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Ana Carolina Fritz Ratayczyk
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DO IBUPROFENO UTILIZANDO Euglenas gracilis
E Daphnia magna
JOINVILLE, SC
2019
ANA CAROLINA FRITZ RATAYCZYK
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DO IBUPROFENO UTILIZANDO Euglenas gracilis
E Daphnia magna
Dissertação de mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Saúde e
Meio Ambiente da Universidade da Região
de Joinville – Univille. Orientador:
Professor Dr. Gilmar Sidnei Erzinger.
JOINVILLE
2019
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, que ilumina meus passos e acalma minha alma nos
momentos de exaustão;
A minha querida família, meu pai e minha mãe, pela paciência e pelo companheirismo,
e a minha irmã Stefany por todo o incentivo;
Ao meu namorado Daniel pelo apoio incondicional e por compreender minha ausência
durante este período de estudo;
A Universidade da Região de Joinville – Univille, pela oportunidade de expandir meus
conhecimentos e realizar minha contribuição para a ciência;
Ao professor Ph.D. Gilmar Sidnei Erzinger, por me aceitar como orientanda no
Mestrado em Saúde e Meio Ambiente, da Universidade da Região de Joinville;
Ao professor Dr. Luciano Henrique Pinto pela paciência e por me ceder seus
conhecimentos para contribuir com este trabalho com sua vasta experiência;
A amiga e analista de laboratórios da Univille Aline Scheller por alegrar minhas noites
de estudo e pela ajuda com os testes;
A Cooperativa de Abastecimento do Vale do Itajaí – Cooper, minha supervisora
Eduarda e minha equipe de trabalho pelo incentivo e seus desdobramentos de horário
para que eu pudesse dispor de tempo para a realização deste projeto;
A todos que contribuíram de alguma forma para a execução desta dissertação.
“Quando um trem passa por um túnel e escurece,
você não joga fora o bilhete e pula fora. Você fica
parado e confia no engenheiro. Assim você confia
nos planos de Deus.” TEN BOON, CORRIE. Do livro
O Refúgio Secreto.
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE SIGLAS
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................14
1.1 OBJETIVOS.........................................................................................................16
1.1.1 OBJETIVO GERAL............................................................................................16
1.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................16
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................17
2.1 Recursos hídricos e a questão da contaminação............................................17
2.1.1 A água como recurso.........................................................................................17
2.1.2 Contaminação dos recursos hídricos Brasileiros................................................17
2.2 O meio aquático e a questão dos medicamentos...........................................19
2.2.1 Os medicamentos como poluentes emergentes................................................19
2.3 O Ibuprofeno como contaminante.....................................................................22
2.3.1 Ibuprofeno..........................................................................................................22
2.4 Métodos de remoção de contaminantes...........................................................24
2.5 Ecotoxicidade.....................................................................................................24
2.5.1 Ecotoxicologia como ferramenta.......................................................................24
2.5.1 Importância dos testes de ecotoxicidade...........................................................25
2.5.2 Tipos de testes de toxicidade ambiental: avaliação além da letalidade............26
2.6 Organismos utilizados como biomarcadores..................................................26
2.6.1 Daphnia magna..................................................................................................27
2.6.2 Euglena gracilis .................................................................................................28
3 METODOLOGIA.....................................................................................................30
3.1 Local de desenvolvimento da pesquisa...............................................................30
3. 2 Delineamento do Estudo.....................................................................................30
3.3 Preparação das soluções......................................................................................30
3.4 Análise com Euglena gracilis.................................................................................30
3.4.1 Preparação da amostra.........................................................................................30
3.4.2 Organismos e manutenção................................................................................31
3.4.3 Teste de alterações comportamentais das algas pelo biomonitoramento via NG-
TOX............................................................................................................................33
3.4.4 Teste de eficiência fotossintética no PAM.........................................................34
3.4.5 Teste de teor de clorofila...................................................................................36
3.5 Teste de toxicidade agudo com Daphnia sp.........................................................37
3.5.1 Teste crônico .....................................................................................................38
4 ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS..........................................................................40
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................40
5.1 Avaliação dos parâmetros fisiológicos e fotossintéticos das algas E.
gracilis.......................................................................................................................41
5.1.1 Avaliação dos parâmetros fisiológicos das algas E. gracilis......................41
5.1.2 Rendimento Fotossintético............................................................................43
5.2 Determinações das concentrações de clorofila frente à exposição ao
ibuprofeno.................................................................................................................46
5.3 - Avaliação dos efeitos ecotoxicológicos por Daphnia magna......................47
5.3.1 Teste de atividade aguda................................................................................47
5.3.2 Testes de avalição dos efeitos crônicos ......................................................48
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................................51
REFERÊNCIAS
RESUMO
A preocupação com a qualidade dos recursos hídricos disponíveis no planeta
vem crescendo nos últimos tempos, teme-se que a velocidade de despejo de resíduos
possa superar a capacidade de renovação e recuperação deste recurso. Com o
crescente uso de medicamentos entre a população, aumenta também o seu descarte,
possibilitando a chegada de mais variadas formas destes produtos nos ambientes
aquáticos. No contexto atual de fármacos que se tornaram agentes poluidores do meio
aquático, é importante que sejam avaliados os impactos ambientais causados por
estes. Estudos que avaliem estes riscos através de testes com organismos vêm
merecendo atenção, para avaliar futuros possíveis prejuízos e alterações ambientais
significativas, e termos a chance desenvolver e avaliar métodos de remoção destes
contaminantes. Este estudo objetivou verificar as alterações comportamentais de
Daphnia magna, assim como utilizar Euglena gracilis para avaliação de diversos
parâmetros que podem ser afetados por contaminantes. Na presença de luz saturante,
cultura de algas expostas a ibuprofeno sofreram mudanças na atividade fotossintética.
Tais resultados apontam para alterações que podem ser utilizadas para
biomonitoramento ambiental. Houve um aumento fisiológico da gravitaxia e do senso
de orientação das algas. O rendimento fotossintético foi variável dependendo da
concentração do ibuprofeno, sendo que acima de 150 mg/L a produção de clorofila
foi induzida. Os testes crônicos para Daphnia magna, resultaram em uma LC50: 14,5
mg/L demonstrando que a sensibilidade deste organismo é maior para este
contaminante do que o já descrito na literatura para outros organismos utilizados como
bioindicadores. A concentração de efeito não observado (NOEC) calculado do
ibuprofeno em testes crônicos de D. magna foi de 3,27 mg/L e concentração de efeito
observado (LOEC) de 11,71 mg/L. A concentração estimada de Ibuprofeno que atinge
o máximo número de filhotes em testes crônicos de D. magna foi de 3,43 mg/L. A
concentração de Ibuprofeno acima de 14,5 mg/L causa 100% de letalidade. Tais
resultados apontam para alterações que podem ser utilizadas para biomonitoramento
ambiental.
PALAVRAS-CHAVE: Poluição emergente, ibuprofeno, alterações na fotossíntese,
mudanças no comportamento
ABSTRACT
Concern about the quality of water resources available on the planet has been
growing in recent times, it is feared that the speed of waste disposal may exceed the
capacity for renewal and recovery of this resource. With the increasing use of drugs
for the population, it also increases its disposal, allowing the arrival of more varied
forms of these products in aquatic environments. In the current context of drugs that
have become agents that pollute the aquatic environment, it is important that the
environmental impacts caused by them are evaluated. Studies that evaluate these
risks through tests with organisms has been deserving attention, to evaluate future
possible damages and significant environmental alterations, and we have the chance
to develop and evaluate methods of removal of these contaminants. This study
investigated the behavioral changes of Daphnia magna, as well as to use Euglena
gracilis for evaluation of several parameters that can be affected by contaminants. In
the presence of saturating light, culture of algae exposed to ibuprofen underwent
changes in photosynthetic activity. These results point to changes that can be used for
environmental biomonitoring. There was a physiological increase of gravitaxy and the
sense of orientation of algae. The photosynthetic yield was variable depending on the
concentration of ibuprofen, and above 150 mg/L chlorophyll production was induced.
Chronic tests for Daphnia magna resulted in an LC50: 14,5 mg/L demonstrating that
the sensitivity of this organism is greater for this contaminant than that already
described in the literature for other organisms used as bioindicators. The calculated
non observed effect concentration (NOEC) of ibuprofen in chronic D. magna tests was
3,27 mg/L and observed effect concentration (LOEC) of 11,71 mg/L. The estimated
concentration of Ibuprofen that reaches the maximum number of pups in chronic D.
magna was 3,43 mg / L. The concentration of Ibuprofen above 14,5 m/L causes 100%
lethality. These results point to changes that may be used for biomonitoring.
KEY WORDS: Emerging pollution, ibuprofen, changes in photosynthesis, changes in
behavior
LISTA DE TABELAS
Tabela 2. Nível de toxicidade para cada um dos 11 produtos farmacêuticos sob
investigação, com base nos resultados de EC50 de Hydra attenuata utilizando a
classificação da comissão da UE 93/67 / EEC............................................................22
Tabela 3. Número médio de filhotes por dia (média) de Daphnia magna expostos a diferentes concentrações de Ibuprofeno (mg/L)........................................................49
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Concentrações máximas dos contaminantes emergentes determinados em
águas de abastecimento público no Brasil de acordo com os dados apresentados na
Tabela 1S. A linha vermelha destaca a concentração de 100 ng L-1, a partir da qual
pode haver risco ao ser humano. MONTAGNER et al,
2017...........................................................................................................................18
Figura 2. Ciclo percorrido pelo medicamento até chegar à água utilizada pela
população...................................................................................................................21
Figura 3. Aumento do consumo de Ibuprofeno na rede pública de uma cidade de São
Paulo..........................................................................................................................23
Figura 4. Imagem de uma Daphnia magna...............................................................29
Figura 5. Imagem do corpo de uma Euglena gracilis................................................30
Figura 6. Ilustração das culturas de E. gracilis nas diferentes concentrações de
Ibuprofeno..................................................................................................................32
Figura 7. Imagem das cepas armazenadas em ambiente controlado. Fonte: arquivo
pessoal da pesquisadora...........................................................................................32
Figura 8. Imagens do software que analisa as algas em tempo real. Fonte: arquivo
pessoal da pesquisadora............................................................................................34
Figura 9. Imagens do sistema do software que analisa as algas em tempo real. Fonte:
arquivo pessoal da pesquisadora...............................................................................35
Figura 10. Aparelho utilizado para fazer os testes PAM. Fonte: arquivo pessoal da
pesquisadora..............................................................................................................36
Figura 11. Processo de filtração para extração da clorofila. Foto: arquivo pessoal da
pesquisadora.............................................................................................................37
Figura 12. Ilustração da preparação das amostrar para o teste agudo com D.
magna.........................................................................................................................38
Figura 13. Amostras de D. magna prontas para o teste crônico. Fonte: Arquivo pessoal
da pesquisadora.........................................................................................................39
Figura 14 - Inibição (-) ou ativação (+) dos efeitos de diferentes concentrações de
ibuprofeno nos parâmetros de movimento e orientação de E. gracilis em ensaios
agudos. Cada ponto de dados representa a média de três medições independentes.42
Figura 15. Inibição (-) ou ativação (+) dos efeitos de diferentes concentrações de
ibuprofeno nos parâmetros de movimento e orientação de E. gracilis em ensaios
crônicos de 45 dias. Cada ponto de dados representa a média de três medições
independentes............................................................................................................43
Figura 16. Efeitos do ibuprofeno na eficiência fotossintética de E. gracilis com
aumento da intensidade luminosa em ensaios agudos. Cada ponto de dados
representa a média de três medições independentes.................................................45
Figura 17. Efeitos do ibuprofeno na eficiência fotossintética de E. gracilis com
aumento da intensidade luminosa em ensaios crônico de 45 dias. Cada ponto de
dados representa a média de três medições independentes......................................46
FIGURA 18. Concentração de clorofila 45 dias após a adição do
Ibuprofeno..................................................................................................................47
Figura 19. Mortalidade de Daphnia magna obtida em testes agudos utilizando a
amostra de Ibuprofeno. Os testes foram realizados em dez concentrações de quatro
repetições, contendo cinco organismos por repetição, a concentração letal (LC50) foi
de 34,91mg/L. (r2 = 0,9827, p =
<0,0001))....................................................................................................................48
Figura 20. número médio de filhotes de Daphania magna em ensaios em triplicata,
em testes crônicos sob diferentes concentrações de ibuprofeno (r2: 0,9990;
p>0,001).....................................................................................................................50
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT - Associação Brasileira de NormasTécnicas
ANOVA – Técnica univariada que trata dados quantitativos em relação a uma variável
independente categórica de três níveis.
CCD – Charged compled devise
ETR – Taxa de Transporte de Elétrons.
EU – União Europeia.
IBP. Ibuprofeno
ISO - International Organization for Standardization.
NG TOX – New Generation Toxicology - Ferramenta de biomonitoramento em tempo
real.
PAM – Pulse Amplification Modulation – Fluorímetro de amplitude de pulso modulada
pH – Potencial de hidrogênio iônico.
YIELD – Eficiência fotossintética
15
INTRODUÇÃO
A preocupação com a qualidade dos recursos hídricos disponíveis no planeta
vem crescendo nos últimos tempos, pois apesar da abundância deste recurso – tido
ainda como renovável, teme-se que a velocidade de despejo de resíduos – muitos
deles tóxicos - possa superar a capacidade de renovação e recuperação deste
recurso, podendo torná-lo insuficiente para atender as necessidades humanas
adequadamente (PINTO et al, 2016).
Atualmente, além de uma infinidade de compostos já comprovadamente
classificados como prejudiciais ao ambiente (como os pesticidas, metais tóxicos e
hidrocarbonetos poliaromáticos), vem aumentando a necessidade de se compreender
melhor a questão dos chamados poluentes emergentes (AMÉRICO & MARQUES,
2017). Trata-se de produtos que anteriormente não estavam nas pautas de
discussões ambientais pelo desconhecimento de seu impacto à vida humana ou ao
ambiente no geral; ou pelo fato de anteriormente não serem encontrados em
quantidades que indicassem a possibilidade de risco (VALCÁRCEL et al, 2011).
Com o crescente uso de medicamentos entre a população, aumentou
proporcionalmente o seu descarte, possibilitando a chegada as mais variadas formas
destes produtos nos ambientes aquáticos. Desde descarte pós-vencimento até
quantidades que não serão totalmente utilizadas e o acesso fácil da população a estes
produtos, são práticas que favorecem a chegada dos medicamentos a ambientes
aquáticos. O aumento da produção também é um fator para geração de maior
quantidade de resíduos tanto industriais como domésticos e também das
distribuidoras, onde gera-se descarte de sobras e produtos vencidos (MONTAGNER
et al, 2017, apud SUMPPF et al, 2007).
No contexto atual de fármacos que se tornaram agentes poluidores do meio
aquático, é importante que sejam avaliados os impactos ambientais causados por
estes, assim como formas de removê-los do meio aquático. É necessário monitorar
também os riscos destes contaminantes a curto e a longo prazo e em diferentes níveis
tróficos, que possam apontar desequilíbrios ambientais como alterações na
fecundidade e alterações na morfologia corporal, por exemplo. (AGUIRRE-MARTÍNEZ
et al, 2018)
Estudos que avaliem estes riscos através de testes com organismos vêm
merecendo atenção, pois é desta forma que também se poderia avaliar futuros
16
prejuízos e alterações ambientais significativas, nos dando assim, a chance
desenvolver métodos de remoção destes contaminantes e também avaliar estes
métodos. (AGUIRRE-MARTÍNEZ et al, 2018)
O presente trabalho, então, objetiva verificar as alterações comportamentais
por testes já consagrados na literatura utilizando organismos aquáticos denominados
Daphnia magna, indo além da questão da mortalidade, mas trabalhando também com
o parâmetro fecundidade como meio de avaliar riscos ecotoxicológicos. Assim como
utilizar as algas Euglena gracilis para avaliação de diversos parâmetros que podem
ser afetados por contaminantes.
Espera-se contribuir para os estudos de tratamento de poluentes emergentes
derivados de medicamentos, utilizando testes de fácil aplicação avaliando como
parâmetro principal o comportamento desses organismos na presença do Ibuprofeno.
17
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 OBJETIVO GERAL
Conhecer a influência do Ibuprofeno que pode ocorrer sobre nível trófico
primário e secundário, evidenciando a existência de perigo ambiental.
1.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Observar as alterações de comportamento das algas;
Alteração na concentração de clorofila (Cclo) e na eficiência fotossintética
(EGF) em algas do gênero Euglena gracilis – representantes do nível trófico
primário;
Alterações no comportamento dos microcrustáceos como nível secundário -
frente a presença de Ibuprofeno, comparadas ao controle.
Determinar quais alterações foram as mais relevantes e significativas e que
apontem para risco ou perigo ambiental.
Discutir a relevância da análise do impacto das alterações do nível trófico
primário e secundário, frente a sua extensão e sensibilidade
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Recursos hídricos e a questão da contaminação
2.1.1 A água como recurso
Desde os primórdios, a água não apenas nos é necessária de forma biológica,
mas também é útil de diversas maneiras que contribuem para o avanço da
humanidade. Como por exemplo, utilizada na geração de energia elétrica, como via
de locomoção, na fabricação de produtos, etc (BAO & ZOUA, 2018).
Porém, devido as mudanças climáticas que vem acontecendo, o crescimento
da população, das áreas urbanas e industriais, este recurso acaba se tornando muitas
vezes escasso ou sofrendo contaminação pela má utilização. Esta contaminação pode
se dar de diversas maneiras, seja a contaminação de grande magnitude gerada pelas
grandes empresas e sistema agropecuário, mas também no dia a dia de forma
doméstica (MARTIN-CARRASCO et al, 2013).
2.1.2 Contaminação dos recursos hídricos Brasileiros
Visto que no Brasil se localizam algumas das maiores fontes de água potável
do mundo, é crucial que este seja uma das prioridades quando se trata de preservação
de recursos naturais (USSAMI, 2017). No Brasil, inúmeras iniciativas a nível federal
tentam de todas as formas preservar ecossistemas e seus recursos, focando
principalmente nas leis ambientais que protegem recursos aquáticos (MATTOS,
2018).
Ainda assim, nas áreas urbanas das maiores cidades, sofre-se de uma
discrepância de acontecimentos naturais que ficam entre a escassez extrema de água
e inundações (USSAMI, 2017). Alguns estudos inclusive colocam a abundância de
água no Brasil em contra ponto da falta de infraestrutura para distribuí-la e tratá-la
removendo contaminantes de fontes domésticas. Levando isso em conta, pode-se
dizer também que são necessários mais estudos e investimentos sobre a preservação
e descontaminação deste recurso (USSAMI, 2017).
19
A presença de fármacos em amostras ambientais tem sido reportada desde a
década de 70 em concentrações de nanogramas a microgramas por litro. Já em 2007,
mais caracterizadas, poderiam ser encontradas substâncias inclusive em água de
abastecimento público no Brasil. A seguir, a figura 1 formulada por MONTAGNER et
al, 2017, coloca estes dados de forma didática:
FIGURA 1. Concentrações máximas dos contaminantes emergentes determinados
em águas de abastecimento público no Brasil ,de acordo com os dados apresentados,
na linha vermelha se destaca a concentração de 100 ng L-1, a partir da qual pode
haver risco ao ser humano (MONTAGNER et al, 2017)
20
*DBP representa o grupo de 15 compostos formado após o processo de
desinfecção de águas estudadas por SHUMPF et al, 2007 (MONTAGNER et al, 2017,
apud SUMPPF et al, 2007).
2.2 O meio aquático e a questão dos medicamentos
2.2.1 Os medicamentos como poluentes emergentes
21
Hoje considerados como “poluentes emergentes” - se destacam os produtos
de saúde e higiene, no qual os medicamentos vêm merecendo atenção especial
devido ao consumo cada vez maior, que vai desde o acesso fácil e as quantidades
que não serão utilizadas; levando ao descarte pós-vencimento; passando pela
questão do envelhecimento geral da população – o que aumenta a faixa etária
consumidora de medicamentos. Isto implica em maior produção e consequentemente
mais resíduos são gerados; tanto nas indústrias farmacêuticas quanto nos descartes
advindos de domicílios e distribuidoras de medicamentos que descartam sobras e
produtos vencidos. (PINTO et al, 2016)
O uso de medicamentos nos dias atuais é uma forma encontrada pelo homem
com a finalidade de aumentar a sua longevidade, assim como sua qualidade de vida.
É uma forma encontrada na luta contra síndromes e doenças, muitas vezes utilizadas
inclusive de forma errônea e abusiva. Desta forma, a produção destes medicamentos
supera seu consumo, gerando descarte destes resíduos em locais onde podem gerar
impacto ambiental indesejado, visto que os medicamentos são formulados muitas
vezes com a finalidade de estimular uma resposta fisiológica do organismo, e
erroneamente acabam por ser descartados nas águas. (MONTAGNER et al, 2017)
No contexto anteriormente citado, vale ressaltar que; uma vez que os
medicamentos vem sendo agentes poluidores, é necessário encontrar meios de
avaliar o impacto ambiental que produzem e estudar formas de eliminá-los do meio
aquático, bem como realizar estudos cada vez mais apurados a respeito dos riscos
ambientais que podem causar em diferentes níveis tróficos e que possam ir além da
letalidade dos organismos, apontarão mudanças que impliquem em risco de impacto
em longo prazo, como alterações morfológicas e de fecundidade, por exemplo. Em
2003, já haviam estudos cujos resultados foram a quantificação destes poluentes
mesmo em baixas concentrações em efluentes já estavam ganhando destaque na
área de pesquisa e pode se destacar também a importância de serem realizados mais
estudos na área, assim como avaliações de impacto a longo prazo destes
contaminantes. (BILA & DEZOTTI, 2003)
Atualmente percebe-se que o ciclo de consumo de medicamentos, que vai
desde a produção até a inserção no mercado, não se atenta adequadamente ao
descarte e a identificação dos perigos que estes podem provocar ao ambiente
aquático, mesmo que em pequenas quantidades e por longos períodos de exposição.
22
Ainda que tenham aumentado o número de patologias tratadas, e isso seja uma
condição inegavelmente boa, medicamentos também são agentes químicos e sua
utilização resulta inevitavelmente na sua eliminação para o meio aquático como
mostra a Figura 2, elaborada por NUNES (2010).
FIGURA 2. Ciclo percorrido pelo medicamento até chegar à água utilizada pela
população:
Fonte: NUNES (2010).
Dentre estes medicamentos, o ibuprofeno acaba se destacando por ser um
analgésico e anti-inflamatório de venda livre, não sendo necessária a apresentação
de receita médica para compra. Visto seu consumo exagerado, por ser de fácil acesso
e passível de automedicação, a sua presença no meio aquático também se destaca.
(RIBEIRO et al, 2016)
Estudos que avaliam e credenciam organismos a serem utilizados em biotestes
vem merecendo atenção especial, pois o emprego de tais testes pode permitir a
avaliação da qualidade da água suspeita de contaminação e avaliar se os processos
de remoção não geram novos resíduos, que podem apresentar também toxicidade
ambiental. Quanto mais rápido e sensível for o teste, melhor o seu emprego.
Em 2016, uma pesquisa realizada por RIBEIRO et al, encontrou Ibuprofeno em
concentrações maiores que naproxeno e cetoprofeno (também antiinflamatórios) em
águas residuais de países desenvolvidos como Suíça, Austrália, Dinamarca e
23
Espanha. Visto que mesmo com todas as tentativas de remoção destes
medicamentos, eles ainda prevalecem no meio aquático.
Um estudo realizado por QUINN et al, (2008) utilizando a escala UE 93/67 /
EEC que fixa os princípios para a avaliação dos riscos para o homem e para o
ambiente, neste caso causados medicamentos utilizando Hydra attenuata, classificou
o ibuprofeno como substância tóxica, tendo como base a EC50 entre 1 e 10 mg/L,
juntamente com várias outras substâncias provenientes de medicamentos. (tabela 2)
TABELA 2. Nível de toxicidade para cada um dos 11 produtos farmacêuticos sob
investigação, com base nos resultados de EC50 de Hydra attenuata utilizando a
classificação da comissão da UE 93/67 / EEC
Ao nos referirmos quanto ao risco causado aos humanos por água
contaminada, ainda não é possível determinar todos os males que podem ser
causados. Porém, baseado em estudos com outros grupos de organismos, pode se
afirmar que água contaminada com medicamentos trazem prejuízos à saúde. Um
exemplo é o estudo realizado por FENSKE, (2017) em que água contaminada com
um hormônio, afeta além do sistema endócrino, o comportamento, pela ação do
hormônio esteroide convergir para o desenvolvimento do sistema nervoso, tendo
reflexos em relação ao organismo testado tornando-a mais susceptível à predação
bem como ter efeitos negativos no comportamento reprodutivo, comprometendo a
manutenção de espécies mais sensíveis.
2.3 O Ibuprofeno como contaminante
24
2.3.1 Ibuprofeno
O Ibuprofeno é um medicamento da classe dos anti-inflamatórios não
esteroidais (AINES), não seletivo, com ações antitérmicas (contra febre), analgésicas
(contra dor) e anti-inflamatórias. Sua metabolização é por via hepática e a excreção,
renal.
FIGURA 3. Aumento do consumo de Ibuprofeno na rede pública de uma cidade de
São Paulo. Fonte: http://www.saude.campinas.sp.gov.br/saude/
O ibuprofeno é um dos medicamentos mais consumidos em larga escala pela
população mundial, que de uma forma geral tem livre acesso e facilidade em obter
estes fármacos, sendo assim também um dos mais presentes nos ambientes
aquáticos. Com base neste preceito, ASHTON et al em 2004, realizaram um estudo
determinando a concentração de medicamentos em efluentes de estações de
tratamento de água e dentre eles o ibuprofeno foi determinado em concentrações
significativamente maiores do que qualquer outro composto farmacêutico alvo.
Este medicamento acaba adentrando os ambientes aquáticos principalmente
pelos esgotos através do descarte inadequado, sendo dos usuários ou fabricantes.
Em 2004, este já era um contaminante encontrado em todas as amostras de esgoto
juntamente com alguns de seus metabólitos, segundo um estudo de WEIGEL et al,
inclusive presentes na água do mar em concentrações de até 7,7 ng/l.
25
Este medicamento causou toxicidade em variados tipos de organismos
aquáticos em outros estudos já realizados. Como por exemplo em embriões do ouriço
do mar Lytechinus variegatus e do mexilhão Perna perna, em que o ibuprofeno causou
toxicidade em concentrações ambientalmente relevantes, e mesmo em baixas
concentrações, pode alterar o mecanismo de homeostase de mexilhões Mytella
charruana (PUSCEDDU et al, 2016). Recentemente, também podem ser encontrados
estudos informando que o ibuprofeno causa o aumento da atividade de algumas
enzimas antioxidantes e de biotransformação em peixes-zebra (Danio rerio).
(BARTOSKOVA et al, 2013)
Assim, ainda que não se encontrasse efeitos agudos causados ao meio
aquático pelo fármaco, segundo HECKMANN et al, 2007, os resíduos podem se
acumular no tanque biológico, levando a causar efeitos tóxicos a longo prazo para a
biomassa. Corroborando com este fato, BHANDARI & VENABLES (2011), verificaram
bioconcentração de ibuprofeno em Pimephales notatus (peixe de aquário), podendo
representar exposição crônica devido a hidrofobicidade relativamente alta do
ibuprofeno. De acordo com estas constatações, é importante considerar a adoção de
tratamentos biológicos mais eficientes para degradar estes compostos.
Apesar dos vários estudos na área, COLAÇO et al (2013), afirmam que o
comportamento, o destino, a ecotoxicidade, o tempo de permanência no ambiente e
a toxicidade dos fármacos não estão totalmente estabelecidos. Ainda sugerem que
desta forma, a questão da ecotoxicidade a longo prazo ainda necessita de mais
estudos, assim como os métodos de remoção destes contaminantes.
2.4 Métodos de remoção de contaminantes
Tanto em estações de tratamento de esgoto como de água, os processos
convencionais utilizados para eliminar contaminantes orgânicos, ainda não tem sido
suficientes. Isso se dá pelo fato da polaridade de sua natureza. Além disso, acredita-
se que as próprias características intrínsecas dos compostos como do próprio método
de remoção acabam por influenciar desfavoravelmente o processo. (MONTAGNER et
al, 2017)
26
MONTAGNER et al (2017), também cita estudos em que métodos conven-
cionais de tratamento promovem a remoção de menos de 25% da concentração da
maioria dos interferentes endócrinos.
Também são utilizados como métodos complementares a ozonização,
processos oxidativos avançados (UV, UV/H2O2, fotocatálise homogênea e hete-
rogênea, etc.), adsorção em carvão ativado, filtração em membranas (microfiltração,
ultrafiltração e nanofiltração) e osmose reversa. (OUARDA et al, 2017)
CHOINA et al, 2014, demonstra que a fotocatálise como método de remoção
se apresenta de grande interesse ecológico já que não requer o uso de quaisquer
produtos químicos adicionais ou solúveis e é especialmente eficaz em soluções
aquosas pouco concentradas.
Mais recentemente, em 2017, estudos concluíram que a solução para
remover estes contaminantes farmacêuticos realmente seria utilizar métodos
duplicadamente. Os resultados do estudo se mostraram favoráveis quando utilizado
dois métodos de remoção associados. Acredita-se que este seja a presciência dos
próximos estudos para removerem contaminantes desta classe. (OUARDA et al, 2017)
2.5 Ecotoxicidade
2.5.1 Ecotoxicologia como ferramenta
O monitoramento da ecotoxicidade de resíduos gerados pelo consumo
humano, nos traz como ferramenta a ecotoxicologia. Esta tem base nas respostas que
adquirimos realizando testes com organismos que sofrem estresse ao entrar em
contato com substâncias químicas, conhecidos como biomarcadores. Sendo,
portanto, como colocado por AZEVEDO & CHASIN, 2003, “uma ciência que objetiva
o estudo de fenômenos de intoxicação ambiental em todas as nuances e
consequências, com finalidade de impedir e prevenir determinada intoxicação ou
saber como interrompê-la, revertê-la e remediá-la, com método específico”.
Podemos assim utilizar a ecotoxicologia como forma de analisar o custo-
benefício trazido pela produção e pelo consumo de bens. Diminuir os custos dos
efeitos trazidos pela poluição química que nos dias de hoje acarreta tantos malefícios
para o meio aquático. A fim de avaliar estes efeitos no ambiente, que hoje se realizam
testes utilizando organismos indicadores. (MAGALHÃES & FERRÃO FILHO, 2008)
27
Estes testes são baseados em expor organismos sensíveis ao estresse, que
podem representar a sua biota, à amostra de alguma substância contaminante
conhecida por um tempo determinado. Assim, é avaliada a resposta fisiológica e
alterações deste organismo frente ao ibuprofeno, como por exemplo reprodução,
crescimento, mutação e taxa de mortalidade, que podem afetar a cadeia trófica ou até
mesmo as características da comunidade aquática em que se encontram.
(MAGALHÃES & FERRÃO, 2008)
2.5.2 Importância dos testes de ecotoxicidade
O principal objetivo da toxicologia é realizar o estudo sobre intoxicação sob
todos os aspectos. Desta forma, como descreve SOUZA (2008), “os agentes tóxicos
são substâncias químicas capazes de quebrar o equilíbrio orgânico, ou seja,
substâncias que provocam alterações na homeostase do organismo”.
Segundo SOUZA (2008), as “avaliações sobre toxicidade já estavam sendo
realizadas depois de percebida a importância dos ambientes aquáticos para a
sobrevivência humana”. Países como Estados Unidos e Rússia implantaram testes de
avaliação ecotoxicológica aguda com organismos aquáticos, tentando relacionar
causa e o efeito do que era despejado na água, focando na sua qualidade. Estudos
utilizando peixes como organismo teste foram realizados a partir da década de 1940,
porém a iniciativa foi vetada pela constatação de que haviam espécies de peixes
resistentes a certas substâncias químicas e, viu-se, então, a “necessidade de utilizar
espécies de maior sensibilidade, baixo custo e que fosse ainda assim uma parcela
considerável de ambientes aquáticos”.
Testes de ecotoxicidade assumem papel importante nos estudos de impacto
ambiental; seja a curto, médio ou a longo prazo. Um trabalho realizado por COSTA et
al (2008), ressaltou a importância dos testes de ecotoxicidade, pois segundo os
autores, uma análise mais abrangente do risco ambiental é possível quando
comparada com as avaliações físico-químicas do ambiente aquático, pois estas não
transmitem adequadamente a ideia de risco, por não avaliarem os seres vivos, mas
apenas os constituintes de um recurso hídrico. Assim, mediante a realização de testes
de ecotoxicidade, as alterações que organismos venham a apresentar que destoam
de sua normalidade passam a ser a forma mais viável e fidedigna de complementar o
controle e avaliação de um possível risco ambiental. (COSTA et al, 2008)
28
Estudos conduzidos por CARRASCHI et al (2012), apontam que os testes de
toxicidade devem ser etapas iniciais de avaliação de risco de fármacos encontrados
nos recursos hídricos, pois assim se tem uma avaliação esperada da resposta do
ecossistema frente a um elemento químico em questão que, sabidamente, provoca
alterações fisiológicas.
2.5.3 Tipos de testes de toxicidade ambiental: avaliação além da letalidade
Estudos de ecotoxicidade devem avaliar os efeitos causados ao organismo-
teste que desviam de sua normalidade, por meio da exposição deste organismo-teste
representativo de seu ecossistema. (CHASIN & AZEVEDO, 2003). Para tal avaliação
é necessário a exposição a várias concentrações da substância potencialmente tóxica
a ser testada, por períodos determinados agudo ou crônico; sendo este último
correspondente a 2/3 de seu ciclo de vida. São avaliados os efeitos agudos, onde se
observa letalidade e imobilidade, e os efeitos crônicos, em que se observam
alterações no crescimento, reprodução e sobrevivência (CARRASCHI et al, 2012).
Visto que alguns medicamentos encontrados no meio aquático estão em
concentrações baixas porém contínuas, esses fármacos provavelmente apresentarão
mais efeitos tóxicos a longo prazo (crônicos) do que efeitos agudos. (CRANE et al,
2006)
Testes de letalidade visam determinar a Concentração Efetiva Média (EC50),
e a Concentração Letal Média (CL50). A principal questão que se tem na atualidade
diz respeito ao uso dos testes envolvendo letalidade em detrimento de outros que
apontam riscos sem levar à morte do organismo. É possível avaliar os efeitos do
ibuprofeno exposto por longos períodos e em concentrações sub-letais ao organismo-
teste. Logo, o desfecho avaliado no teste crônico vai além da letalidade, mas permite
determinar o impacto às funções biológicas, como reprodução e metabolismo do
organismo-teste. (COSTA et al, 2008)
2.6 Bioindicadores e biomarcadores
A utilização de bioindicadores e biomarcadores na toxicologia se torna uma das
melhores maneiras de avaliar e monitorar a longo prazo contaminantes e seus riscos.
Porém, para isso é necessário saber a diferença entre eles.
29
Tratando-se de biomarcadores, pode-se dizer que são grupos de espécies ou
comunidades biológicas cuja presença, quantidade e distribuição indicam a magnitude
de impactos ambientais em um ecossistema aquático e sua bacia de . por múltiplas
fontes de poluição. Além disso, o uso dos bioindicadores é mais eficiente do que as
medidas instantâneas de parâmetros físicos e químicos (p.ex. temperatura, pH,
oxigênio dissolvido, teores totais e dissolvidos de nutrientes, etc) que são
normalmente medidos no campo e utilizados para avaliar a qualidade das águas.
(Callisto, M. et al 2005)
Em quanto biomarcadores podem ser utilizados para monitorar e interpretar
parâmetros biológicos e/ou ambientais, com a finalidade de detectar os possíveis
riscos à saúde. A exposição pode ser avaliada por medida da concentração do agente
químico em amostras ambientais, como o ar (monitorização ambiental), ou através da
medida de parâmetros biológicos (monitorização biológica), denominados indicadores
biológicos ou biomarcadores. (AMORIM, 2003)
2.6.1 Daphnia magna
Estudo conduzido por BRENTANO (2006), afirma que o organismo-teste
Daphnia magna vem sendo utilizado em ensaios de ecotoxicidade desde a década de
1940, sendo que nos últimos 20 anos o seu uso em testes de toxicidade agudos e
crônicos vem sendo cada vez mais frequente devido ao seu fácil cultivo e estabilidade
genética que apresenta entre as gerações. No Brasil somente seus testes agudos são
padronizados pela NBR 12.713 (ABNT, 2004). O teste crônico, por sua vez, não tem
padronização nacional, sendo a referência metodológica mais adotada a descrita por
BRENTANO (2006), que permite avaliar, além da letalidade, a reprodução e
desempenho reprodutivo das fêmeas como um indicativo de contaminação ambiental.
Figura 4: Imagem de uma Daphnia magna. Possuem um comprimento que
varia entre 0,2 mm e 5,0 mm e nadam impulsionada por duas antenas situadas encima
da sua cabeça:
30
Fonte: https://fineartamerica.com/featured/8-water-flea-daphnia-magna-ted-
kinsman.html?product=greeting-card
D. magna são sensíveis a várias substâncias e podem ser facilmente
cultivadas em condições de laboratório, portanto, são organismos modelo muito úteis
em toxicologia. A maioria das pesquisas toxicológicas com esses crustáceos baseia-
se apenas em dados de toxicidade aguda para avaliação da concentração letal (LC50)
para mortalidade ou concentração efetiva (EC50) para imobilização. No entanto, a fim
de fornecer informações mais detalhadas sobre a toxicidade, especialmente os efeitos
subletais induzidos por concentrações mais baixas de substâncias tóxicas, são
necessários testes mais sensíveis. (BOWNIK, 2017)
O teste crônico utilizando além da mortalidade do bioindicador como parâmetro
em baixas concentrações, utiliza-se também o parâmetro da fertilidade, que pode ser
afetada por estresse sofrido devido a contaminantes. (BOWNIK, 2017)
2.6.2 Euglena gracilis como bioindicador
Euglena é um gênero de alga unicelular da divisão Euglenozoa, classe
Euglenophyceae. A espécie Euglena gracilis é encontrada em ambientes dulcícolas,
marinhos ou de águas salobras. Não possui parede celular, reproduz-se
assexuadamente e possui hábitos autotróficos, através da fotossíntese ou
31
consumindo partículas alimentares por fagocitose. Possuem dois flagelos com
funções distintas, utilizando o flagelo longo para orientação e movimentação. Para
observar o ambiente e procurar a melhor posição para a fotossíntese, a célula possui
um estigma, uma organela primitiva localizada na base do flagelo que filtra a luz solar
em função de detecção de estruturas fotossensíveis. (REVIERS, 2006)
As microalgas E. gracilis já são amplamente utilizadas em testes toxicológicos
devido a sensibilidade destes organismos a substâncias tóxicas, alterando a sua
orientação gravitacional, mobilidade, velocidade e formato das células. A mudança na
composição algal, na distribuição dos indivíduos, na estrutura e o seu comportamento,
são utilizados como parâmetros no que compete a biota aquática submetida a
toxicidade de contaminantes. Vários testes como o de teor de clorofila, por exemplo,
já são empregados em suas análises. (MAGALHÃES & FERRÃO, 2008)
FIGURA 5: Imagem do corpo de uma Euglena gracilis. Possui um flagelo para
locomoção e cloroplastos para realização da fotossíntese:
Fonte: https://www.britannica.com/science/eyespot-biology
Em estudos de resíduos industriais na água com algas, Euglena gracilis foi a
única espécie fotossintética detectada. Estes fatores tornaram esta alga um excelente
modelo para estudos toxicológicos de substâncias que podem se acumular nos
cloroplastos. (MACHADO, 2013)
32
3 METODOLOGIA
3.1 Local de desenvolvimento da pesquisa
Este estudo foi realizado no Laboratório de Fotoquímica e Fotobiologia da
Universidade da Região de Joinville, UNIVILLE.
3. 2 Delineamento do Estudo
Trata-se de um estudo experimental, utilizando como parâmetro algas do
gênero Euglena gracilis KLEBS, obtidas da coleção da Universidade Georg-August-
Universität Göttingen, Alemanha, cujos organismos foram submetidos a diferentes
concentrações de ibuprofeno. Avaliou-se ainda os parâmetros de fertilidade e
sobrevida do crustáceo de água doce Daphnia magna sob as mesmas circunstâncias.
3.3 Preparação das soluções
Foram macerados dois comprimidos de ibuprofeno de 600mg cada, diluídos em
30 ml de álcool 99%, e após, diluídos para um 1 L de água destilada resultando em
uma solução de concentração inicial de 1,2 g/l. A absorbância foi então verificada
abaixo de 250.
A solução inicial foi então diluída em água resultando nas seguintes
concentrações: 600 mg/l, 150 mg/l, 60 mg/l, 15 mg/l, 6 mg/l e 3 mg/l. As soluções
foram armazenadas em balões volumétricos.
3.4 Análise com Euglena gracilis
3.4.1 Preparação das amostras
As culturas preparadas nas condições descritas anteriormente foram mantidas
em uma única cultura de 3,5 L, tratadas durante um período de uma semana a fim de
se manter homogeneidade do meio para a aplicação dos testes. Esta cultura foi
subdivida em 21 frações de 150 ml, retirado 1,5 ml de cada fração, as quais receberam
33
posteriormente a adição de 1,5 ml da solução contendo ibuprofeno (18 receberam
ibuprofeno em diferentes concentrações e 3 foram controle). (FIGURA 6)
Figura 6. Ilustração das culturas de E. gracilis já preparadas sob efeito de diferentes
concentrações de Ibuprofeno. Todas as culturas testadas foram originadas de uma
única cultura mãe.
3.4.2 Organismos e manutenção
Os testes foram realizados com cepas de Euglenas gracilis em meio mineral e
orgânico preparado conforme descrição feita por CHECCUCI et al (1976). A
manutenção da cultura ocorreu sob exposição da luz 20 watts/cm², foto período de 12
horas, e temperatura de 20°C, como mostra a figura 7. Todos os testes foram a partir
de uma única cultura, para que não ocorressem desvios relativos a preparos
diferentes de meio mineral.
FIGURA 7. Imagem das cepas armazenadas dentro de estufa sob iluminação e
temperatura controladas. Fonte: arquivo pessoal da pesquisadora.
34
As algas foram avaliadas quanto às alterações comportamentais e quanto à
atividade fotossintética, quando submetidas ao contato com o ibuprofeno.
3.4.3 Teste de alterações comportamentais das algas pelo biomonitoramento via
NG-TOX
Os experimentos comportamentais com Euglena gracilis na presença de
iburprofeno foram realizados utilizando uma ferramenta de biomonitoramento em
tempo real chamada NG-TOX, desenvolvida e homologada pela Ecobabitonga
Tecnologia Ltda. (ERZINGER et al, 2011). A ferramenta monitorou, através da análise
de imagem em tempo real, o comportamento das algas, usando diferentes parâmetros
de movimento do flagelado unicelular fotossintetizante. Objetivam a obtenção de
desvios comportamentais que evidenciam o risco ambiental, de forma rápida. Tais
desvios foram posteriormente confirmados como risco de toxicidade com testes
consagrados de eficiência fotossintética, teor de clorofila – ambos em algas – e teste
de toxicidade em D. magna.
O equipamento NG TOX (FIGURA 8) é constituído por um sistema de conexões
envolvendo quatro tubos de silicone responsáveis pela sucção da cultura de células
de E. gracilis. Amostra de culturas de algas contendo ibuprofeno foi avaliada quanto
aos comportamentos já citados via microscópio, que captura as imagens das células
em movimento. As imagens são gravadas por uma câmara CCD (Charged Coupled
Device) e digitalizadas por uma placa conectada a um microcomputador, onde são
35
apresentadas em um monitor. O software então calcula os parâmetros de movimento,
velocidade de locomoção, velocidade de subida a superfície, tamanho médio das
células; no qual compara o comportamento do meio teste com o controle (contendo
apenas algas) e indicará as diferenças encontradas. (HÄDER, 1985)
Figura 8. Imagem ilustrativa do NG-TOX.
Figura 8. Imagem ilustrativa do aparelho que analiza as algas em tempo real.
36
Figura 9. Imagens do sistema do software que analisa as algas em tempo real. Fonte:
arquivo pessoal da pesquisadora.
3.4.4 Teste de eficiência fotossintética no PAM
Este teste tem por objetivo verificar se alterações comportamentais que
venham a ocorrer, como redução da velocidade de subida a superfície – verificados
no NG TOX - afetam a atividade fotossintética. Os parâmetros de fotossíntese foram
medidos através de um fluorímetro de amplitude de pulso modulada PAM 2000, Walz,
Effeltrich, Alemanha. O princípio de medição do PAM se baseia nas mudanças do
nível de fluorescência da clorofila, após a aplicação de pulsos de luz saturada. (PINTO
et al, 2017) O rendimento de fotossíntese bem como de têmpera (fotoquímico e não
fotoquímico) também foram calculados.
As culturas testadas foram adaptadas no escuro por 1 hora, para então serem
retirados cerca de 1ml e transferidos para cubeta do equipamento PAM. Foi então
submetida à emissão dos pulsos de luz saturante para avaliação da atividade
fotossintética.
A emissão de um pulso de luz saturante permite detectar a fluorescência
máxima, indicando redução completa do receptor de elétrons FSII. A Luz-resposta das
37
curvas foi determinada para todas as amostras tratadas. As algas foram submetidas
a intensidade de iluminação crescente (gerado por uma lâmpada halógena interna)
em 10 passos de 0 a 3111 molm-2/s. Após 20s de cada etapa de iluminação, um pulso
saturante foi aplicado e o rendimento fotossintético e a ETR (taxa de transporte de
elétrons) foram medidos automaticamente.
Desta forma, foi feita a interferência que as amostras promoveram na eficiência
(YIELD) e qual foi a ETR.
Todos os testes foram realizados sempre no mesmo horário, respeitando-se o
tempo de exposição à luz das algas na incubadora, onde se encontravam
armazenadas.
Na Figura 10, pode se verificar o aparelho utilizado para realizar os testes de
PAM.
Figura 10. Aparelho utilizado para os testes PAM. Fonte: arquivo pessoal da
pesquisadora.
38
3.4.5 Teste de teor de clorofila
Este teste objetivou verificar se os parâmetros analisados anteriormente
também afetaram a concentração de clorofila presente nas algas. Alíquotas de 5ml
dos meios de cultura submetidos a presença do ibuprofeno mais o controle foram
retiradas no período de 45 dias após o início dos testes para a extração da clorofila e
demais pigmentos para análises. Tais alíquotas foram tratadas segundo os
procedimentos realizados por OSAFUNE & SUMIDA (2006); e SUMIDA et al (2007).
As alíquotas foram filtradas em bomba de vácuo utilizando papel-filtro da marca
whatman® 47mm. Os papéis contendo o filtrado (células precipitadas) foram então
transferidos para um tubo falcon, e receberam um volume de 5ml de etanol, sendo
posteriormente mantidos a 4°C para a extração dos pigmentos. As misturas foram
então centrifugadas a 6.000 g por 10 min a 4°C para se agregar às células detritos. O
espectro de absorbância do sobrenadante foi medido.
Figura 11. Aparelho utilizado no processo de filtração para extração da clorofila. Foto:
arquivo pessoal da pesquisadora.
39
3.5 Teste de toxicidade agudo com Daphnia magna
Trata-se de um estudo experimental, envolvendo o uso de Daphnias magna,
em que são avaliadas quanto à sobrevivência em teste agudo (48 horas) e
sobrevivência e fecundidade em teste crônico (21 dias). Foram preparadas as
soluções para a realização dos experimentos com soluções de Ibuprofeno a partir de
comprimidos de formulação genéricas comerciais dentro da validade, obtidas através
de compra em farmácia comercial.
A metodologia de testes agudos com Daphnia magna seguiu o descrito na NBR
12.713 (ABNT, 2004) e por BRENTANO (2006). As análises foram realizadas em
quadruplicata. Para melhor entendimento, segue a figura 12 para ilustrar o resultado
da preparação das amostras.
Figura 12. Ilustração da preparação das amostrar para o teste agudo com D.
magna.
Quanto aos testes crônicos que foram realizados, os testes de sobrevivência e
de fecundidade seguiram os passos descritos a seguir.
40
3.5.1 Teste crônico
Para realização dos testes, foram utilizados organismos jovens, com 2 a 26
horas de idade, obtidos a partir da quarta postura de fêmeas cultivadas. O método
consiste na exposição dos organismos jovens da Daphnia magna, a várias diluições
da amostra-testes por um período de 21 dias.
Cada ensaio foi realizado com 4 diluições da amostra, além do controle
negativo (somente água reconstituída - meio M4). As diluições (contendo a formulação
de ibuprofeno) foram preparadas com precisão volumétrica, em progressão
geométrica de razão 1,25. Para cada diluição, utilizou-se 10 réplicas, dispondo
individualmente 10 organismos jovens de Daphnia magna em béqueres de 50 mL.
O organismo-teste foi exposto à solução-teste (que continha as diluições do
Ibuprofeno), sendo transferido de forma a evitar a alteração da concentração final da
mesma. Para tal utilizou-se um coletor de crustáceo a fim de não causar danos ou
estresse aos indivíduos.
Os testes foram mantidos nas mesmas condições ambientais que os lotes de
cultivo, com luminosidade difusa (foto período de 16 horas de luz) e temperatura de
18°C a 22°C. Os organismos-teste receberam diariamente alimentação, sendo
fornecido como alimento a alga clorofícea Scenedesmus subspicatus, em
concentrações próximas a 107células/mL, ad libitum.
Os organismos-teste foram acompanhados durante o teste, sendo que na
primeira semana foram realizadas observações diárias e, após este período, com
leituras três vezes por semana, em dias intercalados: segundas, quartas e sextas-
feiras. Nestes momentos foi observada a sobrevivência e número de jovens gerados
por fêmea. Na figura 13, pode se verificar as amostras já prontas.
41
Figura 13. Amostras de D. magna prontas para o teste crônico. Fonte: Arquivo pessoal
da pesquisadora
Foi analisada a fecundidade dos crustáceos através do número de filhotes
decorrido das posturas, seguindo a metodologia de BRENTANO (2006) para análise
destes resultados.
A fecundidade foi avaliada pela contagem dos neonatos gerados pelas fêmeas
no período de 21 dias. Como parâmetro foi utilizado a média de filhotes gerados por
fêmea, considerando o número de posturas ao longo do teste. Esta média foi obtida
através da seguinte equação:
𝑀é𝑑𝑖𝑎 =nº total de filhotes
21 dias − nº de não posturas Equação 01
A metodologia de teste crônico seguiu o descrito na ISO 10706:2000. Em
ambos os testes - agudo e crônico - foi analisado controle negativo (apenas água de
cultivo – meio M4), em que os crustáceos foram mantidos nas mesmas condições de
luz, temperatura e alimentação das outras soluções testadas. Os ensaios realizados
com Daphnia magna necessitam de controle negativo a fim de verificar o
comportamento da espécie na ausência do poluente, porém, nas mesmas condições
de estresse físico, já que se trata de um organismo sensível.
42
4 ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS
Os dados foram avaliados através de ANOVA, técnica univariada que trata
dados quantitativos em relação a uma variável independente categórica de três níveis.
Para a análise entre os grupos (testes e controle), comparando todos os efeitos, a
técnica utilizada foi uma extensão da ANOVA, denominada ANOVA para medidas
repetidas, que consiste em uma abordagem bem mais elaborada para dados
pareados. Esta parte consta, portanto, das comparações de resultados e médias com
base nos itens quantitativos de sua amostragem.
As análises estatísticas do comportamento das algas avaliadas no NG-TOX
será realizada pelo software ImagingTox®. Trata-se de um programa especialmente
desenvolvido e escrito em plataforma Microsoft. Net 64-bit multilíngue e banco de
dados MS SQL Server. Possui sete threads (sendo uma principal, três para vídeo 1 e
três para vídeo 2), dois serviços (um para controle de conexão PC e NG-TOX, e um
de conexão e validação com o banco de dados), permitindo armazenamento de
bioensaios realizados para “análise forense” e tela de exibição de resultados em
tempo real. O ImagingTox® realiza análise estatística 5-PL integrada.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a determinação toxicológica ambiental do ibuprofeno de forma aguda, foi
realizado o experimento empregando o crustáceo de água doce D. magna e a
microalga E. gracilis.
Não foi encontrado na literatura e nem nas normas ambientais do Brasil e do
Estado de Santa Catarina nenhuma regra que trate especificamente do descarte de
ibuprofeno no ambiente aquático. Admitindo então que estes descartes serão feitos
em esgoto doméstico, este trabalho utilizou como referência a legislação preconizada
pela FATMA (Fundação do Meio Ambiente) em Santa Catarina para esgotos
domésticos e/ou hospitalares, em conformidade com o disposto na Portaria 017/02,
relativo ao padrão de qualidade, que estabelece que o fator de diluição destas
amostras para o crustáceo D. magna seja de 1 (uma parte da amostra e uma parte de
água). (FATMA, 2002)
43
5.1 Avaliação dos parâmetros fisiológicos e fotossintéticos das algas E. gracilis
Para a avaliação das possíveis alterações fisiológicas das algas E. gracilis foi
utilizado o sistema automático de analises de imagem denominado NGTOX. Este
sistema é capaz de avaliar diversos parâmetros fisiológicos, sendo os principais
parâmetros a mobilidade, a orientação gravitacional, a forma e diferentes velocidades.
5.1.1 Avaliação dos parâmetros fisiológicos das algas E. gracilis
Os principais resultados obtidos nos testes agudos estão demonstrados a
seguir na figura 14. O aumento dos parâmetros de motilidade, velocidade, orientação
gravitacional, pode ser um indicativo de que as células de E. gracilis provavelmente
compensaram inibindo a gravitaxia e nadando para o lado, assim utilizando o
Ibuprofeno como fonte de carbono, não sendo necessário, portanto, realizar a
fotossíntese como geração de energia alternativa. (ENGEL et al, 2015)
Ainda assim, Segundo RICHTER et al (2003a) o mecanismo de gravitaxia ainda
não é completamente compreendido. Estudos recentes apontam que a orientação
gravitática é baseada em um sensor fisiológico, que tem sido identificado como um
canal iônico de cálcio mecanossensorial TRP localizado na membrana celular, que é
acionado pela pressão da célula corpo (HÄDER et al, 2009). Há evidencias também
que O AMPc resultante parece ativar uma proteína quinase (DAIKER et al, 2011)
localizada no/ou próximo ao flagelo, iniciando uma reorientação do flagelo, resultando
em uma correção de curso.
Além destes mecanismos, pode haver a possibilidade do Ibuprofeno interagir
com a mobilidade das algas devido a sua ação antioxidante que poderia interagir com
as proteínas envolvidas principalmente no movimento do organismo, como a
calmodulina, ou ainda substituir ou afetar o Ca2 intracelular.
44
Figura 14 - Inibição (-) ou ativação (+) dos efeitos de diferentes concentrações de
ibuprofeno nos parâmetros de movimento e orientação de E. gracilis em ensaios
agudos. Cada ponto de dados representa a média de três medições independentes.
Nestes testes foram observados uma adaptação das algas, sem comprovação
de uma toxicidade letal. Porém, como demonstra a figura 15, ao invés de sofrer uma
inibição de parâmetros fisiológicos como fora observado nos ensaios agudos, a E.
gracilis apresentou um aumento de sua atividade fisiológica. Está demonstrado na
figura 15 que as células inverteram sua orientação gravitacional, que normalmente
apresenta gravitaxia negativa para uma gravitaxia positiva. Este fenômeno fará com
que as algas se direcionem para lugares com menos incidência de luz. Este fenômeno
poderá alterar as variáveis bioquímicas da fotossíntese. Este estímulo fisiológico se
mostrou ineficaz, uma vez que houve um aumento significativo na sensibilidade nas
células com as irradiâncias mais altas, ENGEL (2015) observou semelhante fenômeno
em estudo com o sorbato de potássio.
45
Figura 15 - Inibição (-) ou ativação (+) dos efeitos de diferentes concentrações de
ibuprofeno nos parâmetros de movimento e orientação de E. gracilis em ensaios
crônicos de 45 dias. Cada ponto de dados representa a média de três medições
independentes.
5.1.2 Rendimento Fotossintético
A análise referente ao comportamento de movimento para a superfície das
algas demonstrou alterações significativas em ambas as condições, de forma superior
ao controle. Esta inibição no movimento para a superfície tem relevância para
organismos fotossintéticos aquáticos, pois compromete o desempenho fotossintético
em função da dificuldade de se chegar mais próximo da superfície e do contato com
a luz. Tal condição é sugestiva para que na natureza, havendo exposição das algas
ao ibuprofeno, as algas possam sofrer algum tipo de alteração de caráter tóxico. Este
fenômeno pode ser explicado pela necessidade da E. gracilis apresentar um equilíbrio
entre fototaxia e gravitaxia como forma de melhor adaptação à intensidade luminosa.
Com o aumento da radiação, as células mostram uma fototaxia negativa cada vez
mais precisa, longe da fonte de luz. (RICHTER et al. (2003b) descreveram que a
combinação de fototaxia e gravitaxia leva a um acúmulo de células em regiões da
coluna de água que fornecem ótimas condições de luz para o aparato fotossintético
(cerca de 30Wm-2 de radiação solar).
46
Segue abaixo o gráfico formado com as médias das triplicatas destacando o
comportamento fotossintético (fig. 16). A avalição do rendimento fotossintético é
resultante da medida de o valor de rETR (taxa de transporte de elétrons) sendo uma
variável inversamente proporcional. Segundo RALPH e GADEMANN, (2005) o valor
de rETR dá uma estimativa da atividade e adaptação do sistema fotossintético a uma
série de diferentes intensidades de iluminação. A estimativa de transporte de elétrons
no PSII é um indicador útil de qualquer dano ao aparato fotossintético, uma vez que,
qualquer inibição em PSII vai resultar no bloqueio do transporte de elétrons no PSII
(HODA e HÄDER, 2010). Após a inibição do transporte de elétrons, PSII será foto-
inibido devido à pressão de excitação. Isto resulta da utilização ineficaz e dissipação
de energia de luz, causando o estresse oxidativo (HUANG et al., 1997). Além disso,
as curvas de luz proporcionam informações vitais sobre algas fotosintetizantes à
adaptação fisiológica a estímulos externos (RASCHER et al., 2000, HODA e HÄDER,
2010). Os dados de rendimento fotossintético revelaram que, em baixas
concentrações de ibuprofeno há a indução destes parâmetros, sendo que em altas
concentrações há uma redução significativa deste parâmetro. Estes dados vêm
corroborar com os dados obtidos nos testes fisiológicos onde, nos testes agudos
houve uma inibição da atividade fisiológica fazendo com que a algas fossem
estimuladas a um nado para superfície, ficando desta maneira mais sensíveis e
eficientes ao impulso luminoso (fig. 16). Por outro lado, nos ensaios crônicos de 45
dias verificou-se um gavitaxia positiva o que acarretou numa menor eficiência
fotossintética. (fig 17)
47
Comprimento de onda (µmol photons m-2s-1)
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Re
nd
ime
nto
fo
tos
sin
téti
co
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
controle
3 mg/L
6 mg/L
15 mg/L
60 mg/L
150 mg/L
600 mg/L
Figura 16: Efeitos do ibuprofeno na eficiência fotossintética de E. gracilis com
aumento da intensidade luminosa em ensaios agudos. Cada ponto de dados
representa a média de três medições independentes.
48
Comprimento de onda (µmol photons m-2s-1)
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Re
nd
ime
nto
fo
tos
sin
téti
co
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
controle
3 mg/L
6 mg/L
15 mg/L
60 mg/L
150 mg/L
600 mg/L
Figura 17: Efeitos do ibuprofeno na eficiência fotossintética de E. gracilis com
aumento da intensidade luminosa em ensaios crônico de 45 dias. Cada ponto de
dados representa a média de três medições independentes.
5.2 Determinações das concentrações de clorofila frente à exposição ao
Ibuprofeno
A determinação da clorofila (Figura 18) ficou demostrado que em baixas
concentrações (> 60 mg/L) houve um decréscimo da concentração de clorofila. Por
outro lado, em concentrações maiores que 150 mg/L de ibuprofeno foi observado um
aumento gradativo em relação a amostra controle. Este fenômeno vem comprovar o
fenômeno observado na figura 16 aonde houve um aumento do rendimento fotossintético em
altas concentrações. Este aumento da concentração de clorofila em soluções acima de 150
mg/L de ibuprofeno, o alto rendimento fotossintético e os fenômenos fisiológicos descritos na
figura 15, no qual se observa uma ativação de diferentes parâmetros que irão levar as algas
a uma maior exposição a luz e farão com que a E. gracilis entre em um estresse energético
que causará sua morte. (RICHTER et al. (2003b)
49
FIGURA 18. Concentração de clorofila 45 dias após a adição do Ibuprofeno.
5.3 - Avaliação dos efeitos ecotoxicologicos por Daphnia magna
5.3.1 Teste de atividade aguda
De acordo com CASTRO et al. (2014) para o ibuprofeno, as concentrações
encontradas no ambiente foram quantificadas em uma faixa de 10,0 µg/L a 20,0 mg/L.
Nos testes de toxicidade do ibuprofeno, realizados com Daphnia similis, estes autores
relataram um valor médio para LC50 (97,0 mg/L) superior aos valores máximos
detectados no ambiente aquático.
Segundo o manual FISCO para ibuprofeno da BASF (2017) os valores de EC50
(48 h) para Daphnia magna em testes agudos foram de 35,79 mg/L. Os valores obtidos
nos testes propostos por este trabalho foi de 34,91mg/L, valores estes semelhantes
aos descritos pela BASF (2017) em teste de efeitos agudos como demostrado na
figura 19.
Os resultados demostram que a sensibilidade de Daphnia magna (34,91mg/L)
é bem superior aos descritos na literatura para Daphnia similis (LC50: 97,0 mg/L).
50
Ibuprofeno (mg/L)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Mo
rta
lid
ad
e (
%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Figura 19 - Mortalidade de Daphnia magna obtida em testes agudos utilizando a
amostra de Ibuprofeno. Os testes foram realizados em dez concentrações de quatro
repetições, contendo cinco organismos por repetição, a concentração letal (LC50) foi
de 34,91mg/L. (r2 = 0,9827, p = <0,0001)
5.3.2 Testes de avalição dos efeitos crônicos
Para os experimentos com D. magna utilizou-se como base os resultados
obtidos na revisão de TERRA e FEIDEN (2003) e TERRA et al. (2003), que para
assegurar a validade do teste é necessário que o controle do mesmo apresente pelo
menos 80% de sobrevivência de D. magna adulta, ou seja, 80% dos organismos com
longevidade de 21 dias. Para este critério o teste demonstrou-se válido uma vez que,
no controle houve a morte de apenas um organismo tendo, portanto, uma
sobrevivência de 90% (Figura 19).
51
Para os testes de toxicidade crônica utilizou-se quatro concentrações
previamente descritas na metodologia. A longevidade dos organismos-teste (D.
magna) expostos a diferentes concentrações foi de 21 dias, e variou de acordo com a
concentração de Ibuprofeno em que o organismo foi exposto. O parâmetro
fecundidade foi avaliado a partir da contagem dos filhotes obtidos nos cultivos
individuais, e a concentração que teve a maior média de filhotes por mãe foi a de 6,0
mg/L (Tabela 3).
Tabela 3: Número médio de filhotes por dia (média) de Daphnia magna expostos a diferentes concentrações de Ibuprofeno (mg/L) pelo período de 21 dias.
Ibuprofeno (mg/L) Número médios de filhotes por dia p
Controle 10,00 ± 2,08 0,677
0,06 6,20 ± 2,09 0,433
0,60 7,00 ± 1,682 0,115
6,00 7,67 ± 4,21 0,003
60,00 0,00 ± 0,0 <0,05
p* = ANOVA one-way, nível de significância p < 0,05 - 95% confiança
52
Figura 20. Número médio de filhotes de Daphnia magna em ensaios em triplicata, em
testes crônicos sob diferentes concentrações de ibuprofeno (r2: 0,9990; p>0,001)
Através da utilização do modelo estatístico de 3 parâmetros de distribuição
normal que muitas vezes é referida como a distribuição de Gauss, foi utilizada a
equação 01 descrita a seguir:
𝑌 = 𝑎^[−0,5(𝑥−𝑥0
𝑏)2]
Equação 02
Aonde: a variável “a”, que significa a probabilidade máxima de filhotes em condições
excelentes. A distribuição dos valores é aproximadamente simétrica em torno de 10,43
filhotes médios que foi obtida pela equação 1 pela determinação da variável “a”, e “x0“
o valor da concentração de Ibuprofeno que atinge o máximo número de filhotes (3,43
mg/L). Por outro lado, “b” é a concentração de efeito não observado (CENO ou NOEC
em inglês), que se refere à mais elevada das concentrações testadas em que não se
verificam alterações no ser vivo (3,27 mg/L). Desta maneira, utilizando a Equação 2
acima descrita, foi possível determinar a concentração que causará 100% de
letalidade. Esta concentração foi de 14,5 mg/L de Ibuprofeno e a concentração de
53
efeito observado (CEO ou LOEC em inglês) que foi de 11,71 mg/L, que indicou a
menor das concentrações testadas em que se verificaram alterações no ser vivo.
Nos testes de toxicidade crônica as concentrações estudadas foram baseadas
no valor do LC50 (34,91mg/L) obtidos nos testes agudo e baseados na norma NBR
13.373 (2003). Esperava-se que houvesse uma toxicidade nas concentrações abaixo
do LC50. A amostra que não causou efeito estatisticamente significativo aos
organismos quando comparado ao controle, em termos de fecundidade (CENO), nas
condições de ensaio foi de 3,27 mg/L de Ibuprofeno. E a menor concentração da
amostra que causou efeito estatisticamente significativo aos organismos quando
comparado ao controle, também em termos de fecundidade (CEO), nas condições de
ensaio foi de 11,71 mg/L (ABNT -NBR 13.373, 2003). Este fato justifica os resultados
obtidos na concentração de 6,0 mg/L no qual se obteve a melhor taxa e crescimento
por estar na metade do valor obtido de CEO.
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar da importância dos medicamentos como agentes terapêuticos no
sistemas de saúde da população, sem o descarte adequado os mesmos acabam se
tornando uma classe de contaminante com consequências significativamente
prejudiciais. Ainda constam pesquisas que demonstram o descaso e falta de
informação da população consumidora referente a estes produtos. (CARVALHO et al,
2009). Os resultados obtidos neste trabalho, referentes ao possível descarte
ambiental do ibuprofeno para os as espécies estudadas foram:
A alga E. gracilis apresentou mudanças em seus parâmetros fisiológicos e
bioquímicos frente a diferentes concentrações de ibuprofeno.
Houve um aumento fisiológico da gravitaxia e do senso de orientação da alga.
O rendimento fotossintético foi variável dependendo da concentração do
ibuprofeno, sendo que acima de 150 mg/L a produção de clorofila foi induzida.
Os resultados encontrados nos testes de toxicidade realizados para Daphnia
magna foram de LC50: 14,5 mg/L demonstraram que a sensibilidade deste
organismo é maior para este contaminante do que o já descrito na literatura
para outros organismos utilizados como bioindicadores.
54
A concentração de efeito não observado (CENO ou NOEC em inglês) do
ibuprofeno em testes crônicos de D. magna foi de 3,27 mg/L.
A concentração de efeito observado (CEO ou LOEC em inglês) do ibuprofeno
em ensaios crônicos foi de 11,71 mg/L.
A concentração estimada de Ibuprofeno que atinge o máximo número de
filhotes em testes crônicos de D. magna foi de 3,43 mg/L.
A concentração de Ibuprofeno acima de 14,5 mg/L causa 100% de letalidade.
A conscientização da sociedade através da educação ambiental na redução do
descarte inadequado de medicamentos vencidos ou indesejados é uma ação tangível,
juntamente com um novo olhar sobre as demandas atuais e futuras de gestão e de
saneamento ambiental, a fim de fazer frente às necessidades e desafios que se
apresentam.
55
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