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Anais do XIX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178

Anais do IV Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420

23 e 24 de setembro de 2014

ESTUDO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO RESVERATROL E DO

LICOPENO EM RATOS: INTERFERÊNCIAS RELACIONADAS À

LESÃO HEPATICA POR PARACETAMOL

Matheus Arnosti Landi Pontifícia Universidade Católica de Campinas

Centro de Ciências da Vida [email protected]

Gisele Mara Silva Gonçalves Obtenção e aplicação de insumos de origem vegetal e animal em alimentos, fitoterápicos e

cosméticos Centro de Ciências da Vida

[email protected]

Resumo: o fígado é o maior e mais pesado órgão

interno e possui funções endócrinas e exócrinas, sendo

o hepatócito a célula responsável por estas funções,

além de converter substâncias nocivas em materiais

não-tóxicos que serão excretados. A hepatite tóxica é a

lesão hepática causada por inalação, ingestão ou

administração parentérica de agentes farmacológicos

ou químicos. O Paracetamol é facilmente destoxificado

pela fase II do sistema de metabilização hepática de

drogas, porém, em doses elevadas, provoca produção

maciça de um metabólito altamente lesivo aos

hepatócitos. Utilizando o paracetamol como modelo

experimental de lesão hepática, o objetivo do presente

projeto foi determinar a biodistribuição do licopeno e do

resveratrol nos principais tecidos orgânicos de ratos

com elevada dosagem de paracetamol. O licopeno e o

resveratrol são compostos de origem vegetal com

propriedades antioxidantes que apresentam indicação

terapêutica em distúrbios hepáticos. Para realização do

experimento foram utilizados 40 animais, subdivididos

em 08 grupos (tratados e não tratados), sendo que os

animas dos grupos “tratados” serão submetidos à pré-

tratamento de 8 dias com as substâncias ativas e no 8°

dia sofrerão intoxicação com elevada dose de

paracetamol. Após 24 h e 72 h, serão eutanasiados

para coleta de amostras de sangue e tecidos. Para

análise da biodistribuição, os órgãos/fluido coletados

(soro, fígado, rins, pulmão e coração) serão macerados

e o resveratrol e o licopeno serão quantificados por

Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE) e

Espectrofotômetro de UV visível. Como base nos

resultados obtidos, pode-se concluir que o resveratrol

se apresentou em quantidades mais elevadas no

fígado do que em outros órgãos/fluido. Esse padrão de

distribuição se justifica pela fisiologia destes

órgãos/fluido e o paracetamol provocou redução

significativa na concentração de resveratrol no tecido

hepático, indicando que a atividade antioxidante deste

está relacionada à sua ação hepatoprotetora.

Palavras-chave: paracetamol, licopeno, resveratrol.

Área de conhecimento: farmácia

1. INTRODUÇÃO

Define-se hepatite tóxica como a lesão

hepática causada por inalação, ingestão ou

administração parentérica de agentes farmacológicos

ou químicos [12].

Para a lesão celular metabólica dos

hepatócitos vários são os mecanismos de agressão:

ligação covalente a estruturas celulares, peroxidação

lipídica, reações de oxidação, depleção de glutationa,

sendo que estas agressões celulares podem resultar

alterações mitocondriais, alterações no citoesqueleto

celular ou alterações da homeostase iônica. Como

continuidade do processo, os hepatócitos lesados

podem liberar produtos de peroxidação lipídica,

intermediários reativos de oxigênio e IL 8, ativando por

estes meios as células de Kupffer. Estas liberam

diversas citocinas tais como TNF, IL 1, IL 8 e

incremento na quantidade de intermediários reativos de

oxigênio, que podem lesar diretamente os hepatócitos

[2].

O Paracetamol é facilmente destoxificado pela

fase II do sistema de metabolização hepática de drogas

mediado por glucuronidação e sulfatação, com uma




pequena porção passando pelo Citocromo P-450, e

sofrendo N-hidroxilação com fomação do intermediário

toxico, a N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), que

inicialmente é conjugado à glutationa e é excretado. Na

administração de doses tóxicas de paracetamol, as vias

de glicuronização e sulfatação se saturam e a via do

citocromo P-450 adquire importância para a

biotransformação da droga, ocasionando com isso uma

maior formação da NAPQI [6].

O licopeno atualmente é tido como um dos

mais potentes antioxidantes, protetor da camada

celular; devido à reação com os radicais peróxidos e

com o oxigênio molecular [14; 17]. O licopeno é tido

como o carotenóide que possui a maior capacidade

sequestrante de radicais livres de oxigênio

possivelmente devido à presença das duas ligações

duplas não conjugadas, o que lhe oferece maior

reatividade [11].

O resveratrol (3,5,4 trihidroxiestilbeno) é um

polifenol natural encontrado em mais de 70 espécies de

plantas. Desde a observação original de que o

resveratrol prolonga a vida de organismos inferiores,

simulando os efeitos antienvelhecimento da restrição

calórica [21]. É neutralizador de radicais livres e um

potente antioxidante devido à sua capacidade de

promover as atividades de uma variedade de enzimas

antioxidantes [5]. Apresenta três mecanismos

antioxidantes diferentes: (a) mecanismos de

competição com coenzima Q para diminuir o complexo

da cadeia oxidativa, local de produção de espécies

reativas de oxigênio, (ii) neutralização de adicais O2-

formados nas mitocôndrias e (iii) inibição da

peroxidação lipídica induzida por produtos da reação

de Fenton [22].

2. OBJETIVOS

O objetivo do presente trabalho foi verificar a

biodistribuição do licopeno e do resveratrol nos

principais órgãos para se conhecer melhor a

farmacocinética e avaliar a interferência da into-

xicação por paracetamol na biodistribuição destas.

3. METODOLOGIA

Foram utilizados 40 ratos albinos, machos, da linhagem Wistar, não isogênicos com 60 dias de idade

fornecidos pelo Biotério do Campus II da PUC Campinas. Em todo o período do experimento os animais não foram submetidos a condições de estresse ou qualquer tipo de sofrimento. Não houve restrição de água ou alimento. Foram observados e cumpridos os "Princípios éticos para uso de animais de laboratório" da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório.

O experimento foi conduzido dividindo-se os animais em 2 grupos, licopeno e resveratrol, e 08 subgrupos com 5 animais cada, onde foram escolhidos de forma aleatória, e em seguida pesados para calculo de volume de paracetamol, licopeno e resveratrol administrado.O grupo Licopeno foi dividido em: Licopeno 24 e 72h; Licopeno + paracetamol 24 e 72h. Onde o grupo licopeno recebia durante 8 dias suspensão de licopeno uma vez ao dia na dose de 4 mg/Kg v.o sendo eutanasiados após 24 e 72 h da ultima administração. Já o outro subgrupo após a ultima administração, recebia uma dose toxica de paracetamol de 3 mg/Kg v.o e era eutanasiado após 24 e 72h.

O grupo Resveratrol foi dividido em: Resveratrol 24 e 72h; Resveratrol + paracetamol 24 e 72h. Onde o grupo resveratrol recebia durante 8 dias suspensão de resveratrol uma vez ao dia na dose de 10 mg/Kg v.o sendo eutanasiados após 24 e 72 h da ultima administração. Já o outro subgrupo após a ultima administração, recebia uma dose toxica de paracetamol de 3 mg/Kg v.o e era eutanasiado após 24 e 72h.

3.1 Eutanásia dos animais e coleta do material biológico

Para eutanásia os animais cereberam uma associação de ketamina e xilaziina em dose letal. Em seguida foi realizada uma incisão do abdômen ao tórax do animal expondo seus órgãos internos, podendo assim retirar por meio de uma punção do coração sangue, para obtenção do soro. Em seguida foi coletado fragmentos de fígado, pulmão, rim e coração e pesados.

3.2 Extração do princio ativo do tecido/fluido

Para quantificação foi posto em contato o tecido/fluido com solvente especifico para cada composto, sobre maceração e centrifugação. Para o resveratrol foi utilizado álcool etílico absoluto e para o licopeno éter de petróleo.

3.3 Padronização das amostras

Todas amostras após o processo de extração foram postas em uma câmara de vidro contendo sílica,




e aquecida em banho-maria a 50oC e com aplicação de vácuo, por período suficiente para secar as amostras. Todas as amostras foram ressuspendidas no momento da analise com 500 µL do solvente e filtradas em membrana-filtro de 45 µm.

3.4 Análise das amostras

Para analise das concentrações de resveratrol

foi utilizado um cromatógrafo liquido de alta eficiência

(HPLC/CLAE), e para o licopeno um espectrofotômetro

de UV visível. Nos dois casos foi realizada uma curva

de calibração como podemos observar na figura 1 para

o resveratrol (concentração de 2, 6, 10 e 20 ppm) e na

figura 2 para o licopeno (concentrações de 10, 30, 50 e

100 ppm).

Figura 1:Curva de calibração de resveratrol para HPLC/CLAE

Figura 2: Curva de calibração de licopeno para espectrofotômetro (comprimento de onda 470 nm)

4. RESULTADOS

4.1 Resveratrol

A tabela 01 exibe os dados utilizados para o

cálculo do resveratrol sendo que a concentração

detectada em cada amostra foi utilizada para definir a

concentração em ppm de resveratrol por grama de

tecido/fluido. Os dados foram compilados, e após

analise estatística, foram representadas graficamente

na figura 03.

Tabela 1: dados referentes ao peso do tecido/fluido (g), concentração de resveratrol (mg/mL) encontrada por tecido/fluido, seguida da relação massa de resveratrol/peso (ppm/g). F: fígado; R: rim; P: pulmão; C: coração; S: soro.

Peso (g)

Conc (mg/mL)

ppm/g Peso (g)

Conc (mg/mL)

ppm/g

CR24 CR24 CRP24 CRP24

F 0.413 0.0011 2.663438 0.403 0.0006 1.488834

0.463 0.0008 1.727862 0.44 0.0006 1.363636

0.444 0.0007 1.576577 0.425 0.0017 4

0.449 0.0006 1.336303 0.412 0.0005 1.213592

0.437 0.0007 1.601831 0.45 0.0007 1.555556

R 0.423 0.0002 0.472813 0.463 0.0002 0.431965

0.408 0.0001 0.245098 0.452 0.0009 1.99115

0.413 0.0003 0.726392 0.449 0.0001 0.222717

0.438 0.0005 1.141553 0.425 0 0

0.438 0.0006 1.369863 0.42 0.0003 0.714286

P 0.41 0.0004 0.97561 0.392 0 0

0.407 0.0002 0.4914 0.405 0.0006 1.481481

0.42 0.0001 0.238095 0.446 0.0004 0.896861

0.406 0.0001 0.246305 0.419 0.0002 0.477327

0.439 0.0002 0.455581 0.421 0 0

C 0.4638 0.0002 0.43122 0.423 0.0003 0.70922

0.443 0.0001 0.225734 0.447 0 0

0.412 0.0001 0.242718 0.466 0 0

0.43 0 0 0.466 0 0

0.46 0 0 0.413 0 0

S 0.5 0.0001 0.2 0.5 0 0

0.5 0 0 0.5 0 0

0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2

0.5 0 0 0.5 0 0

0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2

CR72 CR72 ppm/g CRP72 CRP72 ppm/g

F 0.422 0.0011 2.606635 0.463 0.0004 0.863931




0.419 0.0012 2.863962 0.38 0.0007 1.842105

0.451 0.0026 5.764967 0.483 0 0

0.439 0.0008 1.822323 0.431 0.0009 2.088167

0.442 0.001 2.262443 0.431 0.0006 1.392111

R 0.466 0.0005 1.072961 0.436 0.0002 0.458716

0.467 0.0001 0.214133 0.42 0.0003 0.714286

0.466 0.0003 0.643777 0.393 0.0003 0.763359

0.421 0.0002 0.475059 0.379 0.0001 0.263852

0.422 0.0002 0.473934 0.453 0 0

P 0.455 0 0 0.403 0.0001 0.248139

0.422 0.0003 0.7109 0.454 0.0002 0.440529

0.459 0.0007 1.525054 0.453 0 0

0.481 0.0003 0.623701 0.402 0 0

0.487 0.0002 0.410678 0.475 0.001 2.105263

C 0.466 0 0 0.462 0.0002 0.4329

0.417 0.0002 0.479616 0.401 0.0002 0.498753

0.464 0 0 0.475 0 0

0.456 0.0002 0.438596 0.391 0 0

0.432 0 0 0.461 0.0001 0.21692

S 0.5 0.0001 0.2 0.5 0 0

0.5 0 0 0.5 0 0

0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2

0.5 0 0 0.5 0 0

0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2

Figure 3: Biodistribuição do resveratrol. Observar existência de diferença significativa (*p<0.05, pós-teste de Tukey) em relação ao grupo CR72.

4.2 Licopeno

No presente estudo a analise do licopeno ficou comprometida por diversos fatores relacionados a capacidade de quantificação desse. Na preparação da curva de calibração do licopeno em HPLC, a coluna de separação ficou saturada pelo licopeno, pois as características do filme cromatográfico da coluna se mostraram apolares, tendo então uma forte ligação com o licopeno, e apresentando um tempo de retenção inviável e impreciso para separação. Embora em outros estudos com licopeno, como feito por Nunes e Mercadante, 2004 foram utilizados uma coluna cromatográfica com característica parecida, mas outros fatores como concentração e fase móvel devem ser levados em conta; pois o detector disponível para analise nesse estudo era um detector de UV-vis, ou seja, leitura por absorbância, já nos estudos citados o detector utilizado era de arranjo de diodos, logo, com uma sensibilidade maior, necessitando de concentrações menores para calibração. Em uma tentativa de quantificação em espectrofotômetro de UV visível, como visto na figura 2, uma curva de calibração foi realizada no limite de quantificação do espectrofotômetro. Quando analisados as amostras, pode ser visto apenas ruídos de absorbância, e em alguns casos a detecção do licopeno pode ser vista, mas como estava abaixo da curva, a quantificação seria imprecisa e pouco relevante, pois não haveria dados posteriores para comparação.

5. DISCUSSÃO

Após a realização os cálculos de concentração

(ppm/g), e realização de analise estatística, foi possível

observar a diferença de concentrações nos tecidos

estudados (fígado, rim, pulmão, coração e soro) como

era esperado, porém havendo pouca diferença das

concentrações de resveratrol entre o grupo de 24h e de

72h. A diferença mais evidente ocorreu no fígado, onde

é possível verificar um aumento da concentração da

droga me 72 horas (CR72).

Poucos são os relatos encontrados na

literatura sobre a biodistribuiçao do resveratrol. Walle e

colaboradores (2004) observaram níveis plasmáticos

de trans-resveratrol e seus metabolitos de 491 ± 90

ng/ml após 1 hora de administração oral. A utilização

de radiomarcadores possibilitou o estudo da

biodistribuição após administração oral, sendo

detectado em maiores concentrações em órgãos

relacionados à absorção e eliminação, tais como

estomago, intestino, fígado e rins e em menores

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

CR24 CRP24 CR72 CRP72

Fígado

Rim

Pulmão

Coração

Soro

*




quantidades, no colón, duodeno, pulmão, coração e

cérebro [19]. Isso pode ser justificado pelo

comportamento do resveratrol, pois, embora a

absorção deste seja elevada, sua biodisponibilidade

por via oral é muito baixa, haja vista sua rápida

metabolização no fígado [20; 1; 8; 4].

Isso corrobora com o presente estudo, pois

pode-se observar que o padrão de distribuição nos

órgãos dos ratos seguiram o mesmo padrão obtido por

Walle e colaboradores (2004), após administração oral

de 25 mg, o resveratrol se manteve em maior

concentração no tecido hepático comparando-se com

os outros órgãos estudados, todos esses com

concentrações significativamente inferiores à

encontradas no fígado nos períodos de 24 e 72 horas.

Rins exibiram concentrações decrescentes de

resveratrol, e em estudos com roedores, a diminuição

dos níveis de resveratrol nos rins e as baixas

concentrações encontradas no cólon indicaram que a

excreção é realizada preferencialmente por via urinaria

e em menores quantidades pela rota fecal [19], sendo

semelhante aos resultados encontrados por Walle e

colaboradores (2004), que observaram em humanos

maior excreção pela urina após administração oral ou

intravenosa de trans-resveratrol. Coração, pulmão, e

soro mostraram concentrações constantes com

diferenças insignificantes entre eles.

Como descrito anteriormente doses toxicas de

paracetamol, saturam a via de sulfatação e

glucorinazação hepática forçando a metabolização da

droga pelo complexo do Citocromo P-450 [6]. Com

base nesse mecanismo de hepatotoxicidade, na

conhecida ação antioxidante do resveratrol e nos

resultados da biodistribuição obtidos nesse trabalho, é

possível justificar a diminuição significativa de

resveratrol no fígado no grupo CRP72. Seguramente a

diminuição da concentração de resveratrol no fígado é

devido a sua capacidade de reagir com os produtos

formados na intoxicação aguda nos hepatócitos,

neutralizando-os e como consequência diminuir a

hepatoxicidade, sendo excretado logo em seguida.

Estudos da distribuição do licopeno após

administração via oral revelaram que as maiores

concentrações desse, se encontram no fígado, adrenal,

próstata e tecido adiposo. Isso se da após o licopeno

se acumular no fígado devido a sua entrada no

organismo através de quilomícrons , assim, interagindo

com as lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL)

e nas lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são

jogado na corrente sanguínea, com isso os tecidos que

apresentarem receptores de LDL apresentarão maior

captação desses, além disso tecidos com propriedades

apolares, como o tecido adiposo leva a uma maior

retenção do carotenoide [9].

Ferreira e colaboradores (2000), obtiveram

resultados parecidos tratando furões e ratos com

suplemento de licopeno durantes 9 semanas e

analisando em HPLC as amostras, e foram

identificados nos animais concentrações grandes do

pigmento no fígado, intestino, estomago e próstata. Já

em Roth e colaboradores (1990) em dose única de

licopeno via oral em macacos e ratos pode se observar

maiores concentrações no fígado, intestino, colón e

baço. Estudo com cachorros machos, com tratamento

por 28 dias com suplemento de licopeno, como visto

por Koytko e colaboradores (2003), as maiores

concentrações do licopeno foram encontradas no

fígado, adrenal, baço, linfonodos e tecidos adiposo

abdominal.

6. CONCLUSÃO

Como base nos resultados obtidos até o

momento, pode-se concluir que o resveratrol se

apresentou em quantidades mais elevadas no fígado

do que em outros órgãos/fluido. Esse padrão de

distribuição se justifica pela fisiologia destes

órgãos/fluido e está de acordo com os poucos relatos

encontrados na literatura científica e o paracetamol

provocou redução significativa na concentração de

resveratrol no tecido hepático, indicando que a

atividade antioxidante deste está relacionada à sua

ação hepatoprotetora.

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