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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

CAMPINAS 2017

CAROLINE HONAISER LESCANO

AVALIAÇÃO IN SILICO, IN VITRO E IN VIVO DE

COMPOSTOS CANDIDATOS A INIBIDORES DE

FOSFODIESTERASE 5

CAMPINAS 2017


AVALIAÇÃO IN SILICO, IN VITRO E IN VIVO DE COMPOSTOS CANDIDATOS A

INIBIDORES DE FOSFODIESTERASE 5

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Doutora em

Farmacologia.

ORIENTADOR: PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI

COORIENTADORA: PROFa. DRa. FABÍOLA TAUFIC MÓNICA IGLESIAS

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINE HONAISER LESCANO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI.

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO


ORIENTADOR: PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI

COORIENTADOR: PROFa. DRa. FABÍOLA TAUFIC MÓNICA IGLESIAS

MEMBROS:

1. PROF. DR. GILBERTO DE NUCCI

2. PROF. DR. RICARDO NASCIMENTO DOS SANTOS

3. PROF. DR. RODRIGO ALVARO BRANDÃO LOPES MARTINS

4. PROFa. DRa. SORAIA KÁTIA PEREIRA COSTA

5. PROF. DR. STEPHEN HYSLOP

Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna.

Data: 28/07/2017

Dedico a minha MÃE e meu

PAI, por representarem

tudo na minha vida.

AGRADECIMENTOS

Esta tese é fruto do trabalho e apoio de inúmeras pessoas, ainda que a memória me

deixe registrar aqui apenas uma parcela delas, espero agradecer a todas.

Agradeço ao meu orientador, Gilberto De Nucci, pela oportunidade dada a mim.

Obrigada por sua disponibilidade, pelo respeito ao nosso trabalho, e pelo ser humano que

você é. A você, meus incondicionais agradecimentos por contribuir na minha formação. Por

disponibilizar a infraestrutura e pelo seu empenho em promover recursos para que o

trabalho pudesse ser desenvolvido.

Agradeço muito a Profa Fabíola Zakia Mónica pela oportunidade, confiança e por

sempre contribuir imensamente com seus comentários argutos e perspectivas no nosso

trabalho. Agradeço a todos os Professores do Departamento de Farmacologia que

contribuíram diretamente na minha formação e, sobretudo por dividirem por muitas às

vezes seus conhecimentos. E aos funcionários do Departamento de Farmacologia, como

reconhecimento do trabalho inestimável dedicado aos alunos. Sou grata especialmente ao

Gustavo, Bruno, Maísa e Cidinha.

Agradeço a algumas pessoas muito especiais: Camila, Tiago, Cristiano, Mauro

Napolitano, Roberta, Fernando e Glaucia por sua amizade. Meus sinceros agradecimentos.

Agradeço aos amigos e colegas do Laboratório: André, Antônio, Noedi, Beto, Sandra, Júlio,

Renan, Edith, Diana, Samara, Fernanda, Evandro, Pedro, Cleber e Cristiane. Agradeço

imensamente ao Mauro Sucupira pela disponibilidade na quantificação dos compostos e

seus ensinamentos.

À minha família, pelo apoio, carinho e amor, especialmente à minha mãe, por

compreender pacientemente a minha ausência. Mãe e Pai são para vocês que ofereço o

resultado deste trabalho e obrigado por tudo que ensinaram a ser. Ao Alex, Paulette, Bia e

Tales pelas coisas que cultivamos e pela sorte de ter vocês em minha vida!

Ao Ivan, pelo amor, apoio, incentivo e paciência dado a mim. Por todos os dias

vividos ao seu lado e ter me ensinado a cada dia ter ações para ser uma pessoa melhor.

À Capes e Fapesp (N. 2010/16947-9, 2011/11828-4, 2013/05475-7 e 2013/08293-

7) e CNPq (N.470374/2013-6) pelo financiamento desta pesquisa.

À todos agradeço, profundamente.

MUITO OBRIGADA!

RESUMO

A terapêutica farmacológica dos inibidores da fosfodiesterase tipo 5 (PDE5) é

considerada como tratamento de primeira linha para a disfunção erétil. Adicionalmente,

são utilizados para o tratamento da hipertensão pulmonar idiopática e hiperplasia

prostática benigna. Todos os inibidores de PDE5 têm semelhanças estruturais com o

monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) e competem pela ligação no sítio catalítico. A

seletividade e afinidade dos inibidores de PDE5 são determinadas pelo contato direto

entre certos resíduos do domínio catalítico, e entender como ocorrem as interações

moleculares pode ajudar no desenvolvimento de novos fármacos. Desse modo, o

presente trabalho pretendeu avaliar uma série de novos derivados de 6,7-dihidro-3H-

oxazolo[3,4-a] pirazina-5,8-diona in silico e in vitro sobre a proteína alvo PDE5, bem

como avaliar a biodisponibilidade das novas moléculas. Neste trabalho, usamos como

ferramenta de estudo a docagem molecular e a simulação de dinâmica molecular para

analisar as interações das novas moléculas com a PDE5, além de utilizar métodos in vitro

para estudar os efeitos dos compostos em células, plaquetas e tecidos humanos e por fim

investigar os parâmetros farmacocinéticos. Os resultados de docagem e dinâmica

molecular sugerem que os resíduos dos bolsões (bolsão-Q, bolsão-H e região L), que

formam o domínio catalítico da PDE5A são orientados para criar uma rede de interações

que acomodam os inibidores da forma mais estável, dependendo das características

moleculares, estruturais e amostragem conformacional. Ademais, nas células de

carcinoma de colón ou T84 os compostos promoveram o aumento dos níveis de GMPc

sem efeito citotóxico. Nas plaquetas os compostos foram capazes de inibir a agregação

após estímulo com o doador de óxido nítrico (nitroprussiato de sódio) e aumentar os

níveis e GMPc e AMPc com melhores resultados na presença do composto BL-106.

Complementarmente, mostramos que os compostos BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236

foram capazes de inibir a enzima fosfodiesterase 5A. A atividade do BL-106 foi

investigada no corpo cavernoso humano e de coelho e em ureter humano mostrando

relaxamento com valores de pEC50 de 6.48 ± 0.20 (coelho), 7.14 ± 0.30 (humano) e 5.88

± 0.38 (humano). Finalmente, espera-se que os resultados apresentados nesta tese

auxiliem no entendimento das interações dos novos compostos com a PDE5. Fornecendo

embasamento químico para a compreensão da ação destes compostos em nível biológico

e que a descoberta destes possam abrir uma nova alternativa para o desenvolvimento de

outros inibidores.

Palavras-chave: Nucleotídeos cíclicos. Modelagem molecular. Plaquetas.

ABSTRACT

The pharmacological therapy with phosphodiesterase type 5 (PDE5) inhibitors is

considered a first line of treatment for erectile dysfunction. In addition, they are used for

the treatment of idiopathic pulmonary hypertension and benign prostatic hyperplasia.

All PDE5 inhibitors have structural similarities with cyclic guanosine monophosphate

(cGMP) and compete for the bond in the catalytic site. The selectivity and affinity of

PDE5 inhibitors are determined by the direct contact between certain residues of the

catalytic domain, and understanding how the molecular interactions occur may help in

the development of new drugs. This study, therefore, sought to assess a series of new

6,7-dihydro-3H-oxazolo[3,4] pyrazine-5,8-dione derivatives through in silico and in vitro

studies on the target protein PDE5, in addition to evaluating the bioavailability of the

new molecules. In this study, we used the molecular docking and molecular dynamics

simulation tools to analyze the interactions of the new molecules with PDE5, in addition

to using in vitro methods to study the effects of the compounds on cells, platelets and

human tissue, and finally, to investigate the pharmacokinetic parameters. The molecular

docking and dynamics results suggest that residues of pocket (Q-pocket, H-pocket and

region L), which form the catalytic domain of PDE5A, are oriented to create a network of

interactions that can accommodate the inhibitors in a more stable way, depending on

the molecular, structural and conformational sampling characteristics. Furthermore, the

compounds promoted increased levels of cGMP in the colon carcinoma or T84 cells

without cytotoxic effect. In the platelets, the compounds were able to inhibit aggregation

after stimulation with the nitric oxide donor (sodium nitroprusside) and to increase the

cGMP and cAMP levels with better results in the presence of the BL-106 compound. In

addition, we showed that the BL-106, BL-220, BL-230 and BL-236 compounds were able

to inhibit the phosphodiesterase 5A enzyme. The activity of BL-106 was investigated in

the corpus cavernosum of a human and rabbit and in a human ureter, showing

relaxation with pEC50 values of 6.48 ± 0.20 (rabbit), 7.14 ± 0.30 (human) and 5.88 ± 0.38

(human). Finally, it is expected that the results presented in this thesis may assist in

understanding the interactions of new compounds with PDE5, providing a foundation

for understanding the action of these compounds on a biological level, and that the

discovery of these mechanisms may open up new alternatives for the development of

other inhibitors.

Keywords: Cyclic nucleotides. Molecular modeling. Platelets

LISTA DE DROGAS

SUBSTÂNCIA PROCEDÊNCIA

Ácido araquidônico Cayman Chemical

BL-106 Laboratório Biolab (Brasil)

BL-106.1 Laboratório Biolab (Brasil)






DMEM-F12 Ham Sigma-Aldrich (EUA)

DMSO Sigma-Aldrich (EUA)

Enterotoxina termoestável tipo A Bachem (EUA)

Estreptomicina Gibco (EUA)

Forscolina Sigma-Aldrich (EUA)

Nitroprussiato de sódio Sigma-Aldrich (EUA)

Noradrenalina Sigma-Aldrich (EUA)

Penicilina Gibco (EUA)

Tadalafil Laboratório Biolab (Brasil)

Tadalafil-d3 C/D/N Isotopes (Canadá)

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AA Ácido araquidônico

AC Adenilato ciclase

ACTB Gene da Beta-actina

Ala Alanina

AMPc Monofosfato cíclico de adenosina

ANOVA Análise de variância

ANP Peptídeo natriurético atrial

ASCinf Área sob a curva de concentração da droga versus tempo do tempo

0 (zero) extrapolada ao infinito

ASCúltimo Área sob a curva de concentração da droga versus tempo do tempo

0 (zero) ao tempo da última concentração

ATCC American Type Culture Cell

ATP Trifosfato de adenosina

BNP Peptídeo natriurético cerebral

C0 Concentração no tempo 0

CAM Ca+2/calmodulina

cDNA DNA complementar

CG Gradiente conjugado

Cl Clearance ou Depuração

CNP Peptídeo natriurético do tipo C

CO2 Dióxido de carbono

CQA Controle de qualidade alto

CQB Controle de qualidade baixo

CQM1 Controle de qualidade médio 1

CQM2 Controle de qualidade médio 2

Cúltimo Concentração correspondente ao último tempo

DE Disfunção erétil

DEPC Dietilpirocarbonato

DMEM-F12 Meio de cultura Eagle’s modificado-F12 Ham’s

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Ácido desoxirribonucleico

DPBS Tampão fosfato salino de Dulbecco

DTNB Ácido 5,5-ditiobis 2-nitrobenzóico

DTT Ditiotreitol

EDRF Fator de relaxamento dependente do endotélio

EDTA Ácido etilenodiaminotetra acético

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

EPM Erro padrão da média

FDA Food and Drug Administration

GC Guanilato ciclase

GCp Guanilato ciclase particulada

GCs Guanilato ciclase solúvel

Gln Glutamina

Glu Glutamato

Gly Glicina

GMPc Monofosfato cíclico de guanosina

GTP Trifosfato de guanosina

HPLC High Performance Liquid Chromatography

Ile Isoleucina

iNOS Óxido nítrico sintase induzível

InsP3 Inositol trifosfato

IP3R Receptor de inositol trifosfato

Ke Constante de eliminação

LDH Lactato desidrogenase

Leu Leucina

MD Dinâmica molecular

Met Metionina

MLC Fosfatase de cadeia leve da miosina

MLCK Kinase de cadeia leve da miosina

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

nNOS Óxido nítrico sintase neuronal

NOS Óxido nítrico sintase

ON Óxido nítrico

PCR Reação em cadeia da polimerase

PCR-RT Reação em cadeia da polimerase em tempo real

pEC50 Antilog da concentração de droga necessária para produzir 50%

do efeito máximo

PDB Protein data bank

PDE Fosfodiesterase

PDE4 Fosfodiesterase tipo 4



Phe Fenilalanina

PKA Proteína kinase dependente de AMPc

PKG Proteína kinase dependente de GMPc

PPP Plasma pobre em plaquetas

PRP Plasma rico em plaquetas

qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa

RMSD Root-mean-square deviation

RNA Ácido ribonucleico

SBF Soro fetal bovino

SNC Sistema nervoso central

SNP Nitroprussiato de sódio

STa Enterotoxina termoestável tipo A

T1/2 Tempo de meia vida

T84 Linhagem celular de carcinoma de cólon humano

TBX Tromboxano

Thr Treonina

Túltimo Tempo da última concentração

Tyr Tirosina

Val Valina

Vasp Fosfoproteína estimulada por vasodilatador

Vd Volume de distribuição

VMD Visual Molecular Dynamics

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Isoformas da família de fosfodiesterases, distribuição e seus principais

substratos. ....................................................................................................................................................... 32

Tabela 2. Descrição dos sistemas considerados em estudos de dinâmica molecular. ..... 50

Tabela 3. Sequências de primers oligonucleotídicos para genes alvo utilizados na RT-

PCR. .................................................................................................................................................................... 56

Tabela 4. Parâmetros farmacocinéticos dos compostos em cães. ............................................ 93

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Cascata de sinalização do GMPc.. ........................................................................................ 28

Figura 2. Alvos do GMPc após a cascata de sinalização. ............................................................... 30

Figura 3. Hidrólise de AMPc e GMPc em AMP e GMP pelas fosfodiesterases. ...................... 33

Figura 4. Diagrama em fita da estrutura cristalográfica da fosfodiesterase 5 (PDB:1XO7).

.............................................................................................................................................................................. 35

Figura 5. Mecanismo de ação dos inibidores de PDE5 na ereção peniana ............................ 37

Figura 6. Desenho representativo dos parâmetros geométricos que definem os

potenciais de interações intra e intermoleculares dos campos de força utilizados em

simulações de dinâmica molecular ........................................................................................................ 42

Figura 7. Estrutura molecular dos novos candidatos a inibidores de fosfodiesterase 5.

.............................................................................................................................................................................. 44

Figura 8. Redocking da molécula do Tadalafil usado como validação da docagem

molecular. ........................................................................................................................................................ 66

Figura 9. Conformações de encaixe molecular e pontuações (score) previstas para os

candidatos a inibidores de PDE5A. ........................................................................................................ 68

Figura 10. Distâncias amostradas entre átomos de oxigênio da carbonila da cadeia

lateral de Gln817 e nitrogênio do grupo indol dos inibidores .................................................... 70

Figura 11. Mapa de distribuições das distâncias para os pares do anel benzeno no grupo

indol dos inibidores com cadeias laterais não polares dos resíduos Phe820 (d1) e Val782

(d2) nas trajetórias de simulação de dinâmica molecular. ........................................................... 71

Figura 12. Interações específicas entre inibidores e resíduos de PDE5, de acordo com as

modificações químicas. ............................................................................................................................... 72

Figura 13. Modelo de interação observado durante as simulações de dinâmica

molecular mostrando a proximidade entre os resíduos do sítio de ligação da PDE5 e

grupamentos dos compostos. .................................................................................................................. 74

Figura 14. Efeito dos compostos na atividade celular metabólica pelo ensaio de MTT.

.............................................................................................................................................................................. 75

Figura 15. Atividade citotóxica dos compostos pelo ensaio de LDH. ...................................... 76

Figura 16. Efeito dos compostos sobre o acúmulo de GMPc em células. ............................... 77

Figura 17. Curva concentração resposta para os compostos no acúmulo de GMPc

induzido por STa em diferentes concentrações (0.01-1 µM) em células T84.. ..................... 78

Figura 18. Expressão do gene PDE5 em células T84 a partir RT-PCR semi-quantitativa.

.............................................................................................................................................................................. 79

Figura 19. Expressão do gene PDE5 em células T84 foi analisada por PCR quantitativa

em tempo real. ............................................................................................................................................... 80

Figura 20. Efeito dos compostos sobre a agregação plaquetária. ............................................ 81

Figura 21. Efeito do BL-106 ou tadalafil sobre a agregação plaquetária. .............................. 82

Figura 22. Efeito do BL-106 sobre a agregação plaquetária ....................................................... 82

Figura 23. Efeito do BL-106 (A) ou Tadalafil (B) na viabilidade das plaquetas pelo

ensaio de MTT. ............................................................................................................................................... 83

Figura 24. Efeito do BL-106 (A) ou Tadalafil (B) sobre os níveis de GMPc em plaquetas

.............................................................................................................................................................................. 84

Figura 25. Efeito do BL-106 sobre os níveis de GMPc em plaquetas na presença de SNP.

.............................................................................................................................................................................. 85

Figura 26. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de GMPc nas plaquetas em

diferentes tempos de incubação. ............................................................................................................ 85

Figura 27. Efeito do BL-106 (A) ou Tadalafil (B) sobre os níveis de GMPc intracelular e

extracelular em plaquetas ......................................................................................................................... 86

Figura 28. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de AMPc em plaquetas ............. 87

Figura 29. Efeito do BL-106 sobre os níveis de AMPc em plaquetas na presença de SNP.

.............................................................................................................................................................................. 87

Figura 30. Efeito dos compostos sobre os níveis de tromboxano B2 em plaquetas .......... 88

Figura 31. Efeito do BL-106 em diferentes concentrações sobre os níveis de tromboxano

B2 em plaquetas ............................................................................................................................................. 89

Figura 32. Inibição da fosfodiesterase 5 pelos compostos. ......................................................... 90

Figura 33. Inibição da fosfodiesterase 5 pelo composto BL-106. ............................................. 90

Figura 34. Curvas concentração-resposta para BL-106 e Tadalafil em corpo cavernoso

de (A) coelho e (B) humano e pré-contraído com fenilefrina ...................................................... 91

Figura 35. Curva concentração-resposta para BL-106 e Tadalafil em ureter humano e

pré-contraído com cloreto de potássio (KCl, 80 mM). .................................................................... 92

Figura 36. Concentração sérica média calculada pela administração endovenosa em

cães na dose de 3 mg/kg. ........................................................................................................................... 92

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 25

1.1 Nucleotídeos cíclicos .................................................................................................................... 26

1.2 Sinalização do GMPc ..................................................................................................................... 27

1.3 Alvos moleculares do GMPc ...................................................................................................... 29

1.3.1 Proteínas kinases dependentes de GMPc ............................................................................ 30

1.3.2 Canais iônicos controlados por GMPc .................................................................................. 31

1.3.3 Fosfodiesterases .......................................................................................................................... 32

1.4 Fosfodiesterase tipo 5 ................................................................................................................. 33

1.5 Estrutura e função da PDE5 ...................................................................................................... 34

1.6 Inibição da PDE5 ............................................................................................................................ 36

1.7 Inibidores de PDE5 ....................................................................................................................... 38

1.8 Docagem molecular ...................................................................................................................... 39

1.9 Simulações de dinâmica molecular ...................................................................................... 40

1.10 Candidatos a inibidores de PDE5 ........................................................................................ 44

2 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................................................... 46

3 OBJETIVOS .................................................................................................................................................. 48

3.1 Objetivo geral ................................................................................................................................... 48

3.2 Objetivos específicos .................................................................................................................... 48

4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................................... 49


4.1.1 Seleção da estrutura da PDE5 para docagem molecular ............................................. 49

4.1.2 Preparo dos ligantes e docagem molecular ....................................................................... 49

4.2 Simulação de dinâmica molecular ........................................................................................ 50

4.3 Ensaio celular ................................................................................................................................... 51

4.3.1 Cultivo celular .............................................................................................................................. 51

4.3.2 Ensaio da atividade metabólica celular por MTT ........................................................... 51

4.3.3 Dosagem de lactato desidrogenase ...................................................................................... 52

4.3.4 Extração de GMPc das células ................................................................................................ 53

4.3.5 Quantificação do nucleotídeos cíclico GMPc ..................................................................... 53

4.3.6 Extração de RNA das células T84 .......................................................................................... 54

4.3.7 Quantificação de RNA das células T84 ................................................................................ 54

4.3.8 Retrotranscripção do RNA....................................................................................................... 55

4.3.9 Reações em cadeia da polimerase ........................................................................................ 55

4.3.10 PCR Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR) ................................................................ 56

4.4 Avaliações dos compostos na agregação de plaquetas humanas ......................... 57

4.4.1 Agregação plaquetária ............................................................................................................. 58

4.4.2 Extração e quantificação de GMPc e AMPc........................................................................ 58

4.4.3 Dosagem do tromboxano B2 ................................................................................................... 59

4.5 Atividade inibitória da fosfodiesterase 5 (PDE5) in vitro ........................................ 59

4.6 Avaliações do composto BL-106 no relaxamento de músculo liso ...................... 59

4.6.1 Animais .......................................................................................................................................... 60

4.6.2 Preparação de corpo cavernoso de coelho......................................................................... 60

4.6.3 Preparação de corpo cavernoso e ureter humanos ........................................................ 60

4.6.4 Banho para corpo cavernoso e ureter humanos .............................................................. 60

4.7 Avaliação farmacocinética ........................................................................................................ 61

4.7.1 Animais .......................................................................................................................................... 61

4.7.2 Administração dos compostos ................................................................................................ 61

4.7.3 Coleta das amostras ................................................................................................................... 62

4.8 Quantificação compostos ........................................................................................................... 62

4.8.1 Curvas de calibração ................................................................................................................. 62

4.8.2 Controles de Qualidade ............................................................................................................. 62

4.8.3 Extração das amostras ............................................................................................................. 63

4.8.4 Condições cromatográficas e espectrometria de massas .............................................. 63

4.8.5 Obtenção dos parâmetros farmacocinéticos ..................................................................... 64

4.9 Análise estatística .......................................................................................................................... 64

5 RESULTADOS ............................................................................................................................................ 66


5.2 Simulação de dinâmica molecular ........................................................................................ 69

5.3 Ensaios in vitro com células ...................................................................................................... 74

5.3.1 Viabilidade e toxicidade celular ............................................................................................ 74

5.3.2 Efeito dos compostos nos níveis de GMPc ........................................................................... 76

5.3.3 Expressão da fosfodiesterase 5 nas células T84 ............................................................... 79

5.4 Efeito dos compostos na agregação plaquetária ........................................................... 80

5.4.1 Viabilidade das plaquetas ........................................................................................................ 83

5.4.2 Efeito dos compostos nos níveis de GMPc nas plaquetas............................................... 84

5.4.3 Efeito dos compostos nos níveis de AMPc nas plaquetas............................................... 86

5.4.4 Efeito do composto BL-106 nas concentrações de tromboxano B2 .......................... 88

5.5 Inibição da PD5A ............................................................................................................................ 89

5.6 Relaxamento induzido pelo composto BL-106 no corpo cavernoso e ureter

......................................................................................................................................................................... 91

5.7 Perfil farmacocinéticos dos compostos ............................................................................. 92

6 DISCUSSÃO ................................................................................................................................................. 95

7 CONCLUSÃO ............................................................................................................................................ 104

7.1 Conclusões ...................................................................................................................................... 104

7.2 Conclusão geral ............................................................................................................................ 105

ANEXO 1........................................................................................................................................................ 118

ANEXO 2........................................................................................................................................................ 119

ANEXO 3........................................................................................................................................................ 120

ANEXO 4........................................................................................................................................................ 122

25

25

1 INTRODUÇÃO

O monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) é um segundo mensageiro

fundamental na via de sinalização intracelular o qual desempenha papéis críticos em

muitos processos fisiológicos que vão desde o relaxamento do músculo liso,1 inibição da

adesão e agregação plaquetária,2 natriurese,3 motilidade do esperma,4 secreção de íons5

ao crescimento e apoptose celular.6-8

A formação do GMPc ocorre pela guanilato ciclase solúvel e/ou guanilato ciclase

particulada que catalisam a conversão de trifosfato de guanosina (GTP) para GMPc. O

GMPc formado atua diretamente através de três principais alvos celulares: as proteínas

kinases dependentes de GMPc,9 canais controlados por nucleotídeos cíclicos e

fosfodiesterases reguladas por GMPc.10

As fosfodiesterases (PDEs) possuem pelo menos 11 famílias de genes diferentes

em mamíferos e são enzimas funcionalmente distintas e altamente regulamentadas. A

atividade das PDEs tem papel de destaque na sinalização celular, pois são responsáveis

por promoverem a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos. A fosfodiesterase 5 (PDE5)

modula as concentrações intracelulares de GMPc para monofosfato de guanosina.11

A regulação do metabolismo dos nucleotídeos cíclicos depende do perfil de

expressão específica dos diferentes tipos de fosfodiesterase num dado tecido. A PDE5 é

considerada uma proteína citosólica e está expressa em vários tecidos, incluindo

próstata,12 bexiga,13 testículos,14 rim,15 células gastrointestinais,16 células de Purkinje do

cerebelo,17 corpo cavernoso18 e plaquetas.19

Dada a importância do GMPc nas vias de sinalização intracelular sua elevação

permitiu identifica-lo como potencial alvo terapêutico. O aumento do GMPc celular

ocorre através da inibição da PDE5. Esta modulação continua sendo uma interessante

abordagem farmacológica. Atualmente, os inibidores de PDE5 como Sildenafil, Tadalafil

e Vardenafil estão aprovados para tratamento da disfunção erétil,20 hipertensão

pulmonar,21,22 insuficiência cardíaca congestiva23 e sintomas do trato urinário inferior

secundários à hiperplasia prostática benigna.15

26

26

Todos os inibidores de PDE5 têm semelhanças estruturais com GMPc e

competem pela ligação no sítio catalítico da PDE5.24 A seletividade e afinidade dos

inibidores de PDE5 são determinadas pelo contato direto entre certos resíduos do

domínio catalítico na porção carboxi-terminal. O domínio catalítico de interação é

dividido em bolsão-Q, bolsão-H e região-L, estes subdomínios acomodam os resíduos

que interagem diretamente com as moléculas inibidoras.25

De maneira geral, já se sabe que determinados resíduos de aminoácidos são

importantes na estabilização e seletividade da ligação do substrato GMPc bem como dos

inibidores vardenafil, sildenafil e tadalafil no domínio catalítico da PDE5. Por outro lado,

tratando de novas moléculas compreender as possíveis interações que estes compostos

podem fazer com a enzima permite extrair informações importantes para planejamento

racional de fármacos. Adicionalmente, associar as técnicas de modelagem molecular no

qual admite-se avaliar estas predições de interação proteína-ligante a ensaios in vitro,

pode contribuir para explicar em parte os possíveis mecanismos de ação de novas

moléculas.

1.1 Nucleotídeos cíclicos

Os nucleotídeos fosfato cíclico de adenosina (AMPc) e monofosfato cíclico de

guanosina (GMPc) são sintetizados pelas enzimas adenilato ciclase e guanilato ciclase,

respectivamente. AMPc e GMPc são segundos mensageiros ubíquos que medeiam as

respostas biológicas a uma grande variedade de estímulos extracelulares, incluindo

hormônios, neurotransmissores, quimiocinas e citocinas.26 O aumento da concentração

destes nucleotídeos cíclicos resulta na ativação de proteína kinase dependente de AMPc

(PKA) e proteína kinase proteína dependente de GMPc (PKG).9

Através das proteínas kinases dependentes de nucleotídeos cíclicos, é possível

controlar vários processos fisiológicos, tais como resposta inflamatória,27 imunitária,28

cardíaca,23 contração do músculo liso,15 resposta visual,27 sinais neuroendócrinos,29

glicogenólise,30 agregação plaquetária,2 condutância dos canais de íons,27 a apoptose e

controle de crescimento.7

27

27

O papel importante do AMPc e do GMPc nas vias de sinalização intracelular

permitiu identifica-los como potenciais alvos terapêuticos.30 Dada a sua relevância por

estarem ligados principalmente a família de enzimas fosfosdiesterases, que hidrolisam

especificamente os nucleotídeos cíclicos, mediando o controle dos níveis de AMPc e

GMPc e seu retorno ao estado basal.31

O AMPc foi descoberto na década de 1950 durante os estudo sobre a regulação

hormonal do metabolismo dos mamíferos e foi considerado uma molécula

sinalizadora.32 Os níveis celulares de AMPc são controlados através da sua síntese pela

adenilato ciclase (AC) que catalisa a ciclização intramolecular de ATP em AMPc

liberando pirofosfato33 e sua degradação acontece através das PDEs.34

Por sua vez, o GMPc foi descoberto na urina de coelho em 1963,35 logo após foi

confirmada sua existência em 1967.36 As concentrações intracelulares de GMPc são

estritamente controladas pela ação da guanilato ciclase e das fosfodiesterases.37-40 O

GMPc produzido medeia o seu efeito em diferentes alvos celulares com as proteína

kinases dependentes de GMPc, os canais catiônicos dependentes de GMPc e as

fosfodiesterases (PDEs).27 A cascata de sinalização segue em mais detalhes na próxima

seção.

1.2 Sinalização do GMPc

A produção de GMPc ocorre por duas isoformas de guanilato ciclase: a guanilato

ciclase solúvel (GCs) e guanilato ciclase particulada (GCp) através das principais vias de

sinalização, pelo óxido nítrico e por peptídeos (Fig. 1) estes eventos acontecem em um

largo espectro de células.1,41

O óxido nítrico ganhou maior destaque após sua identificação como fator de

relaxamento dependente do endotélio (EDRF).42,43 Somente em 1987, o EDRF e o óxido

nítrico foram reconhecidos como sendo uma mesma molécula.44,45 A formação do óxido

nítrico advém da óxido nítrico sintase (NOS), a qual é expressa em três isoformas: óxido

nítrico sintase neuronal (nNOS), óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e óxido nítrico

28

28

sintase endotelial (eNOS), através da ação catalítica da NOS que convertem o aminoácido

precursor L-arginina em ON e L-citrulina.46

Figura 1. Cascata de sinalização do GMPc. O GMPc é produzido pelas guanilato ciclase: particulada (GCp)

e solúvel (GCs), a ativação das guanilato se dá pelos ligantes: peptídeos endógenos como a uroguanilina e

através do óxido nítrico, respectivamente. O GMPc formado pode ativar as isoformas de PDEs, proteína

kinase e canais iônicos controlados por GMPc.

O óxido nítrico após ser sintetizado vai atuar ativando a CGs na subunidade

da porção N-terminal composta por quatro átomos de nitrogênio e um átomo de ferro,

onde se liga formando um complexo heme ferroso nitrosil e promove a mudança

conformacional capaz de ativar a GCs, gerando assim GMPc, que por sua vez ativa outros

alvos moleculares.47

Outra via de ativação da GC envolve os peptídeos natriuréticos, que

compreendem uma família de mediadores polipeptídicos. Os principais peptídeos

natriuréticos são peptídeo natriurético atrial (ANP ou do tipo A), peptídeo natriurético

cerebral (BNP ou do tipo B) e peptídeo natriurético do tipo C (CNP). Os peptídeos

natriuréticos exercem os seus efeitos biológicos ligando-se aos receptores da guanilato

29

29

ciclase associadas a membranas (alternativamente conhecida como guanilato ciclase

particulada).48

O nível de GMPc em toda a célula é determinado principalmente pelo balanço

entre as atividades das GC e das PDEs que hidrolisam o GMPc. O GMPc pode ser carreado

para o meio extracelular das células pela ação de alguns dos membros da família de

proteínas transportadora de resistência a múltiplos fármacos dependente de ATP.49 No

entanto, a sua contribuição quantitativa na exportação do GMPc é pouca quando

comparado com a ação das PDEs.50 O GMPc produzido tanto pela guanilato ciclase

solúvel quanto pela guanilato ciclase particulada tem suas funções celulares exercidas

através da sua ligação em alvos moleculares.

1.3 Alvos moleculares do GMPc

Processos fisiológicos importantes são regulados pela via dependente de GMPc

como por exemplo: o relaxamento do músculo liso vascular e gastrointestinal, a inibição

da agregação plaquetária, o bloqueio da hipertrofia cardíaca, a proteção contra danos de

isquemia e a melhoria das funções cognitivas.9 Estudos sugerem que estes efeitos (Fig.

2) são largamente mediados pela ativação de proteínas kinases dependente de

GMPc,51,52 canais iônicos controlado por GMPc53 e pelas as PDEs.27

30

30

Figura 2. Alvos do GMPc após a cascata de sinalização. Os vários subtipos de guanilato ciclase e seus

vários ligantes capazes de desencadear diversos efeitos em alvos como as proteína kinases, isoformas de

PDEs e canais iônicos controlados por GMPc que estão envolvidos no controle fisiológico em órgãos como

coração, rim, nos vasos sanguíneos e tecido adiposo. Adaptado de Burnett.54

1.3.1 Proteínas kinases dependentes de GMPc

Dentre a família das proteínas kinases existe a PKG. Quando o GMPc se liga aos

seus resíduos de serina ou treonina ocorrem vários eventos de fosforilação a partir de

um doador, normalmente um nucleosídeo trifosfato (por exemplo, ATP),55 que conduz

ao relaxamento como, por exemplo, em células de músculo liso.

O papel da via do ON/GMPc/PKG é muito importante no relaxamento do músculo

liso, o qual parece estar envolvido na regulação de três principais processos: na redução

das concentrações intracelulares de cálcio livre, na regulação da sensibilização do cálcio

e na regulação dos filamentos finos.56

31

31

Além da implicação do GMPc no músculo liso através da PKG, outro papel

importante deste segundo mensageiro é nas plaquetas.57 Nas plaquetas o GMPc aciona a

ativação da PKG e esse processo leva à inibição da agregação plaquetária através da

fosforilação de diferentes alvos.58 As plaquetas expressam principalmente a isoforma

PKG-Iβ localizada no citosol, que pode interagir com substratos diferentes através do

seu domínio N-terminal.59 Adicionalmente, no trato gastrointestinal a isoforma PKG-II

atua na regulação da secreção de água e cloreto, em células intestinais.60

Convém ainda pontuar a sua participação na ossificação,61 no controle da

liberação de renina no rim,62 além da capacidade de promover a abertura de canais de

potássio ativados pelo cálcio, ocasionando o relaxamento das células do músculo liso.51

Durante os últimos anos uma variedade de funções das PKGs tem sido exploradas

principalmente em órgãos periféricos e no SNC.63-65

1.3.2 Canais iônicos controlados por GMPc

Os canais iônicos controlados por GMPc são proteínas de membrana que

desempenham funções relevantes na transdução sensorial em fotorreceptores e

receptores olfativos.66-68 Estas proteínas podem ser encontradas em uma variedade de

células, incluindo células da retina e de gânglios,68 pinealócitos,69 músculo aórtico,70

células epiteliais e esperma.71

O papel fisiológico de maior destaque dos canais iônicos controlados por

GMPc é na fototransdução. Neste mecanismo o GMPc atua na abertura do canal quando

não há passagem de fóton. Entretanto, quando há luz esse mecanismo é controlado pela

PDE6 através de sua hidrólise que permite a passagem de Na+ e K+ resultando no

fechamento e hiperpolarização do canal.72 De maneira geral, a síntese e a degradação do

GMPc no processo de fototransdução são controlados pela guanilato ciclase retiniana e

PDE6.

32

32

1.3.3 Fosfodiesterases

As PDEs são categorizadas em 11 principais tipos, são enzimas

funcionalmente distintas e altamente reguladas.26,73,74 Cada tipo de fosfodiesterase tem

diferentes especificidades de substrato com base em sua capacidade de discriminar

entre GMPc e AMPc (Tabela 1).26

Tabela 1. Isoformas da família de fosfodiesterases, distribuição e seus principais substratos.

Isoforma Seletividade Distribuição primária em tecido

PDE1 AMPc/GMPc Cérebro, pulmão, coração e células do músculo liso

PDE2 AMPc Córtex supra-renal, cérebro, coração, fígado, corpo cavernoso,

olfato bulbo e plaquetas

PDE3 AMPc Linfócitos, pâncreas, fígado, pulmão, coração e tecido adiposo

PDE4 AMPc Linfócitos, pulmão e cérebro.

PDE5 GMPc Corpo cavernoso, pulmão, plaquetas e células de músculo liso

PDE6 GMPc Retina

PDE7 AMPc Células T e músculo esquelético

PDE8 AMPc Testículos, ovário, intestino delgado, cólon

PDE9 GMPc Amplamente expresso no fígado e rim

PDE10 AMPc/GMPc Cérebro

PDE11 AMPc/GMPc Testículos, cérebro, corpo cavernoso, músculo esquelético e

próstata

Fonte: Adaptado de Essayan.28

As PDEs de mamífero compartilham uma organização estrutural comum,

como o domínio catalítico conservado localizado perto da extremidade C-terminal e um

domínio de regulação perto da extremidade N-terminal da proteína.

Complementarmente, apresentam domínios com ligação de íons metálicos como Zn²+,

Mg²+ e Mn²+. 26

Algumas PDEs, tal como a PDE4 e PDE7 são altamente específicas para

hidrólise de AMPc, entretanto, as PDE5, PDE6 e PDE9 são específicos para GMPc. Ao

mesmo tempo que as PDE1, PDE2 e PDE3 hidrolisam ambos os nucleotídeos.28 As

estruturas e os produtos hidrolisados de AMPc e GMPc são mostradas na Figura 3.

33

33

Figura 3. Hidrólise de AMPc e GMPc em AMP e GMP pelas fosfodiesterases.31

Como vimos a regulação do metabolismo dos nucleotídeos cíclicos depende

do perfil de expressão específica dos diferentes tipos de fosfodiesterase num dado

tecido.30 As PDEs são reguladas por diversos mecanismos bioquímicos que incluem a

fosforilização/desfosforilização, a ligação de GMPc ou AMPc em regiões alostéricas, a

ligação de Ca+2/calmodulina e várias interações proteína-proteína. PDEs participam de

diferentes funções fisiológicas no corpo e por inferência, também em diferentes

condições patológicas.31,71 São reconhecidas como bons alvos de fármacos.30

As fosfodiesterases estão expressas em vários tipos de células, tornando-as

um importante regulador da concentração de AMPc e GMPc.27 Ademais, a utilização de

inibidores podem prolongar a ação intracelular dos nucleotídeos cíclicos pelo aumento

de suas taxas. Convém ainda destacar o papel da fosfodiesterase 5 como alvo na

terapêutica da disfunção erétil.11

1.4 Fosfodiesterase tipo 5

A PDE5 foi originalmente identificada, isolada e caracterizada a partir de

plaquetas.75 Mais tarde foi descrita no tecido pulmonar, nos estudos sobre proteína

AMPc

GMPc

34

34

kinase dependente de GMPc e outras proteínas de ligação ao GMPc, também foi

identificada a PDE5A como uma das principais proteínas de ligação ao GMPc.76 Três

variantes da proteína PDE5A foram identificados. O que difere as três variantes

(PDE5A1-A3) são seus N-terminais e exões únicos seguido por uma sequência comum

de 823 aminoácidos.77,78

PDE5 é considerada uma proteína citosólica expressa no coração, placenta,

músculo esquelético, pâncreas, cérebro, fígado, vários tecidos gastrointestinais e

pulmão,16,31,78 também é expressa em plaquetas onde foi originalmente descoberta.75 É

claro está proeminentemente expressa no músculo liso vascular incluindo os tecidos do

pênis.17

Na PDE5 a estabilização da ligação do GMPc acontece pela fosforilação dos

resíduos serina e treonina. A principal responsável por esta fosforilação é a

PKG. Contudo, quando os níveis de GMPc são elevados e GAF-A já está ocupada pelo

GMPc, a PKA pode também fosforilar este local. Esta fosforilação então aumenta a

atividade catalítica de PDE5, através da afinidade de ligação do GMPc para o domínio

GAF.26 Postula-se que este mecanismo proporciona a célula um método para prolongar a

ativação da PDE5 em um ciclo de retroalimentação iniciada pela síntese de GMPc.79

1.5 Estrutura e função da PDE5

As estruturas cristalográficas demostraram que a PDE5 humana é uma

proteína monomérica e tem uma massa molecular de aproximadamente 200 kDa

composta pelo domínio C-terminal onde se encontra o bolsão catalítico com cerca de

364 aminoácidos.25,31 O domínio N-terminal que é caracterizado por apresentar os

domínios reguladores GAF-A e GAF-B que são as regiões de ligação alostérica para o

substrato enzimático GMPc e local de fosforilação (na posição Ser92). Adicionalmente,

PKA e PKG podem fosforilar a PDE5, o que resulta em um aumento da afinidade de

ligação de GMPc no seu sítio de ligação a PDE5, promovendo um processo alostérico e

aumento da atividade da PDE5.80

35

35

A ligação do GMPc aos locais alostéricos provoca também uma mudança

conformacional na enzima aumentando a afinidade do domínio C-terminal da PDE5 para

o substrato e para os inibidores, mesmo na ausência de fosforilação.80 O domínio

catalítico está localizado na extremidade C-terminal da proteína (resíduos de

aminoácidos: 535-860) que contém a ligação de dois íons metálicos divalentes

necessários para a função catalítica (Zn2+ e Mg2+), também presentes em outras PDEs.81

O domínio é composto por vários resíduos que são responsáveis pela seletividade com o

substrato GMPc bem como aos inibidores. Na Figura 4 podemos ver a participação de

alguns resíduos que são de suma importância na especificidade da ligação do GMPc no

sítio catalítico.25

Figura 4. Diagrama em fita da estrutura cristalográfica da fosfodiesterase 5 (PDB:1XO7). Vista ampliada

do sítio catalítico em complexo com GMPc (vermelho), abaixo a molécula do GMPc com os principais

resíduos responsáveis por sua estabilização no domínio catalítico. Adaptado de Sung et al. 2006.25

36

36

A base da purina é mantida fortemente no sítio ativo através de um "grampo

hidrofóbico" formado pelos resíduos Gln817, Phe820, Val782 e Phe786 de cada lado da

molécula e também é estabilizada por meio de interações hidrofóbicas adicionais que

acontecem com os resíduos Phe786 e Ile768 da PDE5A. O grupo hidroxila do anel da

ribose do GMPc está ligado com moléculas de água presentes no bolsão catalítico por

ligações de hidrogênio. Adicionalmente, a ribose tem uma configuração que facilita a

sua estabilização pelos resíduos Leu725, Leu765 e Phe786 na PDE5A.82

Apesar da semelhança estrutural com outras PDEs, a PDE5 exibe afinidade ~

100 vezes maior para GMPc do que para AMPc.11 Outra semelhança importante é na

sequência de aminoácidos dos domínios catalíticos das PDE5 e PDE6, ambas altamente

específicas para GMPc e com ~ 42% de similaridade no seu sítio catalítico, o que as

difere é a taxa catalítica sete vezes mais fraca na PDE6 quando comparada com a PDE5.83

A caracterização estrutural da PDE5 permite novas abordagens na concepção de novos

inibidores que podem auxiliar no tratamento de patologias associadas com o GMPc.

1.6 Inibição da PDE5

A inibição da PDE5 aumenta os níveis de GMPc após a liberação de óxido

nítrico nos terminais nervosos parassimpático durante estimulação sexual, aumentando

assim o relaxamento do músculo liso (Fig. 5). Consequentemente, conduz a diminuição

do tônus vascular nas artérias e no pênis. Isto faz com que ocorra um aumento do fluxo

sanguíneo e um alargamento do tecido cavernoso do pênis induzindo a ereção.38,84

A ereção peniana ocorre quando o sangue intumesce o corpo cavernoso, um

efeito facilitado pelo relaxamento do músculo liso da região peniana. O tônus do

músculo liso é regulado pelo Ca2+ intracelular, que ativa a Ca2+/calmodulina (CaM)

enzima dependente da kinase de cadeia leve da miosina (MLCK) o que leva à fosforilação

e contração da fosfatase de cadeia leve da miosina (MLC).85

37

37

Figura 5. Mecanismo de ação dos inibidores de PDE5 na ereção peniana. Adaptado de Beavo e Brunton.85

A via do óxido nítrico (NO) leva ao relaxamento do músculo liso por

estimulação da guanilato ciclase solúvel (GCs) que resulta na produção de GMPc e na

ativação da proteína kinase dependente de GMPc. A PKG causa relaxamento do músculo

liso por um mecanismo que inclui a redução da concentração citosólica de Ca2+ (pela

exportação de Ca2+ e/ou pela redução do inositol trifosfato (InsP3) mediada pela

mobilização do Ca2+ ao receptor).85 Ocorre também a desfosforilação de cadeias leves de

miosina pela ativação da fosfatase MLC e/ou pelo sequestro de MLCK numa forma

fosforilada que não é prontamente ativada por Ca2+/CaM. Os inibidores de PDE5 atuam

especificamente inibindo a degradação do GMPc celular pela PDE5 e assim prolongam e

aumentam os efeitos do NO/GMPc.85

Apesar da PDE5 ser a principal enzima de metabolização do GMPc no tecido

cavernoso, a estimulação contribui de forma significativa para a vasodilatação.86,87 As

formas mais abundantes das PDEs no corpo cavernoso humano são a PDE5 (cerca de

70%) e PDE2 (30%).88,89 Há relatos de quantidade pouco expressiva de PDE3 e PDE4.90

38

38

Esta é também a razão para os efeitos mínimos sobre a pressão arterial sistêmica

relatados em estudos clínicos com inibidores de PDE5.74

1.7 Inibidores de PDE5

Na medida em que as funções fisiológicas da PDE5 foram elucidadas, a

descoberta e a especificidade de seus inibidores ganharam destaque no meio científico.

Em meados de 1998 a Pfizer aprovou o Sildenafil para o tratamento da disfunção erétil

(DE) atribuída a sua capacidade de inibição da PDE5,91 que levou a um grande avanço na

terapia farmacológica da DE e ao desenvolvimento de outros inibidores da PDE5, como

Vardenafil, Tadalafil e Iodenafil.92,93

Baseados nos efeitos vaso-relaxantes do GMPc, os inibidores de PDE5 foram

originalmente utilizados para o tratamento de hipertensão, hipertensão pulmonar,

incluindo, doença cardíaca coronária e angina.81 Mais tarde, os inibidores de PDE5

surgiram como uma interessante indicação para DE.94 A expressão abundante de PDE5

no corpo cavernoso humano em relação aos outros tecidos é considerada a principal

razão da eficácia clínica dos inibidores de PDE5 no tratamento da DE.18

O sildenafil foi o primeiro fármaco utilizado por via oral para o tratamento da

DE que teve um sucesso comercial notável com vendas mundiais que ultrapassaram 1.5

milhões de dólares em 2001.94 São numerosos os estudos sobre a prevalência,

fisiopatologia e fatores de risco para DE,95 também sobre a sua farmacologia e eficácia

de tratamento.96

Todos os inibidores de PDE5 são análogos do GMPc, que inibem a degradação

do nucleotídeo cíclico e por competirem com a ligação ao sítio catalítico.97 Ademais, o

nível de GMPc é regulado por um equilíbrio entre a taxa de sua síntese através da

guanilato ciclase e a sua hidrólise para o fisiologicamente inativo GMP através da

PDE5.55

Atualmente, formulações dos inibidores de PDE5 indicados para DE, isto é

Sildenafil, Tadalafil e Vardenafil, foram aprovados pela FDA como parte da terapêutica

39

39

para hipertensão pulmonar.22 Apesar do amplo uso terapêutico ainda existem os fatores

relacionados aos efeitos colaterais dos inibidores de PDE5.84 Dentre os efeitos colaterais

mais descritos estão a dor de cabeça e a congestão nasal. Os efeitos podem ser

interpretados como um resultado da dilatação dos vasos arteriais bem como, da inibição

não seletiva da PDE1 que também hidroliza GMPc, localizada predominantemente nas

células do músculo liso vascular.

A dispepsia é frequentemente relatada como um efeito colateral, o que pode

ser explicado pela alta expressão de PDE5 no esôfago inferior, assim como distúrbios

visuais. Os efeitos oftalmológicos estão provavelmente relacionados com a inibição da

atividade da PDE6 presente na retina, que é responsável pelo controle da transdução de

sinal no olho.46,86

Uma alternativa para diminuição dos efeitos colaterais é a maior seletividade

dos inibidores de PDE5. Devido aos avanços nos estudos in silico, agora é possível

resolver algumas problemáticas no desenvolvimento de novas moléculas através da

concepção de fármacos baseados na estrutura do alvo e na modelagem computacional

de potenciais candidatos a fármacos. De forma paralela, é possível utilizar a

complementação experimental para sanar a hipótese de como ocorre a sinalização.

1.8 Docagem molecular

A docagem molecular é baseada em estruturas que são capazes de se ligarem

a um alvo molecular.98 O objetivo desta técnica computacional está relacionada a

identificação de novas entidades químicas, através de abordagens por triagem virtual

que une o algoritmo da busca conformacional e uma função de pontuação. O algoritmo

de busca é capaz de explorar todas as possíveis orientações e conformações de uma

pequena molécula dentro do local de ligação referente ao alvo.99

A docagem molecular explora o espaço conformacional de ligantes flexíveis,

enquanto a estrutura proteica permanece fixa (dependendo do método empregado),

nesta exploração cada conformação que o ligante assume quando está ligado a proteína

é chamada de hit. A cada pose é dado um valor referente à função de pontuação. A

40

40

função de pontuação representa um método matemático aproximado usado para prever

e avaliar as forças de interações entre o ligante e a proteína alvo.100 Durante a triagem

virtual, é bastante comum usar a função de pontuação para selecionar os melhores

candidatos para ensaios biológicos e bioquímicos.100

A escolha da melhor pontuação representa um estágio inicial para

desenvolvimento de novos fármacos onde os melhores candidatos sofrem uma

otimização racional para aperfeiçoar as suas características farmacodinâmicas,

estabilidade, afinidade e seletividade em relação ao alvo biológico, bem como sua

eficácia nos ensaios celulares.101

De fato, o conhecimento da relação entre a estrutura química de uma

molécula e a sua atividade biológica é importante para compreender que tipo de

substituições químicas se espera para melhorar a atividade dos compostos. De forma

semelhante, a simulação de dinâmica molecular pode ser utilizada para estimar as

interações moleculares entre o ligante e macromoléculas biológicas.102

Em particular os cálculos de dinâmica molecular são capazes de estudar alvos

complexos e seus possíveis ligantes, com objetivo de racionalizar os estudos

experimentais e melhorar os resultados da triagem virtual e docagem.103

1.9 Simulações de dinâmica molecular

Simulações de Dinâmica Molecular (MD do inglês Molecular Dynamics) são

utilizadas para estudar como um dado sistema molecular evolui com o tempo,

considerando as interações entre os átomos do ponto de vista da Mecânica Clássica.

Para realizar os cálculos de MD é preciso conhecer as coordenadas iniciais dos átomos,

seus potenciais de interação (intra e intermoleculares) e as equações de movimento

clássicas.104

Existem disponíveis diversos potenciais clássicos para a realização das

simulações de MD, cada um com uma composição própria sobre as equações que

fornecem o potencial resultante. Desta forma, diferentes campos de força, que é a

41

41

combinação da forma funcional com o conjunto dos arquivos de parâmetros de

potenciais e topologia, podem ser utilizados para realizar as simulações MD, como

CHARMM,105,106 OPLS,107 GROMOS108 e AMBER.109 Estes campos de força possuem

funções de energia potencial similares à da Equação 1.1.

∑

∑

∑ [ ]

∑ [(

)

(

)

]

∑

Nesta equação, é uma soma dos potenciais intra e intermoleculares,

como: ligações covalentes (1º termo); ângulos, formados por três átomos adjacentes e

ligados covalentemente (2º termo); torções diedrais, para um conjunto de quatro

átomos (3º termo); potenciais de Lennard-Jones, para pares de átomos que interagem

por forças de Van der Walls (4º termo); e potencial eletrostático, que descreve as

interações entre átomos carregados (5º termo).

Na Equação 1.1 os seguintes parâmetros são definidos: , , , , , , ,

, , . de acordo com cada potencial . Tais parâmetros podem ser obtidos por

métodos experimentais ou cálculos quânticos e faz parte do processo de parametrização

molecular.

Outras contribuições podem ser adicionadas ao cálculo de através de

termos como os potenciais de Urey-Bradley e ângulos impróprios. Portanto, é

composto pelos potenciais que descrevem as interações intramoleculares (ligações,

ângulos e diedros, além de Urey-Bradley e impróprios) e intermoleculares (Lennard-

Jones e Coulomb), mostradas na Figura 6.

42

42

Figura 6. Desenho representativo dos parâmetros geométricos que definem os potenciais de interações

intra e intermoleculares dos campos de força utilizados em simulações de Dinâmica Molecular.

As coordenadas iniciais dos átomos para proteínas podem ser obtidas pelo

banco de dados PDB (Protein Data Bank),110 por exemplo. Os demais componentes como

solventes e contra-íons podem ser adicionados ao sistema para representar a condição

biológica do estudo. O início da simulação se dá pela definição das velocidades iniciais

dos átomos que compõem o sistema, estas velocidades são atribuídas de acordo com a

distribuição de probabilidades de Maxwell-Boltzmann, com a energia cinética do sistema

correspondendo à temperatura termodinâmica. Cada componente da velocidade segue a

distribuição:

(

)

*

+

43

43

Onde: é a probabilidade do átomo de massa na temperatura T ter

velocidade .

Com os parâmetros do campo de força, posições e velocidades iniciais

definidos, as trajetórias podem ser obtidas por integração numérica das equações

diferenciais de movimento. Ou seja, deve se determinar as posições e velocidades em um

passo seguinte , isto é feito através do método de diferenças finitas, com as

posições seguintes sendo calculadas por expansões de Taylor. Os programas de

simulação de MD usam geralmente algoritmos de Verlet,111 ou variações deste como

Velocity-Verlet, implementado no NAMD.112

De modo geral, estes algoritmos calculam as interações entre os átomos

considerando suas posições e as forças que atuam em cada átomo. A força que atua em

cada átomo é calculada pelo gradiente do potencial . Desta forma, usando

a segunda Lei de Newton, a aceleração de cada átomo também é calculada:

, onde é a massa do átomo . Depois do cálculo da aceleração, a

velocidade de cada átomo no instante deve ser calculada:

. Obtendo-se as velocidades em , as novas posições podem ser calculadas

de acordo com: .

Com as novas posições definidas, o programa recalcula os potenciais de

interação, seguido do calculo de força, aceleração, velocidade e novas posições. Diversos

ciclos correspondem a trajetória da simulação e descrevem a evolução temporal do

sistema molecular.

A simulação de MD é uma técnica ideal para buscar informações a respeito

das interações entre macromoléculas alvo e novas moléculas. Sabemos por estudos

prévios que o domínio catalítico da PDE5 apresenta aminoácidos essenciais para a

ligação do GMPc assim como para os inibidores.25 Por outro lado, o trabalho apresenta

novas moléculas com características distintas. Entretanto, estas moléculas apresentam

algumas similaridades com o composto Tadalafil.

Considerando que novos compostos possuem uma maior mobilidade

conformacional devido as suas estruturas, portanto, maior a probabilidade de interações

44

44

com os resíduos do bolsão catalítico da PDE5, a dinâmica de interação com os resíduos

de aminoácidos devem ocorrer de forma alternativa ao do Tadalafil. Entender como

acontece à interação dos novos compostos no bolsão catalítico da PDE5 pode ajudar a

desvendar o mecanismo que envolve a estabilização destas novas moléculas.

1.10 Candidatos a inibidores de PDE5

Novas moléculas derivadas da estrutura principal 6,7-dihidro-3H-

oxazolo[3,4-a] pirazina-5,8-diona foram sintetizadas pela Biolab indústria farmacêutica.

Como representado na Figura 7, podemos ver a estrutura química destes compostos e a

inserção de grupamentos em R1 e R2. A maioria dos novos compostos possuem uma

porção com grupamento metilenodioxifenil conhecido como um grupo químico

importante na eficácia dos inibidores de PDE5.24

Figura 7. Estrutura molecular dos novos candidatos a inibidores de fosfodiesterase 5, em destaque as

modificações estruturais das novas moléculas.

45

45

As modificações químicas nos novos compostos ocorrem em R1 conforme

ilustrado na Figura 7, onde no composto BL-106 há inserção do grupamento

metilenodioxifenil, em BL-106.1 há adição do grupamento metoxibenzeno, BL-106.2 há

adição do anel benzeno e no composto BL-106.3 ocorre a troca em R1 pelo grupamento

clorobenzeno. Enquanto isso, nos compostos BL-220, BL-230 e BL-236 ocorre a

mudança em R2 no grupamento metil ausente em BL-220, no BL-230 a inserção do

grupamento etanol e no composto BL-236 há a inserção de 2-metiletanol.

Embora hajam disponíveis no mercado inibidores de PDE5, o sucesso destas

terapias ainda é muito limitado. Assim, novos compostos podem sugerir novas

abordagens, uma vez que os inibidores de PDE5 são utilizados na clínica para disfunção

erétil, hipertensão pulmonar e sintomas do trato urinário inferior secundários à

hiperplasia prostática benigna. Complementarmente estudos mostram a relação dos

inibidores de PDE5 na potencialização da ação de fármacos antitumorais.113,114

De modo geral, o desenvolvimento de novas moléculas candidatas a

inibidores de PDE5 ainda está em fase inicial dada a complexidade do desenvolvimento

de um medicamento, por certo já passamos por várias etapas importantes. Convém fazer

uma referência especial às técnicas in silico em combinação com as abordagens

bioquímicas através de ensaios in vitro que permitiram percorrer uma grande linha

deste longo processo.

46

46

2 JUSTIFICATIVA

Devido ao papel biológico importante dos nucleotídeos cíclicos, enzimas

como PDE5 são consideradas um potencial alvo para desenvolvimento de fármacos.

Recentemente, os inibidores da PDE5 foram aprovados para uso clínico no tratamento

de sintomas do trato urinário inferior secundários a hiperplasia prostática benigna e

hipertensão pulmonar. A priori estes fármacos eram usados apenas para disfunção

erétil. No entanto, o sucesso da terapia com os inibidores de PDE5 atualmente

disponíveis no mercado ainda é limitado. Ademais, nenhum novo inibidor de PDE5 com

grande eficiência e que tenha sido incluído como uma nova opção terapêutica na clínica

foi reportado nos últimos anos.

A partir deste panorama, uma série de moléculas orgânicas com alta

diversidade estrutural foi sintetizada pela empresa farmacêutica Biolab. Uma

característica importante dos novos compostos aqui apresentados é um esqueleto

químico distinto dos outras moléculas disponíveis no mercado como o Tadaladil e

Sildenafil. Hipoteticamente, os novos inibidores de PDE5 poderiam alcançar uma

seletividade maior, possivelmente por apresentarem uma mobilidade conformacional

que facilite a sua interação com o sítio catalítico da enzima.

Estudos experimentais in vitro demonstraram que o composto BL-106 foi

capaz de relaxar o corpo cavernoso humano e este relaxamento foi dependente da

concentração, reduzindo a contração induzida pela noradrenalina.115 No corpo

cavernoso a enzima PDE5 está intimamente ligada à hidrólise do GMPc, a sua inibição

ocasiona o aumento do GMPc, proporcionando assim o relaxamento da musculatura lisa

e favorecendo a ereção peniana. De maneira concordante, foi demonstrado os efeitos dos

compostos BL-230 e BL-236 no relaxamento do corpo cavernoso de coelho após

contração induzida pela fenilefrina.116

Nesse sentido, consideramos relevante conduzir novos achados para estas

moléculas promissoras, que podem representar novas possibilidades para criação de

inibidores mais específicos (tanto de PDE5 como outras PDEs). Ainda no que tange à

47

47

metodologia, os estudos in silico trazem uma grande novidade, uma vez que as

moléculas estudadas aqui são inéditas.

48

48

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar in silico , in vitro e in vivo as interações e os efeitos dos compostos

candidatos a inibidores de fosfodiesterase 5.

3.2 Objetivos específicos

• Investigar as interações moleculares dos compostos com a PDE5, através de

docagem molecular e simulações de dinâmica molecular.

• Mapear quais os resíduos que podem interagir com os compostos.

• Investigar os efeitos dos compostos no acúmulo do GMPc em células de

carcinoma de cólon (T84).

• Investigar os efeitos dos compostos na agregação de plaquetas humana in vitro,

avaliar as alterações nos níveis de GMPc, AMPc e TBX.

• Avaliar a capacidade inibitória dos compostos sobre a PDE5.

• Analisar a farmacocinética dos compostos administrado por via endovenosa em

cães, utilizando técnica HPLC-MS/MS.

49

49

4 MATERIAL E MÉTODOS


4.1.1 Seleção da estrutura da PDE5 para docagem molecular

Primeiramente foram feitas buscas no banco de dados de proteínas (PDB),110

a procura da estrutura cristalográfica com as coordenadas tridimensionais que

apresentavam resolução de até 3Å. Fez-se a escolha da proteína PDE5A humana código

PDB: 1XOZ e em seguida, foi analisado o arquivo contendo as coordenadas da PDE5

(.pdb) para a presença de ligantes, cofatores e outras informações relevantes.

4.1.2 Preparo dos ligantes e docagem molecular

As estruturas tridimensionais das moléculas estudadas neste trabalho BL-

106, BL-106.1, BL-106.2, BL-106.3, BL-220, BL-230, BL-236 e Tadalafil foram

construídas e minimizadas com o programa ChemBioDraw Ultra 12.0. A otimização da

geometria dos ligantes foi realizada utilizando o campo de força MMFF94. Já com a

estrutura proteica da PDE5A e a estrutura dos compostos preparadas, utilizamos o

programa DockThor para docagem.

Na plataforma DockThor o arquivo da proteína e posteriormente o arquivo

do ligantes foram carregados e os íons de Zn2+ e Mg2+ foram adicionados como cofatores.

O centro de coordenadas da grade para a docagem foi definido pela posição do bolsão

catalítico da PDE5, assim como suas dimensões. Para o experimento foi utilizado o

centro da grade X: 46.96 Y: 33.83 Z: 11.77, com 12Å em cada eixo e em seguida, foi

realizada a docagem. Os resultados foram visualizados usando o programa VMD 1.9.2.

50

50

4.2 Simulação de dinâmica molecular

As simulações foram feitas a partir da estrutura cristalográfica da PDE5A (a

mesma estrutura utilizada nos ensaios de docagem), obtidos a partir do Protein Data

Bank (PDB: 1XOZ), com uma resolução de 1.37Å.25 Os sistemas a serem simulados foram

construídos para estudar as diferenças conformacionais entre PDE5 complexados com

Tadalafil ou compostos (BL-106, BL-106.1, BL-106.2, BL-106.3, BL-220, BL-230 e BL-

236) (Tabela 2).

Tabela 2. Descrição dos sistemas considerados em estudos de dinâmica molecular.

Sistema Notação Moléculas de água Compostos Largura da caixa (Å)

1 BL-106 27000 BL-106 94.70

2 BL-106.1 27000 BL-106.1 94.55

3 BL-106.2 27000 BL-106.2 94.62

4 BL-106.3 27000 BL-106.3 94.61

5 BL-220 27000 BL-220 94.60

6 BL-230 27000 BL-230 94.61

7 BL-236 27000 BL-236 94.70

8 TAD 27000 Tadalafil 94.65

Simulações realizadas em duplicatas independentes.

Os compostos BLs bem como o composto Tadalafil foram alocados de forma

idêntica no sítio catalítico, tal como determinado pela estrutura cristalográfica. As

configurações iniciais foram construídas com Packmol,117 contendo a PDE5 (sem

complexo, complexo com Tadalafil ou com os compostos), com água (27000 moléculas),

com íons Na+ e Cl- para neutralizar a carga da proteína a concentrações de

aproximadamente 0.1 molL-1. Os sistemas foram simulados da seguinte maneira: com

todos os átomos da proteína fixados, a água e o inibidor complexado foram relaxados,

realizando 1000 passos de minimização pelo método de Gradiente-Conjugado (CG)

seguido por 200 os de simulação MD; mantendo somente os átomos de Cα da proteína

51

51

fixados, foram realizadas 500 passos de minimização de CG, seguidas de 200 ps de

simulação MD. Todos os átomos de PDE5 foram liberados e foram realizadas 2.2 ns de

simulação MD. As coordenadas e velocidades finais foram utilizadas para iniciar cada

etapa de produção. Duas simulações de 80 ns foram realizadas para cada sistema em

ensemble NPT a 1 atm e 310.15 K, totalizando 1280 ns. A pressão foi controlada em

banho de Nosé-Hoover Langevin com um coeficiente de amortecimento de 10 ps-1. O

campo de força CHARM foi utilizado para proteína PDE5, íons, água e para os

inibidores.118 Os parâmetros para Tadalafil e novos inibidores foram obtidos a partir do

programa CGenFF47 e o modelo TIP3 foi utilizado para água.107 As simulações foram

realizados com o programa NAMD112 e a visualização foi feita com o VMD.119 As

distâncias entre os átomos foram calculadas utilizando o programa MDAnalysis.

4.3 Ensaio celular

4.3.1 Cultivo celular

A linhagem de cólon carcinoma humano (T84) foi doada pelo Prof. Dr.

Alexander Kots da George Washington University, Estados Unidos. A linhagem T84 foi

cultivada em garrafas de 75 cm2 contendo meio DMEM-F12 suplementados com 10% de

soro fetal bovino e com antibióticos penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100

µg/mL). As células foram mantidas em estufa a 37 °C sob atmosfera úmida contendo 5%

de CO2, com pH do meio de 7.4. Posteriormente, as células T84 foram cultivadas em

placas de 12 poços até atingirem confluência para realização dos ensaios. Semanalmente

estas células foram propagadas para a realização dos experimentos e congelamento.

4.3.2 Ensaio da atividade metabólica celular por MTT

A mensuração da atividade metabólica constitui a base de numerosos ensaios

in vitro para determinar a resposta de uma população de células a fatores externos como

por exemplo a novos fármacos. Utilizando como indicador a redução de sais de

52

52

tetrazólio. O tetrazólio amarelo ou Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazólio conhecido como MTT é reduzido por células metabolicamente ativas,

em parte pela ação das enzimas desidrogenase, para gerar equivalentes redutores como

NADH e NADPH, levando a formação do formazano roxo intracelular que pode ser

solubilizado e quantificado por meios espectrofotométricos.120 Desta forma utilizamos

esta metodologia para avaliar a viabilidade das células T84 e das plaquetas.

Protocolo nas células T84: Em placa de 96 poços foram incubadas células T84

em estufa úmida com 5% de CO2 a 37 °C por 72 h até atingirem confluência de 80-100%.

Foram incubados os compostos na maior concentração testada nas células (50 µM)

durante os tempos de 1, 24 e 48 h. Decorrido o tempo de incubação, o meio foi

substituído por meio sem soro e acrescentado 10 µL do volume de MTT. Incubando por

1-3 h em estufa a 37 °C (até ficar roxo). Este meio foi retirado e substituído pela solução

álcool isopropílico/HCl 0.04 M. A densidade óptica foi medida através do leitor de

microplaca (SpectraMax-M2e – software SPECTRAmax M2e ROM versão 2.1 Molecular

Devices, CA, EUA) em 570 nm.

Protocolo nas plaquetas: Em placa de 96 poços contento a suspensão

plaquetária (1.5 x 108/mL, 50 µL; obtidas conforme descrito na seção 4.4.1) o composto

BL-106 ou Tadalafil (0.01-100 µM) foi incubado por 5 min, 15 min, 30 min ou 60 min,

posteriormente foi adicionado em cada poço 10 µL de solução de Krebs. Finalmente, 10

µL de MTT (5 mg/mL) foram adicionados em cada poço e após incubação por 3 h a 37

°C, a reação foi interrompida com 100 µL de SDS 10% em HCl (0.01 M). A placa foi lida

em leitor de microplacas (Spectramax 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) no

comprimento de onda de 540 nm.

4.3.3 Dosagem de lactato desidrogenase

A liberação da enzima lactato desidrogenase (LDH) uma enzima presente no

meio intracelular mais especificamente no citosol, é liberada para o meio extracelular

quando ocorre a apoptose celular. Desta forma, utilizamos o sobrenadante da cultura de

células T84 para mensurar a LDH colorimetricamente, utilizando o kit de detecção de

53

53

citotoxicidade LDH (Cayman Chemical, MI, USA). As células T84 foram cultivadas numa

placa de 96 poços a uma densidade óptima previamente determinada em 200 µL de

meio de cultura. O Triton X-100 (10%; 20 µL) foi adicionado aos poços contendo células

para obtenção da liberação máxima de LDH (controle positivo) e o tampão de ensaio (20

µL) foi adicionado para se obter a liberação espontânea (controle negativo).

A maior concentração dos compostos (50 µM) usada nos testes com células

T84 foi testada ou veículo foram adicionados (20 µL) e a placa foi incubada em CO2 a 37

°C por 1, 24 e 48 h. Em seguida, as placas foram centrifugadas a 400 x g durante 5 min e

100 µL de sobrenadante foi transferido para uma nova placa de 96 poços para a

realização da reação, onde 100 µL de solução de reação foi adicionada a cada poço. As

placas foram incubadas com agitação suave num agitador orbital durante 30 min à

temperatura ambiente e a absorbância foi lida a 490 nm.

4.3.4 Extração de GMPc das células

As células T84 foram cultivadas em placas de 12 poços. Cada poço foi lavado

por três vezes com DPBS (tampão fosfato salino de Dulbecco). As células foram tratadas

com o veículo (DPBS + 0.1% de DMSO) ou compostos teste (BL-106, 106.1, BL-106.2, BL-

106.3, BL-220, BL-230 e BL-236) ou Tadalafil durante 10 min, em seguida, o acúmulo de

nucleotídeo cíclico foi estimulado com ativador da guanilato particulada, a Enterotoxina

termoestável tipo A (STa) por 10 min. O meio foi aspirado e o nucleotídeo foi extraído

com HCl 0.1 M (0.3 mL por poço) por 20 min sob agitação. As amostras foram coletadas,

centrifugadas e o sobrenadante, contendo os nucleotídeos cíclicos, foi retirado para

quantificação.121 Após centrifugação e separação do sobrenadante as proteínas foram

extraídas com NaOH 0.1 M e dosadas de acordo ao método de Bradford.122

4.3.5 Quantificação do nucleotídeos cíclico GMPc

Os níveis de GMPc foram quantificados utilizando-se o kit da Cayman

(Cayman Chemical, MI, USA) seguindo as instruções do fabricante. Após a diluição e

54

54

acetilação cada amostra foi quantificada em duplicata e os resultados expressos em

pmol de GMPc/mL/mg de proteína.

4.3.6 Extração de RNA das células T84

O RNA total foi extraído a partir de células T84 após a incubação por 10 min

com o composto BL-106, seguido de estimulação ou não com a STa. As células foram

rompidas utilizando 0.5 mL do reagente TRIzol. O RNA foi então extraído com 20% de

clorofórmio, incubando por 3 min. Em seguida o mesmo foi centrifugado a 12000 rpm, a

4 °C, por 15 min. Nesta etapa foi obtida a solução bifásica, uma orgânica e outra aquosa,

a qual contém o RNA.

Posteriormente, a fase aquosa foi transferida para outro tubo de ensaio com

tampa seguida da adição de isopropanol a 100%. O material foi agitado por 10 min em

temperatura ambiente e realizada uma nova centrifugação a 12000 rpm, a 4 °C, por 10

min. O sobrenadante foi descartado, mantendo o pellet onde foi acrescentado etanol

75%. O material foi ressuspendido em tampão de DNase 1X (10 mM Tris-HCl (pH 7.5 a

25 °C), 2.5 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2) e incubou-se de 30 min a 37 °C com 2.5 unidades de

DNase livre de RNase I. Subsequentemente, o RNA foi re-extraído com fenol: clorofórmio

ácido (1:1, v/v - pH 4.5) e o precipitado com 2 volumes de etanol a 100%. Finalmente, o

precipitado foi lavado com etanol a 75% e ressuspensos em volumes variáveis de água

tratada com DEPC (dietilpirocarbonato).

4.3.7 Quantificação de RNA das células T84

A quantificação do RNA foi realizada através da leitura de uma alíquota da

amostra no espectrofotômetro Nanodrop 2000c (ThermoFisher Scientific, MA, EUA), em

comprimento de onda equivalente a 260 nm, considerando que 1DO260nm equivale a 40

µg de RNA/mL.

A relação entre as leituras realizadas a 260 e 280 nm foi utilizada como

parâmetro na estimativa do grau de contaminação do RNA por proteínas.

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55

Invariavelmente, o valor desta relação deve estar contido na faixa de 1.7 a 2.1. A análise

da qualidade do RNA extraído foi realizada por eletroforese da amostra em gel de

agarose 1.2 %, e visualização das bandas 28S e 18S, correspondentes ao RNA

ribossomal.

4.3.8 Retrotranscripção do RNA

O cDNA foi sintetizado a partir de 1.5 µg de RNA total utilizando Superscript

III (200 U/µL). Resumidamente, o RNA total foi misturado com dNTPs 10 mM (solução

dinucleotídeos trifosfato - dATP, dTTP, dCTP, dGTP), e 200 ng de primers em volume

final de 13 µL. Após um passo de desnaturação durante 5 min a 65 °C, os tubos foram

colocados em gelo durante pelo menos 3 min, para evitar a reformação da estrutura

secundária.

Posteriormente, os componentes seguintes foram adicionados à mistura

reacional: tampão de reação 5X, (DTT 0.1 M), 20 U de RnaseOUTTM e 200 U de

Superscript III em 20 µL de volume final. Os primers foram deixados para hibridar com o

RNA durante 5 min a 25 °C e para o alongamento foi deixado em 50 °C durante 60 min. A

reação terminou com um passo final de inativação da enzima (15 min a 70 °C). Um

controle negativo, uma reação que não contêm enzima RT, foi efetuada em paralelo com

cada retro-transcrição.

4.3.9 Reações em cadeia da polimerase

As amplificações de PCR foram realizadas em 25 µL de volume final

utilizando AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, MA, EUA). Para cada 1 µL de

reação de cDNA foram utilizados os seguintes primers:

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Tabela 3. Sequências de primers oligonucleotídicos para genes alvo utilizados na RT-PCR.

Genes Fita molde e codificadora

pde5a-F 5’-GGAAGAGGTTGTTGGTGTAGC-3’

pde5a-R 5’- GTTCTCCAGCAGTGAAGTCTC-3’

H-ACTB-F 5’- CTGGGCATGGAGTCCTGTG-3’

H-ACTB-R 5’- AGGGCAGTGATCTCCTTCTG-3’

O programa de amplificação consistia de 35 ciclos de: desnaturação a 95 °C

durante 30 segundos, primers de anelamento durante 30 segundos a 57 °C e um passo

de alongamento a 72 °C durante 30 segundos. Cada programa foi precedido por um

passo de desnaturação preliminar para 95 °C durante 5 min e seguido por um passo de

alongamento final a 72 °C durante 7 min. As reações de PCR foram realizadas utilizando

um sistema de PCR GeneAmp 2400 (Perkin Elmer, MA, EUA). Os produtos de PCR foram

separados por eletroforese em 1.2% (m/v) de géis de agarose e visualizados sob luz UV,

após coloração com brometo de etídio.

4.3.10 PCR Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR)

As amostras de cDNA utilizadas na reação de qRT-PCR foram quantificadas

num sistema StepOne PlusTM detecção em tempo real (Applied Byosystems, MA, EUA)

usando a mistura SYBRTM Green PCR Master Mix® (Applied Biosytems, USA), que além

de conter todos os reagentes necessários para PCR (dNTP’s, MgCl2, tampão, Taq Ampli-

Gold), contém o corante SYBR Green, uma molécula que emite maior quantidade de sinal

fluorescente ao intercalar com DNA dupla fita.

As reações foram realizadas em placas de 96 poços (Applied Biosystems, MA,

EUA), onde foi feita uma curva com a mistura de todos os cDNA, conforme mostrado no

esquema abaixo:

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Esquema 1. Diluição seriada da curva padrão utilizando todas as amostras e diferentes

fatores de diluição.

Todas as amostras foram ensaiadas em 12 µL de volume final, sendo 6.25 µL

do reagente SYBR Green PCR Master Mix®, 1 µL de amostra de cDNA (na concentração

de 10 ng/dL) e 0.75 µL dos primers na concentração de 300 nM. Em todas as placas

foram pipetados controles negativos, ou seja, para cada primer avaliado foram feitos

poços contendo água estéril em substituição à amostra.

O programa foi iniciado a 95 °C/10 min, seguido de 45 ciclos: 95 °C/15

segundos e 60 °C/1 min. Ao final de uma amplificação normal foi adicionado um passo

de 20 min, no qual a temperatura aumenta gradualmente de 60° para 88 °C. O gene

ACTB constitutiva foi utilizado como padrão endógeno. Expressão gênica relativa foi

calculada pelo método 2-Ct.123

4.4 Avaliações dos compostos na agregação de plaquetas humanas

58

58

4.4.1 Agregação plaquetária

O sangue venoso periférico foi coletado de voluntários saudáveis (Parecer

CEP n° 184.172) que não receberam qualquer medicamento até 10 dias antes do ensaio.

As amostras foram retiradas e adicionadas em tubo de ensaio contendo anticoagulante

citrato de sódio 3,8% (9:1 v/v).

O plasma rico em plaquetas (PRP) foi obtido após a centrifugação do sangue

total à 400 x g, em temperatura ambiente durante 15 min. O sobrenadante

correspondendo ao PRP foi coletado e o sangue remanescente foi novamente

centrifugado à 800 x g, temperatura ambiente durante 12 min, para obtenção do plasma

pobre em plaquetas (PPP). A agregação foi monitorada utilizando-se um agregômetro de

oito canais Platelet Aggregation Profiler, 8 channel PAP-8 V2.0 optics - Bio-Data

Corporation (Bio-Data Corporation, PA, EUA) calibrado para 0% com PRP e 100% com

PPP.

Em cada ensaio, foram utilizadas amostras de 200 µL de PRP adicionados em

cubetas siliconizadas, mantidas sob agitação constante a 37 °C no agregômetro. Foram

adicionados ao PRP os compostos e incubados por 5 min. Foram avaliados também os

efeitos dos compostos na presença de nitroprussiato de sódio/(SNP 0.1 µM). Após a

incubação, foi adicionado o agonista ácido araquidônico na concentração final de 500

µM. A curva de agregação foi registrada durante 5 min.

4.4.2 Extração e quantificação de GMPc e AMPc

O plasma rico em plaquetas foi incubado como descrito no protocolo

experimental e então estimuladas com ácido araquidônico (500 µM) durante 5 min. A

reação foi interrompida adicionando-se etanol absoluto acidificado (99%) a 4°C, e as

amostras agitadas durante 30 segundos. Em seguida, as amostras foram incubadas em

gelo por 30 min e centrifugadas à 4000 x g, 4°C, por 30 min. Os sobrenadantes das

amostras foram recolhidos. As amostras foram secas à 45 °C, sob fluxo constante de

nitrogênio e estocados à -80 °C até a dosagem.

59

59

A dosagem foi realizada utilizando-se kits comerciais da Cayman (Cayman

Chemical, MI, USA), seguindo-se as instruções do fabricante. A leitura foi realizada a 412

nm. O limite de detecção foi de 0.1 pmol/mL para GMPc e AMPc.

4.4.3 Dosagem do tromboxano B2

O plasma rico em plaquetas foi incubado como descrito no protocolo

experimental e então estimuladas com ácido araquidônico (500 µM) durante 5 min. A

reação foi interrompida adicionando-se 60 µL de solução de EDTA 10 mM a 4°C e as

amostras acondicionadas imediatamente em gelo. Em seguida, as amostras foram

centrifugadas à 4000 x g, 4 °C, por 5 min. Os sobrenadantes das amostras foram

recolhidos e armazenado a −80 °C até os ensaios de quantificação. A quantificação foi

realizada utilizando-se kits comerciais da Cayman (Cayman Chemical, MI, USA),

seguindo-se as instruções do fabricante. A leitura foi realizada a 412 nm. O limite de

detecção foi de 5 pg/mL de TBX B2/mL.

4.5 Atividade inibitória da fosfodiesterase 5 (PDE5) in vitro

Em uma placa de 96 poços foram incubados: 25 µL do substrato GMPc, 20 µL

da enzima fosfodiesterase 5A (BPSBioscience, CA, EUA) e 5 µL dos compostos durante 1

h a 37 °C, após a incubação foi adicionado a reação 100 µL do agente de ligação e

incubado por 30 min sob agitação lenta. Em seguida, a placa foi lida por fluorescência

polarizada (Filter Max F5-Molecular Devices, CA, EUA) com comprimentos de onda de

excitação de 485 nm e detecção emitido em 535 nm.

4.6 Avaliações do composto BL-106 no relaxamento de músculo liso

60

60

4.6.1 Animais

Foram utilizados coelhos machos New Zealand adultos (2-3 kg, n=4)

provenientes da granja Anilab (Paulínia, SP). Ração e água foram fornecidas a vontade.

Todos os protocolos realizados tiveram a aprovação prévia da Comissão de Ética no Uso

de Animais da Universidade Estadual de Campinas (protocolo CEUA-UNICAMP 2383-1).

4.6.2 Preparação de corpo cavernoso de coelho

Os animais foram anestesiados com isoflurano (100 mg/kg) e xilazina (10

mg/kg) e exsanguinados por secção da artéria carótida. O pênis do coelho foi retirado na

região de inserção da crura e imediatamente colocado em solução Krebs (pH 7.4)

composição (mM): NaCl (118); NaHCO3 (25); glucose (5.6); KCl 4.7; KH2PO4 (1.2);

MgSO4.7H2O (1.17) e CaCl2.2H2O (2.5). Em seguida, o tecido cavernoso foi dissecado,

após a remoção dos tecidos conectivos e da túnica albugínea.

4.6.3 Preparação de corpo cavernoso e ureter humanos

Foram utilizados corpos cavernosos e ureteres de três pacientes (23-34 anos

de idade, n=3-4) que haviam sido submetidos a múltiplas doações de órgãos após o

consentimento informado da pessoa apropriada. Todos os protocolos realizados tiveram

a aprovação do Comitê de Ética da Universidade Estadual de Campinas (protocolo de

estudo nº 490/2009).

4.6.4 Banho para corpo cavernoso e ureter humanos

Os tecidos foram montados em câmaras de incubação de tecido (10 mL)

preenchidas com solução Krebs; continuamente aeradas com mistura de O2:CO2

(95:5%), mantidas à temperatura de 37 °C. Mudanças na força isométrica foram

registadas utilizando um sistema PowerLab 4/30 de aquisição de dados (Chart software,

versão 7.0; ADInstruments, Colorado Springs, CO).

61

61

Curvas de concentração-resposta foram obtidas contraindo com

noradrenalina (NOR, 10 μM) no caso do corpo cavernoso ou cloreto de potássio (KCl, 80

mM) no caso de ureter através de doses cumulativas (0.0003 - 30 µM). Uma curva de

concentração-resposta do BL-106 foi construída em cada tira. As tiras de controle

(tratadas com DMSO 40 mM) foram também executadas em paralelo a cada

experimento.

4.7 Avaliação farmacocinética

4.7.1 Animais

Foram utilizados cães adultos da raça Beagle pesando 10 – 15 Kg (n=3-5). Os

animais foram alocados no canil do Hospital Veterinário da Universidade Camilo Castelo

Branco na cidade de Fernandópolis – SP (protocolo CEUA-UNICAMP 3340-1). Os animais

foram avaliados clinicamente pelo médico-veterinário responsável e apresentaram

parâmetros cardiorrespiratórios e de temperatura dentro da normalidade. Em todos os

protocolos, no dia anterior ao estudo, os cães ficaram em jejum não hídrico por 8 h antes

do início das coletas. Do mesmo modo, após 6 h de aplicação do composto, os animais

eram reposicionados nas respectivas baias onde se alimentaram e beberam água

normalmente.

4.7.2 Administração dos compostos

Em primeiro lugar foi colocado o colar “Elizabetano” no cão. Em seguida, foi

realizada tricotomia na porção radial dos membros anteriores. Após esse procedimento

foi feita a assepsia no local com auxílio de gaze umedecida em álcool 70%; seguidamente

foi estancado o acesso venoso com garrote pediátrico na porção superior do úmero. Foi

introduzido o cateter 22G em cada membro para administração pela via endovenosa. A

introdução do cateter foi feita de modo que este acesse a veia cefálica e, em seguida, foi

fixado no local com esparadrapo contornando a pata do animal.

62

62

4.7.3 Coleta das amostras

As coletas das amostras de sangue foram realizadas através de cateter

intravenoso 22G introduzido na veia cefálica de uma ou das duas extremidades

anteriores, foram coletados 1.5 mL de sangue em cada tempo de coleta. Os tempos de

coleta foram: pré dose (0:00); 0:02; 0:05; 0:10; 0:15; 0:20 e 0:30 min; 1:00; 2:00; 3:00;

4:00; 6:00; 8:00; 12:00 e 24:00 h (15 coletas no total). As amostras de sangue foram

centrifugadas a 2500 × g por 10 min a 4 °C e o plasma foi coletado e armazenado a −20

°C até os ensaios de quantificação.

4.8 Quantificação compostos

4.8.1 Curvas de calibração

As soluções padrão estoque dos analitos foram preparadas em acetonitrila

em várias concentrações. As curvas de calibração foram preparadas pela adição da

solução padrão no plasma de cão livre de fármacos, rendendo as concentrações de: 20,

50, 100, 200, 500, 1000, 2000 e 3000 ng/mL para os compostos. As concentrações do

padrão interno (Tadalafil - d3) foram mantidas sempre na concentração 5 ng/mL.

4.8.2 Controles de Qualidade

O controle de qualidade é realizado para antecipar os limites dos valores

analíticos. Foram realizados diariamente durante os ensaios as amostras de controle de

qualidade (baixa, média e alta concentração), com a corrida de um novo controle de

qualidade a cada 10 amostras desconhecidas. Amostras foram preparadas em plasma de

cão livre de fármacos para os controles: CQB – 60 ng/mL, CQM1 – 400 ng/mL, CQM2 –

1200 ng/mL e CQA – 3000 ng/mL.

63

63

4.8.3 Extração das amostras

A extração dos compostos foi realizada com 100 µL de amostra de plasma

adicionado em tubos de ensaio seguida da adição de 20 µL de solução de padrão interno

(5 ng/mL Tadalafil - d3) e 20 µL de hidróxido de amônia 50%, as amostras foram

homogeneizadas por 10 s. Uma extração líquido - líquido foi realizada adicionando 2.5

mL de eter/hexano (60:40, v/v), e homogeneizadas por 40 segundos. As amostras foram

depois centrifugadas à 2000 × g por 5 min, congeladas a -80 °C durante 10 min e após a

separação das fases, a fase orgânica foi coletada e evaporada até a secagem por um fluxo

de nitrogênio a temperatura de 45 °C. O resíduo foi dissolvido com 120 µL de

acetonitrila - água (10:90 v/v) - hidróxido de amônia (2.5 mM), e agitado por 10

segundos.

Após a extração, as soluções foram transferidas para uma placa de 96 poços e

acondicionadas para posterior análise por cromatografia líquida acoplada a

espectrometria de massas (LC-MS/MS). Foram injetados 10 µL de amostra. Os

procedimentos apresentados também foram aplicados não só na avaliação das amostras,

mas também para a extração da curva padrão e das amostras do controle de qualidade.

4.8.4 Condições cromatográficas e espectrometria de massas

Os compostos BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 foram quantificados em

plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (LC-MS/MS),

usando Tadalafil - d3 como padrão interno. A detecção das massas foi realizada através

do monitoramento dos íons resultantes no modo MRM. O sistema LC-MS/MS consistiu

de um cromatógrafo líquido LC-10AVP (Shimadzu - Japão) acoplado a um espectrômetro

de massas triplo quadrupolo (Quattro Micro; Waters Micromass, Milford, MA, USA)

equipado com uma fonte de ionização por "electrospray". A integração foi realizada

usando o software MassLynx 4.0 SP4 (Waters Micromass).

A fase estacionária consistiu de uma coluna kinetex 100A XB-C18 2,6 µm (75

mm × 4.6 mm i.d., Phenomenex®, CA, EUA). As análises dos compostos foram realizadas

com uma fase móvel composta por acetonitrila - água (70:30 v/v) + ácido fórmico

64

64

(0.1%) + acetato de amônia (5 mM), sendo os íons detectados em modo positivo. Os

compostos foram eluídos em velocidade de fluxo de 0.350 mL/min. O tempo de corrida

foi de 5 min. As transições para os íons precursores protonados e para os íons de

produto selecionados do composto BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 foram m/z

404/281.8, 389.50/250, 434/250 e 448.2/250.1, respectivamente.

4.8.5 Obtenção dos parâmetros farmacocinéticos

Os logaritmos das concentrações plasmáticas dos compostos foram traçados

graficamente como uma função de tempo. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos

foram obtidos: a área sob a curva de concentração plasmática versus tempo, do tempo

zero ao tempo 24 h, (ASC0-24h) foi calculada através do método da regra trapezoidal. A

extrapolação desta área até o tempo infinito (ASC0-∞) foi realizada pela adição do valor

Cúltimo/Ke à ASC0-24h, onde Cúltimo é a ultima concentração do fármaco determinada

experimentalmente e Ke é a constante de eliminação da fase terminal.

A concentração plasmática inicial (C0) foi obtida pela extrapolação ao tempo

zero desde a fase terminal da eliminação. A constante de eliminação (Ke) foi estimada

pela regressão linear e o meia-vida de eliminação (T½) foi obtida usando a equação T½=

0.693.Ke-1. O volume de distribuição (Vd) foi calculado através da razão da dose

administrada pela concentração plasmática do fármaco ao tempo zero (C0). O software

usado foi o WinNonlin Professional Network - versão 3.2 e GraphPad Prism versão 6.0.

4.9 Análise estatística

Os valores experimentais foram expressos como média ± erro padrão das

médias (E.P.M.) de n experimentos indicados em cada caso. Os dados foram analisados

utilizando a análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey para avaliar

diferenças entre grupos experimentais. Valores de p<0.05 foram considerados

significativos. Os valores de relaxamento provocados pelo composto BL-106 no corpo

cavernoso e ureter foram calculados como percentual da contração induzida, as quais

65

65

foram tomadas como 100%. O programa Graph (GraphPad, version 6.0 Software, EUA)

foi usado para as análises.

66

66

5 RESULTADOS


Para investigar o modo de acoplamento dos compostos na PDE5A e atribuir

uma pontuação para a interação entre os compostos e os resíduos do bolsão catalítico

foram realizados cálculos de docagem. O arquivo PDB utilizado para o presente estudo

contém a estrutura da PDE5A co-cristalizada com o inibidor seletivo Tadalafil.

Portanto, o valor do desvio quadrático médio (RMSD) foi utilizado para a

validação interna do processo de acoplamento, com valor de 0.32Å, este valor obtido foi

bem dentro do limite aceitável (inferior a 2.0Å). Além da pose do Tadalafil no redocking

ser quase completamente sobreposta com a orientação cristalográfica, validando os

parâmetros de docagem (Fig. 8).

Figura 8. Redocking da molécula do Tadalafil usado como validação da docagem molecular. Comparação

entre a estrutura cristalográfica do Tadalafil (azul) e a melhor pose gerada pela docagem molecular

(vermelha).

67

67

A validação indicou que o programa utilizado na docagem pode reproduzir

com precisão a estrutura e a posição das moléculas usadas no estudo.

Consequentemente, o algoritmo de acoplamento e o protocolo foram adequados para as

simulações de docagem com os compostos.

A docagem molecular permite a obtenção de uma pontuação que é útil para

estimar a afinidade de ligação entre a proteína e o ligante através destas funções,

ademais permite selecionar a conformação mais provável.124 Neste sentido,

apresentaremos a seguir os resultados obtidos no estudo das interações dos compostos

com a PDE5 (Fig. 9). Esse estudo visou elucidar as funções de pontuação e quais são as

interações com a PDE5.

BL106.1 Score -8.67

BL106.2 Score -8.10

BL106 Score -8.77

Tadalafil Score -9.34

68

68

Figura 9. Conformações de encaixe molecular e pontuações (score) previstas para os candidatos a

inibidores de PDE5A (verde). As interações intermoleculares são identificadas como ligações de

hidrogênio (vermelho), apolares (azul) e íon-dipolo (preto).

Todos os compostos BLs foram acomodados na bolsão catalítico através de

interações intermoleculares tais como ligações de hidrogênio, não polares e íon-dipolo.

As pontuações para os novos inibidores variaram entre 8.10 a 8.77 kcal/mol.

Os resultados da docagem indicaram claramente que o composto BL-106 foi a

melhor molécula ancorada, apresentando o valor de menor energia de ligação. De modo

geral, as posições dos compostos no bolsão catalítico sugerem a capacidade dos

compostos em inibir a ligação do GMPc no sítio.

BL106.3 Score -8.43

BL220 Score -8.28

BL230 Score -8.39

BL236 Score -8.15

69

69

5.2 Simulação de dinâmica molecular

Considerando a existência de diferentes conformações para os compostos e a

enzima PDE5A, foram realizadas simulações de dinâmica molecular para encontrar

possíveis novas interações entre os ligantes e o alvo. Convém a partir de agora, então,

analisar a mobilidade conformacional do bolsão catalítico. Usamos esse modelo para

refinar os nossos resultados, para assim obtermos uma conformação do sítio ativo que

possibilitasse a ocorrência das interações em um sistema totalmente dinâmico.

A relação estrutura-função não é apenas influenciada pelos resíduos flexíveis

do bolsão catalítico, mas também pelo equilíbrio das interações, incluindo as interações

de ligação de hidrogênio e o empilhamento π-π entre os compostos e a PDE5A.

As ligações de hidrogênio entre os compostos e a PDE5A são muito

importantes, especialmente a ligação de hidrogênio com o resíduo Gln817. Como

mostrado nas Figura 10A e 10B as interações são sempre amostradas em distâncias

superiores a 3Å, com poucas ligações de hidrogênio calculadas entre Gln817.

No entanto, os novos compostos podem ser estabilizados por interações

polares dipolodipolo com anel indol dos compostos. Os compostos BL106.2 e BL220

são fortemente estabilizados pela cadeia lateral da Gln817, indicando que a orientação

espacial destes compostos favorece a exposição do anel indol formando mais facilmente

ligações de hidrogênio com a carbonila do resíduo Gln817.

70

70

Figura 10. Distâncias amostradas entre átomos de oxigênio da carbonila da cadeia lateral de Gln817 e

nitrogênio do grupo indol dos inibidores: (A) Tadalafil e (B) candidatos a inibidores.

Para compreender a progressão na capacidade de adaptação dinâmica do

sítio ativo da PDE5A após a ligação dos compostos, a partir da hipótese de que outros

resíduos importantes podem estabilizar os novos inibidores no bolsão catalítico, fizemos

uma varredura no sítio ativo a fim de buscar quais foram os resíduos responsáveis por

está estabilização.

Como ilustrado na Figura 11 há interações do anel indol de todos os

compostos com os resíduos da Phe820 e Val782. Estes resíduos também são

responsáveis pela estabilização dos compostos Sildenafil, Tadalafil e Vardenafil.25

Esta análise mostrou uma notável frequência na estabilização do composto

BL-106 com ambos os resíduos da Phe820 e Val782, uma característica significativa na

docagem desse inibidor no bolsão catalítico da PDE5A, uma vez que o mesmo não foi

visto para os outros compostos.

71

71

Figura 11. Mapa de distribuições das distâncias para os pares do anel benzeno no grupo indol dos

inibidores com cadeias laterais não polares dos resíduos Phe820 (d1) e Val782 (d2) nas trajetórias de

simulação de dinâmica molecular. A proximidade de todos os novos inibidores com Phe820 foi

frequentemente observada, exceto para BL-106.3. Adicionalmente, BL-106.1 e BL-236 são observados

distantes de Val782.

72

72

Descobrimos que estas são apenas algumas das possibilidades para as

interações do inibidor com o bolsão catalítico e buscamos avaliar as interações para

cada modificação química feita nos inibidores.

Figura 12. Interações específicas entre inibidores e resíduos de PDE5, de acordo com as modificações

químicas. (A) Met816 com BL-106; (B) Ala779 com BL-106.1; (C) Gln817 (d1) e cadeia lateral Met816 (d2)

com BL-106.2; (D) Gln817 com BL-106.3; (E) Tyr612 com BL-220; (F) Gln779 (d1) e Gly659 (d2) com BL-

230; (G) Met805 (d1) e Phe786 (d2) com BL-236.

73

73

Os resultados mostraram que o grupamento metil no composto BL-106

favoreceu sua estabilização com resíduo da Met816 (Fig. 12A), a inserção do

grupamento metoxi faz interações dipolares com backbone da Ala779 (Fig. 12B), a

inserção do anel benzênico no BL-106.2 aumentou seu caráter hidrofóbico (Fig. 12C), o

átomo de cloro no BL-106.3 (Fig. 12D) aumentou a eletronegatividade do anel atraindo

grupamentos carregados positivamente, ligações de hidrogênio com os resíduos Gln817

foram amostradas para os compostos BL-220 devido a ausência do metil no anel de

pirazina (Fig. 12E) e BL-230 a inserção do etanol no mesmo grupamento (Fig. 12F), e

por fim a inserção do radical metil hidrofóbico na BL236 favoreceu interações

intermoleculares não polares (Fig.12G).

A Figura 13 mostra esquematicamente um modelo de interação para cada

composto baseado na posição dos resíduos catalíticos da estrutura modelada dos

compostos com a PDE5A. Podemos observar uma verdadeira rede de interações que

acomodam os compostos da maneira mais estável possível, dependendo de suas

características moleculares, amostragem estrutural e conformacional.

74

74

Figura 13. Modelo de interação observado durante as simulações de dinâmica molecular mostrando a

proximidade entre os resíduos do sítio de ligação da PDE5 e grupamentos dos compostos. Alguns resíduos

são caracterizados pela versatilidade de interações como Met816, Phe820, Val782, Tyr612, Phe786 e

Gln817.

Ao mesmo tempo que as análises in silico geram resultados satisfatórios

como a possibilidade de avaliar em nível molecular as interações de fármacos com alvos

biológicos, o estudo destes pode e muito se beneficiar através de estudos in vitro e in

vivo. Assim, há um sinergismo entre as informações originadas dos estudos in silico com

seus respectivos efeitos in vitro.

5.3 Ensaios in vitro com células

5.3.1 Viabilidade e toxicidade celular

BL236

75

75

A fim de investigar a influência dos compostos na viabilidade celular foi

utilizado o ensaio de MTT. Os resultados mostraram que não houve diminuição da

viabilidade nos tempos de 1 e 24 h (Fig. 14). No entanto, o tratamento com os compostos

Tadalafil, BL-106 e BL-220 mostraram diminuição da viabilidade celular durante o

período de incubação de 48 h nas células T84 (23.18%, 23,82% e 40.83%,

respectivamente).

Figura 14. Efeito dos compostos na atividade celular metabólica pelo ensaio de MTT. Células T84 foram

pré-tratadas com 50 µM dos compostos ou veículo (0.1% DMSO) por 1h, 24h e 48h. As colunas

representam a média + E.P.M. Dados de três experimentos independentes n=9; Two-way ANOVA seguida

pelo teste de Tukey; *p<0.05 comparado com grupo controle.

Dado os resultados no tempo de 48 h, resolvemos investigar melhor o efeito

citotóxico dos compostos, usando um ensaio mais fidedigno, visto que o sal MTT pode

por muitas às vezes interagir com o próprio composto teste.120 Então utilizamos o ensaio

que mensura a liberação da enzima lactato desidrogenase.

76

76

Figura 15. Atividade citotóxica dos compostos pelo ensaio de LDH. Células T84 foram pré-tratadas com

50 µM dos compostos ou veículo (0.1% DMSO) por 1h e 24h. As colunas representam a média + E.P.M.

Dados de três experimentos independentes n=9; Two-way ANOVA seguida pelo teste de Tukey; *p<0.05

comparado com grupo controle.

Os compostos não aumentaram de forma significativa a liberação da enzima

LDH nas células T84. Portanto, não houve influencia dos compostos sobre a viabilidade

celular, sobretudo nas respostas durante os ensaios de GMPc.

5.3.2 Efeito dos compostos nos níveis de GMPc

Com finalidade de verificar e comparar a atividade dos compostos no sistema

celular, foi seguido um modelo bem aceito para mensuração do acúmulo de GMPc, uma

vez que a PDE5 que é expressa em células T84.16 Decidimos avaliar o acúmulo de GMPc

após estimulação do receptor da guanilato ciclase particulada pela enterotoxina estável

(STa) nas células T84. Como visto na Figura 16A, houve o aumento no acúmulo de GMPc

para os compostos Tadalafil, BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 em cerca de 57%, 58%,

34%, 57% e 64%, respectivamente.

77

77

Figura 16. Efeito dos compostos sobre o acúmulo de GMPc em células. (A) Células T84 foram pré-tratadas

com 50 µM dos compostos, seguido de estimulação pela STa (1 µM). (B) Células T84 foram pré-tratadas

com 50 µM dos compostos ou veículo (0.1% DMSO) por 10 min. As colunas representam a média + E.P.M.

Dados de 3 experimentos independentes n=4-6; #p<0.05 comparado com grupo veículo (DPBS + 0.1%

DMSO). *p<0.05 comparado com grupo STa.

Então, para compreender se os compostos são capazes ded estimular o

aumento de GMPc por si só, as células foram incubadas apenas com as moléculas. Apesar

dos compostos terem aumentado os níveis do nucleotídeo cíclico nas células após

estimulação, isso não é visto nas células que não receberam estímulo na guanilato

ciclase. Os dados mostram que não houve mudança significativa nos níveis de GMPc (Fig.

16B).

Observamos que os compostos geraram uma elevação nos níveis de GMPc

após estimulação das células T84. com a STa. Posteriormente avaliamos se essa elevação

é contida em diferentes concentrações de STa como mostrado na Figura 17.

Para isto, foram construídas curvas concentração-resposta com a STa nas

células T84 na presença dos compostos (50 µM), após incubação por 10 min. Em todas

as concentrações de STa (0.01-1 µM) os níveis de GMPc estão elevados após tratamento

com os compostos.

A B

78

78

Figura 17. Curva concentração resposta para os compostos no acúmulo de GMPc induzido por STa em

diferentes concentrações (0.01-1 µM) em células T84. (A) BL-106, (B) BL-220, (C) BL-230, (D) BL-236 e

(E) Tadalafil, na concentração de 50 µM. Os pontos representam a média + E.P.M. Dados de 2

experimentos independentes (n= 6).

A B

C D

E

79

79

5.3.3 Expressão da fosfodiesterase 5 nas células T84

A PDE5A é reconhecida por hidrolisar cerca de 75% do GMPc nas células

T84.16 Por isso, investigamos se o gene da PDE5A estava realmente transcrito nas células

T84 usadas nos ensaios. Conforme ilustrado na Figura 18, foram obtidos produtos de

RT-PCR correspondentes aos transcritos do gene da PDE5.

Figura 18. Expressão do gene PDE5 em células T84 a partir RT-PCR semi-quantitativa. As reações foram

produzidas com (+) e sem (-) RT. Os genes das proteínas codificadas correspondentes em estudo

aparecem abaixo dos respectivos géis. Os valores apresentados são médias + E.P.M de três réplicas

biológicas independentes.

Também foi observada uma diferença na intensidade da banda positiva para

PDE5 na condição estimulada. Para verificar está hipótese, o nível da expressão da PDE5

foi avaliado por PCR-quantitativa em quatro condições.

Baseados nos resultados da docagem molecular, simulação de dinâmica

molecular e acúmulo de GMPc, o efeito putativo do composto BL-106 foi escolhido para

maiores investigações. Tratamos as células T84 com o composto BL-106 ou com a STa

ou com a combinação do BL106+STa e verificamos se o uso BL-106 aumentaria a

expressão da PDE5A (Fig. 19).

80

80

Figura 19. Expressão do gene PDE5 em células T84 foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. Os

níveis de transcritos foram normalizados relativamente ao gene endógeno da ACTB (beta-actina). As

colunas representam a média + E.P.M de três réplicas biológicas independentes.

Sobre a expressão de genes que codificam a PDE5A, os resultados mostraram

que não houve alteração significativamente biológica na expressão após incubação com

composto BL-106.

5.4 Efeito dos compostos na agregação plaquetária

Foi avaliado o efeito dos compostos na agregação de plaquetas humanas

após ativação da agregação pelo ácido araquidônico (Fig. 20). Não houve inibição

significativa em nenhum dos tratamentos (Fig. 20A).

As investigações seguiram para avaliação do efeito dos compostos na

presença do nitroprussiato de sódio (SNP), um doador de óxido nítrico. Primeiramente

checamos a concentração na qual o SNP não apresentasse efeito na inibição da

agregação; a concentração escolhida foi de 0.1 µM.

Diferentemente do observado para a agregação sem estímulo da guanilato

ciclase solúvel, os compostos BL-106, BL-220, BL-230, BL-236 e Tadalafil diminuíram

significativamente a agregação em cerca de 76%, 71%, 75%, 74% e 44%,

respectivamente (Fig. 20B).

81

81

Figura 20. Efeito dos compostos sobre a agregação plaquetária. (A) Plasma rico em plaquetas (PRP) foi

pré-tratado com compostos (30 µM) por 5 min, em seguida as plaquetas foram estimuladas com ácido

araquidônico (AA-500 µM). (B) PRP foi pré-incubado com compostos (30 µM) por 5 min, seguida da

adição de SNP- 0.1 µM, posteriormente o PRP foi estimulado com ácido araquidônico (AA-500 µM).

Colunas representam a média + E.P.M. n=5 indivíduos; *p<0.05 comparado com grupo AA. #p<0.05

comparado com grupo SNP 0.1 µM.

Foi observado uma sutil diminuição da agregação com composto BL-106 na

concentração de 30 µM (Fig. 20A), o que nos indagou a avaliar se o BL-106 poderia ter

um efeito inibitório em outras concentrações. Uma vez que estudo reportam o efeito dos

inibidores de PDE5 como por exemplo o sildenafil que inibe a agregação plaquetária em

concentrações de 100 a 200 µM.125

Como mostrado na Figura 21A o BL-106 inibiu significativamente a

agregação das plaquetas após ativação pelo ácido araquidônico. O mesmo não foi

observado para o Tadalafil (Fig. 21B).

B A

82

82

Figura 21. Efeito do BL-106 ou tadalafil sobre a agregação plaquetária. PRP pré-tratado com (A) BL-106 e

(B) tadalafil em diferentes concentrações por 5 min, em seguida as plaquetas foram estimuladas com

ácido araquidônico (AA-500 µM); (SNP=nitroprussiato de sódio). Colunas representam a média + E.P.M.

n=5 indivíduos.

Também foi observada uma diferença significativa na diminuição da

agregação plaquetária com adição do composto BL-106 após ativação da guanilato

ciclase solúvel com o SNP 0.1 µM (Fig. 22).

Figura 22. Efeito do BL-106 sobre a agregação plaquetária. PRP pré-tratado com BL-106 por 5 min,

seguida da adição de nitroprussiato de sódio (SNP- 0.1 µM), posteriormente o PRP foi estimulado com

ácido araquidônico (AA-500 µM). (n=5 indivíduos) Colunas representam a média + E.P.M. n=5 indivíduos.

*p<0.05 comparado com grupo AA. #p<0.05 comparado com grupo SNP 0.1 µM.

A

A

B

83

83

5.4.1 Viabilidade das plaquetas

A fim de investigar a influência dos inibidores na viabilidade e

posteriormente averiguar se a diminuição da agregação plaquetária em maiores

concentrações poderia ser oriunda da apoptose das plaquetas foi utilizado o ensaio de

MTT. Os resultados mostraram (Fig. 23) que não houve diminuição da viabilidade nos

tempos de incubação 5, 15, 30 e 60 min. Portanto, não houve influencia dos compostos

BL-106 e do Tadalafil sobre a viabilidade celular, sobretudo nas respostas observadas

posteriormente.

Figura 23. Efeito do BL-106 (A) ou Tadalafil (B) na viabilidade das plaquetas pelo ensaio de MTT. As

plaquetas isoladas foram incubadas com BL-106 ou Tadalafil (0.01-100 µM) por 5 min, 15 min, 30 min e

60 min. As colunas representam a média + E.P.M. Dados de três experimentos independentes n=9, (Two-

way ANOVA seguida pelo teste de Tukey). *p<0.05 comparado com grupo basal.

B

A

84

84

5.4.2 Efeito dos compostos nos níveis de GMPc nas plaquetas

Com o objetivo de avaliar as possíveis vias intracelulares de sinalização

envolvidas na inibição da agregação das plaquetas pelo composto BL-106, estudamos o

efeito dos inibidores nos níveis dos nucleotídeos cíclicos. Como observado na Figura 24,

os níveis de GMPc nas plaquetas incubadas com BL-106 ou Tadalafil não aumentaram

significativamente comparado com basal.

Figura 24. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de GMPc em plaquetas. O PRP foi incubado com

(A) BL-106 ou (B) Tadalafil em diferentes concentrações por 5 min seguida da estimulação por ácido

araquidônico (AA-500 µM). As colunas representam a média + E.P.M. n=4 indivíduos; *p<0.05 comparado

com grupo Basal (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

Como a incubação com composto BL-106 não causou alterações nos níveis de

GMPc, corroborando com resultados observados nas células T84, procuramos investigar

se na presença do SNP, os inibidores proporcionariam um aumento dos níveis dos

nucleotídeos cíclicos. A incubação do composto BL-106 com SNP (0.1 μM) aumentou

significantemente a concentração intracelular de GMPc em relação ao grupo SNP (Fig.

25). Entretanto, nas concentrações menores que 30 μM não houve aumento nos níveis

de GMPc.

A B

85

85

Figura 25. Efeito do BL-106 sobre os níveis de GMPc em plaquetas na presença de SNP. O PRP foi pré-

incubado com BL-106 em diferentes concentrações por 5 min, seguida da adição de SNP 0.1 µM.

Posteriormente, o PRP foi estimulado com ácido araquidônico (AA-500 µM). As colunas representam a

média + E.P.M. n=4 indivíduos; #p<0.05 comparado com grupo Basal, *p<0.05 comparado com grupo SNP

0.1 µM (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

Buscamos ainda avaliar os níveis de GMPc em diferentes tempos de

incubação. Realizamos incubações com BL-106 ou Tadalafil, durante 5, 10, 15, 20 e 30

min, frente a estimulação da guanilato ciclase pelo SNP 0.1 µM. A Figura 26 mostra o

acúmulo de GMPc intracelular nas plaquetas durante a evolução temporal.

Figura 26. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de GMPc nas plaquetas em diferentes tempos de

incubação. As plaquetas foram incubadas com (A) BL-106 ou (B) Tadalafil na concentração de 30 µM em

diferentes tempos. As colunas representam a média + E.P.M. n=4 indivíduos; *p<0.05 comparado com

grupo SNP 0.1 µM (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

A B

86

86

Na Figura 26B podemos observar que houve um aumento significativo do

GMPc em 5 min em ambas incubações quando comparado com os demais.

Adicionalmente, avaliamos o nível extracelular do GMPc nas plaquetas após a incubação

com composto BL-106 e Tadalafil. No entanto, não houve aumento significativo do GMPc

extracelular entre os tratamentos (Fig. 27).

Figura 27. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de GMPc intracelular e extracelular em plaquetas.

As plaquetas foram incubadas com BL-106 ou Tadalafil na concentração de 30 µM em diferentes tempos

seguida da adição de SNP 0.1 µM. As colunas representam a média + E.P.M. n=4 indivíduos.

5.4.3 Efeito dos compostos nos níveis de AMPc nas plaquetas

Avaliamos também o efeito dos inibidores nos níveis de AMPc. Assim como

observados no ensaio de GMPc, os compostos estudados não foram capazes de induzir

um aumento nos níveis de AMPc (Fig. 28A).

87

87

Figura 28. Efeito do BL-106 ou Tadalafil sobre os níveis de AMPc em plaquetas. O PRP foi incubado com

(A) BL-106 ou (B) Tadalafil por 5 min, seguida da estimulação por ácido araquidônico (AA-500 µM). As

colunas representam a média + E.P.M. n=4 indivíduos. *p<0.05 comparado com grupo basal (ANOVA

seguido pelo teste de Tukey). (FORSK=Forscolina 3 µM).

As investigações seguiram para avaliando os níveis de AMPc nas plaquetas

que foram incubadas com BL-106 na presença de SNP (Fig. 29), na tentativa de observar

um acúmulo de AMPc, uma vez que a PDE3 pode ser inibida quando há uma

concentração elevada de GMPc. Houve aumento discreto do AMPc com o composto BL-

106 nas concentrações de 3 e 30 µM na presença de SNP 0.1 µM.

Figura 29. Efeito do BL-106 sobre os níveis de AMPc em plaquetas na presença de SNP. O PRP foi incubado

com BL-106 em diferentes concentrações por 5 min, seguida da adição de SNP 0.1 µM posteriormente o

A B

88

88

PRP foi estimulado com ácido araquidônico (AA-500 µM). As colunas representam a média + E.P.M. n=4

indivíduos; *p<0.05 comparado com grupo SNP 0.1 µM; #p<0.05 comparado com grupo basal (ANOVA

seguido pelo teste de Tukey).

5.4.4 Efeito do composto BL-106 nas concentrações de tromboxano B2

Como já é sabido, o ácido araquidônico é um mediador liberado pela ação da

fosfolipase A2 e atua como um potente agonista na agregação de plaquetária, também

atua com um regulador fisiológico na contração das células do músculo liso vascular.126

Ademais, estudos in vivo mostraram que GMPc é capaz de fosforilar receptores de TBX

A2, contribuindo para inibição da ativação plaquetária.127 Por essa razão investigamos os

níveis de tromboxano B2, um metabolito do tromboxano A2 nas plaquetas, após

incubação dos compostos, seguidos pela estimulação do ácido araquidônico. A Figura 30

mostra que todos os compostos foram capazes de diminuir significativamente os níveis

de TBX B2 nas plaquetas.

Figura 30. Efeito dos compostos sobre os níveis de tromboxano B2 em plaquetas. O PRP foi incubado com

10 µM dos compostos por 5 min, seguida da estimulação por ácido araquidônico (AA-500 µM). As colunas

representam a média + E.P.M. n=3-4. *p<0.05 comparado com grupo AA, #p<0.05 comparado com grupo

basal (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

89

89

O composto BL-106 foi escolhido para maiores investigações (Fig. 31).

Verificamos uma diminuição da produção de TBX A2 nas plaquetas quando incubadas

com composto BL-106, podemos observar que esta redução foi dependente da

concentração. Assim, os compostos poderiam conduzir uma diminuição dos níveis de

tromboxano A2 estabelecimento um ganho na inibição da via da agregação plaquetária

com consequências fisiológicas potencialmente importantes.

Figura 31. Efeito do BL-106 em diferentes concentrações sobre os níveis de tromboxano B2 em plaquetas.

(A) O PRP foi incubado com 10 µM dos compostos por 5 min, seguida da estimulação por ácido

araquidônico (AA-500 µM). (B) O PRP foi incubado com diferentes concentrações do composto BL-106

(0.01-100 µM) por 5 min, seguida da estimulação por ácido araquidônico (AA-500 µM). As colunas

representam a média + E.P.M. n=3-4 indivíduos. *p<0.05 comparado com grupo AA (ANOVA seguido pelo

teste de Tukey).

5.5 Inibição da PD5A

O estudo do mecanismo de ação com possíveis inibidores da enzima PDE5 foi

realizado utilizando a técnica de fluorescência polarizada. Na Figura 32 mostra que o

composto BL-106 apresentou maior inibição quando comparado com os compostos BL-

220, BL-230 e BL-236; está diminuição foi de 83%, 74%, 58% e 78%, respectivamente.

90

90

Figura 32. Inibição da fosfodiesterase 5 pelos compostos. Incubação com 10 µM dos compostos BL-106,

BL-220, BL-230 e BL-236. As colunas representam a média + E.P.M. (n=3 experimentos individuais).

Analisamos também, a atividade inibitória do composto BL-106 em

diferentes concentrações. Foi observado um aumento importante na inibição da PDE5

na concentração de 0.01 µM que foi de 53.84% . Do mesmo modo, o Tadalafil inibiu na

concentração de 0.01 µM apenas 12.39% (Fig. 33).

Figura 33. Inibição da fosfodiesterase 5 pelo composto BL-106. Incubação com diferentes concentrações

do BL-106 ou Tadalafil. Resultados foram expressos pela média + E.P.M, (n=3 experimentos individuais).

91

91

5.6 Relaxamento induzido pelo composto BL-106 no corpo cavernoso e ureter

Este ensaio teve como objetivo avaliar o efeito relaxante do composto BL-106

em tecidos isolados que expressam a PDE5 como corpo cavernoso e ureter. Foram

obtidas curvas concentração resposta em ambos os tecidos. Como podemos observar na

Figura 34, o composto BL-106 induziu o relaxamento no corpo cavernoso de coelho e

humano após contração induzida com a fenilefrina, com valores de pEC50 de 6.48 ± 0.20

(coelho) e 7.14 ± 0.30 (humano) para o composto BL-106 e valores de pEC50 de 6.89 ±

0.06 (coelho) e 7.58 ± 0.07 (humano)

Figura 34. Curvas concentração-resposta para BL-106 e Tadalafil em corpo cavernoso de (A) coelho e (B)

humano pré-contraído com fenilefrina. Os pontos representam a média ± E.P.M (n = 4 coelhos e n = 3-4

doadores humanos).

Para verificar os efeitos do composto BL-106 em outro tecido no qual os

inibidores de PDE5 atuam foi analisado o relaxamento em ureter humano. Como

mostrado na Figura 35, ocorreu também nítida redução da contração induzida pelo KCl

de maneira dependente da concentração com valores de pEC50 de 5.88 ± 0.38 para BL-

106 e pEC50 de 6.18 ± 0.16 para Tadalafil.

A B

92

92

Figura 35. Curva concentração-resposta para BL-106 e Tadalafil em ureter humano pré-contraído com

cloreto de potássio (KCl, 80 mM). Os pontos representam a média ± E.P.M (n = 3-4 doadores humanos).

5.7 Perfil farmacocinéticos dos compostos

O perfil farmacocinético dos compostos foi avaliado após administração

endovenosa em cães Beagle seguido de quantificação por LC-MS/MS. As concentrações

séricas médias dos compostos BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 até 24 após a

administração i.v. são apresentadas na Figura 36.

Figura 36. Concentração sérica média calculada pela administração endovenosa em cães na dose de 3

mg/kg. Os pontos representam a média ± E.P.M (n= 3-5).

93

93

Os parâmetros farmacocinéticos dos compostos estão descritos na Tabela 4.

Os resultados mostraram que as concentrações plasmáticas dos compostos aumentaram

rapidamente após a administração endovenosa. Posteriormente, as concentrações

diminuíram com valores t1/2 de 2.18 - 7.27 h, sugerindo uma extensa distribuição nos

tecidos.

Tabela 4. Parâmetros farmacocinéticos dos compostos em cães.

COMPOSTOS

Endovenoso

(3 mg/kg) BL-106 BL-220 BL-230 BL-236

ASCinf

([ng/h]/mL) 4527.58 ± 764.91 2656.11 ± 905.40 13757.99 ± 4072.59 9857.21 ± 351.71

ASCúltimo

([ng/h]/mL) 4258.14 ± 1583.49 2556.90 ± 883.78 14892.72 ± 4773.47 8859.33 ± 586.45

C0

(ng mL) 1258.56 ± 401.56 1448.64 ± 645.63 4226.50 ± 185.95 1474.83 ± 671.79

Cúltimo

(ng mL) 28.25 ± 17.35 30.62 ± 6.11 113.50 ± 60.01 94.55 ± 7.57

ke

(1/h) 0.11 ± 0.01 0.33 ± 0.08 0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.02

t1/2

(h) 6.23 ± 0.63 2.18 ± 0.53 6.67 ± 0.80 7.27 ± 1.14

túltimo

(h) 24.00 ± 0.00 10.40 ± 2.19 24.00 ± 0.00 24.00 ± 0.00

Vd

(L/kg) 8.12 ± 1.52 3.70 ± 0.73 2.02 ± 0.39 3.20 ± 0.61

Cl

(L/h) 9.31 ± 2.64 1.25 ± 0.44 0.21 ± 0.06 0.30 ± 0.01

A depuração total do plasma e o volume de distribuição foram maiores após

administração do composto BL-106 (9.31 ± 2.64 L/h e 8.12 ± 1.52 L/kg),

respectivamente. O composto BL-236 mostrou o maior volume de distribuição em cães

94

94

com valor de t1/2 de 7.27 ± 1.14. Destacam-se também outro parâmetro farmacocinético

a ASC último, que foi maior para o composto BL-230 com 14892.72 ± 4773.47 ng.h/mL.

95

95

6 DISCUSSÃO

A PDE5 é abundantemente expressa em uma ampla gama de células como no

músculo liso do corpo cavernoso e é também encontrada em plaquetas.128 Conduz

respostas vasorelaxadoras e diversos mecanismos bioquímicos. Nas últimas duas

décadas, uma quantidade cada vez maior de evidências através de estudos celulares e

em animais apontaram os potenciais benefícios dos inibidores seletivos da PDE5 em

diversas doenças.81 Entre elas, disfunção erétil,20 hipertensão pulmonar,21,22

insuficiência cardíaca congestiva23 e sintomas do trato urinário inferior secundários à

hiperplasia prostática benigna.15

A análise estrutural da PDE5 permitiu entender a base da seletividade para o

substrato GMPc.25 A análise do domínio catalítico da PDE5 indicou que o arranjo e a

natureza de alguns resíduos na maior proporção de aminoácidos hidrofóbicos são

cruciais para especificidade.82

Desse modo, a identificação do sítio ativo, a conformação dos ligantes e a sua

estabilidade no bolsão catalítico favoreceram a utilização de métodos computacionais.129

Essas ferramentas computacionais especialmente docagem e simulações de dinâmica

molecular podem ter impacto no processo de desenvolvimentos de novos

fármacos.130,131 Portanto, a importância da utilização de métodos computacionais

proporciona uma melhor compreensão e previsão do comportamento de moléculas

complexadas com o alvo.132 Desta forma, neste estudo descrevemos dois estudos

comparando o acoplamento através de docagem e simulações de dinâmica molecular

para investigar as interações entre a PDE5A e as novas moléculas.

Para investigar o modelo de ligação e atribuir uma pontuação para a

interação entre os compostos BLs e a bolsão catalítico da estrutura cristalográfica da

enzima PDE5A (PDB 1XOZ), foram realizados cálculos de energia livre através das

posições de docagem molecular. A capacidade da função de pontuação é identificar os

melhores ligantes para um determinado alvo. Esta pontuação é considerada a partir dos

melhores modos de interação e sua classificação é de acordo com critérios de energia de

96

96

ligação. Os compostos ancorados que apresentarem maior afinidade de ligação com alvo

recebera a maior pontuação, consequentemente, a melhor classificação.133

Outro critério avaliado foi o RMSD (desvio quadrático médio). Conforme

mostrado nos resultados a conformação experimental assumida pelo Tadalafil foi

reproduzida com RMSD de 0.32 Å em relação à estrutura cristalográfica. Os estudos de

docagem molecular sugeriram que a maioria dos compostos apresentam potencial na

inibição na PDE5.

Os dados mostram que todos os compostos se encaixam muito bem no sítio

ativo. Todos os compostos foram acomodados no bolsão catalítico através de interações

intermoleculares tais como ligações de hidrogênio, não polares e eletrostáticas. As

pontuações para os novos inibidores variaram entre 8.10 a 8.77 kcal /mol. No entanto,

entre todos os compostos o BL-106 mostrou melhor energia de ligação na PDE5A com

uma energia de ligação de 8.77 kcal/mol.

A interação espacial do BL-106 no domínio catalítico é estabilizada por

ligações de hidrogênio, sendo observadas nos resíduos Ser661 e Asp724. Enquanto que

interações apolares aconteceram entre os resíduos Leu804 e Phe820. As interações

hidrofóbicas e ligações de hidrogênio desempenham papel importante na manutenção

da estabilidade conformacional de acoplamento dos novos compostos a PDE5.24,25

A análise do composto BL-106 mostrou que a porção metilenodioxifenil se

encaixa bem no sítio ativo e foi coordenada pelos resíduos Phe820 e Gln817, estes

resíduos são importantes na estabilização de inibidores de PDE5.25 O BL-106 exibiu

arranjo espacial dentro do sítio catalítico semelhante ao Tadalafil. A vista do bolsão

catalítico (Fig.9) com composto 106 ilustra claramente a orientação espacial do anel

pirazina com os resíduos hidrofóbicos do sítio ativo, ao passo que o resíduo da Leu804

está envolvido nas interações apolares.

Por conseguinte, com base nos resultados, pode-se inferir que os compostos

podem apresentar propriedades de ligação semelhantes aos inibidores de PDE5 como

Tadadafil e compartilharem o mesmo bolsão catalítico da proteína devido as

conformações de ligação e aos vários resíduos chave na PDE5.

97

97

Entretanto, a mobilidade conformacional dos novos compostos sugerem que

pode haver diferentes possibilidades de interação entre o sítio catalítico e os inibidores.

Considerando a existência de diferentes conformações para os compostos e a enzima

PDE5A, foram realizadas simulações de dinâmica molecular para encontrar novas

interações entre os compostos e a enzima. Entretanto, agora analisando a mobilidade

conformacional dos compostos e principalmente do bolsão catalítico.

A PDE5 é composta por vários domínios, no qual o domínio C-terminal é onde

o sítio ativo está localizado.25,97 O domínio C-terminal é dividido em outros subdomínios

os quais são: sítio M, bolsão Q, bolsão H e região L, estes bolsões compõem do sítio

catalítico da PDE5A. Sung e colaboradores25 descreveram os resíduos essenciais para

interação e estabilização de moléculas, mostrando que cada bolsão apresenta

particularidades que os dão a possibilidade de seletividade para o substrato. Assim

como para moléculas que competem com o substrato para mesmo local bem como para

diferentes locais de ligação.

Portanto, buscamos entender melhor como as novas moléculas poderiam

interagir com os resíduos de cada subdomínio dentro do bolsão catalítico. Um resíduo

com grande contribuição para estabilização é a Gln817, que apesar das baixas

probabilidades na formação de ligações de hidrogênio entre os novos inibidores com a

sua cadeia lateral, existe a participação de outros resíduos na estabilização dos

compostos com o domínio catalítico.

Isso porque possivelmente à mobilidade do anel indol auxiliou na melhor

estabilização destes compostos, possibilitando a interação com diferentes resíduos. Os

resultados mostraram que houve interações do anel de indol dos inibidores com as

cadeias laterais de resíduos hidrofóbicos Val782 e Phe820, mostrando as interações

apolares no bolsão da PDE5, especialmente para BL-106, BL106.2, BL-106.3, BL220 e

Tadalafil. Essas interações apolares π foram amostras muitas vezes entre o anel benzeno

e anel indol da Phe820 para todos os inibidores (d1).

As simulações de MD mostraram que o Tadalafil interagiu fortemente com

Gln817, Phe820, Ile768, Tyr612, Ala767 e Val782, como descrito na literatura.25,97 Em

geral, este perfil de interação também foi observado para os compostos BL-106,

98

98

BL106.2, BL106.3 e BL-220. A mobilidade conformacional do anel indol dos novos

inibidores aumenta a probabilidade de interações com outros resíduos da proteína. Isto

é verificado para os inibidores: BL106 (Phe820, Leu765, Leu725, Thr761); BL106.1

(Phe820, Tyr612, Leu765, Leu725); BL106.2 (Gln817, Phe820, Ile768, Tyr612, Ala767,

Val782, Leu765); BL106-3 (Phe820, Ile768, Tyr612, Ala767, Val782, Leu765); BL220

(Gln817, Phe820, Ile768, Tyr 612, Ala767, Val782, Leu765); BL230 (Phe820, Tyr612,

Leu765) e BL236 (Phe820, Tyr612, Leu765, Leu725, Thr761). Para todos os inibidores

foi observada uma elevada afinidade para Phe820, sugerindo a importância deste

resíduo em manter os novos inibidores no sítio catalítico, tal como descrito para o

Sildenafil, Tadalafil e Vardenafil.25

Para manter a molécula inibidora no sítio catalítico é necessária a interação

de outros grupos, tais como metilenodioxifenil no bolsão H e anel metilpirazina na

região L. Os resíduos que compõem bolsão H (tal como Ala783, Phe786, Phe787, Leu804

e Ile813) e a região L (Met816) agem em conjunto para estabilizar os inibidores na

PDE5.24,25 Descobrimos que estas são apenas algumas possibilidades para as interações

dos inibidores com a PDE5.

Também avaliamos como as modificações químicas influenciariam na

estabilização dos compostos no sítio catalítico. Curiosamente Met816 pode estabilizar os

inibidores através de interações diretas com o backbone, como observados para BL106.

Alternativamente, a Ala779 pode estabilizar os inibidores por sua cadeia lateral e a

backbone através de interações hidrofóbicas ou dipolo entre agrupamento metoxi

(BL106.1) e o grupo carbonila.

As modificações químicas realizadas no composto BL106.2 aumentaram o

seu carácter hidrofóbico (substituição do grupo metilenodioxifenil pelo anel benzeno),

neste sentido, foram observadas interações com o carbono não polar do resíduo da

cadeia lateral da Met816. Outra possível estabilização pode ocorrer através da interação

com Gln817. O átomo de cloro adicionado no anel de benzeno proporcionou uma alta

eletronegatividade, tal como pode favorecer as interações dipolares, onde o halogêneo é

atraído eletrostaticamente por átomos de resíduo carregados positivamente. Isto foi

verificado pela possibilidade de interação com a cadeia lateral da Gln817,

especificamente está interação ocorre entre os átomos de cloro e nitrogênio (NH2 Cl).

99

99

No composto BL-220 a substituição do grupo metil no anel da pirazina pelo

átomo de hidrogênio faz com que aconteça múltiplas ligações de hidrogênio com cadeia

lateral da Tyr612. Os compostos BL230 e BL236 têm alterações semelhantes como a

inserção de grupamentos como o etanol e metiletanol adicionado em ambos os casos.

Possibilitando a amostragem de novas interações realizadas com o resíduo Gln817

(usando BL230 ou BL236 com o grupo hidroxila do átomo de nitrogênio do resíduo da

amida, mediada pela hidroxila ou hidrogênios da amida). Interações com backbone da

Gly659 também foram observados devido aos dipolos do oxigênio da carbonila com as

hidroxilas etanólicas, mediadas pelo hidrogênio. Entretanto, não orientada suficiente

para formar ligações de hidrogênio. A inserção do radical hidrofóbico metil no BL236

favoreceu as interações intermoleculares não polares, como observado para Phe786.

Além disso, também foi observada a interação do BL-236 com Met805.

As simulações de MD mostraram que todos os inibidores incluindo o

Tadalafil apresentaram o mesmo perfil de interação com este resíduo. Além disso,

observou-se que a Phe820 desempenha um papel importante na estabilização deste

grupo para todos os inibidores. Os resíduos dos bolsões que constituem o sítio catalítico

da PDE5 (bolsão-Q, bolsão-H e região L) não interagem unidirecionalmente, isto é, com

apenas um ou outro anel específico do inibidor.

O que acontece na verdade é uma rede de interações que acomodam o

inibidor mais estável possível, dependendo de suas características moleculares,

amostragem estrutural e conformacional. Um aspecto interessante é que determinados

resíduos (por exemplo, Phe820, Tyr612 e Gln817) podem estabilizar as diferentes

partes do mesmo inibidor, isto é possível devido às conformações tridimensionais

permitidas, principalmente para os novos inibidores estudados aqui.

Alguns resíduos mostraram ser muito importante devido à possibilidade de

estabilizar as diferentes partes de inibidores, tais como: Met816, Phe820, Val782,

Tyr612, Phe786 e Gln817. As análises in silico permitiram avaliar a inibição da PDE5A e

como a inibição está associada ao modo de interação com os resíduos do domínio

catalítico da enzima. No entanto, é necessário análises in vitro para estabelecer a

atividade de inibição de PDE5 dos compostos.

100

100

Primeiramente visamos assegurar que as possíveis respostas adivinham de

células viáveis. Os resultados mostraram que nenhum dos compostos estudados induziu

alterações significativas na viabilidade celular no tempo de incubação adotado no

estudo, adicionalmente, não afetou a viabilidade celular quando incubados durante o

maior tempo de 48 h.

Ademais, estudos têm mostrado que os inibidores de PDE5 podem

potencializar a ação de fármacos antitumorais e aumentar a sensibilidade de diversos

tipos de câncer para os fármacos quimioterápicos.6,113,114 O aumento de GMPc tem sido

reportado como um mecanismo capaz de interferir na apoptose e a proliferação de

várias linhagens de células mutagênicas como de mama, próstata e cólon,114,134 bem

como células em cultura primária derivada de câncer de cólon.135

Os níveis de GMPc nas células T84 são regulados principalmente pela PDE5.

Por sua vez a PDE5 é caracterizada por ter uma elevada afinidade nos sítios de ligação

para GMPc.136 Por está razão, buscamos verificar e comparar a atividade dos compostos

em um sistema celular, seguindo um modelo bem aceito para mensurar os níveis de

GMPc em células de carcinoma de cólon.121

Nossos resultados mostraram que os compostos foram capazes de aumentar

os níveis de GMPc nas células estimuladas com STa em diferentes concentrações,

refletindo uma provável inibição da PDE5. Contudo, o mesmo comportamento não foi

observado na incubação nas células apenas com os compostos. Ademais, resultados

semelhantes foram relatados por Sopory e colaboradores,16 utilizando citrato de

sildenafil. Estes achados levaram a investigações adicionais sobre uma possível

modulação na expressão da PDE5A. Entretanto, o composto BL-106 não foi capaz de

influenciar na expressão da enzima nas células na presença e ausência de STa.

Interessantemente, a expressão da PDE5 também ocorre em plaquetas, local

onde foi inicialmente descoberta,75 assim como as isoformas PDE2 e PDE3.9 Atualmente,

as plaquetas apresentam um papel importante nas doenças cardiovasculares e

emergiram como um bom alvo terapêutico.137 Neste sentido, a elevação de GMPc através

da inibição de PDE5 pode ser de grande valia uma vez que é responsável pela regulação

da amplitude e a duração do GMPc intracelular.

101

101

A consequência mais imediata, da inibição da PDE5 nas plaquetas é o

acúmulo do GMPc, que induz a ativação de proteínas kinases que fosforilam substratos

específicos, tais como fosfoproteína estimulada por vasodilatador (VASP), impedindo a

ativação plaquetária.138 Desse modo, julgamos relevante avaliar os efeitos do BL-106

sobre os níveis de GMPc, AMPc e TBX B2 nas plaquetas.

Os resultados demonstraram que o BL-106 aumentou significativamente os

níveis de GMPc e AMPc, o que poderia explicar, pelo menos em parte, a interação com

PDE5 nas plaquetas. Neste sentido, Gudmundsdóttir e colaboradores125 demonstraram

que o sildenafil inibe a agregação plaquetária in vitro através da sua capacidade de inibir

a PDE5 potencializando o efeito o nitroprussiato de sódio. É descrito que os inibidores

de fosfodiesterases atuam aumentando os segundos mensageiros intracelulares nas

plaquetas tais como GMPc e AMPc.19,58

Complementarmente, o tromboxano A2, sintetizado principalmente por

plaquetas, tido como um vasoconstritor potente e um estimulador da agregação

plaquetária também pode ser modulado pelo GMPc. Estudos do mapeamento de

peptídeos demonstraram que o GMPc pode mediar efeitos sob a fosforilação do domínio

carboxi-terminal do receptor do TBX A2.127 Os dados apresentados mostraram que todos

os compostos foram capazes de reduzir significativamente os níveis de TBX. Dessa

forma, não se poderia descartar um possível efeito antiplaquetário contribuindo

diretamente para a inibição da ativação plaquetária.

Por conseguinte, finalmente avaliamos a atividade inibitória dos compostos

frente a PDE5. O composto BL-106 mostrou ter uma afinidade melhor, que pode ser

explicada pelo fato das várias posições conformacionais de sua estrutura favorecendo

assim maiores e melhores interações com o domínio catalítico da enzima. Esse fato pode

ser observado através dos dados de docagem e de dinâmica molecular.

Ao passo que o GMPc é um regulador fisiológico crucial da vasodilatação

induzida por óxido nítrico (que leva à ereção do pênis) que ocorre após a estimulação

sexual e dado que PDE5 tem uma expressão relativamente alta no corpo cavernoso, os

inibidores de PDE5 podem ser usados para prevenir a degradação de GMPc e, assim,

102

102

aumentar a função erétil em homens não afetados ou em pacientes com disfunção

erétil.27

Pelo fato do composto BL-106 ter sido capaz de aumentar os níveis de GMPc

celular, foram realizadas curvas de concentração dose resposta em corpo cavernoso (de

coelho ou humano) e ureter isolado. O BL106 produziu relaxamento dependente da

concentração no isolado do corpo cavernoso e no ureter. Estes resultados são

interessantes porque a PDE5 é a isoenzima mais importante no corpo cavernoso,

responsável pela atividade hidrolítica do GMPc nas células do músculo liso do pênis.11

Adicionalmente, a expressão da PDE5 não é restrita para o corpo cavernoso, também é

encontrada nas células do músculo liso da aorta, coração, plaquetas, placenta, músculo

esquelético, pâncreas e, em menor grau, em cérebro, fígado e pulmão.77

A diferença em valores pEC50 entre os tecidos pode estar relacionada com a

seletividade e a distribuição da PDE5, uma vez que a regulação do metabolismo dos

nucleotídeos cíclicos depende do perfil de expressão específica dos diferentes tipos de

fosfodiesterase num dado tecido.30 PDE5 é menos expressa no ureter, quando

comparado com a sua distribuição no corpo cavernoso.128,139 Também ocorre a

influência das isoformas na degradação do GMPc nestes diferentes tecidos, as possíveis

diferenças funcionais entre as isoformas de PDE5 podem influir na localização

subcelular, atividade enzimática e sensibilidade a inibidores.77,128,140

Outro aspecto interessante que também devemos considerar são os

parâmetros de farmacocinética. Os modelos cinéticos fornecem um meio robusto de

avaliar como ocorre a cinética de distribuição para uma determinada molécula no

organismo.141 Esses modelos fornecem informações importantes sobre a absorção,

distribuição e eliminação de um fármaco dentro de uma escala de tempo. Além disso,

auxilia a estabeler como diferentes mecanismos estão relacionados, identificando quais

estratégias podem simultaneamente alterar cada parâmetro.142

O comportamento farmacocinético de novos fármacos é primeiramente

determinado em modelos experimentais com animais antes de serem administrados em

humanos. Neste sentido avaliamos os perfis farmacocinéticos dos novos compostos em

cães da raça Beagle, onde o composto BL-236 apresentou melhor perfil farmacocinético

103

103

devido ao maior t1/2, o que é desejável do ponto de vista terapêutico.143 Por conseguinte,

é necessário desenvolver formulações para administração oral dos novos compostos. Os

achados forneceram o passo inicial da farmacocinética destes novas moléculas o que

deve ser considerado para melhora da absorção antes da sua aplicação na clínica.

104

104

7 CONCLUSÃO

7.1 Conclusões

A docagem molecular mostrou melhor valor de pontuação para BL-106.

Foram detalhadas as interações do anel indol dos inibidores BL-106.2 e

BL-220 com a cadeia lateral Gln817. Devido à mobilidade deste anel nos novos

inibidores, foram colhidas outras interações, por exemplo, com cadeias laterais

de resíduos hidrofóbicos Val782 e Phe820.

Em geral, os resíduos dos bolsões (bolsão-Q, bolsão-H e região L) que

compreendem o domínio catalítico de PDE5A são orientados criando uma rede

de interações que acomodaram os inibidores da forma mais estável,

dependendo da estrutura molecular dos inibidores e da capacidade rotacional

dos seus grupos. É interessante notar que nesta rede de interações, alguns

resíduos têm grande importância (especialmente Phe820, Tyr612 e Gln817)

que pode estabilizar diferentes grupos do mesmo inibidor.

Os ensaios demonstraram que estes novos inibidores não apresentavam

toxicidade celular. Os compostos aumentam os níveis GMPc na linhagem

celular testada bem como nas plaquetas. Ademais, o composto BL-106

aumentou os níveis de AMPc e diminuiu os níveis de tromboxano nas

plaquetas

O composto BL-106 induziu relaxamento eficaz no corpo cavernoso, ureter

e na inibição da agregação plaquetária.

Os compostos BL-106, BL-220, BL-230 e BL-236 inibiram a PDE5A in vitro,

com maior valor de inibição para o BL-106.

105

105

O perfil farmacocinético mostrou extensa distribuição tecidual dos

compostos.

7.2 Conclusão geral

Em conclusão, os resultados proporcionam uma percepção da rede molecular

de interação que ocorre no sítio catalítico de PDE5 com os novos compostos

apresentados aqui. Os novos compostos apresentam potencial para serem utilizados

como novos inibidores de PDE5.

106

106

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ANEXO 1

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ANEXO 2

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ANEXO 3

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ANEXO 4

avaliaÇÃo in silico, in vitro e in vivo de compostos …€¦ · ip3r receptor de inositol...

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