BACTERIÓFAGOSBACTERIÓFAGOS

DescobrimentoDescobrimento

Em 1896, o bacteriologista e naturalista inglês Ernest Hanbury Hankin (1865 –1939) que viveu muitos anos na India, relatou que algum agente presente nas águas do Rio Ganges e Yamuna possuía ação antibacteriana contra o Vibrião da Cólera e que esse agente era filrável em filtros de porcelana.

Descobrimento

Superintendente do “Brown Institution of London”, relatou o descobrimento de um pequeno agente que infectava e matava bactérias. Inferiu que podia ser: 1) Um estágio no ciclo de vida das bactérias; 2) uma enzima que a bactéria produzia; ou 3) um vírus que crescia e destruía a bactéria.

Pesquisador do Instituto Pasteur de Paris anunciou em 3 de setembro de 1917 que havia descoberto um “agente invisível “ antagonista dos micróbios causadores de diarréias e os denominou bacteriófagos ou “comedores de bactérias”

São vírus DNA ou RNA que parasitam apenas organismos procariontes.

Os mais conhecidos são os que invadem a bactéria intestinal Escherichia coli, conhecidos como fagos “T” .

Conceitos Básicos

São constituídos por uma cápsula protéica que apresenta uma região denominada cabeça.

Em geral tem formato poligonal, envolvendo o material genético e uma região denominada cauda com formato cilíndrico, contendo, em sua extremidade livre, fibras protéicas.

Constituição Básica

Modelos de Fagos

Envelopados Não envelopados

Grupo Família Genoma Estrutura Bacteriófago

A Myoviridae ds DNA Cauda contrátil

T2, T4, T6

B Siphoviridae ds DNA Cauda longa, não contrátil

λ (lambda), T5

C Podoviridae ds DNA Cauda curta, não contrátil

T7, T3

D Microviridae ssDNA Sem cauda, cabeça grande

ѲX174, S13

E Leviviridae ssDNA Sem cauda, cabeça pequena

Grupo 1: MS-2, f2, R-17, JP501 20–30Grupo 2: GA, DS, TH1, BZ13, KU1, JP34Grupo 3: Qb, VK, ST, TW18Grupo 4: SP, FI, TW19, TW28, MX1, ID2

F Inoviridae ssDNA Sem cabeça, cauda flexível

SJ2, fd, AE2, M13

BACTERIÓFAGOS DE IMPORTÂNCIA BIOTECNOLÓGICA E USADOS NO MONITORAMENTO AMBIENTAL

Bradley 1967; Tomoeda et al. 1975; Furuse, et al. 1979; Sobsey et al. 1995.

Genoma de DNA ou RNA

Fita dupla (ds) ou fita simples (ss)

Circular ou linear

Geralmente não segmentado

Nenhum descoberto até o momento usa RT

Genomas de Fagos

Morfologia varia de simples icosaédricos a filamentosos

A maioria dos fagos têm “cauda” (“tailing”)

Genomas de Fagos1) Genomas RNA (pequenos e ss – menor que 10 Kb)

2) Genomas DNA (pequenos - menor que 10Kb)

3) Genomas DNA médios e grandes (30 a 200kb):

4 grupos com morfologias similares e que podem

produzir recombinantes viáveis:

Exemplos:

1) Bacteriófago T1 (~50 kb)

2) Bacteriófagos T2, T4, e T6 (~170 kb)

3) Bacteriófagos T3 e T7 (~40 kb)

4) Bacteriófago T5 (~130 kb)

Fields, Virology 5th ed

Fields, Virology 5th ed

Biossíntese viral de

fagos com cauda e cabeça e genoma

dsDNA (“T”)

Ciclos de ReplicaçãoTêm dois tipos de ciclo : Lítico e Lisogênico

Durante o ciclo lisogênico as funções líticas ficam reprimidas e o genoma do fago normalmente

fica integrado no genoma da bactéria.

Denominamos como profagos.

Ex: Fago Lambda

Phage λE. coli genome

Injeção do DNA linear do fagoλ

DNA linear do fago λ (50,000 bp)

cos sites

cos sitesUnião das extremidades cos

DNA circular do fago λ

Genoma da E.coli

Recombinação do DNA do DNA do fago λ e DNA da E. coli

Indução da replicação do fago

Progenie do fago λ com o gene da bactéria

Encapsulação do fago

Bacteriófagos: Ciclo Lítico ou

Lisogênico

LISOGENIA

LÍTICO

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• Fase inicial- Proteínas necessárias para replicar DNA- Proteínas reguladoras- Normalmente alteram proteínas da célula hospedeira

• Fase tardia- Replica DNA- Proteínas da estrutura viral

Ciclo Lítico

Fagos Virulentos

Subvertem o sistema do hospedeiro que passa por uma fase lítica que

culmina no rompimento (lise) da célula hospedeira para liberar os

vírions

Fagos Cronicamente Infectantes

Em casos raros fagos como o ssDNA M13 ficam continuamente

liberando virions sem rompimentos da célula hospedeira.

Fatores de Virulência Carreados por Fagos

Fagos podem carregar consigo fatores de virulência:

CAUSAR RECOMBINAÇÕES...

TransduçãoTransferência de Genes Bacterianos por Fagos

Transferência de Genes

Bacterianos por Fagos

Aplicações Biotecnológicas - Fagos

https://sites.google.com/site/virologia2011ufabcp2/aula-10---bacteriofagos

De 1970 até o ano 2000, os bacteriófagos

emergiram como ferramentas importantes na

clonagem de genes com inúmeras aplicações.

Atualmente estão novamente ganhando

importância não só como modelos na biologia

molecular e celular, mas também em

questões de genômica evolucionária, ecologia

e patogênese bacteriana.

Aplicações Biotecnológicas - Fagos

-Enzimas úteis em Manipulação Gênica

- Vetores (fagos ou cosmídeos)

- Phage display

- Terapias - Fagoterapias

Aplicações Biotecnológicas - Fagos

Aplicações mais usuais...

Polimerização dos Ácidos Nucleicos

Ligações fosfodiéster constituem o

núcleo principal da vida já que são parte

da constituição básica de todos os ácidos

nucleicos.

A hidrólise das ligações fosfodiester são

catalisadas pelas fosfodiesterases

(quebra do DNA)

Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância Biotecnólogica

• Atividade de exonuclease 3’ 5’ e de polimerase 5’ 3’;

• Não apresenta atividade de exonuclease 5’ 3’;

• Pode ser utilizada na finalização da extremidade 5’ saliente e marcação do terminal 3’ da fita dupla de DNA;

• Atividade de exonuclease: retira aproximadamente 40 bases/minuto na fita dupla e 4000 bases da fita simples;

• Atividade de endonuclease: polimeriza 15000 nucleotídeos/minutos em condições padronizadas.

DNA Polimerase T4

DNA Polimerase do bacteriófago T7

Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância Biotecnólogica

A T7 DNA polimerase tem uma velocidade de incorporação de nucleotídeos de 300 nucleotídeos por segundo.

Essa enzima é usada na preparação de sondas moleculares radioativas e na amplificação gênica (PCR) de grandes fragmentos de DNA.

A mutagênese in vitro da T7 DNA polimerase resulta na eliminação completa da atividade exonucleolítica da enzima, aumentando assim sua velocidade de adição de nucleotídeos (polimerização do DNA) em 9X.

T7 DNA Polimerase - BACTERIÓFAGO T7

RNA polimerases

• Principais usadas em Biologia Molecular: SP6 e T7- RNA polimerase

SP6 - Bacteriófago da Salmonella typhymurium LT2

Bacteriófago T7Transcrição!

RNA Polimerases dos Fagos SP6 e T7

Bacteriófago SP6 (infecta Salmonella typhimurium) produz RNA polimerase SP6 e o bacteriófago T7 produz a RNA polimerase T7.

São RNA polimerases DNA dependentes e catalisam a elongação 5’3’ de cópias de RNA a partir do DNA molde (transcrição).

Ambas são similares e são usadas para sintetizar o RNA a partir de DNA dupla fita molde.

SP6 e T7 RNA polimerases são extremamente promotores específicas e irão transcrever RNA a partir de qualquer sequência de DNA que foi clonada adjacente a um promotor.

• Usadas para:- Síntese in vitro de transcritos anti-senso;- Produção de RNAs marcados com sondas;- Mapeamento com proteção de RNase

(expressão de RNAm).

• SP6 e T7 – RNA polimerase- Mg2+ e DNA molde fita dupla;- Espermidina e albumina de soro;- Transcritos downstream ao promotor; - Transcreve até a cauda poli-A.

RNA polimerases

Modelo deve ser linearizado

Ligases utilizadas em biologia molecular

Cofatores

DNA ligases

Bacteriófago T7 Vírus da Chlorella

Mais usada em Biologia Molecular:

• T4 DNA ligase – Requer Mg2+ e ATP como cofatores;

• Repara fitas simples em DNA dupla fita, RNA ou híbridos de DNA/RNA.

Bacteriófago T4

Atividades das DNA ligases

Conectam fragmentos de DNA por Ligações fosfodiéster 3’ OH –

5’PO4-

1° AMP

2° União

3°liberação AMP

Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância BiotecnólogicaDNA Ligases - BACTERIÓFAGO T4

DNA ligases conectam fragmentos de DNA catalisando a formação de ligações fosfodiéster entre o terminal 3’OH e o terminal 5’ fosfato.

São usadas em Biologia Molecular para ligar fragmentos de DNA com extremidades coesivas ou extremidades cegas, como os gerados por clivagem por enzimas de restrição;

Servem ainda para adicionar “adaptadores” sintéticos ou reparar quebras no DNA;

A DNA ligase mais frequentemente utilizada em Biologia Molecular é a isolada do bacteriófago T4.

RNA ligases

• Ligações fosfodiéster (5’PO4 – 3’OH) em fitas simples de DNA ou RNA.

T4 RNA ligase

• T4 RNA ligase 1 – RNA fita simples.

T4 RNA ligase 1: A RNA ligase mais bem caracterizada e mais utilizada em Biologia Molecular

• Aplicações:- Análise da estrutura do RNA;- Mapeamento de sítios de ligação de

proteínas;- Rápida amplificação de extremidades de

DNAc;- Ligação de oligonuceotídeos adaptadores

no DNAc;- Síntese de oligonucleotídeos;- Modificação de ácidos nucléicos na região

5’;- Extensão de iniciadores na PCR;- Usada na circularização de moléculas de

RNA e DNA.

• Catalisa ligações intramoleculares e intermoleculares em RNA;

• Mais ativas para ligações de RNA; • Também pode ligar DNA dupla fita.

T4 RNA ligase 2

T4 Polinucleotídeo quinase

• Descoberta em E. coli infectadas por T4• As bactérias infectadas quebram sítios

específicos de seus tRNAs para interferir na manutenção viral (desfosforilação)

• O T4, por sua vez, utiliza sua quinase para restaurar esses tRNAs

T4 Polinucleotídeo quinase

Enzimas de Modificação Isoladas de Fagos Importância BiotecnólogicaPolinucleotídeo quinases - BACTERIÓFAGO T4

Catalisam a transferência de grupos fosfatos para o terminal 5’-OH dos ácidos nucleicos (DNA ou RNA)

Utilidades:

Quando o ATP está marcado radioativamente (ex: 32P-ATP), a polinucleotídeo quinase gera DNA ou RNA marcado com 32P no terminal 5’ catalisando a fosforilação direta dos grupos 5’-OH.

BACTERIÓFAGOS COMO VETORES DE CLONAGEM GÊNICA

A ideia de ligar segmentos de DNA através das extremidades coesivas do bacteriófago tornou-se o “curinga” dos experimentos de engenharia genética.

Com o reconhecimento das enzimas de restrição e das outras ferramentas de clonagem, os sítios coesivos se tornaram o local ideal de ligação dos DNAs exógenos.

BACTERIÓFAGOS COMO VETORES DE CLONAGEM GÊNICA

VETORES DE CLONAGEM

Em 1962 (Allan Campbell)

Observou que o genoma linear do bacteriófago λ

formava um círculo quando entrava na bactéria

hospedeira e um evento de recombinação ocorria

com a iDNA do fago Lambda

Análises posteriores revelaram que o fago λ

possui regiões pequenas de DNA simples fita cuja

sequência é complementar ao outro lado da

sequência linear.

Essas regiões foram denominadas sítios cos

(coesivos) e isso permite que o DNA linear fique

circular quando entra na bactéria hospedeira

Bacteriófago Lambda (λ)

Digerido pela enzima de restrição PstI

Usado comumente em Biologia

Molecular

¨ Como marcador molecular

¨ Na inserção do DNA do fago no

cromossomo da bactéria.

Bacteriófago Lambda (λ)

Kary B. Mullis, Scientific American (1990) 262:36.

Bacteriófagos como Marcadores na

Contaminação Aquática

Alguns bacteriófagos são aptos para infectar bactérias da microbiota normal do trato gastrointestinal humano e assim podem ser encontradas no esgoto e águas residuais.

VANTAGENS DO USO DE FAGOS COMO INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA POR ESGOTO

Especificidade: Ocorrem consistentemente e exclusivamente em fezes humanas e no esgoto, não se replicando no ambiente;

Sensibilidade: Estão presentes em maiores quantidades do que os vírus entéricos além de serem mais estáveis aos tratamentos de águas.

2000 The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 88, 5–21

Bacteriófagos como Marcadores na Contaminação Aquática

BACTERIÓFAGOS JÁ PROPOSTOS COMO INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO

AQUÁTICA

Colifagos somáticos: (Kott 1966; Hilton and Stotzky 1973; Kott et al. 1974; Iawprc 1991),

Colifagos de genoma RNA (FRNA phages) : (Havelaar and Hogeboom 1984; Iawprc 1991)

Fagos que infectam a bactéria Bacteroides fragilis (Armon and Kott et al.1993; Jofre et al. 1986; Tartera and Jofre 1987; Iawprc 1991; Grabow et al. 1995; Gantzer et al. 1998a).

Obrigada!