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DÂMASO DE ARAÚJO CHACON
BIODISTRIBUIÇÃO DO RADIOFÁRMACO PERTECNETATO DE
SÓDIO (Na99mTcO4) EM RATOS SUBMETIDOS À RESSECÇÃO
EXTENSA DO INTESTINO DELGADO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências da Saúde do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, para a obtenção do título
de Doutor em Ciências da Saúde.
Natal - RN 2007
DÂMASO DE ARAÚJO CHACON
BIODISTRIBUIÇÃO DO RADIOFÁRMACO PERTECNETATO DE
SÓDIO (Na99mTcO4) EM RATOS SUBMETIDOS À RESSECÇÃO
EXTENSA DO INTESTINO DELGADO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências da Saúde do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, para a obtenção do título
de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Natal - RN 2007
Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do CCS
C431b Chacon, Damaso de Araújo. Biodistribuição do pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) em ratos
submetidos à ressecção extensa de intestino delgado / Damaso de Araújo Chacon. – Natal, RN, 2007.
68 f. : il.
Orientador: Aldo da Cunha Medeiros.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
1. Síndrome do intestino curto - Tese. 2. Cirurgia - Tese. 3. Intestinos - Tese. 4. Pertecnatato Tc 99m de sódio – Tese. 5. Ratos Wistar –Experiência – Tese. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 616.341(043.2)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTECENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da
Saúde
Dâmaso de Araújo Chacon
BIODISTRIBUIÇÃO DO RADIOFÁRMACO PERTECNETATO DE
SÓDIO (Na99mTcO4) EM RATOS SUBMETIDOS À RESSECÇÃO
EXTENSA DO INTESTINO DELGADO
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros – UFRN - Presidente
Prof. Dr. Adenilson de Souza da Fonseca – UERJ
Prof. Drª. Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho - UFPE
Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito - UFRN
Prof. Drª. Lúcia de Fátima Campos Pedrosa - UFRN
Aprovada em: 15/08/07
v
DEDICATÓRIA
Para Leila,
Gustavo e Paulo Eduardo
que acompanharam com compreensão
esta etapa da minha vida.
vi
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todas as pessoas que contribuiram para a
conclusão deste trabalho.
Primeiramente, ao Professor Doutor Aldo da Cunha Medeiros pelo
apreço e inestimável orientação, cujos ensinamentos foram pautados por
competência, respeito, amizade e sobretudo atenção. Seu entusiasmo pela
pesquisa contagia a todos que têm o privilégio de ser seus alunos. Seu perfil de
pesquisador marca compromissos com a ética e a verdade científica.
Ao Professor Doutor José Brandão Neto, pela perseverança de
implantar um Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde na UFRN,
sonho alentado há tempo por professores desta instituição. Sua competência,
dedicação e esforço permitiram ultrapassar as inúmeras dificuldades na
consolidação de uma pós-graduação deste porte.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde – PPgCSa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte pelas condições oferecidas
durante o doutorado.
Ao Professor Doutor Mário Bernardo Filho (UERJ) pelo respaldo
científico na área do nosso estudo e pelas informações valiosas sempre que
solicitadas.
À Professora Doutora Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho
(UFPE), pela disponibilidade e entusiasmo de nos iniciar nas primeiras noções
da Radiobiologia.
vii
Tenho uma dívida de gratidão com os colegas Irami Araújo Filho pela
inestimável colaboração cirúrgica e a Amália Cínthia Meneses do Rêgo que
sempre encontrava tempo para colaborar ao longo de todo o trabalho.
Agradeço a valiosa e criteriosa colaboração de Ítalo Medeiros Azevedo
sempre disponível nos experimentos, nas análises estatísticas e no manuseio
do contador gama.
Também devo agradecimentos ao Doutor Arthur Villarin Neto por
disponibilizar material indispensável à minha pesquisa e pelos conselhos
valiosos em medicina nuclear.
A bióloga Kércia Regina Santos Gomes Pereira e a biomédica Maria
Kádja Menezes Tôrres Açucena, pelo apoio prestado e competência no
preparo do material radioativo.
A Francisca Vieira de Almeida pela responsabilidade e dedicação no
trato dos animais.
Às funcionárias da Secretaria da Pós-graduação em Ciências da Saúde,
Danielli Queiroz Lopes, Patrícia de Sousa Campos e Leilane Aquino de Paiva
pela eficiência no atendimento.
Ao amigo Ronaldo Pinheiro Gomes Mafra que dedicou seu precioso
tempo na leitura e correção do português.
E finalmente a todos os amigos que comentaram o manuscrito de forma
útil e incentivadora.
viii
SUMÁRIO
Dedicatória ......................................................................................................... v
Agradecimentos ................................................................................................ vi
Listas................................................................................................................. ix
Resumo............................................................................................................xiii
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 1
2 REVISÃO DA LITERATURA....................................................................... 3
2.1. Medicina Nuclear ........................................................................................ 3
2.2. Síndrome do Intestino Curto ....................................................................... 5
3 ANEXAÇÃO DOS ARTIGOS ...................................................................... 8
3.1. ARTIGO I – Biodistribuição do radiofármaco pertecnetato de sódio
(Na99mTcO4) em ratos submetidos a ressecção extensa de intestino
delgado ...................................................................................................... 8
3.2. ARTIGO II – Glucan and Glutamine Reduce Bacterial Translocation in Rats
Subjected to Intestinal Ischemia – Reperfusion........................................ 20
3.3. ARTIGO III - Efeitos das vitaminas A e C em anastomoses intestinais de
ratos tratados com corticosteróide1 .......................................................... 32
3.4. ARTIGO IV - Achados da fundoscopia e alterações do pé diabético em
pacientes do Hospital Universitário Onofre Lopes/UFRN1 ....................... 41
4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES ....................................... 50
4.1. Identificação do Tema............................................................................... 50
4.2. Comentário sobre a Metodologia .............................................................. 51
4.3. Méritos e Contribuições............................................................................. 52
4.4. Metas Futuras ........................................................................................... 53
5 REFERÊNCIAS......................................................................................... 55
Abstract
Apêndice
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Apresentação esquemática do gerador 99Mo/99mTc ........................ 04
Gráficos 1 a 14 - Box plots comparativos da biodistribuição de Tc99m para cada
órgão e seus referidos grupos.......................................................................... 61
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Radioisótopos para diagóstico ........................................................ 03
xi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
%ATI Percentagem de radioatividade
%ATI/g Percentagem de radioatividade por grama
11C Carbono com número de massa 11
CPM Contagem por minuto
99Cu Cobre com número de massa 99
DMSA Ácido dimercaptosuccínico
DP Desvio padrão
DTPA Ácido dietilenotriaminopentacético
EGF Fator de crecimento epidérmico
18F Flúor com número de massa 18
67Ga Gálio com número de massa 67
GH Hormônio do crescimento
GLP-2 Glucagon tipo peptídeo 2
HIDA Ácido imunodiacético hepático
123I Iodo com número de massa 123
124I Iodo com número de massa 124
131I Iodo com número de massa 131
IC Intestino curto
111 In Isótopo instável do índio com número de massa 111
KeV Quiloeletrovolt
MBq Megabequerel
MDP Ácido metilenodifosfônico
99Mo Molibdênio com número de massa 99
99MoO4-2 Íon molibdato
xii
13N Nitrogênio com número de massa 13
NaCl Cloreto de sódio
Na99mTcO4 Pertecnetato de sódio
15O Oxigênio com número de massa 15
PYP Pirofosfato
Sn+2 Íon estanoso
Tc Tecnécio
99Tc Tecnécio com número de massa 99
99mTc Tecnécio metaestável com número de massa 99
VC - 99mTc Veneno de Crótalus marcado com tecnécio
DMSA -99mTc Ácido dimercaptosuccínico marcado com tecnécio
E.coli -99mTc Escherichia coli marcada com tecnécio
SAH -99mTc Sôro de albumina humana marcado com tecnécio
MDP -99mTc Ácido metilenodifosfônico marcado com tecnécio
99mTcO4- Íon pertecnetato
201Tl Tálio com número de massa 201
xiii
RESUMO
A ressecção extensa do intestino delgado resulta na síndrome do intestino
curto com repercussão desabsortiva importante. Uma avaliação morfo-
funcional poderá ser necessária aos órgãos envolvidos no processo. O objetivo
desse estudo foi avaliar a biodistribuição do pertecnetato de sódio em órgãos
de ratos submetidos a ressecção extensa do intestino delgado, a capacidade
adaptativa da mucosa intestinal remanescente e o comportamento da curva
ponderal pós-operatória. Foram utilizados 21 ratos Wistar alocados
aleatoriamente em três grupos (n=7). O grupo tratado, denominado intestino
curto (IC), foi submetido a anestesia e ressecção ampla do intestino delgado, o
grupo controle (C) e o grupo sham que submeteu-se à leve manipulação
cirúrgica das alças intestinais. Após observação por trinta dias administrou-se,
em todos os grupos, 0,l mL de pertecnetato de sódio via plexo venoso orbital.
Decorridos trinta minutos os animais foram sacrificados com superdose de
anestésico para retirada de fragmentos do fígado, baço, pâncreas, estômago,
duodeno, intestino delgado, tireóide, pulmão, coração, rim, bexiga, músculo,
fêmur, e cérebro. As amostras foram levadas ao Contador Gama Automático
1470, WizardTM, Perkin-Elmer para contagem da radioatividade e posterior
cálculo do percentual de atividade radioativa por grama (%ATI/g) em cada
órgão. Segmentos de 3cm do jejuno foram retirados para análise histológica
da mucosa. Utilizou-se avaliação estatística paramétrica (ANOVA) e teste de
Tukey, considerando p<0,05 como significante. Não houve diferenças
significantes da %ATI/g nos órgãos dos grupos estudados. Verificou-se
acentuada redução inicial de peso, em seguida um aumento do peso dos
animais tratados a partir da segunda semana de observação e aumento da
xiv
espessura da mucosa jejunal do grupo IC, comparado com os demais. Em
conclusão, a ressecção ampla do intestino delgado não alterou a
biodistribuição do radiofármaco nos órgãos avaliados entre os animais
estudados. A adaptação da espessura da mucosa pode ter contribuido para
reversão na perda de peso pós-operatória e para que a biodistribuição do
pertecnetato de sódio não fosse afetada pela intervenção cirúrgica. O trabalho
teve um caráter multidisciplinar com a participação de vários departamentos e
laboratórios, como Núcleo de Cirurgia, Departamento de Cirurgia, Laboratório
de Radiobiologia, Departamento de Patologia e Serviço de Medicina Nuclear,
atestando o caráter multidisciplinar da pesquisa.
Descritores: Síndrome do Intestino Curto. Cirurgia. Intestino. Pertecnetato de
sódio. Biodistribuição.Ratos.
1 INTRODUÇÃO
No final do Século XIX, Becquerel e o casal Curie iniciaram estudos
sobre os efeitos biológicos das radiações. Em 1905 o rádio foi usado para
destruir células cancerosas da tireóide. A partir daí os avanços dos estudos
sobre a energia nuclear ocorreram nos mais diversos campos, na medicina, na
indústria, e na agricultura.1-3
Em 1937 o Tecnécio (99mTc) foi descoberto por Perrier e Segre,
tornando-se um dos isótopos mais usados para diagnóstico em medicina
nuclear. Nos anos setenta vários fármacos foram marcados com o 99mTc,
estabelecendo maior afinidade por determinados órgãos ou tecidos. O
Metilenodifosfonato de Sódio (MDP), tem sido usado para cintilografia óssea, o
Ácido Dimercaptosuccínico (DMSA), para estudo renal, o Ácido
Dietilenotriamino pentacético (DTPA), para estudo renal e cerebral, o Ácido
Iminodiacético Hepático e derivados (HIDA), para avaliação hepatobiliar.
Surgiram ainda, o Mercaptoacetiltriglicina (MAG3) com maior especificidade
para o diagnóstico dinâmico renal, o Sestamibi, para diagnóstico oncológico e
do miocárdio, assim como o Teboroxime e o Tetrofosmin para a avaliação da
perfusão cardíaca. Hoje, se dispõe de mais de trinta radiofármacos.1,4
Desde então, trabalhos experimentais foram publicados, especialmente
na área clínica, onde a marcação de hemácias com 99mTc merece destaque.5,6
Também foram identificadas várias interações medicamentosas tanto de
drogas naturais como sintéticas, que podem alterar a biodistribuição dos
radiofármacos.7-11 Holanda e colaboradores estudaram recentemente a
biodistribuição do MDP-99mTc em ratos tratados com drogas antimaláricas.12
2
Um estudo realizado com extrato de Guava (Psidium guajava) descreveu
modificação na biodistribuição do 99mTc usandose hamáceas marcadas.13
Recentemente, outro trabalho demonstrou que o extrato de Ginkgo biloba
promovia diminuição da absorção do Na99mTcO4 no duodeno.14
Entretanto, trabalhos sobre a biodistribuição do Na99mTcO4 na área
cirúrgica ainda são incipientes. O presente estudo analisou o comportamento
do Na99mTcO4 em modelo animal, após uma intervenção cirúrgica abdominal de
grande porte, com a ressecção extensa do intestino delgado, que resultou na
síndrome do intestino curto.
Nestas condições, tornou-se relevante identificar a biodistribuição do
Na99mTcO4 em diversos órgãos que necessitem de uma avaliação morfo-
funcional pós-operatória através de exames de imagem da medicina nuclear.
Analisar a evolução ponderal dos animais no pós-operatório, bem como a
morfologia da mucosa do intestino delgado remanescente também constituíram
propósitos desta investigação.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Medicina Nuclear
A medicina nuclear utiliza cada vez mais radioisótopos que têm
afinidades para determinados órgãos ou tipos celulares.1-4 Esses radioisótopos
podem ser produzidos artificialmente em reatores nucleares, aceleradores de
partículas ou até mesmo em geradores portáteis.
São isótopos que sofrem decaimento, resultando em um elemento mais
estável com emissão de partículas alfa (α), beta (β-, β+), ou raios gama (γ). Este
fenômeno é conhecido como radioatividade e corresponde ao número de
desintegrações por segundo.2,15
O 99mTc, radioisótopo mais utilizado para diagnóstico em medicina
nuclear, destaca-se dos demais por apresentar características próximas de um
radioisótopo ideal, com meia vida de 6 horas, emissão de radiação γ, pouco
ionizante e de fácil captação por detector externo.3 (Tabela 1)
Tabela 1 - Radioisótopos para diagóstico
Radioisótopos Meia-vida Decaimento Energia γ (KeV)
Abundância da Emissão γ (%)
99mTc 6 h γ 140 89 131I 193 h β -,γ 364 81 123I 13 h γ 159 83
67Ga 78 h γ 93,185,300,394 37,20,17,5 111In 67 h γ 171,245 90,94 201Tl 73 h γ 135,167 3,2 11C 20,4 min β+ 511 99,8 13N 10 min β+ 511 100 15O 2,07min β+ 511 99,9 18F 110 min β+ 511 96,9 124I 4,2 dias β+ 511 25
64Cu 13 h β+ 511 38 Adaptada de Saha 1998
4
É obtido através do gerador 99Mo/99mTc composto por uma coluna
cromatográfica de óxido de alumínio (Al2O3), onde é depositado o molibdênio
que decai por emissão de partículas β-, formando os íons molibdato (99MoO4-2 )
e pertecnetato (99mTcO4-). O 99MoO4
-2 possui afinidade pelo alumínio. Usando-
se um eluente de cloreto de sódio a 0,9% (NaCl), o 99mTcO4- é separado na
forma de pertecnetato de sódio (Na99mTcO4).15 (Figura 1)
Figura 1 Apresentação esquemática do gerador 99Mo/99mTc.
Este pode ser utilizado em aplicações clínicas ou servir para preparar
radiofármacos mais complexos, marcados com substâncias químicas com
maior afinidade por determinados órgãos. Este procedimento requer a redução
de sua valência +7 através de agentes químicos como o íon estanoso.2
O Na99mTcO4 tem maior afinidade por glândulas salivares, tireóide,
estômago e rins. Liga-se inicialmente às proteínas plasmáticas com eliminação,
por via renal, de 30% nas primeiras 24 horas.2
Sua biodistribuição é estudada por diversas pesquisas básicas com
drogas naturais ou sintéticas.5,8,9
Um trabalho recente realizado com o VC-99mTc representou importante
ferramenta para estudos de biodistribuição do veneno de Crótalus.16 O SAH -
99mTc mostrou-se como uma boa alternativa em aplicação clínica.17 Um estudo
5
com o extrato da erva ”Uncaria tomentosa” confirmou que em fitoterapia
continua-se a descobrir interações medicamentosas e biodistribuição de
radiofármacos.18
Na área cirúrgica, não há na literatura relato de pesquisas sobre
repercussão de intervenções cirúrgicas de grande porte na biodistribuição do
Na99mTcO4 para órgãos e tecidos.Um trabalho Investigou, em ratos, a
translocação bacteriana em modelo experimental de icterícia obstrutiva,
empregando Escherichia coli marcada com 99mTc (E.Coli - 99mTc). O estudo não
mostrou translocação da E.Coli - 99mTc.19
Ansari e colaboradores utilizaram a cintilografia com DMSA - 99mTc para
avaliar a função renal e consideraram satisfatória sua indicação em
procedimento laparoscópio de rim atrófico.20 Um estudo com esplenectomia total
em que usou-se a E. coli - 99mTc observou falha no sistema mononuclear
fagocitário, indicando a necessidade de técnicas cirúrgicas alternativas para
preservar o tecido esplênico e garantir a fagocitose bacteriana.21
2.2. Síndrome do Intestino Curto
A síndrome do intestino curto decorre por ressecção extensa do
intestino delgado e resulta na incapacidade da manutenção da absorção dos
nutrientes.22-25 Sua etiologia está associada a uma redução maior que 70% do
intestino delgado imposta por condições congênitas ou adquiridas, tais como:
isquemia mesentérica, volvo, trauma, doença de Crohn, e outras.26,27
Essa condição poderá provocar um quadro caracterizado por diarréia,
6
desnutrição, perda de peso, anemia, hipersecreção gástrica, e litíases biliar e
renal.27
A adaptação intestinal a essa situação cirúrgica inclui um processo
complexo com a atuação de vários fatores, tendo como foco o aumento da
superfície absortiva por hiperplasia da mucosa intestinal remanescente.28-30
Técnicas cirúrgicas são utilizadas na tentativa de melhor adequar esse
segmento intestinal. Destacam-se os procedimentos para retardar o trânsito
intestinal com construção de válvulas, segmento intestinal interposto, construção
de segmentos anisoperistálticos e marcapasso intestinal reverso. Como métodos
que visam aumentar a superfície absortiva tem-se a enteroplastia longitudinal e
alongamento intestinal. Os transplantes do intestino delgado ou combinado de
fígado e intestino delgado estão reservados para pacientes com complicações
graves de falência intestinal.31-33
Nos trabalhos que envolvem a síndrome do intestino curto destacam-se
estudos sobre os mecanismos de adaptação do intestino, onde o aumento da
espessura e extensão da parede intestinal constituem fatores decisivos na
capacidade absortiva do segmento remanescente34. Outros, avaliaram as
alterações morfológicas da mucosa e identificaram mediadores da adaptação
intestinal, com destaque para a secreção pancreatobiliar e os hormônios.35-38
O hormônio do crescimento (GH), o glucagon tipo peptídeo-2 (GLP-2), e o fator
de crescimento epidérmico (EGF), têm sido identificados como os principais
promotores da adaptação.39-41 A Glutamina também é usada para minimizar o
dano da redução do intestino, promovendo a reabilitação da absorção
intestinal.42 Um modelo em ratos chama a atenção para o efeito da
administração da dieta com glutamina e avalia a perda de peso pós-operatória
7
e a morfometria da mucosa intestinal. Sua conclusão é que a dieta oral
acrescida de glutamina não contribuiu para reduzir a perda de peso dos
animais, mas foi importante no efeito da adaptação intestinal.43 Martin et al
demonstraram que o GLP-2 associado à nutrição parenteral total estimulou a
adaptação do intestino dos ratos submetidos à ressecção intestinal, e
observaram aumento das criptas de sua mucosa.44
O presente trabalho constitui o primeiro estudo sobre biodistribuição do
Na99mTcO4 em órgãos de ratos submetidos à ressecção extensa do intestino
delgado. Trata-se de um modelo experimental que pretendeu simular a
síndrome do intestino curto, problema que resulta em intensa repercussão
metabólica em diversos órgãos. No pós-operatório de pacientes portadores da
síndrome podem ser necessários exames complementares para
esclarecimento diagnóstico de complicações dela decorrentes ou de outras
doenças eventuais.A justificativa do trabalho prende-se ao fato de que,
havendo alterações na biodistribuição de radiofármacos para determinados
órgãos, resultados falso-positivos ou falso-negativos podem ocorrer, obrigando
à repetição de cintilografia e exposições repetidas a radiações ionizantes.
8
3 ANEXAÇÃO DOS ARTIGOS
3.1. ARTIGO I – Biodistribuição do radiofármaco pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) em ratos submetidos a ressecção extensa de intestino delgado
Aceito para publicação na Acta Cirúrgica Brasileira em 15.04.07
Biodistribution of the radiophamarceutical sodium pertechnetate (Na99mTcO4) after massive small bowel resection in rats1
Dâmaso de Araújo Chacon2, Irami Araújo-Filho2, Arthur Villarim-Neto2, Amália Cínthia Meneses Rêgo3, Ítalo Medeiros Azevedo4, Mário Bernardo-Filho5, José Brandão-Neto6, Aldo Cunha Medeiros6
1. Research performed at Nucleus for Experimental Surgery, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Brazil.
2. Fellow PhD degree, Postgraduate Program in Health Sciences, UFRN, Brazil. 3. Graduate Student, Scientific Initiation Program, UFRN, Brazil. 4. Statistician, Department of Surgery, UFRN, Brazil. 5. PhD, Chairman, Biophysics and Biometry Department, UERJ, Brazil 6. PhD, Full Professor, Postgraduate Program in Health Sciences, UFRN, Brazil.
ABSTRACT Purpose: To evaluate the biodistribution of sodium pertecnetate (Na99mTcO4) in organs and tissues, the morphometry of remnant intestinal mucosa and ponderal evolution in rats subjected to massive resection of the small intestine. Methods: Twenty-one Wistar rats were randomly divided into three groups of 7 animals each. The short bowel (SB) group was subjected to massive resection of the small intestine; the control group (C) rats were not operated on, and soft intestinal handling was performed in sham rats. The animals were weighed weekly. On the 30th postoperative day, 0.l mL of Na99mTcO4, with mean activity of 0.66 MBq was injected intravenously into the orbital plexus. After 30 minutes, the rats were killed with an overdose of anesthetic, and fragments of the liver, spleen, pancreas, stomach, duodenum, small intestine, thyroid, lung, heart, kidney, bladder, muscle, femur and brain were harvested. The biopsies were washed with 0.9% NaCl.,The radioactivity was counted using Gama Counter WizardTM 1470, PerkinElmer. The percentage of radioactivity per gram of tissue (%ATI/g) was calculated. Biopsies of the remaining jejunum were analysed by HE staining to obtain mucosal thickness. Analysis of variance (ANOVA) and the Tukey test for multiple comparisons were used, considering p<0.05 as significant. Results: There were no significant differences in %ATI/g of the Na99mTcO4 in the organs of the groups studied (p>0.05). An increase in the weight of the SB rats was observed after the second postoperative week. The jejunal mucosal thickness of the SB rats was significantly greater than that of C and sham rats (p<0.05). Conclusion: In rats with experimentally-
9
produced short bowel syndrome, an adaptive response by the intestinal mucosa reduced weight loss. The biodistribution of Na99mTcO4 was not affected by massive intestinal resection, suggesting that short bowel syndrome is not the cause of misleading interpretation, if an examination using this radiopharmaceutical is indicated. Key words: Short Bowel Syndrome. Sodium Pertechnetate Tc 99m. Pharmacokinetics.
Rats.
RESUMO Objetivo: Avaliar em modelo animal com ressecção extensa do intestino delgado a biodistribuição de pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) em órgãos e tecidos, a evolução ponderal e a morfometria da mucosa do intestino delgado remanescente. Métodos: Vinte e um ratos Wistar foram aleatoriamente divididos em três grupos de sete animais cada. O grupo intestino curto (IC) foi submetido a ressecção extensa do intestino delgado, o grupo controle (C) não foi operado e o grupo sham foi submetido a leve manipulação cirúrgica das alças intestinais.Todos foram pesados semanalmente. No 30º dia pós-operatório foi administrado 0,l mL de Na99mTcO4 aos animais dos três grupos,IV no plexo orbital, com atividade radioativa média de 0,66MBq. Após 30 minutos os ratos foram mortos e retirados fragmentos do fígado, baço, pâncreas, estomago, duodeno, intestino delgado, tireóide, pulmão, coração, rim, bexiga, músculo, fêmur, e cérebro. As amostras foram lavadas com solução de NaCl 0,9%.A radioatividade foi contada peloContador Gama 1470, WizardTM Perkin-Elmer e calculado o percentual de atividade radioativa por grama (%ATI/g) de cada órgão. Biópsias do jejuno foram submetidas a análise da espessura da mucosa (coloração HE). Utilizou-se avaliação estatística paramétrica (ANOVA) e teste de Tukey, considerando p<0,05 como significante. Resultados: Não houve diferenças significantes da %ATI/g nos órgãos dos grupos estudados (p>0,05). Verificou-se acentuada redução inicial de peso, em seguida um aumento do peso dos animais tratados a partir da segunda semana de observação e aumento da espessura da mucosa jejunal do grupo IC, comparado com os demais. Conclusão: Em ratos com síndrome do intestino curto, uma adaptação na espessura da mucosa contribuiu para reversão na perda de peso inicial e para que a biodistribuição do Na99mTcO4 não fosse afetada pela ressecção extensa do intestino, sugerindo que o intestino curto não é causa de interpretações duvidosas, quando exame cintilográfico com este radiofármaco estiver indicado.Descritores: Síndrome do Intestino Curto. Pertecnetato Tc99m de Sódio.
Farmacocinética. Ratos.
Introduction
Radioisotopes are used in nuclear medicine for diagnostic and therapeutic purposes. The labelling capacity of these isotopes for the plasmatic proteins is well known, and their bioavailability and pharmacokinetics can be modified by drugs and diseases1,2. Among the most useful artificial radioisotopes, technetium-99m, in the chemical form of sodium pertechnetate (Na99mTc04), is the most important. Its use in nuclear medicine is due to the emission of gamma energy of 140 KeV, enabling it to take advantage of the scintillation detectors and obtain enhanced image quality; this is known as scintigraphy3. It has a short life, is low cost, and is obtained from a molybdenum/technetium generator (99Mo/99mTc).3 It is easily distributed through the vascular fluid, intersticial space with uptake by the salivary glands, thyroid, stomach,
10
intestines and other organs3. It is rapidly eliminated by the urine and when incorporated to specific substances, produces organ images of different densities and functions4. Experimental studies carried out with the labelling of red blood cells with 99mTc identified important biological effects, in addtion to alterations in the labelling process5,7. Gomes et al carried out a study with mitomicin-C that described alterations in the labelling of red blood cells6. The literature reports that several natural drugs reduce the efficiency of labelling red blood cells with 99mTc7. An experimental study with Vincristin, used in oncology protocols, showed an interaction of this drug with 99mTc in several organs8. However, there are no reports of research studying the biodistribution of radiopharmaceuticals after surgical procedures. In the present study, we used an experimental model of massive resection of the small intestine, characterizing the short bowel syndrome, which results in unsuitable water and nutrient absorption, causing malnutrition9,10. In spite of the short bowel syndrome, the intestine can be adapted through physiologic, cellular and moleculares mechanisms9. In some patients, dilation and lengthening of the remnant small intestine occur as a phenomenon of functional adaptation. Surgical techniques have been reported that attempt to lengthen this intestinal segment. Such procedures are complex and frequently ineffective, and call for assessments of their efficacy11. Recently, new therapeutic methods, such as isolated small intestine transplantation or combined with liver transplantation, have been an alternative for cases of hepatic failure due to total parenteral nutrition in the treatment of short bowel syndrome12.
Given the antiabsorptive effect of the operation, with great repercussions on the metabolism, radioisotope images may be necessary in the postoperative, in order to control the series of pathological conditions resulting from short bowel syndrome. Scintigraphy can be used in the postoperative of intestinal resections to assess the morphology and metabolism of several organs. Under these conditions, it becomes relevant to study the biodistritubion of Na99mTc04 in specific organs and tissues.
Therefore, the present paper aims to study, in an animal model of massive resection of the small intestine, the biodistribution of Na99mTcO4 in several organs by means of radiation counting in organs and tissues in the postoperative period. We also evaluated the ponderal evolution of the animals after the operation, as well as the mucosal morphometry of the remnant small intestine.
Methods
Twenty-one Wistar rats, age around 180 days, weighing 265g±31g were used. They were supplied by the vivarium of the Nucleus for Experimental Surgery of the Federal University of the Rio Grande do Norte, Brazil. All the animals were weighed and observed in individual cages with water and food (Labina ® Purina) ad libitum and acclimated in the laboratory for 7 days. They were maintained under temperature control (21ºC), air humidity(60 – 70 %) and lighting (12/12 hours light / dark cycle) and handled in accordance with the Animal Experimentation Code of Ethics (Council for International Organizations of Medical Sciences ) and the rules of the Brazilian College of Animal Experimentation. They were randomly divided into three groups: the experimental group rats , denominated short bowel, (SB, n = 7) were subjected to massive resection of the small intestine (90%); control group rats were not operated on (C, n=7) and the third group underwent a simulated operation, called sham (n=7). Rats were fasted overnight before surgery, and anesthetized with sodium pentobarbital
11
(20mg/Kg intraperitoneal) and ketamine (20mg/Kg intramuscular); they were operated on under sterile conditions.
A 3cm midline laparotomy was performed and intestinal transections were done 5 cm above the ileocecal junction and 5 cm from the duodenojejunal transition. With the aid of a surgical microscope (DF Vasconcelos, São Paulo, Brazil), interrupted sutures of 6-0 prolene (Ethicon®, Brazil) were used for bowel anastomosis. The animals typically have a small bowel length of 100 cm, and accordingly, residual length was 5 cm of jejunum and 5 cm of ileum (10 cm), corresponding to 90% of resection. After surgery, the abdomen was closed with interrupted sutures of 4-0 nylon suture (Ethicon®). The animals were allowed water immediately after surgery and food on the second postoperative day. The sham rats were subjected to a 3 cm medium laparotomy and mild manipulation of the small bowel. The rats were weighed weekly with a digital scale (Filizola® São Paulo, Brazil) and observed for 30 days. On the 30th day all the animals were anaesthetized again, and injected with 0.lmL of Na99mTcO4 in the venous orbital plexus, corresponding to radioactive activity of 0.66MBq. After 30 minutes, the animals were killed by lethal dose of anesthetic. Samples of the liver, spleen, pancreas, stomach, duodenum, small intestine, thyroid, lung, heart, kidney, bladder, muscle, femur and brain were harvested. The samples were washed in 0.9% NaCl , weighed on a high-precision digital scale (Bel-Mark 160-II Itália®) and subjected to radioactivity detection using a 1470 WizardTM Gamma Counter- Perkin-Elmer, with automatic correction of radiation decline. The percentage of radioactive activity/g (%ATI/g) of each organ was calculated by dividing the activity/g of the tissue by the total activity administered to each animal. Samples with 2cm of jejunum were harvested 2 cm below the anastomosis. After washed in 0.9% saline, the excised tissues were fixed in 10 % buffered formalin for 48 h, dehydrated and embedded in paraffin. Sections cut at 5µm thickness were stained with hematoxilyn and eosin and morphology was assessed by an observer, who was unaware of the tissue origin. For the morphometric study of intestinal mucosa, Media Cybernetics – LP, USA, Image Pro-Plus software was used with an Olimpus BX-50 microscope fitted with a digital (Samsung®) video camera. The video camera transferred the image from the microscope to the computer screen. The measurement of the mucosal thickness was delimited with a computer mouse from the apex of the villus to the muscularis mucosae and was expressed in microns (µm). The analysis was made under 40x magnification using specimens in which the villi and the crypts were perpendicular to the muscularis mucosae.
For the analysis of the different data related to postsurgical weight loss, to the measurements of total mucosal thickness, and to the biodistribution of sodium pertechnetate of the different groups, parametric variance (ANOVA) was used. For the multiple comparisons, the Tukey test was used. A significance level of 5% (p<0.05) was established.
Results
All the animals survived the surgical procedures. Table 1 shows the results of the differences in %ATI/g among groups SB, C and sham. We observed an increase in the biodistribution of Na99mTcO4 in the thyroid and duodenum of SB rats, when compared to control rats. However, since the standard deviation was high, there was no significant difference (p>0.05). In the stomach, an apparent tendency for reduced biodistribution of the %ATI/g occurred in the SB rats, compared to sham rats, but without statistical significance (p>0.05). In several organs the percentages of
12
radioactive activity (%ATI/g) had very similar values among the groups, without significant differences (Table 1).
TABLE 1 – Biodistribution of Na99mTcO4 in the organs of the respective groups
%ATI/gOrgans
SB C Sham
ANOVA (1)
Liver 0.35 ± 0.089 0.36 ± 0.079 0.39 ± 0.113 0.794400
Spleen 0.22 ± 0.090 0.18 ± 0.031 0.19 ± 0.044 0.565470
Estomach 2.58 ± 0.730 2.72 ± 0.614 4.11 ± 1.793 0.116180
Small bowel 0.28 ± 0.107 0.20 ± 0.052 0.28 ± 0.130 0.690700
Duodenum 1.73 ± 1.814 0.41 ± 0.062 1.13 ± 1.719 0.378723
Pancreas 0.16 ± 0.063 0.14 ± 0.055 0.18 ± 0.125 0.811183
Kidney 0.41 ± 0.086 0.42 ± 0.082 0.36 ± 0.187 0.738872
Heart 0.17 ± 0.075 0.27 ± 0.057 0.17 ± 0.084 0.076831
Lung 0.35 ± 0.105 0.38 ± 0.125 0.31 ± 0.058 0.581337
Thyroid 5.35 ± 1.979 3.71 ± 1.256 3.80 ± 1.058 0.187603
Bladder 0.39 ± 0.114 0.33 ± 0.109 0.27 ± 0.139 0.309546
Muscle 0.07 ± 0.028 0.06 ± 0.019 0.05 ± 0.035 0.570391
Femur 0.16 ± 0.055 0.14 ± 0.036 0.15 ± 0.050 0.760950
Brain 0.02 ± 0.013 0.01 ± 0.003 0.03 ± 0.027 0.482193
Mean ± Standard deviation (1) P- from analysis of variance (ANOVA). The results of the test did not show statistically significant differences (p>0.05), for all the variables. %ATI/g, percent radioacvivity per gram of tissue.
The weight of SB rats decreased during the first and second weeks of survival and, after that, their weight gradually increased until the 30th postoperative day, when it was nearly the same as the C and SHAM rats, which continually increased their weight over time (Figure 1). The differences in the mean weight of SB rats at the end of the second week were significant, when compared to C and SHAM rats (p<0.05).
13
Preoperative 1st week 2nd week 3rd week 4th week180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380W
eigh
t (g)
SB Sham Control
FIGURE 1 – Mean weight of rats in each group and postoperative period
The presence of an increase in intestinal mucosa thickness was detected in all IC rats, when compared to C and SHAM rats until the end of the observation period, as seen in Table 2 (p<0.05) and Figure 2.
TABLE 2 – Jejunal mucosa thickness of rats and their respective groups
GroupsVariable
SB C Sham
ANOVA (1)
Mucosal thickness in µm(2)
334.34 ± 25.9ab 194.40 ± 39.0a 194.22 ± 33.2b 0.0000
Values expressed in Mean ± Standard deviation (1) p-value of analysis of variance (ANOVA). (2) Groups identified with the same letter differ significantly at a level of 5%
(Tukey test). SB = Short bowel; C = control.
14
FIGURE 2 - Small intestine morphology and mucosal cell proliferation on day 30 in short bowel (A) control (B) and sham (C) animals. Massive intestinal resection (A) induced significant increases in total mucosal thickness (arrows), when compared to control and sham animals (B, C) (see Table 2; p<0.05). HE, 40x
A
B
C
15
Discussion
The alterations in the biodistribution of Na99mTcO4 in organs and tissues are very well identified in several studies that used no experimental surgical models 1,,6,,8,13,14. However, in the postoperative of major surgical procedures, there are no reports concerning the biodistribution of radiopharmaceuticals. The present experimental model of the short bowel syndrome in rats submitted to massive resection of the small intestine was used to determine the biodistribution profile of Na99mTcO4 in several organs and tissues. Intestinal failure is characterized by malnutrition and/or dehydration as a result of the inadequate digestion and absorption of nutrients. The most common cause of intestinal failure is short bowel syndrome, which occurs when the functional small bowel mass is reduced below the level necessary for adequate nutrient and water absorption. This condition frequently results from a massive resection of the small bowel. Following resection, the intestine is capable of adaptating in response to enteral nutrients as well as other trophic stimulation. Rodents are commonly used in well-characterized models to assess the process of intestinal adaptation16. Following small bowel resection in the rat, the remnant intestinal mucosa undergoes compensatory alterations in an attempt to restore normal absorptive capacity. Morphologic and functional changes include increases in mucosal length, enterocyte proliferation, as well as increased electrolyte, glucose and amino acid uptake16,17.
In humans, the alterations of intestinal absorption due to massive resection of the small intestine usually cause significant weight loss15. However, in rodents, there is a rapid adaptation of the intestinal mucous membrane, which minimizes weight loss16. These mechanisms of intestinal adaptation take place at physiologic, cellular and molecular levels and they do not correspond to what occurs in the human intestine 17. Nutrients, electrolytes, hormones, cytokines and other elements take part in the process, which involves mainly the intestinal mucous membrane. The process begins with apoptosis and continues with an increase in epithelial cells, vilosities and mucosal crypts, and a consequent remodeling of their architecture. Functionally, this allows for increased substance transport through the intestinal mucosa17.
In the present study a significant decrease was observed in the weights of rats submitted to massive intestinal resection, in the immediate postoperative period, and weight recovery begining at the end of the second week. These data coincide with a classic study on the subject, where morphological and functional adaptations of the jejunum were observed between the first and second postoperative weeks18. This phenomenon was also shown in the morphometry of the jejunal mucous membrane of the animals subjected to massive resection of the present study. Therefore, the mucous membrane hyperplasia observed in the jejunal mucosa of the SB rats of the present experiment, likely contributed to the rapid weight recovery of the animals, starting from the second postoperative week. Welters et al verified that intestinal function recovery begins with the hyperplasia of the intestinal mucosa and that absorptive function depends on the maturity of the enterocytes, a fundamental factor for nutrient metabolism19.
The precocious postoperative recovery of the animals, represented by weight and morphology of the intestinal mucosa recovery, and the healthy behavior of the SB rats, comparable to the controls, certainly contributed to the absence of significant clinical alterations and malnutrition. Consequently, there was no negative effect on the biodistribution of Na99mTcO4 in the vital organs. In an experimental study using
16
malnutrition-inducing diets, Passos et al20 showed that malnutrition affected the biodistribution of Na99mTcO4 in different organs such as the thyroid, brain, stomach and heart. In their study, the intestine was not surgically manipulated.
Studies in animals have been investigating substances that regulate the absorptive function of the intestine21. These mechanisms are mediated by multiple factors, including enteral or parenteral nutrition, hormones and growth factors22. Recently, studies on the use of the human growth hormone (GH), the epidermal growth factor (EGF) and the glucagons-like peptide-2 (GLP-2), produced in the L-cells of the small intestine, have confirmed them as agents that increase intestinal adaptation after massive resection23. The study suggests that, whereas GLP-2 is important in controlling adaptation, there are spatial or regional systems in place that use varying pathways. The significant increase in nutrient-stimulated GLP-2 secretion suggests that GLP-2 is involved not only in the initiation, but also in maintaining the ongoing adaptive process. The increases in mucosal proliferation that are temporally associated with a maintained GLP-2 release, suggest that GLP-2 is important in initiating and maintaining the small intestine’s adaptive response to resection24.
Curtis et al studied rats submitted to massive resection of the small intestine using marker 51mCrl3mC and protein, and observed the animals for one week. They concluded that the rats had no alteration in absorption and digestion time when compared to the treated group and the control; this demonstrated the fast physiological adaptation of the animals25. A growing number of tissue factors are being investigated for having great potential in promoting intestinal adaptation in animals and humans with short bowel syndrome, in the hope of obtaining effective therapies for the syndrome in the future23,26.
In summary, massive intestinal resection in the current study did not interfere significantly with the biodistribution of the radiopharmaceutical Na99mTcO4 in the organs studied. Certainly the mucosal hyperplasia of the remnant intestine was a preponderant factor for the quick weight loss reversal of the animals, and consequent preservation of their healthy metabolism.
The present study does not allow us to comment on the mechanisms by which intestinal resection results in the stimulation of trophic effects and mucosal adaptation, allowing normal biodistribution of Na99mTcO4 in rats. Identifying factors that may enhance the process of intestinal adaptation is an exciting area of research with important potential clinical applications. This area will require further studies.
Conclusion
In rats with experimentally-induced short bowel syndrome, an adaptive response by the intestinal mucosa reduced weight loss. The biodistribution of Na99mTcO4 was not affected by massive intestinal resection, suggesting that short bowel syndrome is not the cause of misleading scintigraphy interpretation when an examination with this radiopharmaceutical is indicated.
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Conflict of interest: none Financial source: CNPq
Correspondence: Dâmaso de Araújo ChaconRua Almte. Nelson Fernandes, 797/1200 59022-600 Natal - RN Brazil
20
3.2. ARTIGO II – Glucan and Glutamine Reduce Bacterial Translocation in Rats Subjected to Intestinal Ischemia – Reperfusion.
Publicado no Journal of Investigative Surgery 2006; 19:39 – 46.
GLUCAN AND GLUTAMINE REDUCE BACTERIAL TRANSLOCATION IN RATS SUBJECTED TO INTESTINAL ISCHEMIA-REPERFUSION
Aldo Cunha Medeiros , PhD* ; Dâmaso Araújo Chacon, MD ; Valéria Soraya Farias Sales, PhD ; Eryvaldo Sócrates Tabosa Egito, PhD ; José Brandão-Neto, PhD; Laíza Araújo Mohana Pinheiro; Mariana Rego Carvalho.
Postgraduate Program in Health Sciences – Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil. Av. Gustavo Cordeiro de Farias, s/n – 59010-180 - Natal/RN, Brazil
Corresponding author:
Dr. ALDO CUNHA MEDEIROS Av. Miguel Alcides Araújo 1889 Natal-RN 59078-270 Brazil Fax: +55-84-2176075; e-mail: [email protected]
Abstract
Intestinal ischemia/reperfusion (I/R) may induce bacterial translocation (BT). Glutamine (GLN)-enriched nutrition decreases BT. However, little is known about the effect of glucan (GL) in BT. This study investigated the combined effect of GL/GLN on BT, intestinal damage and portal blood cytokines in animals under I/R. Four groups of 10 rats each were subjected to 60 min of intestinal ischemia and 120 min of reperfusion. Control group (1) received only rat chow/water, group 2 received glutamine via gavage, group 3 received subcutaneuos soluble 1-3-(D)-glucan, and group 4 received GL+GLN, respectively. A fifth sham group (5) served as a normal control. Bacterial cultures of ileum, mesenteric lymph nodes (MLN), liver and lung biopsies, histological changes of ileum and serum cytokines variables were examined after I/R. Data were analyzed by ANOVA and Newman-Keuls test. Results showed that GLN, GL and GL/GLN significantly reduced BT to MLN, liver and lung. BT was more attenuated after GL treatment than GLN (p<0.05). Rats treated with both GL and GLN exhibited lower bacterial colony counts than the ones treated only with GLN or GL. Severe mucosal damage on histological findings was shown in group 1, but these findings were significantly ameliorated p<0.05) in groups 3 and 4. TNF-α and IL-6 levels in portal serum were significantly reduced and IL-10 was increased by GL and GLN treatment. Conclusions: the use of GL was more effective than GLN in reducing BT, intestinal damage and cytokine levels after I/R. Additionally, the combination of GL and GLN improved results.
Key words: Bacterial translocation, Glucan, Glutamine, Intestine, Mucosa, Ischemia, Reperfusion, Cytokine.
21
Introduction
Bacterial translocation (BT) is the passage of viable indigenous bacteria from the gastrointestinal tract to normally sterile extraintestinal sites, such as the mesenteric lymph nodes (MLN), liver, lungs and other tissues[1]. BT is characterized by the appearance of enteric bacteria in the MLN, liver, and spleen in several conditions, including burns, endotoxemia, hemorrhagic shock and intestinal ischemia/reperfusion (I/R) [2,3]. I/R injury of the small intestine induces marked changes in the mucosa [4]; therefore, impairment of the mucosal barrier function leads to increased BT and endotoxemia [5].
Glucans are a heterogeneous group of glucose polymers found in the cell walls of plants and fungi. They are natural biological response modifiers and their effects are numerous, including anti-tumor response, antibacterial and antiviral activity, hematopoiesis stimulation and wound healing [6,7].
Soluble (1,3)-D-glucan has been demonstrated to be active against infection and to prevent shock in rats and mice [8,9]. Clinical studies suggest that its administration to trauma/surgical patients not only stimulates conversion from leukocyte anergy, but also decreases septic complications and improves the survival rate [10]. However, little is known about the effect of soluble (1,3)-D-glucan on BT.
On the other hand, it has been shown that the supplementation of enteral and parenteral feeds with glutamine (GLN) is able to decrease the frequency of pneumonia, sepsis, and bacteremia in trauma patients [11], to improve T-cell function [12] and to enhance the bactericidal function of neutrophils [13]. Such GLN supplementation preserves the intestinal morphology and function, and may reduce BT as well [14].
The purpose of the present investigation was to study the effect of a soluble (1,3)-D-glucan alone, or in combination with GLN, on BT, gut damage and portal blood cytokines in rats with intestinal I/R.
Materials and Methods
Animals
Fifty male Wistar rats weighing 240±37g (Nucleus of Experimental Surgery, Federal University of Rio Grande do Norte-UFRN, Brazil) were used. Rats were housed in polypropilene cages and maintained under controlled temperature conditions on a 12h light-dark cycle and allowed ad libitum access to commercially available rat chow and water. The experimental protocol was approved by the Research Ethics Committee of the Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil, and adhered to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, US National Research Council, 1996.
22
Experimental design
The rats were randomly assigned to 5 groups (n=10 in each group) as described below. The control group (nº 1) received only chow and water; group 2 received 1.5mg/Kg/day of 5% glutamine (Glutamin�, Support, Brazil) via metal tube gavage every morning; Group 3 received subcutaneous injection of 2 mg/Kg of glucan (Immunoglucan�, Hebron, Brazil); and Group 4 received 2 mg/Kg of GL and 1.5mg/Kg/day of 5% GLN. These treatments were administered for 5 days before surgery. Group 5 (sham) served as a normal control and the rats received only chow and water.
Animals were fasted 12 hr before the experiment and anesthetized with an intramuscular injection of 100mg of ketamine/Kg of body weight. In groups 1,2,3 and 4, under sterile conditions, a laparotomy was done and the superior mesenteric artery (SMA) was occluded with a microvascular clamp for 60 minutes. In order to block any collateral blood supply, the right colic and proximal jejunal arteries were also clamped. The laparotomy incision was then closed, to be opened later for removal of the clamps after 60 minutes of ischemia. Reperfusion was confirmed by the return of pulsation to the mesenteric arcade. The incision was again closed and the animals were sacrificed by anesthetic overdose 120 minutes later. The sham-operated rats received the same surgical procedure as the other groups without being subjected to the ischemia-reperfusion protocol.
Measurement of bacterial translocation
At the end of the procedures (time = 180 minutes), a midline laparotomy was performed under aseptic conditions and biopsies were aseptically obtained for bacterial colony counts. A 1.5 cm long sample of the terminal ileum was excised, opened on its antimesenteric border, and washed in sterile 0.9% saline solution, for quantitation of bacterial population. One gram of MLN complex, liver and lung was removed for culture. Tissues were homogenized and aseptically solubilized after addition of 0.5 mL of 0.9% saline. Aliquots of 0.2mL were processed and cultured on selective MacConkey's agar and blood agar for detection of gram-negative and gram-positive bacteria, respectively. The agar plates were incubated at 37 oC and examined for growth after 24 and 48 hours. Any growth in the plates of bacteria of the same biotype as cultured in the ileum was considered positive and expressed as colony-forming units per gram of tissue (GFU/g). All procedures were performed under laminar air flux.
Histological study
Ileum specimens were fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin. Sections cut at a thickness of 4µm were stained with hematoxylin and eosin for morphometric measurements using an image analyzer (Image-Pro Plus, Media Cyber®). The damage of the intestinal specimens was assessed in a blinded
23
manner by an experienced pathologist according to microscopic criteria for degree of damage based on a grading system previously described [17]: normal mucosa, 0; subepithelial space at the viluus tip, 1; more extended subepithelial space, 2; epithelial lifting along villus, 3; denuded villi, 4; loss of villus tissue, 5; crypt layer infarction, 6; transmucosal infarction, 7; transmural infarction, 8.
Cytokine assays
Portal blood samples were collected and used for measurement of tumor necrosis factor-alfa (TNFα), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-10 (IL-10), determined using enzyme-linked immunoassay kits (all from PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), according to the manufacturer’s recommended protocols. The fluorescence was measured by a Bio-Tec Instruments EL 808 ultra microplate reader, using KC4-V3.0 analysis software. Sensitivity of detection was 30 pg/ml for cytokines.
Statistics
Data analysis was performed using the BioEstat 2.0 program. Differences between the microbiological samples as measured by positive cultures were evaluated by a test for differences between proportions. The results were tabulated and compared by ANOVA using post hoc analysis with Newman-Keuls test. P<0.05 was considered significant.
Results
Body weight
At the beginning of the experiment the body weight of the animals was 240±37g. After 5 days of GL and GLN supplementation they weighed 248±25g and the difference was not significant (p>0.05).
Bacterial translocation
BT of enteric microrganisms to the MLN, liver and lung occurred in all animals. In the Group 1 the incidence of positive cultures and BT to MLN, liver and lung was 100%, 80% and 90%, respectively (Table I). In mesenteric lymph nodes, after treatment with GLN, GL and GL+GLN, the BT was 70%, 40% and 20%, respectively, which was significant when compared to control animals (p<0.01 vs. control). (Table I). So, Group 1 was the only one where the incidence of bacteria isolated from MLN, liver and lung was from 80% to 100%. The incidence of BT to MLN, liver and lung was significantly reduced in the groups supplemented with GL and GLN, when compared with the control (p<0.05). The incidence of BT differed between the groups 2 and 3 in MLN and liver (p<0.05). Nevertheless, the combined treatment with GL and GLN (Group 4) reduced BT to MLN, liver and lung, compared to groups 1, 2 and 3 (p<0.05), but it was not different from the sham (5) group (p>0.05).
The translocating microorganisms most often cultured were Escherichia coli andEnterococcus ssp. Proteus mirabilis and Streptococcus faecalis were also
24
found. The magnitude (i.e., number of bacteria colonies/g of tissue) of translocation to the MLN and liver differed among the groups treated with GLN, GL and GL+GLN. A significant difference (p<0.01) was found when the three groups were compared with the control rats. The number of CFU/g isolated from the lung of Group 2 did not differ from Group 3 (p>0.05). There was a significant decrease in bacterial CFU/g in Group 4 compared with Groups 2 and 3 (p<0.01). (Table II). These results are approximately in agreement with that observed in Table I.
Ileal colonization
The quantitative analysis of bacteria colonizing the ileum showed a significant (p<0.05) Gram positive and Gram negative overgrowth in all control animals. This overgrowth was shown by high CFU/g in the ileum of Gram positive streptococci, and Gram negative E. coli, Proteus sp and enterococci strains. The ileum bacterial count decreased in groups supplemented with GL and GLN, compared with the control. A significant difference was observed (Table III) when the rats supplemented with GL+GLN were compared with groups 1,2,3 and the sham rats (p<0.05).
Macroscopic and histological studies
The ileum demonstrated gross dilatation and intramural hemorrhage after I/R, mainly in control rats. The microscopic findings of the ileum reveled marked mucosal damage after I/R and it was more severe in group 1 than in other groups. The damages included denudation of mucosa, transmural infarction, and neutrophil infiltration of the lamina propria and mucosal layer (Figure 1and Table V). Although mucosal damage was also observed in Group 4, intestinal tissue injury was less severe than in the groups 2 and 3 (p<0.05).
Table I - Incidence of bacterial translocation after intestinal ischemia/reperfusion in rats treated with glucan and glutamine. [n infected/total n (%)].
Group n MLN Liver Lung 1 10 10/10* (100) 8/10* (80) 9/10* (90) 2 10 7/10§ (70) 5/10§ (50) 6/10 (60) 3 10 4/10 (40) 3/10 (30) 5/10 (50) 4 10 2/10ƒ (20) 1/10ƒ (10) 2/10ƒ (20) 5 10 1/10 (10) 0/10 (0) 0/10 ( 0) *p<0.05 vs. 2,3,4,5; ƒp<0.05 vs. 1,2,3; § p<0.05 vs. 3. Groups: 1, control; 2, glutamine; 3, glucan; 4, glutamine + glucan; 5, sham; MLN, mesenteric lymph node. Table II - Bacterial colony counts obtained from MLN, liver and lung cultures. (CFU/g). Group n MLN Liver Lung 1 10 211.1±14.5* 175.9±13.1* 314.1±45.2*
2 10 112±11.0φ 130±14.9φ 108.6±14.6φ
3 10 65.8±8.9ƒ 81.1±17.2ƒ 90.2±12.1ƒ
4 10 24±5.2 40.9±5.5 53.3±18.1 5 10 5±1.7 3±0.8 12±6.1
25
*p<0.01 vs. 2,3,4,5; φp<0.01 vs. 3,4,5; ƒp<0.01 vs.4,5. Groups: 1, control; 2, glutamine; 3, glucan; 4, glutamine + glucan; 5, sham; MLN, mesenteric lymph node. Table III -Incidence of ileum colonization in treated and untreated rats. Ileum GFU(log10)
1 2 3 4 5
Gram + 5.5±1.4 3.6±0.3φ 4.0±0.5 2.2±0.7* 4.4±1.1 Gram - 6.8±0.3 4.1±0.9φ 3.4±1.3 1.9±0.8* 4.7±0.3 * p<0.05 vs. groups 1, 2, 3, 5; φ p<0.05 vs. groups 1, 4. Groups: 1, control; 2, glutamine; 3, glucan; 4, glutamine + glucan; 5, sham.
Table IV - Portal serum levels of cytokines comparing groups untreated and treated with glutamine and glucan. Groups n TNF-α (pg/mL) IL-6 (pg/mL) IL-10 (pg/mL) 1 10 163.7±12* 341.1±46* 251.8±36* 2 10 148±23 290±31 264±47 3 10 81.7±9.3** 154±17** 322±21** 4 10 47±18 103±12.4 410±78 5 10 0 0 0 *p<0.05 vs. groups 3,4; ** p<0.05 vs. groups 2, 4. Groups: 1, control; 2, glutamine; 3, glucan; 4, glutamine + glucan; 5, sham.
Table V - Histological grade of mucosal injury according to classification previously described [17].
1 control x x x x x x x x x x
2 glutamine x x x x x x x x x x
3 glucan x x x x x x x x x x
4 glutamine + glucan
x x x x x x x x x x
5 sham x x x x x x x x x
x
GRADES 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ileum mucosal injury in group 4 was less severe than in the C and GLN groups 1 and 2 (p<0.05). No difference (p>0.05) was observed comparing groups 1 and 4. In group 5 mucosa was normal (grade 0) in 9 rats and grade 1 in one rat.
26
Figure 1. Photomicrographs of ileum segments (HE, 100x). A. Control (1) group showing massive epithelial lifting, dilated capillaries, hemorrhage and ulceration; B. glutamine treatment (group 2) results in a decrease in epithelial injury. The villi are shorter than sham group and it is observed epithelial lifting; C. glucan pretreatment (group 3) results in lifting of epithelium and infiltration of leukocytes within lamina propria and epithelium; D. The treatment with glucan + glutamine (group 4) results in histology of ileal mucosa similar to that of sham group; E. Sham (group 5) showing normal histology.
Cytokines concentration
The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in the serum of control operated rats were 163.7±12pg/mL, 341±46pg/mL and, 251.8±36pg/mL respectively. Significant decrease in serum level of TNF-α (81.7±9.3pg/ml) and IL-6 (154±17pg/ml) was observed in group 3, when compared with group 1 and group 2 rats (p<0.05). When the administration of GL was concomitant with GLN (group 4), the levels of TNF-α and IL-6 were significantly lower than in groups 1, 2 and 3 (p<0.05). Nevertheless, an inverse result was observed in the IL-10 levels. There was a significant increase (p<0.05) in the level of IL-10 in groups 3 and 4 when compared to groups 1and 2. TNF-α, IL-6 and IL-10 were not detected in the portal serum of the sham rats (Table IV).
Discussion
One of the functions of intestinal mucosa is to prevent enteric bacteria and endotoxins from entering into other organs and blood circulation. It is now considered that gut barrier dysfunction is an important reason for infectious
27
complications when patients suffer from intestinal blood supply damage and lack of nutrient support [ 3]. It has been discovered from animal models that BT may be associated with an insufficiency of perfusion and lack of essential nutrients in their mucosa [15,16]. This event may result in the release of endotoxins, because of the change in the gut barrier function, thus facilitating BT [18]. Soluble (1,3)-D-glucan has been demonstrated to actuate against shock and infection in rats and mice [8,9]. Clinical studies suggest that the administration of soluble glucans to trauma/surgical patients stimulates the conversion from leukocyte anergy to normal ones, decreases septic complications and improves the survival rate [10,19]. Soluble glucan reduced myocardial infarction in rat hearts subjected to ischemia followed by reperfusion. The induced cardioprotection occurred rapidly and did not require prolonged pretreatment time [20]. This effect seems to be receptor-mediated and several different receptors for 1,3-glucan have been described. Phagocytic non-CR3 receptor in monocytes/macrophages specific for 1,3-glucans [21,22], glycosphingolipid 1,3-glucan receptor in human neutrophils [23], and dectin-1 in macrophages were identified as potential glucan receptors [24]. Furthermore, toll-like receptors have been reported to coordinate macrophage activation in response to zymosan particles [25]. The results found in this study showed that isolated pretreatment with GL significantly reduced BT to MLN, liver and lung, and was more effective than simple GLN supplementation. The combined GL+GLN treatment was more effective in reducing bacterial colony counts than the GL treatment, indicating a synergistic effect. Based on published evidences, glutamine pretreatment for five days was used in the present study. A previous research considered that a minimum of 5 days of feeding was necessary for the GLN supplementation to show an effect on infectious morbidity [11]. As the experimental model used in this study included biopsies and dosages 60 minutes after I/R, we decided to use a pretreatment for five days.
Several studies have shown that GLN-enriched diets result in a decreased BT in rodents with burn and gut-origin sepsis [26,27]. The etiology of bowel wall protection in I/R injury provided by GLN may be due to the maintenance of the cell antioxidant defence system. Bowel mucosal cell glutathione levels are maintained better in rats receiving GLN than to those in rats receiving only saline [28]. The increased glutathione levels are associated with less cell membrane lipid peroxidation, suggesting that GLN supplementation provides some protection for the bowel during periods of I/R [28]. Jung et al showed an association between gut malondaldehyde (a byproduct of lipid peroxidation) level in septic rats and BT, and suggested that the malondaldehyde may reflect the disruption of gut mucosal integrity [29]. The reduced gut malondaldehyde level in rats treated with GLN, growth hormone, or the combination of both GLN and growth hormone, indicated that these treatments decrease lipid peroxidation, maintain gut mucosa integrity and reduce BT (29). A significant difference in ileal bacterial colonization among untreated and treated I/R rats was observed in our study and E. coli was the bacteria predominantly found in ileum, MLN, lung and liver samples. These findings showed that control rats had an overgrowth of aerobic microorganisms and that the combined GL+GLN treatment resulted in significant reduction in ileal colonization. The isolated treatment with GL attenuated Gram negative ileum colonization, compared with
28
control and sham, meant that it was more effective than GLN, which did not reduce bacterial overgrowth.
GLN has been shown to be an important fuel used by gut mucosa cells as a regulator of cell proliferation and as an essential aminoacid for mucosal growth and function [30]. I/R injury of the small intestine originates marked alterations, mainly in the mucosal layer. They are produced not only during ischemia, but also after reperfusion [31]. In the present study, histological findings of intestinal damage were observed after I/R in the control group, but the damage was less severe in the groups 2, 3 and 4. Our results clearly showed that GL and GLN pretreatment protected the ileum from I/R injury, and the combined use of GL and GLN was the most effective in protecting mucosa.
In this study, increased serum levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 refleted the ischemia/reperfusion injury, as demonstrated by other in vivo trials [3,32]. It has been suggested that IL-6 produced by intraepithelial lymphocytes is responsible for the loss of intestinal barrier function following hemorrhage, and the extent of loss can be correlated with plasma levels of this cytokine [33]. In rats treated with GL it was observed a significantly different cytokine response, which was characterized by decreased production of TNF-α and IL-6, compared with controls and rats treated with GLN, suggesting that immunomodulation with soluble glucan might act to depress the inflammatory cytokine response. The decrease in secretion of these pro-inflammatory cytokines coincided with the increase in IL-10 secretion and could, at least in part, be explained by the action of this cytokine, known to have anti-inflammatory activity. In fact, IL-10 has been shown to inhibit lipopolissacharide-induced monocyte tissue factor expression in whole blood [34], and to decrease TNF-α production in human monocytes [35]. It is known that the sole surgical insult produces cytokine expression under normal circumstances. In this study, cytokines expression was considered zero in sham animals because they were not detected in serum by the used methodology. By the way, the sensitivity of detection was 30 pg/mL to all cytokines. Surgery leads to a transitory immunosuppression , which is associated with decreased GLN levels and increased susceptibility to infection and sepsis. A clinical trial in major abdominal surgery patients was performed with infusion of GLN. The treatment reduced serum TNF-α and immunossuppression [36]. Clinical administration of purified soluble glucan has a number of desirable effects on immune function, including the ability to confer resistance to tumors and various infectious conditions. These findings have stimulated interest in the development of glucan-based therapeutics [37,38].
In conclusion, the isolated use of subcutaneous GL or oral GLN significantly reduced BT in intestinal I/R rats, with GL showing more effectiveness than GLN. The combined administration of GL+GLN considerably attenuated BT, intestinal injury and cytokine production, compared with the isolated treatment. Therefore, the use of GL combined with GLN may be a therapeutic target for future clinical trials in trauma and immunossuppressed patients.
Acknowledgement: This work was partially funded by a grant from CNPq (521341/96), Brazil.
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32
3.3. ARTIGO III - Efeitos das vitaminas A e C em anastomoses intestinais de ratos tratados com corticosteróide1
Publicado na Acta Cirúrgica Brasileira 2003;18 (supl1):28 – 32.
Effects of vitamines A and C on the healing of intestinal anastomosis of rats treated with corticosteroid
Aldo da Cunha MedeirosI,; Dâmaso de Araújo ChaconII; Tertuliano Aires NetoII; Francisco Pignataro Lima III; Ítalo Medeiros de AzevêdoIV; Marília Cavalcanti da TrindadeV
IDr. em Cirurgia, Chefe do Núcleo de Cirurgia Experimental, UFRN, Pesquisador nível 1 do CNPq IIProf. do Departamento de Cirurgia, UFRN; Aluno do programa de Pós-graduação IIIMestre e Prof. do Departamento de Patologia, UFRN IVAluno do Departamento de Estatística, UFRN VBolsista Monitora de Técnica Operatória
RESUMO
OBJETIVOS: Estudo experimental realizado com o propósito de verificar a possibilidade das vitaminas A e C reverterem os efeitos deletérios do corticosteróide na cicatrização de anastomoses do intestino delgado. MÉTODOS: Foram utilizados 50 ratos Wistar, pesando 247± 22g, divididos aleatoriamente em cinco grupos de dez animais, observados em gaiolas individuais com água e alimento ad libitum. A anestesia foi feita com pentobarbital sódico na dose de 20 mg/Kg e operados sob condições assépticas. Durante sete dias no pré-operatório e por sete dias no pós-operatório, os grupos foram assim tratados com doses farmacológicas: I-controle; II-metilprednisolona IM; III- metilprednisolona + vitamina A; IV- metilprednisolona + vitamina C; V- metilprednisolona + Vit. A + Vit. C. Foi feita ressecção de segmento de 1 cm do íleo terminal e anastomose em pontos simples separados. Após sete dias de observação foi determinada a pressão de ruptura das anastomoses, que foram em seguida ressecadas, fixadas em formol 10%, processadas com técnica padrão para histopatologia com coloração HE e tricrômico de Masson. Os dados foram analisados pelo teste t de Student com significância 0,05. A pressão de ruptura das anastomoses do controle não mostrou diferença com o grupo V (p>0,05) e foi significativamente maior que a dos grupos II, III e IV (p<0,05). Entre os grupos III e IV não houve diferença significante (p>0,05). O controle apresentou histopatologia uniforme atingindo escore 142± 17, significativamente maior que no grupo II (95± 22) e não mostrou diferença significante nos escores com o grupo V (153± 15). CONCLUSÃO: Concluiu-se que a metilprednisolona exerce um efeito deletério sobre a cicatrização de anastomoses intestinais em ratos e as vitaminas A e C, quando usadas associadas, contribuíram para reverter esse efeito.
33
Descritores: Vitaminas A e C. Cicatrização. Intestino. Anastomose.
ABSTRACT
OBJETIVE: There is a need to clearly define the affect of A and C vitamines in the healing of intestinal anastomosis on individuals under corticosteroid treatment, and this is the objetive of this study. METHODS: Fifty Wistar rats weighing 247± 22g were randomly separated in five groups. They were observated in individual cages with water and standard food ad libitum. The anesthesia was done with sodium pentobarbital 20 mg/Kg, intraperitoneal. During seven days preoperative and seven days after surgery, the groups were ubmmited to the protocol: I-control; II-metilprednisolone IM; III-metilprednisolone + vitamine A; IV- metilprednisolone + vitamine C; V-metilprednisolone + Vit. A + Vit. C. An enterectomy (1cm) and anastomosis was done, using nylon 6-0. In the seventh postoperative day, the tensil strength of the anastomosis was measured and a representative sample of the healing tissue was fixed in formaline 10% to histopatologic study under hematoxilin-eosine Masson tricromic process. The data were analised by the t Student test, considering significance 0,05. RESULTS: The bursting pressure of anastomosis of the group I (control) had no difference when compared with V group (Vitamine A and C) ( p>0,05). The difference was statisticaly significant when the I and V groups were compared with the II, III and IV groups (p<0,05). An insignificant difference was observed between the III e IV groups (p>0,05). The control group (I) had histopatologic score 142± 17, significantly shorter than group II - metilprednisolene - (95± 22). The difference was not significant when compared the control and the V group (Vitamin A and C), with the score (153± 15). CONCLUSION: the vitamin A and C, when used toghether, contributes to revert the deleterious effects of corticosteroid in the healing of intestinal anastomosis in rats.
Keywords: Vitamin A and C. Healing. Intestine. Anastomosis.
INTRODUÇÃO
Deiscência de anastomose e fístula clinicamente evidentes ocorrem em aproximadamente 5 a 10% dos pacientes submetidos a anastomoses do cólon. No intestino delgado a incidência tem-se mostrado menor1,2. Estudos retrospectivos têm mostrado que, se as fístulas ocorrem, a duração da hospitalização pode duplicar e a mortalidade pós-operatória triplicar1,3. Cerca de 20 a 80% de todas as mortes pós-operatórias podem ser atribuídas a fístulas anastomóticas e suas conseqüências, que incluem abscesso, peritonite e sepse3,4,5. Tem sido demonstrado que, em ratos, os corticosteróides prejudicam a cicatrização de lesões da pele e que a vitamina A é capaz de reverter esses efeitos5. Embora muitas séries retrospectivas tenham mostrado uma maior tendência a fístulas e deiscência de anastomoses intestinais em pacientes tratados com corticosteroides, as diferenças não foram estatisticamente significantes em vários estudos. Diversos estudos apresentaram dados demonstrando evidente predisposição para deiscência de
34
anastomoses nos casos em que os pacientes eram usuários crônicos de
corticosteroides3,6.
As operações do tracto digestivo estão entre as mais freqüentemente realizadas. Os conhecimentos atuais na cicatrização das lesões do tracto digestivo têm avançado e hoje já se entende melhor o impacto de fatores locais e sistêmicos na cicatrização das anastomoses. Entretanto, as fístulas e deiscências anastomóticas permanecem um problema freqüente e grave, associadas com alta mortalidade. Em virtude se ser difícil de examinar os mecanismos de cicatrização de lesões gastrointestinais em modelos clínicos, muito tem sido aprendido através de modelos animais, com limitações por muitos consideradas aceitáveis7. O ácido ascórbico (vitamina C) tem funções biológicas e metabólicas da maior importância, particularmente no que diz respeito ao seu papel na biossíntese do tecido conjuntivo8. A vitamina C participa da hidroxilação da prolina e da lisina, reação indispensável para que ocorra a maturação do colágeno e consequentemente a resistência das feridas à tensão9,10. Tem sido descrito que a suplementação de vitamina C tanto recupera o déficit da vitamina quanto aumenta a síntese do colágeno11,12. Dessa maneira, o uso dessa vitamina em quantidades maiores do que a dose necessária para as necessidades diárias, não apenas é necessário para a biossíntese do colágeno, mas também, para a regulação de outras condições fisiológicas durante o processo de cicatrização das feridas.
O presente trabalho tem o objetivo de estudar, em modelo animal, se a administração de dose acima da fisiológica, de corticosteroide exógeno, prejudica a cicatrização de anastomoses intestinais e se a administração de vitaminas A e C pode reverter esse efeito.
MÉTODOS
Foram utilizados 50 ratos Wistar adultos, fornecidos pelo Biotério do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN, divididos aleatoriamente em 5 grupos de 10 animais. Eles foram observados em gaiolas individuais com água e alimento "ad libitum", anestesiados com pentobarbital sódico na dose de 20 mg/Kg e operados sob condições assépticas. Durante 1 semana no pré-operatório os animais receberam injeções intramusculares de metilprednisolona ou de solução salina, dependendo do grupo, e as seguintes suplementações de vitaminas, conforme o protocolo da tabela 1:
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A dosagem de metilprednisolona foi equivalente a 40 mg de prednisona por dia em média para o homem adulto de 70 Kg. As doses das vitaminas estão abaixo da dose tóxica para o rato. Os animais foram pesados diariamente em balança digital. Após 12 horas usando apenas água, todos os animais foram submetidos a laparotomia mediana de 4 cm, identificação de alça ileal a 5 cm da transição ileocecal. Foi feita ressecção de 1,0 cm de intestino, que foi imediatamente anastomosado com fio de monofilamento de nylon nº 6-0 em pontos simples separados, plano único. Após sete dias de observação, todos os ratos foram relaparotomizados sob anestesia geral para determinação da pressão de ruptura das suturas "in situ" sem interrupção do suprimento sangüíneo nem das aderências intraperitoneais. A alça em estudo foi ligada com fio de algodão nº 00 à jusante da anastomose e um tubo de polietileno nº 4 foi inserido na mesma alça à montante da anastomose, fixando-se firmemente a alça em torno do tubo de modo a vedar o escapamento de ar. Em seguida foi preenchida a cavidade abdominal com solução salina e insuflado ar sob pressão através do tubo antes posicionado com fluxo de 0,5 litro/minuto. Quando surgiu borbulhamento de ar na solução salina foi anotado o momento de ruptura da anastomose através de manômetro intercalado em Y e determinada a pressão máxima de ruptura. Em seguida os animais receberam dose letal de anestésico, o tubo de polietileno foi cuidadosamente retirado, a zona da sutura intestinal ressecada e fixada em formol 10%. As lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson, processadas de acordo com a rotina. A avaliação histológica das lâminas foi feita utilizando-se um sistema digitalizador e analisador de imagens. A área total dos campos microscópicos foi observada utilizando-se microscópio óptico (Olimpus), cuja imagem foi capturada por câmera e digitalizada através de Software Image Pro-plus, versão 3.0 (Media Cybernetics - LP, USA). Foram avaliados dez campos aleatórios de cada lâmina. Após selecionada a resolução desejada, os impulsos ópticos foram digitalizados, resultando em uma imagem de cada campo que foi armazenada e processada em sistema multimídia. As lâminas foram examinadas para quantificação dos elementos da reação inflamatória como quantidade de fibroblastos, de neutrófilos, neovasos, reepitelização, tecido de granulação e fibras colágenas, sob a forma de densidade mínima, máxima e média.
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Os dados foram expressos em média± desvio padrão e a diferença entre as médias foi feita usando-se a análise de variância e o teste t de Student, com significância de 0,05.
RESULTADOS
Ocorreu boa evolução pós-operatória dos animais. Os que receberam metilprednisolona (grupos II, III, IV e V) tiveram um decréscimo ponderal significativo, enquanto no grupo controle não houve diferença significativa entre a média de pesos no pré-operatório e após sete dias de pós-operatório. Dos dez animais que receberam apenas corticóide (grupo II), quatro deles apresentaram deiscência de pele com graus variados de infecção.
As suturas intestinais dos animais do grupo I estavam íntegras. No grupo II ocorreram duas fístulas tamponadas por epiplon, no grupo III e IV apenas uma
fístula tamponada foi detectada em cada grupo e, no grupo V, todas as suturas estavam íntegras, compatíveis com as do grupo de controle. A figura 1 mostra as pressões intraluminares de ruptura das suturas intestinais. A pressão necessária para romper as suturas dos animais do grupo de controle foi significativamente maior do que nos grupos II, III e IV. Comparando-se os grupos III e IV não houve diferença significativa entre as médias das pressões suportadas pelas suturas intestinais (p>0,05). Entretanto, quando foi comparado o grupo II (corticóide) com os grupos III e IV, houve diferença significativa. O grupo V teve a pressão de ruptura menor que o grupo de controle, sem significado estatístico (p>0,05).
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Os animais do grupo controle apresentaram padrão morfológico do ponto de vista histopatológico uniforme, com a presença de tecido de granulação compacto formado por fibras colágenas abundantes de permeio a neoformação vascular e células inflamatórias. Nos ratos que receberam apenas corticóide (grupo II) observou-se padrão morfológico mais heterogêneo, com tecido conjuntivo menos exuberante, constituído por fibras colágenas menos desenvolvidas de permeio à neoformação vascular pouco presente. O padrão histológico dos grupos III e IV não mostrou diferença entre eles. Porém, aproximou-se mais do grupo de controle, o mesmo ocorrendo com os cortes histológicos do grupo V. Os dados histológicos quantificados em densidade média encontram-se resumidos na tabela 2.
DISCUSSÃO
Sem dúvida, as anastomoses digestivas representam uma das áreas mais estudadas no campo da cicatrização das feridas. Credita-se ao uso dos corticosteroides efeitos adversos à cicatrização de diversos órgãos, porém os resultados dos estudos experimentais que têm investigado essa questão são controversos13,14. avaliação cicatricial em anastomoses intestinais após o emprego de corticoides também é conflitante15,16,17,21. Embora existam diversos estudos experimentais sobre a relação entre o uso de corticosteróides e a cicatrização, sua interpretação é dificultada pela grande variação de métodos e equipamentos para a aferição dos parâmetros estudados.
No presente trabalho a dose de metilprednisolona foi escolhida com base em estudos anteriores, que verificaram ser esta a dose mínima capaz de afetar a cicatrização18. Segundo vários autores, os efeitos prejudiciais dos corticosteróides são mais evidentes quando a droga é administrada previamente ao ato cirúrgico e mantida no pós-operatório13,14. No presente trabalho foi seguida essa metodologia, tendo-se iniciado o uso da droga uma semana antes da operação. O início do tratamento com corticosteróides, no período pós-operatório, parece não interferir com a cicatrização14,19,20. A redução ponderal dos ratos submetidos aos corticosteróides também é conhecida por outros autores14,19.
Os dados deste estudo indicaram uma queda na resistência das suturas intestinais dos ratos em uso da metilprednisolona no sétimo dia de observação,
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o que foi observado por outros autores17. Tal resultado pode decorrer de um retardo na deposição de colágeno, com conseqüente redução da resistência nas suturas. Acima de 14 dias não tem sido observada diferença na resistência das anastomoses em relação ao controle15,17. O tempo de sete dias para a determinação da resistência à pressão intraluminal foi escolhido no presente trabalho, tomando por base estudos anteriores que têm demonstrado tendência de ruptura das alças intestinais fora das linhas de sutura, quando o tempo de observação é maior do que sete dias. O uso das vitaminas A e C melhoraram a resistência das suturas tratadas com corticóide, sem diferença significativa entre essas vitaminas, como foi sugerido pelos trabalhos de outros autores, especialmente no que diz respeito à vitamina A5. Vários métodos têm sido utilizados para aferir a resistência de suturas e a respectiva histometria22,23,24,25. A sistemática adotada no presente trabalho com o emprego de sistema digital de captação de imagem e tensiômetro eletrônico dotado de software específico tem mostrado resultados satisfatórios.
A histologia evidenciou atraso na formação de tecido cicatricial dos ratos que receberam metilprednisolona por 14 dias. Os ratos do grupo de controle mostraram tecido conjuntivo bem formado e rico em fibras colágenas, enquanto os grupos que receberam corticosteróide apresentaram proliferação de fibroblastos e células inflamatórias, com fibras de colágeno escassas e desordenadas. O uso das vitaminas A e C, concomitantemente, conseguiu reverter os efeitos deletérios do corticosteróide nas suturas do íleo.
CONCLUSÃO
Os dados coletados no presente trabalho permitem concluir que a metilprednisolona retardou a cicatrização de lesão praticada no jejuno de ratos e que as vitaminas A e C, em associação, podem ter contribuido para reverter a ação da droga.
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Endereço para correspondência
Aldo da Cunha Medeiros Av. Miguel Alcides Araújo 1889 59078-270 Natal, RN
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3.4. ARTIGO IV - Achados da fundoscopia e alterações do pé diabético em pacientes do Hospital Universitário Onofre Lopes/UFRN1
Publicado na Acta Cirúrgica Brasileira 2005;20 (supl1):03 - 07.
Fundoscopic alterations and diabetic foot in patients of Hospital Universitário Onofre Lopes/UFRN
Damaso de Araújo ChaconI; Andréa Dore da Silva Magalhães ChavesII; Raquel Amorim DuarteII; Carlos Alexandre de Amorim GarciaIII; Aldo da Cunha MedeirosIV
IProf. Adjunto do Departamento de Medicina Integrada, Disciplina de Doenças do Sistema Cardiovascular-CCS/UFRN, aluno do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde-UFRN (doutorado) IIMédicas Residentes-R2, Residência em Oftalmologia/HUOL/UFRN IIIProf. Dr. do Departamento de Cirurgia-CCS/UFRN, Coordenador da Residência Médica em Oftalmologia do HUOL/UFRN IVProf. Dr. do Departamento de Cirurgia-CCS/UFRN, Chefe do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN, Pesquisador nível I do CNPq, Orientador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde-UFRN
RESUMO
OBJETIVO: Trabalho com o objetivo de identificar as alterações do pé diabético causadas pelas lesões microangiopáticas e das lesões do fundo de olho secundárias aretinopatia diabética. MÉTODOS: 76 pacientes com Diabetes Melito tipos 1 e 2 atendidos no ambulatório de Oftalmologia e Cirurgia Vascular do HUOL/UFRN, Natal, RN, no período de novembro de 2004 a janeiro de 2005, com queixas relativas a alterações da retinopatia diabética e/ou do pé diabético. Em todos os pacientes foi realizado exame clínico geral, vascular e oftalmológico. Na avaliação específicado pé diabético deu-se ênfase paraa investigação do status vascular pela classificação de Fontaine para Doença Arterial Obstrutiva Periférica, biomecânica,e teste do monofilamento de Semmes-Weinstein. O exame oftalmológico constou de refração e fundoscopia através da qual identificou-se as formas clínicas da retinopatia diabética. Os dados foram submetidos à análise estatística das variáveis primárias que consistiu em caracterizar o grupo quanto a idade, tempo de doença, nível de glicose. A segunda estratégia da análise dos dados constituiu na realização de testes de associação entre algumas variáveis secundárias selecionadas. O software utilizado para os testes estatísticos foi Statistica Versão 5, 1997.RESULTADOS: Dos 76 pacientes diabéticos 97% tinham idade superior a 40 anos. O tempo de doença 65% tinham mais de 10 anos. Com relação à glicose 72,72% apresentaram níveis de glicose em jejum acima de 100mg/dl. 55,26% apresentavam algum grau de retinopatia diabética contra 44,74% que não apresentavam esses sinais. Com as alterações do pé diabético, identificou-se 59,93% com lesões com área de predominância isquêmica, enquanto 41,07% tinham ausência de sinais. 58,82% apresentaram área de predominância neuropática, e 41,18% sem sinais de neuropatia. Com retinopatia diabética 78,57% tinham comprometimento isquêmico no pé e 47,62% tinham algum
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grau de neuropatia diabética. Observou-se que a retinopatia diabética não proliferativa, nos seus diversos graus de comprometimento apresentou-se com percentuais em torno de 80% junto às lesões do pé diabético, seja isquêmico ou neuropático. Dos pacientes que tinham retinopatia 60,46% tinham alterações biomecânicas dos pés. CONCLUSÃO: Concluiu-se que a RDNP leve foi mais freqüente nas lesões do pé diabético isquêmico, enquanto a RDNP severa mostrou-se mais presente no pé diabético neuropático.
Descritores: Neuropatia Diabética, Retinopatia Diabética, Microangiopatia, Pé Diabético
ABSTRACT
PURPOSE: To identify diabetic foot abnormal changes caused by microvascular events and fundoscopy eye lesions due to diabetic retinopathy. METHODS: A survey was performed with 76 diabetic patients from the Hospital Onofre Lopes out-patient department of ophtalmology and vascular surgery. To evaluate the diabetic foot the patients were submmited to an individual interview using Fontaine classification. The vascular test used was Semmes-Weinstein monofilament. Refraction and eye fundoscopy were acomplished in all patients to arrange the diabetic retinopathy.The study results consisted in characterized the group as age,time of disease and glicose level. The second analyse was performed with association tests among the selected secondary study results. " Statística Versão 5,1997 " was the software available. RESULTS: From 76 diabetics patients 97% had age higher than 40 years. 65% had more than 10 years of time disease. 72,72% obtained glicose level>100mg/dl. 55,5% had some degree of diabetic retinopathy against 44,74% had not. About the diabetic foot abnormalities, 59,93% had ischemic damages and 41,07% had not signs. 58,82% had neuropathic foot and there were 41,18% patients without diabetic neuropathy signs. Talking about the diabetic retinopathy population, 78,57% had ischemic foot and 47,62% had neuropathic foot. It was seen 80% of no proliferative diabetic retinopathy in all diabetics foot ( isquemic and neuropathic).The patients with retinopathy 60,46% of them had foot biomechanics abnormalities.CONCLUSION: Light no proliferative diabetic retinopathy was most common in patients with ischemic diabetic foot. The severe no proliferative diabetic retinopathy was most common in patients with neuropathic diabetic foot.
Keywords: Diabetes Neuropathy. Diabetes Retinopathy. Microangiopathy. Diabetic Foot.
Introdução
As conseqüências do Diabetes Melito em longo prazo decorre de alterações micro e macrovasculares que levam a disfunção, dano ou falência de vários
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órgãos. As complicações crônicas incluem a nefropatia, com possível evolução para insuficiência renal, a retinopatia, com a possibilidade de cegueira e a neuropatia, com risco de úlceras nos pés e até amputações1. O Diabetes Melito constitui um dos maiores problemas de saúde. Sua incidência e prevalência estão aumentando, alcançando proporções epidêmicas. Está associado a complicações que comprometem a produtividade, a qualidade de vida e a sobrevida dos indivíduos. Além disso,acarreta altos custos para seu controle metabólico e tratamento de suas complicações. Hoje, sabe-se que o Diabetes Melito constitui a principal causa de amputações primárias dos membros inferiores é, também, a principal causa de cegueira adquirida1.
É conhecido que em torno de 120 milhões de pessoas no mundo são portadoras de Diabetes Melito2. Nos Estados Unidos a doença afeta aproximadamente 6.25%, aproximadamente 16 milhões de pessoas 3.Em nosso país,os índices de mortalidade por essadoença é de 16,8 óbitos para 100 mil brasileiros, atingindo índices maiores em grupos etários acima dos 80 anos (319,2 para 100 mil habitantes)4. Aretinopatia diabética constituia principal complicação do Diabetes Melito apresentando um risco de cegueira 25 vezes maior do que no resto da população. 5 Nos EUA, constituia segunda causa de cegueira e calcula-seque 8000 novos cegos surgem a cada ano devido à retinopatia diabética.5
Entre os fatores de risco atribuídos ao desenvolvimento destas complicações, estão: fatores demográficos, raça, genética, idade, sexo, tempo de evolução do diabetes, tipo de tratamento do diabetes, controle metabólico, gravidez, tabagismo, entre outros.6 A retinopatia diabética pode ser classificada em proliferativa e não proliferativa. A forma não proliferativa pode ainda ser subdividida em leve, moderada e severa e muito severa. Já a proliferativa em precoce e de alto risco.7,8A maioria delas culmina com baixa da acuidade visual eaté cegueira em estágios mais avançados da doença. Os neovasos formados poderão levar ao descolamento do vítreo posterior, hemorragia e descolamento de retina. Outras complicações são: glaucoma neovascular, catarata, diminuição da sensibilidade corneana.9,10 Apesar disso, poucos são os dados que se temrelacionando às alteraçõesda retinopatia diabética e pé diabético.
Tendo em vista esses fatos é importante ampliar conhecimentos que denunciem o grau de comprometimento desses órgãos e que identifique características das complicações da microangiopatia diabética entre os achados do fundo de olho e alterações do pé diabético. Este trabalho tem como objetivo identificar as alterações do pé diabético pelas lesões microangiopáticas e as lesões do fundo de olho pela retinopatia diabética.
Métodos
Trata-se de um estudo prospectivo de um grupo de 76 pacientes atendidos no ambulatório de Oftalmologia e Cirurgia Vascular do Hospital Universitário Onofre Lopes- Natal, RN,no período de novembro de 2004 a janeiro de 2005 e submetido aapreciação do Comitê de Ética daUFRN.
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Foram incluídos pacientes portadores de Diabetes Melito Tipos 1 ou 2 com confirmação laboratorial, que procuraram o Hospital Universitário Onofre Lopes comqueixas relativas a alterações da retinopatia diabética e/ou do pé diabético, sejam elas primárias ou recidivantes, independente do sexo, raça, cor, procedência e profissão. Foram excluídos da pesquisa diabéticos que não apresentaram nenhuma das alterações do fundo de olho ou do pé diabético, os que não concordaram com a participação, deficientes mentais e gestantes.
Em todos os pacientes foi realizado exame clínico constituído de: Anamnese, exame físico geral, vascular e oftalmológico. Na avaliação específicado pé diabético investigou-se o status vascular pela Classificação de Fontaine para Doença Arterial Obstrutiva Periférica,a integridade da pele, biomecânica,presença ou ausência dos pulsos, provas funcionais de isquemia plantar,rubor de declive e enchimento venoso,e teste do monofilamento de Semmes-Weinstein.O exame oftalmológico constou de refração e fundoscopiaatravés da qual identificou-se as formas clínicas da retinopatia diabética.
Os dados foram submetidos à análise estatística das variáveis primárias que consistiu em caracterizar o grupo quanto a idade, tempo de doença, nível de glicose A segunda estratégia da análise dos dados constituiu na realização de testes de associação entrealgumas variáveis secundárias selecionadas. O software utilizado para os testes estatísticos foi o Statistica Versão 5, 1997.
Resultados
Dos 76 pacientes diabéticos objeto desta investigação 97% tem idade superior a 40 anos (figura 1). No que concerne ao tempo de diagnóstico da doença verificou-se que mais de 65% têm doença há mais de 10 anos. (figura 2)
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Com relação à glicose 72,72% apresentaram níveis de glicose em jejum acima de 100mg/dl. Ressalte-se que, embora a amostra seja constituída de 76 pacientes, observa-se que para algumas variáveis este número sofreu pequenas variações por falta de informação do paciente, como por exemplo, apenas 54 pacientes apresentaram os resultados do exame de glicose. (figura 3)
Dos 76 pacientes estudados 55,26% apresentavam algum grau de retinopatia diabética contra 44,74% que não apresentavam esses sinais.( tabela 1). Com relação às alterações do pé diabético, identificaram-se 59,93% com lesões com área de predominância isquêmica, enquanto 41,07% tinham ausência de
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sinais. 58,82% apresentaram área de predominância neuropática, e 41,18% sem sinais de neuropatia. (tabela 1)
Dos pacientes com retinopatia diabética 78,57% tinham comprometimento isquêmico no pé e 47,62% tinham algum grau de neuropatia diabética. (tabela 2 e 3). Observa-se que a retinopatia diabética não proliferativa, nos seus diversos graus de comprometimento apresentou-se com percentuais em torno de 80% junto às lesões do pé diabético, seja isquêmico ou neuropático. Dos pacientes que tinham retinopatia, 60,46% tinham alterações biomecânicas dos pés. (tabela 4)
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Discussão
Inúmeros trabalhos sobre retinopatia e pé diabético têm seguido protocolos distintos, apesar de a microangiopatia constituir fator etiopatogênico comum8,
11,12 ,13. Segundo o ETDRS um dos propósitos do estudo foi conhecer dados da história natural da doença para serem utilizados na identificação dos fatores de risco da retinopatia diabética, alem de avaliar qual o melhor tempo para o seu tratamento com fotocoagulação8. Sabe-se também que desde o final dos anos 50 uma série de estudos sobre retinopatia têm surgido com a identificação de alguns preditores nos fatores de risco da Diabetes Melito8,11,12.
No Brasil protocolos são conhecidos na investigação do pé diabético, mas há carência do registro de dados específicos sobre o assunto, muito embora a prática clínica dos profissionais que lidam com o problema leve-os a constatar a freqüência de pacientes com complicações em pés13 . No presente estudo, as variáveis como idade, tempo de doença, níveis de glicose estão de acordo com trabalhos já publicados14. As faixas etárias acima dos 40 anos de idade representaram mais de 98% do grupo com complicações do diabetes melito estudados. Comprometendo, portanto, um grande número de pessoas na fase produtiva de suas vidas . Confirma-se também que o diabetes melito costuma iniciar suas complicações a partir dos 10 anos de doença15.
Com relação à glicose observou-se que níveis abaixo de 150mg/dl , portanto próximos da normalidade, não garantiram a ausência das complicações. Torna-se necessário um controle mais rigoroso do perfil dos níveis de glicose, ao longo de um tempo para melhor prevenção da doença. A presença das alterações da retina e do pé do diabético na evolução do diabetes melito16, reforça a busca por protocolos mais unificados para melhor avaliar as complicações causadas pela microangiopatia
Com base nos resultados encontrados concluímos que a RDNP leve foi mais freqüente nas lesões do pé com predominância isquêmica, enquanto a RDNP severa representou a forma clínica da retinopatia diabética mais freqüente dos diabéticos com as lesões do pé de predominância neuropática.
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Endereço para correspondência Dâmaso de Araújo Chacon Rua Almte. Nelson Fernandes, 797/1200 59022-600 – Natal, RN
50
4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES
4.1. Identificação do Tema
A motivação para se estudar a biodistribuição do Na99mTcO4 em modelo
animal de ressecção extensa do intestino delgado, ocorreu pelo pouco estudo
existente sobre biodistribuição de radiofármacos em casos cirúrgicos, se
comparado às inúmeras pesquisas desenvolvidas na área clínica.8,9,10,19,20,21
Optou-se por uma intervenção cirúrgica de grande porte que levasse a
uma condição extremamente desabsortiva, passível da necessidade de
avaliação morfo-funcional dos órgãos envolvidos no processo.
Conhecer o perfil da biodistribuição do radiofármaco nesta condição foi
objetivo deste trabalho, além de contribuir para a possível interpretação de
exames cintilográficos pós-operatórios, evitando a repetição desnecessária de
exames duvidosos.
A intervenção cirúrgica realizada, apesar da extensa mutilação
provocada no intestino, não interferiu na biodistribuição do Na99mTcO4 tendo
como provável causa a capacidade de adaptação da mucosa intestinal dos
roedores, que é complexa e multifatorial.35-37 Trabalhos sobre cirurgia da
síndrome do intestino curto em humanos referem que o fenômeno de
adaptação também ocorre, porém de uma maneira mais lenta do que a
observada em ratos.30,45
O monitoramento pós-operatório de portadores da síndrome com
exames complementares que podem incluir cintilografia, torna-se importante,
tendo em vista seu índice de complicações em torno de 25%.46 Avanços no
51
tratamento incluem procedimentos de alta complexidade como a nutrição
parenteral total, o uso de hormônios e tentativas de correção cirúrgica.
Entretanto, apesar desse progresso, a mortalidade situa-se em torno de
30%.46,47 A nutrição parenteral destaca-se como fator decisivo no aumento da
sobrevida desses pacientes, podendo ser responsável por complicações como
trombose venosa profunda, septicemia, doença hepática, necessitando, dessa
forma, de uma avaliação morfo-funcional.48,49
4.2. Comentário sobre a Metodologia
A escolha da unidade experimental de ratos Wistar para esse trabalho
deveu-se ao fato de ter sido o animal usalmente utilizado em estudos
anteriores sobre biodistribuição de radiofármacos12,14,18. Em roedores, a
capacidade de adaptação da mucosa intestinal é rapida, reforçando assim o
modelo experimental adequado para o presente estudo.50,51 Iniciou-se com um
ensaio piloto, tendo em vista que tratava-se de um procedimento cirúrgico de
grande porte, que interferiria intensamente no metabolísmo do animal. Apesar
da mortalidade em humanos submetidos à essa operação ser considerada alta,
todos os animais sobreviveram ao experimento.47
As técnicas cirúrgicas foram padronizadas e necessitaram do uso de
avental de chumbo e proteção da tireóide, dificultando a mobilidade do
cirurgião, porém foram superadas.52-54
No início do experimento a equipe submeteu-se a treinamento para uso
do Contador Gama (Wizard PerkinElmer) e capacitação para manuseio e bio-
segurança de radiofármacos. Os experimentos somente foram iniciados após o
52
credenciamento do Laboratório de Radiobiologia do Núcleo de Cirurgia
Experimental da UFRN pela Comissão Nacional de Energia Nuclear (Registro
AP-0209).
Teve-se o cuidado de determinar uma amostra padrão da mesma
quantidade de Na99mTcO4 utilizada via plexo venoso orbital, tendo em vista que
o Contador Gama identifica automaticamente o decaimento do radiofármaco.
Portanto, para diminuir o erro do provável resíduo do radiofármaco na seringa,
foram colocados no equipamento três tubos de ensaio para controle, com
quantidade de solução de Na99mTcO4 igual à inoculada em cada rato.
Para a análise da biodistribuição fez-se o cálculo do percentual de
atividade por grama (%ATI/g) do Na99mTCO4 em cada órgão a partir da
contagem de desintegração por minuto informado pelo contador. Buscou-se
correlacionar o %ATI/g de cada órgão com seus pesos pelo coeficiente de
correlação de Pearson. Para verificar se essas diferenças eram
estatisticamente significantes, empregou-se a análise de variância paramétrica
(ANOVA), para saber se existia diferença entre pelo menos dois dos três
grupos, o que não ocorreu. Entretanto, verificou-se diferença entre os grupos,
com relação ao comprimento da mucosa e submucosa do jejuno. Procedeu-se
então ao teste de comparações múltiplas de Tukey para identificar quais
grupos diferiram entre si em relação a essa variável.
4.3. Méritos e Contribuições
Os resultados deste estudo encontram respaldo em trabalhos sobre os
mecanismos de adaptação intestinal.28,31,34,37,38,40
53
Observou-se um decréscimo dos pesos no pós-operatório imediato do
grupo IC e recuperação da curva ponderal a partir da segunda semana de pós-
operatório. Isto confirma estudos anteriores em que foram observadas
adaptações morfológicas e funcionais do jejuno entre a primeira e segunda
semana de pós-operatório.29 A adaptação da mucosa após ressecção do
intestino têm sido objeto de estudo, mas raramente é vista de uma maneira
integral priorizando um contexto funcional mais amplo. Certamente porque uma
grande variedade de fatores pode ter papel relevante no processo desta
adaptação.
O presente trabalho mostrou-se relevante, pois contribuiu para
esclarecer vários aspectos sobre o tema em estudo. Em primeiro lugar, o
modelo de ressecção intestinal de 90% do órgão revelou-se factível em ratos e
não resultou em mortalidade dos animais; em segundo lugar, a ressecção
implicou em rápida adaptação do intestino com hipertrofia de mucosa e
recuperação do peso; e por último, a intervenção cirúrgica em ratos não
provocou alterações na biodistribuição do Na99mTcO4 nos diversos órgãos
estudados.
O desafio a partir de então será a ampliação da investigação científica
nesta linha e em conseqüência o empenho em novas publicações.
4.4. Metas Futuras
A pretensão de colaborar com o Núcleo de Cirurgia Experimental da
UFRN nas demais pesquisas sobre biodistribuição de radiofármacos tornou-se
54
patente, tendo em vista a experiência adquirida e a convicção de crescimento,
nesta área do conhecimento, como professor da UFRN. Ratifica-se, desta
forma, o compromisso com a orientação de alunos da iniciação científica e
posteriormente da pós-graduação.
Por fim, a conclusão deste trabalho evidenciou o propósito do Programa
de Pós-Graduação do Centro de Ciências da Saúde-UFRN, onde a inter e
transdisciplinaridade ocorreu quando a promoção do conhecimento científico
estabeleceu-se entre profissionais das diversas áreas de domínio, assim como
entre as instituições conveniadas.
55
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Abstract
Massive resection of the small intestine results in short bowel syndrome with
anti-absorptive effect and repercussions on the metabolism. Morphologic and
functional evaluation may be necessary in order to control wrapped organs.
Scintigraphy an examination with little invading and no biologic damage can be
used. The purpose were to assess the biodistribution of sodium pertecnetate in
organs of rats subjected to massive resection of the small intestine, the
intestinal adaptation of the remnant intestinal mucosa and weight curve
evaluation in the postoperative period. Twenty-one Wistar rats were randomly
allocated into three groups (n = 7). The operated group named short bowel (SB)
after anesthetized was subjected to massive resection of the small intestine; the
control group (C), and sham group (SHAM). On the 30th postoperative day, 0.l
mL of sodium pertechnetate was injected into the venous orbital plexus. After
30 minutes, the rats were killed with an overdose of anesthetic, and fragments
of the liver, spleen, pancreas, stomach, duodenum, small intestine, thyroid, lung,
heart, kidney, bladder, muscle, femur and brain were harvested. The
percentage of radioactivity per gram of tissue (%ATI/g) was determined using
Gama Counter WizardTM 1470, PerkinElmer to all samples. Biopsies of 3 cm
remaining jejunum were removed to histological analyses. Analysis of variance
(ANOVA) and the Tukey test for multiple comparisons were used, considering
p<0.05 as significant. The study had the participation of some departments and
laboratories, as Nucleus of Experimental Surgery, Department of Surgery,
Laboratory of Radiobiology, Department of Pathology and Service of Nuclear
Medicine, certifying the character of a multidisciplinary research. The results
were no significant differences in %ATI/g of the sodium pertechnetate in the
organs of the groups studied (p>0.05). An increase in the weight of the SB rats
was observed after the second postoperative week. The jejunal mucosal
thickness of the SB rats was significantly greater than that of C and sham rats
(p<0.05. The biodistribution of sodium pertechnetate was not affected by
massive intestinal resection in rats. An adaptive response by the intestinal
mucosa probably contributed to the reversion of weight loss and the
biodistribution of sodium pertechnetate was not affected by the surgery.
Key words: Short bowel. Syndrome. Intestine. Surgery. Sodium pertechnetate. Biodistribution. Rats
Apêndice
Apêndice 1
Gráficos 1 a 12 - Box plots comparativos da biodistribuição de Tc99m para cada órgão e
seus referidos grupos.
Fígado
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
0,44
0,46
0,48
0,50
0,52
% A
TI/g
Baço
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
% A
TI/g
Estômago
Mean ±SE ±SD
IC Sham C1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
% A
TI/g
Intestino delgado
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
% A
TI/g
Pâncreas
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
% A
TI/g
Rim
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
% A
TI/g
Coração
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
% A
TI/g
Pulmão
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
0,44
0,46
0,48
0,50
0,52
% A
TI/g
Tireóide
Mean ±SE ±SD
IC Sham C2
3
4
5
6
7
8
% A
TI/g
Bexiga
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
% A
TI/g
Músculo
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,11
% A
TI/g
Fêmur
Mean ±SE ±SD
IC Sham C0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
% A
TI/g