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Avaliação da Biossegurança Alimentar de Genótipos... PAULA, S. M. A.

1

AVALIAÇÃO DA BIOSSEGURANÇA ALIMENTAR DE

GENÓTIPOS DE FEIJÃO CAUPI (Vigna unguiculata L. WALP)

SUSCETÍVEL E RESISTENTE AO Callosobruchus maculatus

(FABR. 1775 ).

SILVIA MARIA ALVES DE PAULA

FORTALEZA-CEARÁ

2008


2

AVALIAÇÃO DA BIOSSEGURANÇA ALIMENTAR DE

GENÓTIPOS DE FEIJÃO CAUPI (Vigna unguiculata L. WALP)

SUSCETÍVEL E RESISTENTE Callosobruchus maculatus

(FABR. 1775 )".

SILVIA MARIA ALVES DE PAULA

TESE SUBMETIDA À COORDENAÇÃO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA, COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM

BIOQUÍMICA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FORTALEZA-CE

JUNHO-2008

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca Universitária

P349a Paula, Silvia Maria Alves de.

Avaliação da biossegurança alimentar de genótipos de feijão caupi (Vigna unguiculata L.

WALP) suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus (FABR. 1775 ) / Silvia Maria

Alves de Paula. – 2008.

162 f. : il. color.

Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Programa de

Pós-Graduação em Bioquímica , Fortaleza, 2008.

Orientação: Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos.

1. Callosobruchus maculatus. 2. Feijão-caupi. 3. Biossegurança alimentar. 4. Gorgulho do

feijão-de-corda. I. Título.

CDD 572


3

Esta tese foi apresentada como parte dos requisitos necessários à

obtenção do grau de Doutor em Bioquímica, outorgado pela Universidade

Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca

de Ciências e Tecnologia da referida Universidade.

A citação de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja feita

de acordo com as normas da ética científica.

_____________________

Silvia Maria Alves de

Paula

TESE APROVADA EM: ___________

________________________________

Dra. Ana de Fátima F. U. Carvalho


Depto. de Biologia

__________________________________

Dr. Thalles Barbosa Grangeiro


Depto. de Biologia

_________________________________

Dr. Maurício Pereira de Sales

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Depto. de Bioquímica

__________________________________

Dr. Francisco Rodrigues Freire Filho

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Centro de Pesquisa Agropecuária do Meio Norte

_____________________________________

Dra. Ilka Maria Vasconcelos Orientadora

Universidade Federal do Ceará Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular


4

AGRADECIMENTOS

A Deus, por todas as coisas que têm realizado em minha vida.

À Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos, pela orientação, dedicação e

paciência durante todos esses anos, meu sincero agradecimento.

Á Profa. Dra. Fernanda Maria Machado Maia por sua amizade, carinho

e orientação durante todos esses anos.

À Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho por tão

gentilmente ter cedido seu laboratório para os ensaios biológicos realizados

neste trabalho e por suas sugestões.

Ao Prof. Dr. Thalles Barbosa Grangeiro por suas valiosas sugestões e

por ter colaborado desde os primeiros momentos, com idéias, concessão de

dados e tudo mais que lhe foi solicitado.

Ao Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales pela amizade, sugestões e por

aceitar fazer parte desta banca examinadora.

Ao Dr. Francisco Rodrigues Freire Filho por ter cedido às sementes

utilizadas no presente trabalho e tão prontamente se dispor em fazer parte

desta banca examinadora.

Ao Prof. José Tadeu Abreu de Oliveira por sua colaboração e amizade.

Á Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito por ter cedido o Laboratório

de Morfologia para a confecção das lâminas.

Ao Prof. Dr. Cláudio Cabral Campello pela ajuda nas análises

estatísticas, principalmente pela paciência e disponibilidade.


5

À Profa. Dra. Maria Socorro de Sousa Carneiro, do Departamento de

Zootecnia, do Centro de Ciências Agrárias da UFC, por seu incentivo e carinho.

À Profa. Dra. Érica Freitas Mota e Neuza Gomes pela ajuda e

cooperação na realização do ensaio de alergenicidade, muito obrigada.

Ao José Ivan Rodrigues de Sousa técnico do Departamento de

Histologia da Universidade Federal do Ceará que confeccionou as lâminas.

As minhas amigas do Laboratório de Nutrição Animal, do Centro de

Ciências Agrárias da UFC, Roseane Sousa e Helena Oliveira, pelo apoio nas

análises realizadas.

Agradeço, de modo especial, aos meus amigos de laboratório Adelina

Braga, Andréa Agaciana, Daniele Oliveira, Geórgia Sampaio, Hellen Paula,

Hemógenes David, Henrique Pinho, Isabel Brasil, Janne Keila, Juliana

Gifoni e Mirella Pereira, por todos esses anos de carinho, amizade e

cumplicidade, meu mais sincero obrigada.

Aos amigos do Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa, Bethânia

Andrade, Edvar Monteiro. Hélio de Araújo, Hévila Salles, Darcy Mayra e

Simone Martins. 7

A todos os Professores do Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular, agradeço pela contribuição na minha formação acadêmica.

Aos Funcionários do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular.

As minhas amigas Cristina Paiva, Estela Maria, Helda Lenz, Janaína

Morais, Magnely Moura, Raquel Miranda, e Vivianne Duarte por essa

amizade que me faz ter força de continuar em frente, amo vocês.

A minha amiga Juçara Maria Romão por seu carinho, e por ajudar nas

pesquisas e digitação desta tese, minha amizade incondicional.


6

A todos meus Amigos e Amigas que sempre estiveram comigo, e que

mesmo sem citá-los um por um estão todos guardados dentro do meu coração.

A minha irmã Maria Ivanda de Paula, por todo o apoio a mim dedicado

todos esses anos, pela ajuda financeira e emocional nos momentos mais

difíceis, e por ser meu maior exemplo.

Aos meus sobrinhos Ana Clara Nazaré e Filipe Nazaré, pelos finais de

semana “perdidos” nos laboratórios da bioquímica.

Aos meus pais, Clóvis de Paula (in memoriam) e Teresa de Paula, por

tudo que sou e que conquistei na minha vida.

Por fim, a toda minha família por ser o melhor de mim, amo todos

vocês.


7

Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes Instituições:

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), por concessão de auxílio à pesquisa através do Projeto de Pesquisa:

“Bioprospecção da Caatinga Cearense com Potencial Nutricional, Bioinseticida,

Biofungicida e Bionematicida” e pela bolsa de Pós-graduação concedida à

autora desta tese.

Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP) por concessão

de auxílio à pesquisa através do Projeto de Pesquisa: “Peptídeos/Proteínas

Presentes em Plantas Nativas e Cultivadas do Nordeste Brasileiro com

Potencial Biotecnológico no Controle de Pragas e Doenças Agrícolas”.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), por concessão de auxílio à pesquisa através do Projeto de Pesquisa:

“Proteínas de Sementes: Aspectos Estruturais, Funcionais e Potencial

Biotecnológico” (PROCAD).

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa

Agropecuária do Meio Norte, pela concessão dos genótipos de feijão-de-

corda utilizados no presente trabalho.

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de

Ciências, Universidade Federal do Ceará, em cujos laboratórios foram

desenvolvidos os experimentos necessários à realização deste trabalho.


8

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS 13

LISTA DE TABELAS 18

ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES 21

RESUMO 22

ABSTRACT 24

1. INTRODUÇÃO 26

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 31

2.1. Feijão Caupi – Produção e Valor Nutricional 32

2.2. Fatores Bióticos Limitantes da Produção do Feijão Caupi 34

2.2.1. Callosobruchus maculatus – Uma Praga de Armazenamento do

Feijão Caupi

35

2.2.2. Resistência do Feijão Caupi ao Callosobruchus maculatus 38

2.3. Feijão Caupi – Uma Fonte de Proteínas com Propriedades Diversas . 39

2.3.1. Proteínas de Reserva do Feijão Caupi – Globulinas 40

2.3.2. Proteínas de Feijão Caupi que Limitam a sua Utilização e Valor

Nutricional

41

2.4. Melhoramento Genético e Biossegurança Alimentar 43

2.4.1. Biossegurança Alimentar 44

2.4.2. Avaliação Qualitativa dos Alimentos 46

3. OBJETIVOS 51

3.1. Gerais 52

3.2. Específicos 52


9

4. MATERIAIS 54

4.1. Sementes 55

4.2. Hemácias. 55

4.3. Animais 55

4.4. Reagentes Químicos 56

5. MÉTODOS 57

5.1. Preparação da Farinha de Cotilédones 58

5.2. Composição Centesimal 58

5.2.1. Determinação do Teor de Umidade 58

5.2.2. Determinação do Teor de Cinzas 58

5.2.3. Determinação do Teor de Proteína Total 59

5.2.4.Determinação do Teor de Lipídios 59

5.2.5.Determinação dos Teores de Fibra Bruta 60

5.3. Caracterização das Proteínas das Sementes 61

5.3.1. Extração das Proteínas Solúveis 61

5.3.2. Dosagem de Proteínas 61

5.3.3. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em Condições Desnaturantes

.

62

5.4. Detecção e Dosagem de Proteínas com Propriedades Antinutricionais

e/ou Tóxicas

63

5.4.1. Lectina 63

5.4.2. Inibidor de Tripsina 64

5.4.3. Uréase 64

5.5. Purificação das Proteínas Ligantes à Quitina (PLQ) 65

5.6. Avaliação da Digestibilidade In vitro das PLQ 67


10

5.6.1. Ação individual da pepsina, tripsina, quimotripsina e papaína sobre

as PLQ

67

5.6.2. Ação Seqüencial da Pepsina, Tripsina e Quimiotripsina 68

5.7. Ensaios Biológicos 68

5.7.1. Ensaio Biológico I - Avaliação da Qualidade Nutricional das

Proteínas de Sementes de Genótipos de Feijão Caupi Suscetível

(BR9 Longá) e Resistente (IT81D 1053) ao Callosobruchus

maculatus (gorgulho)

69

5.7.1.1. Dietas. 69

5.7.1.2. Animais 71

5.7.1.3. Experimento 71

5.7.1.4. Determinação dos Parâmetros Nutricionais 72

5.7.2. Ensaio Biológico II - Avaliação das Propriedades Antinutricionais

e/ou Tóxicas das Proteínas Ligantes à Quitina de Sementes de

Genótipos de Feijão Caupi Suscetível (BR9 Longá) e Resistente

(IT81D 1053) ao Callosobruchus maculatus (gorgulho)

73

5.7.2.1. Dietas 73

5.7.2.2. Análise Histológica e Morfométrica 75

5.7.3. Ensaio Biológico III - Avaliação da Alergenicidade das Proteínas de

Sementes de Genótipos de Feijão Caupi Suscetível (BR9 Longá) e

Resistente (IT81D 1053) ao Callosobruchus maculatus (gorgulho)

76

5.7.3.1. Imunização por Via Oral e Coleta de Soro 76

5.7.3.2. Análise Sorológica por Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA) 77

6. RESULTADOS 78

6.1. Parte 1 80

6.1.1. Composição Centesimal 80


11

6.1.2. Comparação dos Perfis Protéicos das Farinhas de Sementes dos

Genótipos de Feijão Caupi por PAGE-SDS

80

6.1.3. Detecção e Dosagem de Proteínas com Propriedades

Antinutricionais e/ou Tóxicas

82

6.1.3.1. Lectina 82

6.1.3.2. Inibidor de Tripsina 82

6.1.3.3. Uréase 85

6.1.4. Ensaio Biológico I - Avaliação da Qualidade Nutricional das

Proteínas de Sementes de Genótipos de Feijão Caupi Suscetível

(BR9 Longá) e Resistente (IT81D 1053) ao Callosobruchus

maculatus (gorgulho)

85

6.1.4.1. Curvas de Crescimento, Dieta Ingerida e Ganho ou Perda de

Peso Corpóreo

85

6.1.4.2. Balanço de Nitrogênio 87

6.1.4.3. Parâmetros Nutricionais 92

6.1.4.4. Alterações Macroscópicas nos Órgãos dos Ratos 92

6.2. Parte 2 97

6.2.1. Obtenção das Proteínas Ligantes à Quitina 97

6.2.2. Avaliação da Digestibilidade In vitro das PLQ 97

6.2.3. Ensaio Biológico II - Avaliação das Propriedades Antinutricionais

e/ou Tóxicas das Proteínas Ligantes à Quitina (PLQ) de Sementes

de Genótipos de Feijão Caupi Suscetível (BR9 Longá) e Resistente

(IT81D 1053) ao Callosobruchus maculatus (gorgulho)

106

6.2.3.1. Curvas de Crescimento, Dieta Ingerida e Ganho ou Perda de

Peso Corpóreo

106

6.2.3.2. Balanço de Nitrogênio 109

6.2.3.3. Parâmetros Nutricionais 112


12

6.2.3.4. Alterações Macroscópicas nos Órgãos dos Ratos 114

6.2.3.5. Análises Histológicas e Morfométricas 114




119

7. DISCUSSÃO 126

8. CONCLUSÕES 140

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 142


13

LISTA DE FIGURAS

Página

1 - Parâmetros utilizados para classificação dos genótipos BR9 Longá e

IT81D 1053 de feijão caupi como suscetível e resistente

respectivamente, ao Callosobruchus maculatus

2 - Planta de feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walpers]

3 - Esquema do ciclo fenológico do caupi com a ocorrência das principais

pragas

4 - Adulto de Callosobruchus maculatus (Fabricius) em grãos

apresentando ovos e orifício de saída dos insetos

5 - Esquema de obtenção das proteínas ligantes à quitina a partir do

extrato bruto preparado de farinhas das sementes de genótipos de

feijão caupi suscetível (BR9 Longá) e resistente (IT81D 1053) ao C.

maculatus

6 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e -

mercaptoetanol da farinha (80 µgP) de sementes de feijão caupi,

genótipos IT81D 1053 e BR9 Longá, suscetível e resistente ao

Callosobrucus maculatus, respectivamente. (1) Marcadores de massa

molecular; (2) farinha de IT81D 1053 e (3) farinha de BR9 Longá

7 - Curvas de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas à base

de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D

1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus,

respectivamente, suplementada ou não metionina, comparadas com as

curvas de crescimento dos ratos alimentados com a dieta contendo

albumina da clara de ovo e dieta isenta de proteínas


14

8 - Curvas de consumo diário dos ratos (n = 6) alimentados com dietas à

base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e

IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus,

respectivamente, suplementada ou não metionina, comparadas com as

curvas de consumo dos ratos alimentados com a dieta contendo


9 - Cromatografia de afinidade em coluna de quitina. Extrato bruto (250

mgP) do genótipo suscetível (BR9 Longá) foi aplicado em coluna de

quitina (27,1 x 3,1 cm) equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,05 M,

contendo NaCl 0,15 M, pH 7,5. As proteínas foram eluídas com ácido

acético 0,2 M. Fluxo da coluna: 100 mL/ h; Fração: 5 mL/ tubo. Proteína

retida: 0,87 mg

10 - Cromatografia de afinidade em coluna de quitina. Extrato bruto (250

mgP) do genótipo resistente (IT81D 1053) foi aplicado em coluna de

quitina (27,1 x 3,1 cm) equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,05 M,

contendo NaCl 0,15 M, pH 7,5. As proteínas foram eluídas com ácido

acético 0,2 M. Fluxo da coluna: 100 mL/h; Fração: 5 mL/tubo. Proteína

retida: 0,98 mg

11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e -


genótipos IT81D 1053 e BR9 Longá, suscetível e resistente ao C.

maculatus, respectivamente

12 - Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS da albumina sérica

bovina, BSA (controle) e das proteínas ligantes à quitina do genótipo

BR9 Longá (PLQ suscetível), submetidas ao tratamento enzimático in

vitro ,com pepsina, tripsina, quimiotripsina e papaína nos períodos de

tempo: 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas


15


bovina, BSA (controle) e das proteínas ligantes à quitina do genótipo

IT81D 1053 (PLQ resistente), submetidas ao tratamento enzimático in

vitro com pepsina, tripsina, quimiotripsina e papaína nos seguintes

períodos de tempo: 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas


bovina (BSA) e das proteínas ligantes à quitina do genótipo BR9 Longá

(PLQ suscetível), submetidas ao tratamento enzimático in vitro com

pepsina (3 horas), seguida de tripsina e quimiotripsina (2 horas)


bovina (BSA) e das proteínas ligantes à quitina do genótipo IT81D 1053

(PLQ resistente), submetidas ao tratamento enzimático in vitro com

pepsina (3 horas), seguida de tripsina e quimiotripsina (2 horas)

16 - Curvas de crescimento dos ratos (n = 4) alimentados com dietas à base

de proteínas ligantes à quitina (PLQ), genótipos BR9 Longá e IT81D

1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus,

respectivamente, comparadas com as curvas de crescimento dos ratos

alimentados com a dieta contendo albumina da clara de ovo (clara do

ovo) e dieta isenta de proteínas (NPC)

17 - Curvas de consumo diário dos ratos (n = 4) alimentados com dietas à

base de proteínas ligantes à quitina (PLQ), genótipos BR9 Longá e


respectivamente, comparadas com as curvas de crescimento dos ratos

alimentados com a dieta contendo albumina da clara de ovo (clara do

ovo) e dieta isenta de proteínas (NPC)


16

18 - Cortes do duodeno de ratos alimentados com dietas à base de

proteínas ligantes à quitina (PLQ) de sementes de feijão caupi,

genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus, respectivamente, comparado com o

tratamento contendo dieta preparada com albumina da clara de ovo

(grupo controle)

19 - Cortes do jejuno de ratos alimentados com dietas à base de proteínas

ligantes à quitina (PLQ) de sementes de feijão caupi, genótipos BR9

Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus

maculatus, respectivamente, comparado com o tratamento contendo

dieta preparada com albumina da clara de ovo (grupo controle)

20 - Cortes do duodeno de ratos alimentados com dietas à base de



Callosobruchus. maculatus, respectivamente, comparado com o


(grupo controle)

21 - Cortes do jejuno de ratos alimentados com dietas à base de proteínas





22 - Medidas da altura das vilosidades efetuadas em cortes histológicos de

duodeno e jejuno, de ratos alimentados com dietas à base de proteínas






17

23 - Medidas da profundidade das criptas efetuadas em cortes histológicos

de duodeno e jejuno, de ratos alimentados com dietas à base de





(grupo controle)

24 - Medidas da relação vilosidade/cripta efetuadas em cortes histológicos

de duodeno e jejuno, de ratos alimentados com dietas à base de





(grupo controle)

25 - Cinética da síntese de IgE-específica. Camundongos foram imunizados

por via oral com diferentes antígenos e a sorologia foi avaliada por

anafilaxia cutânea passiva (PCA). A imunização foi feita durante dez

dias consecutivos, usando 100 µg de proteína. Antígenos: Ovalbumina

(OVA); farinha do genótipo resistente (IT81D 1053); farinha do genótipo

suscetível (BR9 Longá); fração ligante à quitina de IT81D 1053 (PLQ

Resistente); fração ligante à quitina de BR9 Longá (PLQ Suscetível)


18

LISTA DE TABELAS

Página

1 -

Composição (g/Kg) das dietas controle (clara do ovo e aprotéica) e

experimentais (farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR 9


maculatus, respectivamente)

2 - Composição (g/Kg) das dietas controle (clara do ovo e aprotéica) e

experimentais (proteínas ligantes à quitina de sementes dos

genótipos BR 9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus, respectivamente)

3 - Composição proximal (g/100 g de farinha) de sementes de feijão

caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus, respectivamente, expressa em percentual

de peso seco

4 - Proteínas antinutricionais e/ou tóxicas presentes no extrato bruto de

sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053,

suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus,

respectivamente

5 - Ganho ou perda de pesos dos animais alimentados com dietas à



respectivamente, suplementada ou não metionina, comparado com

os tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara de

ovo e dieta isenta de proteínas


19

6 - Balanço de nitrogênio dos ratos (n = 6) alimentados com dietas à



respectivamente, suplementada ou não metionina, comparado com o

tratamento contendo dieta preparada com albumina da clara do ovo,

calculados para os últimos cinco dias de experimento

7 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6)

com dietas à base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos

BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus

maculatus, respectivamente, suplementada ou não metionina,

comparado com os tratamentos contendo dieta preparada com

albumina da clara de ovo

8 - Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos tubulares

e glândulas anexas do sistema digestório de ratos (n = 6)

alimentados com dietas à base de farinha de sementes de feijão

caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente

ao Callosobruchus maculatus, respectivamente, suplementada ou

não metionina, comparado com os tratamentos contendo dieta

preparada com albumina da clara de ovo e dieta aprotéica

9 - Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) do coração, rins,

pulmões e órgãos linfóides de ratos (n = 6) alimentados com dietas à



respectivamente, suplementada ou não metionina, comparado com

os tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara de

ovo e dieta aprotéica


20

10 - Ganho ou perda de pesos dos animais alimentados com dietas à

base de proteínas ligantes à quitina de sementes de feijão caupi,


Callosobruchus maculatus, respectivamente, comparado com os

tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara do ovo

e dieta isenta de proteínas

11 - Balanço de nitrogênio dos ratos (n = 4) alimentados com dietas à




tratamento contendo dieta preparada com albumina da clara do ovo,

calculados para os últimos cinco dias de experimento

12 - Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 4) com

dietas à base de proteínas ligantes à quitina de sementes de feijão

caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao


tratamento contendo dieta preparada com albumina da clara do ovo

13 - Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos tubulares e

glândulas anexas do sistema digestório de ratos (n = 4) alimentados

com dietas à base de proteínas ligantes à quitina de sementes de

feijãp caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e

resistente ao Callosobruchus maculatus, respectivamente, comparado

com os tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara

de ovo e dieta aprotéica

14 - Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) do coração, rins,

pulmões e órgãos linfóides de ratos (n = 4) alimentados com dietas à




tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara de ovo

e dieta aprotéica


21

ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES

BAPNA N--L–Benzoil–Arginina– p –Nitroanilida

IgE Imunoglonulina E

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

TEMED N,N,N‟,N‟, tetrametiletilenodiamina

Tris Tris (hidroximetil) – aminometano

PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

PBS Tampão fosfato de sódio 0,05 M, contendo NaCl 0,15 M, pH 7,0

PLQ Proteínas ligantes à quitina

UH Unidade de Hemaglutinação. Definida como o inverso da maior

diluição que é capaz de aglutinar uma suspensão de eritrócitos a

2%

NPU Utilização líquida de proteína


22

RESUMO

O Brasil é um dos grandes produtores de feijão caupi [Vigna unguiculata

(L.) Walp.], uma importante leguminosa para consumo humano por ser boa

fonte proteínas e carboidratos. Todavia, há vários fatores que limitam a

produtividade e utilização dessa cultura, destacando-se o ataque pelo inseto

Callosobruchus maculatus (gorgulho), conhecido como uma das principais

pragas de armazenamento. No Nordeste do Brasil, genótipos de feijão caupi

foram criados através de melhoramento genético, visando aumento da

produtividade e resistência a doenças e pragas. Porém, é detectada a

escassez de informações relacionando resistência e valor nutricional. Assim

sendo, no presente estudo, dois genótipos melhorados geneticamente, BR9

Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao gorgulho, respectivamente,

foram selecionados, para verificar se as alterações promovidas pelo

melhoramento afetariam sua qualidade nutricional. Os dados de composição

centesimal mostraram que ambos os genótipos constituem-se em boa fonte de

proteínas (23,45 e 26,61 g/100 g de matéria seca), carboidratos (61,62 e 62,94

g/100 g de matéria seca) e fibra bruta (4,32 e 5,20 g/100 g de matéria seca),

apresentando baixos conteúdos de lipídios (3,30 e 3,89 g/100 g de matéria

seca). Os perfis eletroforéticos da farinha de sementes dos dois genótipos

mostraram-se muito semelhantes entre si, exceto a existência de uma banda

mais proeminente na região de 29 kDa verificada no genótipo resistente.

Fatores antinutricionais tais como lectina, urease e inibidor de tripsina foram

verificados nos dois genótipos de feijão caupi avaliados. Os teores de lectina

(0,10 UH/mgF) e de urease (25,13 e 25,41 U/gF) se mostraram bem similares

nos genótipos suscetível e resistente. Já os conteúdos de inibidor de tripsina

foram diferentes, tendo o genótipo resistente apresentado maior atividade

(18,55 mg de tripsina inibida/gF) em comparação ao suscetível (12,57 mg de

tripsina inibida/gF). Farinhas dos genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, quando

incluídas em dietas para ratos como única fonte protéica, a 10%, não foram

capazes de promover o crescimento dos animais de forma similar à albumina

da clara do ovo (proteína padrão). Todavia, quando comparado o tratamento


23

contendo farinha do genótipo suscetível com aquele contendo o genótipo

resistente, para a maioria dos parâmetros analisados, as respostas foram bem

parecidas. Dietas contendo proteínas ligantes à quitina (PLQ), purificadas do

genótipo suscetível e do resistente, complementadas com albumina da clara do

ovo, apresentaram valor nutricional igual ou superior ao padrão (somente clara

do ovo). Diante dos parâmetros analisados, os resultados permitem concluir

que o melhoramento genético do feijão caupi, o qual conferiu resistência ao

Callosobruchus maculatus, não foi capaz de alterar a qualidade nutricional

dessa leguminosa. Além disso, diferentemente ao verificado com o

Callosobruchus maculatus, não foram observados efeitos antinutricionais,

tóxicos e/ou alergênicos para os animais testados (ratos e camundongos),

associados ao consumo das PLQ provenientes do genótipo suscetível ou do

resistente.


24

ABSTRACT

Brazil is one of the largest producers of cowpea [Vigna unguiculata (L.)

Walp.], a very important legume for human dietary protein and carbohydrate

supply. Nevertheless, there are some factors which limit its productivity and

utilization. The insect Callosobuchus maculatus (cowpea weevil) is considered

the principal pest that attacks stored grains. In the Northeast of Brazil, breeding

efforts involving cowpea have been directed towards the selection of high

yielding varieties associated with traits of resistance to diseases and pests.

However, studies on the nutritional quality of these improved genotypes are

scanty. In this study, the research was conducted with two cowpea genotypes,

BR9 Longá e IT81D 1053, susceptible and resistant to cowpea weevil,

respectively, to evaluate whether the probable factors related to the resistance

would interfere with the nutritional value. Proximate composition showed that

both genotypes are good sources of proteins (23.45 and 26.61 g/100 g dry

matter), carbohydrates (61.62 and 62.94 g/100 g dry matter) and crude fiber

(4.32 and 5.20 g/100 g dry matter), presenting low contents of oil (3.30 and 3.89

g/100 g dry matter). Polyacrylamide gel electrophoresis of the seed flours

showed similar patterns for both genotypes, except for the presence of a very

prominent 29 kDa band in the resistant genotype. The presence of

antinutritional factors such as lectin, urease and trypsin inhibitor was detected in

both cowpea genotypes. Lectin (0.10 UH/mgF) and urease (25.13 and 25.41

U/gF) amounts were similar in the susceptible and resistant genotypes. The

resistant genotype presented a higher content of trypsin inhibitor (18.55 mg

trypsin inhibited/gF) than the susceptible one (12.57 mg trypsin inhibited/gF).

Feeding trial conducted with rats fed the experimental diets containing seed

flour of BR9 Longá and IT81D 1053 as the sole protein source, at 10% level,

were not sufficient to promote animal growth compared to the animals fed the

high quality diet containing egg white. However, when compared the treatments

containing susceptible and resistant cowpea genotypes most of parameters

analyzed were similar. Diets containing the chitin binding proteins (CBP),

purified from susceptible and resistant cowpea genotypes and complemented


25

with egg white, showed similar or higher nutritional values as compared with

the positive control diet (only egg white). Based on these results, it is possible to

conclude that the breeding strategies used to confer resistance to cowpea

against C. maculates did not interfere with its nutritional quality. Most

importantly and contrary to what was observed for C. maculatus, CBP from

susceptible or resistant genotype did not provoke antinutritional, toxic and/or

allergenic effects on tested animals (rats and mice).


26

11.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO


27

O feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] é uma leguminosa

comestível dotada de alto conteúdo protéico, com boa capacidade de fixação

de nitrogênio, sendo, também, pouco exigente quanto à fertilidade do solo

(JÚNIOR et al., 2007). Essa espécie tem como habitat natural regiões de clima

quente, estando bem adaptada às condições das Regiões Norte e Nordeste do

Brasil. Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística – IBGE

(2007), a produção de feijão caupi no Brasil foi de 3.286,282 t em 2007, com

produção estimada de 3.428,101 t para o ano de 2008. No nordeste brasileiro,

essa leguminosa recebe atenção diferenciada, consistindo em um dos

principais componentes da dieta alimentar do nordestino, se sobressaindo,

também, como um importante gerador de emprego e renda.

Apesar da expressiva produção dessa cultura, há vários fatores bióticos

e abióticos que impõem restrições ao cultivo e utilização do feijão caupi. Dentre

os de natureza biótica, ressaltam-se o ataque de pragas e as doenças

(FREIRE-FILHO et al., 1999; CARDOSO et al., 2000). O inseto Callosobruchus

maculatus (Coleoptera: Bruchidae), conhecido como gorgulho do feijão caupi

ou simplesmente gorgulho, se destaca como uma das principais pragas dessa

cultura, sendo responsável pela quase totalidade das perdas ocorridas nos

grãos armazenados, reduzindo seu peso e sua qualidade, bom como o poder

germinativo das sementes (FREIRE et al., 1999; LIMA et al., 2001).

No combate ao ataque do gorgulho, o uso de genótipos resistentes

representa uma prática bastante promissora dada à facilidade de utilização,

baixo custo e compatibilidade com outras táticas de controle. A resistência a

esse inseto foi, inicialmente, relacionada à presença de inibidores de tripsina

(GATEHOUSE et al., 1979). Posteriormente, foi verificado que essa resistência

estava associada à ocorrência de vicilinas variantes (MACEDO et al., 1993).

Uma das características das vicilinas, tanto das normais como das variantes, é

a sua capacidade de interagir com quitina, um homopolímero de N-acetil-D-

glucosamina presente na membrana peritrófica dos insetos (SALES et al.,

1996). Nos genótipos de feijão caupi resistentes ao gorgulho é evidenciada

uma associação mais forte das vicilinas variantes com as membranas

quitinosas do tubo digestivo (FIRMINO et al., 1996).


28

Apesar de vários estudos direcionados à resistência do feijão caupi ao

gorgulho, com foco nos componentes envolvidos e no mecanismo de ação, há

uma lacuna no que diz respeito à comparação do valor nutricional de genótipos

suscetíveis e resistentes, sobretudo se considerado a importância alimentar

dessa leguminosa para o homem. Nesse contexto, o presente estudo foi

desenvolvido buscando responder às seguintes indagações:

1. Sementes de genótipos de feijão caupi suscetível e resistente ao gorgulho

diferem entre si em valor nutricional, quando utilizadas como fonte de

proteínas em dietas para animais monogástricos (ratos)?

2. Sabendo-se que a metionina é o principal aminoácido limitante no feijão

caupi, será que a não suplementação da dieta com esse aminoácido

poderia implicar em respostas drásticas, a ponto de mascarar os efeitos

deletérios, porventura existentes, provenientes do consumo dos genótipos

suscetível ou resistente?

3. Proteínas ligantes à quitina purificadas de sementes de feijão caupi,

portanto, compreendendo as vicilinas, teriam efeitos deletérios quando

incluídas em dietas para ratos em crescimento, a exemplo do que tem sido

verificado com insetos, em particular com o gorgulho do feijão caupi?

4. Haveria diferenças entre as proteínas ligantes à quitina purificadas de um

genótipo suscetível e de um resistente ao gorgulho no que se refere aos

seus efeitos sobre animais monogástricos?

Essas perguntas foram formuladas no intuito de fornecer subsídios que

pudessem auxiliar na decisão de seleção de genótipos de feijão caupi para

cultivo comercial, na tentativa de conciliar produção e valor nutricional, em

virtude da crescente necessidade de incremento na oferta de alimentos visando

o aporte à alimentação do homem.

Como genótipos suscetível e resistente ao gorgulho foram escolhidos

BR9 Longá e IT81D 1053, respectivamente. Essa escolha foi realizada com

base em dados obtidos por Freire (2002), no trabalho intitulado “Genótipos de


29

feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] melhorados geneticamente:

caracterização em relação ao ataque pelo Callosobruchus maculatus (Fabr.,

1792) “, cujos dados estão apresentados resumidamente na FIGURA 1.

Para situar melhor o trabalho aqui apresentado, no contexto da busca

por genótipos mais produtivos de feijão caupi e de elevada qualidade

nutricional, inicialmente serão abordados aspectos relacionados à importância

econômica e nutricional dessa leguminosa. Em seguida, será feita uma breve

revisão sobre os fatores bióticos que limitam a produção e inviabilizam a

utilização do feijão caupi, dando destaque ao ataque do gorgulho, e quais as

principais medidas de controle utilizadas. Nessa abordagem será enfatizado o

papel das proteínas ligantes à quitina na resistência ao gorgulho.

Posteriormente, será ressaltada a importância de realizar ensaios voltados para

avaliação da qualidade nutricional, com ênfase na biossegurança alimentar, de

fontes alimentícias usadas pelo homem que se tornaram resistentes a

determinada praga ou patógeno, seja através do melhoramento genético

convencional, seja pelo uso da engenharia genética.


30

FIGURA 1. Parâmetros utilizados para classificação dos genótipos BR9 Longá

e IT81D 1053 de feijão caupi como suscetível e resistente

respectivamente, ao Callosobruchus maculatus. Os dados

apresentados nessa figura foram provenientes do trabalho

desenvolvido por Freire (2002).

0

20

40

60

80

100

120

Número totalmédio de ovos

postos

Percentual deovos eclodidos

Percentual deinsetos adultos

Consumo porlarva (mg)

Percentual deperda dassementes

IT81D1953

BR9Longá

a

b

a a a

b

a a

a

b


31

22.. FFUUNNDDAAMMEENNTTAAÇÇÃÃOO

TTEEÓÓRRIICCAA


32

2.1. Feijão Caupi – Produção e Valor Nutricional

O feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] é uma leguminosa

dicotiledônea, pertencente à ordem Fabales, família Fabaceae, subfamília

Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Phaseolineae, gênero Vigna, seção

Catiang (NG, 1990) (FIGURA 2).

Essa leguminosa é cultivada em grandes extensões nas regiões

tropicais e, mais particularmente, nas zonas semi-áridas e sub-úmidas dos

continentes africano, asiático e americano (OLIVEIRA et al., 2003; RANGEL et

al., 2003; FREITAS et al., 2004; DUTRA et al., 2007; XAVIER et al., 2007).

Mais de 70% de sua produção mundial estão concentradas em três países:

Nigéria se destacando com 5 milhões de hectares; Niger com 3 milhões de

hectares e o Brasil com 1,9 milhões de hectares (PHILLIPS, et al., 2003; SING

et al., 2003; EMBRAPA, 2007).

No Brasil, o feijão caupi tem extrema importância econômica e social. Na

safra de 2003 – 04, por exemplo, ele representou o quinto granífero mais

produzido, perdendo apenas para soja, milho, arroz e trigo (FUSCALDI et al.,

2005). Considerando o quadro da produção agrícola nordestina, devido

principalmente à falta de chuva na região e escassez de recursos, o feijão

caupi possui relevância no suprimento alimentar e na economia da região por

suas características peculiares, compreendendo ciclo curto, maior tolerância ao

estresse hídrico do que outras culturas, boa capacidade de fixação de

nitrogênio e, ainda, baixa exigência quanto à fertilidade do solo (JUNIOR et al.,

2007). Seu cultivo é baseado em padrões tradicionais, sendo feito tanto por

pequenos, como por médios e grandes produtores

(http://www.acessepiaui.com.br/geral2.id=52012&ref=200605). Todos os

estados da região Nordeste cultivam o feijão caupi, principalmente o Ceará,

Piauí, Rio Grande do Norte, Maranhão, Paraíba e Pernambuco (PAIVA et al.,

1977; CARDOSO, 2000; COSTA et al., 2004; MORAES et al., 2007), sendo

responsáveis por 40% da produção nacional de feijão, incluindo o feijão comum

(Phaseolus vulgaris).

http://www.acessepiaui.com.br/geral2.id=52012&ref=200605


33

FIGURA 2. Planta de feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walpers]. Fonte:

.http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.vice.pi.gov.

br/noticias/fotos/200504/CCOM22_dcab99ff94.JPG&imgrefurl=http:/

/www.vice.pi.gov.br/materia.php%3Fid%3D21943&h=263&w=350&

sz=27&hl=pt-BR&start=2&usg=__FAOojTAheaTsDRkiWd-

YYm4peRQ=&tbnid=dugtFJ9njJFJCM:&tbnh=90&tbnw=120&prev=/

images%3Fq%3Dcaupi%26gbv%3D2%26hl%3Dpt-

BR%26sa%3DG


34

Do ponto de vista nutricional, a semente do feijão caupi é um importante

e tradicional produto na alimentação da população mundial, sendo considerada

uma das leguminosas mais consumidas pelo homem (GRANITO et al., 2005;

MOECHEM et al., 2006). No Brasil e em outros países da América Latina, o

caupi é um dos alimentos básicos mais consumidos e uma fonte de proteínas,

vitaminas e minerais de fácil acesso (MOSCHEM et al., 2006). No Nordeste e

Norte do país, o feijão caupi faz parte da alimentação e do contexto sócio-

econômico das famílias, sendo considerado gênero de primeira necessidade

para essas populações (DUTRA et al., 2007; XAVIER et al., 2007; MORAES et

al., 2007; http://www.acessepiaui.com.br/geral2.phpid=52012&ref=200605).

Na composição do feijão caupi são encontrados proteínas (20 - 30 %),

carboidratos (50 - 63%), vitaminas e fibras alimentares (ONWULIRI et al., 2002;

PHILLIPS et al., 2003; RIVAS-VEJA et al., 2006; KAPTSO et al., 2008). O teor

de lipídios (0,93 a 1,65 %) é baixo, constituído em torno de 66% por ácidos

graxos insaturados. De modo geral, o feijão caupi apresenta um bom

balanceamento de aminoácidos essenciais, embora seja deficiente em

aminoácidos sulfurados (HOSSAIN e BECKER, 2001; ARAÚJO et al., 2002;

PHILLIPS et al., 2003). Entre os micronutrientes mais importantes presentes

nos grãos de feijão caupi sobressaem-se ferro e zinco

(http://www.saboreseletras.com.br/2008/internas/notícias.aspidmateria=518).

Em comparação com outras leguminosas de mesma importância econômica, o

caupi contém baixo teor de fatores antinutricionais (MAIA et al., 2000;

OLIVEIRA et al., 2003).

2.2. Fatores Bióticos Limitantes da Produção do Feijão Caupi

As doenças são responsáveis por expressivas perdas sofridas pelo

feijão caupi no processo de produção e na qualidade nutricional, representando

um fator limitante do cultivo racional dessa cultura. O feijão caupi está sujeito a

doenças causadas por diferentes agentes patogênicos tais como, fungos,

http://www.acessepiaui.com.br/geral2.phpid=52012&ref=200605

http://www.saboreseletras.com.br/2008/internas/notícias.aspidmateria=518


35

bactérias e vírus (GOMES et al., 2004). Essas perdas podem ser maiores ou

menores, de acordo com fatores ambientais e climáticos (LIMA et al., 2001).

Além dos patógenos, ressaltam-se as pragas como causadores de

grandes perdas na cultura de feijão caupi, cujos exemplos são os

fitonematóides e insetos (CARDOSO, 2000). Em relação aos insetos, de uma

maneira geral, a sua ocorrência no feijão caupi é dada em uma determinada

época, relacionada com a produção de seu alimento ideal. A FIGURA 3 mostra

a distribuição das pragas de feijão caupi de acordo com a fenologia da planta.

2.2.1. Callosobruchus maculatus – Uma Praga de Armazenamento do Feijão

Caupi

Dentre os insetos, destaca-se o bruquídeo Callosobruchus maculatus

(Fabr. 1972), que é uma importante praga de pós-colheita, sendo responsável

pela quase totalidade das perdas ocorridas nos grãos armazenados (FIGURA

4). Devido ao seu potencial depreciativo e sua ocorrência mundial, é

considerado como a principal praga do feijão caupi (LIMA et al., 2001;

MOECHEM et al., 2006). A infestação é iniciada nas vagens ainda no campo.

Logo que as vagens amadurecem, é intensificada a infestação no armazém,

principalmente quando a temperatura e a umidade relativa são favoráveis. O

inseto é prejudicial não somente pela redução do peso das sementes, mas

também pela redução do valor nutritivo, pela queda do poder germinativo da

semente e por abrir caminho para o ataque por fungos (FREIRE-FILHO et al.,

1999; BARRETO et al., 2000; LIMA et al., 2001; MURAD et al., 2007).

Os principais métodos de controle de doenças e pragas de feijão caupi

envolvem o uso de agrotóxicos e/ou o cultivo de variedades resistentes. Os

métodos convencionais de controle ao Callosobruchus maculatus com

inseticidas orgânicos sintéticos, visando à conservação de sementes de feijão

caupi, têm apresentado resultados não satisfatórios, quando ao controle do

referido inseto.


36

FIGURA 3. Esquema do ciclo fenológico do feijão caupi com a ocorrência das

principais pragas. Fonte:

http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Feijao/F

eijaoCaupi/pragas.htm


37

FIGURA 4. Adulto de Callosobruchus maculatus (Fabricius, 1775) em grãos

apresentando ovos e orifício de saída dos insetos. Fonte:

http://www.springhalen.dk/snudebiller.JPG


38

Em outros casos, além do custo, a desvantagem da aplicação desses produtos

é relacionada com a viabilidade germinativa das sementes ou com a presença

de resíduos tóxicos prejudiciais ao consumo do grão. Diante desse fato, o uso

de cultivares resistentes constitui uma alternativa promissora com o real

objetivo de reduzir os danos e as perdas no armazenamento. A identificação de

fontes de resistência em feijão caupi, bem como de seus compostos de defesa,

constitui importante ferramenta no melhoramento genético, sendo uma das

táticas mais promissoras no manejo de Callosobruchus maculatus, pela

facilidade de utilização, baixo custo e compatibilidade com outras medidas de

controle (LIMA et al., 2001; COSTA et al., 2004).

2.2.2. Resistência do feijão caupi ao Callosobruchus maculatus

Muitos estudos foram conduzidos até a conclusão dos componentes

envolvidos na resistência do feijão caupi ao Callosobruchus maculatus. A

princípio, essa resistência foi atribuída aos altos níveis de inibidores de tripsina

encontrados em alguns cultivares, como exemplo TVu 2027, considerados

suficientes para inibir toda tripsina do tubo digestivo do inseto (GATEHOUSE,

1979). Contrariando esse achado, foi observada a existência de genótipos

suscetíveis com os mesmos níveis de inibidores encontrados em genótipos

resistentes, tornando claro que os inibidores de tripsina não tinham muito a ver

com a resistência. Corroborando com isso, foi mostrada a presença de

proteases ácidas (aspárticas e cisteínicas) no tubo digestivo de Callosobruchus

maculatus e não de proteases alcalinas (XAVIER-FILHO e COELHO, 1980;

XAVIER-FILHO et al., 1989). Esses dados evidenciavam, portanto, a não

participação dos inibidores de tripsina na resistência ao gorgulho.

Diante da constatação de que Callosobruchus maculatus utiliza

proteinases cisteínicas para digestão de proteínas da dieta, foi sugerida a

participação de inibidores dessas enzimas nos mecanismos de resistência.

Todavia, anos mais tarde foi mostrado que os inibidores de papaína não

estavam envolvidos com a resistência ao gorgulho (FERNANDES et al., 1993).


39

Experimentos posteriores empregando o fracionamento da semente e a

reconstituição de “uma semente” com todas as frações mostraram que o fator

ou fatores da resistência co-precipitavam com as globulinas (vicilinas). Em

seguida, foi verificado que a resistência estava associada à existência de

vicilinas variantes (MACEDO et al., 1993).

Uma das características das vicilinas, tanto das normais como das

variantes, é a sua capacidade de interagir com quitina, um homopolímero de N-

acetil-D-glucosamina presente na membrana peritrófica dos insetos, na parede

celular de algas verdes e fungos, no exoesqueleto de muitos crustáceos e nos

ovos e na cutícula dos nematóides (SALES et al., 1996; SMITH et al., 1997;

GOMES et al., 1997; SELITRENNIKOFF et al, 2001; YANG et al., 2002;

TEXEIRA et al., 2006; FERREIRA et al., 2007). Dados mais recentes mostram

a capacidade de interação das vicilinas de feijão caupi com a quitina,

propriedade esta diretamente relacionada com a defesa das plantas contra

insetos (SALES et al., 2001). Nos genótipos de feijão caupi que são resistentes

ao gorgulho é verificada uma associação mais forte das vicilinas variantes com

as membranas quitinosas do tubo digestivo (FIRMINO et al., 1996). Essa

interação pode ser confirmada pelo uso de anticorpos anti-quitina (SALES et

al., 2001).

2.3. Caupi – Uma Fonte de Proteínas com Propriedades Diversas

Dado ao elevado teor de proteínas presente nas sementes de feijão

caupi é previsível que essas macromoléculas apresentem características e

propriedades distintas. Nesse trabalho, será dada ênfase às proteínas

relacionadas com a função de reserva e as que limitam a utilização de

nutrientes.


40

2.3.1 - Proteínas de Reserva do Feijão Caupi – Globulinas

Proteínas presentes em sementes de leguminosas são classificadas em

dois grupos principais: globulinas ou proteínas solúveis em sal e albuminas ou

proteínas solúveis em água (VIOQUE et al., 1999). As globulinas representam

cerca de 70% das proteínas de leguminosas, podendo ser divididas,

principalmente, em leguminas e vicilinas, sendo essas classificadas pelo seu

respectivo coeficiente de sedimentação 11S ou 7S, respectivamente. A função

das globulinas como proteínas de reserva da semente é a de fornecimento de

energia, carbono e redução de nitrogênio para a germinação e crescimento do

vegetal (CASEY et al., 1986).

As proteínas 7S são oligoméricas com pH e força iônica dependentes do

equilíbrio entre associação e dissociação (SCHOLZ et al., 1983). As estruturas

tridimensionais dessas proteínas têm sido determinadas, servindo de

poderosas ferramentas para o maior conhecimento da relação estrutura versus

função. As proteínas 7S com estruturas mais conhecidas são provenientes de

Phaseolus vulgaris (DYER et al., 1993). Em relação às proteínas 11S, essas

são, também, oligoméricas, usualmente hexâmeros. Entretanto, esses se

mostraram menos susceptíveis à dissociação, exceto pela força iônica e pH

baixos (KOSHIYAMA, 1983).

Frações tipo vicilinas ou 7S (G-1), chamadas vigninas, representam

globulinas heterogêneas com elevada massa molecular (170 kDa), formada de

três subunidades similares (40-70 kDa) ligadas por pontes dissulfetos (CASEY

et al., 1986). Essas foram consideradas o maior conteúdo protéico presente no

tecido de armazenamento de cotilédones de leguminosas (DERBYSHIRE et al.,

1976). No caso particular do feijão caupi, a maioria das proteínas extraídas das

sementes representa a fração globulina (SALES et al., 2000; MOTA et al.,

2003; UCHÔA et al., 2006).


41

2.3.2. Proteínas de Feijão Caupi que Limitam a sua Utilização e Valor

Nutricional

O feijão caupi apesar de ser boa fonte de proteínas, energia e de outros

nutrientes, além de seu baixo custo em relação a outros alimentos ricos em

proteínas, tem sua utilização de certa forma comprometida pela presença,

principalmente, de fatores antinutricionais e/ou tóxicos. Dentre os de natureza

química protéica, destacam-se inibidor de tripsina, lectina e urease (LIENER,

1994; MAIA et al, 2000; OLIVEIRA et al., 2004).

Em geral, os efeitos da presença de inibidores de tripsina na dieta

compreendem: 1) alteração moderada da digestibilidade das proteínas; 2)

redução da absorção de nitrogênio e enxofre; 3) indução de hipertrofia e

hiperplasia pancreática e estimulação excessiva da secreção enzimática; 4)

aumento da síntese de tripsina e quimiotripsina pelo pâncreas (desse modo,

aumentando a demanda de metionina e cisteína); 5) diminuição da taxa de

crescimento em animais testes (esse efeito pode ser prevenido por inativação

dos inibidores por calor, cocção ou suplementação com metionina); 6) estímulo

da perda endógena de nitrogênio e enxofre; 7) estimulação da síntese e

liberação de fatores hormonais, tais como colecistocinina que estimula a

secreção enzimática do pâncreas e 8) hiperplasia nodular, adenoma acinar e

adenocarcinoma (em longo prazo e dependente da ingestão e do nível de

proteínas da dieta) (NORTON, 1991; VASCONCELOS e OLIVEIRA, 2004). No

caso em particular do feijão caupi, a inclusão de farinha de sementes, e não

proteínas purificadas, induziu rápido crescimento do pâncreas de ratos durante

os 150 dias iniciais, e somente após 350 dias é que ocorreu um segundo

período de crescimento rápido. Assim, o padrão geral do crescimento

pancreático observado foi, provavelmente, um resultado combinado das

mudanças dependentes da idade, da susceptibilidade do pâncreas à ação de

fatores antinutricionais da semente e do efeito acumulativo que surge do uso

prolongado de dietas contendo essas sementes (GRANT et al., 1993). A

exposição prolongada ao inibidor de tripsina, aumentou, também, a incidência


42

de lesões pancreáticas pré-neoplásicas e de câncer pancreático (GRANT et al.,

1995).

Quanto à lectinas, vários estudos têm sido conduzidos a fim de verificar

os efeitos antinutricionais causados pela presença dessas proteínas na dieta. A

propriedade de muitas lectinas está vinculada à sua resistência à proteólise

durante a passagem pelo trato digestório, interferindo no aproveitamento dos

nutrientes (VASCONCELOS e OLIVEIRA, 2004). Ademais, lectinas podem se

ligar nas microvilosidades das células do epitélio intestinal, chegando, muitas

vezes, a causar ruptura de membranas e degradação de microvilos,

acarretando lesão no epitélio e diminuição da camada de muco que protege o

tecido epitelial do intestino delgado, principalmente duodeno e jejuno. Algumas

lectinas podem, ainda, ser internalizadas nos enterócitos, atingir o sistema

circulatório e, então, atuar de modo sistêmico, causando diversas alterações

metabólicas (LIENER, 1994; VASCONCELOS e OLIVEIRA, 2004). No caso do

feijão caupi, não foram encontrados trabalhos mostrando os efeitos da lectina

purificada.

Mais recentemente, efeitos deletérios foram vinculados à urease. As

evidências são oriundas de observações feitas a partir de ureases de soja.

Inicialmente, Vasconcelos e colaboradores (2001) demonstraram que as

ureases presentes em farinha de sementes de soja foram capazes de

influenciar negativamente o consumo de alimentos e o ganho de peso de ratos,

afetando de forma significativa os valores relativos à Utilização Líquida da

Proteína (NPU), digestibilidade e peso relativo de órgãos internos. Quando o

modelo experimental foi mudado de ratos para frangos de corte, num

experimento semelhante, novamente as ureases de soja se sobressaíram

como uma proteína antinutricional e/ou tóxica. As alterações descritas foram

verificadas quando as dietas foram formuladas com farinha das sementes

contendo diferentes teores de ureases. Quando urease purificada de sementes

quiescentes de soja foram administradas por via oral a ratos, usando uma

sonda orogástrica, essa proteína foi capaz de induzir alterações na mucosa

gástrica dos animais e de elevar o pH do conteúdo estomacal, de forma

semelhante ao verificado com a bactéria Helicobacter pylori, evidenciando suas

propriedades tóxicas (MAIA, 2008). Apesar das alterações descritas terem sido


43

causadas pela urease de soja, dada a grande similaridade estrutural entre as

ureases, é possível a que proveniente do caupi induza efeito semelhantes.

No contexto de proteínas que limitam utilização do feijão caupi, torna-se

oportuno que sejam ressaltadas as propriedades alergênicas de algumas

globulinas, em particular as leguminas provenientes de amendoim, amêndoa,

castanha e de outras oleaginosas (MARTINS, 2006).

2.4. Melhoramento Genético e Biossegurança Alimentar

Apesar da elevada variabilidade genética, da capacidade de adaptação

e do alto potencial produtivo do feijão caupi, quando comparado a outras

culturas, o seu potencial genético poderia ser mais explorado (FREIRE FILHO

et al., 1999). A complexidade do melhoramento do feijão caupi é decorrente de

várias características da planta e semente, tempo de maturidade e sistemas de

produção usados, que são diferem de região para região. Todavia, há

necessidade de desenvolvimento de genótipos com diferentes atributos e

resistência aos estresses bióticos e abióticos, para atender as necessidades

específicas de diferentes regiões e arranjos produtivos (SINGH et al., 1997;

FREIRE FILHO et al., 1999).

Dentre os diversos objetivos relacionados ao melhoramento do feijão

caupi, destacam-se, sobretudo, o desenvolvimento de genótipos com grãos de

alta qualidade e com resistência múltipla a patógenos e pragas. No início, o

melhoramento teve como principal finalidade o aumento da produtividade.

Posteriormente, o melhoramento priorizou também a resistência a doenças e

pragas, não esquecendo a qualidade do grão e a arquitetura da planta

(FREIRE FILHO et al., 2000). Porém, dada à importância nutricional do feijão

caupi, é importante que aliado ao melhoramento genético, através do uso de

métodos clássicos ou modernos (transgenia), sejam realizados estudos com

ênfase na biossegurança alimentar, com enfoque especial na avaliação do

valor nutricional, de modo a complementar ou mesmo validar os resultados


44

obtidos derivados dos procedimentos adotados visando o melhoramento da

cultura.

2.4.1. Biossegurança Alimentar

Atualmente, uma das grandes preocupações relacionadas ao

melhoramento genético, especialmente quando se faz uso da engenharia

genética, está em assegurar a ausência de riscos, isto é, que as modificações

introduzidas resultam efetivamente no aumento da produção, na melhoria da

qualidade dos alimentos e na diminuição do uso de defensivos químicos.

Desse modo, reduzindo o impacto da agricultura no meio ambiente e não

comprometendo o valor nutricional dos alimentos e nem afetando a saúde

humana. Os organismos modificados geneticamente (OMGs) são organismos

vivos e, portanto, diferentemente dos produtos químicos que podem se diluir,

têm o potencial de se dispersar para novos habitats, colonizar novas áreas e se

multiplicar. Suas novas atividades, incluindo a geração de produtos

metabólicos, enzimas e toxinas, irão continuar a ocorrer, desde que o OGM se

mantenha metabolicamente ativo. Combinações genéticas resultantes de

manipulação genética de genes já existentes podem produzir efeitos não

intencionais ou indesejáveis. Uma vez estabelecidos, organismos vivos não

podem ser revogados. Daí, a preocupação em se tomar os cuidados

necessários para a liberação no meio ambiente de organismos geneticamente

modificados (NUTTI, 2003; WHO, 2000).

Embora as plantas e os animais geneticamente modificados sejam

rotineiramente analisados quanto à produtividade, eficiência reprodutiva,

reações a doenças, e características qualitativas, eles não são avaliados

quanto aos seus possíveis efeitos não intencionais a nível molecular. Novas

variedades de alimentos geneticamente modificados pela tecnologia do rDNA

recombinante são raramente objeto de estudo toxicológico ou outro tipo de

avaliação de segurança (WHO, 2000). Dessa forma, o maior problema na

análise de risco dos organismos gerados pela biotecnologia é que seus efeitos


45

não podem ser previstos em sua totalidade. Os riscos à saúde humana incluem

alergias, toxicidade e intolerância. No ambiente, as conseqüências são a

transferência lateral de genes, a poluição genética e os efeitos prejudiciais a

organismos não-alvo. Com a aprovação em janeiro de 2002 do Protocolo

Internacional de Biossegurança, o princípio da precaução foi estabelecido

como básico e a rotulagem tornou-se obrigatória. A percepção pública obriga

empresas e cientistas a um maior uso da ciência na análise de risco antes do

consumo desses alimentos (NODARI et al., 2003). O risco é tecnicamente a

probabilidade de um evento danoso multiplicado pelo dano causado. Então, se

o dano é grande, mesmo uma baixa probabilidade pode significar um risco

inaceitável. Portanto, o impacto de um transgene no ambiente e na saúde

humana deve ser criteriosamente avaliado (NODARI 2003; GUERRA, 1999).

A FDA (Food and Drug Administration), a FAO (Food and Agriculture

Organization) e a OMS (Organização Mundial da Saúde), estabeleceram como critério

para avaliação dos alimentos geneticamente modificados o conhecimento de sua

Equivalência Substancial (ES), que se baseia na idéia de que alimentos já existentes

podem servir como base para a comparação do alimento geneticamente modificado

(WATANABE e NUTTI, 2002). Tal abordagem não se destina ao estabelecimento da

segurança absoluta, meta praticamente inatingível para qualquer alimento. O objetivo

é garantir que o alimento melhorado seja tão seguro quanto seus análogos

convencionais (WHO, 2000). Se um alimento modificado biotecnologicamente não

apresenta nenhuma diferença na composição de seus nutrientes ou anti-nutrientes em

relação ao seu análogo convencional, ele é considerado um ES. Dessa maneira, o ES

é uma avaliação analítica que compara a composição de um alimento modificado

geneticamente com um alimento análogo já existente. O conceito de ES está

associado, quase que somente, à avaliação de plantas geneticamente modificadas por

tecnologia do rDNA, mas também poderia ser expandido para outros organismos

geneticamente modificados, ou organismos modificados por outras biotécnicas ou,

ainda, por melhoramento tradicional (PERDERSON, 2000; SCHAUZU, 2002;

ATHERTON, 2002).

Alguns fatores devem ser considerados na avaliação da ES, que incluem:

identidade, fonte e composição dos organismos geneticamente modificados; os efeitos

do processamento/cocção sobre alimentos geneticamente modificados; o processo de

transformação; o produto da expressão da proteína do novo DNA; possíveis efeitos


46

secundários da expressão do gene (que incluem a composição em macro e

micronutrientes críticos, antinutrientes, fatores tóxicos endógenos, alérgenos e

substâncias fisiologicamente ativas); ingestão potencial e impacto da introdução do

alimento geneticamente modificado na dieta. Três possíveis conclusões podem ser

tiradas quando a ES é estabelecida: 1) o alimento ou ingrediente alimentar é

geneticamente modificado é substancialmente equivalente ao análogo convencional,

quanto à sua composição e aos seus aspectos agronômicos e toxicológicos; 2) o

alimento geneticamente modificado ou ingrediente alimentar é substancialmente

equivalente ao análogo convencional, exceto por algumas poucas diferenças

claramente definidas; 3) o alimento geneticamente modificado ou ingrediente alimentar

não é substancialmente equivalente, porque diferenças não podem ser definidas ou

porque o análogo convencional não existe (ATHERTON; 2002).

2.4.2. Avaliação Qualitativa dos Alimentos

A necessidade do aumento e da melhoria da qualidade da produção

vegetal com a finalidade de suprir a crescente demanda por alimento é uma

realidade. Até mesmo porque a nutrição humana é 100% influenciada pela

qualidade dos produtos vegetais, particularmente quando considerado o teor de

proteínas, geralmente o componente limitante no valor nutritivo das dietas.

Embora a composição química de uma fonte alimentícia forneça

informações valiosas em termos quantitativos, esta não abrange dados acerca

dos efeitos da maioria dos fatores considerados antinutricionais e/ou tóxicos.

Numa avaliação mais fidedigna, é necessário que a amostra teste seja

administrada a animais experimentais, com o cálculo posterior de diversos

parâmetros biológicos.

Um dos índices que mede a qualidade de uma proteína é a

digestibilidade (D). Esta pode ser definida pela medida da percentagem de

proteínas que são hidrolisadas pelas enzimas digestivas e absorvidas na forma

de aminoácidos ou outro composto nitrogenado. Sua medida “in vivo” é feita

através do cálculo da razão percentual ente o nitrogênio (N) absorvido, o

ingerido vinculado à dieta e o eliminado nas fezes (ANDERSON et al., 1988;


47

SGARBIERI, 1996). Uma forma simples de calcular a digestibilidade aparente

(Da), é dada pela seguinte fórmula:

Da = N ingerido – N fecal X 100 = N absorvido X 100

N ingerido N ingerido

Essa fórmula, entretanto, não é totalmente correta! Isso porque nem

todo nitrogênio excretado nas fezes corresponde a resíduos alimentares não

digeridos, podendo ser proveniente de descamação de camadas epiteliais, por

exemplo (Nitrogênio fecal endógeno). Para tanto, é feita uma correção através

do cálculo da digestibilidade verdadeira (Dv) ou real através da fórmula:

Dv = N ingerido – (N fecal – N fecal endógeno) X 100

N ingerido

Uma outra forma bastante difundida de avaliar a qualidade protéica é

através do cálculo da NPU (Utilização Líquida de Proteína). O método original é

o de Miller e Bender (1955), baseado na percentagem do nitrogênio ingerido

que ficou retido no organismo, sendo o nitrogênio retido determinado pelo teor

de nitrogênio total da carcaça dos grupos de ratos mantidos com a fonte

protéica em estudo, comparado com o nitrogênio da carcaça do grupo

aprotéico (MAHAN e ESCOTT-STUMP, 1996). Pode ser calculada a partir dos


48

NPU = N corporal de G1 – N corporal do G2

X 100 N ingerido pelo G1

valores relativos ao nitrogênio, deduzidos da quantidade de nitrogênio

excretada nas fezes e urina.

NPU pode ser determinada, também, através de ensaios com animais

experimentais em crescimento, utilizando-se dados do nitrogênio total da

carcaça do grupo mantido na dieta contendo 10% de proteína (G1) e do grupo

em dieta aprotéica (G2) (MILLER e BENDER, 1955). A relação é a seguinte:

A relação entre o nitrogênio retido e o nitrogênio absorvido,

representando o nitrogênio utilizado pelo metabolismo animal, pode ser

estabelecida através do cálculo do Valor Biológico (VB). O nitrogênio retido e o

absorvido da dieta são obtidos a partir da análise do nitrogênio da urina e das

fezes em condições basais (sem a ingestão de proteínas) e após a ingestão de

NPU = N retido – (N fecal + N urinário)

X 100 N ingerido


49

proteínas (MILLER e BENDER, 1955; LAJOLO et al., 1989). O VB pode ser

calculado a partir da expressão:

Da mesma maneira que a digestibilidade, o Valor Biológico Verdadeiro

(VBV) pode ser, também, determinado. A correção é realizada sobre os valores

fecais e urinários em relação ao nitrogênio de origem endógena. A expressão

correspondente é a seguinte:

Quanto menor o valor biológico, maior quantidade de proteína será

necessária para que o balanço nitrogenado seja igual a zero, ou seja, alcance o

equilíbrio (WAITZBERG, 2000).

Há, ainda, métodos adicionais de avaliação qualitativa de uma proteína.

Porém, apesar desses servirem como excelentes parâmetros de mensuração,

são caracterizados, geralmente, por exigirem a execução de experimentos

trabalhosos, demorados e de elevado custo. Porém, é conveniente observar

que, em todos os índices de avaliação de qualidade biológica, a digestibilidade

tem papel fundamental. Considerando que uma determinada fonte protéica

N retido

VB = X 100 N absorvido

N ingerido – (N fecal + N urinário)

VBv = X 100 N ingerido – N fecal


50

tenha uma composição aminoacídica ideal, é esperado que, caso essa fonte

apresente uma boa suscetibilidade às enzimas proteolíticas, ela apresente um

alto valor biológico. Se a dieta incluir proteínas biologicamente ativas com

propriedades antinutricionais e/ou tóxicas, havendo a hidrólise dessas

proteínas logo no início do processo da digestão, os seus efeitos serão

anulados e os aminoácidos serão disponibilizados, absorvidos e utilizados pelo

metabolismo animal. Ao contrário, isto é, havendo resistência total ou parcial à

hidrólise, como observada para várias lectinas, a ocorrência de efeitos

deletérios pode ser esperada (VASCONCELOS e OLIVEIRA, 2004).


51

33.. OOBBJJEETTIIVVOOSS


52

3.1 - Gerais

O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar a biossegurança

alimentar de genótipos de feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.]

susceptível (BR9 Longá) e resistente (IT81D 1053) ao gorgulho

(Callosobruchus maculatus; Coleoptera: Bruchidae), usando como modelo

experimental ratos em crescimento. Dietas foram preparadas com farinha de

sementes, suplementada ou não com metionina e, também, com as proteínas

ligantes à quitina de ambos os genótipos, a fim de averiguar se o caráter

suscetível ou resistente ao gorgulho dos genótipos selecionados seria capaz de

causar impactos, tais como toxicidade ou alergia, em animais monogástricos

(ratos) dada a importância do feijão caupi na alimentação humana.

3.2 - Específicos

Analisar as proteínas das sementes dos genótipos suscetível e resistente

ao gorgulho através da determinação da composição centesimal,

dosagem de proteínas solúveis e análise em eletroforese em gel de

poliacrilamida;

Detectar e dosar as proteínas com propriedades antinutricionais e/ou

tóxicas, tais como lectinas, inibidores de tripsina e urease em farinha das

sementes de ambos genótipos;

Avaliar o impacto de dietas contendo farinha de sementes cruas, não

suplementada e suplementada, dos genótipos suscetível e resistente ao

gorgulho sobre ratos em crescimento, considerando vários parâmetros

nutricionais e toxicológicos;

Purificar as proteínas ligantes à quitina dos genótipos suscetível e

resistente ao gorgulho e incluí-las nas dietas para ratos em crescimento, a

fim de averiguar sua importância como fator antinutricional e/ou tóxico

para esses animais;


53

Avaliação da alergenicidade das proteínas ligantes à quitina dos

genótipos, suscetível e resistente ao gorgulho, para ratos.


54

44.. MMAATTEERRIIAAIISS


55

4.1. Sementes

Sementes quiescentes de feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.],

genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus

maculatus (Fabr., 1775), respectivamente, foram cedidas pelo Laboratório de

Citogenética, do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará

e Centro de Pesquisa Agropecuária do Meio-Norte (CPAMN), da Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Teresina-PI. O genótipo BR9

Longá é originário do melhoramento genético da população TVx3777-04E,

proveniente do International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan,

Nigéria. O genótipo IT81D-1053 é uma linhagem também melhorada conhecida

como CNC-0001381, introduzida do IITA no ano de 1989.

4.2. Hemácias

Hemácias de coelho albino, linhagem Nova Zelândia, utilizadas nos

ensaios de aglutinação, foram obtidas de animais adultos e sadios mantidos no

biotério de Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade

Federal do Ceará (UFC).

4.3. Animais

No ensaio de avaliação nutricional da farinha e proteínas ligantes à

quitina dos genótipos em estudo foram utilizados ratos (Rattus norvegicus

Berkenhout, 1769) da linhagem „”Wistar”, brancos, machos. Na obtenção de

antissoro, foram usados camundongos Swiss (Mus musculus Linnaeus, 1758).

Em ambos os casos animais foram fornecidos pelo Biotério Central da UFC.


56

4.4. Reagentes Químicos

Acrilamida, N,N-metileno bisacrilamida, albumina sérica bovina (BSA),

N--benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida, inibidor de tripsina da soja tipo Kunitz,

tripsina, papaína, pepsina, quimiotripsina, marcadores de massa molecular,

N,N,N’,N’ tetrametiletanolamina, “Coomassie Brilliant Blue” G e R, urease,

laminarina, D-glucose, guaiacol, quitina, dimetilaminobenzaldeído, N-acetil-D-

glucosamina, glucuronidase e tetraborato de potássio foram obtidos da Sigma

Chemical Co., St. Louis.

Dodecil sulfato de sódio e -mercaptoetanol foram obtidos da Merck,

Darmstadt, Alemanha.

Os demais reagentes, todos de grau analítico, foram obtidos

comercialmente.


57

55.. MMÉÉTTOODDOOSS


58

5.1. Preparação da Farinha de Cotilédones

Sementes íntegras de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053,

suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus (gorgulho), respectivamente,

foram trituradas em liquidificador e, em seguida, em moinho para café. As farinhas

resultantes foram transferidas para frascos hermeticamente fechados e conservadas a

4 C.

5.2. Composição Centesimal

5.2.1. Determinação do Teor de Umidade

Frascos secos a 100 C e tarados, contendo cerca de 2,0 g de farinha

dos genótipos estudados, foram colocados em estufa a 100 C. Após 24 horas,

os frascos contendo as amostras foram transferidos para um dessecador e

mantidos até que atingissem a temperatura ambiente sendo, então, pesados.

Em seguida, estes foram colocados novamente na estufa por mais 12 horas,

transferidos para um dessecador até atingirem a temperatura ambiente e

pesados. Este procedimento foi repetido até obtenção de pesos constantes. O

teor de umidade foi determinado através da diferença entre os pesos inicial e

final das amostras, sendo esse valor expresso em percentagem.

5.2.2. Determinação do Teor de Cinzas

O resíduo mineral das amostras foi determinado através da incineração

em mufla a 600 C por 4 horas de amostras contendo 2 g de farinha integral de

sementes, acondicionadas em cadinhos de porcelana previamente limpos,


59

secos e tarados. Decorrido o tempo de calcinação, os cadinhos foram

colocados em um dessecador até que atingissem a temperatura ambiente e

pesados. O conteúdo de cinzas foi calculado pelo quociente entre o peso final e

o peso inicial das amostras, expresso em percentagem.

5.2.3. Determinação do Teor de Proteína Total

O conteúdo protéico das amostras de farinha de sementes de caupi foi

determinado pelo método de Kjeldahl, adaptado para medida do teor de

nitrogênio através do método colorimétrico proposto por Baethgen e Alley

(1989).

Amostras contendo 0,02 g de farinha foram acondicionadas em tubos de

mineralização juntamente com 1,5 mL de ácido sulfúrico concentrado e 1,1 g

de mistura sólida composta de sulfato de potássio (acrescentado para

aumentar o ponto de ebulição do ácido), selênio e sulfato de cobre

(catalisadores, adicionados para acelerar a digestão da matéria orgânica) na

proporção de 100:10:1. A mistura foi aquecida em digestor até a completa

mineralização da amostra. A solução concentrada de sulfato de amônio

produzida foi diluída para 50 mL com água grau Milli-Q e utilizada para o

ensaio colorimétrico. O nitrogênio total foi estimado com base em curva padrão

construída com solução de sulfato de amônio. A proteína bruta foi calculada

através da multiplicação do teor de nitrogênio pelo fator 6,25.

5.2.4. Determinação do Teor de Lipídios

Os lipídios totais foram determinados por extração à quente com N-

hexano (AOAC, 1980). Amostras contendo 2 g de farinha de sementes foram

acondicionadas em cartuchos duplos de papel de filtro. Estes foram colocados

no compartimento apropriado de extratores de Soxhlet acoplados a balões


60

previamente desengordurados, secos e tarados. Em seguida, o solvente foi

adicionado e o conjunto aquecido por 8 horas, contadas a partir do ponto de

ebulição do N-hexano. Concluída a extração, o solvente foi parcialmente

recuperado e os balões, contendo o componente lipídico das sementes e

algum resíduo de solvente, foram levados para estufa a 105 5 C por 12

horas. Passado o período de evaporação total do solvente, os balões foram

transferidos para dessecador sem contato manual e, após atingirem a

temperatura ambiente, foram pesados. O conteúdo lipídico foi calculado pela

diferença entre o peso de cada balão antes e depois do processo de extração e

expresso como percentagem do peso seco das amostras.

5.2.5. Determinação do Teor de Fibra Bruta

O teor de fibra bruta foi determinado de acordo com a AOAC (1980).

Amostras da farinha dos genótipos estudados (2 g) foram colocadas em

recipientes de refluxação do aparelho digestor (Sistema de Fibra Bruta/Modelo

TR 146/8-50 e TE 146/5-50) juntamente com 100 mL da solução de H2SO4 a

1,25% e submetidas à fervura por 30 minutos, contados a partir do ponto de

ebulição. Concluída a digestão ácida, procedeu-se a filtração com a haste de

tela (200 – 400 mesh), lavando a tela com água destilada fervente sobre os

resíduos. O material retido na tela foi removido com uma solução de NaOH a

1,25% previamente aquecida (100 mL). O material foi novamente colocado no

aparelho digestor e submetido à fervura por mais 30 minutos. Concluída a

digestão alcalina, o resíduo da hidrólise (água, fibra e minerais) foi filtrado em

cadinho poroso adaptado a um recipiente acoplado a uma bomba de vácuo. O

resíduo sólido final foi lavado com álcool absoluto (20 mL) e, posteriormente,

com éter etílico (10 mL) a fim de facilitar a secagem. Os cadinhos foram então

colocados em estufa com circulação forçada de ar por 12 horas a 105 ºC. Em

seguida, os recipientes foram transferidos para o dessecador e pesados. Essa

pesagem forneceu o peso do material que constava de fibras e minerais. O

passo seguinte foi uma calcinação em mufla a 500 ºC, durante 4 horas. Nesta


61

etapa toda fibra foi oxidada, restando apenas minerais. O valor referente à fibra

bruta foi obtido pela diferença entre o peso do resíduo das digestões antes da

calcinação e o resíduo mineral final, sendo o resultado expresso como

percentagem do peso seco da farinha das sementes.

5.3. Caracterização das Proteínas das Sementes

5.3.1. Extração das Proteínas Solúveis

Para a extração das proteínas totais, farinhas dos genótipos BR9 Longá

e IT81D 1053, suscetível e resistente ao gorgulho, respectivamente, foram

colocadas em contato com tampão fosfato de sódio 0,05 M, contendo NaCl

0,15 M, pH 7,0 (PBS), na proporção de 1:10 (p/v), por 4 horas, a 4 C, sob

agitação constante. Em seguida, as suspensões foram centrifugadas a 10 000

x g, por 30 minutos, filtradas em pano de trama fina, sendo o sobrenadante

denominado de extrato bruto.

5.3.2. Dosagem de Proteínas

Para determinação do teor de proteínas foi utilizada a metodologia

descrita por Bradford (1976). A 100 L de amostra, em diferentes

concentrações, foram adicionados 2,5 mL do reagente de Bradford. A mistura

foi agitada e após 10 minutos em repouso foram feitas leituras das

absorbâncias a 595 nm (espectrofotômetro tipo Espectronic Genesys 8,

Spectronic Instruments). A concentração protéica foi estimada através de uma

curva padrão obtida a partir de concentrações conhecidas de BSA.


62

5.3.3. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em Condições Desnaturantes

(PAGE-SDS)

Eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada em condições

desnaturantes, seguindo-se a metodologia de Laemmli (1970), adaptada para o

uso de placas medindo 16 x 18 cm. A eletroforese foi realizada em gel vertical

de 1,5 mm de espessura, composto por um gel de aplicação (3,5% de

acrilamida e 1% de SDS em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8) e um gel de

separação (15% de acrilamida e 1% de SDS em tampão Tris-HCl 3 M, pH 8,8).

Amostras contendo 4 mg de farinha de sementes de feijão caupi, ou 2

mg de proteínas purificadas, foram suspensas em 1 mL de tampão Tris-HCl

0,625 M, pH 6,8, contendo 1% de SDS e igual concentração de -

mercaptoetanol. As suspensões foram incubadas por 10 minutos a 100 C e,

subseqüentemente centrifugadas a 14 000 g (centrífuga “Eppendorf” 541 7R),

por 10 minutos, a 10 C. Aos sobrenadantes, foi acrescentado azul de

bromofenol, a fim de permitir visualização da corrida eletroforética. Alíquotas

encerrando 20 L foram aplicadas por poço e a corrida conduzida a corrente

constante de 20 mA, durante aproximadamente 2 horas. As bandas protéicas

foram visualizadas por coloração com “Coomassie Brilliant Blue R-250 a

0,05%”. As massas moleculares aparentes das bandas protéicas foram

determinadas por comparação de sua mobilidade eletroforética com aquelas

apresentadas pelos seguintes marcadores protéicos: albumina sérica bovina

(66,0 kDa); ovoalbumina (45,0 kDa); gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase

(36,0 kDa); anidrase carbônica bovina (29,0 kDa); tripsinogênio pancreático

bovino (24,0 kDa); inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz (21,0 kDa) e -

lactoalbumina bovina (14,2 kDa).


63

5.4. Detecção e Dosagem de Proteínas com Propriedades Antinutricionais e/ou

Tóxicas

5.4.1. Lectina

Para detecção e dosagem de lectina foi empregada a técnica de

hemaglutinação segundo metodologia descrita por Moreira e Perrone (1977).

As amostras foram submetidas a diluições seriadas em tubos de ensaio, na

presença de NaCl 0,15 M (1/2, 1/4, 1/8, 1/16 etc). A 0,25 mL de cada diluição,

foi adicionado igual volume de uma suspensão de hemácias de coelho a 2%

tratadas ou não com enzimas proteolíticas. Os tubos foram incubados a 37 ºC,

30 minutos, deixados em repouso por mais 30 minutos ou 15 horas à

temperatura ambiente e, em seguida, centrifugados a 3.000 x g, por 30

segundos, à temperatura ambiente. A visualização dos aglutinados foi feita a

olho nu e os resultados foram expressos em unidades de hemaglutinação (UH),

definida como inverso da maior diluição da amostra ainda capaz de aglutinar

hemácias.

A metodologia utilizada para o tratamento enzimático das hemácias foi a

descrita por Lis e Sharon (1972). Uma amostra de 1 mL de sangue

heparinizado de coelhos foi lavada três vezes com NaCl 0,15 M e,

subseqüentemente, incubadas por 60 minutos a 4 C com a tripsina, na

proporção de 0,1 mg de enzima para 10 mL da suspensão de células. A seguir,

a lavagem dessas células foi efetuada com solução de NaCl 0,15 M, por seis

vezes, sendo o volume final de hemácias suspenso em NaCl em volume

necessário para a obtenção de uma suspensão a 2%.


64

5.4.2. Inibidor de Tripsina

Com o intuito de determinar a presença de inibidor de tripsina nas

sementes dos genótipos, foi empregada a técnica originalmente descrita por

Kakade com algumas modificações (HAMERSTRAND et al., 1981). Farinhas

dos genótipos estudados (0,02 g) foram suspensas em 1 mL de NaOH 0,01 M,

deixadas sob agitação constante por 3 horas à temperatura ambiente e, em

seguida, em repouso por 30 minutos. Os sobrenadantes foram centrifugados a

14 000 x g, por 5 minutos. Após centrifugação, alíquotas de 0,1 mL desses

extratos foram retiradas e incubadas a 37 C num meio de reação que consistia

de 1,6 mL de Tris-HCl 0,05 M, pH 8,2, contendo CaCl2 0,02 M, 0,1 mL de

tripsina (solução estoque de 0,4 mg em 10 mL de HCl 0,001 M) e o substrato

BAPNA. A reação foi interrompida com 0,2 mL de ácido acético 30% (v/v) e a

leitura feita a 410 nm. Os resultados foram calculados considerando a curva

padrão obtida com inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz e expressos como a

quantidade em mg de tripsina inibida (UI) por g de farinha.

Para dissolução de 10 mg de BAPNA foi usado, primeiramente, 0,5 mL

de dimetilsulfóxido que foi agitado vigorosamente em vortex até a completa

dissolução do substrato. Em seguida, o volume foi completado para 1 mL com

água grau milli-Q, sendo esta solução novamente agitada e usada

imediatamente.

5.4.3. Urease

A determinação da atividade ureásica foi feita como descrito por Kaplan (1969),

com algumas modificações. A 0,1 mL de uma solução de uréia 0,5 M foram

adicionados 0,7 mL de uma solução de EDTA tamponado com fosfato de potássio 0,2

M, pH 6,5, e 0,1 mL do extrato bruto com concentração ajustada para 0,2 mg de

proteína por mL. A mistura foi incubada por 15 minutos a 37 C e, então, adicionado 1

mL de uma solução de fenol com nitroprussiato de sódio (62 g de fenol + 0,25 g de


65

nitroprussiato por litro). Subseqüentemente, foi acrescido 1 mL de uma solução de

hipoclorito de sódio mais hidróxido de sódio (43 mL de hipoclorito de sódio comercial a

5,25%, mais 20 g de NaOH em água q.s.p. 1000 mL). A mistura completa foi incubada

por mais 5 minutos a 37 C, seguida da adição de 7 mL de água grau Milli-Q e

agitação vigorosa em vortex. As leituras das absorbâncias foram feitas a 625 nm e a

atividade enzimática foi avaliada em relação a uma curva obtida com urease comercial

(Sigma 41H7008 - 870.000 U/g).

5.5. Purificação das Proteínas Ligantes à Quitina (PLQ)

Amostras (250 mgP) do extrato total dos genótipos de feijão caupi

suscetível e resistente ao gorgulho foram aplicadas à coluna de quitina (38,0 x

1,6 cm), previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,05 M,

contendo NaCl 0,15 M, pH 7,0 (FIGURA 5). Logo após a entrada da amostra no

gel, o fluxo da coluna foi interrompido por 30 minutos. Transcorrido o tempo de

contato da amostra com o gel, o fluxo foi reiniciado e frações foram, então,

coletadas. O primeiro pico (quitina-I), concentrando as proteínas que não se

ligaram à matriz, foi eluído com o próprio tampão de equilíbrio até não haver

mais leitura de absorbância em 280 nm. Em seguida, foi aplicada uma solução

de ácido acético 0,2 M para eluição das proteínas retidas (quitina II). A

cromatografia foi realizada a um fluxo constante de 100 mL/hora, sendo

coletados 5 mL por tubo. Os eluatos foram monitorados através de medidas da

absorbância em 280 nm. A fração protéica retida em coluna de quitina foi

dialisada, liofilizada e, em seguida, avaliada por PAGE-SDS, submetida a

testes de digestibilidade in vitro e usadas em ensaios biológicos para avaliação

de seu potencial antinutricional, tóxico e alergênico.


66

Cromatografia em coluna de quitina equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,05 M, contendo NaCl 0,15 M, pH 7,0

Percolacão da coluna Eluição com ácido acético 0,2 M

com tampão de equilíbrio

FIGURA 5. Esquema de obtenção das proteínas ligantes à quitina a partir do

extrato bruto preparado de farinhas das sementes de genótipos de

feijão caupi suscetível (BR9 Longá) e resistente (IT81D 1053) ao

Calllosobruchus maculatus.

EXTRATO BRUTO

Material Não Retido Material Retido

Proteínas Ligantes à Quitina - PLQ

PAGE-SDS Digestibilidade in vitro

Potencial antinutricional, tóxico e alergênico


67

5.6. Avaliação da Digestibilidade In vitro das PLQ

5.6.1. Ação individual da pepsina, tripsina, quimotripsina e papaína sobre as

PLQ

Inicialmente, 10 mg de proteína foram dissolvidos em 5 mL de HCl 0,1 N.

Dessa solução, foram retiradas 5 alíquotas de 250 L, e adicionados 50 L de

uma solução de pepsina (1 mg/mL em HCl 0,1 N, pH 1,75). Esta proporção

equivale a uma relação enzima/proteína de 10:100. As alíquotas foram

colocadas em banho-maria a 37 0C durante 0,5, 1, 2, 4, e 6 horas. Cada

alíquota retirada foi acrescida imediatamente de 250 L de tampão de amostra

(Tris-HCl 0,125 M, SDS 2%, pH 6,8) 2 vezes concentrado para eletroforese e

aquecida a 100 0C, por 5 minutos. A cada uma das amostras foi adicionada 1

gota de azul de bromofenol a 0,02% e cristais de sacarose, preparando-se,

assim, para a corrida eletroforética. O tempo zero consistiu da amostra mais o

tampão de corrida.

A metodologia utilizada na digestão pela tripsina, quimiotripsina e

papaína obedeceu à mesma seqüência descrita para o tratamento enzimático

pela pepsina, alterando, além das enzimas, a solução de HCl 0,1 N para o

tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,1 (tripsina e quimiotripsina), ou fosfato de sódio

0,25 M, pH 6,0 (papaína).

A verificação da atividade catalítica das enzimas utilizadas (pepsina,

tripsina e quimiotripsina) foi realizada através dos mesmos ensaios enzimáticos

descritos acima com uma proteína reconhecidamente de fácil digestão, no

caso, a albumina sérica bovina (BSA). Os tratamentos enzimáticos com a BSA

só foram acompanhados nos tempos de 30 minutos e 1 hora.


68

5.6.2. Ação Seqüencial da Pepsina, Tripsina e Quimiotripsina

Para realizar digestão in vitro de forma seqüencial 10 mg das PLQ foram

dissolvidos em 500 L de solução de pepsina 0,02 mg/mL de HCl 0,1 N, pH

1,78, permanecendo a 37 oC, por 2 horas. Ao término desse período, foram

retirados 250 L de amostra, sendo 150 L acrescido, imediatamente, de

tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, SDS 2%) dez vezes

concentrado e aquecidos a 100 oC, por 5 minutos, e os outros 100 L acrescido

de igual volume de tampão Tris-HCl 0,25 M, pH 8,91, objetivando inativar a

pepsina e realizar eletroforese da amostra. Aos 250 L restantes foram

adicionados 250 L de uma solução de tripsina mais quimiotripsina (0,02

mg/mL de Tris-HCl 0,25 M, pH 8,91), previamente estabilizada a 37 oC, e

permanecendo nesta temperatura por 3 horas. As soluções enzimáticas foram

preparadas de forma a proporcionar uma relação enzima/amostra de 1:100. Ao

término das 3 horas, alíquota de 250 L foi acrescida, imediatamente, de

tampão de amostra (Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, SDS 2%) dez vezes

concentrado e aquecida a 100 oC, por 5 minutos. Os 250 L restantes, foram

usados na eletroforese. Como controle da ação catalítica das enzimas,

albumina sérica bovina foi submetida à digestão, na mesma proporção da

amostra teste, e coletadas alíquotas nos mesmos tempos que as amostras

teste.

5.7. Ensaios Biológicos

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com

os Princípios Éticos da Experimentação Animal, preconizados pelo Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal (1991), e aprovados pelo Comitê de Ética

e Biossegurança com Animais da UFC.


69

5.7.1. Ensaio Biológico I - Avaliação da Qualidade Nutricional das Proteínas de

Sementes de Genótipos de Feijão caupi Suscetível (BR9 Longá) e


5.7.1.1. Dietas

Foram preparados seis tipos de dietas (TABELA 1) isocalóricas e

isoprotéicas, exceto no caso da dieta NPC, isenta de proteínas ou derivados

nitrogenados, que foi utilizada para fins de controle e cálculo dos parâmetros

nutricionais. Os outros cinco tipos foram preparados de forma a conter as

seguintes variantes protéicas:

Clara do ovo - Dieta controle contendo 10% de proteína bruta oriunda de

albumina da clara do ovo de galinha;

Suscetível –M - O percentual de 10% de proteína foi constituído pela

farinha de sementes de feijão caupi do genótipo suscetível (BR9 Longá)

ao gorgulho;

Suscetível +M - O percentual de 10% de proteína foi constituído pela

farinha de sementes de feijão caupi do genótipo suscetível (BR9 Longá)

ao gorgulho, suplementada com metionina para cobrir os requerimentos

de ratos (COATES et al. 1969);


70

TABELA 1. Composição (g/Kg) das dietas controle (clara do ovo e aprotéica) e

experimentais (farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR

9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus

maculatus, respectivamente)

Ingredientes NPC# Clara do

ovo

Suscetível Resistente

-M* +M¶ -M +M

Amido de milho 500 381,5 84,4 84,4 30,5 30,5

Fécula de mandioca 100 100 100 100 100 100

Glicose 150 150 150 150 150 150

Óleo de milho 150 150 150 150 150 150

Vitaminas 50 50 50 50 50 50

Minerais§ 50 50 50 50 50 50

Clara do ovo - 118,5 - - - -

BR9 Longá - - 415,6 413,2 - -

IT81D 1053 - - - - 469,5 467,1

Metionina - - - 2,4 - 2,4

# NPC - Controle não protéico.

* -M - Farinha não suplementada com metionina. ¶ +M - Farinha suplementada com metionina Mistura de vitaminas vitamina B12 (100%) 0,02; ácido fólico 0,04; biotina

(99%) 0,04; piridoxina HCl 0,04; tiamina HCl 0,04; riboflavina (99%) 0,21;

pantotenato de cálcio (97,5%) 1,20; ácido nicotínico 4,00; inositol 4,00; p-

amino-benzóico12,00; cloreto de colina (50%) 24,00 e amido de milho

954,39. § Mistura de minerais (sulfato de cobre pentahidratado 0,40; sulfato férrico

heptahidratado 5,00; sulfato manganês 3,03; sulfato de zinco heptahidratado

3,60; iodato de potássio 0,04; iodeto de potássio 0,04; fluoreto de sódio 0,12;

vanadato de amônia 0,01; cloreto de níquel hexahidratado 0,08; clorato de

estanho pentahidratado 0,12; selenito de sódio 0,006).


71

Resistente -M - O percentual de 10% de proteína foi constituído pela

farinha de sementes de feijão caupi do genótipo resistente (IT81D 1053)

ao gorgulho;

Resistente +M - O percentual de 10% de proteína foi constituído pela

farinha de sementes de feijão caupi do genótipo resistente (IT81D 1053)

ao gorgulho, suplementada com metionina para cobrir os requerimentos

de ratos (COATES et al. 1969).

Em todas as dietas foram incluídas vitaminas e minerais, de tal forma

que os únicos fatores variáveis foram: procedência da proteína; suplementação

ou não com metionina e ausência completa de proteínas, no caso da dieta NPC

(TABELA 1).

5.7.1.2. Animais

Para avaliação da qualidade nutricional foram utilizados como modelo de

animais monogástricos (mamíferos) ratos da linhagem „”Wistar”, brancos,

machos, desmamados aos 21 dias e adaptados à alimentação com ração

pulverizada, até que fosse atingido o peso médio de 62 5 g. Grupos

homogêneos de animais, com base no peso corpóreo, foram selecionados,

separados individualmente nas gaiolas metabólicas e alimentados por 3 dias

com dieta contendo albumina da clara de ovo, ad libitum, para adaptação à

dieta na forma pulverizada, atingindo peso médio de 70 5 g.

5.7.1.3. Experimento

A metodologia seguida para avaliação da qualidade nutricional das

proteínas das sementes dos genótipos BR 9 Longá e IT81D 1053 foi a descrita


72

por Miller e Bender (1955). Grupos de animais (n = 6) foram alimentados com

dietas controle e experimentais, conforme apresentadas na TABELA 1. Dieta e

água foram oferecidas ad libitum, por 10 dias. Os animais foram pesados

diariamente, tendo sido, também, registrados os quantitativos individuais de

dieta ingerida. As fezes foram coletadas durante os últimos cinco dias do

experimento, secadas em estufa sob ventilação a 40 C, por 24 horas, pesadas

e trituradas em moinho para café, para posterior determinação de nitrogênio

total (BAETHGEN e ALLEY, 1989). Ao final dos 10 dias, estes foram

sacrificados por inalação com halotano, sendo seus órgãos internos (baço,

coração, fígado, rins, estômago, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas,

pulmões e timo) dissecados, liofilizados e pesados. As carcaças foram

colocadas em estufa a 100 C, por 24 horas, pesadas e trituradas, juntamente

com seus respectivos órgãos, para determinação do teor de nitrogênio corporal

(BAETHGEN e ALLEY, 1989).

5.7.1.4. Determinação dos Parâmetros Nutricionais

Os parâmetros nutricionais Utilização Líquida de Proteína (NPU),

Digestibilidade (D) e Valor Biológico (VB) (MILLER e BENDER, 1955) foram

determinados com base nas seguintes fórmulas:

NPU = N da carcaça do grupo teste – N da carcaça do grupo aprotéico N ingerido do grupo teste

D = N ingerido – (N fecal do grupo teste – N fecal do grupo aprotéico) N ingerido do grupo teste


73

5.7.2. Ensaio Biológico II - Avaliação das Propriedades Antinutricionais e/ou

Tóxicas das Proteínas Ligantes à Quitina de Sementes de Genótipos de

caupi Suscetível (BR9 Longá) e Resistente (IT81D 1053) ao

Callosobruchus maculatus (gorgulho)

Após a purificação das quantidades necessárias das proteínas ligantes à

quitina, de extrato bruto preparado a partir de farinha das sementes dos

genótipos suscetível e resistente, foi iniciado o experimento de avaliação de

suas propriedades antinutricionais e/ou tóxicas. O protocolo utilizado foi similar

ao do Ensaio Biológico I, exceto pelo fato de que as dietas experimentais,

desta vez, foram constituídas com as proteínas purificadas em matriz de

quitina, conforme apresentado na FIGURA 2. Análises histológicas e medidas

morfométricas foram, também, realizadas de fragmentos do duodeno e jejuno

dos animais.

5.7.2.1. Dietas

Foram preparados quatro tipos de dietas (TABELA 2) isocalóricas e

isoprotéicas, exceto no caso da dieta NPC, isenta de proteínas ou derivados

nitrogenados, que foi utilizada para fins de controle e cálculo dos parâmetros

nutricionais. Os outros três tipos foram preparados de forma a conter as

seguintes variantes protéicas:

Clara do ovo - Dieta controle contendo 10% de proteína bruta oriunda de

albumina da clara do ovo de galinha;

VB = NPU X 100

D


74

TABELA 2. Composição (g/Kg) das dietas controle (clara do ovo e aprotéica) e

experimentais (proteínas ligantes à quitina de sementes dos

genótipos BR 9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus, respectivamente)

Ingredientes NPC# Clara do

ovo

PLQ*


Amido de milho 500 381,5 381,6 381,8

Fécula de mandioca 100 100 100 100

Glicose 150 150 150 150

Óleo de milho 150 150 150 150

Vitaminas 50 50 50 50

Minerais§ 50 50 50 50

Clara do ovo - 118,5 112,4 112,0

PLQ de BR9 Longá - - 6,0 -

PLQ de IT81D 1053 - - - 6,2

# NPC - Controle não protéico.

* PLQ - Proteínas ligantes à quitina purificadas a partir do extrato bruto oriundo

de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR 9 Longá e IT81D 1053,

suscetível e resistente, respectivamente, ao Callosobruchus maculatus. Mistura de vitaminas vitamina B12 (100%) 0,02; ácido fólico 0,04; biotina

(99%) 0,04; piridoxina HCl 0,04; tiamina HCl 0,04; riboflavina (99%) 0,21;

pantotenato de cálcio (97,5%) 1,20; ácido nicotínico 4,00; inositol 4,00; p-

amino-benzóico12,00; cloreto de colina (50%) 24,00 e amido de milho

954,39. § Mistura de minerais (sulfato de cobre pentahidratado 0,40; sulfato férrico

heptahidratado 5,00; sulfato manganês 3,03; sulfato de zinco heptahidratado

3,60; iodato de potássio 0,04; iodeto de potássio 0,04; fluoreto de sódio 0,12;

vanadato de amônia 0,01; cloreto de níquel hexahidratado 0,08; clorato de

estanho pentahidratado 0,12; selenito de sódio 0,006).


75

PLQ Suscetível - Contendo 9% da proteína bruta na forma de albumina

da clara do ovo e 1% na forma de proteínas ligantes à quitina purificada

do extrato bruto de sementes de feijão caupi, do genótipo suscetível

(BR9 Longá) ao gorgulho;

PLQ Resistente - Contendo 9% da proteína bruta na forma de albumina

da clara do ovo e 1% na forma de proteínas ligantes à quitina purificada

do extrato bruto de sementes de feijão caupi, do genótipo suscetível

(IT81D 1053) ao gorgulho.

Os percentuais de proteínas ligantes à quitina apresentados nas dietas

PLQ Suscetível e PLQ Resistente corresponde à proporção dessas proteínas

em relação às proteínas totais presentes nas sementes dos respectivos

genótipos. Para atingir os 10% de proteína necessários nas dietas, foi feita a

complementação com albumina da clara do ovo.

5.7.2.2. Análise Histológica e Morfométrica

Os fragmentos do duodeno e jejuno foram fixados em formalina a 10%,

por 24 horas. Em seguida, foram processados por meio da metodologia

convencional para obtenção de fragmentos incluídos em parafina,

compreendendo desidratação em soluções alcoólicas de concentração

crescente (70, 80, 90, 95 e 100%), diafanização em xileno, impregnação e

inclusão em parafina. Os cortes histológicos foram feitos em micrótomo, com

espessura média de 5 µm, e corados com hematoxilina-eosina. Imagens

fotomicrográficas dos cortes histológicos preparados foram obtidas com uso de

câmara digital OLYMPUS D-5060 acoplada a microscópio OLYMPUS Modelo

CX-40 (aumentos de 100 e 400x).

A análise morfométrica do duodeno e jejuno abrangeu medidas da altura

de vilosidades e profundidade de criptas intestinais, que foram feitas utilizando-

se o programa Image J para análise de imagens, calibrado com ajuda de


76

lâmina micrométrica OLYMPUS AX 0001 OB-M 1/100. Foram selecionadas

para medição todas as vilosidades que apresentaram integridade estrutural em

toda a sua extensão, medindo-se o seu comprimento da base ao ápice. A

seleção de criptas para medição incluiu apenas aquelas seccionadas

longitudinalmente, com perfil tubular estendendo-se da superfície luminal à

camada muscular da mucosa.


Sementes de Genótipos de caupi Suscetível (BR9 Longá) e Resistente (IT81D

1053) ao Callosobruchus maculatus (gorgulho)

5.7.3.1. Imunização por Via Oral e Coleta de Soro

Grupos de dez camundongos, com 7 a 8 semanas de idade, foram

imunizados por via oral, tendo sido utilizada sonda apropriada para alimentação

intragástrica. Cada animal recebeu diariamente, durante dez dias consecutivos,

100 L de uma solução ou suspensão contendo 100 g de proteína de uma

das seguintes fontes: ovalbumina (OVA), farinha do genótipo BR9 Longá,

farinha do genótipo IT81D1053, PLQ Suscetível e PLQ Resistente, preparada

em NaCl 0,15 M. Animais não imunizados receberam 100 L de salina,

seguindo o mesmo protocolo. Quatorze dias após o término das imunizações,

foi dado um reforço seguindo o mesmo procedimento descrito.

Amostras de sangue foram coletadas por punção no plexo retro-orbital

dos camundongos com pipetas Pasteur, nos dias zero, 7, 14, 21 e 28, após o

término da última imunização. O sangue foi deixado em repouso durante 2

horas à temperatura ambiente, para retração do coágulo. Após esse tempo, o

soro foi separado do coágulo, centrifugado a 600 x g, por 5 minutos. O soro

livre de hemácias foi armazenado à -20 C.


77

5.7.3.2. Análise Sorológica por Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA)

Anticorpos do tipo IgE presentes no soro dos camundongos imunizados

foram quantificados através da técnica de PCA, como descrito por Ovary

(1958) e modificado por Mota e Wong (1969). A determinação dos títulos de

anticorpos do tipo IgE foi feita em ratos albinos machos, sendo definido como o

logaritmo na base dois do inverso da diluição máxima do soro (Dmáx) capaz de

provocar reação cutânea positiva (Título de PCA = log2 1/Dmáx).

Na pele da região dorsal dos animais, previamente depilada, foram

injetados soros diluídos seriadamente. Após um período de latência de 18 a 22

horas, os ratos receberam na veia peniana 1 mL de azul de Evans a 0,05% em

solução salina contendo os diferentes antígenos específicos (1 mg): OVA,

farinha do genótipo IT81D 1053, farinha do genótipo BR9 Longá, PLQ

Suscetível e PLQ Resistente. Após 30 minutos, os ratos foram sacrificados por

inalação com halotano e a pele dissecada para leitura da reação, através da

formação de manchas azuladas provocadas pelo extravasamento do corante

nos locais em que havia anticorpos. Cada teste de PCA foi analisado em

comparação ao controle que apresentava título de anticorpos previamente

determinado, sendo os resultados normalizados nas diversas repetições, de

acordo com o título do controle.


78

66.. RREESSUULLTTAADDOOSS


79

Os resultados foram divididos em duas partes (Parte 1 e Parte 2), na

tentativa de facilitar a compreensão do procedimento experimental adotado no

presente trabalho. As atividades de pesquisa desenvolvidas foram propostas

de modo a responder aos questionamentos feitos.

Na Parte 1, as indagações compreenderam:

Sementes de genótipos de feijão caupi suscetível e resistente ao

gorgulho (Callosobruchus maculatus) diferem entre si em seu valor

nutricional, quando utilizadas como fonte de proteínas em dietas para

animais monogástricos (ratos)?

Sabendo-se que a metionina é o principal aminoácido limitante no feijão

caupi, será que a não suplementação da dieta com esse aminoácido

poderia implicar em respostas drásticas, a ponto de mascarar os efeitos

deletérios, porventura existentes, provenientes do consumo dos

genótipos suscetível ou resistente?

Assim sendo, na parte 1 constam os dados da composição centesimal,

análise do perfil eletroforético, detecção e dosagem de proteínas com

propriedades antinutricionais e/ou tóxicas e avaliação nutricional das farinhas

dos genótipos de feijão caupi, BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente

ao gorgulho respectivamente.

Na Parte 2, os questionamentos incluíram:

Proteínas ligantes à quitina purificadas de sementes de feijão caupi

teriam alguma ação deletéria sobre o organismo animal quando

incluídas em dietas para ratos em crescimento, a exemplo do que tem

sido verificado, em alguns casos com insetos, em particular o gorgulho

do feijão caupi?

Haveria diferenças entre as proteínas ligantes à quitina purificadas de

genótipo suscetível ou resistente ao gorgulho no que se refere à sua

ação sobre animais monogástricos?


80

Dessa forma, na parte 2 estão apresentados os resultados dos

procedimentos usados para obtenção e caracterização das proteínas

ligantes à quitina de ambos os genótipos, suscetível e resistente ao

gorgulho. Também, estão inclusos os dados oriundos da avaliação da

qualidade nutricional e da biossegurança alimentar dessas proteínas.

66..11..PPAARRTTEE 11

6.1.1. Composição Centesimal

Na TABELA 3 estão mostrados os valores obtidos nas análises de

umidade, proteína, lipídios, cinzas, fibra bruta e carboidratos de farinha das

sementes de feijão caupi, dos genótipos suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus. Os teores de umidade, lipídios, cinzas e

carboidratos foram similares para ambos os genótipos. As sementes

analisadas apresentaram alto teor de proteína, superior a 20%, tendo sido

detectada variação significativa entre elas, possuindo o genótipo suscetível

(26,61 g/100 g de farinha) o maior conteúdo protéico. Diferenças significativas

(p < 0,05) foram também verificadas nos conteúdos de fibra bruta, sendo o

genótipo resistente mais rico, cujo valor foi em torno de 5,20 g/100 g de farinha.

6.1.2. Comparação dos Perfis Protéicos das Farinhas de Sementes dos

Genótipos de Caupi por PAGE-SDS

Os perfis eletroforéticos da farinha de sementes dos genótipos

suscetível e resistente ao gorgulho, obtidos por PAGE na presença de SDS e

-mercaptoetanol, não apresentaram diferenças marcantes, com exceção da


81

TABELA 3. Composição proximal (g/100 g de farinha) de sementes de feijão

caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente

ao Callosobruchus maculatus, respectivamente, expressa em

percentual de peso seco

Constituinte Genótipo


Umidade 9,57 ± 0,08a 9,23 ± 0,58ª

Proteína bruta* 26,61 0,30a 23,45 0,12b

Lipídio total 3,30 ± 1,11a 3,89 ± 0,53ª

Cinzas 4,15 ± 0,11a 4,52 ± 0,11ª

Fibra bruta 4,32 ± 0,18b 5,20 ± 0,03a

Carboidratos# 61,62 ± 1,32a 62,94 ± 0,96a

Média de determinações em triplicata. Valores seguidos por letras iguais não

diferem significativamente pelo teste T student (p 0,05).

* N x 6,25. # Determinação por diferença.


82

existência de uma banda mais proeminente logo acima de 29 kDa verificada no

genótipo IT81D 1053 (FIGURA 6). Bandas protéicas com massas moleculares

relativas na faixa de 21 a 97 kDa foram verificadas nos dois genótipos, se

apresentando com maior intensidade aquelas na região em torno de 45 a 66

kDa e uma outra na faixa de 97 kDa.

6.1.3. Detecção e Dosagem de Proteínas com Propriedades Antinutricionais

e/ou Tóxicas

6.1.3.1. Lectina

A presença de lectina, avaliada através da capacidade do extrato bruto

de aglutinar hemácias de coelho, não foi detectada para ambos os genótipos,

quando usadas células não tratadas enzimaticamente. Todavia, quando as

hemácias foram tratadas com tripsina, atividade hemaglutinante foi observada,

não havendo diferença significativa (p > 0,05) entre o genótipo suscetível e

resistente ao gorgulho (TABELA 4). Tendo em vista a baixa atividade

hemaglutinante encontrada, foi especulado se não seria um processo tempo-

dependente, e os resultados apresentados foram mantidos mesmo quando a

avaliação foi feita 15 horas após contato do extrato bruto com as hemácias

tripsinizadas.

6.1.3.2. Inibidor de Tripsina

Os extratos brutos de ambos os genótipos foram capazes de inibir a

tripsina, havendo diferença significativa (p < 0,05) entre os valores

encontrados, sendo a atividade do genótipo resistente superior ao do suscetível

(TABELA 4).


83

FIGURA 6. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e -



Callosobruchus. maculatus, respectivamente. (1) Marcadores de

massa molecular; (2) farinha de IT81D 1053 e (3) farinha de BR9

Longá.

1 2 3

kDa

97

66

45

29

21

14


84

TABELA 4. Proteínas antinutricionais e/ou tóxicas presentes no extrato bruto

de sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053,


respectivamente

Genótipos Proteínas antinutricionais e/ou tóxicas

Lectina* Inibidor de tripsina# Urease§

Suscetível 0,10 0,04ª 12,57 ± 1,4b 25,41 ± 5,4ª

Resistente 0,10 0,04ª 18,55 ± 0,5a 25,13 ± 5,2ª

Média de determinações em triplicata. Valores seguidos por letras iguais não

diferem significativamente pelo teste T student (p 0,05).

* A atividade hemaglutinante (UH/mgF) foi expressa como unidades de

hemaglutinação (UH) por mg de farinha. Uma UH corresponde ao valor

recíproco da maior diluição capaz de provocar aglutinação visível a olho nu. # A atividade inibidora de tripsina foi expressa em mg de tripsina inibida por g

de farinha. § A atividade ureásica foi expressa como unidades de urease por g de farinha.

1 g de urease pura contém 870.000 unidades (Sigma).


85

6.1.3.3. Urease

Os extratos brutos obtidos a partir dos genótipos estudados

apresentaram atividade ureásica, não havendo diferença significativa (p > 0,05)

entre eles (TABELA 4).

6.1.4. Ensaio Biológico I - Avaliação da Qualidade Nutricional das Proteínas de



6.1.4.1. Curvas de Crescimento, Dieta Ingerida e Ganho ou Perda de Peso

Corpóreo

A FIGURA 7 apresenta as curvas de crescimento dos animais durante

os dez dias do experimento. Os animais submetidos à dieta com albumina da

clara do ovo (dieta padrão) mostraram um desempenho satisfatório, o qual já

era esperado, tendo em vista elevada qualidade nutricional dessa fonte

protéica de origem animal. Os animais que continham em suas dietas farinha

dos genótipos suscetível e resistente ao gorgulho, suplementadas ou não com

metionina, apresentaram taxas de crescimento inferiores àqueles que

receberam a dieta padrão. Ainda que inferior à dieta padrão, a suplementação

com metionina proporcionou um melhor desempenho dos animais em relação à

farinha não suplementada. Comparando o genótipo suscetível com o

resistente, embora as curvas de crescimento dos animais tenham mostrado

perfis semelhantes, mantendo a tendência de inclinação, um desempenho

superior foi constatado naqueles cujos tratamentos incluíam farinha do

genótipo resistente como fonte de proteínas.

O desempenho inferior dos animais que continham em suas dietas

farinha dos genótipos de feijão caupi, em relação ao dos submetidos à dieta


86

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dias do Experimento

Pes

o do

s R

atos

(g)

Resistene +M Suscetível+M EG

Resistente-M Suscetível-M NPC

FIGURA 7. Curvas de crescimento dos ratos (n = 6) alimentados com dietas à

base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR9

Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus.


comparadas com as curvas de crescimento dos ratos alimentados

com a dieta contendo albumina da clara de ovo e dieta isenta de

proteínas. Suscetível -M: farinha de BR9 Longá não suplementada

com metionina; Suscetível +M: farinha de BR9 Longá

suplementada com metionina; Resistente -M: farinha de IT81D

1053 não suplementada com metionina; Resistente +M: farinha de

IT81D 1053 suplementada com metionina; EG: Clara do ovo:

albumina da clara do ovo e NPC: dieta aprotéica.


87

padrão, pode ser parcialmente explicado pela quantidade menor de dieta

ingerida no decorrer do período experimental. Esse fato foi mais evidente nos

tratamentos que continham o genótipo suscetível (FIGURA 8).

A TABELA 5 apresenta os dados de ganho ou perda de pesos

calculados através da comparação entre os pesos dos animais no início e no

final do experimento. Os animais pertencentes ao grupo alimentado com a

dieta padrão exibiram ganho de peso correspondente a 47,82%. Embora

inferior ao verificado com a dieta contendo albumina da clara do ovo, mas

significativo (p < 0,05) em relação aos outros tratamentos contendo farinha de

feijão caupi, foi o incremento de peso dos animais submetidos ao tratamento

contendo o genótipo resistente suplementado com metionina (Resistente +M),

cujo valor foi 32,51%. Esse percentual de ganho de peso foi o dobro do

verificado com o grupo que recebeu farinha do genótipo suscetível

suplementado (Suscetível +M) em sua dieta, cujo valor foi 16,60%. Diferenças

significativas (p < 0,05) foram também encontradas quando comparados os

tratamentos contendo os dois genótipos sem terem sido suplementados. De

forma contrária, os animais alimentados com a dieta NPC demonstraram

redução de peso da ordem de 18,25%.

6.1.4.2. Balanço de Nitrogênio

Na TABELA 6 estão os parâmetros analisados apenas nos últimos cinco

dias do experimento, tais como os dados de ingestão alimentar e de nitrogênio

e suas relações com a excreção de matéria fecal e nitrogênio. A ingestão de

dieta e, consequentemente, o consumo de nitrogênio pelos animais

pertencentes aos tratamentos contendo farinha dos genótipos suscetível (32,91

e 0,53 g/rato, respectivamente) e resistente (38,20 e 0,61 g/rato,

respectivamente), sem suplementação com metionina, não diferiram

significativamente (p > 0,05). A suplementação da farinha do genótipo

resistente com metionina proporcionou aumento do consumo de dieta e de

nitrogênio (48,34 e 0,77 g/rato, respectivamente), tornando os valores similares

aos encontrados com a dieta padrão (51,71 e 0,83 g/rato, respectivamente).


88

FIGURA 8. Curvas de consumo diário dos ratos (n = 6) alimentados com

dietas à base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos

BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao

Callosobruchus. maculatus, respectivamente, suplementada ou

não metionina, comparadas com as curvas de consumo dos ratos

alimentados com a dieta contendo albumina da clara de ovo e

dieta isenta de proteínas. Suscetível -M: farinha de BR9 Longá

não suplementada com metionina; Suscetível +M: farinha de BR9

Longá suplementada com metionina; Resistente -M: farinha de

IT81D 1053 não suplementada com metionina; Resistente +M:

farinha de IT81D 1053 suplementada com metionina; EG: Clara

de ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta aprotéica.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dias

Diet

a In

gerid

a (g

)

Clara do ovo Resistente -M Suscetível -M

Resistente +M Suscetível +M NPC


89

TABELA 5. Ganho ou perda de pesos dos animais alimentados com dietas à

base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR9





Dietas* Peso Inicial Peso Final

Percentual de

Ganho (+) ou Perda

(-) de peso¶

EG 70,43 2,22a 104,11 10,67ª +47,82 9,75ª

Resistente –M 70,95 2,92a 79,13 3,42cd +11,53 1,62c

Resistente +M 71,15 3,42a 94,28 5,42b +32,51 6,18b

Suscetível –M 70,91 3,07a 73,43 3,16d +3,55 1,57d

Suscetível +M 71,24 4,34a 83,07 6,42c +16,60 5,95c

NPC 70,19 2,70 57,38 2,24e -18,25 1,99e

Letras iguais na vertical indicam resultados estatisticamente não diferentes

pelo teste T de Student (p 0,05).

* Suscetível -M: farinha de BR9 Longá não suplementada com metionina;

Suscetível +M: farinha de BR9 Longá suplementada com metionina;

Resistente -M: farinha de IT81D 1053 não suplementada com metionina;

Resistente +M: farinha de IT81D 1053 suplementada com metionina; EG:

Clara do ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta aprotéica. ¶ Os percentuais de ganho ou perda de peso foram calculados com base nos

pesos dos animais no início e no final do experimento.


90

TABELA 6. Balanço de nitrogênio dos ratos (n = 6) alimentados com dietas à base de farinha de sementes de feijão caupi,

genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus, respectivamente,

suplementada ou não metionina, comparado com o tratamento contendo dieta preparada com albumina da clara

do ovo, calculados para os últimos cinco dias de experimento

Dieta* Dieta ingerida

(D)

Nitrogênio

ingerido (N)

Excreção fecal

(F)

Nitrogênio fecal

(FN)

F/D x 100 FN/N x 100

EG 51,71 9,67a 0,83 0,14a 1,13 0,21c 0,06 0,12c 2,19 0,54c 7,23 1,05c

Resistente –M 38,20 5,68b 0,61 0,10b 3,66 0,49a 0,20 0,02a 9,58 0,81a 32,79 4,20ª

Resistente +M 48,34 5,03a 0,77 0,08a 3,78 0,56a 0,19 0,02a 7,82 0,56b 24,68 1,90b

Suscetível –M 32,91 4,25b 0,53 0,08b 3,09 0,28b 0,14 0,02b 9,39 1,05a 26,42 3,98ª

Suscetível +M 37,47 7,13b 0,60 0,13b 3,01 0,78b 0,18 0,04a 8,03 1,53a 30,00 3,38ª

Valores seguidos por letras iguais na vertical não diferem significativamente pelo teste T de Student (p > 0,05).

* Suscetível -M: farinha de BR9 Longá não suplementada com metionina; Suscetível +M: farinha de BR9 Longá

suplementada com metionina; Resistente -M: farinha de IT81D 1053 não suplementada com metionina; Resistente +M:

farinha de IT81D 1053 suplementada com metionina e EG: albumina da clara do ovo.


91

Contrariamente, a suplementação da farinha do genótipo suscetível com metionina

não favoreceu a ingestão de dieta e consumo de nitrogênio, mantendo os valores

muito próximos aos encontrados com a farinha não suplementada (37,47 e 0,70

g/rato, respectivamente).

A excreção de matéria fecal e de nitrogênio foi maior nos animais que

receberam dietas contendo farinha de feijão caupi do que naqueles que

consumiram a dieta controle positivo (1,13 e 0,06 g/rato). Entretanto, foram

verificadas divergências nos valores quando apreciados os tratamentos contendo

os genótipos suscetível e resistente. Considerando apenas farinha de sementes

não suplementada, o grupo submetido à dieta contendo o genótipo resistente

apresentou maior excreção de matéria e nitrogênio fecal (3,66 e 0,20 g/rato,

respectivamente) do que o verificado com o genótipo suscetível (3,09 e 0,14

g/rato, respectivamente). A excreção de matéria fecal e nitrogênio (3,78 e 0,19

g/rato, respectivamente) no tratamento contendo o genótipo resistente foi mantida

após suplementação com metionina. Todavia, no genótipo suscetível, após

suplementação com metionina, embora a excreção de matéria fecal (3,01 g/rato)

não tenha tido alteração significativa (p > 0,05), um aumento na eliminação de

nitrogênio (0,18 g/rato) foi verificado, atingido os valores verificados com o

genótipo resistente.

As relações de excreção fecal e dieta ingerida (F/D x 100) e nitrogênio

excretado e nitrogênio ingerido mostraram que os animais alimentados com as

dietas contendo o genótipo suscetível ou resistente apresentaram valores bem

superiores, em alguns casos cerca de 4,5 vezes, quando comparados aos animais

do grupo tido como controle positivo. Apesar dessa variação, não houve

diferenças significativas (p > 0,05) entre os grupos alimentados com dieta

contendo o genótipo suscetível ou resistente, sem suplementação com metionina.

A adição de metionina implicou na diminuição desses valores no grupo submetido

à dieta com o genótipo resistente, mas não resultou em alterações naquele que

continha o genótipo suscetível.


92

6.1.4.3. Parâmetros Nutricionais

Os valores correspondentes aos parâmetros nutricionais, encontram-se

dispostos na TABELA 7. Inicialmente, fica evidenciada a qualidade inferior das

dietas à base de farinha dos diferentes genótipos de feijão caupi, comparadas à

albumina da clara do ovo, observação esta corroborada pelos baixos valores de

NPU (Utilização Líquida de Proteína), digestibilidade e valor biológico.

A digestibilidade da dieta contendo o genótipo suscetível (65,38%) não

diferiu significativamente (p > 0,05) daquela contendo farinha do genótipo

resistente (67,40%). Com a suplementação das dietas através da adição de

metionina foi verificada uma tendência de aumento da digestibilidade nos

genótipos suscetível (70,23) e resistente (68,50%).

Diferenças significativas (p > 0,05) na NPU não foram encontradas quando

comparados os tratamentos contendo farinhas do genótipo suscetível (39,78%) ou

resistente (39,70%). A adição de metionina às dietas parece ter promovido uma

maior retenção das proteínas, particularmente daquelas presentes na dieta

contendo o genótipo suscetível (45,93%). Todavia, os valores não diferiram

significativamente (p > 0,05) em relação às dietas não suplementadas.

As dietas contendo farinha do genótipo suscetível e do resistente

apresentaram valor biológico similar. Uma tendência de aumento do valor

biológico foi verificada após suplementação com metionina. Todavia, os valores

calculados neste último caso não foram significativamente distintos (p > 0,05),

quando comparados com aqueles das dietas não suplementadas.

6.1.4.4. Alterações Macroscópicas nos Órgãos dos Ratos

Ao final do décimo dia de experimento os ratos foram sacrificados e alguns


93

TABELA 7. Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 6) com

dietas à base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR9


maculatus, respectivamente, suplementada ou não com metionina,


albumina da clara de ovo

*Dietas NPU (%) Digestibilidade (%) Valor Biológico (%)

Clara do ovo 87,36 8,21a 98,04 1,78ª 83,91 5,22ª

Resistente –M 39,70 3,44b 67,40 6,04b 59,19 7,63b

Resistente +M 44,24 4,40b 68,50 6,09b 64,41 6,33b

Suscetível –M 39,78 6,36b 65,38 8,72b 60,41 7,39b

Suscetível +M 45,93 4,74b 70,23 5,20b 65,40 7,33b

Valores seguidos por letras iguais na vertical não diferem significativamente pelo

teste T de Student (p 0,05).

* Suscetível -M: farinha de BR9 Longá não suplementada com metionina;

Suscetível +M: farinha de BR9 Longá suplementada com metionina; Resistente

-M: farinha de IT81D 1053 não suplementada com metionina; Resistente +M:

farinha de IT81D 1053 suplementada com metionina e Clara do ovo: albumina

da clara do ovo.


94

órgãos, como pâncreas, fígado, timo, baço, estômago, intestino delgado, intestino

grosso, coração, pulmão e rins, foram retirados e analisados seus respectivos

pesos secos (TABELAS 8 e 9). Em comparação com órgãos internos dos animais

pertencentes ao grupo mantido com a dieta à base de clara de ovo, foi verificado

que, em geral, dietas contendo farinha de feijão caupi não induziram alterações na

maioria dos órgãos analisados. Entretanto, foi observada hipertrofia do pâncreas e

intestino grosso, presente tanto no tratamento com o genótipo suscetível, como no

resistente. Com a suplementação com metionina, ainda que os pesos do intestino

grosso não tenham sido significativamente diferentes (p > 0,05) do verificado com

as dietas não suplementadas, foi verificada uma tendência de redução da

hipertrofia relatada. Os animais que receberam a dieta aprotéica apresentaram

maior peso relativo de alguns órgãos, como pulmões e coração, e atrofia do baço.


95

TABELA 8. Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos tubulares e glândulas anexas do sistema digestório de

ratos (n = 6) alimentados com dietas à base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D

1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus, respectivamente, suplementada ou não com metionina,

comparado com os tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara de ovo e dieta aprotéica

Valores seguidos por letras iguais na horizontal não diferem significativamente pelo teste T de Student (p ( 0,05).

* Suscetível -M: farinha de BR9 Longá não suplementada com metionina; Suscetível +M: farinha de BR9 Longá suplementada

com metionina; Resistente -M: farinha de IT81D 1053 não suplementada com metionina; Resistente +M: farinha de IT81D

1053 suplementada com metionina; Clara do ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta aprotéica.

Órgãos Dietas*

Clara do ovo Resistente –M Resistente +M Suscetível –M Suscetível +M NPC

Pâncreas 0,13 ± 0,03b 0,25 ± 0,06a 0,24 ± 0,06a 0,24 ± 0,06a 0,23 ± 0,07a 0,13 ± 0,04b

Fígado 3,62 ± 0,65a 3,62 ± 0,36a 4,04 ± 0,49a 3,49 ± 0,31a 4,14 ± 0,51a 3,69 ± 0,26a

Estômago 0,45 ± 0,09a 0,51 ± 0,06a 0,48 ± 0,10a 0,50 ± 0,05a 0,55 ± 0,05a 0,47 ± 0,03a

Intestino delgado 2,16 ± 0,12a 2,43 ± 0,26a 2,39 ± 0,32a 2,36 ± 0,44a 2,33 ± 0,25a 2,13 ± 0,18a

Intestino grosso 0,55 ± 0,11c 0,84 ± 0,10a 0,75 ± 0,22ab 0,88 ± 0,10a 0,75 ± 0,12ab 0,64 ± 0,22bc


96

TABELA 9. Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) do coração, rins, pulmões e órgãos linfóides de ratos (n = 6)

alimentados com dietas à base de farinha de sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053,

suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus, respectivamente, suplementada ou não metionina, comparado

com os tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara de ovo e dieta aprotéica

Valores seguidos por letras iguais na horizontal não diferem significativamente pelo teste T de Student (p 0,05).

* Suscetível -M: farinha de BR9 Longá não suplementada com metionina; Suscetível +M: farinha de BR9 Longá suplementada

com metionina; Resistente -M: farinha de IT81D 1053 não suplementada com metionina; Resistente +M: farinha de IT81D

1053 suplementada com metionina; Clara do ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta aprotéica.

Órgãos Dietas*

Clara do ovo Resistente –M Resistente +M Suscetível –M Suscetível +M NPC

Coração 0,24 ± 0,05b 0,28 ± 0,03ab 0,25 ± 0,03b 0,27 ± 0,03ab 0,27 ± 0,03ab 0,31 ± 0,03a

Rins 0,74 ± 0,13a 0,76 ± 0,07a 0,72 ± 0,10a 0,82 ± 0,11a 0,85 ± 0,10a 0,86 ± 0,05a

Pulmões 0,36 ± 0,04b 0,43 ± 0,02ab 0,38 ± 0,06b 0,42 ± 0,05ab 0,44 ± 0,05ab 0,48 ± 0,03a

Timo 0,19 ± 0,04ab 0,19 ± 0,02ab 0,20 ± 0,04a 0,18 ± 0,03ab 0,22 ± 0,07a 0,14 ± 0,03b

Baço 0,17 ± 0,03a 0,16 ± 0,01ab 0,15 ± 0,03ab 0,16 ± 0,03ab 0,16 ± 0,01ab 0,13 ± 0,01b


97

66..22.. PPAARRTTEE 22

6.2.1. Obtenção das Proteínas Ligantes à Quitina

A aplicação do extrato bruto de ambos os genótipos estudados em

coluna de quitina rendeu duas frações protéicas bem definidas (FIGURAS 9 e

10). Uma delas foi obtida pela percolação da coluna com o próprio tampão de

equilíbrio (fosfato de sódio 0,05 M, contendo NaCl 0,15 M, pH 7,5). A outra

fração, que interagiu com o polímero de quitina, foi eluída com solução de

ácido acético 0,02 M. As proteínas ligantes à quitina dos genótipos BR9 Longá,

e IT81D 1053, suscetível e resistente ao gorgulho do feijão caupi,

respectivamente, foram denominadas de PLQ suscetível e PLQ resistente,

sendo doravante assim referidas no presente trabalho. A metodologia utilizada

para obtenção das proteínas ligantes à quitina demonstrou ser bastante eficaz,

permitindo que, em cada procedimento de purificação fossem obtidos

quantitativos dessas proteínas em torno de 0,87 mg (genótipo suscetível) e

0,98 mg (genótipo resistente), que correspondem a 34,8% e 39,2%,

respectivamente, do total de proteína aplicada. O perfil eletroforético dessas

proteínas está apresentado na FIGURA 11, predominando bandas protéicas

com massa molecular aparente na região de 60 kDa. No genótipo resistente,

além de bandas nesta região, destacam-se outras na faixa de 30 kDa.

6.2.2. Avaliação da Digestibilidade In vitro das PLQ

PLQ Suscetível e PLQ Resistente quando incubadas com pepsina por

até 6 horas não sofreram, aparentemente, nenhum tipo de hidrólise, ao

contrário do observado para a BSA que foi totalmente digerida nos primeiros 30

minutos de incubação (FIGURAS 12 e 13, Pepsina). Por outro lado, com


98

0

1

2

3

4

0 20 40 60 80 100 120 140

Frações

A28

0 nm

Ácido acético 0,2 M

PLQ Suscetível

FIGURA 9. Cromatografia de afinidade em coluna de quitina. Extrato bruto (250

mgP) do genótipo suscetível (BR9 Longá) foi aplicado em coluna

de quitina (27,1 x 3,1 cm) equilibrada com tampão fosfato de sódio

0,05 M, contendo NaCl 0,15 M, pH 7,5. As proteínas foram eluídas

com ácido acético 0,2 M. Fluxo da coluna: 100 mL/ h; Fração: 5 mL/

tubo. Proteína retida: 0,87 mg.


99

FIGURA 10. Cromatografia de afinidade em coluna de quitina. Extrato bruto

(250 mgP) do genótipo resistente (IT81D 1053) foi aplicado em

coluna de quitina (27,1 x 3,1 cm) equilibrada com tampão fosfato

de sódio 0,05 M, contendo NaCl 0,15 M, pH 7,5. As proteínas

foram eluídas com ácido acético 0,2 M. Fluxo da coluna: 100

mL/h; Fração: 5 mL/tubo. Proteína retida: 0,98 mg.

0

1

2

3

4

0 20 40 60 80 100 120 140

Frações

A280

nm

Ácido acético 0,2 M

PLQ Resistente


100

FIGURA 11. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS e -



Callosobruchus maculatus, respectivamente. (1) Marcadores de

massa molecular; (2) proteínas ligantes à quitina de IT81D 1053;

(3) proteínas ligantes à quitina de BR9 longá.

kDa

97

66

45

29

21

14

1 2 3


101

FIGURA 12. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS da albumina

sérica bovina, BSA (controle) e das proteínas ligantes à quitina do

genótipo BR9 Longá (PLQ suscetível), submetidas ao tratamento

enzimático in vitro ,com pepsina, tripsina, quimiotripsina e papaína

nos períodos de tempo: 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas. 1 - marcador de

massa molecular; 2 - BSA não tratada enzimaticamente; 3 - BSA

tratada enzimaticamente durante 0,5 horas; 4 - PLQ não tratada

enzimaticamente; 5, 6, 7, 8 e 9 - PLQ tratada enzimaticamente por

0,5, 1, 2, 4 e 6 horas, respectivamente. Proteína aplicada: 50 g.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Pepsina kDa

97

66

45 29 21 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tripsina

kDa

97

66

45

29 21

Quimiotripsina

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Papaína

1 2 3 4 5 6 7 8 9

kDa

97

66

45

29 21

kDa

97

66

45 29 21


102


sérica bovina, BSA (controle) e das proteínas ligantes à quitina do

genótipo IT81D 1053 (PLQ resistente), submetidas ao tratamento

enzimático in vitro com pepsina, tripsina, quimiotripsina e papaína

nos seguintes períodos de tempo: 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas. 1 -

marcador de massa molecular; 2 - BSA não tratada

enzimaticamente; 3 - BSA tratada enzimaticamente durante 0,5

horas; 4 - PLQ não tratada enzimaticamente; 5, 6, 7, 8 e 9 - PLQ

tratada enzimaticamente por 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas,

respectivamente. Proteína aplicada: 50 g.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

kDa

97

66

45

29

21 14

kDa 97

66

45

29

21 14

Pepsina Tripsina

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Quimiotripsina Papaína kDa

97

66

45

29

21

kDa 97

66

45

29


103

tripsina e quimiotripsina, PLQ dos genótipos suscetível e resistente foram

hidrolisadas. Todavia, PLQ Resistente parece ter sido mais resistente à ação

enzimática dessas enzimas do que PLQ Suscetível (FIGURAS 12 e 13,

Tripsina e Quimiotripsina), desde que os perfis eletroforéticos foram

praticamente o mesmo quando considerada incubação por 30 minutos ou 4

horas. Apenas após 6 horas de incubação com tripsina ou quimiotripsina, foi

verificada uma nítida redução na intensidade das bandas protéicas, ou mesmo

ausência de algumas delas, nas PLQ Resistente. Já nas PLQ Suscetível,

alterações na distribuição e intensidade das bandas se tornaram perceptíveis já

nas primeiras horas de incubação das proteínas com as enzimas tripsina e

quimiotripsina.

Quando analisado o comportamento das bandas protéicas das PLQ

frente à incubação com papaína, exemplo de proteinase cisteínica, uma classe

de enzimas característica do trato digestório do inseto Callosobruchus

maculatus, foi observada hidrólise (FIGURAS 12 e 13, Papaína). Essa hidrólise

foi bem mais evidente com as PLQ Suscetível.

Na simulação da digestão usando várias enzimas em seqüência, em

primeiro a pepsina, seguida de tripsina e quimiotripsina, foi evidenciada

conservação das bandas protéicas após incubação das PLQ com pepsina, quer

do genótipo suscetível, quer do resistente, mesmo após 3 horas de contato

(FIGURAS 14 e 15). Entretanto, digestão completa foi obtida após adição de

tripsina e quimiotripsina, sendo esta visualizada mais precocemente nas PLQ

Suscetível (FIGURA 14).


104


sérica bovina (BSA) e das proteínas ligantes à quitina do genótipo

BR9 Longá (PLQ suscetível), submetidas ao tratamento

enzimático in vitro com pepsina (3 horas), seguida de tripsina e

quimiotripsina (2 horas). 1 - marcador de massa molecular; 2 -

BSA não tratada enzimaticamente; 3 - BSA após incubação com

pepsina; 4 - BSA após incubação com pepsina, tripsina e

quimiotripsina; 5 - PLQ não tratada enzimaticamente; 6 - PLQ

após incubação com pepsina e 7 - PLQ após incubação com

pepsina, tripsina e quimiotripsina.

kDa 97

66

45

29

21 14

1 2 3 4 5 6 7


105


sérica bovina (BSA) e das proteínas ligantes à quitina do genótipo

IT81D 1053 (PLQ resistente), submetidas ao tratamento

enzimático in vitro com pepsina (3 horas), seguida de tripsina e

quimiotripsina (2 horas). 1 - marcador de massa molecular; 2 -

BSA não tratada enzimaticamente; 3 - BSA após incubação com

pepsina; 4 - BSA após incubação com pepsina, tripsina e

quimiotripsina; 5 - PLQ não tratada enzimaticamente; 6 - PLQ

após incubação com pepsina e 7 - PLQ após incubação com

pepsina, tripsina e quimiotripsina.

kDa 97

66

45

29

21 14

1 2 3 4 5 6 7


106

6.2.3. Ensaio Biológico II - Avaliação das Propriedades Antinutricionais e/ou

Tóxicas das Proteínas Ligantes à Quitina (PLQ) de Sementes de

Genótipos de Feijão caupi Suscetível (BR9 Longá) e Resistente (IT81D

1053) ao Callosobruchus maculatus (gorgulho)

6.2.3.1. Curvas de Crescimento, Dieta Ingerida e Ganho ou Perda de Peso

Corpóreo

Os resultados do ensaio biológico visando à avaliação das propriedades

antinutricionais e/ou tóxicas das proteínas ligantes à quitina de genótipos

suscetível e resistente ao gorgulho do feijão caupi demonstraram que, em

geral, essas proteínas não induziram diferenças significativas, em relação ao

grupo que recebeu albumina da clara do ovo como única fonte de proteína

(controle).

A FIGURA 16 apresenta as curvas de crescimento dos animais durante

os dez dias do experimento. As curvas de crescimento dos animais submetidos

aos tratamentos contendo as PLQ foram aparentemente superiores ao

controle. Entretanto, diferenças significativas entre as médias de peso dos

animais apenas foram observadas nos últimos dias, quando considerados o

tratamento contendo PLQ Resistente e o grupo controle. Os animais

submetidos às dietas contendo PLQ Suscetível e PLQ Resistente mostraram

curvas de crescimento semelhantes.

O excelente desempenho dos animais observados com as proteínas

teste pode ser explicado pelo consumo diário de dieta, próximo ao do grupo

controle (FIGURA 17). De forma mais precisa, os animais pertencentes ao

tratamento contendo PLQ Resistente apresentaram maior consumo no decorrer

do período experimental em relação àqueles do grupo controle, não havendo

diferença significativa (p > 0,05) quando comparados aos submetidos à dieta

contendo PLQ Suscetível.


107

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dias do Experimento

Pes

o do

s R

atos

(g)

PLQ Resistente PLQ Suscetível Clara do ovo NPC

FIGURA 16. Curvas de crescimento dos ratos (n = 4) alimentados com dietas

à base de proteínas ligantes à quitina (PLQ), genótipos BR9


maculatus, respectivamente, comparadas com as curvas de

crescimento dos ratos alimentados com a dieta contendo

albumina da clara de ovo (clara do ovo) e dieta isenta de

proteínas (NPC).


108

FIGURA 17. Curvas de consumo diário dos ratos (n = 4) alimentados com

dietas à base de proteínas ligantes à quitina (PLQ), genótipos

BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus, respectivamente, comparadas com

as curvas de crescimento dos ratos alimentados com a dieta

contendo albumina da clara de ovo (clara do ovo) e dieta isenta

de proteínas (NPC).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dias

Die

ta in

gerid

a (g

)

Clara do ovo PLQ Resistente PLQ Suscetível NPC


109

A TABELA 10 mostra os dados de ganho ou perda de pesos relativos,

calculados através da comparação entre os pesos dos animais no início e no

final do experimento. Os animais alimentados com dietas contendo PLQ

Suscetível e Resistente apresentaram incrementos de pesos similar ou superior

ao do grupo controle (64,65%). O percentual de ganho de peso verificado para

o grupo contendo PLQ Resistente correspondeu a 75,40%, um valor

significativamente maior (p < 0,05) ao do grupo controle. O grupo alimentado

com PLQ Suscetível apresentou valor de 69,11%, similar ao do controle, que

embora numericamente menor ao verificado para o grupo contendo PLQ

Resistente, não mostrou diferença significativa (p > 0,05). Os animais

alimentados com a dieta aprotéica demonstraram redução de peso

correspondente a 19,08%.

6.2.3.2. Balanço de Nitrogênio

Os dados obtidos para dieta ingerida, nitrogênio consumido, excreção

fecal e nitrogênio excretado encontram-se descritos na TABELA 11.

Os animais que tiveram maior ingestão de dieta durante os cinco últimos

dias foram aqueles cuja PLQ Resistente (64,87 g/rato) foram incorporadas à

dieta, sendo similar ao do grupo contendo PLQ Suscetível (59,53 g/rato) e

superior ao do controle (57,75 g/rato). O consumo de dieta pelos animais que

consumiram PLQ Suscetível embora tenha sido numericamente maior do que o

verificado para o grupo controle, os valores não diferiram significativamente (p

> 0,05). Em consonância com a quantidade de dieta ingerida, o maior consumo

de nitrogênio foi dado pelo grupo contendo PLQ Resistente (0,65 g/rato) que,

por sua vez, foi similar ao do grupo alimentado com PLQ Suscetível (0,60

g/rato) e superior ao controle (0,58 g/rato).

Os animais constituintes dos grupos alimentados com as dietas

contendo respectivamente PLQ susceptível e resistente apresentaram

excreção fecal significativamente superior (p < 0,05) à observada pelo grupo


110

TABELA 10. Ganho ou perda de pesos dos animais alimentados com dietas à




tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara do

ovo e dieta isenta de proteínas

Dietas* Peso Inicial Peso Final

Percentual de

Ganho (+) ou Perda

(-) de peso¶

Clara do ovo 70,91 2,96a 116,75 2,83b +64,65 5,23b

PLQ Suscetível 70,94 2,04a 119, 97 5,67ab +69,11 6,18ab

PLQ Resistente 70,92 1,85a 124,40 5,65a +75,40 5,15ª

NPC 70,91 2,27a 57,38 2,24c -19,08 1,99c

Letras iguais na vertical indicam resultados estatisticamente não diferentes


* PLQ Suscetível: proteínas ligantes à quitina de sementes do genótipo BR9

Longá; PLQ Resistente: proteínas ligantes à quitina de sementes do

genótipo IT81D 1053; Clara do ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta

aprotéica. ¶ Os percentuais de ganho ou perda de peso foram calculados com base nos

pesos dos animais no início e no final do experimento


111

TABELA 11. Balanço de nitrogênio dos ratos (n = 4) alimentados com dietas à base de proteínas ligantes à quitina de

sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus

maculatus, respectivamente, comparado com o tratamento contendo dieta preparada com albumina da clara do

ovo, calculados para os últimos cinco dias de experimento

Dieta* Dieta ingerida

(D)

Nitrogênio

ingerido (N)

Excreção fecal

(F)

Nitrogênio fecal

(FN)

F/D x 100 FN/N x 100

Clara do ovo 57,75 3,22b 0,58 0,32b 1,09 0,21b 0,07 0,01a 1,89 0,04b 12,07 0,69ª

PLQ Suscetível 59,53 5,07ab 0,60 0,51ab 1,59 0,26a 0,06 0,01a 2,67 0,08a 10,04 0,44b

PLQ Resistente 64,87 1,82ª 0,65 0,18ª 1,86 0,25a 0,07 0,01a 2,88 0,14a 10,77 0,97ab

Valores seguidos por letras iguais na vertical não diferem significativamente pelo teste T de Student (p > 0,05).

* PLQ Suscetível: proteínas ligantes à quitina de sementes do genótipo BR9 Longá; PLQ Resistente: proteínas ligantes à

quitina de sementes do genótipo IT81D 1053 e Clara do ovo: albumina da clara do ovo.


112

controle. Apesar das diferenças no conteúdo de matéria excretada, os valores

de nitrogênio fecal não diferiram entre os diferentes grupos experimentais.

A relação entre os quantitativos de fezes excretadas e dieta ingerida

(F/D x 100) mostra valores ligeiramente superiores para os grupos alimentados

com as PLQ em relação ao controle (1,89 g/rato), não havendo diferença

significativa (p > 0,05) entre os que continham em sua dieta PLQ Suscetível

(2,67 g/rato) ou PLQ resistente (2,88 g/rato). O quociente nitrogênio

excretado/nitrogênio ingerido (FN/N x 100) foi baixo em todos os tratamentos.

Porém, para os animais alimentados com as PLQ (10,04 e 10,77 g/rato), os

valores foram ainda mais inferiores do que o apresentado pelo grupo controle

(12,07 g/rato), demonstrando o bom aproveitamento das proteínas.

6.2.3.3. Parâmetros Nutricionais

Os cálculos de NPU (Utilização Líquida de Proteínas), digestibilidade e

valor biológico estão dispostos na TABELA 12, de onde podem ser extraídas

algumas observações importantes. Inicialmente, ficam evidenciadas as

propriedades não antinutricionais das PLQ, observação corroborada pelos

elevados valores de NPU e digestibilidade e, consequentemente, de valor

biológico, similares àqueles apresentados por animais do grupo controle. Com

relação às PLQ, ressalta-se, também, que embora as purificadas de genótipo

resistente apresentem propriedades diferenciadas frente ao gorgulho quando

comparadas àquelas de genótipo suscetível, em ratos isso não é confirmado,

pois as respostas não diferiram significativamente (p > 0,05) em todos os

parâmetros analisados.


113

TABELA 12. Parâmetros nutricionais obtidos pela alimentação de ratos (n = 4)

com dietas à base de proteínas ligantes à quitina de sementes de

feijão caupi, genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e

resistente ao Callosobruchus maculatus, respectivamente,

comparado com o tratamento contendo dieta preparada com

albumina da clara do ovo

*Dietas NPU (%) Digestibilidade (%) Valor Biológico (%)

Clara do ovo 88,19 ± 5,40a 98,68 ± 0,81ª 89,30 ± 4,86a

PLQ Suscetível 89,66 ± 8,30a 99,29 ± 0,57ª 90,32 ± 8,67a

PLQ Resistente 84,68 ± 5,35a 98,93 ± 0,96ª 85,56 ± 4,68a

Valores seguidos por letras iguais na vertical não diferem significativamente


* PLQ Suscetível: proteínas ligantes à quitina de sementes do genótipo BR9

Longá; PLQ Resistente: proteínas ligantes à quitina de sementes do

genótipo IT81D 1053; Clara do ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta

aprotéica.


114

6.2.3.4. Alterações Macroscópicas nos Órgãos dos Ratos

Os resultados discriminados nas TABELAS 13 e 14, referentes aos

pesos secos relativos de alguns órgãos internos dos animais submetidos às

diferentes condições alimentares, demonstram que as PLQ não influenciaram

no desenvolvimento dos órgãos analisados, visto que não foram encontradas

diferenças significativas (p > 0,05) em relação ao grupo controle. Em adição,

alterações nos pesos dos órgãos que pudessem ser correlacionadas ao

consumo das PLQ oriundas do genótipo suscetível ou resistente não foram

observadas, visto que os valores detectados para ambos os grupos são

semelhantes. Porém, ressalta-se que no grupo submetido à dieta aprotéica

algumas alterações foram detectadas, incluindo hipertrofia do estômago,

intestino grosso, rins, coração e pulmões e, também, atrofia do timo. Parece,

todavia, que essas alterações são influenciadas pela ingestão de dieta

deficiente em proteínas, fato este que pode ser corroborado pela constatação

dessas observações apenas no grupo submetido à dieta aprotéica.

6.2.3.5. Análises Histológicas e Morfométricas

Cortes histológicos de segmentos do duodeno e do jejuno dos ratos

alimentados com as frações PLQ Suscetível e PLQ Resistente foram

analisados e comparados com os mesmos segmentos retirados de animais

alimentados com a dieta controle. Nenhuma alteração foi observada. As

vilosidades foram encontradas intactas, sem deformidade ou descamação,

tanto na região do duodeno bem como no jejuno, semelhante ao controle

(FIGURAS 18 e 19). Aumento no número de células não foi observado na

região dos vilos, que pudesse indicar modificação patológica causada pela

ingestão das proteínas ligantes à quitina. A borda em escova dos vilos se

mostrou bem visível, denotando a manutenção de sua integridade. Diminuição


115

TABELA 13. Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) de órgãos tubulares e glândulas anexas do sistema digestório de

ratos (n = 4) alimentados com dietas à base de proteínas ligantes à quitina de sementes de feijão caupi, genótipos

BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus, respectivamente, comparado com

os tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara de ovo e dieta aprotéica



quitina de sementes do genótipo IT81D 1053; Clara do ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta aprotéica.

Órgãos Dietas*

Clara do ovo PLQ Suscetível PLQ Resistente NPC

Pâncreas 0,19 ± 0,02ª 0,20 ± 0,07ª 0,18 ± 0,05a 0,13 ± 0,04a

Fígado 3,53 ± 0,34ª 3,30 ± 0,64ª 3,69 ± 0,40a 3,19 ± 1,25a

Estômago 0,39 ± 0,05b 0,39 ± 0,05b 0,39 ± 0,02b 0,47 ± 0,03a

Intestino delgado 1,83 ± 0,13ª 2,08 ± 0,37ª 2,09 ± 0,24a 2,13 ± 0,18a

Intestino grosso 0,44 ± 0,09b 0,52 ± 0,13ab 0,46 ± 0,12b 0,64 ± 0,04a


116

TABELA 14. Peso seco relativo (g/100 g de peso corpóreo) do coração, rins, pulmões e órgãos linfóides de ratos (n = 4)

alimentados com dietas à base de proteínas ligantes à quitina de sementes de feijão caupi, genótipos BR9 Longá

e IT81D 1053, suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus, respectivamente, comparado com os

tratamentos contendo dieta preparada com albumina da clara de ovo e dieta aprotéica



quitina de sementes do genótipo IT81D 1053; Clara do ovo: albumina da clara do ovo e NPC: dieta aprotéica.

Órgãos Dietas*

Clara do ovo PLQ Suscetível PLQ Resistente NPC

Coração 0,23 ± 0,04b 0,23 ± 0,03b 0,22 ± 0,02b 0,31 ± 0,03a

Rins 0,57 ± 0,06b 0,58 ± 0,07b 0,55 ± 0,08b 0,86 ± 0,05a

Pulmões 0,36 ± 0,06b 0,33 ± 0,03b 0,32 ± 0,04b 0,48 ± 0,03a

Timo 0,18 ± 0,03ab 0,21 ± 0,01ª 0,19 ± 0,02ab 0,14 ± 0,03b

Baço 0,15 ± 0,01ª 0,13 ± 0,01ª 0,13 ± 0,01ª 0,15 ± 0,02a


117

FIGURA 18. Cortes do duodeno de ratos alimentados com dietas à base de




tratamento contendo dieta preparada com albumina da clara de

ovo (grupo controle). A) Vilosidade duodenal dos ratos do grupo

controle; B) Vilosidade duodenal dos ratos alimentados com PLQ

Resistente; C) Vilosidade duodenal dos ratos alimentados com

PLQ Suscetível. LI – Linfócito intraepitelial; NE – Núcleo do

enterócito; CC – Célula caliciforme; BE – Borda em escova; LP –

Lâmina própria e CR – Célula de reserva.

BE CC

BE

NE

BE

NE

CC

NE

CC

LI

LP

LP

LP

A B C


118

FIGURA 19. Cortes do jejuno de ratos alimentados com dietas à base de





ovo (grupo controle). A) Vilosidade duodenal dos ratos do grupo

controle; B) Vilosidade duodenal dos ratos alimentados com PLQ

Resistente; C) Vilosidade duodenal dos ratos alimentados com

PLQ Suscetível. LI – Linfócito intraepitelial; NE – Núcleo do

enterócito; CC – Célula caliciforme; BE – Borda em escova; LP –

Lâmina própria e CR – Célula de reserva.

CC

NE

BE

LI

BE LI

NE

CC

LP LP

CC

NE

LI

LP BE

A B C


119

na altura das vilosidades também não foi observada nos segmentos

analisados. As criptas duodenais e do jejuno também foram analisadas

(FIGURAS 20 e 21) não mostrando alteração visível. Nenhuma divisão

desordenada foi observada nas células de reposição.

O exame morfométrico abrangeu apenas cortes do intestino delgado,

subdividido em duodeno e jejuno. As FIGURAS 22, 23 e 24 apresentam os

gráficos correspondentes aos resultados dos parâmetros analisados, a saber:

altura das vilosidades, profundidade das criptas e relação vilosidade/cripta. Os

animais submetidos às dietas contendo PLQ Suscetível e PLQ Resistente não

apresentaram diminuição de vilosidades e nem aumento na profundidade das

criptas quando comparados àqueles do grupo controle. Divergências também

não foram encontradas quando comparados entre si os animais dos grupos

contendo PLQ Suscetível e PLQ Resistente. Dessa forma, os dados relativos à

razão vilosidade/cripta foram similares aos índices observados para o controle.




A FIGURA 25 mostra que não houve síntese de IgE-específica quando

camundongos foram imunizados por via oral com farinhas dos genótipos de

feijão caupi suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus e suas

respectivas PLQ. Os animais imunizados com ovalbumina (controle) não

apresentaram, também, síntese de IgE até o 14 dia após imunização.


120

FIGURA 20. Cortes do duodeno de ratos alimentados com dietas à base de



Callosobruchus. maculatus, respectivamente, comparado com o


ovo (grupo controle). A) Cripta duodenal dos ratos do grupo

controle; B) Cripta duodenal dos ratos alimentados com PLQ

Resistente; C) Cripta duodenal dos ratos alimentados com PLQ

Suscetível. CC – Células caliciformes; CR – Célula de reserva.

CR CC

CR

CC

CR

CC

A B C


121

FIGURA 21. Cortes do jejuno de ratos alimentados com dietas à base de





ovo (grupo controle). A) Cripta do jejuno de ratos do grupo

controle; B) Cripta do jejuno de ratos alimentados com PLQ

Resistente; C) Cripta do jejuno de ratos alimentados com PLQ

Suscetível. CC – Células caliciformes; CR – Célula de reserva.

CC CR

CC

NE

CC

A B C


122

FIGURA 22. Medidas da altura das vilosidades efetuadas em cortes

histológicos de duodeno e jejuno, de ratos alimentados com

dietas à base de proteínas ligantes à quitina (PLQ) de



respectivamente, comparado com o tratamento contendo dieta

preparada com albumina da clara de ovo (grupo controle).

Letras iguais indicam resultados estatisticamente não

diferentes pelo teste T de Student (p 0,05).

a a a

a a

a


123

0

40

80

120

160

200

Duodeno JejunoSegmentos

Pro

fund

idad

es d

as C

ripta

s (u

m)

Clara do ovo PLQ Resistente PLQ Suscetível

FIGURA 23. Medidas da profundidade das criptas efetuadas em cortes









a a a a a

a


124

0

2

4

6

8

Duodeno Jejuno

Segmentos

Vilo

sida

des/

Crip

tas

(um

)

Clara do ovo PLQ Resistente PLQ Suscetível

FIGURA 24. Medidas da relação vilosidade/cripta efetuadas em cortes









a a a

a a

a


125

FIGURA 25. Cinética da síntese de IgE-específica. Camundongos foram

imunizados por via oral com diferentes antígenos e a sorologia

foi avaliada por anafilaxia cutânea passiva (PCA). A imunização

foi feita durante dez dias consecutivos, usando 100 µg de

proteína. Antígenos: Ovalbumina (OVA); farinha do genótipo

resistente (IT81D 1053); farinha do genótipo suscetível (BR9

Longá); fração ligante à quitina de IT81D 1053 (PLQ Resistente);

fração ligante à quitina de BR9 Longá (PLQ Suscetível).


126

77.. DDIISSCCUUSSSSÃÃOO


127

Uma avaliação da resistência ou suscetibilidade de vários genótipos de

feijão caupi ao Callosobruchus maculatus, foi realizada através de análises

relacionadas ao ciclo biológico desse inseto. Esses estudos foram conduzidos

por Freire (2002) no Laboratório de Citogenética, do Departamento de Biologia

da Universidade Federal do Ceará. Segundo resultados obtidos nesse estudo,

o genótipo IT81D 1053 foi considerado como um dos mais resistentes ao

ataque do desse inseto, enquanto o genótipo BR9 Longá foi caracterizado

como sendo o mais suscetível. Com base nesses dados, aliado ao fato de que

o aumento da produtividade e qualidade requer um trabalho contínuo de

criação e seleção de novos genótipos ou, ainda, a introdução de novos genes e

considerando que são poucos os estudos relacionando resistência a pragas e

valor nutricional dos genótipos desenvolvidos e/ou transformados, os genótipos

BR9 Longá (suscetível) e IT81D 1053 (resistente) foram selecionados para

serem objetos de estudo da presente investigação. Os genótipos foram

comparados através de várias análises bioquímicas e nutricionais, com objetivo

de avaliar se as modificações sofridas pelo genótipo IT81D 1053, que o tornou

resistente ao Callosobruchus maculatus, trouxeram alterações à sua qualidade

nutricional. Esse enfoque se justifica pela importância em se garantir o

consumo seguro de fontes alimentícias provenientes de melhoramento

genético, seja por métodos convencionais ou pelo uso da biotecnologia

moderna, particularmente após a recente aprovação do plantio de Organismos

Geneticamente Modificados (OGM) em nosso país, através da Lei de

Biossegurança/2005.

Os genótipos BR9 Longá e IT81D 1053, suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus, respectivamente, serão, a partir desse ponto,

chamados apenas de suscetível e resistente. No presente trabalho em uma

primeira abordagem, os estudos foram conduzidos apenas com farinhas das

sementes de ambos os genótipos citados.

Os resultados relativos à composição centesimal dos grãos (TABELA 3)

reforçam que o feijão caupi se constitui em uma boa fonte de proteínas e de

calorias (devido ao seu alto conteúdo de carboidratos). Os teores protéicos de

26,61 e 23,45 e g/100 g de matéria seca, para os genótipos suscetível e


128

resistente, respectivamente, diferiram significativamente entre si (p < 0,05).

Apesar da diferença, esses conteúdos se assemelham aos encontrados em

outros genótipos de feijão caupi: 19,50 a 26,10 g/100 g de matéria seca (MAIA

et al., 2000); 23,03 a 23,41 g/100 g de matéria seca (PAULA, 2003); 21,60 a

24,7 g/100 g de matéria seca (CASTELLON et al., 2003); 25,94 g/100 g de

matéria seca (AKINJAYEJU e BISIRIYU, 2004); 20,10 a 25,80 g/100 g de

matéria seca (GIAMI et al., 2001); 24,70 g/100 g de matéria seca (IQBAL et al.,

2006); 26,10 g/100 g de matéria seca (RIVAS-VEJA et al., 2006); 24,70 g/100 g

de matéria seca (OLIVEIRA-CASTILLO et al., 2007); 23,58 e 26,59 g/100 g de

matéria seca (KAPTSO et al., 2008). Diferenças significativas entre os dois

genótipos estudados foram, ainda, encontradas nos teores de fibra bruta (4,32

e 5,20 g/100 g de matéria seca). Todavia, os valores para os dois genótipos

estão dentro das faixas detectadas por Maia (2003) e Onwuliri et al. (2002),

3,77 a 6,23 e 1,7 a 4,50 g/100 g de matéria seca, respectivamente. Uma vez

que os conteúdos de proteína e fibra estão dentro da faixa esperada, esse fato

demonstra que o melhoramento genético não introduziu grandes mudanças no

que diz respeito à análise dos componentes citados.

Em relação aos outros constituintes, foram detectados altos teores de

carboidratos (61,62 e 62,94 g/100 g de matéria seca) e de cinzas (4,15 e 4,52

g/100 g de matéria seca), ao lado de baixos conteúdos de lipídios (3,30 e 3,89

g/100 g de matéria seca). Para os três constituintes citados, não foram

observadas diferenças significativas (p > 0,05) entre os genótipos suscetível e

resistente analisados. Os valores de carboidratos diferem de alguns outros

descritos na literatura: 44,10 a 44,30 g/100 g de matéria seca (ADEBOOYE e

SINGH, 2008); 55,83 a 57,67 g/100 g de matéria seca (KAPTSO et al., 2008);

66,62 a 68,44 g/100 g de matéria seca (PAULA, 2003); 67,78 a 76,08 g/100 g

de matéria seca (MAIA at al., 2000); 71,40 a 74,50 g/100 g de matéria seca

(CASTELLON et al., 2003) e 74,80 g/100 g de matéria seca (RIVAS-VEGAS et

al., 2006). Os teores de cinza são próximos, ou ligeiramente superiores, aos

verificados por Onwuliri et al. (2002), Castellón et al. (2003) e Iqbal et al.

(2006), cujos valores correspondem a 2,8 a 3,3, 2,3 a 3,2 e 4,8 g/100 g de

matéria seca. Em relação aos teores de lipídios, esses foram superiores, em


129

alguns casos, aos de outros genótipos de feijão caupi, cujos valores variaram

de 1,05 a 3,03 g/100 g de matéria seca (ONWULIRI et al., 2002; CASTELLÓN

et al., 2003; RUBASINGHEGE et al., 2006; RIVAS-VEJA et al., 2006). Já Iqbal

e colaboradores (2006) encontraram um valor de lipídio bem superior,

correspondendo a 4,8 g/100 g de matéria seca. Embora se tenha conhecimento

de que a manipulação genética no melhoramento de novos genótipos possa

acarretar uma grande variação na composição química de um modo geral

(GIAMI et al., 2001), o melhoramento genético introduzido no genótipo IT81D

1053, conferindo resistência ao C. maculatus, não acarretou grandes

modificações em suas composições químicas.

Um outro parâmetro comparado foram os perfis eletroforéticos das

farinhas das sementes dos genótipos suscetível e resistente, obtidos por PAGE

na presença de SDS e -mercaptoetanol (FIGURA 6). Em geral, os perfis

mostraram-se muito semelhantes entre si, exceto a existência de uma banda

mais proeminente na região de 29 kDa verificada no genótipo resistente.

Bandas mais intensas foram observadas em ambos os genótipos na faixa 45 a

66 kDa, massas moleculares estas que compreendem proteínas presentes na

fração globulinas (MENDOZA et al., 2001; MAIA, 2003; PAULA, 2003).

Muito embora tenha sido constatado que as sementes dos genótipos

suscetível e resistente estudadas constituem-se boas fontes de calorias e

proteínas, fatores antinutricionais, tais como lectina, inibidor de tripsina e

urease, foram detectados em todas elas. Atividade hemaglutinante não foi

observada nos extratos brutos dos genótipos suscetível e resistente quando

usadas hemácias normais, ou seja, não tratadas enzimaticamente. O

tratamento das hemácias com tripsina, por sua vez, capacitou à aglutinação

(TABELA 4). Certamente, o tratamento enzimático expôs os carboidratos

presentes na superfície da membrana, favorecendo a aglutinação.

Indiferentemente da resistência ao Callosobruchus maculatus, o mesmo

conteúdo de lectina (0,10 UH/mgF) foi encontrado para ambos os genótipos,

teor esse relativamente baixo quando comparado aos presentes em sementes

de soja (Glycine max) e feijão comum (Phaseolus vulgaris) (GRANT et al.,

1995). Conteúdos similares aos encontrados para os genótipos suscetível e


130

resistente foram detectados por Maia (2003), quando analisou outros seis

diferentes genótipos de feijão caupi e usou hemácias tripsinizadas. Quanto ao

inibidor de tripsina, o genótipo resistente apresentou uma maior atividade

(18,55 mg de tripsina inibida/gF) em comparação ao suscetível (12,57 mg de

tripsina inibida/gF). Entretanto, estudos realizados com vários acessos de feijão

caupi têm mostrado não haver uma relação direta entre o conteúdo de inibidor

de tripsina e a resistência ao gorgulho (XAVIER-FILHO e COELHO, 1980;

XAVIER-FILHO et al., 1989; MARCONI et al., 1993). Os teores de inibidor de

tripsina detectados na farinha dos dois genótipos estudados estão dentro da

faixa encontrada por Ene-Obong (1995), 9,8 a 20,5 mg de tripsina inibida/gF, e

menores ou mesmo semelhantes aos detectados por Maia et al. (2000), 12 a

30,56 mg de tripsina inibida/gF. Em relação à outra proteína analisada, a

urease, da mesma forma que a lectina e o inibidor de tripsina, esta não pode

ser relacionada com a resistência ao Callosobruchus maculatus, já que as

farinhas de ambos os genótipos, suscetível e resistente, apresentaram

atividades equivalentes, correspondentes a 25,13 e 25,41 U/gF, não havendo

diferença significativa (p > 0,05) entre elas. Essas atividades se mostraram

superiores às detectadas em outros genótipos de feijão caupi, 9,70 a 20,49

(PAULA, 2003; MAIA, 2003), e bem inferiores àquelas verificadas na soja,

107,32 a 219,28 U/gF (VASCONCELOS et al., 1997; 2001; 2006). Os

constituintes analisados, juntamente com a deficiência de aminoácidos

sulfurados, têm comprometido o valor nutricional de várias leguminosas,

podendo diminuir a disponibilidade dos nutrientes e/ou causar efeitos

fisiológicos adversos (SILVA e SILVA et al., 2000; MUBARAK, 2005).

Apesar dos dados discutidos até o momento não terem evidenciadas

propriedades que pudessem trazer comprometimento à qualidade nutricional

das sementes resistentes ao Callosobruchus maculatus, quando comparadas

ao genótipo suscetível, se tem conhecimento que a forma mais confiável de

avaliar o valor nutritivo de uma determinada fonte é através de sua inclusão na

dieta. Assim, ensaios biológicos, usando ratos em crescimento, foram

realizados, tendo sido adicionadas em suas dietas farinhas dos genótipos

suscetível e resistente como única fonte de proteínas.


131

Os animais alimentados com as dietas contendo farinhas dos genótipos

suscetível e resistente ao Callosobruchus maculatus apresentaram menores

taxas de crescimento que os animais mantidos com dieta à base de albumina

da clara do ovo (controle) (FIGURA 7). A suplementação das dietas à base de

farinhas das sementes com metionina suscitou em melhor desempenho dos

animais. Mesmo assim as curvas de crescimento ficaram abaixo daquela

apresentada pelo controle positivo. O desempenho inferior dos animais

submetidos às dietas contendo farinha dos genótipos, suplementada ou não,

em relação à dieta contendo albumina da clara do ovo, pode ser visualizado

melhor através dos dados de percentual de ganho de peso (TABELA 5). Ao se

relacionar farinha do genótipo suscetível com resistente, o tratamento

correspondente à dieta contendo farinha do genótipo resistente foi o que mais

se aproximou do controle positivo, especialmente quando considerada a

suplementação com metionina. Esse fato está, possivelmente, relacionado ao

maior consumo de dieta e, conseqüentemente, melhor utilização dos nutrientes

(FIGURA 8). Nos estudos realizados por Maia (2003) e Oliveira et al. (2003),

animais alimentados com farinhas de sementes de feijão caupi apresentaram

taxas de crescimento inferiores àqueles mantidos com dietas à base de

albumina da clara do ovo, mesmo quando as farinhas dos genótipos foram

suplementadas com metionina.

As relações entre eliminação fecal e consumo de dieta (F/D x 100) e

entre nitrogênio fecal e nitrogênio ingerido (FN/N x 100) mostraram diferenças

significativas (p < 0,05) em comparação ao controle (TABELA 6). Isso,

provavelmente, tem ligação com a menor digestibilidade das proteínas e/ou

presença de fatores antinutricionais. Quando comparados os dois genótipos de

feijão caupi em estudo, as razões F/D e FN/N praticamente não diferiram entre

os tratamentos, exceto no grupo mantido com a dieta contendo farinha do

genótipo resistente suplementada com metionina. Nesse último caso, valores

ligeiramente menores, porém significativos (p < 0,05), foram observados,

demonstrando uma maior retenção de nitrogênio.

Outros parâmetros nutricionais foram avaliados no presente trabalho

(TABELA 7). Para confirmar a biodisponibilidade dos aminoácidos constituintes


132

das proteínas foi avaliada a digestibilidade verdadeira in vivo que, por sua vez,

poderia ter sido prejudicada pela presença de fatores antinutricionais e/ou

estrutura compacta das proteínas (CARBONARO et al., 2000). As farinhas dos

genótipos apresentaram valores de digestibilidade baixos (67,40 a 70,23%), em

relação ao grupo controle (98,04%). Quando a qualidade das proteínas das

farinhas dos dois genótipos foi avaliada pelo parâmetro NPU (utilização líquida

de proteína), os valores detectados (39,70% e 39,78%) foram aquém daquele

encontrado para o grupo submetido à dieta contendo albumina da clara do ovo

(87,36%). Em relação ao valor biológico, o mesmo quadro foi detectado, isto é,

uma qualidade nutricional inferior das dietas compreendendo as farinhas dos

genótipos de caupi em relação à albumina da clara do ovo (83,91%). Quando

comparados os genótipos suscetível e resistente entre si, diferenças

significativas (p > 0,05) não foram encontradas nos cálculos de digestibilidade,

NPU e valor biológico. A inclusão de metionina causou aumento nos três

parâmetros analisados, porém não foi suficiente para tornar a diferença

significativa (p > 0,05). Os valores encontrados são próximos aos obtidos em

outros trabalhos, em experimentos semelhantes utilizando farinha de sementes

de genótipos de feijão caupi como fonte de proteínas. Grant e colaboradores

(1995) e Friedman (1996), por exemplo, encontraram percentuais de NPU

equivalentes a 38,0 e 45,0, respectivamente. Por outro lado, ainda que valores

detectados para o feijão caupi sejam inferiores aos da albumina da clara do

ovo, os dados evidenciam sua qualidade nutricional, justificando a importância

nutricional, particularmente quando comparado a outras leguminosas.

Canavalia maritima é um dos exemplos (SEENA et al., 2005). Um outro

exemplo é a Cratylia floribunda que apresentou, inclusive, valores negativos

para alguns dos parâmetros citados (RIOS, 1998).

O consumo das dietas experimentais induziu alterações no peso de

órgãos internos dos animais. Os animais que receberam a dieta aprotéica

apresentaram maior peso relativo de alguns órgãos, como pulmões e coração,

provavelmente, em uma tentativa de preservação desses órgãos (TABELA 9).

O consumo das dietas contendo os genótipos de feijão caupi resultou em

hipertrofia do pâncreas e intestino grosso (TABELA 8). Essas alterações,


133

entretanto, não estão relacionadas aos fatores ligados à resistência dos

genótipos, já que suscetível e resistente apresentaram resultados similares. A

hipertrofia do pâncreas, em particular, deve estar ligada à presença de inibidor

de tripsina, como tem mostrado vários experimentos com foco na avaliação do

valor nutricional de leguminosas (GRANT, 1999; OLIVEIRA et al., 2003). No

caso da soja, é sabido que a aglutinina (SBA) causa, também, hipertrofia do

pâncreas e intestino delgado de ratos, e que o inibidor de tripsina é o principal

responsável pela hipertrofia do pâncreas (VASCONCELOS et al., 2001). Se o

inibidor de tripsina é, de fato, o responsável pela hipertrofia pancreática, os

resultados obtidos nesta pesquisa mostram que mesmo o genótipo suscetível

possuindo menor teor dessa proteína em relação ao resistente, esse já foi

suficiente de causar alterações no peso do pâncreas. Além do mais, apesar da

diferença no teor de inibidor de tripsina nos dois genótipos, esta não resultou

em alterações significativas quando comparados os pesos do pâncreas de

animais pertencentes aos tratamentos contendo genótipo suscetível e

resistente.

Os dados obtidos com farinhas dos genótipos suscetível e resistente ao

Callosobruchus maculatus mostram que, embora o feijão caupi não tenha valor

nutricional similar ao da albumina da clara do ovo, uma proteína animal de

referência, essa leguminosa apresenta boa qualidade nutritiva, o que justifica

sua inclusão na dieta. Além disso, em consonância com os objetivos do

presente trabalho, os dados indicam que o melhoramento genético, o qual

conferiu resistência ao Callosobruchus maculatus, não foi capaz de alterar a

qualidade nutricional dessa leguminosa. Ao contrário, para alguns parâmetros

parece ter havido uma melhora, como exemplo o percentual de ganho de peso

que foi mais elevado nos tratamentos contendo o genótipo resistente. Esses

resultados, do ponto de vista econômico e nutricional, podem ser considerados

excelentes, assegurando que o melhoramento genético além de tornar as

sementes mais resistentes ao gorgulho, proporcionando maior disponibilidade

de sementes de caupi, manteve a elevada qualidade nutricional dessa

leguminosa.


134

Visando dar maior sustentabilidade à afirmativa recentemente citada,

isto é, de que o melhoramento genético introduzido além ter conferido maior

resistência ao Callosobruchus maculatus não diminuiu a qualidade nutricional

do caupi, em uma segunda abordagem, no presente trabalho, as proteínas

ligantes à quitina (PLQ) passaram a ser objetos de estudo. A razão para

utilização das PLQ foi decorrente do fato delas compreenderem, também, as

vicilinas e vicilinas variantes, estas últimas relacionadas à resistência

apresentada por alguns genótipos de caupi ao Callosobruchus maculatus

(MACEDO et al., 1993; SALES et al., 1996).

As PLQ foram purificadas de extrato total, obtido a partir da farinha de

sementes dos genótipos suscetível e resistente, através de cromatografia em

coluna de quitina, e foram denominadas de PLQ suscetível e PLQ resistente,

respectivamente (FIGURAS 9 e 10). No procedimento de purificação, foi

verificada uma maior interação de proteínas oriundas do genótipo resistente

com a quitina em comparação ao suscetível. Das 250 mgP aplicadas na coluna

de quitina, ficaram retidas 0,98 mgP e 0,87 mgP, correspondentes as PLQ

resistente e suscetível, respectivamente. Uma das características das vicilinas

é sua capacidade de interagir com quitina, um homopolímero de N-acetil-D-

glucosamina. Entretanto, vicilinas presentes no genótipo resistente, chamadas

de vicilinas variantes, possuem maior afinidade pela quitina do que àquelas do

genótipo suscetível (SALES et al., 1996; 2001). Além disso, nos genótipos de

feijão caupi que são resistentes ao gorgulho é verificada uma associação mais

forte das vicilinas variantes a membranas quitinosas do tubo digestivo do

próprio inseto Callosobruchus maculatus (FIRMINO et al., 1996). As PLQ

possuem massas moleculares relativamente elevadas, predominando bandas

protéicas com massa molecular aparente na região de 60 kDa (FIGURA 11).

Nos genótipos avaliados, as PLQ representam em torno de 1% da

proteína total das sementes. Assim, na avaliação de suas propriedades

antinutricionais e/ou tóxicas, dietas foram formuladas contendo PLQ suscetível

e PLQ resistente na mesma proporção em que estão presentes nas sementes

dos respectivos genótipos. De modo a atingir o percentual protéico mínimo


135

(10%) requerido nas dietas, uma complementação foi feita com albumina da

clara do ovo (TABELA 2), a proteína considerada como referência.

Os animais pertencentes aos tratamentos contendo as PLQ

apresentaram desempenho similar, ou mesmo superior ao do grupo controle,

cuja fonte protéica foi constituída apenas por albumina da clara do ovo

(FIGURA 16). Uma das razões para o bom desempenho, comparado ao

verificado com a farinha de sementes dos genótipos suscetível e resistente,

pode estar relacionada à boa aceitação da dieta (FIGURA 17). A não

interferência das PLQ nesses parâmetros (crescimento e consumo de dieta)

pode ser visualizada de forma mais nítida na análise do percentual de ganho

de peso (TABELA 10). Ao se relacionar o percentual de ganho de peso dos

tratamentos contendo PLQ suscetível (69,11%) e PLQ resistente (75,40%), não

foram encontradas diferenças significativas (p > 0,05). O tratamento contendo

PLQ resistente mostrou, inclusive, valor superior ao do tratamento controle

(64,65%). Em relação ao tratamento contendo PLQ suscetível, diferença

significativa em relação ao controle não foi observada (p > 0,05), muito embora

tenha sido verificada uma tendência para maior ganho de peso no grupo que

continha as PLQ incluídas em sua dieta.

As relações entre eliminação fecal e consumo de dieta (F/D x 100) e

entre nitrogênio fecal e nitrogênio ingerido (FN/N x 100) mostraram diferenças

significativas (p < 0,05) em comparação ao controle (TABELA 11). Na

comparação dos tratamentos contendo PLQ suscetível com PLQ resistente,

diferenças significativas não foram detectadas (p > 0,05). A relação F/D x 100

foi superior nos tratamentos contendo as PLQ em comparação ao controle.

Diferentemente, a relação FN/N x 100 foi inferior nos tratamentos

experimentais (PLQ suscetível e PLQ resistente). Isso demonstra que o

consumo de dietas contendo PLQ resultou em maior retenção de nitrogênio,

justificando o excelente desempenho dos animais.

Corroborando com os dados obtidos, mostrando a inexistência de

propriedades antinutricionais e/ou tóxicas associadas às PLQ, estão os dados

de digestibilidade, NPU e valor biológico (TABELA 12). Os animais submetidos

às dietas contendo PLQ suscetível e PLQ resistente apresentaram valores dos


136

parâmetros citados similares aos do controle. Os valores elevados de

digestibilidade (superior a 98%) e NPU (superior a 84%) justificam o alto valor

biológico das dietas utilizadas, propiciando crescimento dos animais altamente

satisfatório. Resultados semelhantes aos descritos para as PLQ foram

verificados após inclusão de globulinas de feijão caupi em dietas, genótipos

Canapuzinho e TE93 244 23, complementadas com albumina de ovo (MAIA,

2003).

Assim como no primeiro ensaio biológico, vários órgãos internos dos

animais foram analisados (TABELAS 13 e 14). As PLQ, sejam do genótipo

suscetível, sejam do genótipo resistente, não influenciaram no peso dos órgãos

analisados, visto que não foram encontradas diferenças significativas (p > 0,05)

em relação ao tratamento contendo a proteína padrão. Em uma análise mais

minuciosa de órgãos, e considerando que no intestino delgado é onde ocorre a

maior absorção de nutrientes e, ainda que, se trata de um alvo para muitas

proteínas com propriedades deletérias, segmentos do duodeno e jejuno foram

analisados (FIGURAS 18-24). As vilosidades na região do duodeno e jejuno

dos animais expostos às dietas contendo PLQ foram mantidas intactas,

semelhantemente ao verificado no tratamento controle. As criptas não

sofreram, também, alterações. Esses dados confirmam a ausência de

propriedades antinutricionais e/ou tóxicas ligadas às PLQ. Maia (2003) não

encontrou alterações histológicas no intestino de ratos após inclusão de

globulinas de caupi em sua dieta. Similarmente, o intestino delgado e pâncreas

de ratos alimentados com proteínas isoladas de feijão caupi apresentaram

aspectos histológicos normais, quando comparados com ratos mentidos em

dieta à base de caseína (RANGEL et al., 2004).

A resistência apresentada por alguns genótipos de feijão caupi ao

Callosobruchus maculatus envolve uma associação mais forte das vicilinas

variantes a membranas quitinosas do tubo digestivo (FIRMINO et al., 1996).

Assim, se a interação com a quitina for um pré-requisito para ocorrência de

efeitos, o fato das PLQ não terem trazido implicações deletérias aos animais

experimentais já seria, de certa forma, presumível, visto que a quitina é um

polissacarídeo estrutural não presente em mamíferos monogástricos. Todavia,


137

tem sido discutido que na interação com a matriz de quitina, usada para

obtenção das PLQ, há outras ligações além daquelas por afinidade. Tanto isso

ocorre que, algumas vezes, mesmo tendo sido usadas altas concentrações de

N-acetil-D-glucosamina, não houve remoção completa das proteínas retidas,

necessitando de pHs extremos (GIFONI, 2004). Com base nisso e, também,

considerando que para ser feita uma afirmação segura dos efeitos

antinutricionais e/ou tóxicos de uma proteína é requerida a sua administração

de forma pura, as PLQ, livres de outros componentes das sementes, foram

avaliadas.

Ainda que as respostas apresentadas pelos animais que consumiram as

PLQ tivessem sido previstas, foi questionado se a ausência de efeitos não

estaria relacionada à quantidade de PLQ utilizada, apenas 1% da proteína total

da dieta. Assim, ao invés de realizar um novo experimento, incluindo nas dietas

teores mais elevados de PLQ, pois isso demandaria um maior tempo e a

utilização de mais animais, optou-se por fazer uma avaliação do

comportamento dessas proteínas frente às principais enzimas envolvidas na

digestão proteolítica em mamíferos monogástricos. Essa avaliação teve como

base as informações de que a ocorrência de efeitos decorrentes de uma dada

proteína requer a sua resistência, pelo menos, parcial à proteólise

(VASCONCELOS e OLIVEIRA, 2004). Assim, a digestão total das PLQ, caso

houvesse, poderia explicar a ausência de efeitos deletérios relacionados ao

seu consumo.

Primeiramente, as PLQ foram incubadas separadamente com as

enzimas pepsina, tripsina e quimotripsina nos tempos 0,5, 1, 2, 4 e 6 horas.

PLQ suscetível e PLQ resistente quando incubadas com pepsina até 6 horas

mostraram-se bastante resistente à digestão proteolítica, diferentemente do

que ocorreu com a BSA, que foi totalmente digerida nos primeiros 30 minutos

de incubação (FIGURAS 12 e 13). Resistência das globulinas de sementes

secas e maduras de feijão caupi à pepsina, após 4 horas de incubação foi,

também, verificada por (ARAÚJO et al., 2002). Há, inclusive, registros

mostrando que vicilinas de sementes de feijão caupi, resistente e suscetível ao

Callosobruchus maculatus, não foram digeridas pela pepsina, continuando


138

intactas (SALES et al., 1992). Por outro lado, a incubação das PLQ com

tripsina ou quimiotripsina resultou em proteólise. No entanto, a digestão parece

ter sido maior com tripsina. PLQ resistente se mostraram menos sensível à

ação enzimática dessas enzimas do que PLQ suscetível (FIGURAS 12 e 13).

Digestão de globulinas de feijão caupi pela tripsina e quimiotripsina foi

anteriormente relatada. Tripsina foi capaz de clivar globulinas de sementes

maduras e imaturas de feijão caupi, gerando produtos de 30 a 18 kDa, logo

após 5 minutos de digestão. Já a quimiotripsina, mesmo após 4 horas de

incubação, causou digestão mais branda das globulinas (ARAÚJO et al., 2002).

Uma simulação do processo de digestão seqüencial que ocorre nos

animais monogástricos foi realizada, com a finalidade de se ter uma idéia do

comportamento das PLQ no trato digestório desses animais. PLQ suscetível e

PLQ resistente foram completamente digeridas (FIGURAS 14 e 15), sendo a

hidrólise visualizada mais precocemente nas PLQ Suscetível. Esses dados

apontam a alta suscetibilidade das PLQ à proteólise, particularmente pelas

enzimas que atuam em pH alcalino, justificando os resultados obtidos na

avaliação dos efeitos antinutricionais e/ou tóxicos das PLQ, relatados

anteriormente.

Os dados em conjunto obtidos no presente trabalho mostram que,

embora o feijão caupi não tenha qualidade nutricional similar à albumina da

clara do ovo, certamente não é devida à ação das PLQ, que compreendem as

vicilinas, visto que não foram observados efeitos deletérios nos animais

experimentais que pudessem ser associados ao consumo dessas proteínas.

Além disso, embora PLQ resistente, aparentemente, tenham se mostrado mais

resistente à proteólise, do que PLQ suscetível, essas proteínas foram utilizadas

de forma bem similar pelos animais. Com base em alguns parâmetros, o

aproveitamento das PLQ resistente foi, até mesmo, superior, reforçando que o

melhoramento genético não comprometeu a qualidade nutricional do feijão

caupi.

Complementando a comparação dos possíveis efeitos deletérios

oriundos do consumo dos genótipos estudados, os estudos com foco na

alergenicidade mostraram que, por via oral, pode ter havido uma tolerância


139

adquirida pelo animal às proteínas presentes nas farinhas de ambos genótipos,

bem como às PLQ suscetível e PLQ resistente, já que não houve produção de

IgE. Todavia, para que possa ser afirmado que as fontes protéicas em análise

(farinha e PLQ) não são alergênicas, testes adicionais precisam ser realizados,

avaliando seus efeitos por outras vias de imunização. Lectina da Lablab

purpureus, por exemplo, quando administrada aos camundongos pela via

subcutânea gera uma resposta imune mais potente do que pela via oral

(PERREIRA 2000). Frações do látex de Calotropis procera também elicitaram a

síntese de IgE quando imunizadas em camundongos pela via subcutânea, mas

não pela via oral. Isso evidência a indução da tolerância adquirida pelos

camundongos pelas proteínas do látex (RAMOS, 2007). Além da tolerância que

pode ser adquirida pelos organismos imunizados pela via oral, sabe-se que a

resposta imune por essa via é muito difícil, e requer doses elevadas e repetidas

de antígenos. Isso é devido, também, à presença de enzimas proteolíticas no

trato digestório dos animais, além do pH ácido estomacal. Além do mais, a

resposta imunológica quando induzida pela via oral é baixa, de curta duração e,

freqüentemente, confinada às mucosas (VAN DER HEIJDEN et al., 1991;

MELO et al., 1994; MAUREEEN et al., 1986; PEREIRA, 2000).


140

88.. CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS


141

Os dados obtidos no presente trabalho mostram que o melhoramento

genético do feijão-de-corda que, por sua vez, conferiu resistência ao inseto

Callosobruchus maculatus não alterou sua qualidade nutricional, desde que

sementes de genótipos dessa leguminosa, suscetível (BR9 Longá) e resistente

(IT81D 1053) ao gorgulho, quando incluídas na dieta como única fonte de

proteínas, foram igualmente aproveitadas pelos animais. Além disso, foi

observado que, embora o caupi não tenha qualidade nutricional similar à

albumina da clara do ovo, uma proteína de alto valor biológico, certamente isso

não é devido à ação das proteínas ligantes á quitina, compreendendo vicilinas

normais e variantes, visto que não foram observados efeitos antinutricionais,

tóxicos e/ou alergênicos nos animais experimentais que pudessem ser

associados ao consumo dessas proteínas. Do ponto de vista econômico e

nutricional, esses resultados são de grande valia, assegurando que o

melhoramento genético introduzido, além de ter tornado as sementes mais

resistentes a essa praga de grande importância agrícola, manteve a elevada

qualidade nutricional dessa leguminosa.


142

99.. RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS

BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS


143

1. Acesse Piauí. Feijão do Piauí é referência nacional. Disponível em:

http://www.acessepiaui.com.br/geral2.php?id=52012&ref=200605.

2. ADEBOOYE, O. C.. SING, V. Physico-chemical properties of the flours and

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