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Avaliação da Aplicação de

Biomarcadores Salivares no

Contexto do Diagnóstico

Precoce do Cancro Oral Artigo de Revisão Bibliográfica

MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA DENTÁRIA

João Cabral Morgado

Porto, 2015

Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral

I

MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA DENTÁRIA

ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

“AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE BIOMARCADORES SALIVARES NO

CONTEXTO DO DIAGNÓSTICO PRECOCE DO CANCRO ORAL”

JOÃO CABRAL MORGADO

Estudante do 5º ano do Mestrado Integrado em Medicina Dentária

[email protected]

Monografia apresentada à Faculdade de Medicina Dentária da

Universidade do Porto no âmbito da UC “Monografia de Investigação ou

Relatório de Atividade Clínica”

Orientador

João Miguel Silva e Costa Rodrigues Professor Auxiliar Convidado com Agregação da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto Co-Orientador Maria Helena Raposo Fernandes Professora Catedrática da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto

Porto, 2015


II

Resumo O desenvolvimento de novas ferramentas na área biomédica tem permitido

estudar diferentes formas de diagnosticar precocemente o desenvolvimento do

cancro oral. Tendo aumentado a incidência desta patologia ao longo dos

últimos anos, de carácter invasivo e com rápida progressão e, passando

maioritariamente despercebida ao exame clínico em estadios muito iniciais do

seu desenvolvimento, tornou-se imperativo a criação de meios complementares

de diagnóstico mais rápidos, preditivos, informativos e com níveis de

especificidade e sensibilidade aceitáveis para detetar estas lesões em fases

precoces da sua evolução. Neste contexto, têm sido estudados alguns

componentes salivares como proteínas e elementos genéticos, avaliando o seu

potencial e aplicabilidade como biomarcadores tumorais em lesões pré-

malignas ou potencialmente malignas como, por exemplo, as leucoplasias

orais. Deste modo, o diagnóstico e intervenção médica numa etapa primária

da patologia, possibilitará o acesso a mais opções de tratamento e,

consequentemente, a maior sucesso terapêutico reduzindo significativamente a

taxa de mortalidade.

Como meio de pesquisa foram consultados variados artigos científicos

indexados à base de dados online Pubmed® e alguma literatura disponível.

Palavras-chave: “cancro oral”, “proteinas salivares”, “biomarcadores”,

“carcinoma oral escamoso”, “saliva”, “leucoplasia oral”, “microRNA”, “ lesão pré-

maligna”, “diagnóstico”, “displasia”.


III

Abstract

The development of new tools in the biomedical field is allowing the study

of different ways to early diagnose the development of oral cancer. Having an

increased incidence of this disease over the past years, and due to its invasive

nature and fast progression, well as the fact that it is largely unnoticed by the

clinical examination in very early stages of its development, it has turned

imperative to create faster complementary diagnostics, predictive, informative

and with acceptable levels of specificity and sensitivity to detect these lesions at

early stages of development. In this context, has been studied some salivary

components such as proteins and genetic elements are being studied to

evaluate their potential and applicability in pre-malignant tumors as well on

potentially malignant lesions, for example, oral leukoplakia. Thus, diagnosis and

medical intervention in a primary level of the disease may enable access to

more treatment options providing in this way, more successful treatments which

will reduce mortality rate.

As a mean of research were consulted several scientific articles indexed to

the online database Pubmed® and some available literature.

Keywords: “oral cancer”, “salivary proteins”, “biomarkers”, “oral squamous

carcinoma”, “saliva”, “oral leukoplakia”, “microRNA”, “pre-malignant lesion”,

“diagnosis”, “dysplasia”.


IV

Agradecimentos Ao meu orientador,

o Professor Dr. João Rodrigues, dirijo o meu enorme reconhecimento por toda

a paciência, atenção, disponibilidade, ajuda e orientação que me concedeu no

decorrer da realização deste trabalho,

À minha família,

em especial á minha avó Helena Morais, à minha mãe Helena Cabral e ao meu

irmão Rui Morgado pelo apoio incondicional que me deram na luta pela

concretização dos meus objectivos e por estarem sempre presentes em todos

os momentos da minha vida,

Á minha cara-metade,

Tânia Pereira, por toda a força, compreensão e carinho que sempre me

transmitiu,

Aos meus amigos,

especialmente à Mariana Silva e à Ana Torres, que ao longo do meu percurso

académico sempre demonstraram a sua grande amizade para comigo, por todo

o apoio que me deram nos momentos mais dificeis e pelas gargalhadas que

me proporcionaram.


V

Índice

1. Introdução.................................................................................................2

2. Materiais e Métodos..................................................................................5

3. Biofluído Salivar........................................................................................6

4. Identificação de um Biomarcador.............................................................9

5. Micro-RNAs como Biomarcadores no Cancro Oral................................11

5.1. Deteção de Lesões Orais Potencialmente Malignas.......................14

6. Actina e Miosina como Biomarcadores em Lesões Pré-Malignas e

Malignas.......................................................................................................20

7. DNA Mitocondrial como Biomarcador em Lesões Orais Pré-malignas e

Malignas.......................................................................................................25

8. Conclusão................................................................................................30

9. Referências Bibliográficas........................................................................31

10. Anexos......................................................................................................34


VI

Índice de Tabelas Tabela I - Fluídos biológicos utilizados como ferramenta de estudo nos

diversos tipos de cancro......................................................................................6

Tabela II - Componentes salivares com potencial de diagnóstico......................7

Tabela III - Mecanismos que determinam a presença de marcadores

genotípicos e fenotípicos na saliva......................................................................8

Tabela IV -Expressão de alguns miRNAs em amostras salivares de indivíduos

portadores de leucoplasia oral com progressão maligna e sem progressão

maligna em comparação com o observado em amostras salivares de indivíduos

saudáveis...........................................................................................................18

Tabela V- Dados estatísticos sobre os níveis médios de Cox I e Cox II

identificados em meio salivar no grupo controlo e no grupo com carcinoma

oral.....................................................................................................................27

Tabela VI- Comparação estatística entre os níveis de Cox I e Cox II salivar em

estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do carcinoma oral.....................27

Tabela VII – Correlação entre os níveis de Cox I e Cox II identificados na saliva

e no tecido do tumor primário............................................................................29

Índice de Figuras Fig.1 - Métodos de investigação que permitem o estudo e a identificação de novos biomarcadores cancerígenos.................................................................10 Fig.2 - Estadios da transformação cancerígena de uma lesão do ponto de vista histológico..........................................................................................................15 Fig.3 - Cortes histológicos da evolução de uma leucoplasia oral até à formação de um carcinoma de células escamosas..........................................................15 Fig.4 - Nível relativo de expressão salivar de alguns miRNAs em 3 grupos de estudo (controlo, leucoplasias não progressivas e leucoplasias progressivas).....................................................................................................17 Fig.5 - Relação entre o aumento da expressão de mIR-181b, mIR-21 e mIR-345 com o grau de transformação maligna de uma lesão oral........................19 Fig.6 - Diagramas de caixa com os dados obtidos da análise dos níveis relativos de actina e miosina encontrados em lesões orais pré-malignas e malignas.............................................................................................................22 Fig.7 - Percentagem de expressão de CapG por imunoreação nas diversas amostras estudadas...........................................................................................23 Fig.8 – DNA mitocondrial.............................................................................,....25 Fig.9 - Diagrama de Pontos com a dispersão de valores registados para os níveis de Cox I salivar nos estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do desenvolvimento de carcinoma oral..................................................................28 Fig.10 - Diagrama de Pontos com a dispersão de valores registados para os níveis de Cox II salivar nos estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do desenvolvimento de carcinoma oral..................................................................28


VII

Lista de Abreviaturas

o Atc-Atg – Anticorpo-Antigénio

o ATP – (Adenosine triphosphate) – Trifosfato de adenosina

o cDNA – (complementary DNA) - DNA complementar

o CapG – (gelsolin-like actin-capping protein) – Proteína de ligação à actina.

o Cox I - Citocromo c oxidase I

o Cox II – Citocromo c oxidase II

o DNA – (Deoxyribonucleic acid) - Ácido desoxirribonucleico

o HIV – (Human Immunodeficiency Virus) – Vírus da Imunodeficiência

Humana

HIV-1 – Tipo 1

HIV-2 – Tipo 2

o mRNA – (messenger RNA) - RNA mensageiro

o miRNA – micro-RNA

o mtDNA – (mitochondrial DNA) - DNA mitocondrial

o non-pro-LK – (non-progressive leukoplakia) – Leucoplasia sem progressão

maligna

o NIH – National Institutes of Health

o OPL – (Oral premalignant lesion) – Lesão oral pré-maligna

o OSCC – (Oral squamous cell carcinoma) – Carcinoma Oral Escamoso

o pro-LK – (progressive leukoplakia)- Leucoplasia com progressão maligna

o PCR – (Polymerase Chain Reaction)- Reação de Polimerização em Cadeia

o RNA – (Ribonucleic acid) - Ácido ribonucleico


2

1. INTRODUÇÃO

O cancro oral é uma condição definida pela Classificação Internacional de

Doenças como o conjunto de neoplasias malignas que acometem qualquer

região da cavidade oral, desde os lábios à garganta, incluíndo as amígdalas e a

faringe. Mais de 90% destes tumores são designados de carcinomas, afetando

predominantemente o epitélio da mucosa oral. Os restantes estão associados a

outras formas mais raras de tumores, como é o caso dos linfomas, sarcomas e

melanomas. Adicionalmente, algumas neoplasias sistémicas como as que

ocorrem no pulmão ou mama, por exemplo, apresentam um elevado potencial

de metastização para a mandíbula, pelo que o papel do Médico Dentista se

demonstra essencial e priveligiado no diagnóstico desta condição. Atualmente,

o cancro oral encontra-se associado a elevados índices de mortalidade que se

devem, sobretudo, a um diagnóstico tardio devido a fatores associados quer ao

paciente, quer à sensibilidade do Médico Dentista na deteção e diagnóstico

destas lesões, bem como factores relacionados com a especificidade clínica

deste grupo de patologias. De acordo com alguns dados estatísticos

disponíveis, podemos constatar que o carcinoma da cabeça e do pescoço é o

sexto (6º) tipo de cancro mais comum e prevalente em todo o mundo,

correspondendo a aproximadamente 2,8% de todos os cancros detetados. Este

tipo de tumores tem maior incidência em indivíduos do sexo masculino, no

grupo etário acima dos 45 anos de idade, aumentando consideravelmente a

partir dos 65 anos. Como principais fatores de risco apontados para o

desenvolvimento desta condição patológica, podem ser citados alguns hábitos

como o alcoolismo e o tabagismo. Ambos possuem um efeito carcinogénico


3

marcado sobre as células epiteliais da mucosa oral, levando a transformações

celulares e tecidulares como são o caso das displasias, hiperplasias,

ulcerações e outras atipias celulares. Deste modo, é estimado que 8 em cada

10 doentes diagnosticados com cancro oral consumam ou tenham consumido

tabaco, tendo estes indivíduos um risco acrescido (5 a 7 vezes superior) de

virem a desenvolver esta patologia quando comparados com os não

fumadores. [1]

Apesar dos avanços conseguidos nos últimos anos no que concerne ao

diagnóstico e tratamento do cancro oral, este continua a demonstrar uma taxa

de mortalidade bastante elevada, sendo que 6 em cada 10 doentes portadores

desta condição patológica morrem nos 5 anos seguintes após a data do seu

diagnóstico. Este insucesso prende-se como já foi referido anteriormente com

um diagnóstico pouco precoce. Para contrariar esta tendência há que

sensibilizar os pacientes para uma ida periódica ao Médico Dentista, pelo

menos uma ou duas vezes por ano, bem como criar rastreios para a promoção

da saúde oral, e desenvolver ferramentas de diagnóstico mais eficazes.[2]

Segundo o National Institutes of Health (NIH), um biomarcador é um

indicador avaliado e quantificado, presente em mecanismos biológicos normais,

estando patentes também em processos patológicos ou através da resposta

farmacológica a uma terapêutica instituida. Através destas entidades, é

possível obter informação sobre o estado fisiológico de um organismo vivo.

Desta forma, os biomarcadores são considerados ferramentas valiosas na

deteção, avaliação do risco, diagnóstico, prognóstico e monitorização de uma

doença. Um biomarcador pode apresentar-se de diversas formas tais como

anticorpos, microrganismos, DNA, RNA, lípidos, metabolitos ou proteínas.[3]


4

Diversos estudos têm demonstrado que a saliva possui diversos

compostos moleculares e microbianos bastante indicativos do desenvolvimento

de patologias locais e sistémicas. Na sua composição 99% é água, 0,3%

proteínas e 0,2% substâncias inorgâncias. É um biofluido heterogéneo com um

pH levemente ácido (6.0-7.0). Além das muitas funções desempenhadas pela

saliva, esta contém inúmeras vantagens na sua utilização como potencial fonte

de biomarcadores quando comparada com o sangue, nomeadamente no seu

processo de recolha/colheita que é um processo não invasivo, não doloroso, de

fácil aplicação a quase todos os indivíduos em exames médicos que requeiram

a extração salivar. Adicionalmente, as amostras salivares são mais facilmente

manuseadas e armazenadas, não coagulam (como o sangue), é um

procedimento económico e pode ser efetuado por qualquer pessoa,

inclusivamente por auto-colheita. [3]


5

2. MATERIAIS E MÉTODOS

A Pubmed® foi a base de dados online selecionada para pesquisar os

artigos de interesse para a realização desta revisão bibligráfica. Como critérios

de inclusão foram validados os artigos publicados ao longo dos últimos 10 anos

que estabelecessem ligação entre a presença de lesões orais pré-malignas e

malignas e a aplicação de biomarcadores salivares no seu diagnóstico precoce.

Numa segunda fase da pesquisa, a procura da informação foi direcionada de

forma mais específica aos biomarcadores que neste trabalho são abordados

mais detalhadamente. Outras fontes de informação foram consultadas tais

como livros e trabalhos académicos abordando tópicos de interesse bem como

artigos publicados online pela revista de Medicina Dentária “Journal of

Dentistry”.


6

3. BIOFLUÍDO SALIVAR

O estudo de biomarcadores presentes nos fluídos orgânicos (saliva,

plasma sanguíneo, sémen e urina) de pacientes portadores de patologia

neoplásica bem como a sua aplicação para estabelecimento de um diagnóstico

clínico, tem-se revelado bastante útil e promissor pois revela a capacidade de

se poder identificar a partir destes a presença de alterações neoplásicas e,

sobretudo, de modo pouco ou mesmo não invansivo. A utilização destes

componentes com o intuito de detetar e diagnosticar precocemente lesões

neoplásicas surge, também, como uma alternativa à técnica da biópsia, que

constitui uma abordagem mais invasiva.[4]

Tabela I – Fluídos biológicos utilizados como ferramenta de estudo nos

diversos tipos de cancro. (Kulasingam, 2008)[5]


7

Atualmente, tendo em conta a tecnologia disponível, é possível obter

diversa informação clínica quanto ao estado de saúde oral e sistémica de um

indivíduo através da análise e avaliação de determinados componentes

biológicos presentes no fluído salivar. Como exemplo, já conseguiram ser

identificados em meio salivar uma quantidade considerável de analitos, desde

hormonas esteróides a anticorpos contra o HIV[6,7]. Desta forma, a saliva

apresenta-se como um biofluído com um elevado potencial de diagnóstico para

inúmeras condições patológicas, de entre as quais se podem destacar as

infeções provocadas pelos agentes víricos HIV-1, HIV-2, vírus da Hepatite A, B

e C.[8]

Tabela II – Componentes salivares com potencial de diagnóstico.

(Sandhu et al., 2011) [7]


8

A Tabela III a seguir apresentada resume o conjunto de mecanismos que

conduzem ao aparecimento de marcadores biológicos na saliva.

Marcadores Genéticos e Proteicos em Meio Salivar

De Origem Plasmática De Origem Local

o Secreção Salivar

o Difusão Passiva

o Transporte Activo

o Ultrafiltração ao nível das Junções

Celulares

o Fluído Crevicular

o Lise e Necrose Celulares

o Apoptose

o Factores Traumáticos

o Secreção Celular Activa

Tabela III – Mecanismos que determinam a presença de marcadores genotípicos e

fenotípicos na saliva. (Markopoulos et al., 2010)


9

4. IDENTIFICAÇÃO DE UM BIOMARCADOR

A aplicação na prática clínica de biomarcadores salivares como ferramenta

de diagnóstico precoce, isto é, para detetar uma lesão neoplásica de forma

atempada e que permita ao profissional estabelecer um quadro clínico correto e

assertivo com vista a oferecer ao paciente uma terapêutica mais ajustada e

com maior probabilidade de sucesso, exige que sejam desenvolvidos os meios

que permitam conhecer os marcadores específicos para a patologia em

questão. Assim sendo, estão atualmente em prática duas importantes correntes

de investigação nesta área, a proteómica e a genómica que estudam

respetivamente a utilização de proteinas e componentes genéticos salivares

como biomarcadores de interesse.[8,9] Estas análises têm por base a

interpretação inicial da expressão de uma proteina e do mRNA, para que se

possa observar as suas variações e inferir sobre a sua relevância para

determinar estados de saúde ou de patologia. Ambos os marcadores proteicos

e genéticos são úteis no fornecimento de informação, embora os proteicos,

sendo produtos finais de expressão genética têm maior potencial informativo

quanto ao efeito e progressão da doença.[10] Independentemente do tipo de

biomarcador que utilizemos, para este apresentar validade em termos de

diagnóstico deve cumprir um conjunto de pré-requisitos, entre os quais:

elevada especificidade e sensibilidade, fácil aplicação, capacidade de ser

incluido em protocolos estandardizados e ser informativo sobre os seus

resultados para o clínico.[11]


10

Para a deteção de biomarcadores proteicos, existem alguns métodos

conhecidos à disposição, entre os quais se podem destacar técnicas de

imunofluorescência, em que se associa um antigénio sinalizado com

fluorescência a um anticorpo formando um complexo (Atc-Atg), que ao ligar-se

à proteina de interesse, emite um sinal luminoso detetável. Outras alternativas

passam pelo uso da espectrometria de massa ou pela técnica de eletroforese

em gel de agarose. [12] Na análise que permite determinar o nível de expressão

dos genes salivares, poder-se-à recorrer à técnica de microarrays, técnica de

PCR (reação de polimerização em cadeia) aplicando a transcriptase reversa,

assim como a análise de DNA complementar (cDNA). [13]

Figura 1 – Métodos de investigação que permitem o estudo e a identificação de novos

biomarcadores cancerígenos. (Kulasingam, 2008)


11

5. MICRO-RNAS COMO BIOMARCADORES NO CANCRO ORAL

De uma forma genérica, os micro-RNAs (miRNAs) constituem uma

subclasse de pequenos RNA não codificantes que podem possuir em média

cadeias de 18 a 25 nucleótidos de extensão. Estes elementos participam na

regulação da expressão génica através da sua ligação e afinidade a mRNAs

(RNAs mensageiros) específicos. Intervêm não só em processos

fisiológicos, mas também em processos patológicos como no caso da

carcinogénese, através de mecanismos de regulação da tradução de

oncogenes e genes supressores tumorais. De acordo com estudos

desenvolvidos e publicados ao longo dos últimos anos, tem-se vindo a

constatar o seu papel nos processos de proliferação celular, diferenciação

e regulação da apoptose. Desta forma, sabe-se que estes componentes

genéticos vão ser capazes de regular e controlar a tradução proteica

promovendo a degradação dos mRNA alvo. Em adição, segundo

Vasudevan et al., 2007 é conhecido um grupo considerável de micro-RNAs

que vão estimular a tradução de mRNAs quando determinados requisitos e

condições celulares estejam reunidos.[14]

No que respeita ao cancro oral, foi demonstrado que os miRNAs

controlam tanto o seu processo de proliferação celular (Selcuklu et al.,

2009) como o seu mecanismo de apoptose celular (Wong et al., 2008).

Além disso, consoante o tipo de tecido celular em que se encontra, pode

apresentar alterações no que concerne ao seu armazenamento ou grau de

expressão (Jiang et al., 2005). Quanto à sua deteção no fluído salivar, esta


12

é possível pois os miRNAs podem passar diretamente para a saliva a partir

do microambiente tumoral local ou, por outro lado, contidos em vesículas

exossomais a partir da lesão tumoral, as quais impedem a sua degradação

enzimática pelas RNAses ao longo do transporte extracelular (Valadi et

al.,2007; Palanisamy et al.,2010). Em tumores distantes, a saliva constitui

também um bom meio para se isolar os miRNAs tumorais pois estes são

enviados para a corrente sanguínea que por sua vez os conduz para as

glândulas salivares, sendo posteriormente enviados para o meio salivar

através dos ácinos. Os miRNAs devem ser encarados como oncogenes

quando a sua expressão estiver manifestamente aumentada num dado

tumor e sempre que este aumento se traduza num

aceleramento/progressão do processo carcinogénico. Estes micro-RNAs

oncogénicos promovem o desenvolvimento tumoral intervindo de 2 formas:

inibição de genes supressores tumorais ou inibição de genes que controlam

a diferenciação celular ou apoptose.[15,16,17]

No caso do carcinoma oral de células escamosas, estão envolvidos

determinados tipos específicos de miRNAs, entre os quais o miR-125a, o

miR-200a e o miR-31, sendo que os dois primeiros são observados em

níveis mais baixos e o último com expressão acentuada nesta condição

patológica (Park et al.,2009; Liu et al.,2010). A sobreexpressão de mIR-31

na saliva está patente inclusivamente em pequenos tumores e pode ser

detetada em todos os estadios clínicos em pacientes portadores de

carcinoma oral. Em comparação com outros fluidos orgânicos como o

plasma sanguíneo, verificou-se que é um biomarcador com maior

sensibilidade para o diagnóstico de condições orais malignas pois está


13

presente de forma mais abudante na saliva que no plasma. Foi possível

notar igualmente que a quantidade de mIR-31 na saliva diminuiu

significativamente após recorrer à cirurgia de excisão do carcinoma, o que

sugere que a sua expressão é regulada essencialmente pelos tecidos

tumorais.[10,13] Segundo testes levados a cabo por Momen-Heravi et al.,

foram avaliados mais de 700 tipos de miRNAs de amostras salivares de

indivíduos portadores de carcinoma oral, em que 13 desses estavam

diferencialmente expressos em comparação com grupos controlo que não

possuiam a referida patologia. Nos 13 miRNAs com alteração da sua

expressão, 11 deles estavam inativos e os restantes 2 estavam

significativamente expressos ( miRNA-24, miRNA-27b).[18]


14

5.1. DETEÇÃO DE LESÕES ORAIS POTENCIALMENTE MALIGNAS

De entre as neoplasias malignas mais conhecidas e que afetam a região

da cabeça e pescoço podemos referenciar o carcinoma oral de células

escamosas, conhecido por causar uma marcada morbilidade e de

características agressivas. Aproximadamente 16 a 62% destes carcinomas

desenvolvem-se a partir de lesões consideradas potencialmente malignas

como é o caso das eritroplasias e das leucoplasias[19]. As eritroplasias

apresentam-se clinicamente segundo um padrão avermelhado enquanto que

nas leucoplasias este padrão é esbranquiçado.[19] Normalmente a avaliação do

risco de progressão, isto é, de malignização de uma leucoplasia da cavidade

oral, é estabelecido por observação clínica por parte do Médico Dentista e

através de testes histopatológicos ao material biopsado. Para caracterizar o

grau de alteração morfológica de um tecido, ou seja, o grau de displasia celular

numa dada lesão, podemos categorizar segundo quatro estadios por ordem

crescente de atipia, e são estes: Displasia Epitelial de Grau Baixo, Displasia

Epitelial de Grau Moderado, Displasia Epitelial de Grau Elevado e Carcinoma in

Situ. Estas duas últimas formas são as que constituem maior risco de progredir

para patologia invasiva (metastização), por outro lado, as displasias de baixo

grau podem manter-se estáveis durante anos ou até mesmo desaparecer. No

entanto, uma pequena proporção delas evolui para carcinoma.


15

Num estudo levado a cabo por Yang et al com o propósito de compreender

a importância dos miRNAs salivares como biomarcadores no processo de

transformação maligna de leucoplasias orais, recorreu-se à análise de

Figura 2 – Estadios da transformação cancerígena de uma lesão do ponto de vista histológico.

Mucosa Normal, Hiperplasia (aumento do número celular), Displasia (alteração da arquitetura tecidular),

Carcinoma in Situ e Carcinoma Invasivo (metastização), respetivamente. (Franky et al., 2011)

Figura 3 – Cortes histológicos da evolução de uma leucoplasia oral até à formação de um

carcinoma de células escamosas. (A) Displasia epitelial de baixo grau; (B) Displasia epitelial de

grau moderado; (C) Displasia epitelial de alto grau; (D) Carcinoma In Situ; (E) Carcinoma de

células escamosas invasivo. (Yang et al., 2013)


16

leucoplasias com displasia de baixo grau e com diagnóstico histopatológico

similar, porém com aspectos clínicos diferenciados. Foram classificadas em

dois subgrupos: leucoplasias com transformação maligna e sem transformação

maligna. Para tal, foi utilizada uma amostra inicial de 45 pacientes com

diagnóstico de leucoplasia com displasia de baixo grau. Desta amostra, 10

pacientes desenvolveram carcinoma in situ ou carcinoma de células

escamosas após uma média de cerca de 30,1 meses da determinação do

diagnóstico inicial, sendo 2 destes afastados do estudo por fraca qualidade do

RNA obtido. Dos restantes 35 que não desenvolveram carcinoma, 12 foram

excluídos do estudo por ocorrência de novas lesões e outros 5 também foram

excluídos devido à fraca qualidade do RNA obtido. Dos 8 indivíduos restantes

que desenvolveram carcinoma, 7 deles que permaneceram entre 3-5 anos em

observação clínica com displasia de baixo grau foram selecionados para se

identificar as diferenças ocorridas na expressão de miRNA com as respetivas

lesões pré-malignas. Igualmente foram colhidas amostras salivares de 7

controlos saudáveis para aferir a expressão normal de miRNA salivar. Para

avaliar a expressão de miRNA foram escolhidos 8 marcadores (mIR-10b, mIR-

145, mIR-99b, mIR-708, mIR-181c, mIR-30e, mIR-660 e mIR-197) cuja

produção se encontra significativamente alterada em leucoplasias com

transformação maligna em comparação com aquelas que não apresentaram

transformação. Constatou-se que o mIR-10b, mIR-660, mIR-708 e o mIR-30e

estavam marcadamente expressos em leucoplasias com transformação

maligna, antagonicamente o mIR-145, mIR-99b, mIR-181c e o mIR-197

encontravam-se menos ativos neste tipo patológico.[20]


17

Foi ainda possivel de acordo com os dados obtidos sobre os miRNAs

constantes nas amostras salivares dos indivíduos com lesão oral pré-maligna

(leucoplasia), que a sua expressão era diferenciada comparativamente à das

amostras tecidulares recolhidas. Verificou-se então que estes miRNAs afetados

estavam presentes na saliva embora em quantidades muito mais baixas,

contudo com padrões de diferenciação concordantes com os das amostras

tecidulares.[20] Em seguida é apresentada uma tabela (Tabela III) que regista as

alterações encontradas ao nível da expressão dos respetivos marcadores de

miRNA nas duas formas leucoplásicas.

Figura 4 – Nível relativo de expressão salivar de alguns miRNAs em 3 grupos de estudo: grupo controlo – sem

patologia (control); grupo de pacientes com leucoplasia sem progressão maligna (non-pro-LK); grupo de

pacientes com leucoplasia de progressão maligna (pro-LK). (Yang et al., 2013)


18

De acordo com Cervigne et al, existem 3 marcadores de micro-RNA que

estão fortemente associados com o aumento do grau de malignidade de uma

lesão, e são estes: mIR-181b, mIR-21 e mIR-345. (Vêr Figura 5, página 18)

Leucoplasias com progressão

maligna

Leucoplasias sem progressão

maligna

miRNAs com expressão

aumentada (+)

mIR-10b

mIR-708

mIR-30e

mIR-660

mIR-19a

mIR-26a

mIR-181c

mIR-197

mIR-99a/b

mIR-145

miRNAs com expressão

diminuida (-)

mIR-99b

mIR-197

mIR-145

mIR-181c

mIR-708

mIR-181c

Tabela IV – Expressão de alguns miRNAs em amostras salivares de indivíduos portadores de leucoplasia

oral com progressão maligna e sem progressão maligna em comparação com o observado em amostras

salivares de indivíduos saudáveis. (Yang et al., 2013)


19

Figura 5 – Relação entre o aumento da expressão de mIR-181b, mIR-21 e mIR-345 com o

grau de transformação maligna de uma lesão oral. (NP: amostras sem progressão maligna

da lesão, seguindo-se amostras com progressão maligna da lesão em diferentes estadios de

displasia celular (Queratose, Displasia Ligeira, Displasia Moderada, Displasia Severa e

Carcinoma Oral Escamoso). (Cervigne et al., 2009)


20

6. ACTINA E MIOSINA COMO BIOMARCADORES EM LESÕES PRÉ-MALIGNAS E MALIGNAS

Existem atualmente diversos tipos de componentes proteicos estudados

com o objetivo de no futuro poderem vir a ser validados e aplicados como

marcadores de células tumorais. Entre estes estão a miosina e a actina,

proteínas estas de origem intra-celular que apresentam uma estreita ligação do

ponto de vista funcional na célula. Estas duas proteínas integram os filamentos

que compõem o citosqueleto celular, estrutura que confere a forma/morfologia

da própria célula, participa da manutenção das junções celulares bem como de

todos os seus movimentos. Deste modo, a actina e a miosina são consideradas

proteinas-chave nos processos de motilidade e invasão celulares.[21,22]

Num estudo publicado em 2010 por De Jones et al., este apresentou a

miosina e a actina como biomarcadores salivares promissores na deteção

específica de lesões orais pré-malignas e malignas. Como metodologia de

investigação, recolheram 12 amostras salivares de indivíduos portadores de

lesões orais pré-malignas e outras 12 de indivíduos com lesões orais malignas.

Os valores de sensibilidade e especificidade para diferenciar estes dois

estadios lesionais foram respetivamente 100% e 75% (p=0,002) para a actina e

de 67% e 83% para a miosina (p<0.0001). A actina e a miosina foram passíveis

de serem detetadas no fluído salivar uma vez que a identificação de células

epiteliais exfoliadas da cavidade oral, mais especificamente provenientes do

local da lesão, também foram encontradas na saliva. A predominância destas

células epiteliais em meio salivar é explicada pelo fato de toda a saliva em

contato direto com a lesão oral levar a um aumento da probabilidade de serem


21

detetadas proteínas provenientes quer de lesões orais pré-malignas ou

malignas. Assim, os autores partiram do pressuposto que as alterações na

expressão destas duas proteínas na saliva poderiam estar associadas à

progressão do grau de malignização das referidas lesões, sendo que a

quantidade relativa destas duas proteínas nas células epiteliais exfoliadas

presentes na saliva poderia refletir o que ocorre ao nível celular no local da

lesão. Efetivamente o que foi observado neste estudo foi que ambas as

proteínas, actina e miosina, aumentaram de forma clara as suas quantidades

comparativamente com os seus níveis normalizados, sendo que o aumento foi

mais significativo nas lesões orais malignas do que nas lesões pré-malignas.

Estes resultados permitiram aos investigadores concluir que o que ocorre na

saliva para a miosina e a actina é uma consequência direta do que se verifica

nas células afetadas da lesão. Foi ainda referido no estudo que não foi

registado qualquer aumento do número de células epiteliais exfoliadas na

saliva de indivíduos com lesões malignas em comparação com as da saliva de

indivíduos com lesões orais pré-malignas.[23] (Figura 6)

Outros estudos publicados suportam os resultados obtidos por De Jong et

al. mencionando um expressivo aumento na quantidade de isoformas de actina

em experiências in vitro para observar o processo de migração de células

tumorais, tal como em carcinomas de células escamosas invasivos da cavidade

oral.[24,25]


22

No caso da actina, a sua função é regulada por uma proteína da família

das gelsolinas, a CapG, que está presente principalmente ao nível do citosol e

das mitocôndrias. Sendo uma proteína de ligação à actina, vai interferir na

organização desta ao nível dos filamentos do citosqueleto, o que se repercutirá

nas funções celulares em que intervém o citosqueleto.[26] Existem no entanto

evidências do papel oncogénico da CapG indicando o seu envolvimento no

controlo da migração e invasão celulares.[27] Para comparar a expressão de

CapG presente entre lesões orais pré-malignas com a existente em OSCCs,

Nomura et al., recolheu amostras tecidulares tanto de leucoplasias como de

Figura 6 – Diagramas de caixa com os dados obtidos da análise dos níveis relativos de

actina e miosina encontrados em lesões orais pré-malignas e malignas. (A)- Níveis

relativos de actina observados na saliva; (B) – Níveis relativos de miosina observados na

saliva; (C) – Níveis relativos de actina detetados nas células afetadas pela lesão; (D)- Níveis de

miosina detetados nas células afetadas pela lesão. (De Jong et al., 2010)


23

carcinomas orais. Aplicando a técnica de imunohistoquímica, observou-se uma

expressão aumentada desta proteína em 52% dos casos de carcinoma oral no

estadio primário e em 64% dos casos de leucoplasia oral nas respetivas

amostras. Como fator de calibração foram ainda obtidas amostras tecidulares

de mucosa oral normal que revelaram quantidades mínimas ou mesmo

ausência total de expressão de CapG, sendo estas consideradas CapG-

negativas.[28]

Analisando os dados da figura 7, conclui-se que a expressão de CapG é

significativamente mais elevada nas amostras de tecido tumoral com

estadiamento mais avançado (T3 e T4) comparativamente ao observado nas

amostras de tecidos procedentes de lesões orais pré-malignas, neste caso, de

leucoplasias.[28] Apesar de neste estudo as amostras não serem de origem

salivar mas de origem tecidular e decorrente de não terem sido encontrados

Figura 7 – Percentagem de expressão de CapG por imunoreação nas diversas

amostras estudadas. OPLs: Lesões orais pré-malignas; OSCCs: Carcinoma oral de

células escamosas (Estadios – T1, T2, T3 e T4). (Nomura et al., 2008)


24

estudos que abordassem a expressão desta proteína no meio salivar, seria

importante investigar a existência da CapG na saliva e, no caso da sua

identificação neste fluído, verificar se a expressão salivar traduz o

comportamento observado nos tecidos afetados com vista à sua validação

como novo biomarcador salivar tumoral.


25

7. DNA MITOCONDRIAL COMO BIOMARCADOR EM LESÕES ORAIS

PRÉ-MALIGNAS E MALIGNAS

As mitocôndrias são componentes celulares que produzem e fornecem a

energia necessária para que possam ocorrer os processos que permitem a

manutenção das funções da própria célula. É por intermédio de um conjunto de

reações de fosforilação oxidativa que é principalmente gerado o ATP

necessário ao funcionamento dos mecanismos celulares. Num estudo

publicado (Porporato et al.,2014), foi demonstrado que o processo de

fosforilação oxidativa intervém na regulação da transformação cancerígena.[29]

O sistema de reações que

permite a fosforilação oxidativa

encontra-se distribuído em 5

complexos proteicos (I-V),

sendo que alguns dos seus

componentes são codificados

pelo mtDNA.[30] Este DNA

mitocondrial consiste numa

molécula de 16.5 kb, de dupla

cadeia e com apresentação

circular, sendo que é transmitido apenas por via materna. Algumas mutações

ao nível deste DNA como, por exemplo, deleções génicas ou diferenças quanto

ao número de cópias está relacionado com o aparecimento de diversos tipos

de cancro. Por norma, a disfunção mitocondrial está presente em tumores

agressivos e de rápida progressão.[31,32]

Figura 8 – DNA mitocondrial (Phillips et al.,2014)


26

O DNA mitocondrial é passível de ser identificado e isolado em amostras

de fluídos biológicos nomeadamente a partir da saliva.[33] Tendo em conta este

facto, existem estudos que procuraram correlacionar a sua presença na saliva

com o desenvolvimento de carcinoma oral escamoso. De acordo com dados

apresentados, foram detetadas células exfoliadas em meio salivar provenientes

de epitélio de carcinoma oral de células escamosas através de mutações no

DNA mitocondrial.[34,35] Observou-se, entretanto, que este DNA mitocondrial

mutado estava patente em 46% de todos os tumores de cabeça e pescoço e

em 67% dos casos de carcinoma oral de células escamosas diagnosticados a

partir de amostras salivares.[33]

Noutra investigação, foram submetidos a estudo 2 genes específicos do

mtDNA, nomeadamente o Cox I e Cox II (genes que codificam para a citocromo

c oxidase I e II respetivamente) por técnica de quantificação em PCR. Para tal

foram recolhidas amostras salivares de 94 indivíduos com quadro de carcinoma

oral de células escamosas e, em seguida, foi estabelecido um grupo controlo

de 656 indivíduos sem a referida patologia. O que se assistiu foi a um aumento

notório dos níveis médios de Cox I e Cox II nas amostras salivares dos

pacientes portadores de carcinoma, como se pode confirmar pelos resultados a

seguir representados na Tabela IV .[36]


27

Quando se comparou a quantidade de mtDNA salivar expresso com a

evolução do estadiamento tumoral, isto é, numa fase inicial e avançada do

desenvolvimento cancerígeno, o que se pode constatar foi que o DNA

mitocondrial (Cox I e Cox II ) aumentou consideravelmente a sua expressão na

saliva com o aumento do grau de transformação maligna da lesão.[36]

(Observar resultados na Tabela V)

Grupo com Carcinoma Oral

em Estadio Inicial

(Estadios I e II)

Grupo com Carcinoma Oral

em Estadio Avançado

(Estadios III e IV)

Níveis médios de Cox I

0,048 [0,03-0,07]; IC=95%

þ = 0,03

0,086 [0,07-0,11]; IC=95%

þ = 0,03

Níveis médios de Cox II

0,029 [0,02-0,04]; IC=95%

þ = 0,04

0,063 [0,05-0,08]; IC=95%

þ = 0,04

Grupo com Carcinoma

Oral

Grupo

Controlo

Níveis médios de Cox I

0,076 [0,06-0,09]; IC=95%

þ < 0,0001

0,054 [0,05-0,06]; IC=95%

þ < 0,0001

Níveis médios de Cox II

0,055 [0,04-0,07]; IC=95%

þ < 0,0001

0,046 [0,04-0,05]; IC=95%

þ < 0,0001

IC: Intervalo de Confiança; þ: nível mínimo de significância

Tabela V - (Jiang et al., 2005)

IC: Intervalo de Confiança; þ: nível mínimo de significância

Tabela VI – (Jiang et al., 2005)


28

Figura 10 – Diagrama de Pontos com a dispersão de

valores registados para os níveis de Cox II salivar nos

estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do

desenvolvimento de carcinoma oral (Jiang et al., 2005)

Figura 9 – Diagrama de Pontos com a dispersão de

valores registados para os níveis de Cox I salivar nos

estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do

desenvolvimento de carcinoma oral (Jiang et al., 2005)


29

Tendo em conta os dados disponibilizados por este estudo, pode-se

facilmente perceber a existência de uma relação clara entre o grau de

desenvolvimento tumoral e o nível de expressão de mtDNA encontrado na

saliva. Para determinar o grau de relação entre os níveis de mtDNA (Cox I e II)

encontrados na saliva e no tecido do tumor primário, Jiang et al. aplicou o teste

de correlação de Pearson, teste este que mede a força de associação entre 2

variáveis. Os resultados obtidos demonstraram a presença de uma correlação

positiva aceitável entre a quantidade de mtDNA registado na saliva e no tecido

do tumor primário, traduzidos pelos valores apresentados na Tabela VI.[36]

Teste de Pearson

Correlação entre os níveis

identificados na saliva e no tecido

do tumor primário

Cox I

r = 0,30

þ = 0,005

Cox II

r = 0,33

þ = 0,002

Tabela VII – (Jiang et al., 2005)

r : coeficiente de correlação de Pearson ( r = 1: correlação perfeita; 0 < r <1: correlação positiva;

r = 0: correlação nula; -1 < r < 0: correlação negativa); þ: nível mínimo de significância


30

8. CONCLUSÃO

O diagnóstico atempado do cancro oral resulta de um conjunto de fatores,

alguns deles alheios ao próprio Médico Dentista. Atualmente, sabe-se que

cerca de 60% dos pacientes com cancro oral morrem ao fim de 5 anos após

este diagnóstico.[2] Segundo a American Cancer Society, se estes tumores

fossem detetados em estadios iniciais do seu desenvolvimento, a taxa de

sobrevivência a 5 anos poderia aumentar até 83%.[37] Como tal, é importante

dar continuidade ao estudo de novas técnicas de diagnóstico que permitam

obter resultados cada vez mais informativos e confiáveis. Neste trabalho foi

avaliada a aplicação de três tipos diferentes de marcadores salivares, o caso

dos miRNAs da classe dos RNAs, a miosina/actina e a CapG da classe das

proteínas bem como o mtDNA da classe dos DNAs, sendo que os resultados

associados a cada um deles são, de um modo geral, bastante promissores.

A aplicação de biomarcadores salivares na deteção precoce do cancro oral

assume deste modo um papel fulcral no prognóstico desta condição patológica.

Assim, seria de enorme utilidade a sua implementação regular na área da

Medicina Dentária associada à técnica convencional da biópsia para uma maior

asserção e confiança nos diagnósticos elaborados. Apesar de algumas

limitações atuais, é de prever que num futuro próximo com a evolução da

biotecnologia médica, possam vir a ser aplicados como único método não-

invasivo de diagnóstico do cancro oral em substituição da biópsia.


31

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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34

10. ANEXOS

I. Declaração de Autoria do Trabalho Apresentado

II. Parecer do Orientador


35

ANEXO I


36


37

ANEXO II


38

avaliação da aplicação de iomarcadores salivares no ... · fumadores. [1] apesar dos avanços...

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