vida do

parasita.

Portanto, inibidores de cisteína-proteases representam um alvo interessante para

15 concepção de drogas tripanomicidas e leishmanicidas.

4 - Cisteina protease

Proteinases formam um grupo de moléculas biológicas que constituem,

aproximadamente, 2% de todos os produtos de genes identificados nos diversos

programas de sequenciamento do genoma. Elas estão envolvidas numa enorme

20 gama de processos biológicos, mediante seus efeitos pela clivagem de pontes de

amino peptídeos em diversas proteínas encontradas na natureza.

Esta ação hidrolítica é realizada pela identificação e posterior ligação a uma

superfície tridimensional particular, produzida pela proteína, que alinha a ponte para

clivagem precisamente dentro do site catalítico da proteinase. A hidrólise catalítica

25 então se inicia através do ataque nucleofílico da ponte de amido para ser clivada

19/75

pela cadeia de aminoácidos da própria proteinase ou através de ação de moléculas

de água ligadas a cadeia de aminoácidos e ativada pela proteinase.

Proteinases em que o resíduo é um Cis são classificadas como cisteína proteinases.

As cisteína-proteinases não são encontradas tão amplamente como as serina- e as

s aspártico-proteinases. Entretanto, em protozoários da família Trypanosomatidae elas

são muito distribuídas, assim como as metaloproteinases, já tendo sido detectadas

em vários gêneros como Crithidia, Phytomonas, Herpetomonas, Trypanosoma,

Leishmania e Endotrypanum. Neste grupo de microrganismos, estas enzimas estão

envolvidas na nutrição, ciclo de vida e na diferenciação morfológica destes parasitas.

10 As cisteína proteínases são classificadas em cinco clãs: CA, CB, CC, CD e CE

(Barrett, A. J. et ai, 1998). A proteínase do mamão forma o clã CA que contém mais

de 80 entradas distintas em bancos de sequências genéticas. Proteinases do clã

CA, da família C1 estão relacionadas com uma multitude de patologias, tals como

osteoporose, esclerose múltipla, doenças autolmunes e câncer.

15 O estado da arte atual destaca o recente desenvolvimento de alguns inibidores de

cisteína proteinase para uso humano (Deaton, D. N. and Kumar, S., Prog. Med.

Chem. 42, 245-375, 2004; Bromme, D. and Kaleta, J., Curr. Pharm. Des., 8, 1639-

1658, 2002; Kim, W. and Kang, K., Expert Opin. Ther. Patents, 12(3), 419-432, 2002;

Leung-Toung, R. et ai. Curr. Med. Chem., 9, 979-1002, 2002; Lecaílle, F. et ai.,

20 Chem. Rev., 102, 4459-4488, 2002; Hernandez, A A. and Roush, W. R., Curr. Opin.

Chem. Biai., 6, 459-465, 2002).

Estes estudos descrevem atividade potencial in vitro, mas revelam diversas

dificuldades no desenvolvimento de terapias que possam ser utilizadas no

tratamento de doenças em humanos.

20175

As patentes WO-A-9850533 e WO-A-0029408 relatam componentes que podem ser

referenciados como cetonas cíclicas, inibidoras de cisteina proteinases, com

particular referência para a família das proteínases da papaína e mais

especificamente a catepsina K. Em WO-A-9850533 compostos detalhados na

s literatura como potentes inibidores de catepsina K, com boa biodisponibilidade por

administração oral são detalhados (Witherington, J., 'Tetrahydrofurans as Selective

Cathepsin K lnhibitors', RSC meeting, Burlington House, London, 1999). Os mesmos

compostos são descritos em WO-A-9953039 como parte de uma ampla gama de

inibidores de cisteína proteinases associados a doenças causadas por parasitas, em

10 particular ao tratamento da malária para inibição da falcipaína.

4.a T. cruzi

T. cruzi possui uma cisteína proteinase semelhante a L-catepsina denominada de

cruzipaína (ou cruzaína), que é a principal responsável pela atividade proteolítica em

todas as fases do ciclo evolutivo do parasito. Inibidores irreversíveis de cruzipaína

15 do tipo peptidil tais como diazometilcetonas, fluorometilcetonas, alilsulfonas,

vinilsulfonas e vinilsulfonamidas, foram investigados como potenciais agentes anti-T.

cruzi. Em epimastigotas, inibidores do tipo peptidil bloquearam a maturação de

cruzipaína e seu transporte para lisosomas, levando ao acúmulo da sua proteína

precursora no complexo de Golgi e à interferência na via de secreção. Utilizando N-

20 piperazinil-F-Ala-homoF-Ala-vinilsulfona-fenila, Engel e colaboradores observaram

um aumento no número de vesículas que se dirigem do Golgi para a bolsa flagelar

do parasito, interferindo na função do Golgi.

Tratamento de camundongos infectados com a peptidil vinilsulfona, N­

metilpiperazina-FhomoF-vinilsulfona-fenila, levou à redução da carga parasitária e

25 das lesões cardíacas. O mesmo composto foi utilizado em cães, sendo observada

21/75

uma regressão do dano do miocárdio induzido pela infecção por T. cruzi. Além disso,

outros inibidores de cruzipaína (não do tipo peptidil) que foram estudados incluem

acilhidrazidas, aril uréias, ariltiouréias e tiosemicarbazonas.

4.b Leishmania sp

s As cisteíno-proteases são as enzimas proteolíticas mais investigadas em

Leishmania e muitas delas possuem suas sequências depositadas em bancos de

dados e seus genes isolados. São enzimas que pertencem ao Clã A e superfamília

das proteases semelhantes à papaína. A papaína é uma cisteíno-protease com

cadeia polipeptídica única com 212 aminoácidos e três pontes de enxofre, isolada no

10 mamão papaya - Carica papaya. As cisteíno-proteases distribuem-se ainda em

entre a família C1 (semelhantes à papaína) e subfamílias das catepsinas L e B, e

também na família C2 (semelhantes às calpaínas). As cisteíno-proteases de

Leishmania ocorrem em grandes quantidades em volumosos lisossomas,

denominados de megassomas, particularmente abundantes em amastigotas. Estas

1s enzimas desempenham importantes funções na Leishmania como virulência,

manutenção da viabilidade e da morfologia do parasito, invasão do sistema

fagocítico mononuclear do hospedeiro e a modulação de sua resposta imune.

ESTADO DA TÉCNICA EM RELAÇÃO A PRESENTE INVENÇÃO

20 As pequisas revelaram a existência de estudos científicos e pedidos de patentes

relacionados ao assunto da invenção, particularmente ao estudo da semicarbozona

para os aplicativos aqui elencados, em especial em Doença de Chagas e

Leishmaniose sem, contudo, antecipar o uso de COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­

ACl LIDRAZONAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

25 ACILIDRAZONAS, USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-

22/75

ACILIDRAZONAS PARA TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE E DOENÇA DE

CHAGAS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS OBTIDAS. Dentre os vários

documentos e textos científicos encontrados, selecionam-se alguns:

- Patente Número: 20090203714.

s Título: Derivados de furo [3,2-b] pirrol-3-ona e a sua utilização como inibidores de

cisteínas proteinases:

Inclui uma formula (1), e seus sais farmacêuticos aceitáveis, onde: X é CH ou N; e

R.sup.4 é opcionalmente substituído por C.sub.3-8 alkyl ou opcionalmente

substituído por C.sub.3-8 cycloalkyl. A invenção ainda relata uma composição

10 farmacêutica compreendendo componentes da formula (1), e o uso do composto no

tratamento de doenças como osteoporose, doença de Chagas, alguns tipos de

câncer e outros. No entanto, não possui relevância de efeito anterioridade no

presente caso.

- Patente número: 20090197817/7,803,803

1s Título: Tetrahidrofuro [3,2-B] pirrol-3-ona como inibidores da catepsina K

Resumo: Inclui uma formula (1), e seus sais farmacêuticos aceitáveis, onde: X é CH

ou N; um dos R.sup.1 e R.sup.2 is H, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis

sup.6, SR.sup.6, NR.sup.6R.sup.7, N.sub.3, Me, Et, CF.sub.3, SOR.sup.8 e

SO.sub.2R.sup.8; R.sup.3 é selecionado entre tert-butylmethyl, iso-propylmethyl,

20 sec-butyl, tert-butyl, cyclopentyl e cyclohexyl; R.sup.4 é opcionalmente substituído

C.sub.1-8 alkyl ou opcionalmente substituído C.sub.3-8 cycloalkyl; R.sup.6 e

R.sup.7 independentemente selecionados entre H, C.sub.1-8-alkyl e C.sub.3-8-

cycloalkyl, ou R.sup.6 e R.sup.7 são ligados para formar um grupo cíclico em

conjunto com o nitrogênio com o qual estão ligados; e R.sup.8 é C.sub.1-8-alkyl ou

23175

C.sub.3-8-cycloalkyl. Este documento não apresenta relevância no estudo de

anterioridades.

- Título: Inibidores de cisteínas proteases e métodos de utilização dos mesmos.

Patente número: 20090076076/8, 173,696

s Resumo: A presente invenção refere-se à semicarbazona ou tiosemicarbazona

inibidores de cisteínas proteases e métodos de utilização de tais compostos para

prevenir e tratar infecções por protozoários tais como a malária tripanossomíase e

leishmaniose. Os compostos também encontram utilização em inibir cisteína

proteases associadas com carcinogénese, incluindo as catepsinas B e L. Não

10 apresenta relevância como anterioridade à presente invenção.

- Patente Número: 20050182121

Título: Tiosemicarbazona e semicarbozona inibidores de cisteína proteases e

métodos da sua utilização.

A presente invenção relaciona-se com a tiosemicarbazona e semicarbazona

1s inibidoras de cisteína proteases e métodos de utilização de tais compostos para

prevenir e tratar infecções por protozoários tais como a malária tripanossomíase e

leishmaniose. Os compostos também encontram utilização em inibir cisteína

proteases associadas com carcinogénese, incluindo as catepsinas B e L. Este

documento também se refere à semicarbozona e não apresente relevância na

20 presente invenção.

- Patente número: 7,495,023

Título: Tiosemicarbazona e semicarbozone inibidores de cisteína proteases e

métodos da sua utilização.

Resumo: A presente invenção relaciona-se com tiosemicarbazona e semicarbazona

25 inibidores de cisteína proteases e métodos de utilização de tais compostos para

24175

prevenir e tratar infecções por protozoários tais como a malária tripanossomíase e

leishmaniose. Os compostos também encontram utilização em inibir cisteína

proteases associadas com carcinogénese, incluindo as catepsinas B e L. Este

documento também se refere à semicarbozona e não apresente relevância na

s presente invenção.

- Patente número: 6,897,240

Título: Tiossemicarbazona e semicarbazona inibidores de cisteína proteases e

métodos da sua utilização.

Este documento se referese também à tiosemicarbazona e semicarbozona e não

10 apresenta relevância na presente invenção.

- Patente Número: 6, 194,421

Título: Inibidores de proteases de parasitas metazoários.

Resumo: As composições e métodos descritas são para o tratamento de um

paciente infectado por um parasita metazoário inibindo a ação enzimática da

15 protease do parasita metazoário, em que é empregue pelo menos um composto de

fórmula 1 em que A é um sistema substituído ou não substituído de anel

heteroaromático compreendendo 1-3 anéis que se liga a pelo menos um dos S2, S1

e 81 subsitios; B é um sistema de anel substituído ou não substituído

homoaromátlco compreendendo um a três anéis que se liga a pelo menos um do

20 81', S1 e 82 subsites; e X é - C = C--C (=.) -. Estas composições e métodos têm

utilidade particular no tratamento da malária, esquistossomóse e outras doenças

infecciosas. Este documento não impõe anterioridade à presente invenção, que

emprega como composição básica para a formulação medicamentosa HIDRAZIDA­

N-ACILIDRAZONAS.

2s - Patente número: 5,049,561

25175

Título: Anti-helmínticos acylhydrazonas, método de utilização e composições.

Resumo: Diz respeito a um processo para matar os parasitas internos,

especialmente nemátodos, trematódeos e cestódeos que afetam animais de sangue

quente, tais como ovelhas, gado, suínos, caprinos, cães, gatos, cavalos e seres

5 humanos, bem como de aves, por administração de uma quantidade eficaz de um

composto de Fórmula 1, sendo os compostos facilmente preparados por reacções

químicas convencionais. Este documento não impõe anterioridade à presente

invenção, que emprega como composição básica para a formulação medicamentosa

HIDRAZI DA-N-ACILI D RAZONAS.

10 - Patente número: PI06013419-0

Título: 2-ciano-pirimidinas e triazinas como inibidores de cisteína protease,

composição farmacêutica contendo as mesmas, processo para preparação dos

referidos compostos e usos relacionados.

Resumo: Refere-se a compostos da fórmula 1 e sais destes, a um processo para sua

15 manufatura, a seu uso no tratamento de doenças (especialmente cisteina protease,

tais como uch-13- e/ou usp-2 dependente), ou para a manufatura de formulações

farmacêuticas contra estas doenças; métodos de tratamento de animal de sangue

quente compreendendo administrar os compostos e/ou seus sais aos referidos

animais, e preparações farmacêuticas, especialmente para o tratamento das

20 doenças, compreendendo referidos compostos e/ou sais. Este documento não

impõe anterioridade à presente invenção, que emprega como composição básica

para a formulação medicamentosa HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS.

- Patente Número: Pl991438-5

Título: Novas composições e métodos para a prevenção e tratamento de doenças

25 de protozoários.

26175

Resumo: Trata de uma composição especialmente adaptada para administração

parenteral, por exemplo, intranasal, intramuscular, subcutânea, administração

transdérmica ou intravenosa, em que a composição é composta de, pelo menos, um

fármaco anti-protozoários em uma quantidade terapeuticamente eficaz para o

s tratamento ou prevenção de infecções por protozoários no homem e em animais.

Em uma forma de realização, a droga anti-protozoários é um agente de triazina-base

anticoccidiano, por exemplo, um triazinediona ou triazinetriona tais como diclazuril,

toltrazuril, sulfonotoltrazuril ou sais solúveis em água de sódio dos mesmos. Numa

forma de realização presentemente preferida, o agente de triazina-Base

10 anticoccidiano é sulfonototrazuril. Os métodos de tratamento de infecções

protozoárias no homem e animais são também fornecidos. Este documento não

impõe anterioridade à presente invenção, que emprega como composição básica

para a formulação medicamentosa HIDRAZIDAwN-ACILIDRAZONAS.

w Patente Número: W02007056464

15 Título: Compostos para Inibição de Enzimas.

Resumo: Compostos a base de peptídeos, incluindo heteroátomo que contém três

anéis membros eficientemente e seletivamente adotados para inibir as atividades

específicas de N-terminais nucleófilo (NTN) hidrolases associados com o

proteassoma. Os compostos com base em peptídeos incluem um epóxido ou

20 aziridina, e atuação no N-terminal. Entre outras utilidades terapêuticas, os

compostos com base em peptídeos são esperados para exibir propriedades anti­

inflamatórias e inibição da proliferação celular. A administração oral destes inibidores

a base de peptídios proteassoma é possível devido a seus perfis de

biodisponibilidade. Este documento não impõe anterioridade à presente invenção,

27/75

que emprega como composição básica para a formulação medicamentosa

HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS.

- Patente número: WO 1998010779

Título: Método para tratar doenças parasitárias com inibidores de proteassoma.

s Resumo: Revelando métodos de tratamento de infecções parasitárias em

mamíferos por administração de quantidade eficaz de um agente seleccionado de

entre o grupo constituído de inibidores do proteassoma, inibidores da via da

ubiquitina e suas misturas. Embora este método se volte a aplicativos semelhantes,

não impõe anterioridade à presente invenção, que emprega como composição

10 básica para a formulação medicamentosa HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS.

O ESTADO DA TÉCNICA SEGUNDO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Título:

Estudo das propriedades físico-químicas e critérios para a obtenção e validação de

modelos QSAR de semicarbazonas similares criados com a atividade antichagásica,

1s selecionados da literatura.

Fonte: http: //www. academ icoo. com/artigo/study-of-physiochem ical-properties-and-

criteria-for-obtain ing-and-validation-of-qsar-models-of-similar-semicarbazonas-set­

with-antichagasic-activity-selected-of-literature.

Título: Avaliação de tiosemicarbazonas e semicarbazonas como potenciais agentes

20 anti-Trypanosoma cruzi.

Fonte: http://www.academicoo.com/artigo/evaluation-of-the-activity-and-toxicity-of-

thiosemicarbazones-and-semi-carbazones-against-trypanosoma-cruzi-and-

leish man ia-1-amazonensis-in-vitro.

28/75

Título: Avaliação de tiosemicarbazonas e semicarbazonas como potenciais agentes

anti-Trypanosoma cruzi.

Fonte: Exp Parasitai; 129(4): 381-7, 2011 Dec.

Título: Nitrofurylsemicarbazona rênio e complexos de rutênio como agentes anti-

5 trypanosoma.

Fonte: EurJ Med Chem; 41(11): 1231-9, 2006 Nov.

Título: Síntese e atividade anti-tripanossoma de novo 5-nitro-2-furaldeído e

derivados 5-n itroth iopheno-2-carboxaldeido sem icarbazona.

Fonte: Farmaco; 53(2): 89-94, 1998 Feb.

10 Título: Síntese, desenho e avaliação bioquímica de novos inibidores cruzaína com

aplicação potencial no tratamento da doença de Chagas.

Fonte: Bioorg Med Chem Lett; 16(16): 4405-9, 2006 Aug 15.

Título: Avaliação da Toxicidade e Atividade de Derivados de tiosemicarbazonas e

semicarbazonas contra Trypanosoma cruzi e Leishmania (L.) amazonensis in vitro.

15 Fonte: Rio de Janeiro; s.n; 2007. ix, 131 p. ilus, tab, graf, mapas.

Título: Antichagásicos potenciais: Planejamento e Estudo da síntese de biosósteros

triazólicos imidazólicos.

Neste estudo, foram selecionados 22 derivados, dentre os quais o composto

imidazólico contendo semicarbazona, que está sendo sintetizado, mostrou-se com

20 maior capacidade de sofrer redução no grupo nitro. Dinâmica molecular associada

ao encaixe foi utilizada como ferramenta a fim de se avaliar o mecanismo de inibição

sobre a cruzaína. Assim, selecionaram-se o NFOH, além de outros sete bioisósteros,

dentre eles os quatro que foram propostos neste projeto. Após dinâmica molecular

de 3 ns, observou-se que a CYS25 da proteína se distanciou da carbonila do NFOH,

29175

sugerindo dificuldade ao ataque proposto na literatura para outros compostos

contendo esta região da molécula.

Título: Relações quantitativas estrutura-atividade para uma série de inibidores da

cruzaína de Trypanosoma cruzi: modelagem molecular, CoMFA e estudos CoMSIA.

5 Fonte: Journal of molecular graphics modelling (2009).

Título: Estudo complementar entre um encaixe e uma tela de alta taxa de

transferência em cruzaína Inibidores.

Fonte: Journal of Medicinal Chemistry (2010).

Título: Desenho, Síntese e atividade tripanocida de compostos de chumbo com

10 base em inibidores da glicólise do parasita.

Fonte: Bioorganic & Medicinal Chemistry (2008).

Título: Síntese, atividade tripanocida e estudos de modelagem molecular de 2-

alkylaminomethylquinolina derivados.

Fonte: European Journal of Medicinal Chemistry (2011 ).

15 Título: lsoformas de Cisteína protease de Trypanosoma cruzi, 2 cruzipaína e

cruzaína, a preferência de substrato diferente presente e suscetibilidade a inibidores.

Fonte: Molecular and Biochemical Parasitology (2001).

Título: Síntese de inibidores de cisteína protease macrocíclicas de trypanosoma.

Fonte: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2008).

20 Título: Síntese, concepção e avaliação de d-Homophenylalanyl Epoxysuccinato

Inibidores de cisteína protease cruzaína tripanossomal.

Fonte: Tetrahedron (2000).

AVALIAÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA EM RELAÇÃO AOS COMPOSTOS

25 DESTA INVENÇÃO.

30/75

A análise preliminar esclareceu ser conhecido do estado da técnica que:

a) Cisteína proteinases, bem como outras proteases, tem papel fundamental no

desenvolvimento das infecções causadas por parasitas.

b) T. cruzi e Leishmania sp são alvo de terapias combinadas de semicarbazonas

s (subtância e seus derivados), com demonstração de alta especificidade;

c) Uso de proteases lisossomais, a exemplo das catepsinas para o tratamento de

parasitemias é constante do estado da técnica, entretanto, as patentes estão

concentradas nas mãos de 02 grupos.

d) Inibidores de cisteína proteinases podem ser utilizados no tratamento de doenças

10 como HIV e tem sido alvo de pesquisas para o desenvolvimento de terapias

antiparas itoses;

e) Por sua vez, a literatura e documentos de patente relatam que, tiosemicarbazonas

e semicarbazonas, bem como hidrazidas são utéis no tratamento de infecções

causadas por Leishmania sp e T. cruzi;

1s f) Tiosemicarbazonas e semicarbazonas sintéticas já foram avaliadas em modelos

de infecção por T. cruzi;

g) Derivados de semicarbazonas e tiosemicarbazonas já testados apresentaram

baixa toxicidade quando comparados com o padrão-ouro;

h) A associação de tiosemicarbazonas e semicarbazonas com as drogas mais

20 comumente utilizadas tem demonstrado baixa toxicidade;

i) O desenvolvimento de derivados de tiosemicarbazonas e semicarbazonas com

perfil de inibição de enzimas tem aumentado em importância nos últimos 3-4 anos, a

julgar pelo aumento no número de depósitos de patentes nos bancos de PCT;

31/75

j) Existe uma discussão sobre a eficácia de inibidores nos diversos estágios de

desenvolvimento do parasito, durante o processo infeccioso.

Assim, resta claro que estudos envolvendo semicarbazonas no tratamento de

Doença de Chagas e Leishmaniose já são conhecidos; no entanto, as pesquisas

s conduzidas nesta invenção levaram, com grande eficácia, à utilização da Hidrazida­

N-Acilidrazonas como composição altamente eficiente nestes tratamentos, com

resultados ainda não explorados pelo estado da técnica.

APLICAÇÃO DA INVENÇÃO

10 As composições resultantes da invenção se destinam ao uso como alternativa

terapêutica no tratamento da leishmaniose cutânea e/ou muco-cutânea e/ou visceral

em humanos e animais, bem como no tratamento da fase aguda e/ou crônica da

Doença de Chagas.

15 OBJETO RESULTANTE DA INVENÇÃO

Novas séries de derivados de hidrazida-N-acilidrazonas, obtidas a partir do estudo

de semicabazonas, com ação na inibição de cisteína proteinases envolvidas nos

processos infecciosos causados por Leishmania sp. E Trypanosoma cruzi;

Otimização do(s) composto(s) líder(es) para ajuste das propriedades

20 farmacocinéticas e farmacodinâmicas e geração de um candidato a fármaco.

CARACTERÍSTICAS DO OBJETO DA INVENÇÃO

Os inventores determinaram como características da investigação: sintetizar e

avaliar farmacologicamente, em modelos in vitro e in vivo, novas séries de derivados

25 hidrazida-N-acilidrazônicos, desenhados como inibidores de cisteinil proteases, entre

32175

elas a cruzaína ou cruzipaína e a catepsina importantes cistenil proteases

encontradas nas formas epimastigotas, amastigotas e tripomastigoras de T. cruzi e,

promastigota e amastigosta de Leishmania sp. e, realizar a etapa de otimização do

(s) protótipo (s) identificado (s) visando adequar suas propriedades

s farmacodinâmicas e farmacocinéticas, de modo a assegurar sua passagem ao

estágio de candidato a fármaco.

DESCRIÇÃO SINTÉTICA DO OBJETO DA INVENÇÃO

a) Planejamento da série de derivados hidrazida-N-acilidrazona funcionalizados,

10 aplicando-se a estratégia de hibridação molecular entre os protótipos LASSBio-1111

e LASSBio-1064. Neste processo foi proposta a hibridação da subunidade aril­

hidrazida de LASSBio-1111 com a acilidrazona funcionalizada de LASSBio-1064,

visando a construção de novo padrão molecular que conjugue as propriedades

leishmanicida e/ou tripanomicida, identificadas para os protótipos selecionados.

15 A denominação LASSBio foi atribuída aos protótipos, para efeito de identificação dos

mesmos durante as várias etapas do desenvolvimento, os quais serão apresentados

a medida em que a descrição ocorrer.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

20 Para melhor entendimento da invenção, são destacadas as seguintes figuras, que

melhor orientam a descrição, sem criar ambientes limitativos:

Figura 1: Representa graficamente o percentual de medicamentos desenvolvidos

entre 1975 e 2004.

Figura 2: Diagrama de Venn de genomas de cinetoplastideos indicando o número de

25 genes compartilhados e espécie-específica entre as espécies (A). Comparação entre

33/75

T.brucíe, T. cruzíe, L. major (B). Comparação entre L. brasilienses, L. ínfantum e L.

major.

Figura 3: Avaliação de derivados hidrazido-N-acilidrazônicos e miltefosina nas

concentrações de 100 µM (A) e 1 O µM (B) no ensaio de viabilidade do parasito L.

5 major (106 células /poço). Os resultados referem-se à média ± erro padrão de

triplicatas de um experimento representativo. Os valores foram considerados

significativos quando #p < 0,05, ##p < 0,01 em relação ao controle negativo (células

cltivadas apenas com meio); e *p< 0,05, **p < 0,01 quando comparado ao grupo de

células cultivadas com meio e veículo.

10 Figura 4: Efeito dos derivados sobre o curso da lesão da orelha de camundongos

Balb/c infectdos com L. major. Os animais foram infectados com 105 promastigotas

de L. major na derme da orelha durante o tratamento (35 dias) com Veículo (PBS),

antimoniato de meglumina (A, 30 µmol/kg/dia, i.p.), LASSBio-1491 (B, 10

µmol/kg/dia, i.p.).) e LASSBio-1492 (C, 1 O µmal/kg/dia, i.p.). Os resultados referem-

15 se à média da variação da espessura da lesão da orelha em mm ± erro médio

padrão. Os valores foram considerados significativos quando *p < 0,05 quando

comparado com o grupo veículo.

Figura 5: Efeito dos derivados sobre a carga parasitária ne orelha (A) e linfonodo

drenante (B) de camundongos Balb/c infectados com L. major. Os animais foram

20 infectados com promastigotas de L. major tratados com Veículo (PBS), antimoniato

de meglumina (30 µmol/kg/dia, i.p.), LASSBio-1491 e LASSBio-1492 (10

µmol/kg/dia, i.p.). Os resultados referem-se à media± erro padrão de quadruplicatas

de um experimento representativo.

25 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

34/75

O COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO

DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, USO DE COMPOSTOS A

PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS PARA TRATAMENTO DE

LEISHMANIOSE E DOENÇA DE CHAGAS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

s OBTIDAS, objeto desta Patente de Invenção, consiste de compostos que, para

efeito de estudo, foram divididos em derivados semicarbazônicos série 1 e série li e

derivados hidrazida-N-acilidrazona série Ili e série IV.

Planejamento dos derivados semicarbazônicos série 1 e série li:

O planejamento da série de derivados semicarbazônicos la-1 foi realizada aplicando-

10 se a estratégia de aza-homologação sobre a estrutura do protótipo tripanomicida

LASSBio-1064, representada pela inserção do grupo NH como espaçador entre as

subunidades aromática e acilidrazona de LASSBio-1064.

Posteriormente, foi proposta a troca bioisostérica do átomo de cloro, presente nos

derivados da série la-1, pela unidade metilenodioxila, permitindo o desenho dos

15 derivados semicarbazônicos da série li (Fórmula 1). Ressalte-se que este tipo de

bioisosterismo foi previamente identificado em nosso laboratório quando da

descoberta do safrolobano a partir do daltrobano (Lima, L M (1997) Dissertação de

Mestrado, IQ, UFRJ).

35/75

Fórmula 1: Gênese das séries 1 e li a partir da aplicação da estratégia de aza-

homologação sobre o protótipo LASSBio-1064.

Planejamento dos derivados hidrazida-N-acilidrazona série Ili e série IV:

s O planejamento da série de derivados hidrazida-N-acilidrazona funcionalizados foi

realizado aplicando-se a estratégia de hibridação molecular entre os protótipos

LASSBio-1111 e LASSBio-1064. Neste processo fol proposta a hibridação da

subunidade aril-hidrazida de LASSBio-1111 (A, Fórmula 2) com a acilidrazona

funcionalizada de LASSBio-1064 (B, Fórmula 2), visando a construção de novo

10 padrão molecular que conjugue as propriedades leishmanicida e tripanomicida,

identificadas para os protótipos selecionados. A eleição dos grupos 4-nitrofurano e

2-hidroxibenxeno como substituintes da função imina foi proposta considerando

resultados prévios que indicaram a maior relevância destes substituintes para a

atividade desejada, quando comparado aos demais substituintes exemplificados na

15 Fórmula 2.

Cl

LASSBio-1111 (40)

Ar·W•

~ ~A)

(a)

JCI

~

'

36175

Série li (42 a-f)

(b) OH

'· ..e-r-W= , / . / .....

(e)

..... ,, '

LASSBio-1064 (39)

I

OH

)

37/75

Ar-W ;;:: aromáticos ou heteroaromáticos substituídos em diferentes posições com

grupos elétron retiradores e/ou elétron doadores. Os radicais a-e exemplificam

algumas possibilidades, mas não limitam os exemplos possíveis.

Fórmula 2: Gênese das séries Ili e IV a partir da aplicação da estratégia de

s hibridação mole cu lar entre os protótipos LASSBio-1111 e LASSBio-1064.

Pode-se assim, dividir a metodologia sintética em 4 séries, que possuem em comum

reações de interconversão de grupos funcionais baseadas em reações de

condensação e hidrazinólise.

Resultados e discussão:

10 Resumo séries 1 e li (Fórmula 3):

X=H; Z=O; Y=CI (série 1) X=O; 7rCl12; Y=O (série Il)

CHCIJ; t.a.11 h

(B>-r<~yº~ z,v~ º V

X=H; Z=O; Y=CI (série 1) 72% LASSBio-.1481 X=O; Z=CH:z; Y=O (série li) 98%

!EtOH; Nili.i."20 t.a./12h

(D)

/XX)~Y~"'N~ W-A<CH:) lX)~YNHNH2 z Ar-W ...: EtOH; ~Clcat Z 1

\ O 30 mm \Y ,,,::? O

Síntese Série 1:

X=H; 7?0; Y"'CI (série l) 40% LASSBio-1482 X=O; Z=CH2; Y=O (série Il) 85%

Síntese do phenyl 4-chlorophenylcarbamate: LASSBio-1481 (Fórmula 4):

38/75

Em um balão de 125 mi contendo 30 mi de clorofórmio, foram adicionados 11,8

ml(0,093 mols(1,2eq)) de cloroformato de fenila. Em seguida foi adicionada uma

solução, de 1 Og de 4-cloroanilina(0,078mols) em 50 mi de clorofórmio, lentamente

com uma pipeta. No termino da adição já havia precipitado e a reação era

s exotérmica, porém após 32 horas foi verificado total consumo do produto de partida.

O volume de solvente foi diminuído no rotaevaporador e foi adicionado 50 mi de

hexano, deixando a reação em agitação por 1 O minutos.

A reação foi filtrada a vácuo, sendo lavado com hexano, obtido-se um sólido branco

com 72% de rendimento.

10 Síntese da N-(4-chlorophenyl)hydrazinecarboxamide: LASSBio-1482 (Fórmula

5):

CI

CI

EtOH ...

N2H4; t.a.

o

N)lNHNH, H

Em um balão de 500 mi contendo 6,8g(0,032mols) de phenyl 4-

chlorophenylcarbamate, foi adicionado 20 mi de etanol e 45 ml(0,93 mol(30eq)) de

15 hidrato de hidrazina 64%. Após 4 horas foi diminuído o volume do solvente e

adicionado gelo, sendo verificada a precipitação do produto, com 41 % de

rendimento.

Síntese da série semicarbazona (Fórmula 6):

CI

o li EtOH; HCI

~ W-ArCHO;t.a. N NHNH2 H CI

39175

Em um balão de 25 mi contendo 0,259(0,00135 mols) de semicarbazida, sob

agitação e temperatura ambiente, foi adicionado 15 mi de etanol e 1,35mmol de

aldeído(previamente selecionado), seguida da adição de 1 gota de HCI concentrado.

A solução permaneceu sob agitação por 30-240 min, quando CCF foi verificado o

s termino da reação. Após a adição de gelo a solução foi filtrada a vácuo, sendo

obtidos os seguintes compostos, conforme Fórmula 7 abaixo:

H

H H ~ N N'-. ~ y N Ar·W

CI O

Ar~w =

~N02 ~N02 ~ LASSBio-1699 LASSBio·1483

C02H LASSBio-1484

~ CF3 ~ j) HO

LASSBio· 1485 LASSBio-1486 LASSBin·1487

/lcr:º'cH, OH

,,.<º N02 ::D 02N

LASSBio-1488 LASSBio-1489 LASSBio-1490

!y OH

lo OH

10 LASSBio-1.700 LASSBio-1701

40175

Após a caracterização estrutural através das técnicas de Ressonância Magnética

Nuclear de Carbono e Hidrogênio, o grau de pureza das substâncias foi medida,

resultando nos resultados abaixo, conforme tabela 4:

LASSBio-1481 72% 189-192 <0,4%

LASSBio-1482 41% >250 <0,4%

LASSBio-1699 64% 247-250 >0,4%

LASSBio-1483 80% 180-184 <0,4%

LASSBio-1484 80% >250 <0,4%

LASSBio-1485 86% 216-220 <0,4%

LASSBio-1486 61% 136-140 <0,4%

LASSBio-1487 87% 196-200 <0,4%

LASSBio-1488 90% 218-220 <0,4%

LASSBio-1489 52% <0,4%

LASSBio-1490 84% 200-203 <0,4%

LASSBio-1700 85°/o 175-177 98,56%

LASSBio-1701 79% 204-206 98,18%

s Critério de pureza: CHN <0,4%; HPLC>98%

41/75

Série li:

Síntese do phenyl benzo[d][1,3]dioxol-5-ylcarbamate (Fórmula 8):

< o

f enilclorof ormato ... < o

Em um balão de 50ml, contendo 10ml de clorofórmio foi adicionado 0,27ml (0,00218

s mais) de fenilcloroformato , e em seguida uma solução de 0,3g (0,00218mols) de

amina em 7 mi de clorofórmio, e por fim, foi adicionado 0,3ml de trietilamina. A

solução reagiu durante um hora, em temperatura ambiente e por CCF(dic:met2%)

indicou o termino da reação.

O volume do solvente foi diminuído, e com -5ml foi adicionado éter de petróleo

10 aquecido por 50ºC, que ficou agitando por 1 O min. A reação foi filtrada e lavado a

seco com hexano fornecendo 95% de rendimento.

Sintese do N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)hydrazinecarboxamide (Fórmula 9):

N2H4 ..... EtOH:t.a.

Em um balão de 250 mi contendo 2,5g (0,011mols) do carbamato, foi adicionado

1s 60ml de etanol e 24m1 (0,44mols) de hidrazina aquosa 59%. Foi deixado em

agitação por 24 horas, sendo observado a precipitação de um sólido bege, onde

CCF (di:met2%) indicou o termino da reação.

Para o isolamento, a reação foi colocada sob um Becker contendo gelo e

posteriomente, filtrada a vácuo, obtendo rendimento de 85%

42175

Acoplamento dos aldeídos funcionalizados (Fórmula 1 O):

<o:u~ O W-ArCHO li EtOH;HClr~~

O # N~NHNH H 2

Em um balão de 50 mi contendo 0,2g de semicarbazida, foi adicionado, sob agitação

e temperatura ambiente, 1 Oml de etanol e 1, 025mmol de aldeído previamente

s selecionado, seguido de 1 gota de ácido clorídrico.A solução permaneceu sob

10

agitação por 30 minutos, quando CCF(dic:met2%) indicou o termino da reação.

Para o isolamento foi adicionado gelo e filtrado a vácuo, obtendo os seguintes

rendimentos, conforme fórmula 11 abaixo:

~::o~ LASSBio-1197 LASSBio-1198 LASSBio-1199 LASSBio-1200 LASSBio-1201 LASSBio-1202

~~~º'"1Uº" !Q, 6J LASSBio-1203

........__

LASSBio-1209

LASSBio-1204 LASSBio-1205 LASSBio-1206 LASSBio-1207 LASSBio-1208

o LASSBio-121 O LASSBio-1302 LASSBfo· 1303 LA SSBio-1304

43/75

Após a caracterização estrutural através das técnicas de Ressonância Magnética

Nuclear de Carbono e Hidrogênio, o grau de pureza das substâncias foi medida

através do CHN, assim, as substâncias que obtiveram resultados inferiores a 0,4, foi

possível o cadastramento e posterior análise farmacológica. Tabela 5:

LASSBio1197 85,5% 206-211 <0,4%

-·---·--·------LASSBio1198 94% >250 <0,4%

LASSBio1199 92% 242-245 <0,4%

· LASSBio1201 89%

~LÃssiiiõ1-2õ2 ________ 98% ----------· 203-205 <0,4%

203-206 <0,4%

----------~-----·-·--------

LASSBio1203 87,5% >250 <0,4%

----·--------------LASSBio1204 86,6% >250 <0,4%

r .. LASSBio12ÕS____ 84% -----------202-2~-- <0,4% 1 !---------·~------· -------·------ -----

~--A~SBio120~---- 55% 133-138 <0,4%

LASSBio1207 83% 204-206 <0,4%

·---------------------.. ·-·-·------~------! ~ LASSBio1208 97% 192-197 <0,4%

1 LAS;::::: ~::: _ -------~~::~: ___ ::_::_:_:_~ 5

Resumo séries Ili e IV (Fórmula 12):

5

44175

.liº" i\1cOH;H?i.04 70"CJ 241i

(CJXO ,...NH2 ~

X y

X=Y=Cl(séric 111) X=Cl; Y=ll(séric IV)

X=V=Cl(séric III) 82°/,, X=Y=Cl(seric III) 77% X=CI; Y""H(séric IV) 82% X .. CI: Y"'H(séric IV) 69%

lc1J0 .Ph (E) ~

X--(\-)-~>--NHNH, JOIOH; N,H, '==( \ t.a./3b

y X"'Y=Cl(séric lll) 49% LASSBlo-1493 X=CI; Y=H(sérlc IV) 40%

\\' . ··CHOtEtOH; HClcat H (F) " t.aJ30min XYr NÀ' 1"'

V

1

H r\Í•ilr

~ N,NAO y o

H

X=Y..Cl(sérle Ili) X=Cl; Y=H(série IV)

(D) H f CHCb; t.a.J3h

~~:(1ºD xMy

X=Y=Cl(série lll) 51 % LASSBio-1492 X=CI; Y=H(séric IV) 45%

Série Ili:

Síntese do methyl 2,4-dichlorobenzoate (Fórmula 13):

o o

OH OCH3

CI CI

Foi adicionado, num balão de 500ml, 1 Og (0,052 mais) do ácido 2,4 diclorobenzóico

em 200 mi de metanol e 50 gotas de ácido sulfúrico. O balão foi acoplado a um

aparelho de DeanStak, e colocado em agitação vigorosa em refluxo à temperatura

de aproximadamente 70ºC por aproximadamente 24 horas, onde CCF(hex/acet30%)

10 indicou o término da reação.

45175

O volume do metanol foi reduzido, e o pH elevado até 8, onde após a extração com

acetato de etila e concentrado no rotaevaporador, foi obtido um óleo com rendimento

de 81%.

s Síntese da 2,4-dichlorobenzohydrazide (48) (Fórmula 14):

o o

º ............ _____ ,...._ t.a./ 6h / 63%

CI CI

(47) (48)

Um balão contendo 2,5g (12mmol) de 2,4-diclorobenzoato de metila (47) foram

adicionado 25 mi de etanol e 7.3 mi (0.146mols; 12eq) de N2H464%. A mistura foi

submetida a agitação em temperatura ambiente por 6 horas, quando indicou término

10 da reação acompanhado por CCF (eluente: diclorometano: metanol 10%). O volume

foi reduzido a vácuo e adicionado gelo para precipitação do produto, que foi filtrado à

vácuo e lavado com água. Aspecto físico: sólido branco; rendimento: 63%; PF=

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): o 9,62 ( s, 1 H, Hb); 7,62 (d, 1 H, H6', J= 2Hz);

7,46 (d, 1H, H5', J= 2Hz); 7,43 (s, 1H, H3'); 4,52 (s, 2H, NH2)

15 • RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): D 164,73 (Ç=O); 134,61 (C2'); 134,45

(C4'); 131,57 (C6'); 130,48 (C1 '); 129, 13 (C3'); 127,23 (C5')

• IV (KBr) cm-1: 3309 (D NH); 1663 (D C=O); 1616 (õ N-H)

• Pureza (HPLC): 98.67%

Síntese do phenyl 2-(2,4-dichlorobenzoyl)hydrazinecarboxylate LASSBio-

20 1492 ; 49 (Fórmula 15):

CI

o

(48)

CHICl:J t.a/ 7h 80%

46175

o

3' 5

{49)

Em um balão de 50 mi, foram adicionados 20 mi de clorofórmio e 4,9ml de

fenilcloroformato (6mmol; 1.2eq). A solução foi agitada a temperatura ambiente e

adicionado, vagarosamente, uma suspensão de 1 g (5mmols) de 2,4-

s diclorobenzohidrazida em 50 ml de clorofórmio. Após 7 horas de agitação foi

observado total consumo do produto de partida, acompanhada por CCF

(eluente:diclorometano:metanol 5%). A seguir foi adicionado 1 O mi hexano na

reação, mantendo-a sob agitação por 1 O min. Em seguida esta foi filtrada a vácuo e

lavado com hexano obtendo-se o produto 49 (LASSBio-1492). Aspecto físico: sólido

10 branco; PF=180-184ºC; Rendimento: 80%

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d5): o 10,49 (s, 1H, Hb); 10,05 (s, 1H, Hc), 7,74 (d,

1H, H6', J=2Hz); 7,58-7,14 (m, 5H, H3', H5', H2, H4 e H6); 6,89 (d, 2H, H3 e

H5, J=6 Hz)

1s • RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) o (ppm): õ 163,12 (Cd, C=O), 154,24 (Ca,

20

C=O); 150,61 (C2'); 135,42 (C4'), 133,15 (C6'); 131,71 (C1'); 130,54 (C1);

129,51 (C2 e C6); 129,45 (C3 e C5); 127,48 (C3'); 125,44 (C5'); 121,50 (C4)

• IV (KBr) cm·1: 3247 (D NH); 1741e1661 (D C=O); 1033 (D Ar-CI)

• Pureza (HPLC): 98.45%

47/75

Reação de hidrazinólise da hydrazinecarboxylate LASSBio-1493 (Fórmula 16):

o CI

CI o

Foi adicionado em um balão de 50ml 0,3g de produto de partida, 7 mi de etanol, até

total solubilização e então foi colocado 3,84 mi de hidrazina hidrato 80%(30 eq).

s Após 32 horas foi constatado o fim da reação. O volume reacional foi diminuído, e

após adição de gelo e a formação de precipitado, a solução filtrada a vácuo sendo

obtido com um rendimento de 65%.

Metodologia geral de obtenção dos derivados hidrazida-N-acilidrazonas série

10 li (42 a-f) (fórmula 17):

o

(50) w-ArCOH/ t.a.

H H l ~/NYN'N~Ar-w

o (42 a-f)

H H N N

N/ °'V '-NH H li 2

O EtOHI HCl001 ... Cf

CI

Em um balão contendo 0,1g do intermediário 50, foi adicionado, sob agitação

e temperatura ambiente, 1 Oml de etanol e 0,30mmol (1 eq) de aldeído previamente

selecionado, seguido da adição de 1 gota de ácido clorídrico concentrado. A solução

15 permaneceu sob agitação por 1-4 horas, quando CCF (diclorometano:metanol 5-

10%) indicou o termino da reação. O volume do meio reacional foi reduzido (2/3 do

volume) em rotaevaporador, e após a adição de gelo foi verificado a precipitação do

produto, que foi filtrado a vácuo e lavado com água gelada.

48/75

Metodologia de obtenção do (E)-1-(2-hidroxibenzilideno)-5-(2,4-

diclorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1705); (42a) (fórmula 18):

o

CI {50)

EtOH/ HClr.•tl t.a. 78%

ftOce~H2

~/~y~·-......NÚ 1 ~ 3

b o 1 Cl 4 CI d HO 6 # 4

~ 5 \42a}

s O composto 42a foi obtido a partir da condensação da hidrazida 50 com 2-

hidroxbenzaldeído com rendimento de 78%. Aspecto físico: sólido branco. PF= 210-

213ºC

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) ô (ppm): ô 10,66 (s, 1Hb); 10,16 (s, 1Hc);

10,03 (s, 1 H, OH); 9, 11 (s, 1 H, He); 8,23 (s, 1 H, N=CH); 7,92 (d, 1 H, H6', J=

10 8); 7,73 (s, 1 H, H3'); 7,60 (m, 2H, H2 e H5'); 7,20 (t, 1 H, H4, J=6); 6,90-6,80

(m, 2H, H3 e H5)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,3 (Cd, C=O); 155,9 (Ca, C=O);

154,8 (N=CH); 139,1 (C6); 135,1 (C2'); 133,5 (C4'); 131,7 (C6'); 130,8 (C2);

130,5 (C1'); 129,4 (C4)127,3 (C3'); 127,1(C5');120,3 (C1); 119,1(C5);116,0

1s (C3)

• IV (KBr) cm-1: 3436-1852 (D OH); 3232 (D NH); 1708 (D C=O); 1655 (õ N-H);

1046 (DC-CI)

• MS (m/z): 365

49/75

Pureza (HPLC): 99.83%

Metodologia de obtenção do (E)-1-(3-hidroxibenzilideno)-5-(2,4-

diclorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1708); (42b) (fórmula 19):

o e e H

H H /Nyd N'-.. # 1

~ N

b o CI

(42b) OH 5

O composto 42b foi obtido a partir da condensação da hidrazida 50 com 3-

hidroxibenzaldeído em rendimento de 95%. Aspecto físico: sólido branco. PF= 223-

225ºC

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) ô (ppm): ô 10,62 (s, 1Hb); 10,12 (s, 1Hc); 9,48

10 (s, 1 H, OH); 9,05 (s, 1 He); 7,80 (s, 1 H, N=CH); 7,71 (s, 1 H3'); 7,70-7,50 (m,

2H, H5'e H6'); 7, 18 (t, 3H, H2, H3 e H4); 6,76 (d, 1 H6)

• MS (m/z): 365

Pureza (HPLC): 98.58%

15 Metodologia de obtenção do (E)-1-(4-hidroxibenzilideno)-5-(2,4-

diclorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1707); (42c) (fórmula 20):

50175

o _Jy~--- .. ~º 1 /, N" 'NH H 2

'"OH

o - .... CI CI EtOHI Hei,./ t.a.

(50} 90%

e H e H H

/N"tN'- ~,,.. 1 N N H b o 4

3· 5 OH

(42<:)

O composto 42c foi obtido a partir da condensação da hidrazida 50 com 4-

hidroxibenzaldeído em rendimento de 90%. Aspecto físico: sólido branco. PF= 225-

227ºC

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm): õ 10,53 (s, 1 H, Hb); 1O,16 (s, 1 H,

Hc); 9,83 (s, OH); 9,05 (s, 1 He); 7,84 (s, 1 H, N=CH); 7,76 (s, 1 H, 1 H3'); 7,67

(d, 2H, H2 e H6, J=10 Hz); 7,58 (m, 2H, H5'e H6'); 6,82 (d, 2H, H3 e H5,

J=10Hz)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm}: 165,3 (Cd, C=O); 158,7 (Ca, C=O);

10 155.0 (N=CH); 141,2 (C4); 135,1 (C2')133,6 (C4'); 131,7 (C6'); 130,8 (C1 ');

129,4 (C1); 128,5 (C2 e C6); 127.3 (C3'); 125,5 (C5'); 115,41 (C3 e C5)

• IV (KBr) cm-1: 3362 (D NH); 1694 (D C=O); 1651 (õN-H); 1098 (DC-CI)

• MS (m/z): 365

Pureza (HPLC)= 99,84%

15

Metodologia de obtenção do (E)-1-(4-(trifluormetil)benzilideno)-5-(2,4-

diclorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1736); (42d) (fórmula 21):

51/75

e e H H H

58%

/Nyd N'-. ,,-:P 1 N N H b o 4

CI {80)

EtOH/ Hclca11 t.a. {42d) 5

O composto 42d foi obtido a partir da condensação da hidrazida 50 com 4-

triflorometilbenzaldeído em rendimento de 58%. Aspecto físico: sólido branco. PF=

213-216ºC

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): õ 10,93 (s, 1H, Hb); 10,17 (s, 1H,

Hc); 9,34 (s, 1 H, He); 8,07 (d, 2H, H3 e H5, J=1 OHz); 7,97 (s, 1 H, N=CH); 7,77

(s, 1H, H3'), 7,74 (m, 2H, H2 e H6); 7,55 (m, 2H, H5'e H6')

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,33 (Cd, C=O); 154,71 (Ca,

C=O); 139.19 (N=CH); 138,54 (C4); 135,20 (C3 e C5); 133,59 (C2 e C6);

10 131,77 (C2'); 130,80 (C4'); 128,68 (C6'); 128,05 (C1');127,45 (C3'); 127,36

(C5'); 125,38 (C1); 121,47 (Cf3)

• IV (KBr) cm-1: 3555 (D NH); 1703 (D C=O); 1655 (õN-H); 1015 (DC-CI); 1164-

1105 (C-F)

• MS (m/z): 417

15 • Pureza (HPLC): 99.84%

Metodologia de obtenção do (E)-1-(2,4-diclorobenzoil)-5-((5-nitrofuran-2-

il)metileno)carbonohidrazida (LASSBio-1703); (42e) (fórmula 22):

CI

o

(50) EtOH/ Hcl001/ t.a. 87%

52175

o e e H H H

,.,...-Nyd N'-. g. N N H b o

3 {42e)

O composto 42e foi obtido a partir da condensação da hidrazida 50 com 2-

nitrofuraldeído obtendo rendimento de 87%. O composto foi recristalizado com

etanol. Aspecto físico: sólido amarelo. PF= 222-225ºC

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J 8 (ppm): 11.22 (s, 1 H, Hb) 10,22 (s, 1 H, Hc);

9.18 (s, 1H, He); 7.86 (s, 1H, N=CH); 7.79 (d, 1H, H3, J= 4Hz); 7.71 (s, 1H,

H3'); 7.57 (m, 2H, H5'e H6'); 7.32 (d, 1H, H4, J=4 Hz)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) ô (ppm): 165,2 (Cd); 154,0 (Ca); 152.7 (C2);

151,2 (N=CH); 135,1(C2');133,3 (C4'); 131,7 (C1); 130,7 (C6'); 129,3 (C5');

10 129,1(C1');127,2 (C3'); 115,0 (C3); 112,5 (C4)

• IV (KBr) cm·1: 3387 (D NH); 1727 (D C=O); 1667 (õN-H); 1015 (DC-CI); 1244

e 1281 (N=O)

• MS (m/z): 384

Pureza: 99.33%

1s Série IV:

Síntese da methyl 4-chlorobenzoate (Fórmula 23):

53175

o o

H

MeOH/t.a. CI

CI

Em um balão de 500 mi, foi adicionado 1 Og de 4-clorobenzaldeído(0,071 mols), 250

mi de metanol, 18g(0,356 mal) de NaCN e 15g(0,44mols) de Mn02 ativado,

permanecendo sob agitação vigorosa sob temperaturaambiente. Após 8 horas, foi

s verificado por c.c.f.(Hex:Acet 30%) o termino da reação. Esta foi filtrada em filtro de

vidro sinterizado, com sílica gel e Celite, onde no filtrado foi adicionado sulfato de

sódio e concentrado no rotaevaporador, gerando um óleo amarelado, com

rendimento de 69%.

10 Metodologia de obtenção da 4-clorobenzohidrazida (LASSBio-1108) (52)

(fórmula 24):

o

t.a./ 5h/80%

CI (51)

CI

(52)

/NHa N H b

Em um balão contendo 5g (29mmol) de 4-clorobenzoato de metila (51) foram

adicionados 50rnl de etanol e 14.2 mi (0.29mol; 10eq) de N2H4.H20 64%. A reação

1s foi submetida a agitação em temperatura ambiente por 5 horas, onde o término

reacional foi acompanhado por CCF (eluente: diclorometano:metanol 10%). O

volume foi reduzido em rotaevaporador, e adicionado gelo para precipitação do

54175

produto, que foi filtrado à vácuo e lavado com água. Aspecto físico: sólido branco;

rendimento: 80%

• IV (KBr) cm·1: 3310 (D NH); 1656 (D C=O); 1591(õN-H);1008 (DC-CI);

• MS (m/z): 169

s Pureza (HPLC): 98.67%

Metodologia de obtenção do 2-(4-clorobenzoil)hidrazidacarboxilato de fenila

(LASSBio-1702) (53) (fórmula 25):

o

CI (52)

(551

CHCl 3f ta. 1 51% 3' (53) 5

10 Em um balão foram adicionados 5 mi de clorofórmio e 0.7ml de

fenilcloroformato (55) (5.3mmol; 1eq), a solução resultante foi agitada a temperatura

ambiente. Vagarosamente foi adicionado uma suspensão de 1 g (5.3mmol) de 4-

clorobenzohidrazida em 50 ml de clorofórmio. Após 5 horas foi observado por

acompanhamento em CCF (eluente:diclorometano:metanol 10%) total consumo do

15 produto de partida. A seguir foi adicionado 5 ml hexano na reação, mantendo-a sob

agitação por 10 min. O precipitado formado foi filtrado a vácuo e lavado com hexano,

obtendo o produto 53 com 51 % de rendimento.

Aspecto físico: sólido branco; PF=182-185ºC

55175

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J: ô 10,66 (s, 1 H, Hb); 9,92 (s, 1 H, Hc); 7,91 (d,

2H, H2'e H6', J=10 Hz); 7,60 (d, 2H, H3'e H5', J=10 Hz); 7,40 (d, 2H, H2 e

H6, J=B Hz); 7,26 (d, 1H, H4, J=6 Hz); 7,18 (d, 2H, H3 e H5, J=8 Hz)

• IV (KBr) cm-1: 3277 (D NH); 1730 e 1661 (D C=O); 1010 (õ Ar-CI)

s • MS (m/z)= 389

Pureza (HPLC): 97,02%

Metodologia de obtenção do (LASSBio-1710) (54) (fórmula 26):

o o e H H H

~/·yºD N2Hi EtOH a ·/·y·, ~ e NH2

o 1 # ..... CHCl~J t.a. /32h o

CI 62% 10

(53) 3· (54)

Foram adicionados em um balão 50ml 0,3g (1 mmol) do intermediário 53, 7 mi de

etanol, e 1.20ml de hidrazina hidrato 80% (0.03mol; 30 eq). Após 32 horas foi

constatado o fim da reação por CCF (eluente: diclorometano:metanol 5%). O volume

15 reacional foi reduzido em rotaevaporador e após adição de gelo ocorreu a formação

de precipitado, o qual foi filtrado a vácuo, sendo obtendo-se o produto em

rendimento de 62%. Aspecto físico: sólido branco; PF=187-190ºC

56175

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J: õ 10,24 (si, 1 H, Hb); 8, 17 (s, 1 H, Hc); 7,89 (d,

H2'e H6', J=8); 7,63 (s, 1H, He); 7,55 (d, 2H, H3'e H5', J=8); 4,17 (si, 2H,

NH2)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6J õ (ppm): 165,7 (Ca, C=O); 160,3 (Cd, C=O);

s 136,9 (C4'); 132,0 (C1');129,9 (C2'e C6'); 128,9 (C3'e C5')

• IV (KBr) cm"1: 3328 (D NH); 1676 e 1597 (D C=O); 1o13 (o Ar-CI)

• MS (m/z): 227

• Pureza (HPLC): 97,89%

10 Metodologia de obtenção dos derivados hidrazida-N-acilidrazonas da série Ili

(43 a-f) (fórmula 27):

o o H

H H 1

/Nl(N'-~ N N Ar·w H

()

(43 a-f)

CI w-ArCOH/t.a.

(54) CI

Em um balão 50 mi contendo O, 1g do intermediário 54, foram adicionados, sob

agitação em temperatura ambiente, 1 Oml de etanol e 0.43mmol (1eq) de aldeído

15 previamente selecionado, seguido de 1 gota de ácido clorídrico concentrado.A

solução permaneceu sob agitação por 1-4 horas, quando CCF

(diclorometano:metanol 5-10%) indicou o termino da reação. O volume do meio

reacional foi reduzido a pressão reduzida (2/3 do volume), e após a adição de gelo

57175

foi verificado a precipitação do produto, que foi filtrado a vácuo e lavado com água

gelada.

Metodologia de obtenção do

s clorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1704); (43a) (fórmula 28):

CI (54)

EtOHI Hclcatl t.a.

3hl53%

O composto 43a foi obtido a partir da condensação da hidrazida 54 com 2-

hidroxibenzaldeído com rendimento médio de 53%. Aspecto físico: sólido branco.

PF= >250ºC

10 • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J: 8 10,65 (s, 1H, Hb); 10,30 (s, 1H, Hc); 10,02

(si, 1 H, OH); 8,98 (s, 1 H, He); 8,22 (s, 1 H, N=CH); 7,91 (d, 2H, H2'e H6',

J=8Hz); 7,84 (d, 1H, H2); 7,57 (d, 2H, H3'e H5', J=8Hz); 7,17 (t, 1 H, H4,

J=6Hz); 6,88-6,81 (m, 2H, H3 e H5)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6J ô (ppm): 165,2 (Cd, C=O), 156,0 (Ca, C=O);

15 155, 1 (N=CH); 136,5 (C6); 131,5 (C4'); 130,4 (C1 '); 129,3 (C2'e C6'); 128,5

(C3'-C5'e C2); 127,1(C4);120,2 (C1); 119,17 (C5); 116,0 (C3)

• IV (KBr) cm·1: 3309 (D NH); 1701 e 1545 (D C=O); 1664 e 1484 (õ N-H);

1011 (õ Ar-CI)

• MS (m/z): 331

CI

58/75

• Pureza (HPLC): 98,02%

Metodologia de obtenção do (E)-1-(3-hidroxibenzilideno)-5-(4-

clorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1709); (43b) (fórmula 29):

(54) EtOH/ Hcl0./ ta.

4h/91%

o e e H

H H ,......-Nyd N......_4

N N H

b o

(43b}

O composto 43b foi obtido a partir da condensação da hidrazida 54 com 3-

hidroxibenzaldeído em rendimento de 91 %. Aspecto físico: sólido branco. PF= 225-

227°C

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): õ 10,62 (s, 1 H, Hb); 10,28 (s, 1 H, Hc); 9,47 (s,

10 1H, OH); 9,12 (s, 1H, He); 7,90 (d, 2H, H2'e H6', J=4Hz); 7,80 (s, 1H, N=CH);

7,57 (d, 2H, H5'e H3', J=4Hz); 7,17 (m, 3H, H3, H4 e H5); 6,77 (d, 1H, H2)

• IV (KBr) cm·1: 3342 (D NHCO); 1692 (D C=O); 1655 (D N-H); 1015 (D Ar-CI)

• MS (m/z):331

• Pureza (HPLC): 98.93%

15

Metodologia de obtenção do (E)-1-(4-hidroxibenzilideno)-5-(4-

clorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1706); (43c) (fórmula 30):

59175

ffº ~-)V~'""• ·~ d· ~' ~ ~_j'iY~'·U" ' :_ ' li 0~ 1 2· b g l 4

CI O ... Cl 4· # 6 # OH (54) EtOHI Hcl.a1/ ta. :r 5

3h/ 86% (43C)

O composto 43c foi obtido a partir da condensação da hidrazida 54 com 4-

hidroxibenzaldeído obtendo rendimento de 86%. Aspecto físico: sólido branco. PF=

223-225ºC

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J: õ 10,49 (s, 1 H, Hb); 10,28 (s, 1 H, Hc); 9,77 (s,

1 H, OH); 8,92 (s, 1 H, He); 7,90 (d, 2H, H2'e H6', J=8Hz); 7,79 (s, 1 H, N=CH);

7,59 (m, 4H, H3'-H5' e H2 e H6); 6,77 (d, 2H, H3 e H5)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,2 (Cd, C=O); 158,7 (Ca, C=O);

155,3 (N=CH); 141,2 (C4); 136,5 (C4'); 131,5 (C2'e C6'); 129,3 (C2 e C6);

10 128,5 (C3-C5 e C1 '); 125,6 (C3'e C5'); 115,4 (C1)

• IV {KBr) cm·1: 3369 (D NH); 1701 (D C=O); 1651 (D N-H); 1014 (D Ar-CI)

• MS {m/z): 331

• Pureza {HPLC): 99.67%

1s Metodologia de obtenção do {E)-1-(4-(trifluormetil)benzilideno)-5-(4-

clorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1737); (43d) (fórmula 31):

CI (54)

EtOHf HclcatÍ t.a.

4h/84%

60175

O composto 43d foi em a partir da condensação da hidrazida 54 com 4-

triflorometilbenzaldeído obtendo rendimento de 84%. Aspecto físico: sólido branco.

PF:;: 201-204ºC

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J: ô 10,95 (s, 1H, Hb); 10,34 (s, 1H, Hc); 9,24 (s,

1 H, He); 8,05 (d, 2H, H2 e H6, J:;: 8Hz); 7,96 (d, 2H, H2'e H6', J=8Hz); 7,90

(s, 1H, N=CH); 7,35 (d, 2H, H3 e H5, J=8Hz); 7,59 (d, 2H, H3'e H5', J=8Hz)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-dG) õ (ppm): 165,2 (Cd, C=O); 155,0 (Ca, C:;:Q);

139, 1 (N=CH); 138,5 (C4); 136,5 (C3 e C5); 131,4 (C2 e C6); 129,30 (C2'e

10 C6'); 128,5 (C3'e C5'); 127,3 (C4'); 125,3 (C1); 125,3 (C1'); 121,4 (ÇF3)

15

• IV (KBr) cm-1: : 3338 (D NH); 1701 (D C:;:Q); 1663 (D N-H); 1015 (D Ar-CI);

1131 e 1100 (C-F)

• MS (m/z): 383

• Pureza (HPLC)= 99, 12%

Metodologia de obtenção do (E)-1-(4-clorobenzoil)-5-((5-nitrofuran-2-

il)metileno)carbonohidrazida (LASSBio-1491); (43e) (fórmula 32):

61/75

o e e H H H /Nyd N......._ _,,?

~ N

b o 3 CI

~,.,~I(~'""' ·3u--. s· 1

o ..... EtOH/ Hcl0 atl t.a. CI 4·

3•

(54) 4hl87% {43e)

O composto 43e foi obtido a partir da condensação da hidrazida 54 com 2-

nitrofuraldeído em rendimento de 87%. O composto foi recristalizado com etanol.

Aspecto físico: sólido amarelo. PF= 217-220ºC

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): 3 11,24 (s, 1 H, Hb), 10,39 (s, 1 H, Hc); 9, 12 (s,

1 H, He); 7,91 (m, 3H, N=CH e H2'e H6'); 7,80 (d, 1 H, H3, J=4); 7,58 (d, 2H,

H3'e H5', J=8); 7,31 (d, 1H, H4, J=4)

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) ô (ppm): 165,32 (Cd, C=O); 154,57 (Ca, C=O);

152,84 (N=CH); 152,40 (C2); 136,69 (C4'); 131,38 (C1 '); 129,38 (C2'e C6');

10 129,22 (C1); 128,62 (C3'e C5'); 115, 16 (C3); 112,62 (C4)

• IV (KBr) cm-1: 3246 (D NH); 1659 e 1504 (D C=0);1596 e 1351 (õ Ar-N02);

1015 (õ Ar-CI)

• MS (m/z): 350

• RMN 1H com troca por 0 20(500 MHz, DMSO-d6): 7,96 (m, 3H, N=CH e H2'e

15 H6'); 7,81(s, 1H, H3); 7,66 (d, 2H, H3'e H5', J=10Hz); 7,32 (s, 1H, H4)

• Pureza( HPLC): 98.31 %

62175

Considerando que a novidade da presente invenção está conteplada nas séries

Ili e IV, apresentamos a fórmula geral abaixo:

Formu1a 1 (isômeros E e/ou Z)

1. Sendo X= O; S; NH; X1 =O; S: NH;

s Ar= arila ou heteroarila com substituintes W1 e/ou W2 nas posições orlo, e/ou

meta e/ou para; sendo W1 e W2 = grupos elétron retiradores e/ou elétron

doadores, sendo preferencialmente um grupo H, F, Cl, Br, OCH3, OCH3,

OC2H5, OCH(CH3)2, OC(CH3)3; OCF3; N02; C02H; CN; CF3; CHF2; CHF2;

NH2, NHCH3, NHC2H5, NHCH(CH3)2, NH(CH3)3, N(C2H5)2, N(CH3)2, CH3;

10 etila, propila, isopropila, butila, sec-butila e ter-butila.

15

20

Resultados Farmacológicos:

Atividade tripanomicida:

Metodologia Utilizada:

Culturas de T. cruzi. Para o ensaio de atividade antiproliferativa, epimastigotas de

T. cruzi (cepa Tulahuen 2) foram cultivadas a 28 ºCem meio axênico consistindo de

infusão de cérebro coração (33 g / L), triptose (3 g I L), hemina (0,02 g I L), D-(+ )­

glicose (0,3 g / I), estreptomicina (0,2 g / I) e penicilina (200.000 UI L), suplementado

com 10% de soro fetal bovino. [14] Todas as culturas e todos os testes foram

realizados em condições aeróbias. Em todos os testes foi trabalhado com parasitas

em fase de crescimento exponencial (culturas utilizadas 5-7 dias de crescimento,

5

10

15

63175

começando no dia O de um anel de 5 milhões de parasitas I mL). Todos os

resultados são a média de pelo menos três experimentos independentes.

Medida da atividade antiproliferativa [15]. Foi preparado uma suspensão de

parasitas (cepa Tulahuen 2) com uma concentração de 4 milhões de células I mL e

inoculado 0,6 mL I poço em 24 poços da placa. Realizou-se também diluições do

composto em estudo em DMSO a partir de uma solução estoque 200 mM preparada

na hora e imediatamente adicionado a cada poço (5 uL I poço). Os parasitas foram

incubados com os compostos a 28 º C durante 5 dias. O crescimento dos parasitas é

monitorada medindo-se o aumento da absorvância a 61 O nm, que é proporcional ao

número de células [1]. A inibição percentual é calculado como:% ::; {1 - [(Ap - AOp) I

(Ac - AOc)]} x 100, onde p é A61 O da cultura contendo o composto no dia 5; AOp é

A61 O da cultura contendo o composta imediatamente após a adição do composto

(dia O), Ac é A610 da cultura na ausência de composto (controle negativo) no dia 5;

AOc é A61 O, na ausência do composto no dia O. O IC50 corresponde à concentração

de composto capaz de causar uma inibição de 50% de crescimento. Isso é

determinado pela plotagem% de inibição de crescimento em comparação Log

(concentração), ajustando os pontos de uma curva sigmoidal de Boltzmann. Cada

experimento foi repetido três vezes interdias e IC50 é calculado como o empregado

com o crn-1.

20 - Foi realizado teste de atividade tripanomicida dos novos derivados das séries Ili e

IV, onde todos compostos foram testados ín vitro contra as formas epimastigotas de

cepas Tulahuen 2 de T.cruzí. Sua capacidade de inibir o crescimento do parasita foi

avaliada em 25µM, em comparação com o padrão da droga nifurtimox, onde foi

64175

calculada a porcentagem de inibição do crescimento e posterior determinação da

potência tripanomicida, obtendo os seguintes resultados:

Série Ili Série IV

Compostos ICso ,., '

LASSBio· 1493 >>>25

LASSBio-1705 >>>25

LASSBio-1708 >>25

LASSBio-1707 >>>25

LASSBio-1736

A avaliação dos compostos das séries Ili e IV, conforme tabela 8A acima, mostrou

s atividade tripanomicida para os compostos testados em concentrações superior a 25

DM. LASSBio-1703 e LASSBio-1491, foram selecionados para determinação da

potência tripanomicida apresentando valores de Cl50 de 56,7 e 62, 3 DM,

respectivamente.

10 Estudo da atividade leishmanicida

A citotoxicidade é um dos parâmetros biológicos mais comumente avaliado após a

manipulação experimental, visto que pode ser facilmente medido, além de seguir ao

paradigmada dose-dependência de Paracelso (Cho et ai., 2008) e predizer o grau de

toxicidade para a célula indicando a real possibilidade de uso. No presente trabalho,

1s foi investigado a citotoxicidade das séries de derivados hidrazida-N-acilidrazônicos

sobre as células de mamíferos pelo método de dosagem de lactato desidrogenase

em culturas de macrófagos da linhagem J77 4 e sobre as formas promastigotas e

65175

amastigota de Leishmania sp, tratadas com as substâncias testes por um período de

48 horas.

Metodologia Utilizada:

Determinação da viabilidade celular: Macrófagos da linhagem J774 foram

s cultivados em triplicatas em placas de 48 poços, na concentração de 1,5 x 105

células/poço e incubadas em estufa a 37 ºC com atmosfera úmida contendo 7% de

C02 por 4 horas, para adesão dos macrófagos ao plástico. Em seguida, os poços

foram lavados para remoção das células não aderentes e foram acrescentadas as

diferentes concentrações das substâncias a serem testadas. Os poços controles

10 foram células cultivadas somente com meio de cultura e 2 mM de L-glutamina

(Rache) ou células cultivadas na presença do diluente das substâncias (DMSO,

Sigma). A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio do MTT (Hussain et ai.,

1993).

Manutenção de macrófagos: Macrófagos da linhagem J774 foram mantidos em

15 garrafas de cultura em 5 mi de meio DMEM com soro. No momento do uso, as

células foram contadas, ajustadas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB

na concentração de 3 x 105 células/ml e 500 µL dessa suspensão foi distribuída em

placa de 48 poços (Nunc, Denmark) para realização de ensaios do MTT (Hussain et

ai., 1993). Macrófagos foram obtidos também de lavado peritoneal de camundongos

20 Balb/c estimulados com tioglicolato 3%. Macrófagos peritoneais foram plaqueados

na proporção de 3 x 105 células /poço de placa de 24 poços com lamínulas. Os

macrófagos peritoneais foram infectados com formas promastigotas na fase

estacionária de crescimento, numa proporção de 1 O parasitas: 1 macrófago. A placa

foi incubada por 12 horas em estufa de a 37 ºC com atmosfera úmida contendo 7%

2s de C02 . Após 12 horas de infecção, os macrófagos foram "lavados" com solução

66175

salina com fosfatos (PBS, pH 7,2), para remoção dos parasitas não interiorizados.

Os macrófagos foram cultivados com RPMI suplementado com 2 mM del-glutamina,

na presença ou não de diferentes concentrações do(s) composto(s) e foram

mantidas em estufa a 37 ºC com atmosfera úmida contendo 7% de C02 por 1 dia.

s O "screening" das substâncias com atividade leishmanicida foi feito por método de

cultura direta sobre o parasita, inicialmente em promastigota, pois a avaliação em

amastigota é mais demorada e trabalhosa. Os derivados foram avaliados nas

concentrações de 100 µM (A) e 1 O µM (B) sobre o crescimento de formas

promastigotas de L. major (106 células/poços), conforme demostrado na figura 3.

10 A partir dos dados obtidos, a substância LASSBio-1491 foi selecionada como

representativa das séries (Figura 3) para a realização dos demais experimentos

sobre formas amastigotas e efeito leishmanicida in vivo.

Tabela 11. Efeito dos derivados hidrazida-N-acilidrazona da série Ili sobre a

viabilidade de macrófagos da linhagem J77 4 no ensaio de MTT e sobre formas

15 promastigotas de L. major.

Promasti otas de L~ rna or

Substância Citotóxicidade Ci11:otóxi cid:aid lndicede

CLSO e IC95º/,~ Máxima e Máxima (µM)' ( .. lo ;:t; erro (º/o± er-r"ô Seletivi;d.::u::le

adrão • CL50 -e IC95º/ori, adrão b

M~ltefosin.:~ > 100 NT 3.1 (2.3--3.8µM) 88.1±0.1·- 32

Pentiml idin;;::1 > 100 NT 0,8 (0,3 - 1 .3µM) 72,6 ± 2,0·· 125

Nffurt~mox > 100 NT 0.9(0,7-1,1µM) 94,1 ± 0,6--""' 111

74.1 (62.3-Nítrofur<>1zona 85,9) 77,8 ± 1.e- 0•100 NA

67175

A avaliação da atividade leishmanicida na forma promastigota do L. major dos

compostos da série Ili, indicou que LASSBio-1493, LASSBio-1703, LASSBio-1705,

LASSBio-1707, LASSBio-1708, LASSBio-1736, tiveram um alto índice de

seletividade para as células parasitárias, com destaque para a atividade de

s LASSBio-1493 e LASSBio-1705, que foram ativos na ordem de nM (nanomolar).

Tabela 12. Efeito dos derivados hidrazida-N-acilidrazona da série IV sobre a

viabilidade de macrófagos da linhegem J774 no ensaio de MTT e sobre formas

promastigotas de L. major.

Macrófa os

Substâricra CL5GeJC95%{~Ml'

Mil!efosina >100

Pentamidina > 100

Nifurtirnox .'> 100

Crtotoxicidade Máxima

%±erro adrão ~

NT

tlJT

NT

Nitrofurazona 74,1(62,3-85,9} 77,8± 1,9·~

LASSBio 1064 > 100 NT

Promas i otasd L ma·or

CL50 e fC95%•

3,1(2,3-3,8µM)

0,8 (0,3 - 1,3µM)

0,9(0,7-1,1µM)

>100

>100

Cltotóxicldade Máxima

%±erro adrão b

88,1±0,1''*

72,6± 2,0*'

94,1 ± O,ô"

NA NA

lridicede

Seletlvidade

32

125

111

68/75

Analisando os resultados encontrados para os compostos da série IV, podemos

destacar a atividade leishmanicida de LASSBio-1491, LASSBio-1706 e LASSBio-

1709, que possuíram eficácia similar aos padrões Miltefosina e Pentamidina.

De acordo com os resultados obtidos, os novos derivados hidrazida_N--

s acilidrazônicos apresentaram pronunciada atividade anti-promastigota contra L.

major, destacando-se os derivados LASSBio-1489, LASSBio-1490, LASSBi- 1699,

LASSBio-1493, LASSBio-1705, LASSBio-1706, LASSBio-1707, LASSBio-1708,

LASSBio-1709, LASSBio-1736, que apresentaram eficácia anti-leishmania similar ao

fármaco miltefosina, com destaque aos compostos LASSBio-1493 e LASSBio-1705

10 elevada potência leishmanicida na ordem de nM.

N itrofuzarona

1s Nitrocompostos podem exercer a sua ação leishmanicida por uma via de redução do

grupo nitro e à subseqüente interação dos produtos formados com biomoléculas

essenciais do parasito, gerando desta forma dano causado por estresse oxidativo. A

formação dos radicais livres provenientes do processo de biorredução do grupo nitro

pode resultar em peroxidação de membranas biológicas e proteínas, inibição de

20 enzimas e danos ao DNA (Paula et ai., 2009; Rando et ai., 201 O).

Observou-se que a nitrofuzarona apresenta toxicidade para macrófagos da linhagem

J774 (Tabela 10) com CL50 de 74, 1 (62,3 - 85,9) µMe efeito tóxico máximo de 77,8

± 1,9%, e não possui atividade leishmanicida contra formas promastigotas de L.

69175

major até a concentração de 100 µM, fato que evidencia a importância da porção

clorofenila e da subunidade aril-hidrazida de LASSBio-1491 para atividade anti­

promastigota contra L. major. Além disso, o derivado LASSBio-1491 não possui a

mesma ação deletéria que a nitrofuzarona para célula hospedeita (Tabela 12).

s O nifurtimox é um 5-nitrofurano que tem sido uma das alternativas farmacológicas

para o tratamento da doença de Chagas e outras tripanosmiases. No entanto, o

mecanismo de ação deste fármaco está parcialmente desvendado e envolve a

indução de estresse oxidativo (Wilkinson, 2011) devido à formação de radicais

nitroanion por nitroredutases, que na presença de oxigênio, gera intermediários

10 ativos tóxicos para o Ttypanosoma cruzi. A atividade leishmanicida do nifurtimox é

conhecida desde a década de 70 (Mattock & Peters, 1975). Como esperado, neste

trabalho observou-se a elevada potência e eficácia contra formas promastigotas de

contra L. major deste fármaco, com Cl50 de 0,9 (O, 1 - 1, 1) µM e efeito máximo de

94, 1±0,6%.

1s Após seleção de LASSBio-1491 como representaivo das séries de novos derivados

hidrazida N-acilidrazona foii avaliada seu efeito leishmanicida frente a outras

espécies de lelshmania. Para este fim, determinou-se sua concentração inibitória

50% (Cl50) (Tabela 12), no ensaio de viabilidade sobre formas promastigostas de L.

amazonensis, L. braziliensis e L. chagasi em várias concentrações (100, 50, 25, 1 O,

20 1, O, 1, 0,01, 0,001 e 0,0001 µM).

Para a realização dos experimentos de avaliação da atividade anti-promastigota das

substâncias, utilizou-se como fármacos de referência a miltefosina e pentamidina

para os ensaios com L. major e a pentamidina para as espécies de L. amazonenses,

L. brazi/iensis e L. chagasi. A miltefosina, uma análogo da lecitina, foi o primeiro

70175

fármaco a ser ativo por via oral para duas formas clínicas de leishmaniose (cutânea

e visceral) e seu mecanismo de ação parece envolver a inibição da biossíntese de

fosfatidilcolina no parasito e as reações adversas mais comuns associadas a

intervenção terapêutica inclui severa toxicidade gastrointestinal e aumento nos

s níveis de aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase e creatinina

(Berman, 2005; Bhattacharya et ai., 2007). Pentamidina tem sido usada como a

segunda linha de tratamento para as leishmaniones desde os anos 40. O

mecanismo de ação antileishmania da pentamidina, possivelmente inclui inibição da

biossíntese de poliaminas, ligação ao DNA, efeitos no potencial de membrana

10 interno mitocondrial, no entanto ainda não foi claramente definido (Bray et ai., 2003).

A alta toxicidade deste fármaco é um fator limitante de seu emprego terapêutico.

Dentre seus principais efeitos adversos e colaterais, estão a hipoglicemia,

hipotensão, alterações cardiológicas e nefrotoxicidade (Rath et ai., 2003).

Tabela 13. Determinação da potência e eficácia de derivados contra formas

15 promastigotas de L. major, L. amazonensís, L. brazílíensise L. chagasi.

Substãn- Ciso do crescimento e IC 95% (µM)ª Efeito Máximo± erro padrão(%

e concentração)b e ias Lm La Lb Lc Lm La Lb Lc

3, 1 (2,3 88,1 ±

Miltefosina -3,8 - - - 0,1** - - -µM)

0,8 (0,3 95,7 (84,4 25,5 11,9 74, Pentamidin

-1,3 -106,9 (20,3- (8,8- 72,6 ± 94,9± 68,8 ± 6±

a µM) nM) 30,7 15,0 2,0 ** 0,2 ** 0, 1** 0,2 µM) µM) **

7,5 (6,2 8, 1 (73,5 31,4 19,9 75,

LASSBio (17,2 - (19,4- 68,4 ± 80,0 ± 78,0 ± 7± 1491

-8,7 -88,4 45,6 20,4 0, 1 ** 1,4 ** 0,2** 0,4 µM) nM) µM) µM) **

3,7 (3,4 25, 1 LASSBio -4,0 0,8 (0,6 - (24,3- > 100 67,5 ± 94,6 ± 58,9 ± NA

1492 µM) 0,9 µM) 25,9 µM 0, 1 ** 0,4** 1,9** µM)

ª Concentração Inibitória de 50% calculada através de curvas concentração-resposta e o intervalo de confiança de 95%; b média do efeito ± erro padrão da média em triplicatas de um experimento representativo. Os valores de efeito máximo foram considerados significativos quando*p < 0,05, **p <

71/75

0,01 em relação ao grupo DMSO O, 1 %; NA: substância não apresenta atividade leishmanicida significativa até a concentração de 100 µM em relação ao grupo DMSO O, 1 %.

Lm (L. major), La, (L amazonenses), Lb(L. brazi/íensis); Lc (L. chagasí)

5 Os resultados obtidos sugerem que a substância apresentam um padrão de

atividade leishmanicida concentração independente. Tal atividade pode ser devido a

perda de seletividade e conseqüente interação com sistemas do parasito que

atenuem a atividade leishmanicida destes compostos. Além disso, LASSBio-1491

apresentou maior potência leishmanicida para as formas promastigotas das

10 espécies de L. major, L. amazonensis e L. chagasi. Para L. amazonensis LASSBio-

1491 apresentou maior potência leishmanicida que o fármaco pentamidina.

Sabe-se que diferenças de sensibilidade de compostos a várias espécies de

Leishmania têm sido relatadas na literatura. Escobar e colaboradores (2002), por

exemplo, demonstraram diferenças de sensibilidade analisando miltefosina,

15 edelfosina e anfotericina B em diferentes espécies desse parasito. Os autores

verificaram que as formas promastigotas e amastigotas de L. panamensis, L.

mexicana e L. major possuem menor sensibilidade à miltefosina e edefolsina do que

L. tropica, L. aetiopica, L. panamensis e L. donovani. Machado e colaboradores

(2007) observaram valores de lC5o de pentamidina contra formas promastigotas de

20 L amazonensis (strain MHOM/BR/77/LTB0016), L. braziliensis (MCAN/BR/98/R619),

L. chagasi (MCAN/BR/97/P142) e L. major (amostra de cachorro) de 4,7 ± 1,6, 13,4

± 1,4, 34,2 ± 2,5 e 11,5 ± 0, 1 µg/ml (determinação em câmara de Neubauer). Neste

estudo, verificamos que a pentamidina mostrou a seguinte ordem decrescente de

atividade contra formas promastigotas do parasito: L. amazonensis>L. major>L.

25 chagasi e L. braziliensis. A discordância entre os resultados encontrados neste

estudo e os dados observados por Machado e colaboradores (2007) com relação a

72/75

resposta leishmanicida da pentamídina contra L. major, L. amazonenses, L.

braziliensis e L. chagasi se deve ao uso de cepas diferentes e por diferenças

metodológicas no ensaio de avaliação da viabilidade de formas promastigotas.

Evidenciou-se que LASSBio-1491 possue atividade anti-promastigota contra todas

s as espécies (L major, L. amazonensis, L. braziliensis e L. chagas1): com efeito

máximo de 68,4±O,1, 80,0 ± 1,4, 78,0 ± 0,2, 75,7 ± 0,4 e potência de Ciso 7,5 (6,2 -

8,7 µM), 8, 1 (73,5 - 88,4 nM), 31,4 (17,2 - 45,6 µM), 19,9 (19,4 - 20,4 µM),

respectivamente.

Uma vez, tendo sido ativa contra as formas promastigotas de pelo menos três das

10 quatro espécies de Leishmania (L. major, L. amazonensis, L. braziliensis e L.

chagas1), a substância LASSBio-1491 foi selecionada para avaliação da atividade

leishmanicida em várias concentrações (100, 50, 25, 1 O, 1 e O, 1 µM) em modelo de

infecção em lamínula para mensurar a possível inibição sobre a forma intracelular do

parasito (amastigota) de L. major, visto que essa são as formas presentes no

15 hospedeiro vertebrado. A Tabela 14 expõe a Ciso bem como a eficácia máxima da

substância-teste em estudo contra formas amastigotas de L. major e para

diminuição do número de macrófagos infectados.

Tabela 14. Determinação da potência e eficácia máxima do derivado LASSBio-1491

20 e do padrão pentamidina no ensaio de viabilidade de formas amastigotas de L.

major.

Cl50 e IC 95% Efeito Máximo (l..1M)ª (% ± erro padrão)b

Substâncias Amastigotas de Macrófagos Amastigotas Macrófagos L. major infectados de L. major infectados

Pentamidina 11,8 (0-56,3) >100 63,2 ± 12,9* 42,5 ± 4,5*

LASSBio 1491

LASSBio 1492

7,9 (O- 18,7)

>100

73175

27,4 (O - 59,7)

>100

60,8 ± 1,9* 53,5 ± 2,5*

NA NA

ª Concentração Inibitória de 50% calculada através de curvas concentração-resposta e o intervalo de confiança de 95%; b média do efeito± erro padrão da média na respectiva concentração na qual se observou a resposta máxima em triplicatas de um experimento representativo. Os valores de efeito máximo foram considerados significativos quando*p < 0,05, **p < 0,01 em relação ao grupo DMSO

5 O, 1 %; NA: substância não apresenta atividade leishmanicida significativa até a concentração de 100 µM em relação ao grupo DMSO.

No ensaio para avaliar a taxa de infecção dos macrófagos, a substância LASSBio-

1491 apresentou-se muito eficiente em reduzir a infecção de macrófagos, bem como

10 número de amastigotas por macrófago com IC5o (IC95%) de 27,4 (O - 59,7) µM e

efeito máximo de 53,5 ± 2,5%. Além disso, essa substância-teste apresentou

eficácia contra amastigotas de L. major (porcentagem de inibição do crescimento de

amastigota de 60,8 ± 1,9%) similar a da pentamidina (63,1 ± 12,9%).

A substância LASSBio-1491, é uma hidrazida-N-acilidrazona nitrada (presença do

15 substituinte 4-nitrofurano na função imina). Por ser um nitrocomposto, é importante

considerar que essa substância também pode exercer a sua ação por uma via de

redução do grupo nitro (em meio aeróbico ou anaeróbico) e à subseqüente interação

dos produtos formados, a partir desta reação, com biomoléculas essenciais de

bactérias, fungos e parasitas. Assim, devido ao aumento da concentração

20 intracelular de nitrocompostos, maior quantidade de radicais livres é gerada e,

conseqüentemente, maior é o dano causado pelo estresse oxidativo. A formação

dos radicais livres provenientes do processo de biorredução do grupo nitro pode

resultar em peroxidação de membranas biológicas e proteínas, inibição de enzimas

e danos ao DNA (Paula et ai., 2009; Rando et ai., 201 O), não descartando-se a

25 possibilidade de eventos estarem correlacionados ao mecanismo de ação de

LASSBio-1491.

74175

Para verificar a real aplicação terapêutica das séries de derivados hidrazida-N­

acilid razonas foi selecionado LASSBio-1491, como represenativo das séries

estudadas, para determinar seu efeito leishmanicidain vivo. Para tanto, este

composto foi estudado em modelo murino de leishmaniose, utilizando como

s fármaco-padrão o antimoniato de meglumina (Glucantime®; 30 µmal/kg/dia, i.p.),

visto que o mesmo é conhecidamente ativo neste modelo e é um fármaco de

primeira escolha para o tratamento clínico da leishmaniose (Pereira et ai., 201 O). A

despeito do extenso uso do antimoniato de meglumina com continente americano

seu mecanismo de ação, da mesma forma que de outros antimanias pentavalentes,

10 como o estibogluconato de sódio, ainda permanece obscuro. Tem sido sugerido que

os antimoniais pentavalentes são pró-fármacos que são ativados a sua forma

trivalente através de redução intracelular (Baiocco et ai., 2009).

A Figura 4 mostra o resultado do tratamento na progressão da lesão na orelha

infectada com 105 promastigotas de L. major de camundongos Balb/c tratados com

15 PBS, antimoniato de meglumina (30 µmal/kg/dia, i.p.), LASSBio-1491 e o

intermediário de síntese: LASSBio-1492 (1 O µmal/kg/dia, i.p.).

Como pode ser observado na figura 4, a evolução das lesões do grupo submetido

apenas ao tratamento com LASSBio 1492 se mantém igual às do grupo controle

durante todo o experimento. Camundongos tratados com o antimoniato de

20 meglumina (30 µmol/kg/dia, i.p.) ou com LASSBio-1491 (1 O µmol/kg/dia, i.p.)

apresentaram uma redução no tamanho da lesão na terceira semana após o início

do tratamento (quarta semana de infecção, respectivamente).

Após 35 dias de tratamento os animais foram sacrificados e a carga parasitária foi

determinada nas orelhas infectadas e nos linfonodos drenantes dos animais tratados

75/75

com PBS, antimoniato de meglumina (30 µmol/kg/dia, i.p.) LASSBio-1491 e

LASSBio-1492 (ambos10 µmol/kg/dia, i.p.) (Figura 5A e 58).

Com relação à carga parasitária, observou-se que o antimoniato de meglumina e a

substância LASSBio-1491 foram capazes de diminuir o número de parasites na

s orelha, e que todos os tratamentos (antimoniato de meglumina, LASSBio-1491 e

LASSBio-1492) foram capazes de reduzir a carga parasitária no linfonodo drenante.

Os resultados obtidos no modelo de infecção in vivo mostram ainda que a despeito

de LASSBio-1492 não ter apresentado diminuição da espessura da lesão (resultado

da resposta pró-inflamatória), além de não ter sido evidenciada atividade anti-

10 amastigota em modelo de infecção de macrófagos em lamínula com L. major

(Tabela 14), ainda assim apresenta expressiva redução da carga parasitária no

linfonodo drenante.

Em conjunto estes resultados, permitiram destacar a substâncias LASSBio-1491

como um promissor protótipo a fármaco leishmanicida, pois apresentou atividade

15 anti-promastigota direta contra quatro espécies de Leishmania (L. major, L.

amazonensis, L. braziliensis e L. chagas1) e anti-amastigota contra L. major, também

foi capaz de diminuir o número de macrófagos infectados in vitro e aumentar a

produção de óxido nítrico por esses macrófagos, além de apresentar pronunciada

atividade leishmanicida in vivo contra L. major.

1/15

REIVINDICAÇÃO

1) COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, particularmente do

planejamento da série de compostos hidrazida-N-acidrazonas com o objetivo de

s gerar um princípio ativo para composições farmacêuticas voltadas ao tratamento de

Leishmaniose e/ou Doença de Chagas, CARACTERIZADO POR a substância

LASSBio-1491ser uma hidrazida-N-acilidrazona nitrada, presença do substituinte 4-

nitrofurano na função imina e pelo composto LASSBio-1492 ser 2-(2,4-

diclorobenzoil)hidrazidacarboxilato de fenila; obtém-se um novo padrão molecular

10 que conjuga as propriedades leishmanicida e tripanomicida, conforme representado

na estrutura molecular:

Formula 1 (isômeros E e/ouZ) , sendo x =O; s; NH; X1 =o; S:

NH; Ar= arila ou heteroarila com substituintes W1 e/ou W2 nas posições orto, e/ou

meta e/ou para; sendo W1 e W2 = grupos elétron retiradores e/ou elétron doadores,

15 sendo preferencialmente um grupo H, F, CI, Br, OCH3, OCH3, OC2H5, OCH(CH3)2,

OC(CH3)3; OCF3; N02; C02H; CN; CF3; CHF2; CHF2; NH2, NHCH3, NHC2H5,

NHCH(CH3)2, NH(CH3)3, N(C2H5)2, N(CH3)2, CH3; etila, propila, isopropila, butila,

sec-butila e ter-butila.

2) COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS de acordo com a reivindicação

20 1, CARACTERIZADO POR um nitrocomposto capaz de exercer a sua ação por uma

2115

via de redução do grupo nitro e à subseqüente interação dos produtos formados, a

partir desta reação, com biomoléculas essenciais de bactérias, fungos e parasitos; o

aumento da concentração intracelular de nitrocompostos, gera maior quantidade de

radicais livres.

s 3) COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de acordo com as

reivindicações 1 e 2, CARACTERIZADO POR os compostos LASSBio-1111

(leishmanicida) e LASSBio-1064 (tripanomicida), após hibridação da subunidade aril­

hidrazida de LASSBio-1111 com a acilidrazona funcionalizada de LASSBio-1064,

gerar um novo padrão molecular produzindo um composto que conjuga as

10 propriedades leishmanicida e tripanomicida.

4) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­

ACILIDRAZONAS, CARACTERIZADO POR o processo incluir o planejamento da

série de derivados hidrazida-N-acilidrazona funcionalizados, realizado mediante

hibridação molecular entre os protótipos LASSBio-1111 (leishmanicida) e LASSBio-

15 1064 (tripanomicida), mediante hibridação da subunidade aril-hidrazida de LASSBio-

1111 com a acilidrazona funcionalizada de LASSBio-1064, obtendo-se um novo

padrão molecular que conjuga as propriedades leishmanicida e tripanomicida,

5) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­

ACILIDRAZONAS, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO POR

20 eleição dos grupos 4-nitrofurano e 2-hidroxibenxeno como substituintes da função

imina em virtude da maior indicação destes substituintes para a atividade

farmacológica inferida, quando comparado aos demais substituintes,

3/15

6) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4 e 5, CARACTERIZADO

POR substituições por grupos isóstericos ou por grupos doadores e/ou retiradores

de elétrons conectados a um sistema aromático ligada a função imina da

s subunidade N-acilidrazona.

7) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5 e 6, CARACTERIZADO

POR as substâncias LASSBio1491 e LASSBio-1492 serem avaliadas quanto a

atividade leishmanicida em concentrações de 100, 50, 25, 10, 1 e 0, 1 µM, em

10 modelo de infecção em lamínula para mensurar a possível inibição sobre a forma

intracelular do parasito (amastigota) de L. major.

8) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6 e 7,

CARACTERIZADO POR a substância LASSBio-1491, e derivados, com

15 estéreoquímica E ou Z, ou ainda mistura de ambas, reduzir a infecção de macrófagos,

bem como número de amastigotas por rnacrófago.

9) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N­

ACl LIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção da 2,4-

20 diclorobenzohidrazida (48), de acordo com a fórmula molecular representada

abaixo incluir as seguintes etapas e parâmetros, ampliados ou reduzidos na

mesma proporção:

4/15

o

t.a./ 6h I 63%

CI CI 3'

(47) (48)

- 2,5g (12mmol) de 2,4-diclorobenzoato de metila (47);

- 25ml de etanol;

- 7.3 mi (0.146mols; 12eq) de N2H464%;

s - agitação em temperatura ambiente por 6 horas, ou até a indicação do término da

reação acompanhado por CCF (eluente: diclorometano:metanol 10%);

- redução do volume a vácuo;

- meio de precipitação;

- filtragem a vácuo;

10 - lavagem;

- o processo gera um produto sólido, com rendimento: 63%; PF=

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): o 9,62 ( s, 1 H, Hb); 7,62 (d, 1 H, H6', J= 2Hz);

7,46 (d, 1 H, H5', J= 2Hz); 7,43 (s, 1 H, H3'); 4,52 (s, 2H, NH2);

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): õ 164,73 (C=O); 134,61 (C2'); 134,45

1s (C4'); 131,57 (C6'); 130,48 (C1'); 129,13 (C3'); 127,23 (C5');

• IV (KBr) cm·1: 3309 (D NH); 1663 (D C==O); 1616 (õ N-H);

• Pureza (HPLC): 98.67%.

1 O) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

20 CARACTERIZADO POR metodologia de obtenção do 2-(2,4-

diclorobenzoil)hidrazidacarboxilato de fenila (LASSBio-1492) (49) de acordo

5115

com a fórmula molecular representada abaixo incluir as seguintes etapas e

parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

o o e:

H 2

N_,.....NH2 ()ºYc1 ~/"YºD, H I ~ o ... b o 61 #4 CI CI CHCls/ t.af 7h

80% 3· 5

(48) [49)

- 20 mi de clorofórmio;

s - 4,9ml de fenilcloroformato (6mmol; 1.2eq).

- agitação e adição vagarosa de, suspensão de 1 g (5mmols) de 2,4-

diclorobenzohidrazida em 50 mi de clorofórmio.

- agitação por 7 horas com total consumo do produto de partida,

acompanhada por CCF (eluente:diclorometano:metanol 5%).

10 - adição de 1 O mi hexano na reação, mantendo-a sob agitação;

- filtragem a vácuo e lavagem com hexano obtendo-se o produto 49 com

aspecto físico sólido PF=180-184ºC e Rendimento: 80%:

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J: õ 10,49 (s, 1H, Hb); 10,05 (s, 1H, Hc), 7,74 (d,

1 H, H6', J=2Hz); 7,58-7,14 (m, 5H, H3', H5', H2, H4 e H6); 6,89 (d, 2H, H3 e

1s H5, J=6 Hz);

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): õ 163,12 (Cd, C=O), 154,24 (Ca,

C=O); 150,61 (C2'); 135,42 (C4'), 133,15 (C6'); 131,71 (C1'); 130,54 (C1);

129,51 (C2 e C6); 129,45 (C3 e C5); 127,48 (C3'); 125,44 (C5'); 121,50 (C4);

• IV (KBr) cm-1: 3247 (D NH); 1741e1661 (D C=O); 1033 (D Ar-CI);

20 • Pureza (HPLC): 98.45%.

11) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção do LASSBio-1493, (50),

6115

representada de acordo com a fórmula molecular abaixo incluir as seguintes

etapas e parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

- 0,3g do intermediário 49, 7 mi de etanol, (até total solubilização);

s - 0.6ml de hidrazina hidrato 80% (18mmols;20 eq);

- após o fim da reação por CCF (eluente: diclorometano:metanol 5%);

- redução do volume reacional em rotaevaporados;

- formação de precipitado,que foi filtrada a vácuo sendo obtido o produto com

rendimento de 62%; Aspecto físico sólido e PF=190-194ºC;

10 • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6): õ 1O,17 (si, 1 H, Hb); 8,24 (s, 1 H, Hc); 7,70 (d,

1H, H6'); 7,60-7,50 (m, 3H, H3', H5'e He); 4,15 {s, 2H, Nl:hl;

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,08 (Ca, C=O); 159,38 ( Cd, C=O);

135,05 (C2'); 133,57 (C4'); 131,75 (C6'); 130,89 (C1 '); 128,38 (C3'); 127,21

(C5');

15 • IV (KBr) cm·1: 3297 (D NH); 1698 (O C=O); 1651 (óN-H); 1041 (DC-CI);

• Pureza (HPLC): 97,56%.

12) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção do (E)-1-(2-

20 hidroxibenzilideno)-5-(2,4-diclorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1705)

(42a), de acordo com a fórmula molecular abaixo, incluir as seguintes etapas e

7/15

parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

o

CI (501

EtOHI Hclc•tl t.a. 78%

- obtenção do composto 42a a partir da condensação da hidrazida 50 com 2-

hidroxbenzaldeído com rendimento de 78% com aspecto físico sólido e PF= 210-

s 213ºC;

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J õ (ppm): o 10,66 (s, 1 Hb); 1O,16 (s, 1 Hc);

10,03 (s, 1 H, OH); 9, 11 (s, 1 H, He); 8,23 (s, 1 H, N=CH); 7,92 (d, 1 H, H6', J=

8); 7,73 (s, 1H, H3'); 7,60 (m, 2H, H2 e H5'); 7,20 (t, 1H, H4, J=6); 6,90-6,80

(m, 2H, H3 e H5);

10 • RMN 13C (50 MHz, DMSO·d6) õ (ppm): 165,3 (Cd, C=O); 155,9 (Ca, C=O);

154,8 (N=CH); 139,1(C6);135,1(C2');133,5 (C4'); 131,7 (C6'); 130,8 (C2);

130,5 (C1'); 129,4 (C4)127,3 (C3'); 127,1(C5');120,3 (C1); 119,1(C5);116,0

(C3);

• IV (KBr) cm-1: 3436-1852 (D OH); 3232 (D NH); 1708 (D C=O); 1655 (õ N-H);

15 1046 (DC-CI);

• MS (m/z): 365;

• Pureza (HPLC): 99.83%.

13) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N·

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

20 CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção do (E)-1-(3·

hidroxibenzilideno)·5-(2,4·diclorobenzoil)carbonohidrazida LASSBio·1708)

(42b), de acordo com a fórmula molecular abaixo, incluir as seguintes etapas e

parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

CI

8/15

e e H

H H /Nyd N'- # N N

H

b o

1601 EtOH/ Hclca1f t.a.

r 95% (42b) OH

- obtenção do composto 42b a partir da condensação da hidrazida 50 com 3-

hidroxibenzaldeído em rendimento de 95%, resultando em produto de aspecto físico

sólido e PF= 223-225ºC;

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J õ (ppm): õ 10,62 (s, 1Hb); 10,12 (s, 1Hc); 9,48

10 14)

(s, 1 H, OH); 9,05 (s, 1 He); 7,80 (s, 1 H, N=CH); 7,71 (s, 1 H3'); 7,70-7,50 (m,

2H, H5'e H6'); 7,18 (t, 3H, H2, H3 e H4); 6,76 (d, 1H6);

• MS (m/z): 365;

• Pureza (HPLC): 98.58%.

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

AClLIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção do (E)-1-(4-

hidroxibenzilideno)-5-(2,4-diclorobenzoil)carbonohidrazida (LASSBio-1707)

(42c), conforme fórmula molecular abaixo, incluir as seguintes etapas e

15 parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

Cl

9/15

- obtenção do composto 42c a partir da condensação da hidrazida 50 com 4-

hid roxibenzaldeído em rendimento de 90%, resultando em produto de aspecto físico

sólido e PF= 225-227°C;

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): õ 10,53 (s, 1H, Hb); 10,16 (s, 1H, Hc);

s 9,83 (s, OH); 9,05 (s, 1 He); 7,84 (s, 1 H, N=CH); 7,76 (s, 1 H, 1 H3'); 7,67 (d,

2H, H2 e H6, J=1 O Hz); 7,58 (m, 2H, H5'e H6'); 6,82 (d, 2H, H3 e H5,

J=10Hz);

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,3 (Cd, C=O); 158,7 (Ca, C=O);

155.0 (N=CH); 141,2 (C4); 135,1 (C2')133,6 (C4'); 131,7 (C6'); 130,8 (C1 ');

10 129,4 (C1); 128,5 (C2 e C6); 127.3 (C3'); 125,5 (C5'); 115,41 (C3 e C5);

• IV (KBr) cm-1: 3362 (D NH); 1694 (D C=O); 1651 (õN-H); 1098 (DC-CI);

• MS (m/z): 365;

• Pureza (HPLC)= 99,84%.

15) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

1s ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção do (E)-1-(4-

(trifluormetil)benzilideno)-5-(2,4-diclorobenzoil)carbonohidrazida LASSBio-

1736) (42d), conforme fórmula molecular abaixo, incluir as seguintes etapas e

parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

o e e H H H

EtOHI Hei'"/ t.a. (50) 58%

/Nyd N......_ .Q 1 ~ N b o 4

CI

(42d) 5

20

10115

- obtenção do composto 42d a partir da condensação da hidrazida 50 com 4-

triflorometilbenzaldeído em rendimento de 58%, resultando em produto com aspecto

físico sólido e PF= 213-216ºC;

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J õ (ppm): õ 10,93 (s, 1H, Hb); 10,17 (s, 1H, Hc);

s 9,34 (s, 1 H, He); 8,07 (d, 2H, H3 e H5, J=1 OHz); 7,97 (s, 1 H, N=CH); 7,77 (s,

1 H, H3'), 7,74 (m, 2H, H2 e H6); 7,55 (m, 2H, H5'e H6');

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,33 (Cd, C=O); 154,71 (Ca, C=O);

139.19 (N=CH); 138,54 (C4); 135,20 (C3 e C5); 133,59 (C2 e C6); 131,77

(C2'); 130,80 (C4'); 128,68 (C6'); 128,05 (C1'); 127,45 (C3'); 127,36 (C5');

10 125,38 (C1); 121,47 (CF3);

• IV (KBr) cm·1: 3555 (D NH); 1703 (D C=O); 1655 (õN-H); 1015 (DC-CI); 1164-

1105 (C-F);

• MS (m/z): 417;

• Pureza (HPLC): 99.84%.

1s 16) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção do (E)-1-(2,4-

diclorobenzoil)-5-((5-nitrofuran-2-il)metileno)carbonohidrazida (LASSBio-1703)

(42e), conforme fórmula molecular abaixo, incluir as seguintes etapas e

20 parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

o

CI [50) EtOHI Hcl 001 / t.a.

87%

o e e H

3 (42e)

11115

- obtenção do composto 42e a partir da condensação da hidrazida 50 com 2-

nitrofuraldeído obtendo rendimento de 87%;

- recristalização com etanol, gerando produto de aspecto físico sólido e; PF= 222-

225ºC

s • RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 11.22 (s, 1 H, Hb) 10,22 (s, 1 H, Hc);

9.18 (s, 1 H, He); 7.86 (s, 1 H, N=CH); 7.79 (d, 1 H, H3, J= 4Hz); 7.71 (s, 1 H,

H3'); 7.57 (m, 2H, H5'e H6'); 7.32 (d, 1H, H4, J=4 Hz);

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,2 (Cd); 154,0 (Ca); 152,7 (C2);

151,2 (N=CH); 135, 1 (C2'); 133,3 (C4'); 131,7 (C1); 130,7 (C6'); 129,3 (C5');

10 129,1(C1');127,2 (C3'); 115,0 (C3); 112,5 (C4);

• IV (KBr) cm·1: 3387 (D NH); 1727 (D C=O); 1667 (õN-H); 1015 (DC-CI); 1244

e 1281 (N=O);

• MS (m/z): 384;

• Pureza: 99.33%.

1s 17) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

20

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção dos derivados hidrazida-N-

acilidrazonas da série Ili (43 a-f), conforme fórmula molecular abaixo, incluir as

seguintes etapas e parâmetros, ampliados ou reduzidos na mesma proporção:

o

Cl

(54)

H li .......... NYlll' N NH2

H O EtOHI HCl~•t __....,. w-ArCOH/ta. CI

- O, 1g do intermediário 54, foram adicionados;

H

~/~'-1(~'-NA_Ar•W o {43 a-f)

- agitação em temperatura ambiente, 10ml de etanol e 0.43mmol (1eq) de aldeído;

12/15

- ácido clorídrico concentrado;

- solução sob agitação por 1-4 horas, quando CCF (diclorometano: metanol 5-10%),

ou até indicar o termino da reação;

- redução do volume do meio reacional a pressão reduzida (2/3 do volume);

s - adição de gelo e precipitação do produto;

- filtragem a vácuo e lavagem com água gelada.

18) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-

ACILIDRAZONAS, de acordo com as reivindicações 4, 5, 6, 7 e 8,

CARACTERIZADO POR a metodologia de obtenção do (E)-1-(4-clorobenzoil)-5-

10 ((5-nitrofuran-2-il)metileno)carbonohidrazida (LASSBio-1491) (43e), conforme

fórmula molecular abaixo, incluir as seguintes etapas e parâmetros, ampliados

ou reduzidos na mesma proporção;

o

{-~y~' •• , ·3tr--. 1

o ...... EtOHI l-lcl""t/ t.a. CI 4'

3.

o e e H

H H /Nyd N....._ _,ç:. ~ N b o

Cl

(54) 41\/87% (43e)

- obtenção do composto 43e a partir da condensação da hidrazida 54 com 2-

15 nitrofuraldeído em rendimento de 87%;

- recristalização do composto com etanol, gerando produto de aspecto físico sólido e

PF= 217-220ºC;

• RMN 1H (200 MHz, DMSO-d6J: õ 11,24 (s, 1H, Hb), 10,39 (s, 1H, Hc); 9,12 (s,

1 H, He); 7,91 (m, 3H, N=CH e H2'e H6'); 7,80 (d, 1 H, H3, J=4); 7,58 (d, 2H,

20 H3 'e H5', J=8); 7,31 (d, 1 H, H4, J=4);

13/15

• RMN 13C (50 MHz, DMSO-d6) õ (ppm): 165,32 (Cd, C=O); 154,57 (Ca, C=O);

152,84 (N=CH); 152,40 (C2); 136,69 (C4'); 131,38 (C1 '); 129,38 (C2'e C6');

129,22 (C1); 128,62 (C3'e C5'); 115, 16 (C3); 112,62 (C4);

• IV (KBr) cm-1: 3246 (D NH); 1659 e 1504 (D C=O); 1596 e 1351 (ó Ar-N02);

5 1015 (o Ar-CI);

• MS (m/z): 350;

• RMN 1H com troca por D20(500 MHz, DMSO-d6): 7,96 (m, 3H, N=CH e H2'e

H6'); 7,81(s, 1H, H3); 7,66 (d, 2H, H3'e H5', J::::10Hz); 7,32 (s, 1H, H4);

• Pureza( HPLC): 98.31%.

10 19) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS,

CARACTERIZADO POR a avaliação dos compostos revelar atividade tripanomicida

para os compostos LASSBio-1703 e LASSBio-1491, das séries Ili e IV.

20) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO POR a avaliação da atividade

1s leishmanicida na forma promastigota do L. major dos compostos da série Ili,

assinalar que LASSBio-1493, LASSBio-1703, LASSBio-1705, LASSBio-1707,

LASSBio-1708, LASSBio-1736, possuem alto índice de seletividade para as células

parasitárias.

21) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

20 acordo com as reivindicações 18 e 19, CARACTERIZADO POR a atividade de

LASSBio-1493 e LASSBio-1705 serem na ordem de nM.

22) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com as reivindicações 18, 19 e 20, CARACTERIZADO POR a avaliação

da atividade leishmanicida na forma promastigota do L. major dos compostos da

14/15

série IV, revelar atividade leishmanicida de LASSBio-1491, LASSBio-1706 e

LASSBio-1709, semelhantes aos padrões Miltefosina e Pentamidina.

23) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com as reivindicações 18, 19 e 20, CARACTERIZADO POR o derivado

s LASSBio-1491 possuir_atividade anti-promastigota contra todas as espécies (L

major, L. amazonensis, L braziliensis e L. chagas1).

24) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com as reivindicações 18, 19 e 20, CARACTERIZADO POR LASSBio-

1491 apresentar potência maior que a pentamidina contra promastigotas de L.

10 amazonensís.

25) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com as reivindicações 18, 19 e 20, CARACTERIZADO POR atividade anti­

promastigota do derivado LASSBio-1492, intermediário sintético, ativo para as

espécies de L major, L. amazonensis e L. braziliensis.

1s 26) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com as reivindicações 18, 19 e 20, CARACTERIZADO POR o composto

LASSBio-1492, intermediário sintético, apresentar eficácia máxima anti-promastigota

para L. major, L. amazonensis e L. braziliensis, correspondente aos dos fármacos­

padrões miltefosina e pentamidina.

20 27) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com as reivindicações 18, 19, 20, 23, 24 e 25, CARACTERIZADO POR

serem ativas contra as formas promastigotas de pelo menos três das quatro

15/15

espécies de Leishmania (L. major, L. amazonensis, L. braziliensís e L. chagas1), as

substâncias LASSBio-1491 e LASSBio-1492.

28) USO DE COMPOSTOS A PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, de

acordo com as reivindicações 18, 19, 20, 23, e 26, CARACTERIZADO POR a

s substância LASSBio-1491 e derivados com estéreoquímica E ou Z, ou ainda mistura

de ambas diminuir o número de macrófagos infectados in vítro e aumentar a

produção de óxido nítrico por esses macrófagos, além de apresentar pronunciada

atividade leishmanicida in vivo contra L. major.

29) COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA TRATAMENTO DE

10 LEISHMANIOSE E DOENÇA DE CHAGAS, CARACTERIZADO POR a substância

LASSBio-1491 e derivados congêneres (Formula 1), com estéreoquímica E e/ou Z,

ou ainda mistura de ambas ser um protótipo a fármaco leishmanicida, em virtude da

atividade anti-promastigota direta contra quatro espécies de Leíshmania (L. major, L.

amazonensis, L. braziliensis e L. chagas1) e anti-amastigota contra L. major.

Outros Medicamentos

1.535

1/5

FIGURA 1

18 Doenças Tropicais

Tuberculose

3

1,3°/o

A.

B.

T.cruzi 55 Mb

12. 000 genes

L.brasiliensis 32 Mb

8.153 genes

215

FIGURA 2

3.736

49

910

L.major 33 Mb

8.298 genes

1.392

27

71

5

L.major 33 Mb

8.298 genes

T.brucei 25 Mb

9.068 genes

L.infantum 32 Mb

8.154 genes

Nº de promastigotas x 106/ml

o

1 Controle

DMS00,1% Miltefosina

Pentamidina LASSBio 1481 LASSBio 1482 LASSBio 1483 LASSBio 1484 LASSBio 1485 LASSBio 1486 LASSBio 1487 LASSBio 1488 LASSBio 1489 LASSBio 1490 LASSBio 1197 LASSBio 1198 LASSBio 1199 LASSBio 1201 LASSBio 1202 LASSBio 1203 LASSBio 1204 LASSBio 1205 LASSBio 1206 LASSBio 1207 LASSBio 1208 LASSBio 1210 LASSBio 1213 LASSBio 1302

LASSBio 1303

-->.

o 1

[\,) o

(j) CD· ...... CD

(;,,) o

(j) CD' ~­CD

-OJ -

Nº de promastigotas x 106/ml

o -->.

o [\,) o

Controle ~=======:;--;--:;:-----' DMS00,1% H:it

Miltefosina Pentamídína

LASSBío 1481 F= '

LASSBlo 14821 1

LASSBio 1483: H LASSBio 1484 \-4 LASSBio 1485

LASSBio 1486 r-------=u , LASSBio 1487 ~ 1

LASSBio 1488 r----,

LASSBio 1489 hJ , LASSBio 1490 ~* LASSBio 1197 ' * LASSBio 11981 1

LASSBio 1199 : )-1 LASSBio 1201 H LASSBio 1202 I======;-;-" -LASSBio 1203 , LASSBio 1204 LASSBio 1205 I========-._, LASSBio 1206 I========-.:.----, LASSBio 1207 LASSBio 1208

1

, , LASSBio 121 O : ] LASSBio 1213 H L LASSBio 1302

LASSBio 1303 !-----------'

(j) CD· ~­CD

w o

~ -

(j) CD• ~­CD

11 -G) e ;a )> (..V

w --01

4/5

Q)

Q) -a c.n ro Q) ~ !.... Q) o '­

::= o (/) -~o ro ...... o. ro Q) ~ -a _J

o z

-a o C/) "C Q) o '-e .9 o 2 ·--""' (/) = "" ro - e ro º ~ e. ·rn-c Q) E -a .

o _J

z

(A)

1000000

750000

500000

250000

o

(B)

150000

100000

50000

o

515

FIGURAS

CJ Veículo

r::zz:z21 Antimoniato de meglumina (30 µmo/kg, i.p.)

~ LASSBio 1491 (30 µmo/kg, i.p.)

lillTI] LASSBio 1492 (30 µmo/kg, i.p.)

:::::::::: ::::::::::

CJ Veículo

ººººº ººººº ººººº ººººº o o o o o QOOOO

ººººº

r::zz:z21 Antimonista de meglumina (30 µmo/kg, i.p.)

~ LASSBio 1491 (30 µmo/kg, i.p.)

lill:TIJ LASSBio 1492 (30 µmo/kg, i.p.)

00000 o o o o o 00000 00000

1/1

RESUMO

COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO DE

COMPOSTOS HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS, USO DE COMPOSTOS A

PARTIR DE HIDRAZIDA-N-ACILIDRAZONAS PARA TRATAMENTO DE

s LEISHMANIOSE E DOENÇA DE CHAGAS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

OBTIDAS, particularmente descreve a obtenção de inibidores de cisteína

proteinases envolvidas nos processos infecciosos causados pelos parasitas

Trypanossoma cruzi e Leishmania sp. Ou seja, a invenção trata do planejamento da

série de compostos hidrazida-N-acidrazonas com o objetivo de gerar um princípio

10 ativo para composições farmacêuticas voltadas ao tratamento de Leishmaniose e

Doença de Chagas; o planejamento da série de derivados hidrazida-N-acilidrazona

funcionalizados (séries Ili e IV) é realizado mediante hibridação molecular entre os

protótipos LASSBio-1111 (leishmanicida) e LASSBio-1064 (tripanomicida) mediante

hibridação da subunidade aril-hidrazida de LASSBio-1111 com a acilidrazona

1s funcionalizada de LASSBio-1064, obtendo-se um novo padrão molecular que

conjugando as propriedades leishmanicida e tripanomicida.