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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

BIANCA MOREIRA KURITA

ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDO ZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO

DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS

FORTALEZA 2017

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca UniversitáriaGerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

K1a Kurita, Bianca Moreira. ATIVIDADES ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIRREABSORTIVA ÓSSEAS DO ÁCIDOZOLEDRÔNICO DURANTE A MOVIMENTAÇÃO DENTÁRIA INDUZIDA EM RATOS /Bianca Moreira Kurita. – 2017. 109 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017. Orientação: Prof. Dr. Vilma de Lima.

1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.Osteoclastos. 5. Osteoblastos. I. Título.

CDD 615.1




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Vilma de Lima.

FORTALEZA 2017






CDD 615.1

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca Universitária

Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

K1a Kurita, Bianca Moreira.

Atividades anti-inflamatória e antirreabsortiva ósseas do Ácido Zoledrônico durante a

movimentação dentária induzida em ratos / Bianca Moreira Kurita. – 2017.

109 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2017.

Orientação: Profa. Dra. Vilma de Lima.

1. Movimentação Dentária. 2. Ácido Zoledrônico. 3. Remodelação Óssea. 4.

Osteoclastos. 5. Osteoblastos.. I. Título.

CDD 615.1






CDD 615.1




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Farmacologia. Área de concentração: Farmacologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Vilma de Lima.

Aprovado em ___/___/_____

COMISSÃO EXAMINADORA

_______________________________________________ Profª. Drª. Vilma Lima (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC

________________________________________________ Prof. Drª. Cristiane Sá Roriz Fonteles

Universidade Federal do Ceará – UFC

_____________________________________________

Prof. Drª. Ana Maria Sampaio Assreuy Universidade Estadual do Ceará - UECE






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AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Drª. Vilma Lima, por todos os ensinamentos e

incentivos os quais se fizeram imprescindíveis em minha vida acadêmica e

profissional.

Às professoras doutoras Cristiane Sá Roriz Fonteles e Ana Maria

Sampaio Assreuy participantes da banca avaliadora desta dissertação, pelas

considerações fundamentais para o aprimoramento deste trabalho.

Aos professores doutores Thyciana Ribeiro Rodrigues, Nylane Maria

Nunes de Alencar e Roberto César Pereira Lima Júnior, pelas correções pertinentes

por ocasião do exame de qualificação de mestrado.

Ao professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro (in memorian), que deixou

em nós a saudade, mas merece agradecimentos sinceros pelos ensinamentos

repassados, os quais nunca serão esquecidos. Será sempre lembrado pela pessoa

íntegra e ética que sempre foi.

Ao coordenador do programa de pós-graduação em Farmacologia,

professor doutor Pedro Jorge Caldas Magalhães pelo trabalho sólido que vem

desenvolvendo à frente deste cargo.

Aos professores do programa de pós-graduação em Farmacologia do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina (UFC), pelos

conhecimentos compartilhados durante as disciplinas cursadas.

À professora doutora Deysi Viviana Tenazoa Wong, pela disponibilidade e

auxílio durante as dosagens de citocinas. Agradeço também pela amizade e

palavras de otimismo.

À doutoranda Iracema Matos de Melo, pelo companheirismo durante

todos os passos deste trabalho.

Aos pós-graduandos e colegas de laboratório Rafael Reis Ribeiro e José

Carlos Ribeiro, pela cordialidade e apoio durante os experimentos.

Às alunas de iniciação científica Marina Fiúza Sarte, Tereza Cristina

Marques Forte e Lorena Araújo Silva, por toda a dedicação e ajuda.

À minha turma de pós-graduação, por terem me proporcionado momentos

de alegria e me concedido a oportunidade de construir amizades novas e sinceras.

Aos funcionários técnicos e administrativos da Universidade Federal do

Ceará Adalberto Nascimento de Lima Júnior, Laura Alves de Sousa, Célia Araújo de






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Carvalho, Alana Carvalho Bezerra Viana, Naiara Felipe Alves, Adaulto Rodrigues de

Sousa e Gabriela Mariângela Faria de Oliveira pelo suporte concedido durante esses

dois anos.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), pelo apoio científico e suporte financeiro.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

À Deus, que em sua infinita bondade, nunca me desamparou, mesmo nos

momentos em que duvidei, sua força e amor me levantaram e me encorajaram a

estar aonde estou. Sei que continuará a andar ao meu lado pelo restante de minha

trajetória.

Aos meu pais, Evandro e Cecy Moreira, que com muito amor me criaram

e por nenhum minuto descuidaram do meu futuro. Tudo que fiz e farei não será o

suficiente para agradecer por todo o suporte que me deram. Para vocês, meu maior

amor e gratidão.

Ao meu marido, Lucio Kurita, que me incentivou a perseguir meus

objetivos. Seu amor, companheirismo diário e palavras de ânimo me ajudaram a

prosseguir e ultrapassar todos os obstáculos.

Aos meus irmãos, Arianne e Nacip, que mesmo de longe, sei que torcem

por mim assim como torço por eles.

Aos meus amigos Ana Larissa Lima, Marco Antônio Ribeiro, Elysderble

Nogueira, Juliana Oliveira, Edyr Freitas, Flávia Jucá, Thales Dantas e Felipe

Ramirez, pela amizade dedicada a mim e por estarem sempre presentes nos

momentos de tristeza e alegria.

À orientadora e amiga, professora Vilma, com quem construí uma relação

que vai além do laboratório. Uma amiga sincera, que sempre me incentivou e

reconheceu meus esforços.

Às amigas, Iracema Melo, Vilana Araújo, Marina Fiuza e Tereza Cristina

Marques, que me acompanharam durante o mestrado e com quem eu pude

compartilhar meus anseios, dúvidas e experiências. Obrigada pelas conversas

animadas que tivemos e pela amizade que perdurará.






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RESUMO

A movimentação dentária induzida (MDI) combina respostas de reabsorção e neoformação ósseas, que dependem da atividade de mediadores químicos da inflamação, culminando em remodelação óssea. Tal observação tem incentivado a avaliação do efeito do ácido zoledrônico (ZOL), um bisfosfonato que inibe a atividade osteoclástica, sendo amplamente utilizado para tratamento de desordens metabólicas ósseas, como a osteoporose e metástases ósseas. Contudo a literatura não tem abordado a participação de citocinas pró-inflamatórias e a modulação do eixo RANKL-OPG durante a MDI e tratamento com ZOL. Diante, disso, avaliou-se o efeito do ZOL na remodelação óssea da MDI. A MDI foi realizada em 72 ratos Wistar anestesiados pela instalação e ativação de uma mola fechada de níquel-titânio com 50 gf, fixada ao 1° molar superior esquerdo e aos incisivos superiores. Os mesmos receberam H2O destilada, sendo considerados animais não tratados (NT - 1 ml/kg-i.v.) ou ZOL (50, 100 e 200 µg/kg-i.v.), 5 min antes da inserção do dispositivo, e no 7º dia. No dia zero, foram coletadas amostras sanguíneas para avaliação do leucograma (mm3 de sangue) e dosagem de fosfatase alcalina óssea (FAO: U/I) e mensurados os espaços entre os dentes. No 11º dia, as coletas e as mensurações foram repetidas e as gengivas e hemiarcadas removidas para as avaliações da atividade da mieloperoxidase (MPO: x 103 mg de gengiva) e dos níveis de TNF-α e IL-1β (pg/mg de gengiva), análise histomorfométrica das áreas de compressão, tração e hialinas do ligamento periodontal (LP), análise histológica por escores (0 a 3) das reabsorções radicular (RR) e óssea (RO) e análise imunohistoquímica para RANKL, OPG, TRAP e TNF-α. Os animais foram pesados diariamente durante todo o período experimental, sendo os valores encontrados, relacionados à massa do dia zero; Comissão de Ética no Uso de Animais-UFC nº 28/15. O grupo NT apresentou aumento do deslocamento dentário, escores altos para as RR e RO, aumento da atividade de MPO e dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β, maior imunomarcação para RANKL, TRAP e TNF-α no lado de compressão do LP e para RANKL e OPG no lado de tração, resultando em aumento da razão RANKL/OPG no lado de compressão (p<0,05). Não apresentaram alterações nos níveis séricos de FAO, leucograma e na análise histomorfométrica (p>0,05), mas perderam peso inicialmente, alcançado os valores basais ao 7º dia. O tratamento com ZOL nas três doses reduziu o movimento dentário de forma dose-dependente, bem como reduziuos escores de RR e RO e a atividade de MPO (p<0,05). No entanto, a maior dose de ZOL (200 µg/kg) não alterou os níveis gengivais de TNF-α e IL-1β (p>0,05). Nessa mesma dose, o ZOL reduziu a imunomarcação para TRAP no lado de compressão, OPG no lado de tração e RANKL e TNF-α em ambos os lados, resultando em decréscimo na razão RANKL/OPG nas duas regiões avaliadas (p<0,05). Ademais, o tratamento com o ZOL não induziu alterações do leucograma e não promoveu perda de peso significante em relação aos animais não tratados (p>0,05). Em suma, o ZOL reduziu a MDI por meio da inibição de biomarcadores ósseos essenciais à diferenciação e atividade osteoclástica e redução do anabolismo ósseo. Palavras-chave: Movimentação Dentária. Ácido Zoledrônico. Remodelação Óssea. Osteoclastos. Osteoblastos.






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ABSTRACT

BONE ANTI-INFLAMMATORY AND ANTIRREABSORTIVE ACTIVITIES OF ZOLEDRONIC ACID DURING INDUCED TOOTH MOOVEMENT IN RATS

The induced tooth movement (ITM) combines bone resorption and neoformation that depends on chemical mediators of inflammation, thus culminating in bone remodeling. This observation has encouraged the evaluation of the effect of zoledronic acid (ZOL), a bisphosphonate that inhibits osteoclastic activity, being widely used for treating bone metabolic disorders, such as osteoporosis and bone metastasis. However, literature has not addresses the participations of proinflammatory cytokines on RANKL-OPG axis modulation during MDI and ZOL treatment. On this, we evaluated the effect of ZOL on bone remodeling of ITM. ITM was performed in 72 anesthetized Wistar rats by the installation and activation of a nickel-titanium coil-spring, with 50 gf, fixed on upper left 1st molar and upper incisors. The same received distilled water, being considered as non-treated group (NT - 1 ml/kg-i.v.) or ZOL (50, 100 e 200 µg/kg-iv), 5 minutes before the dispositive insertion, and on 7th day. On day zero, blood samples were collected for leukogram assay (mm3) and bone alkaline phosphatase dosage (BALP: U/I), and the space between the teeth were measured. On the 11th day, the collects and measures were repeated and the gingivas and hemimaxillas were removed for myeloperoxidase activity dosage (MPO: 103 mg of tissue) and TNF-α e IL-1β gingival levels analysis (pg/mg of tissue), histomorphometric analysis of periodontal ligament areas of compression, traction and hyalines, histological evaluation by scores (0 to 3) of root and bone resorptions and immunohistochemical staining for RANKL, OPG, TRAP, TNF-α e IL-1β. The animals were weighted daily during the all-experimental period, and then, were related to basal values; Ethics Committee on the Use of Animals-UFC nº 28/15. The NT group, had an increase of tooth movement, high scores of root and bone resorption, increased activity of MPO and high gingival levels of TNF-α e IL-1β, intense immunostaining for RANKL, TRAP e TNF-α on the compression side and for RANKL and OPG on the traction side of periodontal ligament, resulting on increased RANKL/OPG ratio on compression side (p<0.05). Still, they do not presented changes in serum levels of BALP, in total and differential leukogram assay and histomorphometric analysis (p>0.05), but they lost weight initially, being the initial weight, recovered from the 7th day. ZOL treatment in three doses used reduced tooth movement in a dose-dependent manner, as well as resulted in low scores of root and bone resorption and reduction of MPO activity. However, ZOL in the high dose (200 µg/kg) did not change TNF-α e IL-1β gingival levels (p>0.05). Still, this dose reduced the immunostaining of TRAP on compression side, OPG on traction side and RANKL and TNF-α on both sides, resulting on a decrease of RANKL/OPG ratio on both regions analyzed (p<0.05). In addition, ZOL treatment did not induce changes on leukogram values and body mass variation in comparison to the animals that received dH2O (p>0.05). In short, ZOL reduced the ITM by decreasing bone biomarkers essential for osteoclastic differentiation and activity and reducing bone anabolism. Keywords: Tooth movement. Zoledronic Acid. Bone remodeling. Osteoclasts. Osteoblasts.






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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a osteoclastogênese 19

Figura 2 Ligação do osteoclasto maduro à matriz óssea 20 Figura 3 Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a

osteoblastogênese 21 Figura 4 Resposta inflamatória após aplicação de uma força 25 Figura 5 Desenhos esquemáticos dos processos de reabsorção óssea alveolar no lado de

compressão e neoformação óssea alveolar no lado de tração 28 Figura 6 Estrutura química de um bisfosfonato, destacando-se a ligação P-C-P. Os ligantes

R1 e R2 podem variar de acordo com cada tipo de fármaco 33 Figura 7 Fórmulas moleculares de um bisfosfonato não-nitrogenado, como exemplo, o

Clodronato, e de bisfosfonatos nitrogenados, como o Alendronato de Sódio e Ácido Zoledrônico. 34

Figura 8 Mecanismo de ação dos N-BFs 36 Figura 9 Estrutura química do Ácido Zoledrônico 38 Figura 10 Representação esquemática do modelo de MDI por mola fechada Ni-Ti e

administração de ZOL 46 Figura 11 Fotografia ilustrativa do modelo de movimentação dentária induzida 47 Figura 12 Fotomicrografia das raízes do primeiro molar superior esquerdo do rato 50 Figura 13 Fotomicrografias ilustrando os delineamentos para quantificação das áreas de

compressão e tração do ligamento periodontal 52 Figura 14 Fotomicrografia com delineamento para a quantificação das áreas hialinas do

ligamento periodontal 53 Figura 15 Fotomicrografia com delineamento para as análises histológicas de reabsorções

radiculares e ósseas 54 Figura 16 Movimentação dentária induzida (MDI) durante 11 dias por mola fechada de Ni-Ti

com 50 gf 58 Figura 17 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea em animais submetidos à MDI por

mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 59 Figura 18 Análise histomorfométrica dos sítios de compressão (A) e de tração (B) e áreas

hialinas do ligamento periodontal pós 11 dias de MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 61

Figura 19 Fotomicrografias dos cortes transversais das raízes distovestibulares 62 Figura 20 Atividade da mieloperoxidase no tecido gengival de hemiarcadas controles e

submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 63 Figura 21 Níveis de TNF-α e IL-1β no tecido gengival de hemiarcadas controles e

submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 64 Figura 22 Contagens das imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP 66 Figura 23 Imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP no lado de compressão de

hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 67 Figura 24 Imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP no lado de tração de

hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 68 Figura 25 Leucograma de animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 69 Figura 26 Efeito do Ácido Zoledrônico (ZOL) na variação da massa por 11 dias em animais

submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf 70 Figura 27 Modelo hipotético do efeito do ZOL na remodelação óssea da MDI 81






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LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1 Escores referentes à extensão de reabsorções radiculares (RR) e ósseas

(RO) nos lados de compressão 53

Tabela 1 Efeito do ácido zoledrônico nas reabsorções radiculares e ósseas após 11

dias de MDI 60






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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABC Complexo avidina-biotina-peroxidase

ADP Adenosida disfosfato

AMPc Adenosida monofosfato cíclica

ANOVA Análise de Variância

ATP Adenosina trifosfato

AP Proteína Ativadora

AppCCl2p Adenosina-5’-beta-gamma-diclorometileno-trifosfato

Apppi Éster do ácido trifosfórico 1-adenosina-5-3-[3-metilbut-3-enil]

BSA Albumina sérica bovina

BFs Bisfosfonatos

BMP Proteína morfogenética óssea

c Cemento

C Controle

CCL Quimiocina motivo (C-C) ligante

CMO Conteúdo mineral ósseo

CMOs Células da medula óssea

CXCL Quimiocina motivo (C-X-C) ligante

C-fms Receptor para o fator estimulador de colônias

C-Jun Proteína codificada pelo gene Jun

d Dentina

DKK Dickkopf

DL Raiz distolingual

DV Raiz distovestibular

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática

EphB Receptor de efrina B

FAO Fosfatase alcalina óssea

FCG Fluido crevicular gengival

FGF Fator de crescimento fibroblástico

FPP Farnesil pirofosfato

FPPS Farnesil pirofosfato sintetase

Gf Gramas força

Gp Glicoproteína

GGPP Geranil-geranil pirofosfato

GGPPS Geranil-geranil pirofosfato sintetase

G-MCSF Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos

H2Od Água destilada

H-TAB Hexadecil-trimetil-brometo de amônio






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ICAM Proteína de adesão intercelular

IFN Interferon

IGF Fator de crescimento insulínico

IL Interleucina

INT Raiz intermediária

IPP Isopentenil pirofosfato

IV Intravenosa

JAK Janus quinase

K7M3 Células de osteosarcoma murinho

lp Ligamento periodontal

LPR Receptor de lipoproteína

LPS Lipopolissacarídeo

M Raiz mesial

MAPK Proteíno-quinases ativadas por mitógenos

MDI Movimentação dentária induzida

ML Raiz mesio-lingual

MPO Mieloperoxidase

mRNA RNA mensageiro

NaCl Cloreto de sódio

NAFTc Fator nuclear de células T ativadas

NaPO4 Fosfato de sódio

NF-κB Fator nuclear κ-B

Ni-Ti Níquel-Titânio

NO Óxido nítrico

NT Não tratado

NT-x Telopeptídio N-terminal

N-BFs Bisfosfonatos nitrogenados

oa Osso alveolar

OCN Osteocalcina

ONMB Osteonecrose dos maxilares induzida por bisfosfonatos

OPD O-fenilenodiamina

OPG Osteoprotegerina

OSF Fator estimulante de osteoblastos

OSM Oncostatina M

OSX Osterix

p Polpa

PBS Tampão fosfato-salino

PG Prostaglandina

pH Potencial hidrogêniônico

PTH Hormônio da paratireoide






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qPCR Reação em cadeira de polimerase em tempo real

RANK Receptor ativador do fator nuclear-κB

RANKL Ligante do receptor ativador do fator nuclear-κB

RAW 264.7 Células de linhagem macrofágica murina

RFA Reação de fase aguda

ROS Espécies Reativas de Oxigênio

RO Reabsorção óssea

RR Reabsorção radicular

RT-PCR Transcriptase reversa- reação em cadeia de polimerase

RUNX Fator de transcrição relacionado a RUNT

SMAD Proteína SMAD

SP Substância P

STAT Transdutor de sinal e ativador da transcrição

TGF Fator transformador do crescimento

TLR Receptor Toll-like

TNF Fator de necrose tumoral

TRAF Receptor associado ao TNF

TRAP Fosfatase ácida tartarato-resistente

UFC Universidade Federal do Ceará

V-CAM Proteína vascular de adesão celular

VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular

VO Volume ósseo

VT Volume de tecido

ZOL Ácido Zoledrônico






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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 16 2. REVISÃO DE LITERATURA 18 2.1 Remodelação óssea 18 2.2 Movimentação dentária e inflamação 23 2.3 Estudos da movimentação dentária induzida (MDI) 29 2.4 Bisfosfonatos 32 2.5 Ácido Zoledrônico 38 3. JUSTIFICATIVA 42 4. OBJETIVOS 43 4.1 Geral 43 4.2 Específicos 43 5. METODOLOGIA 44 5.1 Seleção de animais 44 5.2 Fármacos, reagentes e anticorpos 44 5.3 Protocolo experimental 45 5.2.1 Modelo de Movimentação Dentária Induzida (MDI) 45 5.3.2 Grupos experimentais 47 A. Grupos não-tratados 47 B. Grupos ácido zoledrônico (ZOL) 47 C. Grupos controles 48 5.4 Quantificação dos espaços interdentais 48 5.5 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea 49 5.6 Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal 49 5.7 Histologia de reabsorções radiculares e ósseas alveolares 53

5.8 Dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO) gengival 54

5.9 Dosagens dos níveis gngivais de TNF-α e IL-1β 55 5.10 Análise imunohistoquímica para detecção de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP 56

5.11 Análise do leucograma 57 5.12 Análise da variação de massa corpórea 57






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5.13 Aspectos éticos 57 5.14 Análise estatística 57 6.RESULTADOS 58 6.1 Quantificação dos espaços interdentais 58 6.2 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea 58 6.3 Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal 59 6.4 Histologia das reabsorções radiculares e ósseas 60 6.5 Atividade da mieloperoxidase gengival (MPO) 63 6.6 Análise dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β 63 6.7 Análises imunohistoquímicas 64 6.8 Leucograma 69 6.9 Variação de massa corpórea 70 7. DISCUSSÃO 71 8. CONCLUSÃO 82 Referências 83 Apêndices 105 Apêndice A - Controles negativos para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP 105

Apêndice B - Aparelhos e instrumentos laboratoriais 106 Apêndice C- Soluções e materiais de consumo 108 Anexo 109 Anexo A - Aprovação da comissão de ética no uso de animais 109

16

1 INTRODUÇÃO As repercussões de fármacos que afetam o metabolismo ósseo, como os

antirreabsortivos, a exemplo dos bisfosfonatos, têm sido investigadas especialmente em

modelos animais (KAIPATUR et al., 2013; FERNANDEZ-GONZÁLEZ et al., 2016). Os

bisfosfonatos nitrogenados são utilizados no tratamento de desordens metabólicas

ósseas, como osteoporose e metástases ósseas (JUNG et al., 1973; BROOM et al.,

2014). Dentre eles, destaca-se o ácido zoledrônico, um potente inibidor de osteoclastos,

utilizado como adjuvante quimioterápico (BARNADAS et al., 2014) e para o tratamento

de fraturas na osteoporose pós-menopausa (CHÁVEZ-VALENCIA et al., 2014). O uso de

bisfosfonatos nitrogenados, principalmente o ácido zoledrônico, por períodos

prolongados, impossibilita o manejo odontológico dos pacientes, uma vez que o risco de

osteonecrose dos maxilares aumenta (GHONEIMA; ALLAN; WINDSOR, 2010). Esta

condição se caracteriza por exposição do tecido ósseo decorrente da incapacidade de

cicatrização do epitélio (KOHSLA et al., 2007). Diante disso, o tratamento ortodôntico e

outras intervenções cirurgicas orais são contraindicados durante a terapia com

bisfosfonatos nitrogenados (KRISHNAN; PANDIAN; KUMAR, 2015).

O osso é um tecido especializado rico em Ca2+ que se encontra em

remodelação óssea contínua. Esse processo depende da atividade de osteoclastos, que

reabsorvem o osso em desuso da matriz óssea, osteoblastos que recompõem a matriz,

formando um novo osso, e osteócitos que regulam a atividade dessas células (DATTA et

al., 2008; RUCCI, 2008). A remodelação óssea é o processo que renova o tecido ósseo,

mantendo a força e a homeostasia óssea, que se inicia logo após o nascimento e

perdura até a morte. Em mulheres na menopausa tende a diminuí-la, mas não a torna

inexistente (CLARKE et al., 2008). A mesma, depende da atividade orquestrada de

osteoclastos e osteoblastos, os quais se intercomunicam pela expressão de proteínas e

receptores que regulam a diferenciação, proliferação e atividade dessas células (ZHAO

et al., 2006; PEDERSON et al., 2008; MARTIN; SIMS, 2005; TANG et al., 2009). O osso

também sofre influência expressiva do sistema imune, uma vez que clastos e blastos

expressam receptores para leucócitos, citocinas e quimiocinas, os quais regulam o

processo de maturação dessas células, modulando o metabolismo ósseo (DATTA et al.,

2008; RUCCI, 2008; JIANG et al., 2015).

Nesse contexto, a movimentação dentária é definida como o deslocamento

dentário fisiopatológico advindo da aplicação de uma força, envolvendo a produção de

mediadores inflamatórios que atuam no ligamento periodontal e no osso alveolar. O

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estresse mecânico leva a deformação do ligamento periodontal, originando áreas de

compressão e tração (WISE; KING, 2008). No lado de compressão, o colabamento dos

vasos induz hipóxia e consequente morte celular (GAEGLER; MERTE, 1983). A partir

disso, a matriz extracelular passa a ser composta por fibras colágenas densas, com

ausência de células, denominadas áreas hialinas da matriz extracelular (FRACALOSSI

et al., 2009). Essas áreas liberam fatores quimiotáticos para células gigantes

multinucleadas, que se diferenciam em osteoclastos e tornam a reabsorver o osso

adjacente (VON BÖHL; KUIJPERS-JAGTMAN, 2009). Os eventos inflamatórios são

gerados ao redor das áreas hialinas, uma vez que, os macrófagos, ao fagocitarem essas

áreas, liberam quimiocinas e citocinas que atraem células mesenquimais. Por isso, a

movimentação dentária agrega uma resposta inflamatória asséptica, sem infecção

(KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006). Quando a força é aplicada corretamente, o mínimo

de áreas hialinas é gerado, permitindo a reabsorção óssea frontal. Forças de grande

intensidade, induzem áreas hialinas extensas, o que leva ao atraso do movimento

dentário (FRACALOSSI et al., 2009). No lado de tração, o estiramento do ligamento

periodontal permite a aposição óssea, mediada pelo aumento da angiogênese e de

células osteogênicas como osteoblastos, as quais são induzidas por fatores de

crescimento (FRANCESCHI; XIAO, 2003; BODINE et al., 2007).

Embora o tratamento com ácido zoledrônico não seja recomendado durante a

movimentação dentária, esse trabalho buscou investigar o efeito desse fármaco durante

a remodelação óssea, para a qual o modelo de movimentação dentária induzida (MDI)

em ratos representa uma ferramenta para o estudo desse processo. A literatura tem

abordado os efeitos macroscópicos do ácido zoledrônico na quantificação das taxas do

movimento dentário, mas ainda carece de informações sobre as repercussões

farmacológicas a nível de resposta inflamatória e consequente remodelação óssea da

MDI. Por isso, objetivou-se avaliar a modulação de mediadores inflamatórios,

influenciando o metabolismo ósseo, no tratamento com ácido zoledrônico durante a

remodelação óssea.

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2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Remodelação óssea

O osso é um tecido conjuntivo resistente e especializado, constituído por íons

Ca2+ na forma de hidroxiapatita, que se encontra em constante remodelação óssea

(DATTA et al., 2008). O processo de renovação é dependente da atividade de células

como osteoclastos, que reabsorvem a matriz óssea, osteoblastos, que exercem funções

osteogênicas, e osteócitos, células provenientes de osteoblastos, que constituem a

matriz óssea e exercem funções mecanossensoriais (RUCCI, 2008). Essas células

atuam de forma sincronizada para que a reabsorção seja seguida de neoformação

óssea, preservando a matriz tecidual (RAGGAT; PARTRIDGE, 2010).

Os osteoclastos são derivados de células estaminais hematopoiéticas e seu

desenvolvimento envolve a interação do fator estimulador de colônias de macrófagos

(M-CSF) e do seu receptor C-fms, o qual é encontrado na superfície de tais células

progenitoras (REDLICH; SMOLLEN, 2012). Na osteoclastogênese o recrutamento de

células originadas da linhagem de macrógafos se fundem para formar células

multinucleadas com bordas em escova, os osteoclastos (UDAGAWA et al., 1990;

WALKER, 1975), os quais expressam fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) em

sua superfície (TEITELBAUM; ROSS, 2003). Nesse processo de diferenciação, diversos

mediadores inflamatórios, tais como as prostaglandinas E (PGE2) (BEZERRA et al.,

2000), citocinas como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), a interleucina (IL)-1β

(LIMA et al., 2004) e a IL-17, metaloproteinases de matriz óssea, e óxido nítrico (LEITAO

et al., 2005) exercem um papel crucial na destruição óssea osteoclástica (GUIMARÃES

et al., 2016). Tais mediadores estimulam o aumento de citocinas como o ligante do

receptor ativador do fator nuclear-κB (RANKL), expresso em células estromais como

linfócitos T e B, fibroblastos e osteoblastos, e do M-CSF (WIKTOR-JEDRZEJCZAK et

al., 1990; YASUDA et al., 1998; HOWARD; ZWILLING, 1998; QUINN et al., 2000;

MANABE et al., 2001). O M-CSF atua na proliferação de pré-osteoclastos, ao passo que

o RANKL ativa o receptor ativador do fator nuclear κB (RANK), induzindo a diferenciação

e a ativação de osteoclastos (YASUDA et al., 1998). Após a ligação entre RANK e

RANKL, o fator nuclear-κB (NF-κB) e a proteína ativadora-1 (AP-1), encontrados no

citoplasma sob condições normais, migram para o núcleo e regulam a transcrição gênica

(BOYLE, SIMONET, LACEY; 2003). O NF-κB e a AP-1 ativam o fator nuclear de células

T ativadas-1 (NAFTc-1), uma molécula chave para a diferenciação osteoclástica que age

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nesse processo por intermédio de vias como a do receptor associado ao TNF-6 (TRAF-

6), c-Jun e proteína MAPK p38 (IKEDA et al., 2004; GOHDA et al., 2005; ZHAO et al.,

2007), promovendo oscilação intracelular dos níveis de Ca2+, e induzindo a

osteoclastogênese (YANG, LI; 2007) (Figura 1).

Figura 1 – Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a osteoclastogênese. A interação RANK-RANKL na presença de M-CSF na membrana de pré-osteoclastos promove a ativação de NF-κB e AP-1, com consequente migração para o núcleo. Ambos regulam a ativação de NAFTc-1, que estimula a osteoclastogênese via TRAF6, C-Jun e MAPK p38. Baseado em DATTA et al., 2008; RUCCI et al., 2008; RAGGAT; PARTRIDGE, 2012.

Para interagir com o osso, os osteoclastos maduros expressam αVβ3

integrina, um receptor que interage com proteínas da matriz óssea como a osteopontina

e a sialoproteína óssea (DAVIES et al., 1989). A ocupação do sítio da αVβ3 integrina,

além de promover a oscilação dos níveis de Ca2+, promove a fosforilação de tirosina e a

produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), ativando o osteoclasto para promover

reabsorção óssea (SHANKAR et al., 1993; DATTA et al., 1995; NAKAMURA et al.,

1998). As mudanças que ocorrem no citoesqueleto para formar a borda em escova são

mediadas pela GTPases (CHELLAIAH et al., 2000) (Figura 2).

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Figura 2 – Ligação do osteoclasto maduro à matriz óssea. A ligação do osteoclasto ao osso ocorre pela expressão de αVβ3 integrina, que induz oscilação dos níveis de cálcio e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Assim, a célula passa a reabsorver o tecido pela presença da borda em escova formada pelas GTPases. Baseado em DATTA et al., 2008.

De maneira coordenada, os osteoblastos são as células importantes durante

a neoformação óssea, cuja diferenciação também é estimulada por diversos fatores, em

diferentes estágios. Os osteoblastos se desenvolvem a partir de células progenitoras

mesodérmicas que, quando completamente diferenciadas, produzem a matriz óssea. O

fator estimulador de osteoblastos (OSF-1) atua na quimiotaxia de pré-osteoblastos e na

maturação de osteoblastos imaturos (YANG et al., 2001). Todavia, o anabolismo ósseo

depende, principalmente, da expressão do fator de transcrição relacionado a RUNT-2, o

RUNX2, cuja ativação resulta em diferenciação de pré-osteoblastos em osteoblastos

maduros, bem como a sobrevivência dessas células (GAUR et al., 2005).

O RUNX2 pode ser induzido pela via Wnt/β-Catenina, pelo fator transformador

do crescimento-β (TGF-β) e pelas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) (DATTA et

al., 2008). O hormônio da paratireoide (PTH), os fatores de crescimento fibroblástico

(FGF) e insulínico (IGF), e as BMPs também levam à expressão de RUNX2, via indução

de SMADs e MAPKs (FRANCESCHI; XIAO, 2003; BODINE et al., 2007).

A via Wnt/β-Catenina exerce um papel importante na ativação osteoblástica

(BODINE; KOMM, 2006). As proteínas Wnt são glicoproteínas secretadas por células da

medula óssea e hematopoiéticas (YAMANE et al., 2001). Elas se ligam a um complexo

de receptores composto pelos receptores de lipoproteínas de baixa densidade 5 e 6 e

um receptor Frizzled (VAN AMERONGEN; NUSSE, 2009). A interação entre as

proteínas Wnt e o complexo de receptores inibe a fosforilação de β-catenina, levando a

um acúmulo da forma não-fosforilada no citoplasma, a qual se transloca para o núcleo, e

modula a transcrição gênica (TAMAI et al., 2000).

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Esta via também leva à superexpressão de Osteoprotegerina (OPG), uma

citocina antiosteoclastogênica produzida por osteoblastos que se liga ao RANKL e

impede sua ligação ao RANK (KAWASAKI et al., 2006). Desta forma, inibe a

osteoclastogênese e induz apoptose de osteoclastos maduros (LACEY et al., 1998).

Esta via pode ser infra-regulada por proteínas como a Dickkopf -1 (DKK1), a qual é

secretada fisiologicamente pela pele e baço (KWACK et al., 2008).

A oncostatina M (OSM) também induz a atividade osteoblástica ao se ligar a

um receptor de citocinas chamado glicoproteína 130 (Gp130), presente na membrana de

osteoblastos, induzindo a ativação da via de sinalização JAK-STAT, o que resulta na

modulação da transcrição gênica (WALKER et al, 2010). Ainda, a expressão

osteoblástica de osteopontina, osteonectina e osteocalcina é importante na produção de

componentes da matriz, a exemplo da hidroxiapatita, contribuindo para a manutenção da

mineralização óssea (MURSHED et al., 2005) (Figura 3).

Figura 3 – Vias de indução da transcrição gênica de fatores que estimulam a osteoblastogênese. A ligação do fator transformador de crescimento (TGF-β), hormônio da paratireoide (PTH), proteína morfogenética óssea (BMP), fator de crescimento fibroblasticos (FGF), fator de crescimento insulínico (IGF) e oncostatina M (OSM) na membrana de pré-osteoblastos e osteoblastos maduros leva à ativação da neoformação óssea via indução de RUNX-2, que modula a transcrição gênica para aumentar sua própria expressão, bem como de osteoprotegerina (OPG), osteocalcina (OCN) e osterix (OSX). Baseado em RAGGAT; PARTRIDGE, 2012.

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Em relação aos osteócitos, estas células também estão incluídas na “Unidade

Básica Multicelular” do esqueleto, juntamente aos osteoblastos e osteoclastos,

demonstrando participar ativamente na remodelação do tecido ósseo (BONEWALD,

JOHNSON, 2008; O’BRIEN; NAKASHIMA; TAKAYANAGI, 2013), apesar de terem sido

considerados inertes durante anos. Osteócitos são osteoblastos terminalmente

diferenciados contidos dentro da matriz óssea mineralizada e são envolvidos na

mecanosensação e transdução deste tecido (BONEWALD, JOHNSON, 2008). A

literatura tem destacado a função de osteócitos no controle da formação e reabsorção

óssea. A identificação da esclerostina, uma proteína restrita a osteócitos e considerada

antagonista da via Wnt/β-Catenina (TEN DIJKE et al., 2008), forneceu a primeira

evidência de que os osteócitos exercem controle direto sobre a formação óssea. Ainda,

estudos genéticos revelaram que os osteócitos são fontes celulares de RANKL e que

reconhecidamente controlam a osteoclastogênese (NAKASHIMA et al., 2011; XIONG;

O’BRIEN, 2012).

Sabe-se que os osteoblastos são os principais reguladores da diferenciação

de osteoclastos, uma vez que as principais citocinas requeridas para esse processo são

expressas por essas células (DATTA et al., 2008), a exemplo de RANKL e M-CSF, que

são marcadores característicos da linhagem osteoblástica, assim como PTH, fosfatase

alcalina e osteocalcina (SIMS; GOOI, 2008; RUCCI, 2008; GOOI et al., 2010). Foi

observado, ainda, em um estudo in vitro, que a osteoclastogênese ocorria somente na

presença de osteoblastos e células estromais (TAKAHASHI et al., 1988).

Durante o processo de reabsorção óssea, os osteoclastos e os osteócitos

liberam TGF-β e IGF-1 que induzem o recrutamento de células mesenquimais pré-

osteoblásticas aos sítios de destruição óssea (MARTIN; SIMS, 2005; TANG et al., 2009).

Osteoclastos também expressam a 1-fosfato de esfingosina, uma proteína de

sinalização osteoblástica, que atua como agente quimiotático para osteoblastos

(PEDERSON et al., 2008). Ainda, essas células também produzem efrina-B2, que ao se

ligar aos receptores EphB4, presentes em osteoblastos, induz o aumento da

diferenciação osteogênica, bem como a inibição da osteoclastogênese pela

infrarregulação de NAFTc-1 (ZHAO et al., 2006). De fato, há uma estreita comunicação

entre osteoblastos e osteoclastos, que interagem para promover remodelação e

manutenção do tecido ósseo (RAGGAT; PARTRIDGE, 2010).

O osso pode sofrer influência significativa do sistema imune, uma vez que na

superfície das células ósseas são expressos muitos receptores para citocinas, células de

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defesa e quimiocinas (DATTA et al., 2008). Quando há algum fator de ativação desse

sistema, a exemplo de doenças como a artrite reumatoide (JI et al., 2002) e periodontite

(YOSHIHARA et al., 2004), e indução de estresses mecânicos como a instalação de

aparelhos ortodônticos (GARLET et al., 2007; 2008), há a produção de mediadores da

inflamação que interagem com clastos e blastos modulando o metabolismo ósseo

(RUCCI, 2008; JIANG et al., 2015). Dessa forma, modelos de movimentação dentária

induzida têm sido utilizados afim de elucidar os mecanismos inerentes à remodelação

óssea.

2.2 Movimentação dentária e inflamação A movimentação dentária é, por definição, o deslocamento de um dente

decorrente de uma força mecânica aplicada ao mesmo, envolvendo diretamente o

ligamento periodontal e o osso alveolar, de tal forma a gerar uma área de compressão

do ligamento contra o osso alveolar e, no lado oposto, uma de tração dos ligamentos

periodontais. As forças mecânicas não induzem apenas a movimentação dentária, mas

também, estimulações biológicas capazes de promover reações teciduais que

determinarão uma nova posição estável e duradoura do dente (FRACALOSSI et al.,

2009), cujo fenômeno é denominado mecanotransdução. Tais estímulos biológicos

envolvem eventos celulares, a partir dos quais ocorrem as proliferação, diferenciação e

apoptose de células do ligamento periodontal nos sítios de compressão e tração,

estimulados pela liberação de mediadores da inflamação como prostaglandinas,

citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, dentre outros (KRISHNAN;

DAVIDOVITCH, 2009; CHIBEBE; SATAROBINAS; PALLOS 2011).

Burstone (1962) dividiu a movimentação dentária em seres humanos em três

fases. A primeira, chamada de fase inicial que perdura até o 5º dia e se caracteriza pelo

movimento do dente no espaço periodontal. A segunda, corresponde à fase de latência

em que há o retardo do movimento dentário, devido à formação de áreas hialinas por

volta do 6º ao 12º dia. Por fim, a fase de pós-latência, que ocorre a partir do 13º dia, na

qual há um aumento das taxas de movimentação dentária por conta da reabsorção das

áreas hialinas por osteoclastos (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).

Ao ser iniciada, a movimentação do dente através do alvéolo induz a

obliteração dos vasos sanguíneos do ligamento periodontal, diminuindo a quantidade de

vascularização no lado de compressão (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).

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Consequentemente, surgem zonas de necrose focal, que apresentam trombose capilar e

redução do número de células, chamadas de áreas hialinas da matriz extracelular, por

se assemelharem à cartilagem hialina em cortes histológicos (MEIKLE et al., 2006). Os

macrófagos são recrutados e diferenciados em osteoclastos para remoção dessas áreas

e, por conseguinte, acabam por reabsorver o osso circunjacente e favorecer o

deslocamento do dente (VON BÖHL; KUIJPERS-JAGTMAN, 2009).

A hipóxia instalada no sítio de compressão leva ao desenvolvimento de um

processo inflamatório agudo, no qual há a liberação de fatores como a histamina, a

bradicinina, a substância P e o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), os

quais facilitam o extravasamento de plasma dos capilares (WISE; KING, 2008). Com a

perda de líquido, os leucócitos se concentram no lúmen do vaso, e dada a evolução do

processo, se aderem ao longo do endotélio e transmigram para o meio extracelular,

sendo recrutados para o lado de compressão por meio de estímulos de citocinas e

quimiocinas (ANDRADE; TADDEI; SOUSA, 2012) (Figura 4). Em conjunto com as

alterações vasculares e celulares, a compressão do ligamento periodontal também induz

a produção de mediadores da inflamação. Esses mediadores atuam no processo

inflamatório agudo induzindo quimiotaxia de leucócitos como neutrófilos, linfócitos e

monócitos para o local da inflamação por meio da expressão de moléculas de adesão

como VCAM-1 e ICAM-1 (KINDLE et al., 2006), bem como desempenhando um papel

relevante na remodelação óssea induzida pela movimentação ortodôntica, agindo de

forma direta e indireta na atividade das células ósseas (KRISHNAN, DAVIDOVITCH,

2006; 2009; MEIKLE, 2006; JIANG et al., 2015). Dentre eles, destacam-se a PGE2 e as

citocinas pró-inflamatórias, o TNF-α e as IL-1β, -6 e -8 e -17, bem como o fator

estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF). Esses mediadores

químicos ativam os osteoclastos a promover reabsorção óssea (KUWABARA et al.,

2001; YAGO et al., 2007; CHAE et al., 2011; JIANG et al., 2015) (Figura 4).

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Figura 4 – Resposta inflamatória após aplicação de uma força. A hipóxia estimula a liberação mediadores da inflamação que facilitam a saída de leucócitos dos vasos e a quimiotaxia para o local da inflamação. PG: prostaglandina; SP: substância P; VEGF: fator de crescimento de endotélio vascular; TNF: fator de necrose tumoral; IL: interleucina. Adaptado de Andrade; Taddei; Sousa, 2012.

Em contrapartida, as citocinas anti-inflamatórias como IL-4, -10, -18, e os

fatores TGF-β, FGF e IGF exercerem efeitos estimulatórios sobre osteoblastos,

favorecendo a neoformação óssea (HORWOOD et al., 1998; TEIXEIRA et al., 2010;

CHENG et al., 2011).

As prostaglandinas (PGs) atuam principalmente nos eventos vasculares da

inflamação, mas sabe-se que também são potentes reguladores da osteoclastogênese

(SHIMIZU et al., 1992). Estudos revelam uma correlação positiva entre a dor após

instalação de elásticos separadores e os níveis de PGE2 no fluido crevicular gengival

(FCG) de pacientes, uma vez que o pico de deste mediador no FCG se deu por volta de

1 hora após o estímulo, sendo concomitante ao aumento dos escores da Escala Visual

Analógica (GIANNOPOULOU; DUDIC; KILIARIDIS, 2006). Também foi observado um

aumento na produção PGE2, bem como a consequente ativação de osteoclastos nos

sítios de reabsorção óssea alveolar na presença de periodontite (RASMUSSEN;

HANSTROM; LERNER; 2000). Além disso, a incubação de monócitos de sangue

periférico com 10-7 M de PGE2 aumentou a expressão de RANKL após 48 horas

(KANZAKI et al., 2002).

TNF-α, IL-1β e IL-6 são citocinas envolvidas na resposta inflamatória inicial.

No contexto do movimento dentário, tais citocinas têm influência importante na

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remodelação óssea, uma vez que atuam ativamente na maturação osteoclástica

(REDLICH; SMOLEN, 2012).

Particularmente, o TNF-α promove a osteoclastogênese mediante a sua

ligação ao receptor p55 presente na membrana de pré-osteoclastos, induzindo a

diferenciação dessas células em osteoclastos maduros. Também promove a

suprarregulação de RANKL, M-CSF e quimiocinas em osteoblastos (LAM et al., 2000;

TEITELBAUM; ROSS, 2003; YANO et al., 2005). Além de induzir a osteoclastogênese, o

TNF-α exerce uma ação inibitória na neoformação óssea, pois estimula a apoptose de

osteócitos, células que promovem a manutenção da matriz óssea por regularem a

atividade de osteoblastos (AHUJA et al., 2003; RUCCI, 2008).

Da mesma forma, a IL-1β também é um mediador chave envolvido na

osteoclastogênese, que é expresso em níveis elevados no lado de compressão durante

o movimento dentário (GARLET et al., 2007; NAKAO et al., 2007; REN et al., 2007). A

diferenciação de osteoclastos mediada por IL-1β ocorre tanto pela indução de fusão,

ativação e sobrevivência de células reabsortivas (BASARAN et al., 2006), como pelo

aumento da produção de RANKL por osteoblastos e células estromais durante as fases

iniciais da movimentação ortodôntica (LE GALL, SASTRE, 2010). Outros estudos

também constataram que a IL-1β induz a suprarregulação de PGE2, M-CSF e

quimiocinas e a infrarregulação da expressão de osteoprotegerina (OPG), em

osteoblastos (TANABE et al., 2005; BLETSA; BERGGREEN; BRUDVIK, 2006).

A IL-6, induzida por TNF-α e IL-1β, estimula a reabsorção óssea por um

mecanismo distinto, que consiste em intensificar o acoplamento entre osteoclastos e

osteoblastos (STEEVE et al., 2004). Foi observado que esta citocina estimula a

osteoclastogênese na presença de osteoblastos, mas não em culturas de osteoclastos,

apenas (HATTERSLEY et al., 1988). Receptores para a IL-6, como o Gp130, presentes

em osteoblastos, são necessários para que haja osteoclastogênese (UDAGAWA et al.,

1995). Seu efeito se dá pela estimulação da expressão de RANKL nessas células,

intensificando a interação RANK-RANKL (PALMQVIST et al., 2002). Além disso, a IL-6

regula a ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal por TNF-α e IL-1, induzindo o

aumento da liberação de cortisol que também promove reabsorção óssea (VAN GOOL

et al., 1990; CHROUSOS, 1995).

Por outro lado, a IL-4, a IL-10 e o TGF-β desempenham papel inibitório

desses processos, controlando a reabsorção e favorecendo a neoformação ósseas.

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Estes são expressos no ligamento periodontal durante a movimentação dentária e

inibem a osteoclastogênese por estimular a expressão de OPG em osteoblastos

(HORWOOD et al., 1998; TEIXEIRA et al., 2010). Além disso, a IL-4 diminui a expressão

de RANKL via inibição de STAT 6. A IL-10 inibe a produção de TNF-α, IL-1β e IL-6,

tendo sua expressão superior no lado de tração em comparação ao de compressão

(PALMQVIST et al., 2006; GARLET et al., 2007). Um estudo in vitro constatou que TGF-

β induz a suprarregulação de osteoblastos e de OPG durante a tração de células do

ligamento periodontal e, semelhante à IL-10, esta citocina inibe a expressão de IL-6

(KANZAKI et al., 2006).

Mesmo sendo considerada uma citocina importante na ativação de

macrófagos, IFN-γ possui uma ação inibitória da osteoclastogênese em conjunto com os

receptores tipo-Toll (toll-like receptors ou TLRs), inibindo a expressão de RANKL e do

gene que codifica o receptor do fator estimulador de colônias (c-Fms) (JI et al., 2009).

Também foi encontrada em níveis aumentados no lado de tração após indução do

movimento dentário em humanos (GRANT et al., 2013).

O sistema de quimiocinas também exerce função importante na remodelação

óssea. Quimiocinas, como CCL2, 3 e 5, CXCL8 (IL-8) e CXCL12, promovem a

diferenciação de pré-osteoclastos pela indução de RANKL (YU et al., 2004) e induzem a

quimiotaxia e sobrevivência de osteoclastos maduros (OKAMATSU et al., 2004;

WATANABE et al., 2004). RANKL induz a produção de CCL2, 3 e 5 por osteoclastos,

sugerindo uma sinalização autócrina e parácrina da osteoclastogênese e um aumento

da reabsorção óssea (YU et al., 2004; BINDER et al., 2009).

CCL5 e CXCL12 também exercem influência na atividade de osteoblastos

(ANDRADE; TADDEI; SOUSA, 2012). Estudos observaram que a ligação dessas

quimiocinas aos osteoblastos induz o recrutamento e inibição da apoptose dessas

células, como também induzem a expressão de colágeno tipo-I em suas superfícies

(YANO et al., 2005; ANDRADE et al., 2009).

A comunicação entre osteoclastos e osteoblastos por intermédio do sistema

RANK/RANKL/OPG pode ser mediada pela ação das quimiocinas (BOYCE, XING,

2008), as quais são induzidas por IL-1β e TNF-α, contribuindo para a osteoclastogênese

e exacerbando a reabsorção óssea (YU et al., 2004; YANO et al., 2005; SCHALL,

PROUDFOOT, 2011).

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Figura 5 – Desenhos esquemáticos dos processos de reabsorção óssea alveolar no lado de compressão (A) e neoformação óssea alveolar no lado de tração (B). No lado de compressão, a reabsorção óssea é regulada pela via RANK/RANKL/OPG, podendo, também, ser estimulada por mediadores pró-inflamatórios como TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e PGE2 e quimiocinas. No lado de tração ocorrem proliferação de osteoblastos e síntese de colágeno, em que participam quimiocinas, citocinas e fatores de crescimento. Adaptado de Andrade; Taddei; Sousa 2012.

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2.3 Estudos da movimentação dentária induzida (MDI) Os modelos de movimentação dentária induzida (MDI) em animais constituem

boas estratégias para o estudo da remodelação óssea, uma vez que mimetizam as

principais características clínicas, como o movimento propriamente do dente em direção

à força aplicada e a produção de biomarcadores inflamatórios e ósseos (REN et al.,

2004).

Um modelo que vem sendo bastante utilizado consiste na instalação e

ativação de dispositivos ortodônticos, no qual o movimento dentário induz a liberação de

mediadores químicos da inflamação em poucos dias após a aplicação de força (XIE;

KUIJPERS-JAGTMAN; MALTHA et al., 2011; BOAS NOGUEIRA et al., 2013; YAN et al.,

2015).

À semelhança do que se observa em humanos, em que um conjunto de

eventos biológicos estão bem estabelecidos, em modelos animais, a hipóxia gerada pela

compressão do ligamento periodontal da raiz sob movimentação resulta em trombose

capilar e apoptose celular, formando as chamadas áreas hialinas da matriz extracelular,

que apresentam poucas células. Os eventos vasculares iniciais conduzem, rapidamente,

à mobilidade celular para a área afetada, sendo os neutrófilos importantes componentes

que atuam pela liberação de enzimas lisossomais, sinalizando e atraindo novas células

para o local. Tais eventos favorecem a ação de diversos mediadores químicos

plasmáticos e celulares (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; FRACALOSSI et al., 2009;

ANDRADE et al., 2012; YUCEL-LINDBERG; BAGE et al., 2013).

Um estudo observou o aumento de prostaglandina E2 em apenas 24 h após a

indução do movimento dentário em gatos (SAITO et al., 1991), o que sugere a

participação desse mediador nos eventos iniciais da inflamação consequente do

estresse mecânico, favorecendo a formação de osteoclastos, uma vez que estimula a

enzima adenilato-ciclase e a adenosina monofosfato cílica (AMPc) intracelular em

osteoblastos (SUZAWA et al., 1999).

Xie, Kuijpers-Jagtman e Maltha (2011) constataram um aumento da marcação

para macrófagos, nos 3º e 5º dias da ativação, de uma mola de níquel-titânio em ratos.

Outro estudo, também em ratos, revelou o aumento de IL-8, importante agente

quimiotáxico para neutrófilos em 5 dias de MDI (YANG et al., 2013). Vandevska-

Radunovic et al. (1997) constataram o aumento da marcação de neutrófilos na 24ª hora

e aos 3 dias do início da MDI em ratos, o que foi confirmado na imunohistoquímica para

células CD43+. Os achados, em conjunto, sugerem que a ativação de um dispositivo

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ortodôntico em animais induz um aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias

advindas da ação de macrófagos e neutrófilos ativados.

Estudos observaram, ainda, o aumento da produção de citocinas como TNF-α

e IL-1β em até 7 dias de MDI em roedores, coincidente com maiores taxas do

deslocamento dentário (SAITO et al., 1991; HAZAN-MOLINA et al., 2013; ALIKHANI et

al., 2015; YAN et al., 2015). Quando do tratamento com o Basiliximab, bloqueador de

linfócitos T, ou com o Etanercepte, anticorpo para TNF-α, houve um decréscimo na

movimentação dentária em camundongos, evidenciando que TNF-α participa ativamente

da remodelação óssea da MDI nesses animais. Além disso, também foi verificado um

aumento de IL-6 no 5º dia da instalação da mola, o que possibilita a sugestão da

correlação entre TNF-α, IL-1β e IL-6, citocinas que agem em conjunto na ativação da

reabsorção óssea (YANG et al., 2013; YAN et al., 2015).

Sabe-se que TNF-α, IL-1β e IL-6 induzem diferenciação de osteoclastos pelo

aumento da expressão de mediadores como RANKL e M-CSF (PALMQVIST et al., 2002;

TANABE et al., 2005; YANO et al., 2005). Deveras, a literatura relata a presença de

RANKL, de c-fms e de M-CSF em 3 e 10 dias do início da movimentação em roedores,

evidenciando que o aumento da expressão desses mediadores é consequência dos

níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias, contribuindo, assim para a

osteoclastogênese (KAKU et al., 2008; XIE; KUIJPERS-JAGTMAN; MALTHA et al.,

2008; FRANZEN et al., 2014; ALIKHANI et al., 2015). Estudos mostram, ainda, a

presença de osteoclastos, pelo aumento da marcação para TRAP e Catepsina K em até

10 dias de MDI em roedores (XIE; KUIJPERS-JAGTMAN; MALTHA et al., 2011; HAZAN-

MOLINA et al., 2013; FRANZEN et al., 2014; ALIKHANI et al., 2015; YAN et al., 2015).

Além disso, constatou-se que a interação RANK-RANKL pode ocorrer logo após a

aplicação de força, uma vez que foi relatado o aumento da subunidade p65 do NF-κB,

em 3 e 24 horas de MDI em ratos (ZUO et al., 2007).

Um aumento da expressão do fator de crescimento do endotélio vascular

(VEGF) no lado de tração foi relatado em dois estudos em camundongos aos 10 dias de

MDI, o que confirma os achados histológicos que relataram um aumento da

microcirculação do ligamento periodontal nessa região (SANDSTEDT, 1904;

OPPENHEIN, 1911; SHWARZ,1932; KOHNO et al., 2003; KAKU et al., 2008). Além

disso, mediadores anti-inflamatórios também modulam a reabsorção óssea da MDI,

tanto pelo aumento fisiológico, como pela administração local de citocinas, que induzem

31






CDD 615.1

a neoformação óssea também foi observada durante a MDI em animais (WANG; ZHU;

LIANG, 2000; LOW et al., 2005; BROOKS et al., 2009; KOHARA et al., 2012; HAKAMI et

al., 2015).

O tratamento local diário com 1,5 µg/kg de IL-4 em camundongos submetidos

à MDI por 12 dias reduziu a taxa de movimentação, o que sugere um desequilíbrio na

remodelação óssea devido o estímulo da neoformação óssea. Ademais, houve

diminuição da marcação para TRAP, mostrando que a IL-4 também interfere na

atividade de osteoclastos (HAKAMI et al., 2015). Da mesma forma, camundongos

tratados localmente com 1,5 µg/20µl de IFN-γ também demonstraram taxas de

movimentação e marcação para TRAP reduzidas no mesmo período (KOHARA et al.,

2012). Ainda, a presença de TGF-β também foi verificada após por Wang, Zhu, Liang

(2000) em ambos os lados, sendo superior no lado de tração em 5 e 10 dias de MDI em

ratos. Outros achados também revelam o aumento da marcação para RUNX2 e OPG

aos 1º e 14º dias de MDI em ratos, respectivamente (LOW et al., 2005; BROOKS et al.,

2009).

Quanto às fases da movimentação dentária em humanos, a MDI em animais

também segue essa mesma divisão. Observou-se que a fase inicial da MDI em ratos

ocorre a partir da 6ª hora até o 4ª dia. A fase de latência perdura até o 7⁰ dia. A fase de

pós-latência se dá a partir do 8⁰ dia, em que há um aumento gradual das taxas de MDI,

as quais atingem o pico de movimentação no 11⁰ dia (ARAÚJO, 2015). Além de todas

essas semelhanças, a cavidade oral de humanos e murinos também é similar, uma vez

que ambas são constituídas por epitélio gengival, sulcular e juncional, fibras colágenas,

cementos celular e acelular e osso alveolar. A principal diferença é que o epitélio

gengival do roedor é queratinizado, diferentemente da do humano que não apresenta

queratina (LISTGARTEN, 1975).

Acerca da indução da movimentação dentária, a literatura relata a inserção de

elásticos entre molares (WALDO; ROTHBLATT, 1954), fixação de molas helicoidais de

fabricação manual (ALTAN et al., 2012), e instalação de molas fechadas de níquel-titânio

ancoradas por mini-implantes (KAIPATUR et al., 2013) ou fixadas por fio de amarrilho

(HELLER; NANDA). Estas últimas têm sido bastante utilizadas, uma vez que são de fácil

manuseio e proporcionam distribuição contínua e controlada da força (REN; MALTHA;

KUJIPERS-JAGTMAN, 2004).

32






CDD 615.1

A utilização de ratos é vantajosa para o estudo do movimento dentário, pois

estes apresentam baixo custo de manutenção, favorecem um número maior da amostra

em estudo, além da possibilidade de conservação do dispositivo ortodôntico por período

mais prolongado. Adicionalmente, o preparo para análises histológicas é relativamente

fácil, e a maioria de anticorpos necessários para as técnicas de biologias molecular e

celular estão disponíveis para estes animais (REN; MALTHA; KUJIPERS-JAGTMAN,

2004). Além de ratos, a movimentação dentária também foi induzida em cachorros

(TENG; LIOU, 2014) e gatos (SAITO et al., 1991).

Diante de todas essas observações, considera-se que a movimentação

dentária induzida por aparato ortodôntico em ratos agrega uma série de eventos

biológicos que levam à remodelação óssea e ao aumento da taxa de movimentação

dentária, também observadas clinicamente.

Observa-se, de fato que a movimentação dentária induzida agrega

fenômenos biológicos que culminam em remodelação óssea (WISE; KING, 2008). Nesse

contexto, a utilização de fármacos anti-inflamatórios ou antirreabsortivos, como os

bisfosfonatos, podem repercutir negativamente neste processo (KRASNY et al., 2013;

KRISHNAN; PANDIAN; KUMAR, 2015)

2.4 Bisfosfonatos

Os bisfosfonatos (BFs) são análogos não-biodegradáveis do pirofosfato com

intensa afinidade por cristais de hidroxiapatita e constituem a principal classe de

fármacos utilizados no tratamento de desordens metabólicas ósseas, dentre elas a

osteoporose, uma condição caracterizada pelo aumento da taxa de reabsorção óssea

(JUNG et al., 1973).

A estabilidade desses fármacos se deve à ligação de um átomo de carbono

com dois átomos de fosfato (P−C−P), o que confere ao composto, resistência à

metabolização e hidrólise enzimática por pirofosfatases (ROGERS et al., 1994; FLEISH

et al., 2002). As ligações adicionais do carbono central podem interagir com diversos

grupamentos, dentre eles, destacam-se os átomos de carbono, oxigênio e nitrogênio.

Essas cadeias laterais ligadas ao carbono podem ser definidas como ligantes R1 e R2

(ROGERS et al., 1994).

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CDD 615.1

Figura 6 – Estrutura química dos bisfosfonatos, destacando-se a ligação P-C-P. Os ligantes R1 e R2 podem variar de acordo com cada tipo de fármaco. Baseado em RUSSEL et al., 2008.

Quando uma dessas cadeias laterais é um grupamento hidroxila (-OH) ou

uma amina primária (NH2) ocorre a formação de um complexo tridentado que se liga de

forma mais eficaz ao cálcio, aumentando a afinidade a este mineral (JUNG et al., 1973).

Primariamente, os BFs são pouco absorvidos quando ingeridos por via oral o

que se atribui à baixa lipossolubilidade desses fármacos, o que interfere no seu

transporte transcelular por entre as barreiras epiteliais. O transporte de BFs ocorre,

principalmente, pela circulação sanguínea, após atravessarem as junções entre células

do epitélio (BOULENC et al., 1993; LIN et al., 1996). A elevada afinidade pela matriz

mineral óssea favorece a rápida depuração plasmática dos BFs (LIN et al., 1996). Os

mesmos são metabolicamente estáveis, portanto, são excretados pela urina na sua

forma inalterada (LIN et al., 1996).

Esses fármacos são adsorvidos em sítios de intensa remodelação óssea

(CHEONG, 2014) onde exercem seu efeito farmacológico (GREEN, 2004), dependente

da internalização em osteoclastos. Tal internalização causa inibição da reabsorção

óssea por induzir a apoptose dos osteoclastos (FLANAGAM; CHAMBERS, 1990). Além

de influenciar a funcionalidade de osteoclastos, os BFs promovem efeitos diretos na

matriz óssea decorrentes da sua interação com os cristais de hidroxiapatita, inibindo a

precipitação do fosfato de cálcio plasmático, a agregação e a dissolução desses cristais

(FLEISH et al., 1969).

Devido à avidez para se ligar ao osso, os BFs são úteis como agentes

marcadores de metástases ósseas e locais de fraturas (RUSSEL et al., 2008). A partir da

década de 1970, estes fármacos começaram a ser amplamente empregados no

tratamento na terapia oncológica, permanecendo até os dias atuais como ferramenta na

prevenção de complicações esqueléticas decorrentes de mieloma múltiplo (JI et al.,

2014) e de metástases ósseas do câncer de mama (SUMI et al., 2014). Também são

utilizados no tratamento da osteoporose pós-menopausa, reduzindo os marcadores do

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CDD 615.1

metabolismo ósseo e o risco de fraturas óssea e aumentando a densidade mineral

óssea (LIBERMAN et al., 1995; REGINSTER et al., 2000).

Por conta da adsorção dos BFs em superfícies minerais ósseas, o contato

com as células osteoclásticas é facilitado. Além disso, a queda do pH característica de

áreas de reabsorção óssea facilita a dissociação entre esses fármacos e a hidroxiapatita

e, consequentemente, os BFs são fagocitados pelos osteoclastos (SATO et al., 1991).

No meio intracelular localizam-se em vesículas endocíticas, as quais devem ser

acidificadas para permitir a saída dos BFs para o citoplasma (THOMPSON et al., 2006) e

exercer seus efeitos que culminam em apoptose dos osteoclastos.

Os BFs se dividem em duas classes farmacológicas. Na primeira, estão

aqueles que não contém nitrogênio em sua fórmula molecular, sendo então chamados

de bisfosfonatos não-nitrogenados. A segunda classe, agrega os bisfosfonatos mais

atuais, os quais apresentam o átomo de nitrogênio em sua composição, sendo

classificados como bisfosfonatos nitrogenados (N-BFs) (GREEN 2004, RUSSEL et al.,

2008) (Figura 7).

Figura 7 – Fórmulas moleculares de um bisfosfonato não-nitrogenado, como exemplo, o Clodronato, e de bisfosfonatos nitrogenados, como o Alendronato de Sódio e Ácido Zoledrônico. Arquivo da autora.

Os BFs não-nitrogenados, como o clodronato, o etidronato e o tiludronato,

exercem seu mecanismo de ação mediante a produção de análogos não-hidrolizáveis do

ATP (ROGERS et al., 1994). Lehenkari et al. (2002), em um estudo in vitro utilizando

mitocôndrias de ratos Sprague-Dawley, observaram que o metabólito adenosina-5'-beta-

gamma-diclorometileno-trifosfato (AppCCl2p), originado pelo clodronato, administrado na

concentração de 5x10-4 M, diminuiu do consumo de oxigênio nessas organelas, por inibir

a estimulação de adenosina difosfato (ADP) e a atividade da translocase do nucleotídeo

adenina para formar adenosina trifosfato (ATP). No mesmo estudo, foi realizado outro

35






CDD 615.1

ensaio in vitro com osteoclastos humanos onde foi constatado que o AppCCl2p provocou

a apoptose de 80% dessas células por induzir a perda do potencial de membrana

mitocondrial, caracterizado pela ineficiência em transcolar um átomo de fósforo ao ADP

para formar ATP.

Os N-BFs, como o alendronato, o pamidronato, o ibandronato, o risedronato e

o ácido zoledrônico interferem na atividade e na sobrevivência de osteoclastos, porém

por um mecanismo de ação distinto ao dos BFs não nitrogenados. Seu local de ação

corresponde à via do mevalonato, conhecida pela importância da biossíntese de

colesterol e outros esteróis (RUSSEL et al., 2008). Os N-BFs interferem na cascata

desta via, bloqueando a atividade da farnesil difosfato sintetase (FPPS) (FISHER et al.,

1999)

Esse bloqueio leva à inibição da formação de isopentenil pirofosfato (IPP) em

farnesil pirofosfato (FPP), substrato necessário para a formação de geranil-geranil

pirofosfato (GGPP), via geranil-geranil pirofosfato sintetase (GGPS). Tanto o FPP quanto

o GGPP são necessários para a prenilação das GTPases, como Ras, Rab, Rho e Rac,

as quais são fundamentais para a função e sobrevivência de osteoclastos (LUCKMAN et

al., 1998; ROGERS, 2003). Devido ao acúmulo de GTPases não preniladas em

consequência da interferência na sinalização dessas proteínas, o citoesqueleto perde a

sua conformação, e o transporte vesicular fica comprometido, resultando na

desorganização e achatamento dos prolongamentos celulares. Desta forma, a célula

perde a capacidade reabsortiva óssea, sendo induzida à apoptose (ROELOFS et al.,

2006). Também foi demonstrado que o acúmulo de IPP induzido por N-BFs resulta na

sua ligação ao AMPc para formar um análogo ao ATP intracelular, o Apppi (éster do

ácido trifosfórico 1-adenosina-5-3-[3-metilbut-3-enil]). Esta molécula induz de forma

direta a apoptose de osteoclastos, semelhante ao AppCC12p (MONKKONEN et al.,

2006; ARKKO et al., 2014) (Figura 8)

36






CDD 615.1

Figura 8 – Mecanismo de ação dos N-BFs. Esses fármacos interferem na via do mevalonato levando à desorganização do citoesqueleto e indução direta e indireta da apoptose de osteoclastos. Baseado em Rogers, 2003; Roelofs et al., 2006; Russel et al., 2008.

Clinicamente, o tratamento com N-BFs é bem tolerado desde que a dosagem

correta seja respeitada (OROZCO; MAALOUF, 2012). Contudo, a elevada afinidade pelo

osso mineral promove incorporação duradoura à matriz óssea, mesmo após anos do uso

cessado (WATTS; DIAB, 2010). O tratamento e a ligação à matriz óssea prolongados

culminam em decréscimo da qualidade óssea, quando comparada a um tecido ósseo

fisiológico (ALLEN; BURR, 2008). Por fim, a baixa qualidade óssea é responsável pelo

aumento da incidência de fraturas atípicas de fêmur em pacientes sob tratamento da

osteoporose pós-menopausa (DONNELLY et al., 2012) e de metástases ósseas

resultantes do câncer de mama (WON et al., 2014).

O uso de N-BFs por um período prolongado também apresenta repercussões

importantes na cavidade oral, em que se destaca a osteonecrose dos maxilares, uma

condição restrita ao osso alveolar, caracterizada pela exposição de tecido ósseo

decorrente da incapacidade de cicatrização do epitélio após intervenções orais (AMLER;

JOHSON; STAM, 1960; KOHSLA et al., 2007).

A osteonecrose dos maxilares foi definida pela Sociedade Americana de

Pesquisa Óssea e Mineral como a exposição óssea no complexo maxilo-facial que não

cicatriza em 8 semanas após sua identificação, acometendo pacientes que recebem ou

receberam terapia com N-BFs sem, no entanto, terem passado por radioterapia

(KOHSLA et al., 2007).

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CDD 615.1

A patogênese da osteonecrose dos maxilares induzida por bisfosfonatos

(ONMB) possui caráter multifatorial, envolvendo os efeitos ósseos dos BFs como

supressão da remodelação óssea, depleção de osteoclastos e redução da angiogênese

associadas à invasão tecidual por micro-organismos periodontopatógenos e traumas

orais (EID; ATLAS, 2014). Pode-se estabelecer, também, uma relação entre a ocorrência

de ONMB e a utilização de N-BFs por via intravenosa, uma vez que esses fármacos têm

sua ação potencializada pela maior afinidade à hidroxiapatita (OROZCO; MAALOUF,

2012).

A ocorrência aumentada de osteonecrose nos maxilares se deve à alta taxa

de remodelação óssea sofrida pelos ossos da face em comparação aos demais do

corpo, o que propicia a rápida adsorção dos N-BFs nessas regiões. Por isso, os efeitos

negativos desse tratamento são vistos, primeiramente, nos maxilares (WALTER et al.,

2014).

A combinação entre a supressão da remodelação óssea e seus efeitos

antiangiogênicos com intervenções cirúrgicas dentoalveolares interfere na reconstituição

óssea, promovendo a exposição deste tecido (ESTILO et al.; 2008; ALLEN et al., 2009).

Os sintomas mais comuns incluem dor, edema, parestesia local, supuração e úlceras na

mucosa inserida (OROZCO; MAALOUF, 2012), que se seguem à necrose propriamente

dita.

A ONMB pode ser evitada ou pelo menos minimizada com o correto

aconselhamento do paciente a solicitar uma avaliação dentária antes do início do

tratamento, realizando as intervenções necessárias (RIZZOLI et al., 2008). O tratamento

inclui o uso de enxaguatórios bucais como o digluconato de clorexidina a 0,12%, terapia

antimicrobiana sistêmica e controle da dor (KOHSLA et al., 2007).

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CDD 615.1

2.5 Ácido Zoledrônico O ácido zoledrônico (ZOL) pertence à terceira geração de N-BFs (BLACK et

al., 2007; LAMBRIDOUNAK et al., 2008; REID et al., 2002; KHAJURIA; RAZDAN;

MAHAPATRA, 2011). Sua estrutura molecular apresenta dois átomos de nitrogênio

ligados a um anel heterocíclico, aumentando sua afinidade pela matriz óssea (RUSSEL

et al., 2008) (Figura 9).

Figura 9 – Estrutura química do ácido zoledrônico. Bisfosfonato nitrogenado pertencente à terceira geração, apresentando os átomos de nitrogênios ligados à uma cadeia cíclica. Adaptado de LI; DAVIS, 2003.

Seu efeito farmacológico consiste na inibição potente da reabsorção óssea

osteoclástica (GREEN et al., 2004), sendo indicado para o tratamento de doenças que

afetam o metabolismo ósseo, como a hipercalcemia maligna (LOKADASAN et al., 2015),

mieloma múltiplo (KYLE et al., 2007) e metástases ósseas (BROOM et al., 2014). Nestas

últimas, o ZOL age inibindo a anidrase carbônica e impedindo a multiplicação das

células tumorais e consequente invasão tecidual, mantendo o equilíbrio do pH (TAURO

et al., 2014). Tem sido demonstrado que o ZOL é bem tolerado e após sua

administração intravenosa (IV) apresenta boa distribuição aos diversos sítios calcificados

(LIN; DAVIES, 2003; MATHEW; BRUFSKY; 2014). Nancollas et al. (2006) observaram

que os diferentes tipos de BFs apresentam diferenças na cinética de ligação à

hidroxiapatita, tendo o ZOL, a maior afinidade por esta molécula, de maneira dose-

dependente (WEISS et al., 2008). Em modelos animais de roedores, Weiss et al. (2008) utilizaram ZOL marcado

com Carbono 14 e observaram que, após a administração intravenosa (IV) de 150 µg/kg

desse fármaco, a concentração plasmática máxima foi atingida em 5 minutos,

declinando rapidamente em 4 horas. Nesse período, foi constatado o aumento da

interação com tecidos calcificados, a qual se manteve até 24 horas. A excreção máxima

do ZOL ocorreu em 24 horas, principalmente pelos rins (WEISS et al., 2008).

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CDD 615.1

Quanto ao seu mecanismo de ação, o ZOL tem sido considerado o N-BF com

maior potência em inibir a síntese de FPPS e induzir a produção de Apppi (DUNFOR et

al., 2001). Essa característica justifica sua grande afinidade pela matriz óssea, bem

como sua maior capacidade de retenção neste tecido por um longo período de tempo,

otimizando sua ação antirreabsortiva (GREEN et al., 2004). Além disso, o ZOL, ensaiado

in vitro com osteoclastos de coelhos e humanos, mostrou-se um potente inibidor da

atividade da FPP, promovendo o aumento da ativação de caspases-3-like, cuja atividade

está relacionada à apoptose de osteoclastos (BENFORD et al., 2001). Foi sugerido que

a suprarregulação da caspase-3 poderia ser consequência da falta de GTPases

preniladas (BENFORD et al., 2001).

Sabe-se que as caspases desempenham um papel importante na maturação

de citocinas pró-inflamatórias (WANG; LENARDO, 2000). Diante disso, estudos

abordaram o papel do ZOL na produção de citocinas, as quais participam da

osteoclastogênese via eixo RANK/RANKL/OPG (BOYCE; XING, 2008). Kimachi et al.

(2011) realizaram ensaios in vitro com duas linhagens de células macrofágicas murinas:

RAW264.7 e células da medula óssea. As primeiras células foram cultivadas com

RANKL (100 ng/ml) e TNF-α (50 ng/ml), com ou sem ZOL (0,5 µM). Após 3 dias,

observou-se que a adição de ZOL às culturas preveniu a produção de RANK induzida

por TNF-α e RANKL. Em ensaios de Western Blotting, o ZOL inibiu a ativação do NF-κB

promovida por TNF-α. Corroborando esses achados, demonstraram que o TNF-α

aumenta a atividade transcricional do NF-κB em seus ensaios de luciferase. No entanto,

o tratamento com ZOL diminuiu significantemente tal atividade de transcrição. Nas

culturas de células da medula óssea, foram adicionados TNF-α (50 ng/ml), RANKL (100

ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) e ZOL (10 ou 30 µM). Verificou-se que o ZOL inibiu a

maturação de osteoclastos induzida por TNF-α e/ou RANKL, mesmo com adição de M-

CSF. Mercatali et al. (2013) analisaram os efeitos do ZOL ao longo do tempo em

pacientes sob tratamento quimioterápico do câncer de mama, próstata e pulmão. No

período de 9 a 12 meses de quimioterapia foi observado uma diminuição não significante

de RANKL, seguida de aumento de OPG (p>0,05), resultando, contudo, em diminuição

significante da razão RANKL/OPG em relação aos níveis basais. Quanto aos níveis

séricos do telopeptídeo N-terminal (NTX), um marcador da presença de reabsorção

40






CDD 615.1

óssea, foi verificada a diminuição significante nos tempos de 3 a 4 meses e 6 a 8 meses,

em relação aos valores basais. Ohba et al. (2014a) realizaram um estudo in vitro de reabsorção óssea,

utilizando células da linhagem de células de osteosarcoma agressivo (K7M3), que

produzem um fator solúvel indutor da osteoclastogênese. A citometria de fluxo e a

reação de transcriptase reversa seguida de reação em cadeia de polimerase (RT-PCR)

mostraram que o ZOL foi responsável por diminuir a produção de RANKL nas culturas

dessas células. Também foi observado que a adição de ZOL inibiu a diferenciação

osteoclástica induzida pelas células K7M3, ao diminuir a marcação para TRAP. Quanto

à OPG, a reação em cadeia de polimerase em tempo real (qPCR) demonstrou que, nas

culturas tratadas, sua expressão aumentou. De fato, foi constatado um decréscimo na

razão RANKL/OPG (OHBA et al, 2014a). Sabe-se que uma variedade de tumores sólidos superexpressam VEGF-A e

os receptores VEGFR. Especialmente uma linhagem de células de osteosarcoma

agressivo, células K7M3, expressam altos níveis de VEGF-A e induzem resposta

neoangiogênica, favorecendo o crescimento tumoral rápido. Tem sido demonstrado que

N-BFs, como o ZOL e ALD, diminuíram a expressão de VEGFR2 em uma linhagem de

células endoteliais (bEnd.3) e inibe a proliferação e a proliferação e migração de células

endoteliais. Adicionalmente, o ZOL diminui a expressão de VEGF-A e VEGFR1 em

estudos com células de osteossarcoma agressivo (K7M3) in vitro e in vivo (OHBA et al.,

2014b). O ZOL, não obstante suas atividades antirreabsortivas via inibição e apoptose

de osteoclastos, parece modular a resposta imune inata por osteoblastos e macrófagos

estimulados por patógenos (CARAGLIA et al., 2006). Assim, considerando que os

osteoblastos possuem papel relevante na patogênese da doença osteoarticular induzida

por várias bactérias. Rizzo et al. (2014), em células humanas de osteosarcoma (SaOS-2)

com propriedades osteoblásticas, mostraram que o ZOL exerce efeito imunomodulador

da secreção de citocinas e nos efeitos citotóxicos da C. pneumoniae sobre as células

SaOS-2 durante 24, 48 e 72 horas. Ademais, esse fármaco inibiu o crescimento

bacteriano e, quando utilizado como pré-tratamento, induz um aumento dos níveis de

TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-12 em culturas colonizadas com C. Pneumonia.

Alguns estudos já investigaram as repercussões estruturais ósseas

consequentes do tratamento com ZOL durante a MDI. Sirisoontorn et al. (2012)

avaliaram o efeito da administração intraperitoneal de ZOL na dose de 1,6 µg/kg em

41






CDD 615.1

ratas ovariectomizadas. O tratamento se iniciou duas semanas após a ovariectomia,

durando 6 semanas no total. As aplicações eram feitas semanalmente. Os dispositivos

ortodônticos foram instalados duas semanas após o início do tratamento com ZOL. Foi

relatado uma diminuição do deslocamento dentário após 28 dias. Além disso foi

constatado que o ZOL preveniu as reabsorções radiculares.

Os efeitos do ZOL na produção de mediadores inflamatórios e de marcadores

ósseos são notáveis. Entretanto, no contexto da remodelação óssea consequente à

MDI, são escassos os estudos que investigam a sua repercussão tanto na reabsorção

como na formação óssea. Diante disso, pareceu coerente averiguar os impactos do uso

do ZOL durante a MDI, correlacionando as alterações nos níveis de mediadores pró-

inflamatórios e a presença de biomarcadores do metabolismo ósseo com o seu efeito

farmacológico.

42






CDD 615.1

3 JUSTIFICATIVA

Os bisfosfonatos nitrogenados são a classe de fármacos mais utilizada para

tratamento de desordens metabólicas ósseas, a exemplo da osteoporose, da doença de

Paget e das metástases ósseas advindas de tumores sólidos e mieloma múltiplo. Seu

uso estendido promove efeitos adversos relevantes na cavidade oral, como a

osteonecrose dos maxilares, uma condição que impede a cicatrização epitelial

promovendo exposição óssea. Esta condição depende, também, da via de

administração, tendo os fármacos endovenosos, como o ácido zoledrônico, maior

associação à esta doença.

O ácido zoledrônico (ZOL), um bisfosfonato nitrogenado, é considerado como

um potente inibidor da reabsorção óssea. Não obstante suas atividades antirreabsortivas

via inibição e apoptose de osteoclastos, o ZOL demonstrou potencial modulador a

resposta imune inata de osteoblastos e macrófagos quando estimulados por patógenos.

A movimentação dentária induzida (MDI) por dispositivo ortodôntico é

caracterizada por apresentar fenômenos de reabsorção e neoformação ósseas, devidos

a alterações vasculares e celulares, bem como à participação de mediadores

inflamatórios. Nesse contexto, fármacos antirreabsortivos podem interferir na MDI ao

promover um desequilíbrio da remodelação óssea.

A literatura, contudo, não tem abordado as repercussões do tratamento com o

ZOL na resposta inflamatória necessária à remodelação óssea alveolar durante a MDI.

Este trabalho objetiva avaliar a participação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α

e IL-1β, na modulação do eixo RANKL-OPG quando do tratamento com ZOL durante a

remodelação óssea da MDI.

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4 OBJETIVOS 4.1 Geral

O objetivo geral do presente estudo foi avaliar o efeito do ácido zoledrônico

(ZOL) na resposta inflamatória e na remodelação óssea alveolar durante a

movimentação dentária induzida em ratos.

4.2 Específicos

• Analisar os efeitos do ZOL na resposta inflamatória e na remodelação óssea

alveolar, por meio de: o Quantificação dos espaços entre os primeiros molares superiores e

incisicos centrais superiores de hemiarcadadas controles e submetidas à

MDI e contralaterais não submetidas; o Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal nos lados de

compressão e tração e áreas hialinas; o Histologia da raiz distovestibular e do osso alveolar circunjacente para

avaliação de reabsorções radiculares e ósseas; o Análise da infiltração neutrofílica por meoo da dosagem da atividade da

mieloperoxidase (MPO) gengival;

o Dosagens dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β por ELISA;

o Marcação imunohistoquímica para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP; o Avaliação do anabolismo ósseo pela dosagem sérica de Fosfatase Alcalina

Óssea • Verificar a repercussão sistêmica do ZOL mediante:

o Leucograma; o Análise da variação de massa corpórea.

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5 METODOLOGIA 5.1 Seleção de animais

Foram utilizados 72 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, com massa

corpórea entre 180 e 220 gramas provenientes do Biotério Central do Campus do Pici da

Universidade Federal do Ceará – UFC e transferidos para o Biotério Setorial do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia (FaMed, UFC-Fortaleza). Estes animais

foram mantidos em gaiolas apropriadas, em número de 4 animais em cada uma delas.

Os ratos receberam ração comercial balanceada própria e água à vontade, e

permaneceram nas mesmas condições ambientais durante os experimentos. As coletas

de sangue foram utilizadas para obtenção de valores basais bioquímicos e de

leucograma.

5.2 Fármacos, reagentes e anticorpos Como abordagem farmacológica, foi utilizado medicamento genérico,

apresentado em frasco-ampola de 5 ml de solução injetável, contendo 4,264 mg de

ácido zoledrônico, equivalente a 4 mg de ácido zoledrônico, produzido pelo laboratório

Eurofarma (São Paulo-SP, Brasil). Antes da administração intravenosa (i.v.), o fármaco

foi adequado à temperatura ambiente e diluído em água destilada (H2Od).

Para a anestesia dos animais foi utilizada a combinação de cloridrato

quetamina (Cetamin, Syntec®, Hortolândia-SP, Brasil) com cloridrato de xilazina (Xilazin,

Syntec®, Hortolândia-SP, Brasil), em proporções de 90 mg/kg e 10 mg/kg,

respectivamente, administrada intramuscularmente (i.m.).

O brometo de hexadeciltrimetilamônio (H-TAB), a albumina sérica bovina

(BSA), a tetrametilbenzidina (TMB), o Tween TW20 e a Carragenina lâmbda tipo IV

foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis-MO, USA).

Para as dosagens de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-

1β) por ELISA, foram utilizados anticorpos anti-TNF-α e anti-IL-1β da R&D Systems

(Minneapolis-MS, EUA) [Anticorpos de captura: diluição em tampão fosfato-salino (PBS)

10% (1:1000); Anticorpos de detecção: diluídos em BSA 1% (1:1000)].

As marcações imunohistoquímicas foram feitas utilizando-se os anticorpos

primários policlonais de cabra TNF-α, fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP),

ligante do receptor ativador do fator nuclear-κB (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) com

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CDD 615.1

o respectivo secundário anti-cabra e sistema ABC, todos fornecidos pela Santa Cruz

(Dallas-TX, EUA) e diluídos no diluente de anticorpo com redução de background da

Dako (Barueri-SP, Brasil). O sistema de coloração para imunohistoquímica, cromógeno

3,3’diaminobenzidine DAB/peróxido foi adquirido da Dako (Carpinteria-CA, EUA).

A quantificação dos níveis séricos da enzimas fosfastase foi utilizado o kit

do fabricante LABTEST® (Labtest®, Lagoa Santa-MG, Brasil). O kit de coloração utilizado

para realização do leucograma dos animais foi obtido da Instant Prov Stain

Set® (Newprov Produtos para Laboratório, Pinhais-PR, Brasil).

O formol, o álcool etílico absoluto, o EDTA e a solução pronta de hematoxilina

de Harris utilizados nas diferentes análises foram obtidos da Dinâmica (Dinâmina,

Diadema-SP, Brasil).

5.3 Protocolo Experimental 5.3.1 Modelo de Movimentação Dentária Induzida (MDI)

Foi utilizado o modelo de movimentação dentária induzida (MDI) por

dispositivo ortodôntico descrito anteriormente por Heller e Nanda (1979), adaptado pelo

nosso laboratório por Dutra (2010) e Araújo (2015). Este modelo consistiu na utilização

de molas fechadas de níquel-titânio (Morelli®-ref. 35.20.064; Sorocaba-SP) fixadas aos

primeiros molares superiores esquerdos e incisivos centrais superiores por meio de fio

de amarrilho de aço inox de 0,008 polegadas (Morelli® - ref. 55.01.210; Sorocaba-SP) e

ativadas com uma força de 50 gf mensurada por tensiômetro (Morelli®, ref: 75.02.009,

Sorocaba-SP, Brasil) (KARRAS et al., 2009; KAIPATUR et al., 2013). Para fixação

adicional dos amarrilhos, criou-se um sulco na região cervical dos incisivos superiores

com um disco de lixa acoplado à uma microrretífica sob irrigação com soro fisiológico, e

preenchido com resina fotopolimerizável (Fill Magic, Vigodent®, Rio de Janeiro-RJ,

Brasil). Nenhuma ativação adicional foi feita ao longo do período experimental, no

entanto, os animais foram monitorados diariamente quanto à presença ou não deste.

Demonstrou-se que o modelo de MDI causa movimentação dos dentes a

partir do dia 1º dia, progredindo até o 4º dia. Do 4º ao 7º dia não é observado

deslocamento importante. Porém, a partir do 7º dia, a movimentação volta a ocorrer,

atingindo o pico no 11º dia da instalação da mola e, a partir de então, formando um platô

até o 21º dia (ARAÚJO; 2015). Microscopicamente, as raízes retornam a uma posição

mais centralizada no ligamento periodontal e apresentam maiores reabsorções,

caracterizando, assim, a remodelação óssea.

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CDD 615.1

Devido ao pico de movimentação dentária e a presença de remodelação

óssea ocorrer no 11º dia, este foi escolhido para eutanásia e análise dos materiais

coletados. Os animais foram eutanasiados após o referido período com overdose

anestésica da combinação de cloridratos de quetamina e xilazina.

Figura 10 – Representação esquemática do modelo de MDI por mola fechada Ni-Ti e administração de ZOL. No dia 0 foram registrados os valores basais de massa corpórea, leucograma e fosfatase alcalina óssea. A seguir, os animais, previamente anestesiados, receberam ZOL ou H2Od, tomaram-se os registros das medidas dos espaços interdentários e instalou-se a mola fechada de níquel-titânio ativada com 50 gf. No 7⁰ dia, repetiram-se as administrações de ZOL. Ao 11⁰ dia, foram refeitas as coletas de amostras sanguíneas e as medidas interdentais. As gengivas submetidas à MDI e contralaterais controles foram retiradas para dosagem da atividade de MPO e dos níveis e citocinas por ELISA. Seguiu-se a eutanásia e foram as maxilas para os ensaios de microscopia. LC: lado de compressão; LT: lado de tração; RRs: reabsorções radiculares; ROs: reabsorções ósseas.

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Figura 11 - Fotografia ilustrativa do modelo de movimentação dentária induzida. Posicionamento da mola fechada com fixação no primeiro molar superior esquerdo (1º MS) e incisivos superiores (ICS). A mola Ni-Ti é fixada com o fio de amarrilho e a resina na face vestibular dos incisivos superiores (Fonte: Laboratório de Osteofarmacologia). 5.3.2 Grupos Experimentais A. Grupo não tratado

Esses grupos foram constituídos por 8 ratos cada submetidos à MDI. Os

animais receberam água destilada (H2Od 1 ml/kg, i.v.) 5 minutos antes da instalação do

aparelho e após este, no 7º dia.

B. Grupos Ácido Zoledrônico (ZOL) Três grupos foram constituídos por 8 animais cada, os quais receberam ácido

zoledrônico dissolvido em água destilada nas doses de 50, 100 e 200 µg/kg-i.v.,

respectivamente. A primeira administração ocorreu 5 minutos antes da instalação do

aparelho, para que a mola fosse ativada concomitantemente ao pico plasmático desse

fármaco em ratos (WEISS et al., 2008). A segunda administração se deu após sete dias.

Os animais continuaram em observação até o 11º dia, quando, então, foram

eutanasiados.

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C. Grupos Controle Este grupo foi constituído por 8 animais não submetidos à instalação da mola,

nem abordagens farmacológicas, quando das análises macroscópicas e de variação da

massa corpórea.

Nos ensaios de histomorfometria, histologia, imunohistoquímica, dosagem da

atividade da mieloperoxidase e dos níveis de TNF-α e IL-1β por ELISA, foram utilizadas

as hemiarcadas contralaterais controles.

Ensaios Grupos

Macroscopia, microscopia e dosagens gengivais de MPO e TNF-α

Dosagem de IL-β

Controle 8 - NT 8 8

ZOL 50 µg 8 8 ZOL 100 µg 8 8 ZOL 200 µg 8 8

Quantidade de animais/ensaio 40 32

Total 72

5.4 Quantificação dos espaços interdentais Concomitantemente à mesialização dos molares desafiados ocorre a

palatinização dos incisivos. Dessa forma, as medidas obtidas entre molares e incisivos

do lado esquerdo foram subtraídas das medidas das hemiarcadas contralaterais, as

quais apresentaram apenas a palatinização dos incisivos, enquanto os molares

permaneceram imóveis na hemiarcada. Então, no 11º dia, imediatamente antes da

eutanásia dos animais, foram tomadas as medidas dos espaços entre os primeiros

molares superiores esquerdos e incisivos superiores das hemiarcadas submetidas à MDI

(MDI11) e das contralaterais controles (N11) de cada animal, utilizando paquímetro digital.

Os valores encontrados nas hemiarcadas no dia da eutanásia foram subtraídos

daqueles encontrados no dia 0, MDI0 e N0, respectivamente. Por fim, a subtração entre essas diferenças foi calculada em percentual, em função do valor basal N0, a seguir:

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5.5 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea (FAO) Antes da instalação da mola (dia zero), bem como na ocasião da eutanásia

(dia 11), foram coletados 1 ml sangue do plexo orbital dos animais sob anestesia. Em

seguida, para a reposição dos fluidos, 2 ml de solução salina de NaCl a 0,9% foram

administrados por via intraperitoneal no dia zero. Os tubos de sangue foram

centrifugados (1800 g) por 10 minutos e o soro foi coletado e armazenado para

avaliação indireta da atividade osteoblástica, por meio da dosagem de fosfatase alcalina

óssea FAO. A quantificação seguiu a metodologia da inativação térmica de amostras

(MOSS; WHITBY, 1975), conforme instruções do fabricante (Labtest®, Lagoa Santa-MG,

Brasilpara a dosagem de FAT, a seguir:

Após a identificação dos tubos de ensaio em Branco, Amostra e Padrão,

adicionou-se em todos os tubos a quantidade de 250 µl do tampão e 25 µl de substrato.

Posteriormente, adicionou-se 25 µl da amostra nos tubos assim identificados e 25 µl de

padrão no tudo assim identificado inicialmente. Após a homogeneização, todos os tubos

foram submetidos ao aquecimento indireto a 37 ºC por 10 minutos. Em seguida adiciona-

se 1 ml do reagente de cor em todos os tubos para que sejam efetuadas as leituras

espectrofotométricas em 590 nm. A fosfatase alcalina óssea é determinada pela

dosagem da fosfatase alcalina total (constituída pelas isoformas hepática, entérica e

óssea) subtraída da dosagem realizada com a amostra aquecida a 56 ºC por 10 minutos,

seguindo a mesma sequência descrita acima. Os níveis séricos de fosfatase foram

expressos em unidades por litro (U/l).

5.6 Histomorfometria das áreas do ligamento periodontal

Após os registros dos espaços interdentais, as hemiarcadas foram

removidas e fixadas em formol a 10% tamponado por 48 horas. Em seguida, foram

desmineralizadas em EDTA a 10% durante 30 dias, aproximadamente. Posteriormente,

foram lavadas em água corrente por 1 hora, e processadas para a inclusão das maxilas

em parafina. Os cortes obtidos com espessura de 4 µm em lâminas apropriadas foram

corados com hematoxilina e eosina.

Para esta análise, consideraram-se os cortes transversais da raiz

distovestibular (DV) do primeiro molar superior esquerdo, por apresentar menos

variabilidade de morfometria e de posição na hemiarcada (Figura 11).

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Figura 12 – Fotomicrografia das raízes do primeiro molar superior esquerdo do rato. Corte transversal do primeiro molar superior esquerdo do animal. Em destaque, as raízes mesial (M), intermediária (INT), mesiolingual (ML), distolingual (DL) e distovestibular (DV), sendo esta utilizada na histomorfometria.

As imagens digitalizadas das lâminas foram obtidas por meio de microscópio

ótico (Nikon Eclipse-Ci, Tóquio, Japão). Nas fotomicrografias foram identificadas as

estruturas dentárias como osso alveolar, ligamento periodontal, cemento, dentina e

polpa dentária (Figuras 13A e 13B). Histomorfometricamente, foram quantificadas (%) as

áreas de compressão, tração e hialinas do ligamento periodontal utilizando-se o software

NIS Elements Documentation®. Para isso, foi traçada uma linha correspondente ao

limite externo do ligamento periodontal, em contato com trabeculado ósseo (Figura 13C).

Posteriormente, traçou-se outra linha coincidente ao limite interno do ligamento

periodontal, em contato com o cemento (Figura 13D). A área total do ligamento

periodontal foi obtida pela diferença entre essas medidas. Após isso, foram delineadas

as áreas de compressão e tração, delimitadas por um ângulo de 120⁰, no ligamento

periodontal e somadas entre si, respectivamente (Figuras 13E e 13F). As respectivas

áreas, de compressão ou tração, foram expressas em percentual em relação à área total

do ligamento periodontal, a seguir:

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As áreas hialinas, quando presentes ao longo do ligamento periodontal,

também foram calculadas. Para tanto, estas foram contornadas e somadas suas áreas

entre si (Figura 14). Por fim, o total de área hialina foi expresso em percentual em

relação à área total do ligamento periodontal, a seguir:

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Figura 13 – Fotomicrografias ilustrando os delineamentos para quantificação das áreas de compressão e tração do ligamento periodontal. Para a histomorfometria foram utilizadas as raízes DV a partir dos cortes transversais do primeiro molar superior esquerdo do animal. A e B. Fotomicrografias demonstrando as estruturas correspondentes do periodonto (oa: osso alveolar; lp: ligamento periodontal; c: cemento; d: dentina; p: polpa dentária); C. Linha azul demarcando contorno externo do ligamento periodontal, em contato com o trabeculado ósseo; D. Linha vermelha delimitando a área mais externa do cemento; E. Linha laranja delimitando a área do ligamento periodontal no lado de compressão compreendida pelo ângulo de 120⁰; F. Linha verde delimitando a área do ligamento periodontal no lado de tração compreendida pelo ângulo de 120⁰. Setas pretas indicam lado de compressão e setas brancas, lado de tração.

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Figura 14 – Fotomicrografia com delineamento para a quantificação das áreas hialinas do ligamento periodontal. Delimitação em azul das áreas hialinas presentes no ligamento periodontal. A seta preta indica o lado de compressão e a branca, lado de tração. 5.7 Histologia de reabsorções radiculares e ósseas alveolares

Para esta análise, foram consideradas as mesmas fotomicrografias da raiz

distovestibular (DV) do primeiro molar superior esquerdo, utilizadas para a análise

histomorfométrica.

Foram inseridos círculos englobando as raízes, cujos raios partiam do centro

da polpa. Demarcou-se, então, uma linha que coincidia com o longo eixo das raízes

dividindo o círculo em duas metades, correspondentes a dois ângulos de 180º. O lado

correspondente à área de compressão, foi dividido em três partes com ângulos de 60º

cada, como ilustrado na figura 15.

A partir dessa divisão em ângulos de 60º, foram estabelecidos escores de 0 a

3 para mensurar o grau das reabsorções radiculares (RR) e ósseas (RO), de acordo com

a abrangência de cada sextante, como mostrados no quadro 1.

Quadro 1 – Escores referentes à extensão de reabsorções radiculares (RR) e ósseas (RO) nos lados de compressão.

Escores Grau de extensão de reabsorções

0 RR/RO ausentes 1 RR/RO abrange 60º da área delimitada 2 RR/RO abrange 120º da área delimitada 3 RR/RO abrange 180º da área delimitada

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Figura 15 – Fotomicrografia com delineamento para as análises histológicas de reabsorções radiculares e ósseas. Delimitação da raiz com um círculo cujo raio parte do centro da polpa. A linha que divide o círculo em duas metades coincide com o longo eixo da raiz, dividindo o círculo em duas partes com ângulos de 180º. A metade correspondente ao lado de compressão está dividida em três partes, com 60º cada.

5.8 Dosagem da atividade da mieloperoxidase (MPO) gengival No intuito de quantificar a presença de neutrófilos na gengiva subjacente à

área submetida à MDI, a atividade da mieloperoxidase gengival foi avaliada, uma vez

que tal enzima se encontra presente em abundância nos grânulos azurófilos de

neutrófilos. O ensaio foi realizado conforme protocolo descrito anteriormente por

Bradley, Christensen, Rothstein (1982), adaptado por Lima et al. (2005).

No 11⁰ dia, os tecidos gengivais de 8 animais de cada grupo, bem como o da

hemiarcada contralateral do grupo controle, foram removidos e armazenados em freezer

-80 ⁰C. Posteriormente, foram homogeneizados e processados para análise da atividade

da mieloperoxidase em leitor de placas. Assim, o tecido gengival foi pesado e triturado

em solução contendo NaCl (100 mM), EDTA (15 mM) e NaPO4 (20 mM) e o homogenato

foi centrifugado a 4 ºC por 15 minutos (3000 g). O pellet foi, então, imergido em solução

hipotônica com 900 µl de NaCl a 0,2%; 900 µl de NaCl a 1,6%; 900 µl de glicose a 5%, e

novamente centrifugado (3000 g) a 4 ºC por 15 minutos. O pellet final foi ressuspendido

em solução de NaPO4 a 50 mM e hexadecil-trimetil-brometo de amônio (H-TAB), e

homogeneizado (10000 g) a 4oC por 15 min. O sobrenadante foi usado para o ensaio em

adição ao tetrametilbenzidina (1,6 mM) e H2O2 (0,5 mM). A reação enzimática foi

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interrompida com 50 µl de H2SO4 (1M). A atividade de MPO foi determinada em

absorbância de 450 nm.

Os valores foram expressos em atividade de MPO por miligrama de gengiva

comparada à curva padrão construída utilizando neutrófilos peritoneais de ratos. Para

alcançar este objetivo, a migração de neutrófilos foi induzida por injeção intraperitoneal

de carragenina lambda tipo IV em ratos (300 µg/cavidade peritoneal) (CUNHA et al.,

1989). Uma curva padrão relativa de neutrófilos (>90% de pureza) e os números de

absorbância foram obtidos por processamento de neutrófilos purificados, como descrito

acima, e o ensaio da atividade de MPO foi realizado.

5.9 Dosagens dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β

Os primeiros sobrenadantes obtidos por ocasião dos ensaios da MPO foram

utilizados para quantificar os níveis de TNF-α e IL-1β por ELISA. Inicialmente, placas de

96 poços foram incubadas overnight a 4 °C com anticorpos anti-TNF-α ou anti-IL-1β

diluídos em PBS na concentração de 1:1000 (R&D Systems). Após a sensibilização das

placas, estas foram lavadas três vezes com solução tampão PBS/Tween-20 (0,05% R&D

Systems). Após isso, as amostras foram adicionadas em poços únicos cada e a curva

padrão foi realizada por meio de diluições seriadas em 11 poços seguidas de incubação

overnight a 4 ºC. As placas foram lavadas novamente e incubadas com anticorpo

monoclonal biotinilado anti-TNF-α ou anti-IL-1β (R&D Systems) diluídos em BSA a 1%

na concentração de 1:1000. Após o período de incubação à temperatura ambiente por 2

h, repetiram-se as lavagens das placas e foram adicionados 100 µL do complexo HRP-

estreptavidina 1000 (R&D Systems) diluído 1:5000. Decorridos 20 minutos, 50 µL do

reagente de cor o-fenilenodiamina (OPD, R&D Systems) foram adicionados e as placas

foram incubadas na ausência de luz a 37 ºC por 20 min. A reação enzimática foi

interrompida com 100 µl de stop solution (2 NH2SO4) e a densidade óptica foi mensurada

a 450 nm em espectrofotômetro. As concentrações das citocinas contidas nas amostras

foram calculadas a partir da curva padrão, sendo as concentrações iniciais de 4000

pg/ml. Os resultados foram expressos em picograma de citocinas (CUNHA et al., 1993).

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5.10 Análise imunohistoquímica para detecção de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP

A partir dos blocos de parafina utilizados para a histologia foram obtidos

cortes (4 µm) em lâminas de poli L-lisina (Probe on Plus®) adequadas para a técnica de

imunohistoquímica. Os cortes foram desparafinizados em estuda a 60 ⁰C e hidratados

em temperatura ambiente por meio de imersões conseguintes em xilol, álcool 95% e

água destilada em referido período de tempo para cada solução. Em seguida, foram

imersos em solução tamponada 0,1 M (Tampão de citrato; pH 6,0) sob aquecimento a

65 ⁰C, por 30 minutos. Após o resfriamento em temperatura ambiente por 20 minutos, os

cortes foram incubados em peróxido de hidrogênio a 3%, para bloqueio da peroxidase

endógena, intercaladas com solução tamponada de fosfato (PBS). A fim de se bloquear

ligações proteicas inespecíficas, o BSA a 5% foi utilizado para o bloqueio de proteínas.

A incubação com anticorpos primários anti-RANKL (1:100), anti-OPG

(1:100), anti-TRAP (1:100) e anti-TNF-α (1:100) foi feita durante a noite (overnight) a 4

⁰C. Seguidamente, realizaram-se novas lavagens e posterior incubação com anticorpo

secundário biotilinado anti-IgG anti-RANKL (1:100), anti-OPG (1:300), anti-TRAP (1:300)

e anti-TNF-α (1:300) durante 30 minutos, à temperatura de 22 a 25 ⁰C. Nesse período, o

complexo ABC foi preparado conforme instrução do fabricante (Vectastain ®). Após nova

lavagem com PBS, a reação foi visualizada pela adição do cromógeno

3,3’diaminobenzidina DAB/peróxido, por 2 minutos, em temperatura ambiente. A reação

foi interrompida com água destilada e as lâminas foram contracoradas por hematoxilina

de Harry durante 5 minutos, em temperatura ambiente. Os controles negativos foram

processados simultaneamente conforme protocolo descrito acima. No entanto, o

primeiro anticorpo foi substituído por PBS-BSA 5 %. Nenhum dos controles negativos

mostrou imunorreatividade para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP. (Apêndice A). Por fim,

foram realizadas desidratação seriada em concentrações de álcoois, clareamento em

xilol e, finalmente, as respectivas montagens das lâminas e lamínulas.

As contagens de células positivas para os marcadores utilizados foram

realizadas em microscópio ótico (Nikon Eclipse-Ci, Tóquio, Japão) por um examinador

cego quanto aos tratamentos empregados. Foram selecionados para as contagens, dois

campos microscópicos com aumento de 400x, correspondentes aos lados de

compressão e de tração do ligamento, respectivamente. Consideraram-se marcações

positivas àquelas que apresentavam coloração marrom. Para TRAP, foram contadas,

somente, marcações marrons em células multinucleadas.

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5.11 Análise do Leucograma Os leucogramas foram avaliados antes da instalação da mola (dia 0) e no

momento da eutanásia (dia 11), a partir do plexo venoso caudal. Foram coletados 20 µl

de sangue e diluídos em 380 µl de líquido de Turk, para a realização da contagem do

número total de leucócitos, utilizando câmara de Neubauer. Adicionalmente, uma gota

de sangue foi colhida para a confecção de esfregaço corado pelo método HE para as

contagens diferenciais de neutrófilos, linfócitos e monócitos.

5.12 Análise da variação de massa corpórea Os animais tiveram suas massas corporais medidas antes da instalação do

aparato ortodôntico e, após este, diariamente, durante 11 dias. Os valores encontrados

foram expressos como a variação de massa corpórea (g) em relação à massa inicial.

5.13 Aspectos éticos Todos os protocolos abordados foram previamente submetidos e aprovados

pelo Comissão de Ética para Uso de Animais da Universidade Federal do Ceará, sob

número 28/15 (Anexo A). Os pesquisadores envolvidos se esforçaram em reduzir ao

mínimo o número de animais utilizados, bem como o sofrimento dos mesmos de acordo

com as orientações previstas na Lei Arouca 11.794/2008 e suas resoluções normativas.

5.14 Análise estatística

A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro-Wilke. Os dados

paramétricos como os resultados da quantificação da MDI, das análises

histomorfometrica e imunohistoquímica, dosagens em tecidos gengivais, dosagem de

fosfatase alcalina óssea, leucograma e variação de massa corpórea foram expressos

como média±erro padrão da média (epm) e as comparações entre os grupos foram

realizadas pela Análise de Variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparações

múltiplas de Bonferroni. Os dados não paramétricos, como os da análise histológica por

escores, foram expressos em mediana, seguida de seus valores extremos. As

comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Kruskall-Wallis, seguido

pelo pós-teste de Dunn. Em todas as situações foi adotado o nível de significância de

P<0,05. O software utilizado para todas as análises foi o GraphPad Prism® versão 6.0

para Mac OS X (La Jolla-CA, EUA), com licença devidamente autorizada.

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6. RESULTADOS 6.1. Quantificação dos espaços interdentais

A MDI foi avaliada diretamente na maxila, considerando os espaços entre a

distal do incisivo e a mesial do primeiro molar superiores de hemiarcadas controles (não

submetidas à MDI) e submetidas à intalação e ativação da mola de animais que

receberam apenas H2Od (não tratados) ou tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg).

A figura 16 mostra que a instalação e a ativação da mola de Ni-Ti entre os

primeiro molar superior esquerdo e incisivos superiores nos animais do grupo não

tratado resultou em um aumento de 87,2% do movimento dentário quando comparado

às hemiarcadas contralaterais controles, as quais não foram submetidas à MDI

(Controle= 1±0,3; NT= 7,8±0,5). Observou-se que o ZOL, nas três doses utilizadas,

reduziu de forma significante (p<0,05) e dose-dependente a MDI após 11 dias, quando

comparada a MDI em animais não tratados (ZOL 50= 2,6±0,2; ZOL 100= 1,4±0,1; ZOL

200= 0,7±0) em 76,5%, 94,1% e 104,4%, respectivamente, comparadas ao grupo não

tratado (NT= 7,8±0,5).

Figura 16 – Movimentação dentária induzida (MDI) durante 11 dias por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. As hemiarcadas foram mensuradas antes e após 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da média da MDI obtida pela diferença entre as medidas encontradas no dia 0 e 11 em animais dos grupos Controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT; ¤p<0,05 em relação ao ZOL 50; §p<0,05 em relação ao ZOL 100 µg/kg. ANOVA; Bonferroni.

6.2 Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea (FAO)

A figura 17 demonstra que a MDI por 11 dias não alterou os níveis séricos de

fosfatase alcalina óssea, quando comparada aos valores controle (Controle= 97,2±2,6;

NT= 84,5±5,6; p>0,05).

Controle NT ZOL 50 ZOL 100 ZOL 2000

2

4

6

8

10

Mov

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)

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*¤

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(µg/kg)

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MDI (11 dias)

59






CDD 615.1

As três doses de ZOL administradas durante 11 dias de MDI reduziram

significantemente (p<0,05) os níveis da FAO (ZOL 50= 41,7±5,3; ZOL 100= 47,7±2,2;

ZOL 200= 41,7±1,9), em 67,8%, 62,6% e 67,8%, respectivamente, quando comparados

aos valores dos não tratados (NT= 84,5±5,6).

Figura 17 - Dosagem sérica de fosfatase alcalina óssea em animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Amostras sanguíneas foram coletadas antes (valores controles) e após 11 dias da MDI. Os valores representam a média ± erro padrão da média dos níveis séricos fosfatase alcalina óssea de animais dos grupos controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.

6.3 Análise histomorfométrica A raiz distovestibular do primeiro molar superior esquerdo dos animais foi

avaliada histomorfometricamente. Consideraram-se as áreas do ligamento delimitadas

pelo ângulo de 120⁰ nos lados de compressão (LC) e de tração (LT) do ligamento. Na

figura 18 (A e B) observa-se que 11 dias de MDI não causaram alterações significantes

(p>0,05) nas áreas de compressão (Controle= 24,2±1,5; NT= 23,8±1,6) e tração

(Controle= 31,2±1,58; NT= 31,6±0,8), respectivamente, assim como o tratamento com

ZOL nas três doses utilizadas também não induziu alterações significantes em ambos os

lados avaliados (LC: ZOL 50= 21,9±1,2; ZOL 100= 22,2±1,9; ZOL 200= 23±2); (LT: ZOL

50= 33,7±; ZOL 100= 33,5±2,3; ZOL 200 =32±1,7), em comparação às hemiarcadas dos

animais não tratados (LC: NT=23,8±1,6; LT: NT= 31,6±0,8), respectivamente.

A figura 18C ilustra que 11 dias de MDI induziu significantemente a formação

de áreas hialinas no ligamento periodontal de animais não tratados, quando comparados

ao grupo Controle (Controle= 0,0±0,0; NT= 1,5±0,0). O tratamento com as três doses de

ZOL foi capaz de reduzir significantemente (p<0,05) o surgimento dessas áreas no


20

40

60

80

100

120

FAO

(U/l)

(µg/kg)MDI (11 dias)

*# *#*#

60






CDD 615.1

ligamento periodontal (ZOL 50= 0,7±0,0; ZOL 100= 0,7±0,3; ZOL 200= 0,6±0,0) em

53,3%, 53,3% e 60%, respectivamente, quando comparados ao grupo controle (NT=

1,5±0,0).

6.4 Análise histológica A figura 19A ilustra as estruturas do periodonto correspondentes às

observadas nas fotomicrografias. Na figura 19B observa-se uma raiz distovestibular de

uma hemiarcada controle, não submetida a MDI, com preservação de osso alveolar na

periferia do ligamento periodontal, de cemento e de dentina. As raízes distovestibulares

dos animais não tratados submetidos à MDI por 11 dias, demonstraram intensas áreas

de reabsorções óssea, cementária e dentinária no lado de compressão do ligamento

periodontal. A administração de ZOL, nas doses de 50, 100 e 200 µg/kg, manteve a

integridade das estruturas periodontais (figura 19D, E e F).

A análise histológica mostrou que após 11 dias de MDI, houve um aumento

significante da reabsorção radicular, bem como da reabsorção óssea. O tratamento com

ZOL nas doses de 50, 100 e 200 µg/kg foi capaz de prevenir, de forma significante, as

reabsorções radiculares e ósseas, sendo as doses de 100 e 200 µg/kg, mais eficazes

em reduzir a reabsorção radicular, quando comparadas à dose de 50 µg/kg (Tabela 1).

Tabela 1 – Efeito do ácido zoledrônico sobre as reabsorções radiculares e ósseas após 11 dias de MDI.

N=8/grupo; #p<0,05 comparado ao grupo Controle; *p<0,05 comparado ao grupo NT; ¤p<0,05 em relação ao grupo ZOL 50 µg/kg. ANOVA; Bonferroni.

Grupos Áreas reabsortivas

Controle NT ZOL 50 µg/kg

ZOL 100 µg/kg

ZOL 200 µg/kg

Reabsorção Radicular (escores)

0 (0-0) 2 (2-3)# 1,5 (0-2)* 1 (0-1)*,¤ 0 (0-1)*,¤

Reabsorção Óssea (escores) 0 (0-0) 3 (2-3)# 1,5 (1-2)* 1 (0-2)* 1 (0-2)*

61






CDD 615.1

Figura 18 – Análise histomorfométrica dos sítios de compressão (A) e de tração (B) e áreas hialinas do ligamento periodontal pós 11 dias de MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. As maxilas foram removidas após 11 dias e processadas para método HE. Os valores representam a média ± erro padrão da média da razão entre as áreas de compressão, tração e hialinas, e a área total do ligamento periodontal (%) na raiz distovestibular de animais dos grupos controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.


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20

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#


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C

62






CDD 615.1

Figura 19 - Fotomicrografias dos cortes transversais das raízes distovestibulares. (A) Esquema de estruturas do periodonto: osso alveolar (oa), ligamento periodontal (lp), cemento (c), dentina (d) e polpa (p). (B) Raiz de hemiarcada controle. Raízes de hemiarcadas de animais não-tratados submetidos à MDI (C) ou ZOL 50 µg/kg (D), 100 µg/kg (E) e 200 µg/kg (F). Setas pretas indicam lado de compressão e setas brancas, lado de tração.

63






CDD 615.1

6.5 Atividade da mieloperoxidase (MPO) gengival

A figura 20 demonstra que 11 dias de MDI aumentou a atividade da

mieloperoxidase de forma significante (p<0,05) em 200%, quando comparada ao tecido

gengival de hemiarcadas não tratadas (NT=0,9±0,2; NT= 2,7±0,4).

O ZOL nas três doses utilizadas preveniu significantemente (p<0,05) o

aumento da MPO (ZOL 50=0,5±0,12; ZOL 100=0,5±0,15; ZOL 200=0,4±0,16), em

72,2%, 72,2% e 77,8%, respectivamente, em relação ao tecido gengival de animais

controle (NT= 2,3±0,6).

Figura 20 - Atividade da mieloperoxidase no tecido gengival de hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Os tecidos gengivais subjacentes à área desafiada foram removidos após 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da média da quantificação de MPO (U x 103/mg de tecido) de animais dos grupos Controle, não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.

6.6 Análise dos níveis gengivais de TNF-α e IL-1β

A figura 21 mostra que 11 dias de MDI (NT) aumentaram de forma significante

(p<0,05) os níveis de TNF-α e IL-1β em 621% e 200%, respectivamente, no tecido

gengival, quando comparados às gengivas contralaterais controles (TNF-α:

Controle=0,2±0,0; NT=1,7±0,2; IL-1β: Controle=0,2±0,0; NT=0,6±0,1).

O tratamento com ZOL (200 µg/kg) não preveniu o aumento significante nos

níveis gengivais de ambas as citocinas após 11 dias de MDI (TNF-α: NT=1,7±0,2; ZOL

200= 1,3±0,2; IL-1β: NT= 0,6±0,1; ZOL 200=0,4±0,0)


1

2

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4

MPO

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64






CDD 615.1

Figura 21 – Níveis de TNF-α e IL-1β no tecido gengival de hemiarcadas controles e submetidas à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Os tecidos gengivais subjacentes à área desafiada foram removidos após 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da média dos níveis de gengivais de TNF-α e IL-1β (pg/mg x 103/mg de tecido) de animais dos grupos Controle, Não tratado (NT) e tratados com ZOL (200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle. ANOVA; Bonferroni. 6.7 Análises imunohistoquímicas

As imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP presentes nos lados

de compressão e de tração, respectivamente, de uma raiz distovestibular, estão

representadas através das figuras, onde constam as contagens de células positivas na

figura 22, e as fotomicrografias das imunomarcações nas figuras 23 e 24. Observou-se

que a raiz de animais controles não submetidos à MDI apresentou um número

importante de marcações positivas para TNF-α nos lados de compressão e tração

(figuras 22A e 23B: Controle=16±2; figuras 22A e 24B: Controle=15,6±1,7). Após 11 dias

de MDI nos animais que não tratados, foi constatado um aumento significante dessas

marcações no lado de compressão (figuras 22A e 23D: NT=27,7±1,4). No lado de

tração, não foram observadas diferenças nessa contagem (figuras 22A e 24D:

NT=18,3±0,9). A maior dose de ZOL reduziu significantemente as marcações nos lados

Controle NT ZOL 2000.0

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IL-1β

(pg/

mg

x103 d

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ngiv

a)

#


B

65






CDD 615.1

de compressão (figuras 22A e 23F: ZOL 200=7±1,1) e de tração (figuras 22A e 24F: ZOL

200=6±1,7).

Para RANKL, foi observado que as hemiarcadas de animais controles não

submetidas à MDI apresentaram poucas marcações positivas nos lados de compressão

(figuras 22B e 23H: Controle= 4,7±0,33) e de tração (figuras 22B e 24H: Controle=

04,7±0,9). A MDI durante 11 dias foi responsável por aumentar, de forma significante, as

células RANKL+ em ambos os lados nos animais não tratados (figuras 22B e 23J: NT=

14,3±3,4; figura 22B e 24J: NT= 14,3±0,6). A maior dose do ZOL diminuiu de forma

significante as imunomarcações para RANKL tanto no lado de compressão (figuras 22B

e 23L: ZOL 200= 2,3±0,3) como no de tração (figuras 22B e 24L: ZOL 200= 1,6±0,3).

Para OPG, constatou-se que as hemiarcadas controles apresentaram leve

imunomarcação nos lados de compressão (figuras 22C e 23N: Controle= 4,7±0,9) e

tração (figuras 22C e 24N: Controle= 5±1). Após 11 dias de MDI, foi constatado que não

houve diferença significante no número de marcações no lado de compressão (figuras

22C e 23P: NT= 3±0,6) nos animais não tratados, quando comparado ao controle. No

lado de tração, foi observado um aumento significante de células OPG+ (figuras 22C e

24P: NT= 12,7±1,8) após 11 dias de MDI. O ZOL, na maior dose, preveniu de forma

significante, as marcações positivas no lado de tração (figuras 22C e 24R: ZOL 200=

3,3±0,3) mantendo o número de marcações no lado de compressão (figuras 22C e 23R:

ZOL 200= 2,3±0,3).

A razão RANKL/OPG para os lados de compressão e tração se mostraram

equivalentes nos animais controles não submetidos à MDI como está demonstrado na

figura 22D (compressão: Controle= 1±0,13; tração: Controle= 0,9±0). A MDI por 11 dias

nos animais não tratados, foi responsável pelo aumento significante da razão

RANKL/OPG no lado de compressão (figura 22D: NT= 4,8±0,9), a qual se manteve

estável no lado de tração (figura 22D: NT= 1,3±0,2). A maior dose do ZOL foi

responsável por diminuir, significantemente, a razão RANKL/OPG em ambos os lados do

ligamento periodontal (figura 22D; compressão: ZOL 200= 1±0; tração: ZOL 200=

0,5±0,1).

Por fim, as marcações para TRAP no periodonto de animais controles não

submetidos à MDI, foram observadas em quantidade reduzida nos lados de compressão

(figuras 22E e 23S; Controle= 1±0,13) e tração (figuras 22E e 24S; Controle= 2±0,0). Ao

fim de 11 dias de MDI em animais não tratados, houve um aumento significante do

número de imunomarcações no lado de compressão (figuras 22E e 23V; NT= 20,7±0,9),

66






CDD 615.1

não havendo alterações significantes no lado de tração (figura 22E e 24V; NT= 2,7±1,2).

O ZOL, em sua maior dose, preveniu significantemente o aumento de células TRAP+ no

lado de compressão (figuras 22E e 23Y; ZOL 200= 4±1,7) e não induziu alterações

significantes nesta contagem no lado de tração (figuras 22E e 24Y; ZOL 200= 1,7±0,33).

Figura 22 – Contagens das imunomarcações para TNF-α, RANKL, OPG e TRAP. Os gráficos representam o número de marcações encontrados nos lados de compressão e tração no ligamento periodontal. Número de marcações TNF-α+ (A), RANKL+ (B), OPG+ (C), razão RANKL/OPG (D) e TRAP+ (E). Os valores representam a média ± erro padrão da média do número de células nos cortes histológicos dos grupos Controle, Não tratado (NT) e ZOL (200 µg/kg). N=3/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni

Controle NT ZOL 2000

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*(µg/kg)

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MDI (11 dias)

Lado deCompressãoLado de Tração

67






CDD 615.1

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68






CDD 615.1

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69






CDD 615.1

6.8 Leucograma

A figura 25 A, B, C e D mostram que 11 dias de MDI não provocaram

aumento significante do número total de leucócitos (Controle=16,9±0,6; NT= 16,7±2,8),

bem como os números de neutrófilos (Controle= 3,9±0,2; NT= 4±0,7), linfócitos

(Controle= 12±0,4; NT= 11,2±2,2) ou monócitos (Controle= 0,6±0,0; NT= 0,4± 0,0),

respectivamente.

As três doses de ZOL administradas durante 11 dias de MDI não induziram

alterações significantes (p>0,05) na contagem de leucócitos totais (NT=16,7±2,8; ZOL

50=15,4±1,7; ZOL 100=15,9±1; ZOL 200=16,4±1,2), bem como no número de neutrófilos

(NT=4±0,7; ZOL 50=3,6±0,5; ZOL 100=4,8±0,4; ZOL 200=4,5±0,4), linfócitos

(NT=11,2±2,2; ZOL 50=11,6±1,5; ZOL 100=11±0,7; ZOL 200=10,7±0,9) e monócitos

(NT= 0,4± 0,0; ZOL 50=0,3±0,0; ZOL 100=0,5±0,0; ZOL 200=0,6±0,0) quando

comparados aos respectivos não tratados.

Figura 25 - Leucograma de animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Amostras sanguíneas foram coletadas antes (valores controles) e após 11 dias da MDI. Os valores representam a média ± erro padrão da média do leucograma de animais dos grupos Controle, Não tratado (NT) e ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; ANOVA; Bonferroni.

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(µg/kg)

D

MDI (11 dias)

70






CDD 615.1

6.9 Variação de massa corpórea

A figura 26 mostra a variação de massa corpórea causada pela MDI por 11

dias, quando comparada a de animais controles, não submetidos a MDI. Observou-se

que a MDI induziu significante (p<0,05) a perda de peso nos animais não tratados a

partir do 1º dia (valores basais) e assim mantendo até o 5º dia. A partir do 6º dia, os

animais atingem seus valores basais, ultrapassando-os a partir do 8º até o 11º dia, sem,

contudo, atingir os valores de animais controles.

O tratamento com ZOL, nas três doses utilizadas, não alteraram a perda de

massa corpórea vista durante os 11 dias de MDI (p>0,05).

Figura 26 - Efeito do Ácido Zoledrônico (ZOL) na variação da massa por 11 dias em animais submetidos à MDI por mola fechada de Ni-Ti com 50 gf. Os animais foram pesados diariamente por 11 dias. Os valores representam a média ± erro padrão da variação de massa corpórea, obtidos pela diferença entre os pesos de cada animal e o peso observado no dia 0, de animais dos grupos Controle, Não tratado (NT) e tratados com ZOL (50, 100 e 200 µg/kg). N=8/grupo; #p<0,05 em relação ao Controle; *p<0,05 em relação ao NT. ANOVA; Bonferroni.

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* * *

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**

** * * *

71






CDD 615.1

7. DISCUSSÃO

Nesse estudo, foi escolhido o modelo de movimentação dentária induzida em

animais por ter se mostrado útil para estudar os eventos relacionados à remodelação

óssea, com a vantagem de se observar sítios distintos conforme o predomínio de cada

um dos processos de reabsorção e neoformação ósseas. Além das alterações

vasculares e celulares iniciais, há ainda a participação de vários mediadores, como

citocinas, fatores de crescimento e neurotransmissores, os quais tornam o ambiente

favorável à remodelação óssea, consequentemente, ao deslocamento dentário através

do osso alveolar (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).

A escolha de ratos Wistar se deu pela facilidade de manuseio dos mesmos e

acesso aos dentes, mas, principalmente, pela reprodutibilidade na obtenção de medidas

para quantificar a MDI (ARAÚJO, 2015). Quanto à força utilizada no estudo, tem sido

demonstrado que intensidades entre 10 e 50 gf induzem maiores taxas de

movimentação, enquanto que forças exorbitantes são prejudiciais ao periodonto

(NAKANO et al., 2014). Nakano et al. (2011) demonstraram que a MDI durante 7 e 10

dias com 50 gf favoreceu maior imunoexpressão de marcadores de reabsorção óssea,

como RANK, RANKL e M-CSF. Adicionalmente, vale ressaltar que resultados do nosso

laboratório também constataram um pico de movimentação dentária aos 11 dias com 50

gf, bem como aumento da imunomarcação para RANKL e TRAP no ligamento

periodontal da raiz distovestibular do primeiro molar superior esquerdo (ARAÚJO, 2015).

Ainda, sabe-se que o curso da movimentação dentária em animais é bastante

semelhante à cronobiologia da movimentação dentária em humanos, e é dividido em

três fases, inicial, latência e pós-latência (BURSTONE, 1962; FRACALOSSI et al., 2009;

CHOI et al., 2010; ARAÚJO, 2015). Dessa forma, a escolha do 11º dia de MDI foi feita

com base no fato de que nesse período observa-se um pico de deslocamento dentário

correspondente à fase de pós-latência da MDI em animais, logo, julgamos coerente

utilizar a força de 50 gf no protocolo experimental em questão, e consideramos que este

modelo de MDI, com força contínua reconhecida, seja útil para melhor compreender os

efeitos de fármacos antirreabsortivos, a exemplo do ácido zoledrônico, evidenciando

seus mecanismos junto à resposta inflamatória esperada na MDI.

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CDD 615.1

A repercussão do ácido zoledrônico no tecido ósseo tem sido abordada na

literatura, tanto para prevenção de metástases ósseas do câncer (JI et al., 2014; SUMI

et al., 2014), como no tratamento da osteoporose pós-menopausa (BOONEN et al.,

2008). Mais recentemente, os efeitos macroscópicos do ácido zoledrônico foram

avaliados na MDI por mola fechada de Ni-Ti, mostrando-se capaz de restringir o

deslocamento dentário (SIRISOONTORN et al., 2012; FERNANDEZ-GONZÁLEZ et al.,

2016). No entanto, os efeitos diretos desse fármaco no recrutamento de neutrófilos

correlacionado à atividade de marcadores ósseos não estão bem elucidados. Desse

modo, este estudo a avaliou o ácido zoledrônico nos eventos celulares e vasculares da

inflamação relacionados à produção de marcadores ósseos durante a remodelação

óssea alveolar da MDI.

Sabe-se que o emprego de fármacos antirreabsortivas, a exemplo do ácido

zoledrônico, tem-se mostrado importante no manejo da quimioterapia para pacientes

com alguns tipos de cânceres, como de próstata, mama e mieloma múltiplo (JI et al.,

2014, SUMI et al., 2014). Entretanto, pouco se sabe acerca de seus efeitos na MDI,

processo este conhecido por induzir remodelação óssea, agregando reabsorção e

neoformação ósseas em sítios distintos, porém, de maneira coordenada (KRISHNAN,

DAVIDOVITCH; 2006).

Para a seleção das diversas doses de ácido zoledrônico foram considerados

os cálculos propostos por Reagan-Shaw; Nihal; Ahmada, em 2008, em que se observou

que a dose absorvida no período de uma semana durante a quimioterapia com 4 mg de

ácido zoledrônico em humanos, correspondia a 100 µg/kg em ratos. Fixou-se essa

dosse como a intermediária e foram escolhidas a menor (metade) e a maior (dobro), 50

µg/kg e 200 µg/kg, respectivamente. Vale salientar que estas doses têm sido avaliadas

em diferentes modelos animais e se mostraram eficazes e seguras (KHAJURIA;

RAZDAN; MAHAPATRA, 2015; SILVA et al., 2015). Nossos resultados mostram que o ácido zoledrônico, nas doses de 50, 100 e

200 µg/kg, diminuiu a MDI no 11º dia. Considerando-se o ácido zoledrônico como o

bisfosfonato de efeito antirreabsortivo mais potente (ZHAO; HU, 2015), a repercussão

negativa na MDI era esperada, devido ao desequilíbrio na remodelação óssea. Estudos

na literatura têm evidenciado que o ácido zoledrônico é capaz de afetar a MDI, porém

em variações diversas do modelo em termos de intensidade de força, tempo de

experimentação e diferenças na posologia e via de administração, porém, mesmo com

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CDD 615.1

diversidades de protocolos, o ácido zoledrônico mostrou-se capaz de reduzir a MDI.

Sirisoontorn et al. (2012), utilizando a dose de 1,6 µg/kg de ácido zoledrônico por via

intraperitoneal, administrada uma vez por semana durante 6 semanas, preveniu a MDI

em ratas ovariectomizadas submetidas a instalação e ativação de uma mola fechada de

Ni-Ti com 25 gf por 28 dias. Ainda, Fernandez-González et al. (2016) administraram

dose única de 16 µg/kg de ácido zoledrônico na mucosa do palato e avaliaram o

deslocamento mesial dos molares por ativação de mola fechada de Ni-Ti com 50 gf nos

dias 7, 14 e 21, por meio de microtomografia. Em todos os períodos experimentais, foi

observado que as taxas de deslocamento dentário nos animais que receberam o ácido

zoledrônico foram menores quando comparadas aos animais do grupo controle.

De fato, a inatividade do citoesqueleto de osteoclastos causada pelos

bisfosfonatos em geral leva à infrarregulação de fatores de crescimento liberados por

osteócitos da matriz, que recrutam osteoblastos para formar um novo osso, culminando

em diminuição da remodelação óssea. O processo de remodelação óssea é

caracterizado pelo acoplamento relativamente harmônico entre osteoclastos e

osteoblastos, e durante a movimentação dentária, qualquer intervenção nessa dinâmica,

resulta em alteração no curso da MDI, explicando os resultados do presente estudo

(RUCCI, 2008; RAGGAT; PARTRIDGE, 2010; JIANG et al., 2015).

Nesse contexto, a MDI pode ser reduzida tanto em decorrência da diminuição

da reabsorção óssea necessária para a movimentação dentária propriamente dita,

conferida por agentes antirreabsortivos ósseos, como também a um aumento no

anabolismo ósseo. De fato, tem sido descrito que, em condições de elevada atividade

anabólica, em detrimento da reabsortiva, como na osteopetrose, o movimento dentário

eruptivo é interrompido pela intensa deposição de minerais na matriz, resultando em

dentes impactados no osso basal e agenesias dentárias (BJORVATN; GILHUUS-MOE;

AARSKOG, 1979; IDA-YONEMOCHI et al., 2002).

Afim de esclarecer se o efeito pelo qual o ácido zoledrônico restringiu o

deslocamento dentário pode ser essencialmente causado pelo aumento do anabolismo

ósseo, considerou-se avaliar os níveis séricos de fosfatase alcalina óssea (FAO), um

marcador da presença de osteoblastos (WHYTE, 1994). O presente estudou mostrou

que os 11 dias de MDI não alteraram os níveis séricos da fosfatase alcalina óssea

(FAO), quando comparada aos valores basais. A fosfatase alcalina é composta de 3

isoformas e, dentre estas, a isoforma óssea é a predominante. Geralmente, níveis

elevados de FAO são encontrados na presença de doenças de afetam o metabolismo

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CDD 615.1

ósseo, como a metástase ou a doença de Paget (COLEMAN et al., 2008). Neste estudo,

os níveis não alterados de FAO após a MDI indicam que o processo de remodelação

óssea ocorreu em sua normalidade. Nossos achados podem ser corroborados pela

literatura, onde se verificou que o tratamento ortodôntico induzido em beagles com 25 gf

não repercutiu em mudanças significantes nos níveis séricos e em fluido crevicular

gengival da FAO nos períodos de 7, 28, 56 e 83 dias (TENG; LIOU, 2014).

Por outro lado, o tratamento com o ácido zoledrônico diminuiu os níveis

plasmáticos dessa enzima, indicando que este fármaco reduziu os mecanismos de

anabolismo ósseo. A literatura tem abordado por meio de estudos in vitro que utilizaram

células de linhagem de osteosarcoma e precursores de osteoblastos e osteoblastos

maduros, a diminuição da FAO à medida que as concentrações de ácido zoledrônico

aumentavam (VAISMAN; MCCARTHY; CORTIZO, 2005; PATNTIRAPONG et al., 2012).

Ainda, foi observado que a adição de Zn2+ e Mg2+ após o tratamento com ácido

zoledrônico reestabelecia as concentrações de FAO. Visto que as fosfatases são

metaloenzimas que precisam desses íons divalentes como co-fatores (VAN HOOF; DE

BROE, 1994), pode-se sugerir que esse fármaco atue como um agente quelante, devido

aos dois átomos de fosfatos da sua estrutura química (VAISMAN; MCCARTHY,

CORTIZO, 2005). Além disso, pode-se aventar que o ácido zoledrônico interfere tanto na

expressão de FAO em osteoblastos ativos como em seus precursores, podendo, desta

forma, afetar não só a atividade dessas células, mas também sua diferenciação.

Clinicamente, foi relatado que pacientes com câncer de mama e metástase

óssea confirmada sob quimioterapia associada ao ácido zoledrônico, apresentaram

diminuição dos níveis séricos de FAO em intervalos de 3 meses de um período de 18

meses, os quais são restabelecidos quando os pacientes se encontram em wash out

quimioterápico por 6 meses (BARNADAS et al., 2014; PATEL et al., 2014).

O aumento dos níveis desta enzima está diretamente relacionado à presença

de metástases ósseas e à maior progressão desta doença tendo consequência no

aumento da incidência de mortalidade de pacientes com câncer (BARNADAS et al.,

2014; NISHIZAWA et al., 2014). Ao reduzir a FAO sérica, o ácido zoledrônico se mostra

efetivo como adjuvante quimioterápico. Nossos dados, em conjunto com os dados da

literatura indicam que a redução da MDI pelo ácido zoledrônico não se deveu ao

aumento de formação óssea, e sim, pela restrição potente da reabsorção óssea alveolar.

Uma vez que a redução da MDI não foi causada pelo aumento do anabolismo

ósseo, ao passo que o ácido zoledrônico reduziu os níveis séricos de fosfatase alcalina

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CDD 615.1

óssea, buscou-se investigar a repercussão desse fármaco nos aspectos reabsortivos

deste modelo. A histomorfometria do ligamento periodontal mostrou que os 11 dias de

MDI não mostraram alterações em ambos os lados, possivelmente por se encontrar na

fase em que a remodelação inicial ocorrera anteriormente e, portanto, as raízes

encontram-se centralizadas no alvéolo, bem como o tratamento com ácido zoledrônico

não alterarou essas áreas no ligamento periodontal observadas durante a MDI em

nenhuma das doses utilizadas. De fato, dados do nosso laboratório mostraram que a

MDI causou redução significante da área de ligamento periodontal no lado de

compressão e aumento correspondente na área de tração desde a 6ª h até o 4º dia. A

partir de então, essas áreas retornam às suas dimensões normais, assim seguindo até

os 21 dias. Ao 11º dia de MDI, as áreas do ligamento periodontal nos lados de

compressão e tração não apresentam alterações de extensão uma vez que as raízes

distovestibulares se encontram centralizadas no alvéolo, pois a remodelação inicial

ocorrera (ARAÚJO, 2015).

A constrição de vasos sanguíneos do ligamento periodontal na fase inicial da

MDI leva à formação de áreas de necrose focal caracterizadas pela redução de células,

chamadas áreas hialinas da matriz extracellular. Quando a intensidade da força gera o

mínimo de áreas hialinas, ocorrem, então, as reabsorções ósseas frontais. Na presença

exacerbada dessas áreas devido à maior intensidade de força, ocorre a reabsorção

óssea solapante, em que células distantes do ligamento são recrutadas para reabsorver

as áreas hialinas, acarretando um atraso do movimento dentário devido à distância e a

maior quantidade de osso à ser reabsorvida (FRACALOSSI et al., 2009).

Em quantidades diminuídas, essas áreas favorecem a liberação fatores

quimiotáxicos que recrutam células multinucleadas originárias do osso basal, induzindo

a sua diferenciação em osteoclastos. A partir de então, os macrófagos se deslocam para

a periferia do ligamento periodontal, promovendo a reabsorção do tecido necrótico.

Memo assim, esse processo gera um retardo da movimentação dentária, por isso a

formação de áreas hialinas é característica da fase de latência da MDI (KRISHNAN;

DAVIDOVITCH, 2006; FRACALOSSI et al., 2009; VON BÖHL; KUIJPERS-JAGTMAN,

2009). Vale salientar que nas fases posteriores, de pós-latência, o processo de

hialinização se apresenta de forma bastante discreta (VON BÖHL et al., 2004), tal como

foi observado no presente estudo. De fato, embora significante, observamos que os 11

dias de MDI causaram aumento discreto dessas áreas, considerando todo o ligamento

periodontal. Dados do nosso laboratório mostraram que houve um pico de áreas hialinas

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CDD 615.1

ao 1º dia de MDI, se estendendo até o 4º dia. A partir do 7º dia, essas áreas se

mostraram discretas, permanecendo assim até o 21º dia (ARAÚJO, 2015). No 11º dia,

quando se sabe ser o dia de pico da MDI, esta ocorre concomitantemente à baixa

quantidade de áreas hialinas presentes em toda a extensão do ligamento periodontal.

Ainda assim, as três doses de ácido zoledrônico utilizadas foram capazes de

reduzir à metade essas áreas hialinas no ligamento, evidenciando sua formação ao

mínimo. Esses achados estão de acordo com outros estudos em que o alendronato de

sódio também restringiu o surgimento de áreas hialinas no ligamento periodontal em

período semelhante, 11 ou 14 dias de MDI (KARRAS et al., 2009; ARAÚJO, 2015). A

formação mínima de área hialina pelo ácido zoledrônico pode estar relacionada com a

redução da MDI, uma vez que essas áreas são importantes no recrutamento de células

que iniciariam a reabsorção óssea.

Buscando avaliar o efeito antirreabsortivo do ácido zoledrônico a nível

histológico, as reabsorções presentes na raiz distovestibular e no osso alveolar

circunjacente foram analisadas. A análise dos escores histológicos mostrou que houve

um aumento intenso de reabsorções radiculares e ósseas após 11 dias de MDI,

corroborando os achados de Fracalossi et al. (2009), que constataram a presença

dessas reabsorções na raiz distovestibular e osso alveolar circunjacente a ela após 9

dias de MDI. O tratamento com ácido zoledrônico nessa pesquisa mostrou ser efetivo

em prevenir as reabsorções radiculares e ósseas, o que confirma a redução da MDI

devido ao efeito antirreabsortivo desse fármaco. Quanto à preservação radicular, nossos

achados estão de acordo com as observações de Sirisoontorn et al. (2012), em que a

administração intraperitoneal por 6 semanas com 1,6 µg/kg de ácido zoledrônico em

ratas ovariectomizadas preveniu as reabsorções radiculares após 28 dias de MDI, com

intensidade de força de 25 gf.

Como mencionado anteriormente, o ácido zoledrônico reduziu a MDI,

possivelmente por inibir a reabsorção óssea. Assim, considerou-se importante avaliar se

esse efeito poderia estar relacionado à modulação dos eventos celulares da inflamação

que ocorrem durante a MDI, uma vez que a participação de mediadores inflamatórios na

atividade osteoclástica já é bem estabelecida (YOSHIHARA et al., 2004; DATTA et al.,

2008; RUCCI, 2008; JIANG et al., 2015). Vale ressaltar que a movimentação dentária

engloba, principalmente, o ligamento periodontal e o osso alveolar, mas, também induz

alterações inflamatórias no tecido mole circunjacente ao dente, que compõe o

periodonto (WISE; KING, 2008).

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CDD 615.1

Avaliou-se a presença de neutrófilos, células importantes da inflamação

aguda, durante a MDI por meio da dosagem da atividade da mieloperoxidase gengival,

uma enzima presente em abundância nos grânulos azurófilos de neutrófilos. Após 11

dias de MDI, a atividade de mieloperoxidase gengival se mostrou elevada. De fato, a

ativação de um dispositivo ortodôntico favorece uma exacerbação da resposta

inflamatória, caracterizada, principalmente, pela presença de neutrófilos (ARAÚJO,

2015). Ainda, estudos que avaliaram a reabsorção óssea alveolar induzida em ratos no

mesmo período, também demonstraram um aumento da atividade da MPO (DE

ARAÚJO-JÚNIOR et al., 2013; GÓES et al., 2014; GUIMARÃES et al., 2016). Entretanto,

o ácido zoledrônico preveniu, significantemente, o aumento da atividade dessa enzima.

A modulação de neutrófilos pelo ácido zoledrônico já foi abordada na literatura por

Williams et al. (2000), em que o mecanismo dos bisfosfonatos, o qual consiste em inibir

a atividade de GTPases, parece interferir no processo de maturação e função

neutrofílica. Em outro estudo em culturas de células, Kuiper et al. (2012) observaram

que o ácido zoledrônico inibiu a quimiotaxia de neutrófilos e a atividade de NADPH

oxidase, uma enzima importante para a atividade fagocitária, bem como a diferenciação

de células hematopoiéticas nessas células de maneira concentração-dependente.

Tem sido relatado que fármacos antirreabsortivos podem afetar o sistema

imune inato, e interferir na liberação de enzimas lisossomais, a exemplo da

metaloproteinase-8, por neutrófilos (TERONEN et al., 1997). Sugere-se que a alta

incidência de osteonecrose dos maxilares por bisfosfonatos também pode estar

relacionada à incapacidade do sistema imune inato, facilitando a instalação da infecção

(KUIPER et al., 2012).

A instalação de mola Ni-Ti induz, além da migração neutrofílica, o aumento da

produção de citocinas, como TNF-α e IL-1β (HAZAN-MOLINA et al., 2013; ALIKHANI et

al., 2015), as quais participam ativamente da osteoclastogênese e indução de

osteoclastos maduros (TEITELBAUM; ROSS, 2003; BASARAN et al., 2006; LE GALL,

SASTRE, 2010) e estão presentes desde os estágios iniciais da MDI (ALIKHANI et al.

2015).

No presente trabalho, foi observado o aumento significante dos níveis de

TNF-α e IL-1β após 11 dias de MDI, quando comparados aos tecidos gengivais

contralaterais, em concordância com outros autores, os quais mostraram que a ativação

de uma mola Ni-Ti é responsável pelo aumento dos níveis de TNF-α e IL-1β após em 7 e

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CDD 615.1

10 dias, respectivamente (DE OLIVEIRA et al., 2014; YAN et al, 2015). Sabe-se que o

TNF-α induz a produção e secreção de IL-1β por macrófagos, tendo um papel

importante na remodelação óssea (DINARELLO et al., 1986; REDLICH; SMOLEN,

2012). O ácido zoledrônico, após 11 dias de MDI, não preveniu o aumento dos níveis

gengivais de TNF-α e IL-1β. Observou-se, ainda, a participação de TNF-α no modelo da

MDI, comparativamente à IL-1β.

De fato, ensaios in vitro observaram que a incubação de osteoclastos isolados

de humanos saudáveis com ácido zoledrônico foi responsável por promover o aumento

dos níveis de TNF-α e IL-1β (TSENG et al., 2015). Da mesma forma, estudos que

utilizaram células da linhagem de macrófagos murinos e osteosarcomas humanos,

constataram que o pré-tratamento com ácido zoledrônico aumentou a produção de TNF-

α, IL-1β e IL-6 após a incubação com LPS (MURATSU et al., 2013; RIZZO et al., 2014).

Embora o ácido zoledrônico não tenha prevenido o aumento dos níveis de TNF-α após

11 dias de MDI, estes se mantiveram elevados em relação ao controle.

Considerando que o ácido zoledrônico possui rápida depuração plasmática, e

se liga fortemente ao osso, avaliou-se a sua presença neste tecido. A imunohistoquímica

para TNF-α mostrou um aumento das imunomarcações no lado de compressão do

ligamento periodontal da raiz DV dos animais não tratados (NT), estando em

conformidade com os achados na literatura, que mostram a participação de TNF-α na

remodelação óssea da MDI (BOAS NOGUEIRA et al., 2013; ALIKHANI et al., 2015; YAN

et al., 2015). O ácido zoledrônico (200 µg/kg), diferentemente do que foi observado na

gengiva, diminuiu significantemente o número de células positivas para TNF-α nos lados

de compressão e tração do ligamento periodontal. Apesar da literatura não abordar com

especificidade o efeito do ácido zoledrônico na imunohistoquímica para TNF-α durante a

MDI, foi constatado que, na osteonecrose induzida por ácido zoledrônico, há um

aumento das imunomarcações para TNF-α (SILVA et al., 2016). Contudo, a

osteonecrose é uma condição peculiar, caracterizada por necrose propriamente dita,

sequestro ósseo, associada, muitas vezes, à presença de micro-organismos (SILVA et

al,. 2015), o que favoreceu a produção de citocinas pró-inflamatórias.

Citocinas pró-inflamatórias, principalmente TNF-α, promovem reabsorção

óssea por induzir a expressão de RANKL em células estromais como fibrosblastos e

osteoblastos (QUINN et al., 2000; MANABE et al., 2001). (LE GALL; SASTRE, 2010),

além de inibir a neoformação por estimular a apoptose de osteócitos e favorecer a

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infrarregulação de OPG (AHUJA et al., 2003; TANABE et al., 2005). Nesse contexto,

percebe-se que o eixo RANKL-OPG sofre uma influência relevante de mediadores da

inflamação (BOYCE; XING; 2008). Nesse estudo, foi verificado o aumento da

imunomarcação para RANKL no lado de compressão do ligamento periodontal da raiz

DV dos animais não tratados (NT), provavelmente em decorrência do aumento de TNF-

α. No lado de tração, as marcações positivas para RANKL também foram aumentadas.

Sabe-se que o movimento dentário ocorre mediante reabsorção óssea no

lado de compressão e neoformação no lado de tração (SANDSTEDT, 1904;

OPPENHEIN, 1911; SHWARZ, 1932), por isso o aumento da imunomarcação para

RANKL em ambos os lados indica o processo de remodelação óssea induzido pela

aplicação de força, uma vez que no lado de compressão foi constatado o aumento da

osteoclastogênese, e no lado de tração, maior presença de osteoblastos. A maior dose

de ácido zoledrônico diminuiu as imunomarcações para RANKL em ambos os lados,

indicando que houve uma redução da diferenciação osteoclástica no lado de

compressão e, no lado de tração, a diminuição de osteoblastos. Embora a literatura não

apresente estudos que avaliem os efeitos do ácido zoledrônico em imunohistoquímica

para RANKL durante a MDI, protocolos que utilizam ratas ovariectomicadas tem sido

abordados, nos quais o tratamento semanal com 1,5 µg/kg de ácido zoledrônico por 4 e

8 semanas, resultou na diminuição de células RANKL+ em fraturas ósseas na tíbia (LI et

al., 2012).

A OPG é uma citocina antiosteoclastogênica expressa em osteoblastos e

impede a ligação entre RANK e RANKL, inibindo a osteoclastogênese e, por

conseguinte, a reabsorção óssea (LACEY et al.,1998; KAWASAKI et al., 2006). Foi

observado um aumento de células OPG+ no lado de tração no ligamento periodontal da

raiz DV dos animais não tratados (NT), indicando a diminuição da osteoclastogênese

nesta região, o que pode favorecer a neoformação óssea. No lado de compressão, não

foram observadas alterações significantes no número de células imunomarcadas para

OPG, uma vez que neste local, a diferenciação osteoclástica se encontra aumentada

devido a maior presença de TNF-α e RANKL. Esses resultados estão de acordo com

aqueles encontrados por ZHOU et al. (2011), em modelo semelhante de MDI.

A utilização da maior dose de ácido zoledrônico foi responsável por prevenir

as marcações positivas para OPG no lado de tração, possivelmente por um aumento de

Dickkopf-1 (DKK-1), visto que a DKK-1 é uma proteína responsável por regular a via

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Wnt/β-Catenina, inibindo a transcrição gênica e, consequentemente, a produção de OPG

(BARON; RAWADI, 2007; KWACK et al., 2008). De fato, tem sido demonstrado que o

tratamento anual com 5 mg de ácido zoledrônico em mulheres com osteoporose pós-

menopausa aumentou, de forma significante, os níveis séricos de DKK-1 após 1 mês da

administração, mantendo-se elevados até o 6º mês (GATTI et al., 2014). Esses dados

parecem coerentes com os níveis diminuídos de FAO por ácido zoledrônico.

A razão RANKL/OPG foi empregada, uma vez que esta relaciona a

quantidade desses biomarcadores, indicando a elevação ou redução da reabsorção

óssea. Devido ao aumento a imunomarcação para RANKL no lado de compressão da

raiz DV dos animais não tratados (NT), foi observado que a razão RANKL/OPG se

mostrou elevada nesta região, a qual se confirmou pelo aumento da imunomarcação

para TRAP, mostrando o aumento da atividade osteoclástica e reabsorção óssea. No

lado de tração, tal razão permaneceu inalterada devido ao aumento concomitante da

marcação para OPG, coerente com as baixas imunomarcações para TRAP e

consequente redução da atividade osteoclástica e reabsortiva, o que pode favorecer a

formação óssea nessa área.

Entretanto, no lado de compressão, o ácido zoledrônico preveniu o aumento a

razão entre ambos os biomarcadores e das imunomarcações para TRAP, indicando

menor atividade osteoclástica e reabsortiva neste lado. No lado de tração, o ácido

zoledrônico promoveu uma diminuição significante da razão RANKL/OPG, devido ao

número reduzido de células positivas para RANKL, seguida por imunomarcações para

TRAP reduzidas. De fato, achados da literatura mostram que 12 dias de MDI

promoveram um aumento da imunomarcação para TRAP (TADDEI et al., 2013). Embora

não sejam abordados protocolos que envolvam o efeito do ácido zoledrônico na

marcação para TRAP durante a MDI, estudos mostram que em lesões osteolíticas e

osteosarcomas presentes em tíbias de camundongos, o tratamento semanal com ácido

zoledrônico foi responsável por diminuir a marcação positiva para TRAP após 8 e 5

semanas, respectivamente (LEE et al., 2002; ZHOU et al., 2005).

Confirmando que as doses utilizadas nesse estudo não causaram alterações

sistêmicas importantes, o ácido zoledrônico não alterou o leucograma, não alterando os

neutrófilos, linfócitos ou monócitos. Esses dados podem ser corroborados por aqueles

observados por Silva et al. (2015), os quais não constataram alterações significantes no

número de leucócitos, neutrófilos e linfócitos, após 13 dias do tratamento de ratos Wistar

ccom ácido zoledrônico nas doses de 40 e 200 µg/kg durante 3 semanas. Quanto à

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variação de massa corpórea, visto que houve perda de peso inicial em todos os animais

submetidos à MDI, tratados ou não, é possível inferir que a própria instalação da mola foi

responsável por induzir a perda de massa corpórea. De fato, procedimentos cirúrgicos

orais em animais, como a indução de reabsorção óssea alveolar por ligadura em torno

do segundo molar superior de ratos, também resultam em perda inicial de massa

corpórea inicial (LIMA et al., 2004, GÓES et al., 2012). Uma vez que os animais tratados

com ácido zoledrônico atingiram seu peso inicial no decorrer do período experimental,

não diferindo estatisticamente dos animais não tratados, pode-se dizer que esse

fármaco não induz alterações importantes na variação de massa corpórea.

Em suma, embora o ZOL tenha reduzido significantemente os eventos

anabólicos ósseos nesse estudo, seu efeito predominante na MDI consistiu na

diminuição da resposta inflamatória, com redução da atividade de MPO gengival e

consequente redução da MDI por menor reabsorção óssea osteoclástica via modulação

de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP, sem alterações sistêmicas importantes.

Figura 27 – Modelo hipotético do efeito do ZOL na remodelação óssea da MDI. O ZOL resultou em menor MDI sem induzir o anabolismo ósseo ao diminuir os níveis séricos de FAO e as marcações para RANKL e OPG no lado de tração, mas pelo seu efeito anti-inflamatório, ao reduzir a infiltração neutrofílica e potente antirreabsortivo ósseo, inibindo a osteoclastogênese pela redução de TNF-a e RANKL, levando à diminuição da atividade osteoclástica e reabsortiva confirmada pela diminuição de marcação para TRAP e da razão RANKL/OPG no lado de compressão.

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8. CONCLUSÃO

• O ácido zoledrônico reduziu a atividade anabólica óssea na MDI;

• O ácido zoledrônico resultou em menor MDI via redução da resposta

inflamatória e inibição potente da reabsorção óssea;

• Sistemicamente, o ácido zoledrônico não induziu alterações no leucograma

e na massa corporal dos animais.

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APÊNDICES

Apêndice A – Controles negativos para análise imunohistoquímica de TNF-α, RANKL, OPG e TRAP

Controles negativos do lado de compressão (A: TNF-α; B: RANKL; C: OPG; D: TRAP). Controles negativos do lado de tração (E: TNF-α; F: RANKL, G: OPG; H: TRAP).

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Apêndice B – Aparelhos e instrumentos laboratoriais

• Abridor de boca de rato (confeccionado pelo Laboratório de

Osteofarmacologia – UFC, Fortaleza-CE) • Agitador magnético 725a (Fisatom, São Paulo-SP, Brasil)

• Agitador Vortex (Phoenix, Araraquara-SP, Brasil)

• Alcoômetro Gay-Lussac (Incoterm, Porto Alegre-RS, Brasil) • Algodão (Johnson&Johnson, São Paulo-SP, Brasil)

• Alicate ortodôntico de corte de amarrilho (Quinelato®, ref: QO.151.00, Rio

Claro – SP, Brasil) • Balança digital BS3000 (Bioprecisa BS3000, Curitiba-PR, Brasil) • Balança digital modelo F6/1 (Filizola, São Paulo-SP, Brasil)

• Balança eletrônica de precisão (Sartorius BR 210S, Gotinga, Baixa Saxônia,

Alemanha) • Balança eletrônica de precisão FA2104N (Bioprecisa, Curitiba-PR, Brasil) • Banho-maria digital NT (Nova técnica equipamentos, Piracicaba-SP, Brasil)

• Centrífuga 80-2B (Centribio, São Paulo-SP, Brasil)

• Centrífuga Eppendorf 5804R (Eppendorf, Hamburgo-HA, Alemanha) • Destilador modelo 016 (Fabbe-Primar, São Paulo- SP, Brasil)

• Disco de Lixa 4 ½ 100 (3M, Campinas-SP,Brasil)

• Espátula 7 (Golgran, São Caetano do Sul-SP, Brasil) • Espectrofotômetro UV-5100B (Senova, Xangai, China)

• Fio de amarrilho de aço inox de 0,008 polegadas (Morelli®, ref:55.01.208,

Sorocaba-SP,Brasil)

• Fotopolimerizador Led (Ecco®, Campinas-SP, Brasil)

• Freeser -80 ⁰C (Revco Elite Plus, ThermoScientific, San Jose, EUA)

• Gase (Nexcare – 3M, Campinas-SP, Brasil)

• Homogeneizador de amostras – Polytron PT1035 (Kinematica, Lucerna,

Suiça) • Leitor de placas do tipo ELISA modelo ELX 800 (BioTek Instruments,

Winooski-Vermont, EUA) • Máquina de gelo EGE 300M (Everest, Rio de Janeiro-RJ, Brasil) • Microscópio ótico (Nikon Eclipse Ci, Tóquio, Japão)

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• Microscópio ótico modelo 175045 (Zeiss, Oberkochen-Baden-Wüttemberg,

Alemanha) • Micro-retífica modelo 300 (Dremel®, São Paulo-SP, Brasil)

• Mola fechada de níquel-titânio (Morelli®, ref: 35.20.064, Sorocaba-

SP,Brasil)

• Pinça clínica (Golgran, São Caetano do Sul-SP, Brasil) • Pipetas automáticas (LABMATE+, Varsóvia, Polônia)

• Porta-agulha Mathieu (Golgran, São, Caetano do Sul-SP, Brasil)

• Regrigerador Biplex 350 (Cônsul, São Paulo-SP, Brasil) • Tensiômetro (Morelli®, ref: 75.02.009, Sorocaba-SP,Brasil)

• Tesoura cirúrgica (Golgran, São Caetano do Sul-SP, Brasil)

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CDD 615.1

Apêndice C - Soluções e materiais de consumo

• Água destilada • Corante rápido de hematoxilina e eosina (NewProv®, Pinhais-PR, Brasil)

• Resina Composta Fill Magic (Vigodent®, Rio de Janeiro-RJ, Brasil) • Soro fisiológico 0,9% (NaCl 0,15 M) frasco com 500 ml (ADV, Nova

Odessa-SP, Brasil)

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CDD 615.1

ANEXOS Anexo A - Aprovação do estudo pela Comissão de Ética no Uso de Animais – UFC

bianca moreira kurita - repositorio.ufc.br · k1a kurita, bianca moreira. atividades...

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