avaliação da atividade antifúngica de extratos de cassia ... · o aumento de micoses...

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QQQQQUÍMICAUÍMICAUÍMICAUÍMICAUÍMICA

Revista PIBIC, Osasco, v. 3, n. 2, 2006, p. 151-158

Avaliação da atividade antifúngica de extratosde Cassia fistula (Leguminosae)

Samanta Pimenta de AndradePesquisadora

Orientadora

O aumento de micoses oportunistas e a necessidade de novos agentes antifúngicos na agricultura têm estimulado a

busca de novos metabólitos secundários com atividade antifúngica a partir de plantas medicinais. A espécie vegetal Cassia

fistula é utilizada na medicina popular como agente antimicrobiano e antiinflamatório e foi objeto do presente estudo.

Extratos obtidos a partir de C. fistula foram avaliados contra fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e

Cladosporium sphaerospermum através do ensaio bioautográfico. Foram observadas atividades significativas para vários

extratos obtidos de diversos tecidos vegetais. Os extratos hexânico e diclorometânico de sementes de C. fistula ativos

contra os fungos testados foram submetidos ao fracionamento cromatográfico e foi possível localizar uma fração ativa a

partir do extrato hexânico, que apresentou uma atividade inibitória mínima de 10 µg.

Cassia fistula. Extratos vegetais. Atividade antifúngica.

The increasing occurrence of opportunistic mycoses and the need for new antifungal agents in agriculture has stimulated

the search for new antifungal secondary metabolites from the plants. Cassia fistula is specie used in folk medicine as anti-

microbial and anti-inflammatory, and was objective of this study. Extracts of C. fistula were evaluated against phytopatogenic

fungus Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum by a bioautographic method on TLC plates. Since

the hexane and dichloromethane extracts from the seeds showed high growth inhibitory activity, they were subjected to

fractionation procedures using chromatographic techniques associated with the bioautographic assay. Thus it was possible

to locate the active fraction from the hexane extract showing the minimum inhibitory amount of 10 µg.

Cassia fistula. Vegetable extracts. Antifungal activity.

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Samanta Pimenta de Andrade


1 Introdução

As plantas produzem diversos compostos orgânicos,

muitos dos quais não participam diretamente de seu

desenvolvimento. Essas substâncias referidas como

metabólitos secundários ou produtos naturais

desempenham um papel fundamental nas suas interações

de defesa contra predadores e patógenos (CROTEAU et

al., 2000). Muitos destes metabólitos secundários

apresentam atividades biológicas e têm sido utilizados

na indústria farmacêutica e agroquímica (HAMBURGER;

HOSTETMANN, 1991). Dentre as diversas atividades

biológicas apresentadas, há um grande estímulo para a

procura de substâncias antifúngicas, tendo em vista o

aumento das infecções fúngicas bem como a necessidade

de novos agentes antifúngicos na agricultura, para evitar

perdas incalculáveis para a produção agrícola

(ZACCHINO, 2001).

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade

antifúngica de extratos vegetais dos diversos tecidos da

espécie vegetal Cassia fistula (Leguminoseae), utilizada

na medicina popular como cicatrizante e

antiinflamatória (DI STASI; LIMA, 2002). Esta espécie é

uma árvore utilizada com fins ornamentais, devido à

beleza de suas flores, mas também encontra-se na

medicina popular contra diversos males (figura 1). Sobre

esta espécie vegetal foram publicados diversos trabalhos

de metabólitos secundários biologicamente ativos. No

trabalho de YADAVA et al. (2003) foi isolada uma flavona

glicosilada a partir do extrato polar de sementes de

Cassia fistula. Este flavonóide apresentou uma

considerável atividade antimicrobiana. O extrato aquoso

e etanólico das folhas de outra espécie do gênero Cassia

(Cassia alata) foi testado in vitro contra fungos, leveduras

e bactérias, sendo que o extrato aquoso apresentou uma

atividade antimicrobiana comparável com a dos

antibióticos utilizados como padrão (SOMCHIT et al.,

2003). A partir de outros dados da literatura, pode-se

concluir que esta espécie demonstra um alto potencial

para a descoberta de substâncias antifúngicas.

Figura 1 - Exemplar da espécie Cassia fistula.

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Avaliação da atividade antifúngica de extratosde Cassia fistula (leguminosae)


2 Material e Métodos

2.1 Coleta do material vegetal

A espécie Cassia fistula foi coletada em um parque

localizado na região norte de São Paulo em março e

setembro de 2004. A localização exata da árvore é GPS

S 23o 30 564´ W 46o 36 501´. Esta espécie foi identificada

pela professora Adriana Amaral Baroli (UNIFIEO), e uma

exsicata (SPSF 30711) foi depositada no Herbário do

Instituto Florestal de São Paulo.

2.2 Extração

Os tecidos vegetais foram separados manualmente

em folhas, galhos, flores, frutos e sementes, sendo

submetidos às etapas de secagem e moagem. Em seguida,

os tecidos vegetais foram extraídos com metanol a frio

por duas vezes, sob banho de ultra-som. Os extratos

metanólicos foram então suspendidos em água e

particionados com hexano, diclorometano, acetato de

etila e n-butanol (figura 2). As soluções obtidas foram

concentradas em evaporador rotatório.

2.3 Avaliação da atividade antifúngica

Os extratos brutos e frações obtidos a partir destes

foram submetidos ao ensaio antifúngico pelo método

bioautográfico para a detecção de substâncias

antifúngicas frente aos fungos fitopatogênicos

Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium

cladosporioides segundo a metodologia descrita

(HOMANS; FUCHS, 1971). No ensaio foram utilizadas

cromatoplacas de sílica-gel 60 F254 (Merck), onde foram

aplicados 40 mL de uma solução estoque das frações de

10 mg/mL, correspondendo a 400 µg dos extratos brutos.

No caso de frações foram aplicados 200 µg. A placa foi

eluída em hexano:acetato de etila 7:3, e após a

evaporação do solvente, esporos do fungo Cladosporium

sphaerospermum e de C. cladosporioides em solução de

glicose e sais foram nebulizados sobre a placa e a mesma

foi incubada em câmara úmida a 25°C, durante 48 horas

no escuro. Decorrido este período, o crescimento do

fungo foi observado sobre toda a placa cromatográfica,

exceto nas regiões onde se encontravam as substâncias

fungitóxicas, visíveis sob a forma de manchas claras de

inibição do crescimento do fungo.

2.4 Fracionamento dos extratos ativos

O extrato hexânico de sementes de C. fistula (794,9

mg), obtido inicialmente, foi fracionado em coluna

filtrante, utilizando-se sílica-gel G-60, sendo eluído com

hexano:acetato de etila em gradiente de polaridade e

em seguida com metanol. Foram recolhidas 34 frações

de aproximadamente 5 mL cada e, após analise do perfil

cromatográfico via CCDC, foram reunidas em 16 frações.

Todas as frações obtidas, foram submetidas ao ensaio

bioautográfico para detecção das substâncias

responsáveis pela atividade antifúngica.Figura 2 - Esquema de obtenção dos extratos brutos dostecidos vegetais de C. fistula.

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O outro extrato que apresentou atividade antifúngica,

extrato diclorometânico de sementes de C. fistula (326,6

mg), também foi fracionado em coluna filtrante,

utilizando-se sílica-gel G-60, sendo eluído com hexano:

acetato de etila em gradiente de polaridade e em seguida

com metanol. Foram recolhidas 47 frações de

aproximadamente 5 mL cada, que após analise do perfil

cromatográfico via CCDC foram reunidas em 26 frações.

Todas as frações obtidas foram submetidas ao ensaio

bioautográfico para detecção das substâncias

responsáveis pela atividade antifúngica.

2.5 Avaliação da concentração inibitória mínima

A fração ativa do extrato hexânico de sementes foi

submetida ao ensaio antifúngico pelo método

bioautográfico para determinação da concentração

inibitória mínima (MIC). No ensaio foram utilizadas

cromatoplacas da Merck de sílica gel 60 F254, onde

foram aplicadas 40 µL, 20 µL, 10 µL, 5 µL, 2,5 µL e 1 µL

de uma solução estoque da fração de 10 mg/mL,

correspondendo a 400 µg, 200 µg, 100 µg, 50 µg,

25 µg e 10 µg, respectivamente.

3 Resultados e Discussões

Todos os extratos obtidos a partir de Cassia fistula

foram submetidos ao ensaio bioautográfico contra os

fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e

C. spharospermum. Os extratos que apresentaram maior

atividade foram os extratos hexânico (ECF13),

diclorometânico (ECF14) e em AcOEt (ECF15), obtidos

a partir das sementes de C. fistula, principalmente contra

os fungos Cladosporium cladosporioides. Esta atividade

foi determinada com base no halo de inibição do

crescimento fúngico observado na cromatoplaca (figura

3). Observou-se ainda que os extratos hexânico (ECF9)

e diclorometânico (ECF10) dos galhos e o extrato

diclorometânico (ECF2) das folhas apresentaram

moderada atividade para os dois fungos testados,

enquanto o extrato hexânico das flores (ECF5) apresentou

pequena atividade para ambos os fungos (figura 3). Para

o fracionamento biomonitorado foram selecionados os

extratos hexânico (ECF13) e dicrometânico (ECF14) das

sementes que mostraram maior atividade contra os fungos

testados.

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O extrato hexânico de sementes de C. fistula foi

submetido ao fracionamento cromatográfico em coluna,

e as frações obtidas da coluna de fracionamento foram

novamente submetidas ao ensaio bioautográfico para a

Figura 3 - Extratos de C. fistula bioautografados com fungos do gênero Cladosporium.

localização das frações responsáveis pela atividade

antifúngica (figura 4). Notou-se que as frações ativas

correspondem as de número 11 a 16, que apresentaram

uma substância com Rf de 0,4.

Figura 4 - Frações do extrato hexânico de sementes de C. fistula bioautografados com fungos do gênero Cladosporium.

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O extrato diclorometânico também foi submetido ao

fracionamento cromatográfico em coluna. Para localização

das frações ativas, estas foram submetidas ao ensaio

bioautográfico frente aos dois fungos fitopatogênicos;

entretanto, as frações analisadas separadamente não

apresentaram atividade antifúngica significativa como no

extrato bruto. Estes dados permitem supor que não seja

uma única substância responsável pela atividade antifúngica

observada, mas que esteja ocorrendo um sinergismo das

várias substâncias presentes no extrato para que haja inibição

do crescimento fúngico, como observado para o extrato

bruto.

A fração ativa obtida a partir do extrato hexânico

de sementes de C. fistula foi aplicada em

concentrações decrescentes de 400 a 10 mµg, para

avaliação da concentração inibitória mínima.

Observou-se uma substância fortemente ativa (Rf 0,4)

contra o fungo Cladosporium sphaerospermum em

todas as concentrações testadas (figura 5), comparável

ao antifúngico padrão nistatina (ativo a 10 mµg).

Verificou-se ainda observada uma atividade fraca,

frente ao fungo Cladosporium cladosporioides

(tabela 1).

Figura 5 - Fração ativa do extrato hexânico de sementes de C. fistula bioautografada para avaliação da concentração inibitóriamínima.

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Com base nestes resultados, sugere-se que esta

substância possua um potencial para a produção de um

novo agente antifúngico capaz de proporcionar uma

aplicação agroquímica.

4 Conclusão

Os ensaios bioautográficos para a detecção e

atividade antifúngica contra os fungos fitopatogênicos

Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium

cladosporioides revelaram uma atividade significativa

para os extratos hexânico e diclorometânico de sementes

contra ambos os fungos testados. Através do

fracionamento cromatográfico biomonitorado pelo

ensaio antifúngico, foi possível isolar uma substância

ativa a partir do extrato hexânico das sementes de C.

fistula. Curiosamente as diversas frações obtidas a partir

do fracionamento do extrato diclorometânico não

apresentaram atividade antifúngica significativa. Visto

que o extrato apresentou uma atividade razoável, pode-

se supor que ocorra uma ação sinérgica de duas ou

mais substâncias para que ocorra a atividade observada

para o extrato. Com base nos resultados e de outros

trabalhos descritos na literatura, pode-se sugerir que

esta espécie apresenta um alto potencial para a

descoberta de substâncias antimicrobianas, incluindo

agentes antifúngicos.

Agradecimentos

À Dra. Maria Claudia Marx Young do Instituto

Botânico pela colaboração na realização dos ensaios

antifúngicos, e ao Prof. Dr. Sílvio Miranda Prada pela

coleta da espécie vegetal.

Referências

CROTEAU, R.; KUTCHAN, T. M.; LEWIS, N. G. Natural products (secondary metabolites). In: BUCHANAN, B.;

GRUISSEM, W.; JONES, R. Biochemistry & molecular biology of plants. Rockville: American Society of Plant

Physiologists, 2000.

DI STASI, L. C.; HIRUMA-LIMA, C. A. Plantas medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica. 2. ed. São Paulo:

UNESP, 2002.

* - Atividade fraca*** - Atividade forte

Tabela 1 - Avaliação da concentração inibitória mínima (MIC).

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GRUISSEM, W.; JONES, R. Biochemistry & molecular biology of plants. Rockville: American Society of Plant

Physiologists, 2000.

HOMANS, A. L.; FUCHS, A. J. Direct bioautography on thin layer chromatograms as a method for detecting

fungitoxic substances. Journal of Chromatography, v. 51, p. 327-330, 1970.

HAMBURGER, M.; HOSTETTMANN, K. Bioactivity in plants: The link between phytochemistry and medicine.

Phytochemistry, v. 30, p. 3864-3874, 1991.

SOMCHIT, M. N. et al. In vitro antimicrobial activity of ethanol and water extracts of Cassia alata. J.

Ethnopharmacology, v. 84, p. 1-4, 2003.

YADAVA R. N., VERMA V., J. A new biologically active flavone glycoside from the seeds of Cassia fistula (Linn.).

Asian Natural Products Research, v. 5, p. 57-61, 2003.

YUNES, R. A.; CHECHINEL FILHO, V. Breve análise histórica da química de plantas medicinais: sua importância na

atual concepção de fármaco segundo os paradigmas ocidental e oriental. In: YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas

medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, 2001.

ZACCHINO, S. Estratégias para a descoberta de novos agentes antifúngicos. In: YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B.

Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, 2001.

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