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AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE COMPOSTOS DE

COORDENAÇÃO DE FERRO

FRANZ VIANA BORGES

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – DARCY R IBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ

AGOSTO – 2008

i

AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE COMPOSTOS DE COORDENAÇÃO DE FERRO

FRANZ VIANA BORGES

Orientador: Prof. Milton Masahiko Kanashiro

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

AGOSTO – 2008

“Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,

como pa rte das exigências para obtenção do título

de Mestre em Biociências e Biotecnologia”.

ii

AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE COMPOSTOS DE COORDENAÇÃO DE FERRO

FRANZ VIANA BORGES

Comissão Examinadora:

Dr. Maurício Afonso Vericimo (Doutor em Biociências e Biotecnologia) - IB/UFF

Dr. Renato Augusto DaMatta (Doutor em Ciências) - LBCT/UENF

Dra. Michelle Frazão Muzitano (Doutora em química de produtos naturais) LBR/UENF

Dr. Milton Masahiko Kanashiro (Doutor em Biociências e Biotecnologia) - LBR/UENF

“Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Nor te Fluminense Darcy Ribeiro,

como parte das exigências para obtenção do título

de Mestre em Biociências e Biotecnologia”.

iii

Este trabalho foi desenvolvido sob orientação do Pr ofessor Milton Masahiko

Kanashiro, no Laboratório de Biologia do Reconhecer do Centro de

Biociências e Biotecnologia; da Universidade Estadu al do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro.

Apoio financeiro:

Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Jane iro (FAPERJ)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy R ibeiro (UENF)

iv

Dedico este trabalho aos meus Pais, Renato e Carol por todo apoio,

dedicação, amor e confiança a mim dispensados.

Aos meus irmãos Marcell e Renata , pelos momentos felizes e descontraídos

ao longo dessa caminhada.

Ao meu “pequeno” grande amor Thaís , pelos bons momentos, pelo carinho,

compreensão e por me dar forças sempre que precisei.

Dedico também a Maria Inês Borges Pinheiro, Ivone Mary Vianna Dresj an

e Benedito Bastos Brasil – In Memorian

v

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar sempre comigo.

À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, pela minha

formação e pelos conhecimentos adquiridos ao longo desse tempo.

Ao Professor Milton Masahiko Kanashiro por contribuir de forma relevante

para minha formação e pela paciência que teve comigo durante esse tempo.

Ao professor Adolfo Horn Jr. e professora Christiane Fernandes e sua equipe,

Josane, Luciana, Vagner, Gabi e Érika, responsáveis pela síntese dos compostos,

sem os quais esse trabalho não seria possível.

Ao Professor Edésio Melo, pela ajuda em alguns experimentos, pelos

conselhos e pela paciência.

Aos companheiros e amigos, Inarei, Thiago, Willian, Layla, Halyka, Alba e

Marcela pelos excelentes momentos de descontração.

Aos técnicos de Laboratório, Rosângela, Jorge, Fernando, Patrícia, Núbia e

Claudinha, sem os quais esse trabalho certamente não seria possível.

Ás técnicas Rita e Juju, verdadeiras professoras, pela ajuda indispensável.

À minha segunda família, Dona Ilda, Cáudia, Cláudio, Lala e Lucas, por me

aceitarem como neto, filho e irmão.

A todos meus familiares que acreditaram em mim, em especial à minha avó

Norma, pela preocupação e amor materno dedicados a mim todo esse tempo.

Por fim àqueles que contribuíram para realização desse trabalho e a todos,

que de certa forma me ajudaram, contribuindo com minha formação acadêmica e

profissional.

vi

Índice

Lista de Figuras.........................................................................................................VIII

Lista de Tabelas...........................................................................................................X

Lista de Pranchas.......................................................................................................XI

Lista de Abreviaturas.................................................................................................XII

Resumo....................................................................................................................XIV

Abstract.....................................................................................................................XVI

1 – Introdução...............................................................................................................1

1.1 – Câncer: Aspectos gerais..........................................................................2

1.2 – Quimioterapia antitumoral…...…..……………...…………………………....6

1.2.1 – Quimioterápicos antineoplásicos.….....……………….......................8

1.2.2 – Resistência à cisplatina..…....………………………………………..13

1.3 – Compostos de coordenação e nucleases sintéticas...............................16

1.4 – Apoptose............................................................................ ……………..19

1.4.1 – Apoptose, câncer e quimioterapia….…......…………………………22

2 – Justificativa ..……….…….….….…….....…………………………………………….24

3 – Objetivos.........….……….…..……..…....……………………………………………..25

3.1 – Objetivo Geral…......….…........……………………………………………..25

3.2 – Objetivos específicos.……..….……………………………………………..25

4 – Materiais e métodos.…..………...…..…………...………....………………………..26

4.1 – Compostos de coordenação.....….…......…………………........…………26

4.2 – Animais utilizadados………..….….…..……...…………..….…..………....28

4.3 – Cultura das linhagens de células de origem tumoral…............…..…….28

4.4 – Avaliação da atividade biológica dos compostos de coordenação frente

às células tumorais em cultura…….…….…...............................................................28

4.5 – Avaliação dos efeitos citotóxico e citostático dos compostos de

coordenação frente às células tumorais.....................................................................29

4.6 – Avaliação da apoptose por microscopia de fluorescência......................29

4.7 – Avaliação da apoptose pela fragmentação do DNA em gel de

agarose......................................................................................................................31

vii

4.8 – Avaliação da toxicidade dos compostos in vitro.....................................31

4.8.1 – Obtenção de Células Mononucleares do Sangue Periférico

(PBMC)......................................................................................................................31

4.8.2 – Avaliação da toxicidade dos compostos frente às Células

Mononucleares do Sangue Periférico........................................................................32

4.9 – Análise da ultra estrutura das células tumorais tratadas com os

compostos por Microscopia Eletrônica de Transmissão (M.E.T.)..............................33

4.10 – Análise da funcionalidade mitocondrial por Microscopia Confocal.......34

4.11 – Determinação da toxicidade dos compostos in vivo.............................35

4.12 – Análise estatística…………………………………………………………..35

5 – Resultados………………………………………………………………………………36

5.1 – Avaliação do efeito dos compostos na viabilidade celular......................36

5.2 – Avaliação da indução de apoptose em células tumorais mediada pelos

compostos…...............................................................................................................41

5.2.1 – Avaliação da indução de apoptose mediada pelos sais dos

compostos..................................................................................................................48

5.3 – Cálculo de dose efetiva 50% dos compostos (IC50)...............................51

5.4 – Avaliação de apoptose por fragmentação de DNA em gel de agarose..52

5.5 - Avaliação da atividade mitocôndrial através de Microscopia Confocal

(M.C.)..........................................................................................................................53

5.6 - Análise da ultra-estrutura celular por Microscopia Eletrônica de

Transmissão (M.E.T.).................................................................................................57

5.7 - Determinação da toxicidade dos compostos in vivo (DL50)....................60

6 – Discussão.............................................................................................................62

7 – Conclusões...........................................................................................................69

8 – Referências Bibliográficas....................................................................................70

viii

Lista de Figuras

Figura 1: Estimativa mundial de mortes por câncer para 2020....................................2 Figura 2: Estimativa das principais causas de morte mundial para 2030....................3 . Figura 3: Capacidades adquirias pelas células tumorais.............................................5 Figura 4 – Estruturas de alguns antimetabólitos usados no tratamento de

neoplasias..................................................................................................................10

Figura 5 – Estruturas de mostardas nitrogenadas usadas como quimioterápicos.....11 Figura 6 – Estruturas de nitrossuréias usadas como quimioterápicos.......................11 Figura 7: Mecanismo de ação da cisplatina...............................................................12 Figura 8: Mecanismos de resistência à cisplatina......................................................14 Figura 9: Vias de ativação e mecanismos centrais da apoptose...............................22

Figura 10: Esquema de síntese e estrutura dos compostos de coordenação estudados...................................................................................................................28 Figura 11: Microscopia de Fluorescência de células U937........................................31

Figura 12: Efeito citotóxico dos compostos (1), (2) e (3) frente às células leucêmicas

humanas U937, THP-1 e HL-60 após 72 horas de incubação...................................38

Figura 13: Efeito citotóxico dos compostos (1), (2) e (3) frente às células leucêmicas

humanas MOLT-4 e JURKAT após 72 horas de incubação......................................39

ix

Figura 14: Efeito citotóxico dos compostos (1), (2) e (3) frente às células humanas

normais (PBMC) após 72 horas de incubação...........................................................41

Figura 15: Porcentagem de apoptose induzida pelo composto (1) em cinco células

leucêmicas humanas determinada por microscopia de fluorescência ......................44





Figura 18: Porcentagem de apoptose induzida pelo composto (1), (2) e (3) em

células mononucleares do sangue periférico de um individuo normal (PBMC),

determinada por microscopia de fluorescência..........................................................48

Figura 19: Porcentagem de apoptose induzida pelo sal FeCl3, que faz parte da

síntese dos 3 compostos, em cinco células leucêmicas e em células normais

(PBMC) humanas determinada por microscopia de fluorescência...........................50

Figura 20: Porcentagem de apoptose induzida pelo sal FeSO4, que faz parte da

síntese apenas do composto (3), em cinco células leucêmicas e em células normais

(PBMC) humanas determinada por microscopia de fluorescência............................51

Figura 21: Eletroforese em gel de agarose para detecção de fragmentação do DNA

de células U937 tratadas com 100 e 200µM dos compostos (1), (2) e (3) durante 24

horas...........................................................................................................................54

x

Figura 22: Eletroforese em gel de agarose para detecção de fragmentação do DNA

de células THP-1 tratadas com 100 e 200µM dos compostos (1), (2) e (3) durante 24

horas...........................................................................................................................54

Figura 23: Ensaio de toxicidade in vivo dos compostos de coordenação 2 e 3.........63

xi

Lista de Tabelas

Tabela 1: Estimativas, para o ano 2008, de número de casos novos por câncer, em

homens e mulheres, segundo localização primária.....................................................1

Tabela 2: Dose efetiva 50% dos compostos de ferro 1, 2 e 3....................................52

xii

Lista de Pranchas

Prancha 1: Microscopia Confocal de células U937 analisadas após 36 horas, grupo

controle.......................................................................................................................56

Prancha 2: Microscopia Confocal de células U937 incubadas durante 12, 24 ou 36

horas com os compostos 1, 2 e 3...............................................................................57

Prancha 3: Efeito do tratamento com composto 1 na morfologia ultra-estrutural de

células U937 por visualizado microscopia eletrônica de transmissão........................60

Prancha 4: Efeito do tratamento com os compostos 2 e 3 na morfologia ultra-

estrutural de células U937 visualizado por microscopia eletrônica de transmissão...61

xiii

Lista de Abreviaturas Bcl-2 – B cell lymphoma 2

cis-[Pt(NH3)2Cl2] – Cisplatina

Cis-DDP – cis-diamminedichloridoplatinum (II)

DD – Death Domain

DISC – Death inducing signaling complex

DL50 – Dose Letal para 50% de um grupo de animais

DMEM – Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

D.O – Densidade Óptica

FADD – Fas-Associated Death Domain

G2 – Grow 2

GA – Glutaraldeído

HPClNOL – N,N-bis-(piridil-(2-il-metil)[(3-cloro)(2-hidroxi)]propilamina)

HTP – Hematoporfirínicos

IC50 – Concentração necessária para 50% de inibição

IAP – Inhibitor of Apoptosis Protein

INCA – Instituto Nacional do Câncer

KDa – Quilo Dalton

MET – Microscopia eletrônica de Transmissão

MDR – Multiple-drug resistance

MMR – Mismatch repair

MTT – [3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]

OMI/HtrA2 – Serino protease mitocondrial que ajuda na ativação da apoptose

OMS – Organização Mundial de Saúde

PA – Paraformaldeído

PBMC – Células Mononucleares do Sangue Periférico

PBS – Tampão Salina Fosfato

RNA – Ácido Ribonucléico

RR – Recombinação Homóloga

SEB – Enterotoxina B Estafilocócica

SMAC/DIABLO – proteína mitocôndrial que ajuda na ativação da apoptose

xiv

TLS – Síntese de Translesão

TNF – Fator de Necrose Tumoral

TRAIL – TNF-related apoptosis-inducing ligand

XIAP – X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein

xv

RESUMO

As neoplasias são hoje a terceira maior causa de morte no Brasil, e estima-se que

em meados do século 21 o câncer já atinja o primeiro lugar em número de mortes

em nosso país. Atualmente o câncer é responsável por aproximadamente sete

milhões (12,5%) de mortes por ano em todo o mundo, apesar de diferentes terapias

existentes. Neste trabalho foi estudada a ação antitumoral de três compostos de

coordenação de ferro frente a cinco linhagens celulares de origem leucêmica

humanas (U937, THP-1, HL-60, JURKAT e MOLT-4), bem como o efeito tóxico dos

compostos frente a células normais humanas (PBMC) e a determinação da DL50

para camundongos suíço-albino. O ensaio com MTT [3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide] demonstrou que todos os compostos foram capazes de

inibir o crescimento das células tumorais mesmo na menor concentração testada

(50µM). A análise por microscopia de fluorescência mostrou que os compostos

foram capazes de induzir apoptose nas linhagens celulares testadas de maneira

tempo e dose dependentes, sendo que a linhagem THP-1 mostrou maior resistência

aos compostos (2) e (3) e a linhagem HL-60 ao composto (3). A apoptose induzida

pelos compostos foi confirmada pelo ensaio de fragmentação de DNA em gel de

agarose. A análise por microscopia confocal das células tratadas com os compostos

e incubadas com rhodamina 123, demonstrou que havia um comprometimento

mitocondrial nas células testadas. Essa alteração foi confirmada nas amostras

analisadas por microscopia eletrônica de transmissão, quando foi também

observado o envolvimento do reticulo endoplasmático no processo. Os compostos

foram tóxicos às células normais humanas (PBMC), porém em grau menor do que

para células tumorais, exceto para o composto (2), que se mostrou mais tóxico para

células normais. Os compostos (1) e (2) mostraram toxicidade similar ao do

composto cisplatina frente a células normais humanas in vitro, enquanto que o

composto (3) foi menos tóxico para células normais quando comparado a cisplatina.

A DL50 dos compostos (2) e (3) foram, respectivamente, 108,5 mg kg-1 e 147,2 mg

kg-1, possuindo toxicidade inferior que a do composto cisplatina descrita na literatura

(50,0 mg kg-1). Esses resultados mostram que os compostos de coordenação

testados inibem o crescimento de células tumorais in vitro por induzir morte celular

xvi

por apoptose e sugerem que a via apoptótica mitocondrial está envolvida neste

processo.

Palavras-chave: Cisplatina, Compostos de coordenação, câncer, apoptose.

xvii

ABSTRACT

Neoplasias are the third leading cause of death in Brazil and death by cancer is

estimated to reach the most important death cause in Brazil at the middle of this

century. Nowadays cancer causes nearly 7 million deaths every year (12.5%)

worldwide, although several cancer therapies are available. In this work we studied

the antitumoral activity of three iron coordinated compounds against five human

leukemia cell lines (U937, THP-1, HL-60, JURKAT e MOLT-4), as well as the toxic

effect of the complexes in human normal cells (PBMC) and DL50 complexes values in

Swiss albino mice. The MTT assay [3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide] showed that all complexes were able to inhibit tumoral

cell growing, even in the lowest concentration (50µM). Fluorescence microscopy

analysis showed that all complexes were able to induce apoptosis in all cell lines

tested in a time- and dose-dependent manner. However, THP-1 cell line was less

responsive to the complexes (2) and (3) and HL-60 cell line to the complex (3). The

apoptosis mediated by the complexes was confirmed by DNA ladder fragmentation

assay in agarose gel. Analysis with confocal laser scanning microscopy of cells

treated with the complexes and incubated with rhodamine 123 suggests a

mitochondrial commitment in these cells. This change was confirmed in the samples

analyzed by transmission electron microscopy, where we observed the involvement

of the endoplasmatic reticulum in the process. All complexes were toxic to the human

normal cells (PBMC); however they were more toxic to tumor cells, except for

complex (2) that was more toxic to normal cells. Complexes (1) and (2) showed

similar toxicity to the cisplatina in human normal cells in vitro, while complex (3) was

less toxic to normal cells than cisplatina. DL50 value of complexes (2) e (3) was,

respectively, 108,5 mg kg-1 and 147,2 mg kg-1, showing less toxicity than cisplatina

complex described in the literature (50 mg kg-1). In summary, we found that these

iron coordinated compounds inhibit cancer cell growth by inducing apoptosis cell

death in vitro and support the hypothesis that mitochondrial apoptotic pathway is

involved in this process.

Key words: Cisplatin, Coordinated compounds, cancer, apoptosis.

Borges F. V. Introdução

1

1 – Introdução

1.1 – Câncer: Aspectos gerais

Entende-se por câncer o conjunto de doenças que tem por característica o

crescimento desordenado e difuso de células anormais, causado por diversos

fatores, sejam eles externos (químicos, tabaco, radiações e infecções por

organismos) ou internos (mutações herdadas ou que podem ocorrer durante o

metabolismo, hormônios e condições imunológicas). Fatores como esses podem

atuar juntos ou em seqüência, promovendo assim, o início da carcinogênese (Cotran

et al., 2000).

O câncer é hoje considerado um dos principais problemas mundiais de saúde

e uma das mais importantes causas de enfermidade e morte em crianças e adultos.

Para o ano de 2008, segundo estimativas do Instituto Nacional do Câncer (INCA),

466.730 novos casos da doença serão registrados só no Brasil (Tab. 1). As maiores

incidências ficam por conta do câncer de próstata em homens e de mama em

mulheres (Inca, 2008).

Fonte: MS/Instituto Nacional de Câncer

Tabela 1 - Estimativas, para o ano 2008, de número de casos novos por câncer, em

homens e mulheres, segundo localização primária.


2

Considerando as estimativas mundiais os números não são menos

alarmantes. O câncer é responsável por 12,5% das mortes, uma porcentagem maior

que as estimadas para AIDS, tuberculose e malária juntas. Em 2005, a Organização

Mundial de Saúde contabilizou 53 milhões de mortes no mundo, das quais 7,6

milhões foram causadas por câncer (13%). Em 2007, segundo a OMS foram 11

milhões de novos casos (excluindo câncer de pele) e 7 milhões de mortes Em uma

projeção feita pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para 2020, o câncer

poderá levar ao óbito 10,3 milhões de pessoas no mundo (Figura 1).

Figura 1 – Estimativa mundial de mortes por câncer para 2020. Fonte: OMS (2005).


3

Em 2030, as estimativas apontam o câncer como a principal causa de morte

mundial, conforme mostrado na figura 2.

Projeção de Mortes Mundiais por causa, 2002-2030

Ano

Projeção de Mortes Mundiais (Milhões) Câncers

Isquemia

Doenças Cardiacas

TuberculoseMalária

HIV/AIDS

Out ras doenças Infecciosas

Acidentes de trâns ito

Derrame

Figura 2 – Estimativa das principais causas de morte mundial para 2030. Fonte: OMS

(2007).

Os diversos tipos de cânceres são classificados de acordo com o tecido e tipo

de célula dos quais se originam. Cânceres originados de células epiteliais são

denominados carcinomas; aqueles originados a partir de tecidos conjuntivos ou

células musculares são denominados sarcomas. Cânceres que não se encaixam em

nenhuma dessas categorias incluem os vários tipos de leucemia, derivados de

células hematopoiéticas, e cânceres derivados de células do sistema nervoso.

Aproximadamente 90% dos cânceres humanos são carcinomas, talvez porque a

maioria das células em proliferação no corpo se encontram no epitélio, ou porque os

tecidos epiteliais são mais expostos a várias formas de danos físicos e químicos que

favorecem o desenvolvimento do câncer (Alberts, et al., 2002).

As causas que podem levar ao desenvolvimento do câncer são variadas.

Fatores ambientais e o modo de vida, associados à constituição genética do

indivíduo são responsáveis por governar o desenvolvimento do câncer de uma forma

geral (Alberts, et al., 2002).


4

Após muitos avanços, as pesquisas sobre câncer geraram um rico e

complexo corpo de conhecimento, revelando ser o câncer uma doença que envolve

mudanças dramáticas no genoma de uma célula ao longo de sua vida. Tais

mudanças passaram a ser elucidadas após a descoberta de mutações que

produzem oncogenes com ganho de função e genes supressores tumorais com

perda recessiva de função. Ambas as classes de genes foram identificadas em

células humanas e animais, através de alterações em suas funções e pela produção

do fenótipo cancerígeno em modelos experimentais (Bishop & Weinberg, 1996).

Várias linhas de evidência indicam que a tumorigênese é um processo que

ocorre em várias etapas e que essas etapas refletem alterações genéticas que

dirigem uma progressiva transformação de células normais em células altamente

malignas (Hanahan & Weinberg, 2000). Essa transformação pode ser evidenciada

em células em cultura, onde células de roedores requerem pelo menos a introdução

de duas mudanças genéticas até que elas adquiram a competência tumorigênica,

enquanto células humanas são mais difíceis de transformar (Hahn et al., 1999).

Acredita-se que o vasto genótipo de células tumorais seja resultado da

manifestação de seis alterações essenciais na fisiologia celular, que coletivamente

ditam o crescimento de células malignas: auto suficiência em fatores de crescimento,

insensibilidade a fatores inibidores de crescimento, evasão do programa de morte

celular (apoptose), potencial de replicação ilimitado, angiogênese sustentada e

invasão tecidual e metástase (fig. 3) (Hanahan & Weinberg, 2000).


5

Figura 3 – Capacidades adquirias pelas células tumorais. É sugerido que a maioria senão

todos os tipos de câncer adquirem o mesmo grupo de capacidades funcionais durante seu

desenvolvimento, embora através de várias estratégias diferentes (Hanahan & Weinberg,

2000).

Observações de cânceres em humanos e em modelos animais apontam que

o desenvolvimento tumoral acontece via um processo formalmente análogo à

evolução Darwiniana, no qual uma sucessão de mudanças genéticas, cada uma

conferindo vantagens para o crescimento celular, leva à progressiva conversão de

células normais em células cancerígenas, quebrando assim a harmonia tecidual e

levando a sociedade celular ao colapso através de um processo microevolucionário

(Nowell, 1976).

Essa forma peculiar de ação faz do câncer um conjunto de doenças de difícil

combate. O sistema imunológico muitas vezes não reconhece as células tumorais

como sendo uma perigosa ameaça que deve ser eliminada, pois essas células,

mesmo transformadas, ainda possuem um fenótipo muito similar aos das células

normais. Dessa forma, as células tumorais acabam por induzir tolerância

imunológica através de diversos mecanismos (Mapara & Sykes, 2004), o que

Angiogênese sustentada Invasão tecidual e metástase

Pontencial replicativo ilimitado

Evasão da apoptoseInsensibilidade a sinais anti-crescimento

Auto suficiência em fatores de crescimento


6

impede o sistema imunológico de produzir uma resposta imune eficaz contra o

tumor, permitindo assim, que a massa de células transformadas cresça sem nenhum

controle imunológico efetivo (Mapara & Sykes, 2004).

1.2 – Quimioterapia antitumoral

Existem três tipos principais de tratamento para o câncer: cirurgia,

radioterapia e quimioterapia (Murad & Katz, 2000). Outros métodos, também

utilizados hoje em dia, é o de fotorradiação com derivados hematoporfirínicos (HTP)

(Machado, 2000) e a imunoterapia (Salmonm, 1998). O objetivo de cada um destes

tratamentos é erradicar o câncer, normalmente por meio da terapia combinada, onde

é associado mais do que um tipo de tratamento. Apenas com os métodos de

tratamento citados, um terço dos pacientes alcança a cura total através de medidas

locais (cirurgia ou radioterapia), que são eficazes quando o tumor ainda não sofreu

metástase por ocasião do tratamento. Todavia, na maioria dos casos, a neoplasia

caracteriza-se pelo desenvolvimento precoce de micrometástases, indicando a

necessidade de uma abordagem sistêmica, que pode ser efetuada, em cerca de 60-

70% dos casos com a quimioterapia (Chabner & Longo, 1996; Spence & Jonhston.

2001)

A quimioterapia contra o câncer ou antineoplásica refere-se à administração

de drogas citotóxicas, capazes de promover morte celular ou pelo menos inibir o

crescimento celular. O tratamento quimioterápico tem como objetivo, erradicar o

tumor ou reduzir seu crescimento, diminuindo dessa forma os sintomas relacionados

ao câncer, promovendo a cura ou prolongando a vida do paciente (Nygren, 2001).

A quimioterapia para o tratamento do câncer foi introduzida na medicina há

cinqüenta anos atrás. Na verdade, o tratamento do câncer com agentes químicos

teve inicio a várias centenas de anos, porém foi só no início da década 1940 que o

primeiro uso da quimioterapia sistêmica foi documentada com sucesso. Baseado na

experiência da guerra sobre os efeitos do gás mostarda no sistema linfático, esse

agente foi utilizado para o tratamento de um paciente com linfoma. Embora o tumor

tenha rapidamente crescido após um efeito antitumoral inicial, essa experiência

marcou o inicio da quimioterapia a tumores malignos (Gilman, 1963; Kidwai et al.,


7

2002). O avanço no conhecimento sobre a bioquímica do metabolismo celular levou

ao desenvolvimento de antimetabólicos durante as décadas seguintes, como

metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina e 5-fluorouracil. Nos anos 60

e 70 surgiram os agentes naturais como os antibióticos actinomicina D e

doxorubicina e substâncias puras extraídas de extratos vegetais, como os alcalóides

de vinca (Pratt & Ruddon, 1979).

O grande avanço da quimioterapia moderna aconteceu após a introdução da

cisplatina durante a década de 70, o que mudou consideravelmente a perspectiva

para pacientes com câncer testicular, sendo mais tarde também usada no

tratamento de outros tumores sólidos (O’Dwyer et al. 1997).

Durante as décadas seguintes, alguns novos fármacos contribuíram

substancialmente como opções para o tratamento do câncer foram introduzidos,

entre elas a taxol, com alta atividade contra o câncer de mama, e os inibidores de

topoisomerase I, como o Irinotecano. Além disso, os antimetabólicos fludarabina e

cladribina têm estendido o leque de opções para o tratamento de alguns tipos de

linfoma (Nygren, 2001).

Uma grande limitação da quimioterapia no tratamento do câncer são seus

freqüentes efeitos colaterais. Embora os fármacos com ação antitumoral sejam

produzidos especificamente contra células cancerígenas, células hematopoiéticas e

células epiteliais intestinais normais, e os queratinócitos da matriz capilar são

freqüentemente suscetíveis aos efeitos tóxicos desses agentes, o que explica a

maior parte dos efeitos colaterais da quimioterapia: náuseas, perda de cabelo e

susceptibilidade maior às infecções (Almeida et al, 2005). Porém, o corpo recupera-

se destes inconvenientes após o tratamento, e o uso clínico desses fármacos exige

que os benefícios sejam confrontados com a toxicidade, na procura de um índice

terapêutico favorável (Foye & Sangupta, 1996).

Parece que a toxicidade dos fármacos é devido, em parte, a apoptose induzida

pela proteína p53, já que camundongos nocautes para p53 tratados com drogas

quimioterapêuticas ou radioterapia não sofrem o mesmo grau de agressão nos

tecidos suscetíveis, e sobreviveram a doses que são letais para camundongos wild-

type (Kormarova & Gudkov, 2000). Isso aparentemente resulta de uma perturbação

na via intrínseca apoptótica, já que a expressão ectópica de Bcl-2 em células da


8

medula óssea alcança efeitos similares (Dome et. al, 1998). Existe uma correlação

direta entre a ativação de p53 e os sítios de toxicidade em tecidos normais. Esses

estudos destacam as razões fundamentais da falta geral de sucesso em desenvolver

fármacos que podem matar células de maneira específica usando uma abordagem

empírica. Por um lado, p53 potencializa a ação da maioria das drogas, mas é

inativada na maioria dos tumores, por outro, a via intacta de p53 em células normais

contribui para sua própria destruição. Uma abordagem combinada utilizando um

bloqueador de p53 com uma droga anticancerígena poderia eliminar a toxicidade

enquanto mantém o efeito antitumoral (Johnstone et al., 2002).

Outra importante limitação da quimioterapia é a resistência específica de

alguns tumores a determinados medicamentos aliada ao problema da resistência a

múltiplas drogas (MDR), os quais têm sido apontados como uma das principais

causas de falha terapêutica e de mortes (Fernandes et al, 2005).

1.2.1 – Quimioterápicos antineoplásicos

A importância clínica dos agentes antineoplásicos induz a necessidade de

estudo sistemático, o que primeiramente deveria ser feito com o uso de

classificações químicas, levando-se em conta os diferentes grupos funcionais

presentes na estrutura das moléculas desses agentes. Contudo, a variedade de

tipos de compostos utilizados em quimioterapia oncológica é tão grande, que tal

classificação só pode ser feita indiretamente. Calabresi e Chabner em 1995

descreveram uma classificação conveniente dos fármacos antineoplásicos onde o

critério classificatório baseia-se no ponto de interferência no mecanismo de ação das

diferentes etapas da síntese do DNA, transcrição e tradução. Entretanto, os autores

consideram esta classificação arbitrária pois, por exemplo, os agentes hormonais,

entre outros, não são classificáveis desta forma.

Os agentes antineoplásicos mais antigos e mais usados são conhecidos

como agentes alquilantes que, comprovadamente, interagem quimicamente com o

DNA e não são ativos somente no processo de divisão celular. De fato, na

quimioterapia são descritos muitos alvos que podem ser estudados com o intuito de

se estabelecer novos fármacos antitumorais, sendo que o DNA apresenta-se como


9

um dos alvos mais estudados (Keskin et al, 2000). As moléculas com potencial

atividade antitumoral mais estudadas interagem de alguma forma com o DNA. Com

isso é possível fazer uma subclassificação dos antitumorais em relação ao

mecanismo de ação no DNA (Lehninger, 2000):

• inibição da síntese de nucleotídeos: através do uso dos análogos das bases

nitrogenadas (Agentes antimetabólicos);

• efeito direto no DNA: são os agentes alquilantes como as mostardas nitrogenadas,

nitrossuréias, complexos tipo cisplatina e outros. A bleomicina forma radicais livres

que destroem o DNA, pois fragmenta as hélices, mecanismo diferente dos outros

fármacos mostrados;

• ligantes que interagem na fenda menor do DNA: berenil, pentamidina e análogos;

• alteração das propriedades de pareamento de bases: intercalantes como a

proflavina, acridina, amsacrina;

• inibição da DNA-girase: doxorrubicina.

Alguns dos principais compostos que interagem de certa forma com o DNA

são: Agentes antimetabólicos, mostardas nitrogenadas, nitrossuréias, e os

complexos de platina.

Agentes antimetabólicos

O desenvolvimento de quimioterápicos com ações sobre o metabolismo

intermediário das células em proliferação é importante do ponto de vista clínico, pois

estes agentes são muito estudados e clinicamente empregados. Embora não se

tenha ainda descoberto qualquer propriedade bioquímica peculiar compartilhada por

todas as células cancerosas, sabe-se que essas células possuem várias diferenças

metabólicas quantitativas em comparação com as células normais, tornando-as mais

suscetíveis aos diversos antimetabólicos ou análogos estruturais das bases

nitrogenadas (Oliveira & Alves, 2002). Os agentes antimetabólicos exercem seus

efeitos principalmente por bloquearem bioquimicamente a síntese do DNA e,

portanto, são restritos à fase S do ciclo celular (Oliveira & Alves, 2002). Pode-se

citar alguns exemplos de antimetabólicos utilizados clinicamente no tratamento do

câncer, por meio das seguintes subclasses: Análogo do ácido fólico: Metotrexato

(MXT); Antagonistas das pirimidinas: Fluorouracil (5-Fluoroouracil; 5-FU), Floxuridina


10

(5-Fluorodesoxiuridina; FUDR) e Citarabina (citosina arabinosídeo, ara-C); análogos

das purinas: Mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP); tioguanina (6-

tioguanina;TG); Pentostatina (2’-desoxicoformicina); Fosfato de fludarabina (mono

fosfato de 2-fluoro-arabinofuranosiladenina; Cladribina (2-clorodesoxiadenosina)

(fig.4).

Figura 4 – Estruturas de alguns antimetabólicos usados no tratamento de neoplasias Mostardas nitrogenadas

Como dito anteriormente os agentes alquilantes são antineoplásicos pioneiros

pois, em 1942, o agente alquilante tipo mostarda nitrogenada, meclorometamina, foi

utilizado com sucesso para induzir remissão tumoral transitória em um paciente

portador de linfoma; esse acontecimento marcou o início da era moderna de

quimioterapia do câncer (Kidwai et al., 2002). Os agentes alquilantes são, também,

os antineoplásicos mais estudados e considerados os antitumorais mais usados na

atualidade. Eles são capazes de formar ligações interfilamentares com o DNA e

necessitam ser metabolizados pelas fosfamidases (enzimas microssomais


11

hepáticas), para que seus metabólitos possam exercer o efeito alquilante celular.

Dentro dessa classe têm-se os fármacos Mecloretamina (Mustargen®) e Clorambucil

(Leukeran®), além da ciclofosfamida (Cytoxan®), a Isofosfamida® e o melfalano

(Alkeran®), (fig.5) (Salmonm, 1998).

Figura 5 – Estruturas de mostardas nitrogenadas usadas como quimioterápicos.

Nitrossuréias

São agentes antitumorais que precisam ser biotransformados nos seus

derivados alquilantes por decomposição não enzimática (Salmonm, 1998). Formam

diferentes adutos de alquilação com o DNA, porém a formação da ligação cruzada

interfilamentar entre a posição N1 da deoxiguanosina e N3 da deoxicitosina é a

responsável pela atividade citotóxica. Também alquilam o RNA e inibem a auto-

reparação do DNA (Oliveira & Alves, 2002). As nitrossuréias utilizadas clinicamente

são a Carmustina (BCNU), Lomustina (CCNU) e Semustina (metil-CCNU) (fig.6).

Estes agentes antineoplásicos são altamente lipossolúveis, tornando-os úteis no

tratamento de tumores cerebrais (Salmonm, 1998).

Figura 6 – Estruturas de nitrossuréias usadas como antitumorais


12

Cisplatina

Os compostos de platina representam a mais importante classe de agentes

antitumorais, e o desenvolvimento clínico do complexo de coordenação cis-

diaminodicloroplatina (II), comumente conhecido como cisplatina ou cis-DDP,

marcou os anos setenta como uma nova era no tratamento do câncer (Gonzalez et

al., 2001). A Cisplatina e outros compostos relacionados, como a oxaplatina e a

carboplatina são importantes agentes quimioterapêuticos usados amplamente no

tratamento de muitos tumores, incluindo cânceres de testículo, ovário, bexiga,

cervical, cabeça, pescoço e pulmão (Rosenberg, 1999; Jordan & Carmo-Fonseca,

2000; Wang & Lippard, 2005).

Entre todos os compostos de platina, a Cisplatina é o composto mais bem

estudado e ainda hoje é um dos mais potentes agentes antitumorais,

desempenhando uma atividade clínica significante contra uma variedade de tumores

sólidos (Wang et al., 2004). Em alguns casos como para o câncer de testículo, a

taxa de cura pode ultrapassar 90%, chegando a 100% quando detectado

precocemente (Zhang & Lippard, 2003; Wang & Lippard, 2005). Apesar do sucesso

da cisplatina no tratamento do câncer de testículo, sua efetividade no tratamento de

outros cânceres é mais limitada devido aos mecanismos de resistência intrínsecos

ou adquiridos das células tumorais (Kartalou & Essigmann, 2001).

A Cisplatina é administrada aos pacientes pela via intravenosa. A

concentração de cloreto no sangue é de 100 mM, alta o suficiente para suprimir a

hidrólise da cisplatina, permitindo que a droga chegue às células como uma

molécula neutra (Reedijk, 2003).

A cisplatina entra na célula por difusão passiva (Jamieson & Lippard, 1999) e

também – como recentemente descoberto – por transporte ativo mediado por

transportadores cooper Ctr1p em leveduras e mamíferos (Ishida et al., 2002). Dentro

da célula, a concentração de cloreto é de 4 mM, conseqüentemente levando a

hidrólise da cisplatina, embora de maneira lenta. Os radicais cloreto são então

substituídos por moléculas de água, gerando espécies aquosas positivamente

carregadas que podem reagir com sítios nucleofílicos de algumas macromoléculas

intracelulares, formando adutos em proteínas, RNA e DNA (fig. 7). Esses adutos por


13

sua vez, bloqueiam a replicação e a transcrição do DNA induzindo morte celular

através de mecanismos de apoptose ou necrose (Fuertes et. al., 2003).

Sangue

Citoplasma

Bloqueio da transcrição

Bloqueio da replicação

Parada em G2 Morte celular programada

Polimerase

Polimerase

Figura 7 – Mecanismo de ação da cisplatina (Kartalou & Essigmann, 2001).

A inibição da síntese de DNA por cisplatina foi inicialmente indicada como a

responsável por sua atividade antitumoral. Contudo, subseqüentes estudos

mostraram que a inibição da síntese de DNA não estava correlacionada com a

sensibilidade de diferentes linhagens celulares à droga (Sorenson & Eastman,

1988). Mais recentemente foi proposto que a cisplatina mata as células tumorais por

induzir o bloqueio do ciclo celular em G2 e por ativar mecanismos apoptóticos (Chu,

1994).

Embora ainda esteja sobre confirmação se o sucesso clínico da cisplatina se

apóia primariamente na sua habilidade em induzir apoptose. Duas proteínas

celulares, p53 e p73, são responsáveis por induzir o bloqueio do ciclo celular e

apoptose em resposta a danos no DNA. Alguns resultados obtidos por Gong e

colaboradoes em 1999, sugerem que cisplatina pode induzir duas vias paralelas de

resposta de morte celular, uma dependente de p53 e a outra de p73.


14

A proteína supressora tumoral p53 é uma potente ativadora da apoptose, e

células cancerígenas deficientes de p53 são menos responsivas à terapia com

cisplatina (Gallagher et. al., 1997). O gene que codifica a proteína p53, TP53, é o

mais freqüentemente mutado em cânceres humanos, a proteína é encontrada inativa

em aproximadamente 50% dos tumores. Esse fator de transcrição é considerado um

“guardião do genoma”. Ele está presente em uma forma inativa em células normais,

e torna-se funcional quando ativado em resposta ao estresse celular. A ativação de

p53 leva a expressão de vários genes alvos responsáveis pela parada do ciclo

celular ou apoptose, dependendo do ambiente celular (Bouchet et al., 2006).

Existem evidências de que as células podem ser mortas pela cisplatina de

uma maneira independente de p53, o que implica na presença de outras vias

apoptóticas (Jordan & Carmo-Fonseca, 2000). Uma das vias alternativas pode

envolver o produto de um gene relacionado a p53, a proteína p73. O gene p73

codifica proteínas com habilidade de induzir apoptose. A cisplatina induz a ativação

da tirosina quinase c-Abl, um mediador essencial que interrompe o ciclo celular em

resposta a um dano causado no DNA, potencializando a atividade pró-apoptótica de

p73. Esses resultados sugerem que os sinais de dano no DNA são canalizados

através de c-Abl para p73 (Jordan & Carmo-Fonseca, 2000).

Outros prováveis reguladores da apoptose induzida por cisplatina incluem a

expressão de proteínas da família Bcl-2, ativação de cascatas de quinases induzidas

por stress e a perda dos telômeros (Stresser et. al., 1994; Sanches-Perez et. al.,

1998; Ishibashi & Lippard, 1998).

1.2.2 – Resistência à cisplatina

A principal limitação na aplicação clínica da cisplatina e dos outros derivados

de platina, tem sido o desenvolvimento de resistência dos tumores à essas drogas

(Boulikas & Vougiouka, 2003).

Sabe-se hoje que alguns tipos de cânceres são insensíveis ao tratamento

com cisplatina, enquanto outros desenvolvem resistência somente durante a

quimioterapia. A resistência a drogas baseadas em platina pode ocorrer por diversos

mecanismos, incluindo aumento do efluxo da droga, sua inativação, alterações no


15

seu alvo, processamento do dano induzido pela droga (reparo de adutos) e evasão

da via de apoptose (fig. 8) (Brabec & Kasparkova, 2002; Morin, 2003; Siddik, 2003;

Torigoe, 2005).

Figura 8 – Mecanismos de resistência à cisplatina (Katalou & Essigmann, 2001).

O acúmulo reduzido de cisplatina intracelular pode surgir ou devido à

diminuição da captação ou pelo aumento do efluxo da droga, o que é

freqüentemente observado em linhagens de células resistentes à cisplatina. O

inibidor da sódio-potássio ATPase, ouabaína inibe a captação da droga, e o acúmulo

de cisplatina é potássio-dependente, mesmo que a cisplatina não seja transportada

para células pela bomba de sódio-potássio, sugerindo que o acúmulo é dependente

do potencial de membrana celular (Andrews et. al., 1988). Além disso, vários

aldeídos inibem a captação, presumivelmente formando bases de Schiff com

proteínas de membrana. De forma interessante, uma proteína de membrana de 48

kDa é expressa em níveis mais baixos nas células resistentes a cisplatina apontando

um decréscimo na acumulação intracelular da droga (Bernal et. al., 1990)

Além dos mecanismos para captação reduzida da cisplatina, a diminuição do

acúmulo celular de cisplatina pode acontecer por um aumentado efluxo da droga

pelas células. A cisplatina não é um substrato para glicoproteína P (produto do gene

mdr) que é superexpressa em células multi-drogas resistentes e funciona como

bomba para o efluxo da droga (Toffoli et al., 1991). Algumas células resistentes a

Aumento do efluxo

Inativação por Glutationa

Diminuição da entrada

Envelope nuclear Aumento da remoção do

adutos de cisplatina

Defeito nos mecanismos apoptóticos

Aumento do “bypass” dos adutos de cisplatina


16

cisplatina superexpressam uma proteína de 200 kDa. Estas células exibem um

acúmulo reduzido de cisplatina, sugerindo que esta proteína pode estar envolvida no

efluxo da cisplatina (Kawai et. al., 1990). Além disso, a bomba de exportação

glutationa S-conjugada dependente de ATP pode expulsar a cisplatina conjugada a

glutationa e pode estar envolvida na redução da concentração de cisplatina

intracelular em células resistentes a esta droga (Chen et. al., 1998).

O reparo do DNA é tido como o principal mecanismo de resistência à

quimioterapia baseada em cisplatina. Em células humanas, a maioria das ligações

cruzadas entre as fitas de DNA feitas pela cisplatina é removida principalmente pelo

sistema de reparo por excisão de nucleotídeos (NER-Nucleotide Excision Repair)

(Zamble et. al., 1996, Kartalou & Essigmann, 2001). Esse mecanismo atua nos

adutos cisplatina-DNA da cromatina. Por isso, a maneira como os nucleossomos

modulam o NER nos adutos formados pela cisplatina no DNA é de grande interesse.

Modificações pós traducionais de histonas, como fosforilação e acetilação, podem

modular NER a partir de um dano na cromatina causando mudanças na estrutura do

nucleossomo, aumentando a acessibilidade de outras proteínas. Esses eventos

facilitam a ligação de complexos remodeladores e proteínas de reparo ao

nucleossomo, estimulando dessa forma o reparo do DNA e ajudando as células a

sobreviverem ao stress induzido pela cisplatina (Brabec & Kasparkova, 2005).

Embora o mecanismo de NER seja o principal meio pelo qual as células tumorais

adquirem resistência à cisplatina, há evidências de mecanismos celulares de reparo

adicionais que também podem afetar a eficácia antitumoral da cisplatina (Beljanski

et. al., 2004).

O reparo por recombinação homóloga (RR) e a síntese de translesão (TLS)

fornecem rotas pelas quais células podem continuar o processo de replicação

mesmo na presença dos aductos bloqueando a forquilha de replicação. RR e TLS

são consideradas vias de tolerância a danos no DNA, pois elas permitem que as

células completem a replicação e mitose, aumentando assim, a freqüência de

mutações e recombinações. Linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae que

eram deficientes em RR e TLS individualmente, foram hipersensitivas quando

expostas à cisplatina (Doetsch et. al., 2001).


17

Outro importante mecanismo de resistência à cisplatina ocorre devido a um

sistema de reparo celular intrínseco conhecido como Mismatch repair (MMR). O

papel primário do MMR é a correção de erros durante a replicação do DNA,

supressão da recombinação, interação com outras vias de reparo do DNA, regulação

dos pontos de checagem do ciclo celular e indução de apoptose (Meyers et. al.,

2004). O status do MMR de uma célula pode influenciar sua resposta a uma

variedade de agentes quimioterapêuticos. Observações recentes sustentam a visão

de que o mecanismo de MMR medeia a citotoxidade da cisplatina frente às células

tumorais e que uma disfunção nesse tipo de reparo do DNA pode resultar em

resistência ou tolerância de células tumorais à cisplatina (Papouli et. al., 2004). A

ligação do complexo MMR aos adutos cisplatina-DNA parece aumentar a

citotoxidade desses adutos, ou por ativar vias de sinalização que levam a apoptose

ou por causar “ciclos fúteis” durante a TLS ao passarem pelos aductos cisplatina-

DNA (Nehme et. al., 1999).

Alterações na expressão de oncogenes (como c-fos, c-myc, H-ras, c-jun, e c-abl)

e de genes supressores tumorais (como p53) também têm sido relacionadas com a

resistência celular à cisplatina. Porém, como uma mudança na expressão destes

genes pode levar a efeitos pleiotrópicos sobre a homeostase celular, o mecanismo

relacionado à resistência não está completamente esclarecido (Kartalou &

Essigmann, 2001).

1.3 – Compostos de coordenação e nucleases sintétic as

Os compostos de coordenação são substâncias que contêm complexos

metálicos; os complexos metálicos contêm íons metálicos ligados a vários ânions ou

moléculas nulas circundantes conhecidas como ligantes. O íon metálico e seus

ligantes compreendem a esfera de coordenação do complexo. O átomo do ligante

que se liga ao íon metálico é o átomo doador. O número de átomos doadores

ligados ao íon metálico é o número de coordenação do íon metálico (Brown et al.,

2005).

Atualmente muitos compostos de coordenação têm sido sintetizados com o

objetivo de simularem a ação de nucleases naturais com diferentes aplicações. Entre


18

elas a terapêutica contra o câncer, uma vez que a integridade do material genético é

essencial para a sobrevivência da célula. Mas a extraordinária resistência do DNA a

hidrólise, que é bioquimicamente essencial para a manutenção da integridade do

material genético, torna-se um desafio para a síntese de fosfodiesterases ou

nucleases que possam promover a sua hidrólise em uma escala de tempo razoável

(Sreedhara & Cowan, 2001).

O desenvolvimento de drogas antitumorais baseadas em metais foi

estimulado pelo sucesso clínico do composto de coordenação cis-

diaminodicloroplatina(II) (cis-[Pt(NH3)2Cl2], cisplatina) e seus análogos (Brabec,

2002). Com a descoberta de que este composto inibia o crescimento de células

cancerígenas por atuarem sobre o DNA, confirmou-se que compostos de

coordenação podem interagir com a dupla fita do DNA. Tal interação pode ocorrer de

diferentes formas: (a) interações não covalentes (eletrostática); b) interações

covalentes; (c) interação por intercalação; (d) interação por oxidação; (e) interação

via hidrólise (Hecht, 1996).

Enquanto o cis-[Pt(NH3)2Cl2] interage com o DNA pela formação de ligações

covalentes, um grande número de compostos de metais do primeiro período de

transição interage por um mecanismo oxidativo, devido a rica química redox

apresentada por tais elementos (Burrows, 1998). Embora já existam metalofármacos

que atuam sobre o DNA seguindo o mecanismo oxidativo, o mesmo não é

apropriado quando se pensa na utilização em biotecnologia, tendo em vista que a

clivagem oxidativa do DNA atua de forma diferente daquela apresentada pelas

nucleases naturais (Cowan, 2001; Burrows, 1998). Com base neste aspecto,

estudos têm sido realizados de forma a buscar compostos que possam atuar

promovendo a clivagem hidrolítica do DNA (Neves et al., 2001; Horn et al., 2004).

Compostos de coordenação que são candidatos a apresentarem atividade

hidrolítica sobre o DNA devem apresentar as seguintes características: (a)

apresentarem cargas positivas quando em solução, o que facilita a atração de tais

compostos pelo DNA, pois o mesmo apresenta cargas residuais negativas; (b)

ambiente de coordenação insaturado ou contendo ligantes lábeis, o que facilita a

interação com os grupos fosfatos do DNA; (c) possibilidade de formarem espécies

nucleofílicas (OH-) em condições suaves de pH; (d) apresentarem certa solubilidade


19

em água; (e) serem, de preferência, eletroquimicamente inertes em condições

biológicas. Com estas características em mente, pode-se promover o planejamento

racional de compostos, iniciando-se pela proposição de ligantes que permitam a

obtenção de complexos com ambientes de coordenação insaturados (Horn et al.,

2004).

Aliado ao estudo da síntese e caracterização das propriedades dos compostos,

o que por si só tem se mostrado de fundamental relevância ao desenvolvimento da

ciência básica, os compostos que apresentam as características relatadas acima são

elegíveis para serem estudados na promoção da clivagem do DNA. A confirmação

inicial desta habilidade propicia a realização de estudos posteriores para evidenciar

se o mecanismo de ação se dá por via hidrolítica ou oxidativa. O estabelecimento do

tipo de interação composto-DNA abre um amplo leque de possibilidades para

aplicação dos mesmos, tendo em vista que todo ser vivo, incluindo aqueles que

agridem espécimes de interesse ao homem e o próprio, são dependentes do seu

código genético para crescerem e se replicarem. Desta forma, compostos que

apresentam atividade na promoção da clivagem da molécula do DNA isolada, são

fortes candidatos a apresentarem atividade frente a microorganismos ou células

tumorais.

Diferentes complexos metálicos já demonstraram ser capazes de promover a

clivagem do DNA, entre eles, [Fe2(BPClNOL)2(H2O)2]2+ (Neves et al., 2001),

[Fe2(IDB)2(µ-O)(µ-OAc)2]Cl2 (Liu et al., 2002), Zn2HP (Sissi et al., 2001),

[Cu(HPClNOL)Cl]Cl (Fernandes et al., 2006) e [Fe(HPClNOL)(SO4)]2-µ-oxo · 6H2O

(Parrilha et al., 2008)

Outros compostos de coordenação ainda não tiveram a confirmação de

atuarem como nucleases, porém foram capazes de induzir apoptose em diversos

tipos de células cancerígenas e são vistos como promissores agentes antitumorais.

Muitos compostos de rutênio com estado de oxidação 2+ ou 3+ mostraram atividade

antitumoral, especialmente contra cânceres com metástases (Zhang & Lippard,

2003). Estudos da atividade biológica de compostos de diródio conduzidos na

década de 70 mostraram que compostos Rh2(µ-O2CR)4 (R=Me, Et, Pr) exibem

significante atividade antitumoral in vivo contra tumores L1210, carcinoma ascítico

de Ehrlich, sarcoma 180 e linhagens tumorais P388 (Chifotides & Dunbar, 2005). Um


20

grande número de complexos de ouro utilizados no tratamento da artrite reumatóide,

especialmente a auranofina e [Au(dppe)2]Cl, também têm sido investigados como

agentes quimioterápicos contra o câncer (Ahmad et al., 2006). Alguns grupos de

compostos de vanádio também apresentaram atividade antitumoral, sendo o

principal exemplo o dicloreto de vanadoceno (Cp2VCl2), que demonstrou atividade

contra certos tipos de tumores comparável ao observado com o composto cisplatina

(Noblía et al., 2005). Outros compostos como lantânio (Kostova et al., 2005), cério

(Kostova et al., 2005) e zircônio (Kostova & Momekov, 2006) também apresentaram

bons resultados frente a células tumorais.

1.4 – Apoptose

A principal forma de suicídio celular é conhecida como apoptose ou morte

celular programada. Tal mecanismo é central para vários processos biológicos e

pode ser ativado em resposta a estímulos específicos ou a várias formas de injúria

ou estresse celular (Hannun, 1997). A apoptose é essencial para a regulação do

desenvolvimento, geração do sistema imune e posteriormente para manutenção da

homeostase em tecidos adultos, sendo conseqüência de uma balanceada taxa de

morte versus proliferação celular (Fischer & Schulze-Osthoff, 2005).

Igualmente ou talvez mais importante, é o papel da apoptose como causa de

doenças. A desregulação da taxa apoptótica pode resultar em severas síndromes

patológicas. Ataque cardíaco ou falência do fígado estão associadas à “morte súbita”

de áreas ou órgãos inteiros, enquanto certas síndromes degenerativas são

resultados de uma morte celular neuronal progressivamente mais lenta. De maneira

controversa, a baixa taxa de apoptose pode promover a sobrevivência e o acúmulo

de células anormais que por sua vez podem evoluir para a formação de um tumor ou

levar a doenças autoimunes (Fischer & Schulze-Osthoff, 2005).

Atualmente muitos dos eventos moleculares necessários para ativação,

amplificação e execução dos mecanismos apoptóticos já foram elucidados

(Johnstone et al., 2002). O processo de apoptose é caracterizado por distintas

mudanças morfológicas e bioquímicas, incluindo blebbing de membrana,

encolhimento celular, condensação da cromatina, fragmentação do DNA,


21

externalização de fosfatidilserina e inicialização de transdução de sinais apoptóticos.

A cascata de reações bioquímicas pode incluir novos mRNA e síntese de proteínas,

expressão de p53, ativação de caspases, ação de endonucleases ativadas por

caspases e ativação de Fas ligante ou receptor de TNF. Esse processo é seguido

por uma rápida fagocitose das células apoptóticas por células vizinhas. Distinguindo-

se assim, da morte por necrose, pela ausência de uma resposta inflamatória

(Renehan et al., 2001; Kiechle & Zhang, 1998).

A morte por apoptose é definida por distintas mudanças morfológicas e

bioquímicas mediadas por uma família de proteínas conhecida com caspases, que

são expressas como zimogênios e são proteoliticamente processadas a um estado

ativo seguindo um estímulo apoptótico (Johnstone et al., 2002). Examinando os

padrões de ativação de caspases seguido de diferentes estímulos apoptóticos, pelo

menos duas distintas vias foram elucidadas. A via mitocondrial e a via dos

receptores de morte, que podem ser divididas em três estágios: sinalização, ativação

e execução (fig. 9) (Schulze-Osthoff et. al., 1998; Yu & Zhang, 2003).

Sinais de morte originados por estresse celular, incluindo radiação e drogas

quimioterapêuticas, ativam um programa intrínseco de apoptose que é mediado

amplamente pelas mitocôndrias. A liberação de citocromo c por essas organelas no

citoplasma induz a formação de um complexo oligomérico contendo citocromo c e

Apaf-1. Este complexo, chamado de apoptossomo, promove a ativação catalítica da

caspase-9, que posteriormente cliva e ativa a caspase-3 efetora resultando em uma

subseqüente degradação de substratos de morte celular. Juntamente com citocromo

c, as proteínas SMAC/DIABLO e Omi/ HtrA2 localizadas nas mitocôndrias também

são liberadas no citoplasma. Uma vez liberadas, essas duas proteínas se ligam a

uma proteína inibidora de caspases conhecida como XIAP, essa ligação ajuda a

ativar os mecanismos de apoptose por neutralizar a função inibitória dessa proteína

(Fischer & Schulze-Osthoff, 2005).


22

Em contraste à via intrínseca, a estimulação de receptores de morte ativam um

programa extrínseco de apoptose que freqüentemente não necessita do

envolvimento mitocôndrial. Receptores de morte formam um subgrupo da

superfamília de receptores para fator de necrose tumoral (TNF) que incluem TNF-

R1, CD95, e receptores de ligantes indutores de apoptose relacionados a TNF

(TRAIL – TNF-related apoptosis-inducing ligand). Todos os receptores de morte são

caracterizados por possuírem um motivo intracelular chamado de domínio de morte

(DD – Death domain). Após o reconhecimento do ligante, os receptores de morte

interagem via seus domínios de morte com os domínios de morte de proteínas

adaptadoras tais como FADD. Essas proteínas adaptadoras também contem um

segundo motivo de interação, o domínio efetor de morte, que facilita a ligação

dessas proteínas a caspase-8 iniciadora, para formar o complexo sinalizador indutor

de morte (DISC – Death inducing signaling complex). Depois de ser ativada por

DISC a caspase-8 cliva e ativa a caspase-3, resultando em futura clivagem de alvos

Figura 9 – Vias de ativação e mecanismos centrais da apoptose (Yu & Zhang, 2003).

Sinalização

Execução

Comprometimento

Estímulo apoptótico

Proteínas das familias Bcl-2 BH3

Proteínas da família Bcl-2 multidominio

Proteínas mitocondriais apoptogênicas

Dano no DNA

Fatores de crescimento

Receptores de Morte

Citocinas

Morte Celular

Degradação do DNA

Caspases

Citocromo C

Mitocôndria

Reticulo Endoplasmático

Apoptosomo


23

celulares. Em alguns tipos de células, contudo, a progressão linear da formação de

DISC até a ativação da caspase-3 é insuficiente para completar o programa de

morte celular, e a amplificação do estímulo gerado pelos receptores de morte torna-

se necessária. Isso é feito pela participação da via mitocôndrial (Fischer & Schulze-

Osthoff, 2005).

Um mecanismo conhecido pelo qual a via mitocôndrial auxilia na apoptose

após ativação dos receptores de morte é através clivagem de Bid (um membro pró-

apoptótico da família Bcl-2) mediada pela caspase-8. Uma vez clivada, tBid

(Truncated Bid) transloca-se para a mitocôndria, aonde ela pode induzir a liberação

de citocromo c, SMAC e Omi/HtrA2. Desta maneira, os sinais gerados pelos

receptores de morte podem ser amplificados através da formação de ativação do

apoptosomo, o qual aumenta a ativação das caspase efetoras (Fischer & Schulze-

Osthoff, 2005).

A falha em ativar a apoptose representa o principal obstáculo no tratamento do

câncer com drogas antitumorais. Em adição, acredita-se que defeitos na maquinaria

apoptótica possuem um importante papel na sobrevivência e proliferação de células

neoplásicas na ausência de quimioterapia, por permitir que subpopulações de

células danificadas e geneticamente instáveis evitem ser eliminadas. O

reconhecimento de discretas anormalidades em células tumorais que ocorrem no

centro da maquinaria apoptótica e em suas vias regulatórias de sinalização tem

destacado a maquinaria apoptótica como um novo e interessante alvo potencial para

o desenvolvimento racional de drogas antitumorais (Cummings et al., 2004; Kamb &

Lassota, 2004).

1.4.1 – Apoptose, câncer e quimioterapia

Uma característica marcante da tumorigênese é o crescimento desordenado de

uma população clonal de células que se tornam insensíveis a certos sinais

apoptóticos (Hanahan & Weinberg, 2000). O mecanismo de apoptose é um

paradigma para o entendimento de como as drogas antitumorais funcionam e como

os tumores evadem sua ação. A descoberta de que a apoptose contribui para a

atividade antitumoral de muitas drogas quimioterapêuticas permitiu repensar como


24

um mecanismo de resistência intrínseca para maioria das drogas poderia surgir.

Defeitos na maquinaria apoptótica permitem as células neoplásicas sobreviverem

além do período normal de vida, acumular mutações genéticas, sustentar o

crescimento sob condições de hipóxia e stress oxidativo, e ainda promover a

angiogenese tumoral. Além disso, essa célula também deve evadir a resposta imune

antitumoral do hospedeiro (Yu & Zhang, 2003).

A apoptose é regulada em muitos níveis, incluindo os estágios de iniciação,

transdução, amplificação e execução, e mutações que afetem cada um desses

estágios foram encontradas em células tumorais. A expressão alterada ou a

mutação de genes que codificam proteínas chaves da maquinaria apoptótica podem

fornecer às células cancerígenas uma vantagem intrínseca de sobrevivência e uma

inerente resistência a drogas quimioterapêuticas. Essa dupla modificação resulta

em crescimento e expansão de células neoplásicas em primeira instância e pode

frustrar uma subseqüente terapia (Johnstone et al., 2002).

Drogas com diferentes estruturas e especificidades induzem mudanças

morfológicas características associadas com apoptose, e agora acredita-se que vias

apoptóticas contribuem para ação citotóxica da maioria das drogas

quimioterapêuticas (Lowe & Lin, 2000). Em conjunto essas observações indicam que

células podem interpretar um estímulo induzido por droga da mesma maneira que

um estímulo fisiológico, tais como hipoxia e privação de fatores de crescimento são

interpretados (Johnstone et. al., 2002). Por isso, proteínas que regulam as vias de

apoptose são excitantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas e de outras

abordagens para o tratamento do câncer (Vermeulen et. al., 2005).

Diversos métodos possibilitam a identificação de células em apoptose,

comumente as mais empregadas são as técnicas com marcadores fluorescentes,

microscopia eletrônica para diagnóstico morfológico e eletroforese em gel de

agarose onde é possível identificar apoptose em um padrão característico

denominado “DNA ladder”, como conseqüência da clivagem do DNA em regiões

nucleossômicas (Chandra et. al, 2000; Hutchins & Barger, 1998; Zimmerman et. al.,

2001).

101 Borges F. V. Justificativa

25

2 – Justificativa

Dentre as várias enfermidades que acometem o homem, o câncer tem mostrado

ser uma das doenças de mais difícil tratamento, visto que ainda não estão disponíveis

no mercado fármacos ou métodos de controle mais práticos e efetivos.

A quimioterapia ainda continua sendo a principal forma de tratamento para a

maior parte dos cânceres, onde aliada à outros tratamentos como a radioterapia

alcança boas taxas de cura e regressão do tumor. Em relação à quimioterapia, a

grande limitação continua sendo o problema gerado pelos efeitos tóxicos dos fármacos

usados durante o tratamento, os quais não são específicos para o tumor e acabam

provocando fortes efeitos colaterais no organismo do paciente, como náuseas, perda de

cabelo e imunodeficiência, que estão entre os mais comuns.

Outro problema muito comum é resistência dos tumores às principais drogas,

intrínseca a alguns tumores e adquirida por outros durante o tratamento, elevando o

número de falhas terapêuticas e mortes.

Por isso, a identificação de novos agentes antitumorais mais potentes, seletivos,

e menos tóxicos, permanecem como uma das mais urgentes metas para o combate ao

câncer.

Borges F. V. Objetivos

26

3 – Objetivos

3.1 – Objetivo Geral Este trabalho tem como objetivo a avaliação da atividade antitumoral do

composto de coordenação mononuclear de ferro [Fe(HPClNOL)(Cl)2]NO3 e dos

compostos dinucleares de ferro [Fe(HPClNOL)Cl]2-µ-O.2NO3.CH3OH e

[Fe(HPClNOL)(SO4)]2-µ-O.9H2O frente às células de origem tumoral humanas.

3.2 – Objetivos específicos

1. Avaliar os efeito dos compostos na viabilidade celular

2. Avaliar a indução de apoptose mediada pelos compostos nas células de

origem tumoral.

3. Determinação da toxicidade dos compostos frente à células mononucleares

do sangue periférico humano.

4. Verificar alterações morfológicas, induzidas pelos compostos, na ultra-

estrutura das células tumorais.

5. Determinar a Dose Letal Mediana (DL50) dos compostos em camundongos

CF1 (suíço-albino).

6. Analisar a provável via de apoptose pela qual os compostos atuam.

Borges F. V. Materiais e Métodos

27

4 – Materiais e métodos 4.1 – Compostos de coordenação

Foram estudados os efeitos de três compostos de coordenação. Um

mononuclear [Fe(HPClNOL)(Cl)2]NO3 (composto 2) e dois dinuclreares,

[Fe(HPClNOL)Cl]2-µ-O.2NO3.CH3OH (composto 1) e [Fe(HPClNOL)(SO4)]2-µ-O.9H2O

(composto 3), onde HPCINOL significa N,N-bis-(piridil-(2-il-metil)[(3-cloro)(2-

hidroxi)]propilamina). Os compostos foram sintetizados no Laboratório de Ciências

Químicas, CCT, UENF, e gentilmente cedidos pela equipe do Professor Adolfo Horn Jr

e Dra. Christiane Fernandes. Os compostos (1) e (2) fazem parte da mesma síntese,

por isso estão representados na mesma figura, (Fig. 10a). O sal FeCl3 que faz parte da

síntese dos compostos (1) e (2), e o sal FeSO4 que faz parte da síntese do composto

(3) também foram testados frente as células tumorais e normais. Os sais foram

utilizados nas maiores concentrações testadas para os compostos, 200µM ou 400µM.

Os três compostos, bem como os sais, foram diluídos em meio D-MEM F12 (Gibco

BRL, EUA) para atingir as concentrações de 400µM, 200µM, 100µM e 50µM.


28

Fe

N

N

N

Cl OFe

NHO

Cl

N

N

Cl

OH

Cl

Fe

N

N

N

Cl

OH

Cl

Cl

+NO3 2 NO3.CH3OH

MeOH

N

N

N

Cl

OH

+ FeCl3 + NaNO3

1

N Cl

OHN

N

N

FeN

N

O

Cl

OSO3

N

FeO

N

O3SO

Cl

N

O

H

H

FeSO4.7H2OMeOH

Figura 10 – Esquema de síntese e estrutura dos compostos de coordenação estudados: a)

Composto mononuclear de Ferro Fe(HPClNOL)(Cl)2]NO3 (2) e composto dinuclear de Ferro

[Fe(HPClNOL)Cl]2-µ-O.2NO3.CH3OH (1) e b) Composto dinuclear de Ferro

[Fe(HPClNOL)(SO4)]2-µ-O.9H2O (3).

a

b

Composto 1 Composto 2

Composto 3


29

4.2 – Animais utilizados Camundongos de ambos os sexos, suíço albino, com idade mínima de 35 dias e

peso entre 18 e 22g, provenientes do Biotério da UENF foram utilizados para o ensaio

de toxicidade dos compostos.

4.3 – Cultura das linhagens de células de origem tu moral

As células de origem leucêmica humanas THP-1 e HL-60 (linhagens mielóides),

e U937, JURKAT, e MOLT-4 (linhagens linfóides) foram cultivadas em meio D-MEM

F12 (Gibco, BRL) suplementado com 20µg/mL de gentamicina (Gibco, BRL) e 10% de

soro fetal bovino (Gibco, BRL). As culturas foram repicadas a cada 2 dias e mantidas

em estufa (Forma Scientific Inc., modelo 3159) a 37°C, com 5% de CO2 e umidade

controlada.

4.4 – Avaliação da atividade biológica dos composto s de coordenação frente às

células tumorais em cultura

As células leucêmicas citadas no item 4.3 foram plaqueadas em volume de 100

µL/poço (1x106 cels/mL) em placas de 96 poços, tratadas com as drogas nas

concentrações finais de 50µM, 100µM e 200µM para os testes de viabilidade celular

com MTT e para análise de Microscopia Confocal; 50µM, 100µM, 200µM e 400µM para

os testes de indução de apoptose, e 50µM e 100µM para análise por microscopia

eletrônica de transmissão. As células foram mantidas em estufa a 37°C, com 5% de

CO2 e umidade controlada. No tempo de 72 horas as células foram avaliadas quanto a

inibição de crescimento (MTT), após 12, 24 e 36 horas quanto a taxa de apoptose e

necrose por microscopia de fluorescência e para análise por microscopia confocal e

após 24 para análise por microscopia eletrônica de transmissão.


30

4.5 – Avaliação dos efeitos citotóxico e citostátic o dos compostos de

coordenação frente às células tumorais

Após tratamento como no item 4.4, a viabilidade celular foi determinada através

do microensaio colorimétrico utilizando MTT [3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide]. As células foram incubadas por 72 horas com os

compostos e após o tempo determinado (72 horas) foram adicionados 10µL de MTT

(Sigma, 5mg/mL) para cada 100µL de cultivo. As placas foram mantidas na estufa por

quatro horas. Após esse período foram retirados 150µL do sobrenadante de cada poço

e depois adicionados 100µL de uma solução de HCl com isopropanol, homogeneizando

bem até a completa dissolução dos cristais de sal formados. A placa de 96 poços foi

lida em espectrofotômetro (MULTISKAN-EX) utilizando o comprimento de onda de

570nm. Os resultados foram analisados através da absorbância de cada poço e os

experimentos foram realizados em triplicatas. Para os experimentos com as linhagens

celulares U937, THP-1 e HL-60 o composto cisplatina foi utilizado com fins

comparativos com os compostos testados na concentração final de 50 µM.

4.6 – Avaliação da apoptose por microscopia de fluo rescência

As células cultivadas com a droga conforme os tempos e concentrações

indicados no item 4.4 (12, 24 e 36 horas) foram coradas com uma solução de 10 µg/mL

laranja de acridina (Sigma) e 10 µg/mL de brometo de etídio (Sigma). Após a

montagem em lâmina e lamínulas, as células foram levadas ao microscópio de

fluorescência (Axioplan – Carl Zeiss) e contadas aproximadamente 300 células em

vários campos escolhidos aleatoriamente, descriminando-se as células apoptóticas,

necróticas e normais. Foram feitas duplicatas para cada condição e os experimentos

foram repetidos pelo menos duas vezes.

Foram adotados padrões convencionais com relação à morfologia e coloração

das células (fig.11):


31

• Células vivas: possuem morfologia do núcleo intacta, DNA corado por laranja de

acridina (cor verde).

• Células apoptóticas: condensação da cromatina e fragmentação do núcleo,

DNA corado por laranja de acridina (cor verde), que reflete a membrana plasmática

intacta e não permeável ao brometo de etídio.

• Células necróticas

- primárias: morfologia do núcleo necrótico, corado por brometo de etídio (cor

vermelha).

- secundárias: condensação da cromatina e fragmentação do núcleo, DNA corado por

brometo de etídio (cor vermelha) e laranja de acridina, que demonstra a

permeabilização necrótica da membrana plasmática que permite a entrada do brometo

de etídio.

Figura 11 – Microscopia de Fluorescência de células U937 evidenciando as

características para classificação das células como mencionadas acima em: 1 –

Normais, 2 – Necrose, 3 – Apoptose Primária e 4 – Apoptose-necrose (necrose

secundária). As fotos foram feitas após 24 horas de incubação das células com o

composto (1) na concentração de 200µM.

1

1

1

1

2

3

3

4

4


32

A porcentagem de cada população celular – células normais, apoptóticas e

necróticas – em relação ao total foi calculada. Foi considerado para o cálculo da

porcentagem de apoptose as células apoptóticas e as necróticas secundárias, também

chamadas de apoptose-necrose.

4.7 – Avaliação da apoptose pela fragmentação do DN A em gel de agarose

Para avaliação da apoptose pela fragmentação do DNA células U937 e THP-1

foram incubadas com 100 e 200µM dos compostos durante 24 horas. Após esse tempo

as células foram colhidas e centrifugadas a 500xg e o pellet lavado com 1mL de

solução salina (PBS pH 7,4). A extração do DNA foi feita de acordo com as

especificações do fabricante através do kit Enhanced Apoptotic DNA Ladder Detection

Kit (BioVision). O DNA extraído aplicado em gel de agarose a 1,5% em TBE. A corrida

foi realizada a 50V durante 2 horas. Após esse tempo o gel foi corado e visualizado em

transiluminador com luz ultravioleta.

4.8 – Avaliação da toxicidade dos compostos in vitro

4.8.1 – Obtenção de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)

Voluntários saudáveis do Laboratório de Biologia do Reconhecer (UENF) foram

submetidos a coleta de sangue venoso com sistema de tubos "VacutainerTM" (Becton

Dikinson) contendo heparina sódica, para a obtenção das células; foram coletados

20mL de sangue por voluntário.

O sangue total coletado foi lentamente adicionado sobre o Ficoll-Paque™ Plus

(1,08g/mL), na proporção de 2:1 (20mL de sangue para 10mL de Ficoll) em tubos

cônicos de 50 mL, e submetido a centrifugação de fracionamento (500g, à temperatura


33

ambiente, próxima a 20ºC, durante 40 minutos). O fracionamento dos componentes do

sangue ocorre por diferença de densidade dos mesmos.

O plasma, que compõe a primeira camada do gradiente obtido, foi descartado.

As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) formam a camada logo abaixo

do plasma e das plaquetas, em forma de anel que se dispõe acima do colchão de Ficoll.

Abaixo do Ficoll há o tapete de células polimorfonucleares, que compreende os

granulócitos, e abaixo deste estão os eritrócitos formando o sedimento no fundo do

tubo.

As PBMC coletadas foram lavadas com meio RPMI-1640 (Meio HEPES

modificado – GIBCO-BRL) através de três centrifugações de 500g, a 4ºC durante 10

minutos, cada. Após o processo de lavagem, as células foram ressuspendidas em

RPMI. A partir desta suspensão uma alíquota foi retirada e diluída em Azul de Tripan

(0,2%), para a realização da contagem do número de células e avaliação da viabilidade.

As contagens foram feitas em câmara de Neubauer. As células foram colocadas em

garrafas de cultivo (25cm2, Corning) para que os monócitos aderissem. Após 2 horas, o

sobrenadante, sem os monócitos, foi colhido e as células plaqueadas como descrito no

próximo item.

Toda a manipulação com o sangue e PBMC, exceto a contagem das células, foi

feita em condições estéreis, em capela de fluxo laminar.

4.8.2 – Avaliação da toxicidade dos compostos frente às Células Mononucleares do

Sangue Periférico

As PBMCs separadas como no item 4.8.1 foram cultivadas em placas de 96

poços, nas quais foram distribuídas numa quantidade aproximada de 1,0 x 106

células/poço. O meio utilizado para cultura e para diluição dos compostos foi RPMI –

1640 (GIBCO BRL) suplementado com 10% de soro fetal bovino e com antibiótico

Gentamicina 20µg/mL (GIBCO BRL). As células foram cultivadas na presença dos


34

compostos e na presença do ativador inespecífico enterotoxina B estafilocócica (SEB –

0,25µg/mL). A avaliação da viabilidade das células mononucleares do sangue periférico

foi feita também através do ensaio com MTT como no item 4.5 e o ensaio para

avaliação de apoptose foi feito por microscopia de fluorescência como no item 4.6, nas

mesmas concentrações e tempos utilizados para as células tumorais. Para o ensaio de

toxicidade com MTT o composto cisplatina foi utilizado com fins comparativos com os

compostos testados na concentração final de 50 µM.

4.9 – Análise da funcionalidade mitocondrial por Mi croscopia Confocal

A microscopia confocal foi utilizada com a finalidade e analisar alterações

funcionais nas mitocôndrias de células tumorais tratadas com os compostos. Para

avaliar a atividade mitocôndrial foi utilizado o marcador fluorescente rodamina 123

[metil-O-(6-amino-3’-imino-3H-xantem-9il benzoato monoclorídrico)]. Este marcador

acumula-se seletivamente nas mitocôndrias funcionais de uma maneira dependente do

potencial transmembrana. Células U937 foram incubadas com os compostos nas

concentrações de 50, 100 e 200µM de acordo com o item 4.4, porém obedecendo a

uma cinética inversa (36, 24 e 12 horas). Após as últimas 12 horas a solução estoque

de rodamina (1mg/mL) foi diluída diretamente em meio DEMEM-F12 (Gibco BRL, EUA)

para obter uma concentração de 10µg/mL. As culturas foram incubadas por 30 minutos,

no escuro, e observadas usando laser de argônio de 543nm. As micrografias das

células U937 foram tiradas no Microscópio Confocal modelo CLSM (Zeiss, Alemanha).


35

4.10 – Análise das células tumorais tratadas com os compostos por Microscopia

Eletrônica de Transmissão (M.E.T.)

Para verificar alterações morfológicas nas células tumorais tratadas com os

compostos as mesmas, após tratadas, foram processadas para analise por M.E.T.

Células U937 foram descongeladas e deixadas crescer durante 24 horas de acordo

com o item 4.3. Após esse tempo, foram adicionados os compostos diretamente no

meio das células nas concentrações de 50 e 100µM. As células foram mantidas em

estufa a 37°C, com 5% de CO2 e umidade controlada durante 24 horas.

Após o período de incubação com os compostos, as células foram centrifugadas,

por 10 min a 1200rpm e lavadas 3 vezes com Tampão Salina Fosfato (PBS, pH 7,2). O

pellet foi fixado por 1 h em solução de Karnovsky (1% GA, 4% PA, 5mM CaCl2, 5%

sacarose e tampão CaCo 0,1M). Após a fixação as células foram lavadas 3 vezes em

uma solução de 5% sacarose e 0,1M de tampão CaCo e pós-fixadas por 2h protegido

da luz em solução 1:1 de ósmio e Ferrocianeto de potássio. Após o período de pós-

fixação as células foram lavadas 2x, desidratadas sequencialmente em soluções de

acetona (30, 50, 70, 90 e 100%) e deixadas overnight em uma solução 1:1 de acetona e

resina epóxi (EPON). A solução foi então trocada por epon puro e os tubos colocados

em estufa para polimerização da resina durante 48 horas. Os blocos polimerizados

foram seccionados em ultramicrótomo e as seções ultrafinas colocadas em grades de

cobre. As micrografias das células U937 foram tiradas no Microscópio Eletrônico de

Transmissão modelo TEM-900 (Zeiss, Alemanha).


36

4.11 – Determinação da toxicidade dos compostos in vivo

Para o ensaio de toxicidade in vivo foram utilizados somente os compostos 2 e 3,

sintetizados em maior quantidade. Camundongos suíço albino, não isogênicos, de

ambos os sexos, como massa média de 20g, foram inoculados com diferentes

concentrações da droga via intraperitoneal. O camundongos foram separados em

grupos de 4 animais para cada um dos compostos, totalizando 6 grupos por composto.

Foram utilizadas 5 concentrações de ambos os compostos de acordo com cada grupo

(50, 75, 100, 150 e 250 mg kg-1). O 6° grupo foi inoculado apenas com o veículo (água

ultra-pura e DMSO ou apenas água), sendo, portanto, o grupo controle. A mortalidade

dos animais foi acompanhada por até 72 horas. Após esse tempo foi determinada a

DL50 dos compostos in vivo através do programa Graph Pad versão 4.0

4.12 – Análise estatística

As análises estatísticas foram feitas para os testes de viabilidade e indução de

apoptose utilizando o programa Graph Pad versão 4.0. Para ambos os experimentos foi

utilizado o teste estatístico One-way ANOVA. As diferenças significativas foram

consideradas como P<0,05, P<0,01 e P<0,001.

Borges F. V. Resultados

37

5 – Resultados

5.1 – Avaliação do efeito dos compostos na viabilid ade celular

O experimento para avaliação do efeito citotóxico ou citostático dos compostos

foi realizado através do microensaio colorimétrico utilizando MTT [3(4,5-dimethylthiazol-

2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide].

Todos os compostos testados foram capazes de reduzir a viabilidade das

linhagens de células testadas, sendo que o composto (1) se mostrou mais eficaz dentre

os três compostos. Como pode ser observado na figura 12 a menor concentração do

composto (50µM) foi capaz de inibir o crescimento da linhagem HL-60. Nessa mesma

figura pode ser visto também que essa linhagem foi a que mostrou maior resistência

frente aos compostos (2) e (3), quando comparada com as demais linhagens celulares

testadas.

As linhagens JURKAT e MOLT-4 (fig.13) também se mostraram um pouco mais

resistentes ao composto (3) para a concentração de 50µM. Para as concentrações de

100 e 200µM todos os compostos foram satisfatórios na redução da viabilidade celular,

quando comparados aos controles após 72 horas de incubação (figs.12 e 13). A

linhagem celular U937 mostrou ser a mais susceptível aos compostos. Sua viabilidade

foi reduzida aproximadamente em 90% após 72 horas, mesmo na menor concentração

para todos os compostos.


38

Figura 12 – Efeito citotóxico dos compostos (1), (2) e (3) e dos sais FeCl3 e FeSO4 frente às

células leucêmicas humanas U937, THP-1 e HL-60 após 72 horas de incubação. A avaliação foi

feita através do microensaio colorimétrico utilizando MTT. O composto cisplatina foi usado como

controle positivo. n=3; **P<0,01.

THP-1 - Mielóide (72 horas)

0

Sal(20

0µM) 50 10

020

0

Cis(50

M) 0

Sal(20

0µM) 50 10

020

0

Cis(50

M) 0

Sal(20

0µM) 50 10

020

0

Cis(50

M)0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6

******************** ****

Concentração ( µµµµM)

DO

570

U937 - Linfóide (72 horas)

0

Sal(20

0µM

) 50 100

200

Cis (5

0M) 0

Sal(20

0µM

) 50 10020

0

Cis (5

0M) 0

Sal(20

0µM

) 50 10020

0

Cis (5

0M)

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6

**** **

Composto 1Composto 2Composto 3

******************


DO

570

HL-60 - Mielóide (72 horas)

0

Sal (2

00µM

) 50 100

200

Cis (5

0µM

) 0

Sal (2

00µM

) 50 100

200

Cis (5

0µM

) 0

Sal (2

00µM) 50 10

020

0

Cis (5

0µM

)0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6

** ****** **************


DO

570


39


células leucêmicas humanas MOLT-4 e JURKAT após 72 horas de incubação. A avaliação foi

feita através do microensaio colorimétrico utilizando MTT. n=3; *P<0,05, **P<0,01.

JURKAT - Linfóide (72 horas)

0

Sal(20

0µM) 50 10

020

0 0

Sal(20

0µM) 50 10

020

0 0

Sal(20

0µM) 50 10

020

0

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6

Composto 1

Composto 3

Composto 2

***

** ****** ******


DO

570

MOLT-4 - Linfóide (72 horas)

0

Sal (2

00µM) 50 10

020

0 0

Sal (2

00µM

) 50 100

200 0

Sal (2

00µM) 50 10

020

0

0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6

**

**

** ************


DO

570


40

Para avaliar a toxicidade dos compostos in vitro, células mononucleares do

sangue periférico (PBMC) de indivíduos normais foram incubadas com os compostos.

Após os tempos determinados, as células foram avaliadas quanto à inibição de

crescimento, também pelo ensaio colorimétrico com MTT.

. As células normais, assim como as células tumorais foram incubadas com os

compostos nas concentrações de 50, 100 e 200µM. Após 72 horas o MTT foi

adicionado à cultura, que ficou incubada em estufa por mais 4 horas. Após esse tempo

os cristais de MTT formados pelo metabolismo celular foram dissolvidos utilizando uma

solução de isopropanol e HCl. A densidade ótica foi então determinada em um

espectrofotômetro utilizando comprimento de onda de 570nm. O composto cisplatina

(50µM), foi utilizado para fins comparativos com os compostos testados.

A figura 14 mostra que o composto 3 foi o que menos interferiu na viabilidade

celular, mesmo na concentração de 200µM após 72 horas. Nas concentrações de 50 e

100µM não houve diferença significativa quando comparado ao grupo controle

(P>0,05). Os compostos 1 e 2 assim como a cisplatina reduziram a viabilidade celular

em 50% após 72 horas.


41


células humanas normais (PBMC) após 72 horas de incubação. A avaliação foi feita através do

microensaio colorimétrico utilizando MTT. n=3; *P<0,05, **P<0,01, P>0,05 para as

concentrações de 50 e 100µM do composto 3.

PBMC (72 horas)

0

Sal (2

00µM

) 50 100

200

Cis (2

5µM

) 0

Sal (2

00µM

) 50 100

200

Cis (2

5µM

) 0

Sal (2

00µM

) 50 100

200

Cis (2

5µM

)0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

Composto 1

Composto 3

Composto 2

****

****

**

*** **

********


DO

570


42

5.2 – Avaliação da indução de apoptose em células t umorais mediada pelos

compostos

Devido à indução de apoptose ser o resultado de diferentes mecanismos de ação

de várias drogas antineoplásicas, como exemplo o taxol (Blagosklonny et al., 1996) e a

cisplatina (Gonzalez et al., 2001), a análise de indução de apoptose é usada como um

método de triagem de compostos com ação antitumoral.

A taxa de apoptose induzida pelos três compostos foi analisada utilizando a

microscopia de fluorescência, pelo método de coloração de células com os corantes de

DNA, laranja de acridina e brometo de etídio. Laranja de acridina, um corante vital,

entra nas células através da membrana intacta e interage com o DNA pelo

intercalamento de bases ou interações eletrostáticas. Quando ligada ao DNA se torna

espectralmente similar a fluoresceína, com um máximo de excitação em 502nm e

máximo de emissão em 525nm, resultando em uma coloração verde. Ao contrário o

brometo de etídio é capaz de penetrar apenas em células com membrana rompida e

deixa o núcleo com uma coloração alaranjada (Kosmider et al., 2004). Os parâmetros

para discriminação das células estão descritos no item 6.4.4 de acordo com Coligan et

al, 1992.

Após a incubação com os diferentes compostos as células foram coradas,

levadas ao microscópio de fluorescência e discriminadas em normais, apoptóticas e

necróticas, segundo os parâmetros descritos acima, para os três tempos determinados

(12, 24 e 36 horas).

A figura 15 mostra a porcentagem de apoptose induzida pelo composto (1) em

cinco linhagens de células leucêmicas humanas (THP, U937, HL-60, JURKAT e MOLT-

4) após 12, 24 e 36horas. Podemos observar nos gráficos dessa figura que o composto

(1) foi capaz de induzir altas taxas de apoptose em todas as linhagens de células

leucêmicas quando comparado com os controles já em 24 horas, principalmente na

concentração de 400µM. Em 36 horas já observamos uma taxa de mais de 50% de

apoptose para todas as células na concentração de 200µM. Assim como nos

experimentos de viabilidade celular a linhagem celular U937 mostrou ser a mais


43

suscetível dentre as outras, apresentando 67,5% de apoptose após 36 horas na

concentração de 100µM e de quase 100% na concentração de 200µM.

Os compostos (2) (fig.16) e (3) (fig.17) se mostraram menos eficazes que o

composto (1) na indução de apoptose em todas as linhagens de células. A exceção foi

a linhagem celular MOLT-4 que se mostrou mais suscetível ao composto (3),

ultrapassando 40% de apoptose já em 12 horas na concentração de 100 µM.

A linhagem celular U937 se mostrou mais suscetível ao composto (2) do que ao

composto (3), apresentando 65,6% de apoptose na concentração de 200µM após 24

horas para o composto (2) e apenas 24,1% de apoptose para o composto (3) no

mesmo tempo.

O contrário foi observado para linhagem celular JURKAT, que apresentou 43%

de apoptose após 36 horas na concentração de 200µM para o composto (3) e apenas

20% de apoptose para o composto (2) no mesmo tempo e mesma concentração.

De maneira interessante a linhagem celular THP-1 se mostrou resistente aos

compostos (2) e (3) quando comparados com o composto (1). Mesmo na concentração

mais elevada (400µM) e após 36 horas, ambos os compostos induziram um baixo

percentual de apoptose. Como pode ser observado nas figuras 16 e 17, os compostos

(2) e (3) induziram apenas 13% e 35% de apoptose respectivamente para a

concentração de 400µM. A linhagem celular HL-60 também foi mais resistente ao

composto 3, mesmo em altas concentrações (fig. 17) quando comparado com os outros

compostos.

As taxas de necrose não excederam os 3% para todos os compostos em todas

as concentrações, mesmo após 36 horas (dados não apresentados).


44

Figura 15 – Porcentagem de apoptose induzida pelo composto (1) em cinco linhagens de

células leucêmicas humanas (U937, THP-1, MOLT-4, JURKAT e HL-60), determinada por

microscopia de fluorescência em três tempos diferentes, 12, 24 e 36 horas. n = 2; *P<0,05,

**P<0,01,***P<0,001.

U937

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

***


% A

popt

ose

***

**

***

***

***

***

**

***

THP-1

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

**

***

******

***

***


% A

popt

ose

* *

MOLT-4

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

* ****

***

***

******

JURKAT

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose ***

***

***

***

*

***

***

***

HL-60

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

12 h24 h36 h


% A

popt

ose

***

******

***

***

***


45




**P<0,01, ***P<0,001.

U937

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

***

***

***

***

***

***

***

THP-1

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

** *

MOLT-4

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

***

***

**

***

***

JURKAT

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

* ** *****

***

***

HL-60

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

12 h24 h36 h


% A

popt

ose

****

***

***

******


46




**P<0,01, ***P<0,001.

U937

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

*****

***

***

******

*

THP-1

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

* * * ****

***

MOLT-4

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

* *****

***

***

****** ***

******

***

***

JURKAT

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


% A

popt

ose

**

***

***

***

***

***

****

HL-60

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

12 h24 h36 h


% A

popt

ose

******


47

Os compostos foram testados também em células humanas normais (PBMC)

para determinar seu percentual de apoptose frente a essas células. Após a incubação

com os diferentes compostos as células foram coradas, levadas ao microscópio de

fluorescência e discriminadas em normais, apoptóticas e necróticas, segundo os

mesmos parâmetros descritos para células tumorais.

A figura 18 mostra a porcentagem de apoptose induzida pelos compostos (1), (2)

e (3) em células mononucleares do sangue periférico de doadores saudáveis após 12,

24, e 36 horas. Ao contrário do que ocorreu para células tumorais, os compostos 1 e 3

foram menos tóxicos quando comparados com o composto 2. O composto 2 foi o

menos ativo frente às células tumorais e o que mais induziu apoptose em células

normais. Os compostos 1 e 3 induziram altas taxas de apoptose nas concentrações de

200µM após 36 horas (83%) e 400µM após 24 e 36 horas (80 e 82% respectivamente),

enquanto que o composto 2 induziu altas taxas de apoptose já em 24 horas numa

concentração de 200µM (74,5%) e após 36 horas numa concentração de 100µM

(81,4%).


48

Figura 18 – Porcentagem de apoptose induzida pelo composto (1), (2) e (3) em células

mononucleares do sangue periférico de um individuo normal (PBMC), determinada por

microscopia de fluorescência em três tempos diferentes, 12, 24 e 36 horas. n=2, *P<0,05,

**P<0,01, ***P<0,001.

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Composto 1


% A

popt

ose

*

**

******

***

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Composto 2


% A

popt

ose

*

*****

*********

**

Composto 3

0.0 50.0 100.0 200.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

12 h24 h36 h


% A

popt

ose

****

***

******


49

5.2.1 – Avaliação da indução de apoptose mediada pelos sais dos compostos

Os sais FeCl3 e FeSO4 fazem parte das sínteses dos compostos (1) e (2) e do

composto 3, respectivamente. Ambos os sais foram testados a uma concentração de

400µM (maior concentração testada para os compostos) frente às mesmas cinco

células tumorais utilizadas nos testes anteriores (U937, THP-1, JURKAT, MOLT-4 e HL-

60) bem como frente as células normais (PBMC).

As figuras 19 e 20 mostram a taxa de apoptose induzida pelos sais comparada

com a apoptose ocorrida no grupo controle (células sem os compostos, nos gráficos é

mostrado como zero). Como podemos observar pelos gráficos, não houve diferença

significativa (P>0,05) entre as taxas de apoptose nas células tratadas com os sais

quando comparadas com o grupo controle. Nenhum dos dois sais foi capaz de induzir

apoptose em nenhuma das células testadas, inclusive nas células normais. As taxas de

apoptose só chegaram a 10% (após 36 horas) para células normais. Isso ocorre devido

às células normais serem mais suscetíveis a morrerem do que as células tumorais em

condições de cultivo, principalmente pelo fato de não conseguirem se dividir quando

não estão sob ativação. Por isso pode-se perceber também uma taxa de

aproximadamente 10% de apoptose no grupo controle.

Os sais também não induziram necrose (menos que 1%) em nenhuma das

células testadas, mesmo nas células normais (resultado não apresentado).


50

Figura 19 – Porcentagem de apoptose induzida pelo sal FeCl3, que faz parte da síntese dos

compostos (1) e (2), em cinco células leucêmicas humanas (U937, THP-1, MOLT-4, JURKAT e

HL-60) e em células normais (PBMC) determinada por microscopia de fluorescência em três

tempos diferentes, 12, 24 e 36 horas. n = 2; P>0,05.

U937

0 FeCl3 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

THP-1

0 FeCl3 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

JURKAT

0 FeCl3 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

MOLT-4

0 FeCl3 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

HL-60

0 FeCl3 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

PBMC

0 FeCl3 (400mM)0

102030405060708090

10012 h24 h36 h

% A

popt

ose


51

Figura 20 – Porcentagem de apoptose induzida pelo sal FeSO4, que faz parte da síntese

apenas do composto 3, em cinco células leucêmicas humanas (U937, THP-1, MOLT-4,

JURKAT e HL-60) e em células normais (PBMC) determinada por microscopia de fluorescência

em três tempos diferentes, 12, 24 e 36 horas. n = 2; P>0,05.

U937

0 FeSO4 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

THP-1

0 FeSO4 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

JURKAT

0 FeSO4 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

MOLT-4

0 FeSO4 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

HL-60

0 FeSO4 (400µM)0

102030405060708090

100

% A

popt

ose

PBMC

0 FeSO4 (400mM)0

102030405060708090

10012 h24 h36 h

% A

popt

ose


52

5.3 – Cálculo de dose efetiva 50% dos compostos (IC 50)

Para efeito de uma melhor comparação da atividade dos compostos frente as

diferentes células testadas foi feito o cálculo de dose efetiva 50% (concentração dos

compostos capaz de induzir morte em 50% das células tratadas). A IC50 foi determinada

utilizando o programa GraphPad Prism versão 4.0. através da curva de regressão não

linear, a partir dos dados apresentados nas figuras 15, 16 e 17.

Analisando os dados da tabela 2 pode-se observar, em geral, que o composto 1

possui os menores valores de IC50 e o composto 2 os maiores. A menor IC50 foi obtida

no tratamento das células U937 com o composto 1, onde 82,2 µM é capaz de induzir

morte em 50% das células após 36 horas. Pela tabela pode também perceber o quanto

as células THP-1 são resistentes aos compostos 2 e 3.

Tabela 2: Dose efetiva 50% dos compostos de ferro 1, 2 e 3.

Composto 1 (µM) Linhagem Celular 12 horas 24 horas 36 horas

U937 HL-60

MOLT-4 JURKAT THP-1

> 400 148,2 ± 1,06 82,2 ± 1,01 291,9 ± 1,04 203,2 ± 1,04 187,7 ± 1,02 > 400 331,4 ± 1,06 178,7 ± 1,08 > 400 289,5 ± 1,03 153,7 ± 1,02 > 400 212,3 ± 1,12 156,4 ± 1,04


U937 HL-60

MOLT-4 JURKAT THP-1

> 400 177,1 ± 1,08 109,9 ± 1,03 > 400 > 400 237,9 ± 1,03 > 400 > 400 300,2 ± 1,02 > 400 > 400 > 400 > 400 > 400 > 400


U937 HL-60

MOLT-4 JURKAT THP-1

> 400 289,1 ± 1,01 171,4 ± 1,02 > 400 > 400 >400 > 400 184,0 ± 1,12 104,4 ± 1,04 > 400 264,8 ± 1,04 207,8 ± 1,05 > 400 > 400 > 400


53

5.4 – Avaliação de apoptose por fragmentação de DNA em gel de agarose

O método DNA laddering foi utilizado para verificar a fragmentação

internucleosomal do DNA das céulas tumorais, para confirmar a apoptose induzida

pelos compostos. Células THP-1 e U937 foram incubadas durante 24 horas com 100 e

200µM dos compostos (1), (2) e (3). Após esse tempo, as células foram lavadas em

PBS (pH 7,4) e o DNA foi extraído através do kit Enhanced Apoptotic DNA Ladder

Detection Kit (BioVision). Após a extração, as amostras foram aplicadas em gel de

agarose 1,5% e a corrida foi feita a 50V durante 2 horas. O gel foi então corado,

visualizado e foto-documentado em transiluminador com luz ultravioleta.

Como pode ser observado na figura 21, todos os compostos foram capazes de

induzir fragmentação do DNA em células U937, tanto em 200µM quanto em 100µM

após 24 horas de incubação. Contudo, para a linhagem THP-1 somente o composto 1

foi capaz de induzir fragmentação do DNA em ambas as concentrações (200 e 100µM)

após 24 horas (fig. 22). O composto (2) não foi capaz de induzir apoptose nessa

linhagem celular em nenhuma das concentrações testadas e o composto (3) induziu

apoptose somente na concentração de 200µM.


54

Padrão C1-200 C1-1 00 C2-200 C2-100 C3-200 C3-100 Controle (µM)

Figura 21 – Eletroforese em gel de agarose para detecção de fragmentação do DNA de

células U937 tratadas com 100 e 200µM dos compostos (1), (2) e (3) durante 24 horas.

Padrão C1-200 C1-100 C2-200 C2-100 C3 -200 C3-100 Controle (µM)

Figura 22 – Eletroforese em gel de agarose para detecção de fragmentação do DNA de

células THP-1 tratadas com 100 e 200µM dos compostos (1), (2) e (3) durante 24

horas.


55

5.5 – Avaliação da atividade mitocôndrial através d e Microscopia Confocal (M.C.)

Para verificar a provável interação da mitocôndria com os compostos, foi utilizado

o corante fluorescente rodamina 123. Este marcador acumula-se seletivamente nas

mitocôndrias funcionais de uma maneira dependente do potencial transmembrana.

Céluas U937 foram incubadas com diferentes concentrações dos 3 compostos

durante 12, 24 e 36 horas. Após os tempos determinados a rodamina foi adicionada às

culturas, que foram mantidas no escuro por 30 minutos. Após esse tempo as células

foram observadas e em microscópio confocal utilizando um laser de argônio de 543nm.

A prancha 1 (a) e (b) mostra células U937 sem o tratamento com os compostos

(grupo controle). Nessas células observa-se que as mitocôndrias se encontram

organizadas na periferia da célula, ou seja, ao redor do núcleo, que nessas células

ocupa a maior parte do citoplasma. Na prancha 2, que mostra as células tratadas com

os compostos nas diferentes concentrações e tempos, pode-se notar que a

fluorescência é quase que uniforme por todo citoplasma da célula. Mesmo em 12 horas,

numa concentração de 100µM, para o composto (3) ou após 24 horas numa

concentração de 50µM para o composto (1) já se observa uma marcação uniforme por

toda a célula. Isso sugere o comprometimento mitocôndrial durante o processo de

apoptose.


56

Prancha 1 – Microscopia Confocal de células U937 analisadas após 36 horas. (a) e (b) controle

(células sem os compostos). A fluorescência se concentra ao redor do núcleo, aonde se encontra um

grande número de mitocôndrias.

b

a

25µm


57

b a

d c

e f 10µm


58

Prancha 2 – Microscopia Confocal de células U937 incubadas durante 12, 24 ou 36 horas com os

compostos 1, 2 e 3. (a) células incubadas durante 24 horas com 50µM do composto 1. (b) Células

incubadas com 200µM do composto 1 durante 12 horas. (c) células incubadas com 100µM do

composto 2 durante 24 horas. (d) células incubadas com 50µM do composto 2 durante 36 horas. (e)

células incubadas com 100 µM do composto 3 durante 12 horas. (f) células incubadas com 100 µM do

composto 3 durante 36 horas. Fluorescência difusa por todo citoplasma celular, evidenciando um

comprometimento mitocôndrial durante o processo de apoptose.


59

5.6 – Análise das células tumorais tratadas com os compostos por Microscopia

Eletrônica de Transmissão (M.E.T.)

A fim de avaliar as alterações induzidas pelos compostos, na ultra-estrutura das

células tumorais, as mesmas foram analisadas por Microscopia eletrônica de

transmissão. A linhagem celular monocítica U937 foi escolhida por ter se mostrado a

mais sensível aos compostos nos testes de indução de apoptose. As células foram

incubadas durante 24 horas com 50 e 100µM dos compostos. Após o tempo

determinado, as células foram lavadas e processadas de acordo com o item 4.9 para

posterior visualização em microscópio eletrônico de transmissão.

A prancha 3 mostra células U937 não tratadas (grupo controle) e tratadas com

50 e 100µM do composto (1) durante 24 horas. Podemos notar nas células normais que

o núcleo é grande e disforme, com cromatina difusa e não condensada. As

mitocôndrias e o RE aparecem normais e em grande número. Nas células tratadas com

o composto (1) podemos notar, mesmo em 50µM, áreas condensadas de cromatina na

periferia do núcleo e o inicio da fragmentação nuclear, marcas típicas de apoptose

(prancha 3c). Em 100µM, após 24 horas, observa-se a total fragmentação nuclear, o

colapso do reticulo endoplasmático e inúmeros vacúolos presentes no citoplasma

(prancha 3d). Tais características são marcas mais avançadas do processo de

apoptose.

A prancha 2 mostra os efeitos dos compostos (2) e (3) na ultra-estrutura das

células U937 após 24 horas. Em 50µM já aparecem áreas de cromatina condensada na

periferia do núcleo (prancha 4a). Com 100µM as áreas de cromatina condensada

aumentam, o núcleo começa a se encolher e já pode ser observado o inicio da

formação dos corpos apoptóticos e blebbing de membrana (prancha 4b). Para o

composto (3) o processo é semelhante. Com 50µM do composto já são observadas

áreas de cromatina condensada na periferia do núcleo (prancha 4c). Na concentração

de 100µM podemos notar a intensa condensação da cromatina e núcleo picnótico.


60

Prancha 3 – Efeito do tratamento com composto 1 na morfologia ultra-estrutural de células

U937 visualizado por microscopia eletrônica de transmissão. (a) e (b), grupo controle, células

sem os compostos. (c), células incubadas com 50µM do composto 1 durante 24 horas,

cromatina começa a se condensar na periferia. (d), células incubadas com 100µM do

composto 1 durante 24 horas, núcleo fragmentado, vacúolos são observados. M –

mitocôndria, N – núcleo, RE – Reticulo endoplasmático, V – vacúolos.

M

RE

N

N

N

N N

N

c d

M

M

RE

RE

RE

V

a b

2µm


61

Prancha 4 – Efeito do tratamento com os compostos 2 e 3 na morfologia ultra-estrutural de

células U937 visualizado por microscopia eletrônica de transmissão. (a), células incubadas

com 50µM do composto 2, cromatina condensada na periferia da célula. (b), células incubadas

com 100µM do composto 2, formação de corpos apoptóticos, núcleo diminui de tamanho. (c),

células incubadas com 50µM do composto 3, cromatina condensada na periferia da célula. (d),

células incubadas com 100µM do composto 3, encolhimento celular, núcleo pequenótico. M –

mitocôndria, N – núcleo, RE – Reticulo endoplasmático.

2µm

a

c

b

d

N

RE

M N

N

N

M

RE

M


62

5.7 – Determinação da toxicidade dos compostos in vivo (DL50)

A fim de verificar a toxicidade dos compostos in vivo, camundongos suíço albino,

não isogênicos, com 4-5 semanas, foram separados em grupos de 4 animais para cada

umas das concentrações para ambos os compostos (2 e 3). As concentrações

utilizadas para os dois compostos foram: 50, 75, 100, 150 e 250 mg kg-1. A figura 23

mostra a porcentagem de animais vivos de acordo com a concentração crescente dos

compostos. Os animais foram acompanhados por até 72 horas.

Como mostrado nos gráficos da figura 23, o composto (2) foi o mais tóxico para

os animais, causando a morte de 40% dos animais na concentração de 100 mg kg-1. A

DL50 para esse composto foi calculada em 108,5 mg kg-1. Assim como observado nos

experimentos in vitro o composto (3) foi menos tóxico para os camundongos. Podemos

observar no gráfico que até a concentração de 100 mg kg-1 todos os animais

permaneceram vivos após 72 horas. A DL50 para esse composto foi calculada em 147,2

mg kg-1.


63

Figura 23 – Ensaio de toxicidade in vivo dos compostos de coordenação 2 e 3. O

animais foram inoculados via intraperitoneal com diferentes concentrações dos

compostos testados. Os gráficos mostram a porcentagem de animais vivos de acordo

com a concentração dos compostos.

0 50 100 150 200 250 3000

102030405060708090

100110

Composto 2

mg/kg

Ani

mai

s vi

vos

(%)

0 50 100 150 200 250 3000

102030405060708090

100110

Composto 3

mg/kg

Ani

mai

s vi

vos

(%)

Borges F. V. Discussão

64

6 – Discussão O câncer se origina devido ao mau funcionamento de vários sistemas de

controle de uma célula (Sompayrac, 2004). Sem a ação adequada dos sistemas de

controle essa célula mutante sofre uma proliferação anormal que leva a formação de

uma população de células tumorais que cresce ativamente. A progressão do tumor

continua com mutações adicionais que ocorrem nas células em proliferação. Essas

mutações podem ter uma variedade de efeito nas células, mas eventualmente

resultam em um crescimento ainda mais acelerado (Cooper, 1993).

A quimioterapia ainda é hoje o tratamento terapêutico mais utilizado contra a

maior parte dos cânceres, sendo administrada sozinha ou em conjunto com outras

técnicas. No entanto, a resistência intrínseca e extrínseca a drogas antitumorais é o

maior obstáculo para o seu sucesso (Kohno et al., 2005). Desta forma, existem

diversas pesquisas em busca de novas drogas que possam atuar de forma mais

eficaz. Entre as abordagens utilizadas na busca de novas drogas está a síntese de

compostos metálicos que possam interagir com a molécula de DNA, baseada na

descoberta de que a o composto cis-[Pt(NH3)2Cl2] (cisplatina), age através dessa

interação (Burrows e Muller, 1998).

O composto cisplatina é administrado por via intravenosa e devido aos níveis

de íons cloreto na corrente sanguínea ser relativamente alto (100 mM) isso suprime

a hidrólise e mantêm o composto em um estado neutro. Uma vez dentro da célula a

concentração do íon cloreto diminui (~20 mM) facilitando a hidrólise. Isso resulta em

uma forma ativada cis-[Pt(NH3)2Cl(OH2)]+ (Jamieson e Lippard, 1999). Essas

espécies aquosas carregadas positivamente podem reagir com sítios nucleofílicos

de algumas macromoléculas intracelulares, formando aductos em proteínas, RNA e

DNA. Esses aductos por sua vez, bloqueiam a replicação e a transcrição do DNA

induzindo morte celular através de mecanismos de apoptose ou necrose (Fuertes et.

al., 2003).

Dentre os compostos sintetizados como esse objetivo, estão os compostos

produzidos pela equipe dos professores Adolfo Horn Jr e Christiane Fernandes.

Fernandes e colaboradores em 2006 demonstraram que o composto de

coordenação [Cu(HPClNOL)Cl]Cl foi capaz de clivar o DNA plasmidial pB II KS+ e


65

induzir apoptose em células THP-1. Acredita-se que o mecanismo de clivagem do

DNA utilizado seja via hidrólise, uma vez que os experimentos conduzidos na

ausência e presença de oxigênio mostraram resultados similares. A clivagem da

forma superenovelada e da forma linear foram significativamente diferentes mesmo

na presença de oxigênio. Além disso, o mecanismo aceito para a clivagem via

hidrólise por alguns complexos metálicos é pela substituição de moléculas lábeis por

um grupo fosfato do DNA, seguido de um ataque nucleófilo intramolecular, não

liberando desta forma o fosfato, que permanece coordenado ao cobre, para a

religação da fita de DNA. Outro composto sintetizado pelo mesmo grupo também foi

testado quanto sua atividade nucleásica. Em 2008, Parrilha e colaboradores

mostraram que o composto 3, [Fe(HPClNOL)(SO4)]2-µ-oxo · 6H2O, foi capaz de

promover a clivagem do DNA fita dupla e fita simples em concentrações muito

baixas e pH fisiológico, tanto em ambiente aeróbico quanto em anaeróbico. O que

indica que o processo de clivagem deve seguir um mecanismo hidrolítico. Além

desses, outros compostos semelhantes também apresentaram o mesmo processo

de clivagem do DNA, como por exemplo [Fe2(BPClNOL)2(H2O)2]2+ (Neves et al.,

2001), [Fe2(IDB)2(µ-O)(µ-OAc)2]Cl2 (Liu et al., 2002) e Zn2HP (Sissi et al., 2001).

Com bases nesses resultados, mais dois compostos de estruturas similares,

[Fe(HPClNOL)(Cl)2]NO3 (composto 2), [Fe(HPClNOL)Cl]2-µ-O.2NO3.CH3OH

(composto 1), foram sintetizados pelo mesmo grupo.

Baseado em suas características químicas, os três compostos de

coordenação foram testados quanto sua atividade antitumoral in vitro, bem como sua

toxicidade in vitro e in vivo. Primeiramente, os compostos (1), (2) e (3), foram

colocados em culturas com diferentes linhagens celulares para verificar seu efeito

citotóxico ou citostático. Após 72 horas de incubação foi verificado que os três

compostos promoveram um efeito citotóxico em todas as células tumorais testadas

(figs. 12 e 13). Mesmo na concentração de 50µM, todos os compostos foram

capazes de provocar uma redução significativa no número de células tumorais

quando comparado com grupo controle. A linhagem HL-60 mostrou-se mais

resistente quando comparada as demais (inclusive THP-1), como pode ser

observado nos gráficos da figura 12 para os compostos (2) e (3) na concentração de

50µM. Uma provável explicação para essa diferença é que essas células se replicam


66

em uma velocidade muito maior que as demais linhagens, por isso, em 72 horas o

crescimento das células HL-60 supera o efeito inibidor do composto para

concentração de 50µM. Os sais FeCl3 e FeSO4 que fazem parte das sínteses dos

compostos (1) e (2) e do composto 3, respectivamente, também foram testados

frente as células tumorais (figs. 19 e 20). Como pode ser observado nos gráficos

dessas figuras, nenhum dos dois sais foi capaz de induzir apoptose nas 5 linhagens

celulares testadas (P>0,05).

A morte celular programada ou apoptose é a principal forma de morte celular

e é central para diversos processos biológicos. A apoptose pode ser ativada em

resposta a estímulos específicos ou a várias formas de injúria ou estresse celular

(Hannun, 1997). A maioria das drogas com diferentes estruturas e especificidades

induzem mudanças morfológicas características associadas com apoptose, e

acredita-se que vias apoptóticas contribuem para ação citotóxica da maioria das

drogas quimioterapêuticas (Lowe e Lin, 2000). Os compostos foram então testados

quanto ao potencial de indução de apoptose. Diferente da apoptose, a morte celular

por necrose se processa como uma resposta a estímulos agressivos, como a

exposição a tóxicos. Na necrose ocorre liberação de citocinas provocando resposta

inflamatória no local, fato que difere da morte por apoptose (Ziegler e Groscurth,

2004).

Os compostos foram, então, testados quanto sua capacidade de induzir

apoptose ou necrose em cinco linhagens de células tumorais. Os gráficos das

figuras 15, 16 e 17 mostram apenas a porcentagem de apoptose induzida pelos três

compostos de ferro, já que as taxas de necrose não excederam os 3% para todos os

compostos em todas as concentrações testadas, mesmo após 36 horas O composto

(1) mostrou ser o mais eficiente na indução de apoptose quando comparado aos

compostos (2) e (3). Esse composto foi capaz de induzir uma significativa taxa de

apoptose em todas as células testadas. Diferentemente do composto (1), os

compostos (2) e (3) não foram capazes de induzir altas taxa de apoptose em todas

as células. A linhagem THP-1 mostrou-se resistente a esses dois compostos, nos

tempos e concentrações testadas, apesar de se mostrar susceptível aos compostos

no teste de citotoxicidade. Essa diferença pode ser devido ao tempo de incubação,

que para o teste de citotoxicidade foi de 72 horas contra no máximo 36 horas para


67

os testes de apoptose. De uma forma geral, o composto (2), mononuclear, foi o

menos eficiente na indução de apoptose e a linhagem celular U937 a mais

susceptível aos três compostos. De maneira interessante, essa linhagem foi a mais

resistente para os compostos de cobre sintetizados pelo mesmo grupo, e a linhagem

THP-1, que se mostrou mais resistente aos compostos de ferro, foi a mais

susceptível aos compostos de cobre (Fernandes et. al., 2006; Cortês, 2007).

Os sais FeCl3 e FeSO4 também foram testados quanto sua capacidade de

induzir apoptose ou necrose nas linhagens celulares utilizadas. De acordo com os

experimentos de citotoxicidade, nenhum dos sais foi capaz de induzir apoptose ou

necrose nas células testadas (P>0,05), o que indica que a ação dos compostos é

devido ao ligante (HPClNOL) coordenado ao íon de ferro doado pelos sais.

A morte por apoptose também foi comprovada pela análise da fragmentação

do DNA das células tumorais em gel de agarose. Nessa técnica, apesar de não ser

possível quantificar, é possível identificar o processo apoptose através de um padrão

característico denominado “DNA ladder”, como conseqüência da clivagem do DNA

em regiões nucleossômicas. Os três compostos foram capazes de induzir apoptose

em células U937 em ambas as concentrações testadas (100 e 200µM) como pode

ser observado na figura 21. Para a linhagem THP-1 somente o composto (1) foi

capaz de induzir apoptose nas concentrações testadas de 100 e 200µM (figura 22)

após 24 horas, de uma maneira dose dependente. Contudo, o composto (2) não foi

capaz de induzir apoptose nessa linhagem celular nas concentrações e tempos

testados. O composto (3) foi capaz de induzir apoptose nessa célula somente na

concentração de 200µM. Esses resultados estão de acordo com o que foi verificado

pela microscopia de fluorescência para os compostos e para as linhagens U937 e

THP-1 (figs. 15, 16 e 17).

O efeito tóxico dos compostos foi avaliado frente à células mononucleares do

sangue periférico humanas. O ensaio com MTT mostrou que os compostos foram

significativamente tóxicos para células normais, porém em menor intensidade que

para células tumorais. O composto cisplatina, rotineiramente utilizado no tratamento

de diversos tipos de câncer, foi utilizado como método de comparação e também foi

tóxico às células normais, talvez até mais do que os compostos testados, visto que a

cisplatina foi utilizada em uma concentração menor que a dos outros compostos


68

(25µM). O composto (3) apresentou uma menor toxicidade quando comparado aos

outros dois compostos e com o composto cisplatina. Somente a concentração de

200µM foi considerada significativa na redução da viabilidade das células normais.

Os testes de indução de apoptose nas células normais mostrou que o

composto (2), menos ativo frente à células tumorais, foi o mais tóxico para células

normais. Na concentração de 50µM após 36 horas e 100µM após 24 horas, os níveis

de apoptose já eram significativos. Os compostos (1) e (3) foram similares quanto a

indução de apoptose nas PBMC humanas. Deve ser considerado para esse

experimento que mesmo na presença do ativador inespecífico enterotoxina B

estafilocócica (SEB), responsável pela ativação das células, estas apresentavam

uma taxa basal de apoptose de aproximadamente 10%, como pode ser observado

no grupo controle. A taxa de necrose para células normais (PBMC) não ultrapassou

os 4% (dados não apresentados). Os sais FeCl3 e FeSO4 não apresentaram efeito

tóxico frente à células normais, como pode ser observado nas figuras 16, e 17.

Juntos esses resultados mostram que os compostos (1) e (3) apesar de induzirem

apoptose em células normais, são menos tóxicos para essas do que para as células

tumorais. Para o teste de citotoxicidade utilizando MTT o composto (3) foi menos

tóxico do que a cisplatina, utilizada em uma concentração inferior ao desse

composto (25µM).

A Microscopia Eletrônica de Transmissão revelou as alterações ultra-

estruturais, causadas pelos compostos, em células U937 tratadas. Como mostrado

nas pranchas 1 e 2, mesmo em uma concentração de 50µM após 24 horas, sinais

clássicos do processo de apoptose são evidentes. Nesse estágio a cromatina

começa a se condensar na periferia celular (áreas mais escuras no núcleo). Essa

característica não é possível de ser observada na microscopia de fluorescência, por

isso, é observado uma baixa taxa de apoptose nessa concentração no tempo de 24

horas. Contudo, fica claro que o processo de apoptose já foi iniciado. Na

concentração de 100µM o processo já esta mais avançado como mostrado nas

pranchas 1 e 2. A cromatina já esta mais condensada, o núcleo já aparece

fragmentado ou pequeno (núcleo pequenótico), a célula sofre um processo de

encolhimento e já pode ser observado o inicio da formação dos corpos apoptóticos

(blebbing de membrana). Não foram observadas células em necrose nessas


69

concentrações no tempo de 24 horas. Esses resultados, reforçam o que foi

observado pela microscopia de fluorescência e pela fragmentação do DNA em gel

de agarose. Os compostos (1), (2) e (3) induzem apoptose, mas não induzem

necrose em células tumorais, nas concentrações e tempos testados.

Através de estudos sobre o padrão de ativação de caspases seguido de

diferentes estímulos apoptóticos, pelo menos duas distintas vias foram elucidadas. A

via mitocondrial e a via dos receptores de morte (via mitocôndria independente), que

podem ser divididas em três estágios: sinalização, ativação e execução (Schulze-

Osthoff et. al., 1998; Yu e Zhang, 2003). Confirmando a indução de apoptose pelos

compostos testados, procuramos um indicativo de qual das duas vias de apoptose

seria disparada pelos compostos.

Sabe-se que a alteração no potencial transmembrana mitocondrial é um dos

primeiros eventos a acontecer durante o processo de apoptose via mitocôndria

(Takahashi et al., 2004). Como pode ser observado nas figuras da prancha 2, pela

marcação difusa no citoplasma celular, percebe-se que o potencial transmembrana

mitocondrial é visivelmente afetado em concentrações e tempos em que ainda não

podemos perceber uma taxa significativa de apoptose. Esse resultado sugere o

comprometimento mitocôndrial durante os primeiros estágios do processo de

apoptose. Contudo, estudos complementares a fim de esclarecer a real participação

da via mitocôndrial na indução desse processo são necessários. Além disso, nossos

estudos não nos permitem excluir a indução de apoptose através da via dos

receptores de morte.

A toxicidade dos composto (2) e (3) foi determinada in vivo como mostra a

figura 19. O conhecimento do parâmetro DL50 é fundamental para avaliação da

toxicidade de compostos experimentados em animais. Como se esperava, o

composto (2) também foi o mais tóxico in vivo quando comparado ao composto (3).

A DL50 para o composto (2) foi de 108,5 mg kg-1 e para o composto (3) em 147,2 mg

kg-1. A DL50 da cisplatina administrada via intraperitoneal é descrita na literatura

como estando na ordem de 4,33 x10-5, ou seja, aproximadamente 50 mg kg-1 (Hydes

e Russel, 1988). Outros compostos mostram valores ainda menores de DL50, como

por exemplo o composto de cobre CuNG, [copper N-(2-hydroxy acetophenone)

glycinate] que possui uma DL50 de 35 mg kg-1 (Majumder et al., 2003). A


70

comparação desses valores com os resultados obtidos nesse trabalho indicam que

os compostos mono e dinucleares de ferro testados possuem toxicidade inferior que

a de alguns compostos descritos na literatura, inclusive toxicidade inferior a da

cisplatina que é clinicamente utilizada no tratamento de inúmeros tipos de câncer.

Para definir melhor o mecanismo pelo qual os compostos induzem apoptose

nas células testadas (incluindo qual via de apoptose esta ativada) serão necessários

mais estudos, inclusive para verificar se eles realmente conseguem interagir com o

DNA presente no núcleo celular, considerando que existe um ambiente celular com

diferentes moléculas que também podem interagir com os compostos. O que

sabemos até momento, é que a via de resposta a danos ao DNA utilizando p53 já

pode ser excluída como o único mecanismo de ação, desses compostos, uma vez

que as células testadas ou possuem a proteína p53 não funcional – linhagens THP-

1, U937 e MOLT-4 – ou simplesmente não expressam tal proteína – linhagens HL-60

e JURKAT. (Marchini et al., 1999; Sugimoto et al., 1992; Bhatia et al., 1995). Além

disso, tais constatações nos indicam que o prosseguimento das pesquisas com os

compostos de ferro Fe(HPClNOL)(Cl)2]NO3 (2), [Fe(HPClNOL)Cl]2-µ-O.2NO3.CH3OH

(1) e [Fe(HPClNOL)(SO4)]2-µ-O.9H2O (3) (como por exemplo para determinação da

dose terapêutica em camundongos com tumor), é um trabalho que merece maior

atenção, sendo bastante promissor.

Borges F. V. Conclusões

71

7 – Conclusões

Os resultados aqui apresentados nos permitem concluir que:

� Para os três compostos testados nesse trabalho foi observado um efeito

citotóxico frente todas as linhagens celulares testadas, mesmo na menor

concentração após 72 horas.

� Os três compostos foram capazes de induzir apoptose em células

tumorais de maneira dose dependente. Sendo que a linhagem THP-1 se

mostrou resistente aos compostos (2) e (3) e a linhagem HL-60 mais

resistente ao composto (3), nos tempos e concentrações testados.

� A apoptose foi comprovada através da análise do padrão “ladder” de

fragmentação do DNA em regiões nucleossômicas e através da

microscopia eletrônica de transmissão, que evidenciou alterações típicas

do processo de apoptose na ultra-estrutura de células U937 tratadas com

os compostos.

� Os compostos foram tóxicos para células normais in vitro. Porém, a

toxicidade foi menor quando comparado com as células tumorais. O

composto (2) foi o mais tóxico in vitro, seguido pelos compostos (1) e (3),

respectivamente. O composto (3) foi ainda menos tóxico do que a

cisplatina (25µM) nas concentrações de 50 e 100µM.

� A Microscopia Confocal mostrou evidências de que a via de apoptose

ativada pelos compostos pode ser a via mitocondrial.

� O composto (2) foi também o mais tóxico in vivo com a DL50 calculada em

108,5 mg kg-1 contra 147,2 mg kg-1 do composto (3). Comparando com

dados da literatura, esses compostos mostraram ser menos tóxicos do que

o composto cisplatina in vivo.

Borges F. V. Referências Bibliográficas

72

8 – Referências bibliográficas

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