RESULTADOS E DISCUSSOInicialmente para realizao da prtica foi necessrio diluir a concentrao do p-Nitrofenol (pNP), que era inicialmente de 0,04g/L. Diluiu-se este valor para diversas concentraes, seguindo modelo de clculo abaixo para a concentrao de 0,001g/L:

Assim, pipetou-se 1,25mL de pNP 0,04g/L, e diluiu-se este volume num balo volumtrico de 50mL com tampo fosfato 100mM (pH = 8).

Para as demais concentraes foi realizado o mesmo clculo e obteve-se as concentraes de 0,002g/L, 0,004g/L, 0,006g/L, 0,008g/L e 0,01g/L.

Com esses dados, foram lidas as absorbncias ( = 410nm) referentes a cada concentrao, para que fosse traada uma curva padro para o p-Nitrofenol. Os dados de absorbncia esto dispostos da tabela 1 abaixo.

Tabela 1 Dados de absorbncia por concentrao (g/L).Amostras (g/L)Absorbncia

0 (branco)0

0,0010,108

0,0020,211

0,0040,420

0,0060,642

0,0080,830

0,011,033

O grfico para estes resultados est na figura 1 abaixo. Figura 1 Grfico da relao entre Absorbncia e Concentrao.Pela figura 1, obtm-se a equao da reta que retrata essa relao linear, exibida na mesma.

Assim, iniciou-se a reao enzimtica, adicionando-se 0,2mL de enzima diluda (0,1 ml de enzima/ 100 ml de soluo), e com o passar do tempo analisou-se a absorbncia que a soluo de amostra possui-a, retirando alquotas de 2mL. Os dados de absorbncia esto descritos na tabela 2 abaixo.

Tabela 2 Relao da Absorbncia pelo tempo de reao.Tempo (min)Absorbncia

0 (branco)0

3,00,129

4,50,160

6,00,192

9,00,263

10,50,295

12,00,326

13,50,364

A partir da equao da reta da curva padro, pode-se calcular a concentrao de pNP que ainda est presente no meio.

No ponto (0,0), a absorbncia lida pelo espectrofotmetro foi de 0,120, mas como o mesmo j define este como sendo o nosso branco, ele retira este valor das leituras seguintes, passando a ser ponto de absorbncia 0. Ento, para fins de clculo de concentrao, utilizaremos o valor de absorbncia 0,120. Este clculo foi feito segundo modelo abaixo:

Para os outros pontos o mesmo tipo de clculo foi utilizado, sendo encontradas as concentraes na tabela 3 abaixo.

Tabela 3 Valores de concentraoTempo (min)AbsorbnciaConcentrao (g/L)Concentrao (g/mL)

0 (branco)01,110 x10-3111000,00

3,00,1291,198 x10-31197894,02

4,50,1601,497 x10-31497367,53

6,00,1921,806 x10-31806501,47

9,00,2632,492 x10-32492392,40

10,50,2952,801 x10-32801526,35

12,00,3263,101 x10-33100999,85

13,50,3643,468 x10-33468096,40

Com estes dados, traa-se o grfico 2 abaixo.

Figura 2 - Grfico da relao entre Concentrao e tempo.

Atravs da figura 2 encontra-se a equao da reta para este grfico, e percebe-se que o coeficiente angular desta, A=235987g/mL.min, para encontrar o coeficiente angular em mol pNP/mL.min. Sabendo que a massa molar do pNP de 139,11 g/mol, faz-se o seguinte clculo:

Como a atividade enzimtica especfica tem unidades de UI/g ou UI/mL, onde UI=mol/min, assim temos que, a atividade enzimtica da Lipase Cndida antactica ser:

Outra maneira de calcular a atividade lipoltica desta enzima, atravs de uma curva de calibrao do pNP em concentrao molar (mol/L), para se obter o coeficiente de absortividade molar no p-nitrofenol. Posteriormente, realizar a reao enzimtica, e de posse dos diferentes resultados de absorbncia obtidos pela reao qumica ao longo do tempo, calcular o fator desta curva. Com esses dados em mos, e atravs da frmula desenvolvida por Menoncin et al (2009), calcula-se, finalmente, a atividade de hidrlise enzimtica.Ento, para esse procedimento, inicia-se traando a curva padro que possui a relao absorbncia versus concentrao molar. As concentraes molares utilizadas so encontradas atravs do seguinte modelo de clculo:

Este mesmo clculo foi feito para as outras concentraes da tabela 1. Como os valores de concentrao no mudaram, os valores de absorbncia permanecem os mesmos, e estes esto dispostos da tabela 4 abaixo.Tabela 4 - Dados de absorbncia por concentrao molarAmostras(M)Absorbncia

00

7,188x10-60,108

1,437x10-50,211

2,875x10-50,420

4,313x10-50,642

5,751x10-50,830

7,188x10-51,033

Ento, traa-se a curva de calibrao disposta na figura 2 abaixo.

Figura 3 Grfico da relao entre Absorbncia e Concentrao molar

Com a equao da reta deste grfico, encontra-se o coeficiente de absortividade molar do pNP nas condies do experimento, que o coeficiente angular da figura 3 acima.

Aps a realizao da reao enzimtica, as absorbncias obtidas sero as mesmas expostas na tabela 2. E assim, traa-se um grfico de absorbncia em relao ao tempo, que est na figura 4 abaixo.

Figura 4 Grfico da relao entre Absorbncia e tempo.

Para este grfico a equao de reta obtida est disposto na figura 4. Seu coeficiente angular ser o fator da curva Abs x tempo, que nos ajudar a calcular a atividade enzimtica.

Enfim, aplicando a frmula de Menoncin et al (2009) abaixo, encontra-se a atividade de hidrlise.

Nesta frmula, tm-se que:

A = atividade de hidrlise (U);F = Fator da curva obtido do grfico Abs x tempo;VF = Volume total (amostra+tampo+substrato)(30mL);CC = Coeficiente da curva de calibrao;VA = Volume da alquota (substrato).

Substituindo valores, encontra-se que: