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MICROBIOLOGIA
MICROORGANISMOS
A microbiologia tem um papel essencial no monitoramento da qualidade de alimentos, água e do ambiente.
A Biocen do Brasil oferece meios de cultura destinados a detecção de microrganismos: isolamento e identif icação.
As enterobacteriaceas são bacilos gram negativos com muitas propriedades em comum. Habitam o intestino humano e
de animais de sangue quente.
Os principais gêneros da família Enterobacteriaceae são: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia, Proteus, Yersinia entre outros.
Testes
bioquimicos.Escherichia Shigella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Hafnia Proteus Yersinia
Lactose + - - D + + - - -
Gás (glicose) + - + + + + + + -
H2S - - + D - - - D -
Uréase - - - D + D - + +
L-TD - - - - - - - + -
Motilidade D - + + - + + + D
Indol + D - D - - - D D
Lisina + - + - + D + - -
Citrato de
simmons- - + + + + - D D
As enterobactérias são bacilos gram negativos pertencentes a família das Enterobacteriaceae. Estão amplamente
distribuídos no solo, água plantas e no intestino do homem e animais. Podem causar infecções intestinais e extra
intestinais. O choque endotóxico é uma manifestação letal da infecção por bactérias gram negativas. As endotoxinas
são lipopolisacárides farmacologicamente ativos, contidos no interior das paredes celulares das gram negativas.
Esses lipopolissacarideos são estruturados por três regiões:
(1) uma porção variável externa de carboidratos que determina a especif icidade antigênica (ex: vários sorotipos de
Salmonella); (2) um cerne ou centro de polissacarídeo que é estruturalmente similar entre as espécies e (3) uma
porção lipídica altamente conservada, denominada lipídio A. As bactérias entéricas gram negativas possuem,
comumente, um único e grande plasmídio R que codif ica para a resistência a vários antibióticos. Cepas dos gêneros
Enterobacter, Serratia, Klebsiella e Providencia, além de várias cepas indol positivas de Proteus e cepas cefalotina
resistentes de E. coli, possue ?-lactamases induzíveis que proporcionam resistência cruzada a vários antibióticos do
grupo dos ?-lactâmicos.
A característica morfológica da colônia de um microrganismo em meio de agar pode ser uma forma de identif icação
pois as enterobacteriáceas produzem colônias secas ou mucóides relativamente grandes de coloração cinza opaca
em agar sangue. A hemólise em agar sangue é variável e não distinta. As colônias que aparecem como ondas
(dispersão) sugerem motilidade, provavelmente Proteus. As colônias vermelhas em agar MacConkey ou com brilho
verde em agar eosina azul de metileno (BEM) indicam que o microrganismo é capaz de formar ácido a partir da lactose
do meio.
Entretanto, a diferenciação das enterobactérias se baseia na presença ou não de enzimas codif icadas por genes
cromossômicos. Essas enzimas participam do metabolismo bacteriano e podem reagir com substratos incorporados
aos meios de cultura. Junto com um indicador, pode identif icar a utilização do substrato ou de produtos metabólicos
específ icos estabelecendo um perfil bioquímico que identif ica a espécie.
É possível evitar perda de tempo e identif icações errôneas realizando-se observações preliminares. Com poucas
exceções, as enterobactérias têm as seguintes características:
- fermentação da glicose,
- oxidase negativa,
- redução de nitrato a nitrito,
Por definição, fermentação é um processo metabólico de óxido-redução que ocorre em meio anaeróbio. Nas provas
bioquímicas, esse processo é detectado pela observação da mudança de cor por indicadores de pH como
conseqüência da formação de produtos ácidos. A acidif icação do meio de prova pode ocorrer através da degradação
de carboidratos por vias diferentes que não a fermentação, ou pode haver em alguns meios componentes diferentes
de carboidratos que resultem em produtos f inais ácidos. Embora a maioria das bactérias que metaboliza carboidratos
seja anaeróbia facultativa, a utilização pode nem sempre ocorrer em condições estritamente anaeróbias. Todas as
enterobactérias fermentam a glicose formando ácido pirúvico (via de Embden-Meyerhof). As bactérias são
diferenciadas pelo carboidrato que metabolizam e pelos tipos e quantidade de ácidos produzidos. Na fermentação da
glicose pela Escherichia coli ocorre uma fermentação ácida mista o que resulta na produção de grandes quantidades
de ácidos acético, lático e fórmico ocasionando uma acentuada diminuição do pH no meio de prova. Isto pode ser
observado no teste positivo do vermelho de metila. Por outro lado, o grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia
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observado no teste positivo do vermelho de metila. Por outro lado, o grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia
metabolizam o ácido pirúvico pela via do butileno gllicol produzindo acetil metil carbinol (aceína), observado na prova
positiva de voges-Proskauer (VP). Observe que os principais produtos dessa via são álcoois com produção de
pequena quantidade de ácido gerando uma prova de vermelho de metila negativa para esse grupo de microrganismos.
O gás resultante da fermentação bacteriana é formado da clivagem do ácido fórmico. A produção de gás é melhor
observada em meio líquido para fermentação de carboidratos com a colocação de tubos de Durham invertidos .
Bactérias que não formam ácido fórmico são incapazes de formar gás (a maioria das Shigella), contrariamente aos
microrganismos que utilizam a via butileno glicol que produzem grandes quantidades de CO2 como o grupo Klebsiella,
Enterobacter, Hafnia, Serratia.
A fermentação da lactose é mais complexa que a da glicose. A lactose é um dissacarídeo composto por glicose e
galactose (ligação galactosídica). Ao ser hidrolisada, ocorre a liberação da glicose e da galactose. Para metabolizar a
galactose, duas enzimas devem estar presentes: (1) ?-galactosídeo permease e (2) ?-galactosídase enzima
necessária para hidrolisar a ligação ?-galactosídica após a lactose ter entrado na célula. Como a fermentação da
lactose ocorre por degradação da glicose, microrganismos que não podem fermentar a glicose não podem formar
ácido a partir da lactose. Isto explica porque a glicose não faz parte dos meios de isolamento primário como o agar
MacConkey e BEM pois impediria a visualização de fermentação da lactose.
O ONPG (?-nitrofenil-?-D-galactopiranosídeo permanente) é um composto similar à lactose. O que difere é a
substituição da glicose pelo grupo (?-nitrofenil). A prova de ONPG consiste na detecção da enzima ?-galactosídase,
sendo útil para identif icar fermentadores tardios de lactose.
O teste de oxidase pode ser observada utilizando-se f itas de oxidase. A presença de pigmentação púrpura signif ica
que a bactéria possue a enzima citrocromo axidase (oxidase +). Bactérias que não possuem a enzima são oxidase –,
não apresentando pigmentação nas f itas de oxidase.
Outras provas bioquímicas utilizadas para a identif icação de enterobactérias são: o vermelho de metila, Voges-
Proskauer, citrato de Simmons, teste da urease, meio de Kliger, indol e a pesquisa da triptofano desaminase.
No teste de vermelho de metila observa-se se o microrganismo é capaz de produzir ácidos em quantidade suficiente
para abaixar o pH em valores inferiores a 4,4. Isto indica que o microrganismo em questão realiza uma fermentação
ácida mista (ácido fórmico, acético, lático e succínico) – VM+. Caso não ocorra a virada do meio para o vermelho, o
teste é negativo e a cor do meio se mantém. No teste de Voges-Proskauer pesquisa-se bactérias fermentadoras de
glicose através da fermentação butanodiólica. VP+ o meio tem coloração vermelha, VP- meio amarelo claro.
Salmonella - bacilo gram negativo pertencente a família Enterobacteriaceae, com ou sem presença de f lagelos e
intracelulares facultativas. A patogenicidade das salmonelas varia de acordo com o tipo sorológico, idade e condições
de saúde do hospedeiro. A S. typhi é o agente da febre tifóide. As salmonelas paratíf icas causam infecção
semelhantes a febre tifóide. Os demais sorotipos de Salmonella causam uma enterocolite sem complicações que
desaparece em uma semana. As salmonelas são geralmente veiculadas por alimentos contaminados e a infecção é
denominada de intoxicação alimentar. Em crianças, a salmonela frequentemente invade a circulação afetando vários
órgãos. A infecção por Salmonella tem início na mucosa intestinal e quando há enterocolite sem invasão da corrente
sangüínea, a salmonela atravessa a camada do epitélio e se prolifera na lâmina própria da mucosa. Quando há
infecção sistêmica, a Salmonella cai na corrente sangüínea via linfática.
O diagnóstico das infecções por Salmonella é realizado um enriquecimento e o isolamento em agar verde brilhante,
agar SS e agar MacConkey. A identif icação é feita por provas bioquímicas e por sorologia.
Shigella - o gênero Shigella é constituído de 4 es[écies: S. dysenteriae, S. f lexneri, S.boydii, S. sonnei. Os sorotipos de
Shigella são caracterizados somente pelos antígenos O ou somáticos uma vez que essa bactéria é desprovida de
antígenos capsulares (K) e f lagelares (H). A doença causada pela Shigella é denominada de shigelose ou disenteria
bacilar. Ocorre uma invasão e destruição da camada epitelial da mucosa com intensa reação inflamatória acarretando
leucócitos, muco e sangue nas fezes. Na infecção por Shigella dysenteriae tipo I (bacilo de shiga) pode aparecer a
síndrome hemolítica urêmica gerada pela presença de altos níveis de verotoxina I (VT I). A infecção pode ser adquirida
pela ingestão de água e/ou alimentos contaminados, além do contato pessoal. O diagnóstico é feito pelo isolamento da
Shigella, a partir de fezes, em meio MacConkey e SS. A identif icação é feita por testes bioquímicos e sorológicos.
Yersinia - o gênero Yersinia compreende a Y. pestis, Y.enterocolitica, Ypseudotuberculosis, Y.frederiksenii,
Y.kristensenii e Y. intermedia sendo que as 3 últimas não são associadas a doenças humanas.
Y. pestis é o agente etiológico da peste e tem os roedores como reservatórios e as pulgas como veículos. O homem
pode adquirir a doença após ser picado pela pulga ou por manipulação de animais contaminados. A peste se
caracteriza de 3 formas clínicas: bubônica, pulmonar e septicêmica. A bubônica caracteriza-se pela inflamação dos
linfonodos principalmente os axilares e inguinais. A fase pulmonar pode ocorrer como uma complicação da bubônica
ou ser adquirida por contato com pacientes com infecção pulmonar. A septicêmica é rara mas pode ocorrer no pico da
epidemia. O fator de virulência de Y. pestis são os antígenos superficiais que a tornam resistentes à fagocitose. Essa
bactéria produz, também, uma exotoxina.
Y. enterocolitica é uma espécie bastante heterogenia. São encontradas no ambiente e em animais normais ou
acometidos pela doença e causam diferentes tipos de sintomatologia, sendo a principal a infecção intestinal
manifestada por diarréia e dores abdominais. Infecções sistêmicas podem ocorrer e geram doenças debilitantes como
cirrose hepática, eritrema nodoso, artrite, conjuntivite e osteomielites. A infecção intestinal é adquirida pela ingestão de
alimentos contaminados. O isolamento é realizado em agar MacConkey e SS com posterior identif icação bioquímica e
sorológica da bactéria.
E. coli – bacilo gram negativo pertencente as enterobactérias. O gênero Escherichia compreende as espécies E. coli,
E. hermanii, E. fergusonii, E.vulneris e E. blattae. Seis são as categorias de E. coli enteropatogênicas: E. coli
enteropatogênica clássica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC) E. coli enteroaderente (EAEC) e E. coli enteroagregativa (EAggEC).
As EPECs são os agentes mais freqüentes de diarréia infantil. Os sorotipos mais comuns são O111:H-, )111:H2 e
O119:H6. A capacidade da bactéria em aderir à mucosa intestinal é mediada por plasmídio. A adesão pode ser difusa,
quando ocorre em toda a superfície da célula, ou localizada quando a adesão se dá em certos locais da célula. Após
se aderirem a célula, inicia-se a produção de citotoxinas semelhantes a toxina de Shiga (Shigalike). O reservatório é o
homem e o isolamento de EPEC das fezes é realizado em ágar MacConkey. A identif icação ocorre por provas
bioquímicas e pelo emprego de soros polivalentes que são empregados para a identif icação presuntiva e os soros
monovalentes que são usados para a confirmação.
As EIECs são imóveis pois não dispõem de f lagelos, não descarboxilam a lisina e apresentam um plasmídio que
transporta determinantes genéticos responsáveis pela penetração nas células epiteliais. As EIECs proliferam no
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transporta determinantes genéticos responsáveis pela penetração nas células epiteliais. As EIECs proliferam no
interior das células causando uma infecção e necrose da mucosa do íleo e cólon.
As infecções intestinais causadas por EIEC são comuns em crianças com mais de 2 anos e são adquiridas por
ingestão de alimentos e água contaminados ou por contato pessoal. A detecção é realizada por cultivo de fezes em
agar MacConkey e agar SS e por provas bioquímicas e sorológicas.
As ETECs são os biosorotipos de E. coli que produzem enterotoxinas termolábeis e termoestáveis. As toxinas
termolábeis são conhecidas por LT I e LT II e as toxinas termoestáveis por STa e STb. As EIECs isoladas de seres
humanos raramente produzem enterotoxinas LT II e nunca a enterotoxina STb.
A enterotoxina LT I é uma proteína imunogênica com peso molecular de 100.000 daltons cuja molécula possui 5
subunidades periféricas (subunidade B) e uma central (subunidade A). As subunidades B f ixam a toxina à superfície
da célula epitelial e a subunidade A altera o metabolismo celular, pois bloqueia a absorção de sódio estimulando a
excreção de potássio e carbonato pelas células das criptas. Isto determinará um aumento do volume de líquido na luz
intestinal e consequentemente a diarréia. A enterotoxina LT I é semelhante a enterotoxina produzida pelo Vibrio
cholera. A STa contariamente a LT I é uma molécula pequena (17-18aminoácidos) e não imunogênica pesando
aproximadamente 5.000 daltons. A STa é uma potente toxina que também altera o metabolismo hidrossalino da mucosa
intestinal. Além das enterotoxinas, ETEC apresentam fímbrias usadas para f ixá-las à mucosa do intestino delgado.
Essas fímbrias são imunogênicas e são conhecidas como fatores de colonização. São pelo menos 3 fatores de
colonização imunologicamente distintos de origem humana. Depois que a bactéria atravessa a barreira gástrica, ela se
fixa na mucosa intestinal por meio do fator de colonização (as f imbrías).uma vez f ixada, começa a se proliferar e
produzir as enterotoxinas que determinarão a diarréia aquosa. As enterotoxinas LT I e STa assim como os fatores de
colonização, são codif icados por genes localizados em plasmídios designados de ent. As ETECs acorrem em crianças
e em adultos e é conhecida como a diarréia do viajante. Seu reservatório é o próprio homem e a infecção se transmite
pela ingestão de água e alimentos contaminados. A infecção por ETEC é superficial, não havendo penetração do
epitélio intestinal. Desta forma, os pacientes não apresentam leucócitos, sangue ou muco nas fezes. O isolamento de
ETEC se faz em agar MacConkey e na pesquisa de enterotoxinas LT I e STa. A enterotoxina LT I pode ser
demonstrada em cultura de células e por testes de aglutinação de hamácias sensibilizadas pela toxina. A pesquisa de
STa geralmente é feita por inoculação em camundongos recém nascidos.
A EHEC determina uma diarréia sanguinolenta que é denominada de collite hemorrágica. Está associada a ingestão de
alimentos contaminados e é conhecida como a doença do hambúrguer. As EHEC produzem duas citotoxinas
semelhantes a toxina de Shiga (Shigalike toxin) SLT I e SLT II ou verotoxinas (VT) I e II . Essas toxinas são codif icadas
por bacteriófagos lisogênicos e são as responsáveis pela hemorragia intestinal e pela síndrome hemolítica urêmica que
pode acompanhar a colite hemorrágica. As EHEC aderem à mucosa intestinal por fímbrias codif icadas por plasmídios.
A identif icação se dá pela dosagem de toxinas em cultura de células Vero ou por sondas genéticas que detectam os
genes que as codif icam.
O sorotipo que representa esse biogrupo é a E. coli O157:H7.
Listeria monocytogenes – O gênero Listeria compreende a L. monocytogenes que é patogênica para o homem, e
outras espécies não patogênicas geralmente encontradas no solo, vegetais, animais e no homem. A L.
monocytogenes causa beta hemólise. A listereriose pode ser confundida com outras doenças, pois sua sintomatologia
pode se assemelhar a um resfriado comum, a uma inflamação de garganta, uma septicemia severa ou a doenças do
sistema nervoso central. Infecções inaparentes podem ser transmitidas durante a gestação via placenta, o que resulta
em aborto. A infecção pode também ser transmitida durante o parto em decorrência de aspiração do líquido aminiótico.
A listeriose é uma causa freqüente de abortos e mortalidade de recém nascidos. No adulto, a principal doença é a
meningite, e no idoso a mortalidade é bastante alta (70%). São bacilos gram positivos f lagelado, resistente a
temperaturas de refrigeração.
Pseudomonas - bacilo gram negativo que são diferenciados entre eles por testes bioquímicos, de sensibilidade a
antibióticos, formação de pigmentação, número e localização dos f lagelos. As espécies comumente isoladas
correspondem a P. aeruginosa, P. malthophila e P.cepacia.
P. aeruginosa tem a capacidade de produzir um pigmento esverdeado denominado piocianina. É um germe oportunista
que infecta processos cirúrgicos e queimaduras podendo resultar em bacteremias severas, ceratites em cirurgias
oculares e pneumonias. O cultivo é realizado a partir de material infectado e identif icado por série bioquímicas e pela
presença de pigmentos.
Staphylococcus – O gênero compreende várias espécies, sendo duas delas as mais importantes: S. aureus, S.
epidermides. São cocos gram positivos, com divisão em vários planos tendendo a formar cachos de uvas. A
diferenciação entre as espécies se dá pelo testes de coagulase (S. aureus coagulase + e S. epidermides coagulase -
).
Streptococcus – Os estreptococos são denominados de várias maneiras. A designação mais comum tem por base a
hemólise em ágar sangue. Se a hemólise é total disse que o estreptococos é beta-hemolítico, se for parcial que ele é
alfa hemolítico e, não havendo hemólise disse que ele é gama hemolítico ou não hemolítico. Os estreptococos alfa
hemolíticos que costumam conferir coloração esverdeada às hemácias por transformação da hemoglobina em uma
substância semelhante a bilerrubina são conhecidos por S. viridans.
São cocos gram positivos que se dividem em um só plano e se agrupam em cadeias de tamanho variável. Fazem parte
desse grupo o S. pyogenes, S. agalactiae, S. faecalis, S. bovis, S. pneuminiae.
Neisseria – O gênero Neisseria compreende várias espécies que podem ser diferenciadas por meio de provas
bioquímicas. A N. gonorrhoeae ou gonococo e a N. meningitidis ou meningococo causam gonorréia e meningite,
respectivamente. Essas são resistentes à vancomicina e a polimixina. As neisserias são cocos gram negativos que se
agrupam em pares geralmente. Os bordos dos pares são achatados ou levemente côncavos semelhantes ao grão de
feijão.
Haemophylus – O gênero Haemophylus é um bastonete gram negativo cultivável em meios que contenham sangue. As
espécies mais patogênicas para o homem são H. inf luenzae, H. parainfluenzae, H. haemolyticus e H. aphrophilus que
são encontrados nas vias aéreas superiores. H. ducreyi é o agente do cancro mole, uma doença venérea. São
cocobacilos bem pequenos, gram negativo.
Brucella – O gênero Brucella é constituído por cocobacilos ou bacilos gram negativos. São 3 as espécies de
importância para o homem: B. abortus, B. melitensis e B. suis. A doença é a brucelose que é bastante invasiva,
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importância para o homem: B. abortus, B. melitensis e B. suis. A doença é a brucelose que é bastante invasiva,
podendo penetrar no organismos através da mucosa digestiva e ocular. A brucela é um parasita intracelular do
sistema retículo-endotelial. A brucelose é uma zoonose, pois o homem a adquire através do contato com animais
doentes.
Bibliografia Consultada
Jaw etz,E, Melnick,J.L., Adelberg,E.A., Brooks,G.F., Butel,J.S., Ornston,L.N. Microbiologia Médica. 18ª. Ed . 1989.
Koneman,E.W., Allen, S.D., Janda,W.M., Schreckenberger,P.C., Winn,W.C.Jr. Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas
colorido. 5ª. Ed. 2001.
Silva,N, Junqueira,V.C.A., Silveira,N.F.A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 1997.
Trabulsi, L.R. Microbiologia. 2ª. Ed.1991
Rua Pedro Stancato, nº 690, Chác. Campos dos Amarais - Campinas - SP
Telefone: (19) 3246.2581 Fax: (19) 3246-2581 [email protected]