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EDUARDA FRATONI
AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA, CITOTÓXICA E
TOXICOLÓGICA DE EXTRATOS E COMPOSTOS DAS
CASCAS E FOLHAS DE Drimys brasiliensis
Itajaí (SC)
2017
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
EDUARDA FRATONI
AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA, CITOTÓXICA E
TOXICOLÓGICA DE EXTRATOS E COMPOSTOS DAS
CASCAS E FOLHAS DE Drimys brasiliensis
Dissertação submetida à
Universidade do Vale do Itajaí como
parte dos requisitos para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Angela
Malheiros
Itajaí (SC)
Junho de 2017
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Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi – CRB- 14/963
F865a
Fratoni, Eduarda, 1993-
Avaliação fitoquímica, citotóxica e toxicológica de extratos e
compostos das cascas e folhas de Drimys brasiliensis [manuscrito] /
Eduarda Fratoni. – Itajaí, SC. 2017.
146 f. ; il. ; tab.
Referências: p. 123-141.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte
dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
“ Orientadora: Profª. Dra. Angela Malheiros.”
1. Plantas medicinais. 2. Extratos vegetais. 3. Produtos naturais. 4.
Toxicidade.
I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.
CDU: 615.32
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Aos meus pais, Evaldo e Marileia
e minha irmã Angela.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente aos meus pais, Evaldo e Marileia, por todos os
ensinamentos, força e amor. Sem vocês eu não teria chegado até aqui!
À minha irmã Angela, pelas conversas e apoio, nunca me deixando
sozinha nos momentos que eu mais precisei. Amo você!
À minha orientadora Profa. Dra. Angela Malheiros, que por 6 anos me
transmitiu conhecimento e sabedoria. Obrigada pela amizade e
companheirismo. Te admiro muito!
Agradeço ao Prof. Dr. Rivaldo Niero, que me ensinou não só química,
mas ser uma excelente profissional.
À minha família de Itajaí, meus tios e primos que me acolheram ao
longo desse tempo. Obrigada por todos os momentos juntos!
A todos os familiares que sempre torceram e me motivaram nessa
caminhada.
Ao Prof. Dr. José Roberto Santin pelos ensaios toxicológicos e outras
tantas ajudas no desenvolvimento deste trabalho.
À Tailyn Zermiani e à Amanda Ellen de Athayde, por toda ajuda nos
ensaios analíticos e pela grande amizade.
Ao Prof. Theodoro Maciel Wagner pelos ensinamentos e análises no
cromatógrafo gasoso.
Ao CIPOI-UNICAMP, principalmente ao Alexandre Eduardo Nowill e
Gilberto Carlos Franchi Jr pelos ensaios de citotoxicidade.
Ao Prof. Dr. Clóvis Antônio Rodrigues pela ajuda no infravermelho.
Ao Laboratório Escola de Análises Clínicas (LEAC) pelo
processamento das amostras biológicas.
Ao Pedro Pablo Perez Netto pelas análises de RMN.
Ao Prof. Dr. Leo Lynce Valle de Lacerda pelo auxílio nas análises
estatística.
A Profa Dra. Ruth Meri Lucinda por me proporcionar a participação no
projeto Duas Rodas.
Agradeço muito por ter cruzado com tantas vidas durante todo tempo
no laboratório. Obrigada Sarah, Joana, Ingrid, Raisa, Greice, Pâmela, Emili,
Marcel, Tiago, Miguel, Deivisson, Martina, Luísa, Camile, Giovana,
Adriana, Thaísa, Tailyn, Letícia, Anna Rocha, Ana Cristina, Amanda,
Adavielly e tantos outros, por dividirem conhecimento e boas risadas
diariamente.
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Agradeço em especial a minha amiga Ivi, por todos os momentos,
dentro e fora do laboratório. Você foi muito importante no desenvolvimento
deste trabalho. Obrigada por tudo!
A todos meus amigos que sempre me incentivaram e me
proporcionaram momentos inesquecíveis, pois “amigos são como o vento: às
vezes perto, outras longe, mas eternos em nossos corações”.
Agradeço aos professores participantes da banca examinadora que se
disponibilizaram e dividiram comigo este momento tão importante e
esperado.
A todos os professores do PPGCF que transmitiram seus conhecimentos
e me sanaram dúvidas.
A instituição Universidade do Vale do Itajaí, estendendo-se a todos os
funcionários e laboratórios.
A Capes pela bolsa de mestrado e o CNPq e FAPESC pelo auxílio
financeiro.
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“Se eu vi mais longe, foi por estar sobre ombros de gigantes. ”
Isaac Newton
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AVALIAÇÃO FITOQUÍMICA, CITOTÓXICA E
TOXICOLÓGICA DE EXTRATOS E COMPOSTOS DAS
CASCAS E FOLHAS DE Drimys brasiliensis
Eduarda Fratoni
Junho de 2017
Orientador: Angela Malheiros, Dra.
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias bioativas
Número de Páginas: 146.
A Drimys brasiliensis apresenta grande interesse como fonte de sesquiterpenos
drimanos com propriedades antitumorais. Assim, o presente estudo tem como
objetivo avaliar por métodos fitoquímicos o extrato das folhas e cascas e analisar a
citotoxicidade in vitro e a toxicidade in vivo de sesquiterpenos drimanos e extratos
das cascas de D. brasiliensis. Para a obtenção das soluções extrativas foram utilizados
os solventes diclorometano (DCM) e hexano, proporção droga vegetal:solvente 1:10
e 1:20 (m/v) e tempo de maceração dinâmica 2 e 6 h. Os extratos foram avaliados em
relação a massa e qualitativamente por cromatografia em camada delgada (CCD) e
cromatografia a gás (GC). Os drimanos drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial
(2), 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3) foram quantificados por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE). A citotoxicidade dos extratos foi avaliada em
células de leucemia mieloide crônica (K562), linfoblástica aguda B (Nalm6) e os
drimanos em células de linfoma de Burkitt (RAMOS e RAJI), linfoma histiocítico
difuso (U937), leucemia linfoblástica aguda de célula T (MOLT4), leucemia linfoide
aguda (REH e B15), osteossarcoma (HOS) e carcinoma de pulmão de não pequenas
células (NCI-H1299), utilizando o método do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazólio (MTT). Os efeitos tóxicos do extrato hidroetanólico foi
determinado pelos ensaios de toxicologia aguda, teste do micronúcleo e hemólise.
Para o isolamento, o extrato das folhas foi submetido a processos cromatográficos e
posteriormente as substâncias isoladas foram elucidadas por técnicas
espectroscópicas de infravermelho (IV), massas e ressonância magnética nuclear
(RMN). A CCD e a CG se mostraram técnicas viáveis para a análise qualitativa dos
extratos e a CLAE foi precisa e eficiente para a quantificação dos drimanos 1, 2 e 3.
O processo extrativo que resultou nos melhores rendimentos em massa e
concentração dos drimanos foi utilizando solvente DCM, na proporção 1:10 e no
tempo de 6 h. Os extratos de DCM e hexano apresentaram resultados entre 20,37 a
11,91 µg/mL para as células K562 e Nalm6. Já os drimanos isolados exibiram efeitos
citotóxicos com valores de CI50 que variaram de 14,03 a 0,13 µM. O composto 2
demonstrou resultado significativos para as células U937, MOLT4 e B15 com CI50
1,29, 1,77 e 1,74 μM e o driamano 3 para as células RAJI, MOLT4 e REH com CI50
de 0,80, 0,13 e 1,17 μM respectivamente. O extrato hidroetanólico das cascas não
exibiu efeitos toxicológicos no teste de dose fixa, não apresentou mutagênicidade in
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vivo e não causou hemólise das células eritrocitárias. Foi possível isolar dos extratos
das folhas 4 compostos, um álcool graxo, uma lignana a (8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R)-
bicubebina, e os sesquiterpenos criptomeridiol e o 1-β-(p-
metoxicinamil)dendocarbin-A. Os resultados mostram que as cascas não apresentam
toxicidade e são uma fonte de sesquiterpenos drimanos ativos. As folhas dessa
espécie possuem lignanas e outroas sesquiterpenos drimanos de interesse, exibindo a
importância química e medicinal.
Palavras-chave: D. brasiliensis. Drimano. CLAE. Toxicidade.
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PHYTOCHEMICAL, CYTOTOXIC AND
TOXICOLOGICAL EVALUATION OF EXTRACTS
AND COMPOUNDS OF BARK AND LEAVES OF Drimys
brasiliensis
Eduarda Fratoni
June 2017
Supervisor: Angela Malheiros, PhD.
Area of Concentration: Natural products and bioactive substances
Number of Pages: 146.
Drimys brasiliensis presents great interest as a source of drimane sesquiterpenes with
antitumor properties. The present study aims to evaluate its bark and leaf extracts by
phytochemical methods and to analyze the in vitro cytotoxicity and in vivo toxicity of
drimane sesquiterpenes and extracts of D. brasiliensis bark. To obtain the extractive
solutions, the solvents used were dichloromethane (DCM) and hexane, at
plant:solvent ratios of 1:10 and 1:20 (w/v) and dynamic maceration times of 2h and 6
h, respectively. The extracts were evaluated in relation to mass, and qualitatively by
thin layer chromatography (TLC) and gas chromatography (GC). The drimanial (1),
1-β-(p-cumaroyloxy)-polygodial (2), and 1-β-(p-methoxycinnamoyl)-polygodial (3)
were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The
cytotoxicity of the extracts was evaluated in cells of chronic myeloid leukemia
(K562), acute lymphoblastic B leukemia (Nalm6) and the drimanes in Burkitt's
lymphoma cells (RAMOS and RAJI), diffuse histiocytic lymphoma (U937), acute T-
cell lymphoblastic leukemia (MOLT4), acute lymphocytic leukemia (REH and B15),
osteosarcoma (HOS) and non-small cell lung carcinoma (NCI-H1299) using the 3-
(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) method. The
toxic effects of the hydroethanolic extract were determined by the acute toxicology,
micronucleus, and hemolysis tests. For the isolation, the leaf extract was submitted to
chromatographic processes and later, the isolated substances were elucidated by
spectroscopic techniques of infrared (IR), masses and nuclear magnetic resonance
(NMR). TLC and GC were feasible techniques for qualitative analysis of the extracts,
and HPLC was accurate and efficient for the quantification of drimanes 1, 2 and 3.
The extractive process that resulted in the best mass yield and concentration of the
drimanes was the use of DCM solvent, at a ratio of 1:10 and time of 6 h. The DCM
and hexane extracts showed results of between 20.37 and 11.91 μg/mL for K562 and
Nalm6 cells. The isolated drimanes exhibited cytotoxic effects, with IC50 values
ranging from 14.03 to 0.13 μM. Compound 2 demonstrated significant results for
U937, MOLT4 and B15 cells with IC50 of 1.29, 1.77 and 1.74 μM and drimane 3 for
RAJI, MOLT4 and REH cells, with IC50 of 0.80, 0.13 and 1.17 μM respectively. The
hydroethanolic bark extract showed no toxicological effects in the fixed dose test, did
not present mutagenicity in vivo, and did not cause hemolysis of the erythrocytic cells.
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From the leaves, it was possible to isolate 4 compounds; a fatty alcohol, a lignan to
(8S, 8'S, 8''R, 8''R, 9''R)-bicubebin, and the sesquiterpenes cryptomeridiol and 1-β-(p-
methoxycinnamoyl)dendocarbin-A. The results show that the bark is nontoxic and is
a source of active drimane sesquiterpenes. The leaves of this species have lignans and
other sesquiterpenes of interest, exhibiting chemical and medicinal importance.
Keywords: D. brasiliensis. Drimane. HPLC. Toxicity.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mutações genéticas do desenvolvimento do câncer. ................ 36 Figura 2 – Tipos de crescimento celular. ................................................... 37 Figura 3 – Aspectos gerais da planta D. brasiliensis. ................................ 47 Figura 4 – Perfis cromatográficos dos padrões 1-3 no comprimento de onda
de 310 nm e padrão 4 em 232 nm. .............................................................. 52 Figura 5 – Rendimento (g) dos extratos das cascas de D. brasiliensis na
avaliação do líquido extrator, proporção droga vegetal:solvente e tempo de
extração. ...................................................................................................... 73 Figura 6 – CCD dos extratos obtidos em hexano e DCM, 2 e 6 h na proporção
1:20 e drimanos 1-3 extraídos das cascas de D. brasiliensis. ...................... 73 Figura 7 – Perfil cromatográfico por CG dos padrões 1-3. ........................ 75 Figura 8 – Perfil cromatográfico por CG dos extratos em hexano e DCM das
cascas de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 2 horas. ................. 75 Figura 9 – Perfil cromatográfico por CG dos extratos em hexano e DCM das
cascas de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 6 horas. ................. 76 Figura 10 – Perfil cromatográfico por CLAE dos extratos em hexano e DCM
das cascas de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 2 horas. ........... 78 Figura 11 – Perfil cromatográfico por CLAE dos extratos em hexano e DCM
das cascas de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 6 horas. ........... 78 Figura 12 – Correlação linear do rendimento em massa (%) dos extratos com
o rendimento do drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) e 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial (3) (mg/g de extrato). ........................................ 79 Figura 13 – Concentração do drimanial (1) nos extratos das cascas de D.
brasiliensis na avaliados por CLAE. ........................................................... 82 Figura 14 – Concentração do 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) nos extratos
das cascas de D. brasiliensis na avaliados por CLAE. ................................ 82 Figura 15 – Concentração do 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3) nos
extratos das cascas de D. brasiliensis na avaliados por CLAE. .................. 83 Figura 16 – Comparação das concentrações dos compostos 1-3 nos extratos
de D. brasiliensis avaliados por CLAE e CG. ............................................. 85 Figura 17 – Peso acumulado dos animais tratados com extrato de D.
brasiliensis e grupo veículo. ....................................................................... 90
18
Figura 18 – Observações histopatológicas do fígado e rins dos animais
tratados com extrato de D. brasiliensis e o grupo veículo. Aumento: 400 x
..................................................................................................................... 92 Figura 19 – Porcentagem de hemólise dos heritrócitos do grupo veículo,
tratado com extrato de D. brasiliensis e Triton-X. ...................................... 95 Figura 20 – Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato
clorofórmico das folhas de D. brasiliensis. ................................................. 97 Figura 21 – Espectro de IV do composto DBFA 19-33. ............................ 98 Figura 22 – Cromatograma e espectro de massas do composto DBFA 19-33.
..................................................................................................................... 98 Figura 23 – Espectro de IV do composto DBFA 14. ............................... 100 Figura 24 – Perfil cromatográfico por CG do composto DBFA 14. ........ 100 Figura 25 – Espectro de massas do composto DBFA 14. ........................ 101 Figura 26 – Principais fragmentações do DBFA 14. ................................ 101 Figura 27 – Espectro de RMN 1H (300 MHz, Piridina-d/TMS) do composto
DBFA 14. .................................................................................................. 102 Figura 28 – Espectro de RMN ¹3C (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto
DBFA 14. .................................................................................................. 103 Figura 29 – Espectro de DEPT (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto
DBFA 14. .................................................................................................. 103 Figura 30 – Correlações espacial entre 1H-1H (↔) obtidas do espectro de
NOESY do composto DBFA 14. .............................................................. 104 Figura 31 – Espectro de HSQC (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto
DBFA 14. .................................................................................................. 108 Figura 32 – Espectro de HMBC (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto
DBFA 14. .................................................................................................. 108 Figura 33 – Espectro de COSY (300 MHz, Piridina-d/TMS) do composto
DBFA 14. .................................................................................................. 109 Figura 34 – Espectro de NOESY (300 MHz, Piridina-d/TMS) do composto
DBFA 14. .................................................................................................. 109 Figura 35 – Espectro de massa do composto DBFA 26. .......................... 111 Figura 36 – Principais fragmentações do DBFA 26. ................................ 111 Figura 37 – Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do composto
DBFA 26. .................................................................................................. 112 Figura 38 – Espectro de RMN ¹3C (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto
DBFA 26. .................................................................................................. 112
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Figura 39 – Espectro de DEPT (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto
DBFA 26. .................................................................................................. 113 Figura 40 – Perfil cromatográfico por CG do composto DBFA 26. ........ 113 Figura 41 – Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do composto
DBFA 25-28. ............................................................................................. 116 Figura 42 – Espectro de RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto
DBFA 25-28. ............................................................................................. 117 Figura 43 – Espectro de DEPT (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto
DBFA 25-28. ............................................................................................. 117
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Rendimento dos extratos das cascas de Drimys brasiliensis. ... 72 Tabela 2 – Área em porcentagem dos compostos 1-3 nos extratos das cascas
de D. brasiliensis por CG. ........................................................................... 77 Tabela 3 – Concentração dos compostos 1-3 em mg/g dos extratos obtidos
das cascas de D. brasiliensis. ...................................................................... 80 Tabela 4 – Comparação das concentrações dos compostos 1-3 em mg/g dos
extratos obtidos das cascas de D. brasiliensis. ............................................ 84 Tabela 5 – Avaliação da viabilidade celular dos extratos das cascas de D.
brasiliensis nas linhagens celulares............................................................. 86 Tabela 6 – Avaliação da viabilidade celular dos compostos 1-3 nas linhagens
celulares. ..................................................................................................... 89 Tabela 7 – Consumo de água e ração dos animais tratados com o extrato de
D. brasiliensis e grupo veículo.................................................................... 90 Tabela 8 – Peso dos órgãos dos animais do grupo veículo e o grupo tratatado
com extrato de D. brasiliensis. .................................................................... 91 Tabela 9 – Parâmetros bioquímicos dos animais do grupo veículo e tratados
com extrato de D. brasiliensis. .................................................................... 92 Tabela 10 – Parâmetros hematológicos dos animais do grupo veículo e
tratados com extrato de D. brasiliensis. ...................................................... 93 Tabela 11 – Porcentagem dos eritrócitos policromáticos (PCE) e contento
micronúcleos (PCEMN) dos animais tratados com extratos da D. brasiliensis
e grupo veículo. ........................................................................................... 94 Tabela 12 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 1H para o
composto DBFA 14 e (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55). ......... 105 Tabela 13 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 13C e DEPT
para o composto DBFA 14 e (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55).
.................................................................................................................. 106 Tabela 14 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 1H e 13C para
o composto DBFA 26 e dados da literatura para o Criptomeridiol (15). .. 114 Tabela 15 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 1H para o
composto DBFA 25-28 e dados da literatura para o dendocarbin-A (36) e
drimanial (1). ............................................................................................. 118
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Tabela 16 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 13C para o
composto DBFA 25-28 e dados da literatura para o dendocarbin-A (36) e
drimanial (1). ............................................................................................. 119
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALP – Fosfatase alcalina
ALT – Alanina aminotransferase
AST - Aspartato aminotransferase
B15 – Célula de leucemia linfoide aguda
B16F10 – Célula de melanoma murino
CA – Coluna A
CB – Coluna B
CC – Coluna C
CCD – Cromatografia em camada delgada
CD – Coluna D
CE – Coluna E
CG – Cromatografia a gás
CG-FID – Cromatógrafo gasoso com detector de ionização de chama
CHCM – Concentração de hemoglobina corpuscular média
CI50 – Concentração inibitória mínima de 50 %
CIM – Concentração inibitória mínima
CIPOI – Centro integrado de pesquisa oncohematologica na infância
CIT – Centro de informações toxicológicas
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
CONCEA – Conselho nacional de controle de experimentação animal
DCM - Diclorometano
DL – Dose letal
DL50 – Dose letal de 50%
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Minimum Essential Medium
DMSO – Dimetilsulfóxido
DU145 – Célula de carcinoma de próstata
EPC – Eritrócitos policromáticos
EPCMN - Eritrócitos policromáticos contendo micronúcleo
Hb – Hemoglobina
HCM – Hemoglobina corpuscular média
HCT116 – Célula de carcinoma de cólon
HEPES – Ácido etanosulfônico de hidroxietil-piperazina
HL60 – Célula de leucemia promielocítica
HOS – Célula de osteossarcoma
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HTC – Hematócrito
IARC – International agency for research on cancer
INCA – Instituto nacional do câncer
IV – Infravermelho
K562 – Célula de leucemia mieloide crônica
KB – Célula de carcinoma epidermoide da boca
LLA – Célula de leucemia linfoide aguda
LLC – Célula de leucemia linfoide aguda
LMA – Célula de leucemia mieloide aguda
LMC – Célula de leucemia mieloide crônica
LPA – Célula de leucemia promielocítica aguda
LPC – Célula de leucemia promielocítica crônica
M – Metástase a distância
MCF-7 – Célula de adenocarcinoma mamário humano
MMS – Metil-metano-sulfóxido
MOLT4 – Célula de leucemia linfoblástica aguda de célula T
MTT – brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
N – Linfonodos
Nalm6 – Célula de linfoblástica aguda B
NCI-H1299 – Célula de carcinoma de pulmão de não pequenas células
OECD – Organization for economic co-operation and development
OMS – Organização Mundial da Saúde
OVCAR – Célula de carcinoma de ovário
PBS – Tampão fosfato-salino
PC3 – Célula de carcinoma de próstata
RAJI – Célula de Linfoma de Burkitt
RAMOS – Célula de linfoma de Burkitt
RBC – Eritrócitos
RDW – Distribuição das células vermelhas
REH – Célula de leucemia linfoide aguda
Rf – Retention factor
RMN – Ressonância magnética nuclear
SBF – Soro fetal bovino
SMMC-7721 – Célula de hepatoma humano
T – Tumor primário
T24 – Célula de carcinoma de bexiga
TGI – Inibição total de crescimento
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TR – Tempo de retenção
U139 – Célula de glioblastoma humano
U937 – Célula de linfoma histiocítico difuso
UICC – União Internacional Contra o Câncer
UV – Ultravioleta
VCM – Volume corpuscular médio
WBC – Leucócitos
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................ 29 2 OBJETIVOS ..................................................................................... 31 2.1 Objetivo Geral .................................................................................. 31 2.2 Objetivos Específicos ........................................................................ 31 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................ 33 3.1 Plantas medicinais ............................................................................ 33 3.2 Neoplasias .......................................................................................... 35 3.2.1 Aspectos gerais .................................................................................. 35 3.2.2 Leucemias e linfomas ......................................................................... 39 3.2.3 Sarcomas e carcinomas...................................................................... 41 3.3 Toxicologia ........................................................................................ 43 3.4 Drimys (Winteraceae) ....................................................................... 46 3.5 Sesquiterpenos drimanos ................................................................. 53 3.6 Métodos Cromatográficos ................................................................ 56 4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................. 60 4.1 Material ............................................................................................. 60 4.1.1 Material vegetal .................................................................................. 60 4.2 Obtenção e otimização do processo de extração dos drimanos..... 60 4.2.1 Análise dos extratos por CCD ............................................................ 62 4.2.2 Análise dos extratos por CG ............................................................... 62 4.2.3 Análise dos extratos por CLAE........................................................... 63 4.2.4 Apresentação e análise dos resultados do processo extrativo ............ 63 4.3 Estudo de citotoxicidade .................................................................. 64 4.3.1 Cultura de células ............................................................................... 64 4.3.2 Ensaio de citotoxicidade ..................................................................... 64 4.3.3 Apresentação e análise dos resultados de citotoxicidade ................... 65 4.4 Ensaios toxicológicos ........................................................................ 65 4.4.1 Animais ............................................................................................... 65 4.4.2 Toxicologia aguda (dose fixa) ............................................................ 66 4.4.3 Ensaio do micronúcleo ....................................................................... 67 4.4.4 Atividade hemolítica ........................................................................... 67 4.4.5 Apresentação e análise dos resultados toxicológicos ......................... 68 4.5 Isolamento de compostos das folhas de D. brasiliensis .................. 68 4.5.1 Obtenção do extrato ........................................................................... 68
28
4.5.2 Procedimentos experimentais gerais .................................................. 68 4.5.3 Isolamento e identificação dos compostos das folhas de D.
brasiliensis...……………………………………………………………….69 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................... 71 5.1 Otimização do processo de extração dos drimanos ........................ 71 5.1.1 Análise dos extratos por CCD ............................................................ 72 5.1.2 Análise dos extratos por CG ............................................................... 74 5.1.3 Análise dos extratos por CLAE ........................................................... 76 5.2 Atividade citotóxica .......................................................................... 86 5.3 Toxicologia......................................................................................... 88 5.3.1 Toxicologia aguda .............................................................................. 88 5.3.2 Teste do micronúcleo e atividade hemolítica ...................................... 94 5.4 Identificação dos compostos das folhas de D. brasiliesnis .............. 96 5.4.1 Composto DBFA 19-33 ....................................................................... 98 5.4.2 Composto DBFA 14 ............................................................................ 99 5.4.3 Composto DBFA 26 .......................................................................... 110 5.4.4 Composto DBFA 25-28 ..................................................................... 115 6 CONCLUSÕES .............................................................................. 121 REFERÊNCIAS ..................................................................................... 123 ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE
ANIMAIS – CEUA/UNIVALI .............................................................. 143
29
1 INTRODUÇÃO
O tratamento de doenças com produtos naturais, incluindo as plantas
medicinais, produtos de origem animal e minerais são formas antigas da
prática medicinal. A medicina tradicional ainda serve como base para a
investigação e desenvolvimentos de novos medicamentos (DAVID;
WOLFENDER; DIAS, 2015; LAHLOU, 2013). Estima-se que entre os anos
de 1981 e 2014, 32 % dos novos fármacos aprovados são compostos
derivados de produtos naturais, e 6 % são produtos naturais sem alterações
(NEWMAN; CRAGG, 2016).
O desenvolvimento de um fitoterápico ou um fitofármaco geralmente
começa nos centros de pesquisas das universidades. A partir da matéria-prima
vegetal são preparados extratos, esses passam por técnicas cromatográficas
variadas para a determinação da quantidade de ativos e comparação da sua
atividade em diversas condições (BRAGA, 2009). A preparação dos extratos
vegetais é uma etapa importante e necessita de cuidados para obter um extrato
de qualidade e com marcadores em concentração adequada para a atividade
biológica. A escolha do solvente também é de grande importância para que a
extração ocorra de forma a separar os compostos presentes no extrato
(FALKENBERG; SANTOS; SIMÕES, 2007).
Entre as plantas estudadas por pesquisadores do Núcleo de
Investigações Químico Farmacêuticas – UNIVALI (NIQFAR/UNIVALI) e
também em colaboração com outros Grupos de Pesquisa se destaca a espécie
Drimys brasiliensis. Sua atividade biológica vem sendo relata em diversos
modelos experimentais como antimicrobiana (SILVEIRA et al., 2012), anti-
inflamatória (MALHEIROS et al., 2005), leishmanicida e antimalarial
(CLAUDINO et al., 2013). Além das propriedades supracitadas a planta
apresenta potencial antitumoral, uma vez que a atividade do extrato das
cascas foi comprovada em linhagens de células tumorais de leucemia
mieloide (K562), linfoide aguda B (Nalm6), adenocarcinoma mamário
humano (MCF-7), melanoma murino (B16F10) e células HeLa
(CLAUDINO, 2011; SILVA, 2009). Os sesquiterpenos drimanos, drimanial
(1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2), 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3)
e poligodial (4) foram testados nas mesmas linhagens tumorais e em
linhagens de carcinoma de próstata (PC3) e carcinoma de ovário (OVCAR).
Todos apresentaram resultados promissores frente às células testadas. Alguns
30
resultados se destacam como os obtidos pelo composto 1-β-(p-cumaroiloxi)-
poligodial (2), nas células K562 e Nalm6 que apresentou resultados de
concentração inibitória mínima de 50 % (CI50) de 3,56 e 8,18 µM
respectivamente. O drimano 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3)
demonstrou maior atividade para a célula PC3, no qual apresentou um CI50
de 6,26 µM (CLAUDINO, 2011; FRATONI et al., 2014; SILVA, 2009).
O
O
CHO
CHO
OH
O
HO
O
O
CHO
CHO
Drimanial (1) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2)
O
O
CHO
CHOO
CHO
CHO
1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3) Poligodial (4)
Com base nos dados apresentados, pretendeu-se dar continuidade aos
estudos, buscando metodologias de análise cromatográfica como a CCD, CG
e CLAE para avaliação qualitativa e quantitativa dos drimanos isolados das
cascas de D. brasiliensis. Também pretendeu-se avaliar a toxicidade e
citotoxicidade, assim como isolamentos de novos metabólitos das folhas.
31
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar por métodos fitoquímicos o extrato das cascas e folhas e
analisar a citotoxicidade in vitro e a toxicidade in vivo de sesquiterpenos
drimanos e extratos das cascas de D. brasiliensis.
2.2 Objetivos Específicos
Obter extratos das cascas por maceração dinâmica variando solvente,
relação droga-solvente e tempo de extração;
Analisar qualitativamente os extratos das cascas por CCD e CG;
Quantificar os drimanos nos extratos das cascas por CLAE;
Analisar a citotoxicidade dos extratos das cascas em células K562 e
Nalm6 e os drimanos isolados em células RAMOS, RAJI, U937, MOLT4,
REH, B15, HOS e NCI-H1299;
Avaliar a segurança do extrato hidroetanólico 96 ºGL pelos ensaios de
toxicologia aguda, mutagenicidade e atividade hemolítica;
Isolar metabólitos secundários a partir do extrato das folhas, através de
técnicas cromatográficas;
Identificar os metabólitos secundários dos extratos das folhas por
técnicas espectroscópicas de IV, RMN e massas.
32
33
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Plantas medicinais
A humanidade vem utilizando a natureza a milhares de anos para suprir
suas necessidades, e as plantas tem sido a base da medicina tradicional há
muito tempo. Registros muitos antes de Cristo já mostravam o uso de plantas
como forma de medicamentos (CRAGG; NEWMAN, 2016; DUTRA et al.,
2016). Na Mesopotâmia é encontrado o primeiro registro da utilização de
plantas medicinas, no qual usavam óleos das espécies de Cedrus, Cupressus
sempevirens, Glicyrrhiza glabra, Commiphora species e Papaver
somniferum, e que ainda hoje são utilizados para o alívio de tosses, resfriados,
infecções e inflamações. O melhor registro farmacêutico encontrado até hoje
é o Ebers Papyrus, criado pelos egípcios em 1500 a.C., o qual documenta
cerca de 700 fármacos, a maioria oriundo de plantas, incluindo fórmulas e
forma de administração. Na medicina chinesa são encontrados documentos
desde 2700 a. C. abordando o uso de plantas e no antigo ocidente os gregos
também contribuíram com manuscritos para o uso racional de plantas
medicinais (ATANASOV, 2015; CRAGG; NEWMAN, 2016).
Atualmente as plantas ainda fazem parte da medicina tradicional em
todo mundo. É estimado que 70% da população mundial não tem acesso a
medicina convencional, recorrendo as plantas como principal fonte
terapêutica (PFERSCHY-WENZIG; BAUER, 2015). Por isso o estudo da
composição química e efeitos biológicos das plantas vem evoluindo cada vez
mais. Vários compostos que apresentam atividade biológica foram isolados
de plantas e são hoje empregados na clínica, como por exemplo a morfina,
salicina, codeína, pilocarpina, entre outros (CECHINEL-FILHO; YUNES,
2016).
As plantas medicinais possuem uma grande história no tratamento do
câncer. Entre os fármacos antineoplásicos mais conhecidos derivados de
plantas estão os alcaloides da vinca, vimblastina (5) e vincristina (6), isolados
da Catharanthus roseus. Atualmente estes alcaloides são utilizados no
tratamento de linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de ovário e
testículo e leucemia linfoblástica aguda infantil (BRANDÃO et al., 2010;
CRAGG; NEWMAN, 2016).
34
NH
N
OH
N
NO
O
OO O
HH
OH
H
O
O
NH
N
OH
N
NO
O
OO O
HH
OH
H
O
O
O
Vimblastina (5) Vincristina (6)
O paclitaxel (7) (Taxol®) outro potente agente anticâncer isolado das
cascas de Taxux brevifolia, é utilizado no tratamento de câncer de mama,
ovário e pulmão. O paclitaxel induz diferentes tipos de morte celular, seu
exato mecanismo é amplamente estudado, agem principalmente na
estabilização dos microtúbulos, inibindo a despolimerização dos mesmos. O
docetaxol (8) é um análogo ativo do paclitaxel, e é utilizado principalmente
para o tratamento de câncer de mama e pulmão. Os análogos dos taxanos tem
grande importância no desenvolvimento de agentes antineoplásicos, muitos
desses estão em fase de estudos clínicos e pré-clínicos (CRAGG; NEWMAN,
2016; LEE et al., 2016).
NH
O
OH
O
O
O
O
O
OH
OO
O
O
O
OH
NHO
O
OH
O
O
OHO
OH
OO
O
O
O
OH
Paclitaxel (7) Docetaxel (8)
Outra importante contribuição para o desenvolvimento de fármacos
antineoplásicos é a classe de agentes derivados da camptotecina (9), um
alcaloide isolado de uma árvore ornamental chinesa, Camptotheca acuminata
Decne. O extrato da C. acuminata apresentou atividade antitumoral e a
camptotecina foi estabelecida como o componente ativo. Nos ensaios pré-
clínicos realizados na década de 70, a substância demonstrou uma baixa
35
atividade cancerígena e ainda nos ensaios clínicos apresentou toxicidade para
os rins, mas após pesquisas realizadas, foram desenvolvidos o irinotecano
(10) e topotecano (11), dois análogos da camptotecina, utilizados para câncer
ovário, pulmão e cólon-retal (BRANDÃO et al., 2010; CRAGG; NEWMAN,
2016).
N
N
O
O
OOH
N
N
O
O
N
N
O
OH O
O
Camptotecina (9) Irinotecano (10)
OH
N
N
N
O
OH O
O
Topotecano (11)
3.2 Neoplasias
3.2.1 Aspectos gerais
O câncer vem se tornando a primeira causa de mortes em todo mundo,
sendo um dos principais problemas de saúde que a humanidade enfrenta.
Segundo estimativas do projeto Globocan 2012, da Agência Internacional
para Pesquisa em Câncer (IARC, do inglês International Agency for
Research on Cancer) da Organização Mundial da Saúde (OMS), houve 14,1
milhões de casos novos de câncer e um total de 8,2 milhões de mortes por
câncer, em todo o mundo. É estimado que morrerão 13,2 milhões de pessoas
pelo câncer e que 21,4 milhões de casos novos de câncer surgirão até 2030
(FERLAY, 2012). No Brasil o Instituto Nacional do Câncer (INCA) prevê
para os anos 2016/2017, aproximadamente 596 mil novos casos de câncer. A
maior incidência deve ser entre as mulheres, com 300.800 casos e em homens
295.200 casos (INCA, 2015).
36
O câncer surge no corpo por uma alteração nos genes do DNA, chamado
mutação genética (Figura 1). Esta alteração genética pode ocorrer em genes
conhecidos como proto-oncogenes, estes são inativos em células normais, no
entanto, quando ativados, estes proto-oncogenes transformam-se em
oncogenes, os quais são responsáveis pela malignização das células normais.
Passando então a denominar células cancerosas (INCA, 2017).
Figura 1 – Mutações genéticas do desenvolvimento do câncer.
Legenda: Mutações iniciais: Modificações em alguns genes, porém ainda não é
possível detectar um tumor clinicamente. 4º mutação: Proto-oncogenes se transforam
em oncogenes (células neoplásicas).
Fonte: INCA (2011).
O crescimento celular no organismo pode se dar de forma controlada e
não controlada. A hiperplasia, metaplasia e displasia são denominações de
crescimento celular controlado, já as neoplasias referem-se ao crescimento
não controlado, comumente conhecido por “tumor” (Figura 2). Os tumores
são classificados entre benignos e malignos, conforme a morfologia e a
biologia do processo tumoral. Os tumores malignos são conhecidos também
como câncer, que por sua vez, é caracterizado pela multiplicação e
propagação descontrolada no corpo de formas anormais das próprias células
corporais. É uma das principais causas de morte no mundo, sendo que a
maioria dos cânceres afetam os grupos etários mais avançados (BRASIL,
2016).
Os tumores malignos são diferenciados entre si dependo do tecido que
deriva o tumor. Quando a origem for de tecidos epiteliais de revestimento
interno e externo são denominados carcinomas, quando o epitélio for
glandular são chamados de adenocarcinomas. Os sarcomas são originários de
tecidos conjuntivos ou mesenquimais e as leucemias e linfomas tem origem
nos tecidos hemolinfopoetico (BRASIL, 2016).
37
Figura 2 – Tipos de crescimento celular.
Legenda: Hiperplasia e displasia são crescimentos celular controlado e reversível;
Neoplasia (câncer in situ e câncer invasivo) é crescimento celular descontrolado e
irreversível.
Fonte: INCA (2011).
O câncer quando detectado é classificado de acordo com a extensão do
tumor. O estadiamento como é chamado o método utilizado para a
classificação, pode ser clínico ou patológico. Estadiar um caso de neoplasia
maligna significa avaliar o seu grau de disseminação. A União Internacional
Contra o Câncer (UICC), preconiza o sistema de estadiamento denominado
Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos. Baseia-se na
anatomia da doença, como as características do tumor primário (T), as
características dos linfonodos das cadeias de drenagem linfática do órgão em
que o tumor se localiza (N) e a presença ou ausência de metástase (M) (INCA,
2011).
Segundo o manual ABC do Câncer do INCA (2011) os parâmetros do
sistema TNM recebem graduações, geralmente de T0 a T4; N0 a N3; e de M0
a M1, respectivamente.
Tumor primário (T):
Tx: tumor primário não pode ser avaliado;
T0: não há evidências de tumor primário;
Tis: carcinoma in situ;
T1: tumor < 2 cm;
T2: tumor > 2 cm < 5 cm;
T3: tumor > 5 cm;
T4: tumor com qualquer tamanho, com extensão à parede
torácica e/ou a pele.
38
Linfonodos (N):
Nx: linfonodos não podem ser avaliados;
N0: linfonodos sem sinal de metástase;
N1: metástase linfonodais leves;
N2: metástase linfonodais moderadas;
N3: metástase linfonodais graves.
Metástase a distância (M):
M0: ausência de metástase a distância;
M1: metástase a distância.
Quando essas categorias são agrupadas (T, N e M) em combinações pré-
estabelecidas, ficam distribuídas em estádios que variam de I a IV (Quadro
1). E estes podem ser subclassificados em A e B, assim expressando o nível
da evolução da doença.
Quadro 1 – Subdivisões do estadiamento do câncer.
Estádios Fases Tumor Linfonodo Metástase
0 Tis N0 M0
I
IA T1 N0 M0
IB T0 N1 M0
T1 N1 M0
II
IIA
T0 N1 M0
T1 N1 M0
T2 N0 M0
IIB T2 N1 M0
T3 N0 M0
III
IIIA
T0 N2 M0
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1 M0
T3 N2 M0
IIIB
T4 N0 M0
T4 N1 M0
T4 N2 M0
IIIC Qualquer T N3 M1
IV Qualquer T Qualquer N
Fonte: Adaptado de INCA (2011).
39
3.2.2 Leucemias e linfomas
A leucemia se caracteriza por uma proliferação neoplásica generalizada
ou acúmulo de células hematopoiéticas, com ou sem envolvimento periférico.
Na maioria dos casos, as células leucêmicas extravasam para o sangue, onde
podem ser vistas em grande número, podendo infiltrar-se no fígado, baço,
linfonodos e outros tecidos (GARCÍA; CABRERO; CAÑIZO, 2016).
Pacientes com leucemia comumente possuem sinais e sintomas que são
decorrentes da insuficiência da medula óssea e consequente infiltração de
células leucêmicas nos órgãos. Isto leva a sintomas como anemia,
hemorragias, infecções (deficiência de glóbulos brancos) e organomegalia
(fígado e baço principalmente). As leucemias são classificadas em linfoide
(comprometimento da linhagem linfoide) e mieloide (comprometimento da
linhagem mieloide) e são classificadas como agudas (crescimento rápido de
células imaturas do sangue) ou crônicas (aumento de células maduras, mas
anormais) (KUMAR et al., 2009). Outra classificação é de acordo com o grau
de maturidade das células afetadas, sendo: leucemia mieloide aguda (LMA)
e crônica (LMC), leucemia linfoide aguda (LLA) e crônica (LLC) e leucemia
promielocítica aguda (LPA) e crônica (LPC) (HAMERSCHLAK, 2010).
A leucemia é uma doença que progride rapidamente e por este motivo
deve ter seu tratamento iniciado logo após o diagnóstico, devido às
complicações causadas como síndromes anêmicas, leucopênica e
trombocitopênica ao paciente. As leucemias são estratificadas conforme
critérios citológicos, citogenéticos ou moleculares (ARBER et al., 2016).
Leucemias agudas caracterizam-se por serem de curta duração ou mesmo
com início rápido (semanas), e dificilmente é um achado em um exame
sanguíneo de rotina. As leucemias crônicas evoluem gradualmente e
apresentam-se de longa duração (MCCOYD; GRUENER; FOY, 2014).
As leucemias agudas caracterizam-se por um distúrbio das células
progenitoras hematopoiéticas no qual pode-se verificar a presença de mais de
20% de blastos na medula óssea identificados por meio de biopsia
(SCHOLAR, 2008; YUSUF, 2017). A leucemia aguda possui dois principais
subtipos; linfoblástica e mieloide. A leucemia linfoblástica ocorre
principalmente na infância enquanto a mieloide na vida adulta (após os 63
anos em média). O tratamento padrão para leucemia inclui quimioterapia com
uso de antraciclinas (doxorrubicina, idarubarin ou daungrubacina) e em
40
alguns casos o transplante é necessário (MCCOYD; GRUENER; FOY,
2014).
As leucemias crônicas acometem principalmente adultos. A leucemia
linfocítica crônica ocorre entre 65-70 anos, com leve predição para o sexo
feminino. É uma doença assintomática no início e que muitas vezes é
descoberto por meio de exame de sangue de rotina (MCCOYD; GRUENER;
FOY, 2014; PETERS et al., 2017).
A leucemia mieloide crônica é uma neoplasia clonal de células
estaminais hematopoiéticas, na qual há uma proliferação descontrolada de
células da linhagem granulocítica sem que ocorra a perda da capacidade de
diferenciação. A característica mais predominante é a aberração citogenética
ocasionada pela translocação entre cromossomos, resultando no cromossomo
Filadélfia (cromossomo Ph1). A leucemia mieloide crônica tem uma
prevalência ligeiramente maior no sexo masculino, podendo ocorrer em
qualquer idade, no entanto, mais de 50% dos casos acomete indivíduos com
idade acima de 65 anos (HANLON; COPLAND, 2017; PASIC; LIPTON,
2017).
Os linfomas ocorrem a partir da proliferação clonal de células linfoides
que se encontram em diferentes estágios de diferenciação. Os linfomas são
classificados em duas categorias distintas, sendo, os linfomas de Hodgkin e
os linfomas não-Hodgkin. De acordo com a OMS existem mais de 70
diferentes tipos de linfomas, sendo estes classificados em 4 grupos: neoplasia
de células B maduras, células T maduras e neoplasias de células natural killer,
linfoma de Hodgkin e distúrbios linfoproliferativos associados à
imunodeficiência (WAHED; DASGUPTA, 2015).
O linfoma de Hodgkin tem origem nos linfonodos do sistema linfático
que é formado por um conjunto de órgãos e tecidos, que produzem células
que são responsáveis pela imunidade e também constituem-se dos vasos
linfáticos que fazem a condução destas células pelo corpo. O linfoma de
Hodgkin desenvolve-se a partir do momento em que um linfócito
(normalmente Tipo B) se converte em uma célula maligna, passando a crescer
de forma descontrolada, esta célula começa a produzir clones nos linfonodos.
Estes clones passam a ser disseminados aos tecidos adjacentes e nos casos
em que não há tratamento, podem atingir outras partes do corpo, afetando
comumente o tórax (INCA, 2017).
O linfoma não-Hodgkin é um tipo de câncer caracterizado pela
proliferação anormal de células T, B ou ambas, afetando diretamente as
41
células do sistema linfático (PANDEY et al., 2017). O linfoma não-Hodgkin
constitui-se de um amplo espectro de doenças do sistema imunológico que
variam dos mais benignos aos malignos mais agressivos. Aproximadamente
85-90% dos linfomas não-Hodgkin derivam de células T ou NK. A
classificação desse linfoma segue conforme preconizado pela OMS (2016),
sendo neoplasias de células B maduras, células T maduras e células natural
killer (NK). Os perfis expressados pelos linfomas não-Hodgkin refletem a
célula de origem saudável da qual o linfoma foi derivado, no entanto, refletem
também mudanças decorrentes de alterações genéticas, epigenéticas entre
outras (ARBER et al., 2016).
Dentro os linfomas não-Hodgkin o linfoma de Burkitt é o câncer que se
prolifera mais rapidamente e progride com muita rapidez tendendo a
disseminar pelo sistema nervoso central, caracterizando-o como muito
agressivo (ARMITAGE et al., 2017).
3.2.3 Sarcomas e carcinomas
Os sarcomas, outro grupo de câncer maligno de origem mesenquimal,
possui mais de 70 subtipos histológicos. Estes são classificados em 2 grandes
categorias, sendo sarcomas de partes moles e sarcoma de osso (HUI, 2016).
Comumente os sarcomas se localizam nas extremidades como a coxa (partes
moles). Os sarcomas são esporádicos e idiopáticos, tendo relação de causa
com fatores genéticos associados ou não a fatores ambientais, mas possui
uma etiologia desconhecida. Os sarcomas ósseos ou osteosarcomas são os
mais raros do grupo, no entanto, ocorrem com mais frequência em crianças e
adolescentes. Este grupo de sarcoma representa 0,2 % dos novos casos
diagnosticados a cada ano (HUI, 2016; SHENG; MOVVA, 2016).
Os osteosarcomas possuem subtipos, sendo eles: clássico, parosteal,
periosteal, telangiectatico e osteosarcoma associado à doença de Paget e
também osteosarcoma após irradiação. Pacientes com osteosarcoma
apresentam dor e inchaço (COSKER; GIBBONS, 2017).
Atualmente o câncer de pulmão é considerado o câncer que causa mais
mortes nos EUA, sendo que deste grupo, 85% do total diagnosticado é
carcinoma de pulmão de não pequenas células (AHMED et al., 2017). A
partir de 2008 o câncer de pulmão foi a única maior causa de morte
relacionada a câncer no mundo (LEE et al., 2015).
42
Para o câncer de pulmão de não pequenas células a intervenção cirúrgica
é o tratamento de escolha quando nos estágios iniciais (SU et al., 2017). Do
total dos pacientes diagnosticados mais de 50% já estão em estágio avançado
da doença, resultando em um prognóstico muito ruim. Mesmo com os
avanços na quimioterapia a sobrevida média destes pacientes é inferior a 12
meses, e a taxa de sobrevivência até 5 anos é menor que 1% (ZHOU; YAO,
2015).
O diagnóstico e tratamento do câncer de pulmão de não pequenas
células é um processo demorado e que envolve uma interação de diversos
profissionais de saúde e organizações. O atendimento a estes pacientes é
também um processo contínuo que envolve desde a avaliação dos cuidados
primários, procedimentos de biopsia e os diagnósticos por imagem, além das
avaliações de especialistas. Atrasos em relação ao diagnóstico e início de
tratamento tem sido associado ao aumento da massa tumoral, agravando o
quadro de saúde do paciente, com consequente progressão da doença
dificultando o tratamento e a cura (KIM et al., 2016). A maioria dos pacientes
em estágio avançado da doença não tem prognóstico de cura. A quimioterapia
adjuvante ao tratamento cirúrgico apresenta benefícios apenas para pacientes
em fase II-IIIA. Para os pacientes com estadiamento IA a quimioterapia tem
efeitos que agravam o quadro clínico, piorando a sobrevivência do paciente.
O câncer de pulmão de não pequenas células ainda é um desafio para os
profissionais da saúde (BRADBURY et al., 2016).
Visando a melhoria do quadro de saúde dos pacientes com câncer busca-
se cada vez mais medicações que tenham menores efeitos adversos e com
melhores resultados, no entanto, verifica-se ainda diversos efeitos adversos
dos quimioterápicos atuais de uso clínico. Um exemplo é o uso da associação
de carboplatina/paclitaxel que causam toxicidades hematológicas,
neuropatia, vômitos e náuseas, e o gefitinib apresentou reações adversas
como erupções cutâneas, diarreia além do aumento nos níveis de
transaminases hepáticas (PAKKALA; RAMALINGAM, 2017).
A doxorrubicina vem sendo usada no tratamento de câncer desde 1970.
Os estudos mostraram 6,7% de remissão completa da doença e 20% de
remissão parcial em pacientes com sarcoma de tecido mole metastático.
Atualmente estes valores vem aumentando o que faz com que este fármaco
seja mais utilizado como tratamento para o câncer. No entanto pacientes
apresentaram toxicidade hematológica, neutropenia febril e alopecia
(SHENG; MOVVA, 2016).
43
As células malignas e normais são muito semelhantes e o grande desafio
do tratamento pela quimioterapia é a distinção entre essas células, que muitas
vezes refletem em efeitos secundários maléficos (BRANDÃO et al., 2010).
O crescente avanço no tratamento do câncer vem aumentando a sobrevida
dos pacientes, no entanto, as questões relacionadas a qualidade de vida destes
deve ser avaliada, pois, os efeitos adversos das medicações podem agravar o
quadro de saúde, tornando a qualidade de vida ruim. Na busca por novos
medicamentos mais seletivos e com menores efeitos adversos as plantas
medicinais vêm ganhando destaque como fonte de novos princípios ativos.
3.3 Toxicologia
A toxicologia é a ciência que investiga a interação entre as substâncias
químicas e o organismo, observando-se os possíveis efeitos adversos. Estes
podem variar de efeitos leves, como irritações, até os mais graves como lesão
permanente de um órgão. A capacidade de um agente causar danos ao
organismo é dita como toxicidade (OGA, 2008).
De acordo com dados do Centro de Informações Toxicológicas (CIT),
no estado de Santa Catarina, 115 pessoas foram atendidas por intoxicação por
plantas, 2854 por medicamentos e 17 por alimentos no ano de 2014. Entre os
anos de 2008 a 2013 foram registrados 15803 casos de intoxicações por
medicamentos, destes 91 óbitos. Para plantas foram registrados 794 casos,
com 1 óbito e 108 casos para intoxicação por alimentos, sem óbito (CIT,
2016).
O uso de plantas medicinais tem crescidos nos últimos anos, seja por
meio da medicina popular ou como fonte para pesquisa e produção de novos
agentes terapêuticos (SPONCHIADO et al., 2016). Conforme dados da OMS
(2013), muitos países fazem uso da medicina tradicional para o tratamento de
doenças, principalmente as doenças crônicas, como por exemplo, em
Singapura e República da Coreia que 76 a 86% de sua população fazem uso
da medicina tradicional. Estes costumes são transferidos por gerações e tem
seu uso normalmente por via oral e geralmente não são comunicados aos
profissionais de saúde. Mesmo com o uso de uma planta durante séculos, não
se pode garantir que esta não esteja sendo prejudicial ao homem. Por questões
de segurança à população, torna-se importante avaliar a toxicidade,
verificando o potencial tanto mutagênico, genotóxico e carcinogênico
(MELO-REIS et al., 2011).
44
Os medicamentos a partir de plantas, como os fitoterápicos e
fitofármacos devem estar disponíveis para o uso da população, sendo eles
seguro e não causar danos à saúde (SILVA; BARREIRA; OLIVEIRA, 2016).
Portanto, a toxicologia é importante para garantir a segurança de
medicamentos que são disponibilizados ao consumo humano, garantindo que
este não afete à saúde do consumidor (OGA, 2008).
Faz-se necessário realizar estudos toxicológicos para estabelecer a dose
letal (DL), tempo de exposição, relação dose-resposta, efeitos adversos,
assim definindo a segurança do medicamento derivados de plantas e/ou os
alimentos (ERNST, 2015).
A exposição a um agente tóxico pode ocorrer em quatro categorias:
aguda, sub-aguda, sub-crônica e crônica. O termo agudo refere-se à exposição
a um determinado produto em um período menor que 24 horas, no qual há
uma administração de uma única dose ou em doses repetidas ao longo deste
tempo. Sub-aguda refere-se à exposição a um agente químico, sendo esta
repetida, durante um mês ou menos. Já a exposição sub-crônica é considerada
quando o período de exposição for de 1 a 3 meses, e a crônica quando um
indivíduo sofre exposição a um agente químico por um período maior que
três meses (GUPTA, 2016).
As quatro categorias de exposição podem ocorrer por qualquer via de
administração, podendo ser via oral, intraperitoneal, intravenosa e
subcutânea. Além destas categorias pode ser considerada como via de
administração a aplicação dérmica (GUPTA, 2016).
A toxicologia genética estuda os efeitos de agentes químicos e físicos
sobre o material genético, incluindo nesta categoria uma grande variedade de
ensaios in silico, in vitro e in vivo. Todos os testes usados têm como
finalidade avaliar danos causado no DNA, uma vez que desempenham
importante papel no passo inicial do processo de carcinogenese (BLASS,
2015).
Ensaios de citotoxicidade in vitro são testes capazes de prever a
toxicidade de produtos ou compostos em diferentes tecidos. Fazem parte do
processo de avaliação de segurança de um composto, além de possibilitar a
identificação de compostos anticâncer (TOLOSA; DONATO; GOMEZ-
LECHON, 2015). Um ensaio comum na citotoxicidade é o MTT adicionado
em culturas de células, possibilitando medir por meio de técnicas
espectroscópicas a atividade mitocondrial das células viáveis (ANGIUS;
FLORIS, 2015; LUPU; POPESCU, 2013).
45
As linhagens celulares cultivadas em meio de cultura multiplicam-se
continuamente, e assim o ensaio do MTT possibilita avaliar a interferência
que um agente químico induz nos processos metabólicos das células e como
este interfere no crescimento e multiplicação celular (IVANOVA; UHLIG,
2008).
Compostos que apresentam citotoxicidade são aqueles que têm
capacidade de matar células saudáveis, ou em casos específicos linhagens
celulares usadas para a identificação de compostos com potencial
anticancerígeno. Nestes casos é importante que o composto mate o maior
número de células cancerígenas e o menor número de células saudáveis. O
MTT é um método extensamente empregado para realizar triagens, pois, é
simples, de baixo custo, reprodutível e importante para avaliar a segurança
de um produto ou substância (ONG et al., 2017).
O termo hemólise significa ruptura da membrana dos glóbulos
vermelhos, resultando na liberação de hemoglobina. A ocorrência ou não de
hemólise é importante para avaliar a segurança de substâncias sob as células
sanguíneas (ALMIZRAQ; YI; ACKER, 2017). Assim, a integridade da
membrana celular é um dos parâmetros comumente usados para avaliar a
citotoxicidade em diferentes metodologias (IVANOVA; UHLIG, 2008).
A hemólise sanguínea anormal pode ocorrer a partir de uma
manipulação inadequada durante o processamento do sangue, condições de
armazenamento, anticorpos que causam lise, defeitos na membrana, além da
presença de compostos químicos geradores de hemólise (SOWEMIMO-
COKER, 2002). Os eritrócitos possuem membrana plasmática celular
simples, por não apresentarem núcleos e organelas, a hemólise é facilmente
detectada por métodos espectrofotômetro devido a liberação da hemoglobina,
além de ser abundante no meio sanguíneo (MANAARGADOO-CATIN,
2016). Os ensaios de hemólise são importantes nos estudos com plantas
medicinais, por serem rápidos, de fácil execução e apresentarem resultados
confiáveis (DE-QIANG et al., 2011).
Entre os ensaios toxicológicos incluem-se a investigação da
mutagenicidade, a qual refere-se à produção de alterações genéticas
transmissíveis (GUPTA, 2016). Mutagenicidade é, portanto, um subconjunto
de genotoxicidade em que o DNA é mutado, resultando em uma célula
alterada. Compostos com propriedades mutagênicas, ou seja, capacidade de
causar danos no DNA, mesmo quando em doses baixas, representam risco
46
potencial para causar câncer em um indivíduo (ARAYA; LOVSIN-BARLE;
GLOWIENKE, 2015).
Um dos ensaios de mutagenicidade usado é o teste do micronúcleo, o
qual avalia os danos citogenéticos que resultam na formação de
micronúcleos. É um teste in vivo realizado para a detecção de agentes
clastogênicos e aneugênicos. Os micronúcleos eram usados somente para
mensurar danos cromossômicos, atualmente constituem-se em um ensaio
confiável para agentes carcinógenos e genotóxicos (RIM; KIM, 2015).
3.4 Drimys (Winteraceae)
A família Winteraceae é composta por aproximadamente 8 gêneros e 70
espécies; é predominante no hemisfério sul, ocorrendo desde a Australásia
até Madagascar e Américas. O gênero Drimys possui a maior área de
distribuição geográfica da família, compreende cerca de 6 espécies, dentre
elas as espécies Drimys winteri, Drimys granadensis, Drimys brasiliensis e
Drimys angustifolia que são classificadas por suas características
morfológicas, anatômicas e cariotípicas (BRASÍLIA, 2011;
EHRENDORFER et al., 1979; TRINTA; SANTOS, 1997).
No Brasil são encontradas as espécies de D. angustifolia e D.
brasiliensis, principalmente nas regiões de climas temperados, estendendo-
se desde a Bahia até o Rio Grande do Sul (BACKES; NARDINO, 1999). A
duas espécies são popularmente conhecidas como casca-de-anta e uma única
diferença é marcante entre elas, no qual a D. angustifólia apresenta folhas
estreitas, angustas, e pedúnculos curtos, enquanto a D. brasiliensis apresenta
folhas obovadas e pedúnculos longos (EHRENDORFER et al., 1979;
TRINTA; SANTOS, 1997). A relatos dos aborígenes Araucanos que o nome
casca-de-anta se dá, pois, a anta (Tapirus americanus) quando ficava doente
recorria a casca da árvore dessas espécies (PIO CORREA, 1931).
A D. brasiliensis é uma árvore que pode chegar até 20 metros de altura,
com folhas obovadas com até 14,3 cm de comprimento e 5,8 cm de largura,
suas inflorescências apresentam pedúnculo longo, em geral, com três a cinco
flores brancas. Seus frutos quando maduros apresentam coloração escuro-
rajados, frutificando a partir de outubro em Santa Catarina, que são
consumidos por aves que auxiliam na dispersão das sementes e reprodução
da espécie (Figura 3) (TRINTA; SANTOS, 1997).
47
Figura 3 – Aspectos gerais da planta D. brasiliensis.
Fonte: Brasília (2011).
Além de casca-de-anta, D. brasiliensis é conhecida popularmente
também como cataia, capororoca picante, carne-de-anta, melambo, paratudo,
pau-para-tudo, canela-amarga, pau casca-de-anta, cataeira e, em tupi-guarani,
caá-tuya, que significa árvore-para-velho (LONGHI, 1995; LORENZI, 1992;
SCHULTZ, 1975). No planalto catarinense a casca da espécie é muito
utilizada na culinária como condimento para carnes, substituindo a pimenta-
do-reino (TRINTA; SANTOS, 1997). Na medicina tradicional é utilizada
como carminativa, estomáquica e tônica. Ela também é altamente
recomendada para todos os tipos de problemas gástricos e estomacais,
incluindo dispepsia, disenteria, náuseas, dores intestinais e cólicas bem como
febre e anemia. Ainda pode-se citar atividade antiespasmódica, contra
hemorragia uterina e algumas vezes no tratamento do câncer (DE ALMEIDA,
1993; SIMÕES et al., 1986; TRINTA; SANTOS, 1997).
No gênero Drimys são encontradas difererentes classes de substâncias
como os sesquiterpenos drimanos, flavonóides, aromadendranos e lignanas
(JANSEN; GROOT, 2004; LAGO et al., 2010; LIMBERGER et al., 2007;
MALHEIROS, 2001; MORTON, 1981; SIMÕES, et al., 1986).
Nas folhas da espécie D. winteri foram encontradas substâncias como
safrol (12), drimenol (13), poligodial (4), 3-β-acetoxidrimenina (14),
criptomeridiol (15), cirsimaritina (16), quercetina (17), astilbina (18) e
quercitrina (19) (SIERRA; LOPES; CORTÉS, 1986; MUÑOS-CONCHA et
al., 2007), já na espécie D. brasiliensis a substância cubebina (20) foi isolada
(MALHEIROS, 2001). Em procedimentos extrativos de óleos essenciais
realizados com as folhas da espécie D. angustifolia foram evidenciados os
compostos sabineno (21), biciclogermacreno (22), mirceno (23), espatulenol
48
(24), 4-terpineol (25), limoneno (26) e trans-cariofileno (27) (GOMES, 2012;
GOMES et al., 2013; LIMBERGER et al., 2007). Já no óleo essencial da D.
brasiliensis foram encontrados o drimenol (13), ciclocolorenono (28), bem
como o, biciclogermacreno (22) e sabineno (21) cujo óleo apresentou
atividade anti-inflamatória e citotóxica (GOMES, 2012; GOMES et al., 2013;
LAGO et al., 2010; LIMBERGER et al., 2007). Vichnewski, Kulanthaivel e
Herz (1986) isolaram das partes aéreas de D. brasiliensis as substâncias
confertifolina (29), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) e 1β-p-
cumaroiloxivaldiviolide (30).
Vários trabalhos relatam a composição química das cascas do gênero
Drimys. Foram encontrados os compostos 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial
(3), poligodial (4), taxifolina (31), astilbina (18), drimendiol (32), drimenol
(13), isodrimeninol (33), isodrimenin (34), mukaadial (35) e dendocarbin A
(36) na espécie D. winteri (CECHINEL-FILHO et al., 1998; MALHEIROS,
2001; MALHEIROS et al., 2001; MUÑOS-CONCHA et al., 2007; PAZ et
al., 2015; ROBLES et al., 2014; ZAPATA et al., 2009). Das cascas de D.
brasiliensis foram isolados o drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial
(2), 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3), poligodial (4), drimenol (13), 1-β-
O-p-metoxi-E-cinamil-5α-ceto-11α-enol-albicanol (37), 1-β-O-p-metoxi-E-
cinamil-isodrimeninol (38), 1-β-O-(p-metoxi-E-cinamil)-6α-
hidroxipoligodial (39), isodrimeninol (33), espatulenol (24), hinoquinina
(40), fuegina (41) e o ácido poligonal (42) (CLAUDINO, 2011; FRATONI
et al. 2014; FRATONI et al., 2016; MALHEIROS, 2001; MALHEIROS et
al., 2005; SILVA, 2009)
Nos óleos essenciais das cascas de D. winteri foram detectados o α-
pineno (43), γ-curcumeno (44), mirceno (23) e 4-terpineol (25)
(MONSÁLVEZ et al., 2010; ZAPATA; SMAHHHE, 2010) e nos óleos de
D. brasiliensis o α-pineno (43), biciclogermacreno (22), ciclocolorenono
(28), drimenol (13) e espatulenol (24) (LAGO et al., 2010; LIMBERGER et
al., 2007).
Um único trabalho realizado com as raízes foi encontrado, no qual
Anese e colaboradores (2015) isolaram da espécie D. brasiliensis os
compostos poligodial (4), acetal poligodial (45), dendocarbin L (46) e fuegina
(41).
49
O
O H
OH
O
O
OAc
Safrol (12) Drimenol (13) 3-β-acetoxidrimenin (14)
OH OH
O
OH
OH O
O
O
O
OH
OH O
OH
OH
OH
Criptomeridiol (15) Cirsimaritina (16) Quercetina (17)
O
OH
OH O
OH
OH
ORamnose
O
OH
OH
OH
OH O
ORamnosil
O
OO
OO
OH
Astilbina (18) Quercitrina (19) Cubebina (20)
OH
Sabineno (21) Biciclogermacreno (22) Mirceno (23) Espatulenol (24)
OH
4-terpineol (25) Limoneno (26) Trans-cariofileno (27)
50
O
O
O
O
O
OH
O
O
OH
Ciclocolorenono (28) Confertifolina (29) 1β-p-coumaroiloxi-
valdiviolide (30)
OOH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
Taxifolina (31) Drimendiol (32) Isodrimeninol (33)
OO
OHCOH
CHO
OH
O
O
OH
Isodrimenin (34) Mukaadial (35) Dendocarbin A (36)
O
O
H OH
O
H
O
O
O
O
OH
O
1-β-O-p-metoxi-E-cinamil- 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-
5α-ceto-11α-enol-albicanol (37) isodrimeninol (38)
O
O
OOH
OH
O
OO O
O
O O
O
O
OH
OH
1-β-O-(p-metoxi-E-cinamil)- Hinoquinina (40) Fuegina (41)
6α-hidroxipoligodial (39)
51
COOH
OH
Ácido poligonal (42) α-pineno (43) γ-curcumeno (44)
O
O
O
O
O
OH
Acetal poligodial (45) Dendocarbin L (46)
A D. brasiliensis vem sendo estudada há alguns anos por pesquisadores
do Núcleo de Investigações Químico Farmacêuticas da Universidade do Vale
do Itajaí (NIQFAR/UNIVALI) em colaboração com outros Grupos de
Pesquisa. A maioria dos estudos foram realizados com as cascas e os
resultados mais expressivos referem-se à observação da atividade
antimicrobiana (SILVEIRA et al., 2012), anti-inflamatória (MALHEIROS et
al., 2005), leishmanicida, antimalarial (CLAUDINO et al., 2013) e
antitumoral (CLAUDINO, 2011; SILVA, 2009).
Outros trabalhos também relatam a atividade bioherbicida de extratos
das raízes de D. brasiliensis (ANESE et al., 2015), atividade anti-inflamatória
do óleo essencial das folhas e cascas (LAGO et al., 2010) e atividade
citotóxica em células de glioblastoma humano (U-138 MG) e carcinoma de
bexiga humana (T24) do óleo essencial das folhas incorporado em
nanoemulsões (GOMES, 2012).
Os drimanos 1, 2, 3 e 4 foram quantificados por Athayde (2015) em
extratos hidroetanolicos das cascas de D. brasiliensis submetidos a diferentes
condições extrativas. A metodologia desenvolvida por CLAE para a
quantificação apresentou boa resolução cromatográfica e foi validada, sendo
sensível, reprodutível e linear. O cromatograma de cada drimano pode ser
visualizado na Figura 4. Os compostos 1, 2 e 3 apresentaram os tempos de
retenção (TR) de 25 ± 0,1; 24 ± 0,1 e 33 ± 0,1 minutos respectivamente e
duas regiões de máxima absorção em 227 e 310 nm no ultravioleta (UV). Já
o drimano 4 apresentou absorção máxima em 232 nm com tempo de retenção
de 23 ± 0,1 minutos. Entre os 4 compostos avaliados o poligodial (4)
52
apresentou as maiores concentrações em todos os extratos, seguido do 1-β-
(p-metoxicinamil)-poligodial (3), drimanial (1) e em menor concentração o
1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2).
Figura 4 – Perfis cromatográficos dos padrões 1-3 no comprimento de onda de 310
nm e padrão 4 em 232 nm.
(1)
(2)
(3)
(4)
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial; (4) poligodial.
Fonte: Autorizado por Athayde (2015).
53
3.5 Sesquiterpenos drimanos
Os sesquiterpenos são estruturas que possuem em seu núcleo principal
15 carbonos. A sua biosítese tem como precursor o farnesil pirosfofato, que
pode formar sesquiterpenos lineares ou cíclicos (NIERO; MALHEIROS,
2016). Os drimanos são uma classe de compostos pertecente aos
sesquiterpenos, seu núcleo base drimano (47) é derivado a partir do
sesquiterpeno drimenol (13) isolado das cascas de D. winteri Forst
(Winteraceae). Os sesquiterpenos drimanos são encontrados principalmente
na família Winteraceae e também em espécies vegetais da família
Canellaceae, Polygonaceae (Polygonum hydropiper L principal espécie que
contém drimanos), Taxaceae, Aizoaceae, Thelipteridaceae, Umbelliferae,
além de fungos dos gêneros Marasmius, Pestalotiopsis e Laetiporus,
esponjas marinhas do gênero Dysidea e moluscos do gênero Doriopsilla
(ALLOUCHE et al., 2009; CLAUDINO et al., 2013; FRATONI et al., 2016;
HE et al., 2015; JANSEN; GROOT, 2004; KUANG et al., 2016).
H
12
34
56
7
89
10
11
12
13 14
15
Drimano (47)
O sesquiterpenos drimanos possuem muitas atividades biológicas já
comprovadas, incluindo antibacterianos, antifúngicos, insceticida,
citotóxicos, fitotóxicos, piscicidas e moluscicidas (JANSEN; GROOT,
2004). O poligodial (4) é um dos principais sesquiterpeno drimano presente
na família Winteraceae. Foi isolado pela primeira vez da Polygonum
hidropiper que é muito utilizada na medicina tradicional (MUÑOZ-
CONCHA et al., 2007). Diversos trabalhos vêm demonstrando algumas
atividades que são atribuídas a este composto como antifúngica
(MALHEIROS et al., 2005), anti-inflamatória, antinociceptiva (ANDRE et
al., 2004, 2006; MALHEIROS et al. 2001; MENDES et al., 2001),
vasorelaxante (ANDRE et al., 1999, 2003), leishmanicida e antimalárico
(CORREA et al., 2011), inibidor de lesão gástrica (MATSUDA et al., 2002)
e herbicida (ANESE et al., 2015). Nos extratos hidroetanólico obtidos das
54
cascas D. brasiliensis o poligodial (4) se apresenta como um dos compostos
majoritário (ATHAYDE, 2015).
Outros compostos também presentes na família Winteraceae, no gênero
Drimys são o drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) e o 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial (3). Estes também vem sendo avaliados em
relação as atividades biológicas. Trabalhos realizados por Silveira et al.
(2012) avaliaram a atividade antimicrobiana dos compostos 1, 2, 3 e 4, em
cepas de bactérias gram-negativa e gram-positivas. O composto 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial (3) foi ativo para Bacillus cereus na concentração
de 31,25 µg/mL, seguido do poligodial (4) o qual apresentou atividade para
a mesma bactéria em uma concentração de 62,5 µg/mL.
Os drimanos 1, 2, 3 e 4 foram avaliadas também em duas formas
promastigotas de Leishmania (Leishmania amazonensis e Leishmania
brasiliensise) uma forma trofozoíta de Plasmodium (Plasmodium
falciparum), no qual os drimanos apresentaram resultados bastante
satisfatórios com CI50 entre 1 a 42 μM e dentre eles, o 1-β-(p-cumaroiloxi)-
poligodial (2) foi o mais ativo, com CI50 de 5,55 μM para L. amazonenses,
2,52 μM para L. brasiliensis e 1,01 μM para P. falciparum (CLAUDINO et
al., 2013).
Malheiros e colaboradores (2005) avaliaram a atividade antifúngica dos
drimanos 1-4 em cepas de Microsporum canis, M. gypseum Epidermophyton
floccosum, Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes. Os compostos 2-4
obtiveram os melhores valores de concentração inibitória mínima (CIM),
uma faixa de 3 a 100 µg/mL. O poligodial (4) mostrou mais efetivo para o
fungo E. floccosum, com CIM de 3 µg/mL.
Recentemente a atividade citotóxica dos drimanos frente algumas
células cancerígenas vêm sendo relatada. O drimanial (1), 1-β-(p-
cumaroiloxi)-poligodial (2), 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3)
apresentaram efeitos citotóxicos promissores para leucemia linfoide aguda B
(Nalm6) e leucemia mieloide crônica (K562). O composto 2 obteve os
melhores CI50 com valores de 8,18 μM para a Nalm6 e 3,56 μM para a K562.
O poligodial (4), 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-5α-ceto-11α-enol-albicanol
(37), 1-β-O-p-metoxi-E-cinamil-isodrimeninol (38) e a mistura de drimanial
(1) e 1-β-O-(p-metoxi-E-cinamil)-6α-hidroxipoligodial (39) também foram
avaliados, mas esses não tiveram resultado tão significativos quantos os
outros drimanos mencionados. Essa perda da atividade pode estar relaciona a
falta do grupamento aldeído nos carbonos C-11 e C-12 dos compostos 37, 38
55
e 39, e no composto 4, por não apresentar o grupamento cinamoil ligado ao
carbono C-1 do núcleo drimano (FRATONI et al., 2016).
Estudos demonstram que outros sesquiterpenos drimanos, como o
poligodial (4), isopoligodial (48), confertifolina (29) e isodrimenin (34)
apresentaram atividade tumoral contra adenocarcinoma mamário humano
(MCF-7) e câncer de próstata humano (PC3 e DU145) (MONTENEGRO et
al., 2014); o 1β-O-E-cinamil-6α-hidroxi-9-epi-poligodial (49), 1β-O-E-
cinamil-5α-hidroxipoligodial (50), 1β-O-E-cinamilpoligodial (51), 1β-O-E-
cinamil-6α-hidroxi-isodrimeninol (52) e 1-β-O-(p-metoxi-E-cinamil)-6α-
hidroxipoligodial (39) para carcinoma epidermoide da boca (KB), cólon
(HCT116) e leucemia promielocítica (HL60) (ALLOUCHE et al., 2009); e o
7-drimen-3α,11-diol-3-O-α-D-glicopiranosideo (53) para leucemia mieloide
crônica (K562) e hepatoma humano (SMMC-7721) (DONG et al., 2011).
CHOCHO
O
O
CHOCHO
OH Isopoligodial (48) 1β-O-E-cinamil-6α-hidroxi-
9-epi-poligodial (49)
O
O
CHOCHO
OH
O
O
CHOCHO
1β-O-E-cinamil-5α- 1β-O-E-cinamilpoligodial (51)
hidroxipoligodial (50)
O
O
OOH
OH
OH
OO
OH
OH
OH OH 1β-O-E-cinamil-6α-hidroxi- 7-drimen-3α,11-diol-3-O-α-D-
isodrimeninol (52) glicopiranosideo (53)
56
3.6 Métodos Cromatográficos
A cromatografia possui destaque entre os métodos modernos de
análises, devido a sua facilidade em separar, identificar e quantificar
substâncias químicas. É um método físico-químico de separação de
componentes, composto por uma fase estacionária e uma fase móvel.
Durante o processo de separação, no qual a fase móvel passa pela
estacionária, as substâncias presentes são distribuídas pelas duas fases, elas
são seletivamente restritas pela fase estacionária, o que resulta na migração
diferenciada das substâncias com a fase móvel (AQUINO NETO; SILVA;
NINES, 2003; COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
A fase estacionária no processo cromatográfico pode ser sólida ou
líquida, já a fase móvel um gás ou líquido. Se a fase móvel é um líquido é
chamada de cromatografia líquida, e se for um gás, então é denominada de
cromatografia gasosa. A cromatografia gasosa é geralmente aplicada para
gases, misturas de líquidos voláteis e material sólido. A cromatografia líquida
é utilizada especialmente para amostras térmicas instáveis e não voláteis
(COSKUN, 2016). Outro critério de classificação das técnicas
cromatográficas é a forma física do sistema de separação. Se a fase
estacionária é colocada dentro de um tubo cilíndrico é chamada de
cromatografia em coluna, mas se é disposta sobre uma superfície plana é
denominada cromatografia planar (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
A cromatografia em camada delgada (CCD) embora seja uma antiga
técnica, ainda é muito empregada no campo das análises farmacêuticas. É
composta por uma fase estacionária sólida, revestida sobre um suporte sólido
de vidro, plástico ou alumínio, e de uma fase móvel geralmente solventes de
polaridades diferentes (AQUINO NETO; SILVA; NINES, 2003; COSKUN,
2016; SIDDIQUI; ALOTHMAN; RAHMAN, 2017). A CCD oferece muitas
vantagens, como fácil compreensão e execução, separação em pouco tempo,
versatilidade, alta repetitividade, variabilidade de amostras e baixo custo. É
uma ferramenta poderosa para rastrear materiais desconhecidos como drogas
de abuso. Ela desempenha um papel crucial na fase inicial do
desenvolvimento de fármacos, detectando impurezas e produtos de
degradação e é muito utilizada no processo de isolamento de produtos
naturais (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006; STICHER, 2008;
SIDDIQUI; ALOTHMAN; RAHMAN, 2017).
57
Outra técnica de separação é a cromatografia gasosa (CG), que se baseia
na diferente distribuição dos compostos presente em uma amostra entre a fase
estacionária, sólida ou líquida e a fase móvel, um gás. Como uma ferramenta
analítica a CG pode ser utilizada para a separação direta e análise de amostras
gasosas, soluções líquidas e sólidos voláteis (BHARDWAJA; DWIVEDI;
AGARWAL, 2016). A CG é uma técnica simples, altamente sensível e de
rápida aplicação para separação de moléculas. Quantidades muito pequenas
de substâncias podem ser detectadas, assim sendo uma excelente técnica
quantitativa. Vale ressaltar que a CG é um procedimento empregado para
compostos voláteis e termicamente estáveis, portanto se o produto a ser
analisado não possuir essas características a formação de um derivado se faz
necessário, mas nem sempre é viável. Além disso, a CG não é muito eficiente
para análises qualitativas, necessitando de outras técnicas para uma
identificação precisa de substâncias desconhecidas (COLLINS; BRAGA;
BONATO, 2006; SIDDIQUI; ALOTHMAN; RAHMAN, 2017; COSKUN,
2016).
A CG é composta por uma fonte de gás de arraste, injetor, coluna
cromatográfica, detector e software para registro e tratamento dos dados. As
substâncias presentes na amostra passam através da coluna, onde são
separadas e chegam ao sistema de detecção. Um dos detectores mais
utilizados é o de ionização de chamas. O gás de arraste chega ao detector e
uma chama é produzida, queimando e ionizando as moléculas presente nessa
corrente gasosa. Este detector responde muito bem a quase todos os tipos de
compostos. Outro fator que influencia na separação é a temperatura. A
temperatura pode ser mantida a mesma durante toda a análise ou aumentada
gradualmente. O aumento da temperatura diminui o tempo de análise, mas
causa uma perda na resolução. (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) também é uma
técnica para análises de amostras. É classificada como cromatografia líquida
em coluna. Diferentes mecanismos de separação são empregados pela CLAE,
o mais comum é a cromatografia líquido-sólido. As colunas são preenchidas
com pequenas partículas, e a fase móvel é arrastada através da fase
estacionária por alta pressão. A especificidade, precisão e exatidão do método
de CLAE é elevada, no entanto, só são atingíveis se forem realizados testes
de adequação do sistema antes da análise (SIDDIQUI; ALOTHMAN;
RAHMAN, 2017; THAMMANA, 2016).
58
A CLAE é composta por uma bomba, injetor, coluna cromatográfica,
detector, software para registro e tratamento dos dados (THAMMANA,
2016). O sistema de detecção da técnica de CLAE mede propriedade físicas
ou físico-químicas da amostra. Os detectores universais são os mais
procurados, principalmente pelos laboratórios de pesquisas que utilizam uma
variedade de amostras (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006). Um dos
detectores amplamente utilizados é detector ultravioleta (UV), que através de
um programa de varredura é capaz de selecionar vários comprimentos de
onda. Esta técnica possui uma alta detectabilidade, permite obter o espectro
de absorbância, comprimento de onda e tempo de retenção de cada
componente separado (SIDDIQUI; ALOTHMAN; RAHMAN, 2017). Em
uma matriz com várias substâncias, conhecer o espectro de absorbância de
cada uma permite selecionar o comprimento de onda de máximo absorção,
assim melhor a detecção e eliminar picos interferentes (COLLINS; BRAGA;
BONATO, 2006).
As técnicas de CG e CLAE são muito utilizadas em análises qualitativas
e quantitativas de substâncias. Nos processos qualitativos a identificação
pode ser feita comparando um pico com o tempo de retenção de um padrão.
Este método não é muito conclusivo, pois outros compostos podem
apresentar o mesmo tempo de retenção. O uso de equipamentos acoplados
com espectrofotômetro de UV ou de massas, permite uma maior precisão na
identificação desses compostos. A partir dos cromatogramas obtidos, pode-
se aplicar as análises quantitativas (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
Nos ensaios quantitativos muitos cuidados devem ser tomados, perda e
contaminação não podem ocorrer no preparo da amostra. A etapa de
separação dos componentes também pode ser uma fonte de erros como,
adsorção irreversível de parte da amostra na fase estacionária, resposta do
detector afetada por alterações na temperatura e vazão, quantidade de amostra
fora da faixa linear do detector, entre outras. Para transformar a intensidade
do sinal emitido, em uma medida relacionada com a quantidade da
substância, faz-se a integração dos sinais. A integração pode ser feita de
forma manual ou eletrônica (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
Segundo Collins, Braga e Bonato (2006) os métodos manuais são mais
demorados e sujeitos a erros, assim atualmente os sistemas eletrônicos são
mais utilizados, e proporcionam obter dados como o tempo de retenção, área
e altura dos picos. Vários métodos são utilizados para gerar as medidas
obtidas na integração, tais como:
59
Normalização: Este método permite comparar a área obtida no
cromatograma com a porcentagem da composição da mistura. Para
que isso ocorra, todas as substâncias presentes na amostra precisam
ser eluídas e a resposta do detector seja a mesma para a todas;
Fator de resposta: É utilizado para corrigir a equação de
normalização, quando o detector não responde de maneira igual para
todas as substâncias. É realizado injetando-se uma mistura de
concentrações conhecida da substância, e relacionar posteriormente
a porcentagem conhecida com a observada;
Calibração externa: Através de uma curva analítica desenvolvida
com o padrão a ser analisado, que correlaciona as áreas obtidas com
a concentração, é possível estabelecer pelo gráfico ou equação linear
a quantidade da substância presente na amostra. É um método
sensível a erros de injeção, bem como erros de preparo da amostra;
Padronização interna: O método consiste na adição de uma
concentração conhecida de uma substância na amostra a ser
analisada. O padrão interno deve ser similar a substância a ser
quantificada, não fazer parte da amostra e ter TR próximo ao da
substância. Realiza-se um gráfico que relacione a razão das áreas
com a concentração, tanto do padrão interno quanto da substância,
e quantifique os 2 igualmente ao realizado na calibração externa.
Esse método é menos sensível a erros de injeção, variações
instrumentais, entre outros.
Análises por CG e CLAE são amplamente utilizadas pela indústria
farmacêuticas e na pesquisa com produtos naturais. Permite a detecção de
contaminantes, produtos de degradação, resíduos de solvente, bem como o
isolamento, identificação e quantificação de compostos (SIDDIQUI;
ALOTHMAN; RAHMAN, 2017; STICHER, 2008).
60
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Material vegetal
As cascas e folhas de Drimys brasiliensis foram coletadas na cidade de
Rancho Queimado/SC em janeiro de 2009, foram secas em estufa a 40 ºC por
5 dias e trituradas. A identificação botânica da espécie foi realizada
anteriormente pelo Prof. Dr. Ademir Reis (UFSC) e uma exsicata foi
depositada no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí/SC), sob o código de HBR-
2031.
4.2 Obtenção e otimização do processo de extração dos drimanos
As cascas de D. brasiliensis (4 g) foram submetidas à extração por
maceração dinâmica, a temperatura ambiente conforme condições descritas
no Quadro 2. Posteriormente as soluções foram filtradas e o solvente
evaporado.
Para a otimização das soluções extrativas foi empregado um
experimento fatorial do tipo 2x2x2, no qual foram estudados três fatores em
dois níveis, totalizando 8 testes (Quadro 2). Os fatores foram: fator 1 -
solvente (hexano e diclorometano), fator 2 - proporção droga vegetal:solvente
(1:10 e 1:20) e fator 3 - tempo de extração (2 e 6 horas), como covariável foi
avaliado o rendimento em massa extraída e o fator dependente foi
considerado a concentração dos drimanos 1, 2 e 3.
Quadro 2 – Fatores e níveis utilizados no delineamento fatorial da obtenção das
soluções extrativas das cascas de D. brasiliensis.
Fatores Níveis
-1 +1
1: Solvente Hexano Diclorometano
2: Proporção droga vegetal:solvente (m/v) 1:10 1:20
3: Tempo de extração (h) 2 6
61
Quadro 3 – Número de lote das soluções extrativas com os respectivos fatores e níveis
estudados no delineamento fatorial.
Lotes Fatores
1 2 3
1 -1 -1 -1
2 +1 -1 -1
3 -1 +1 -1
4 +1 +1 -1
5 -1 -1 +1
6 +1 -1 +1
7 -1 +1 +1
8 +1 +1 +1
1 = solvente; 2 = Proporção droga vegetal:solvente; 3 = tempo de extração.
Os drimanos drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) e 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial (3) quantificados nos extratos e avaliados na
atividade citotóxica in vitro foram previamente isolados em trabalhos
realizados por Claudino (2011) e Fratoni et al. (2014).
Drimanial (1): sólido amorfo amarelo claro. RMN 1H (CDCl3 300 MHz)
9,84 d (H-11); 9,35 s (H-12); 7,63 d (H-3’); 7,49 d (H-5’, H-9’); 6,91 d (H-
6’, H-8’); 6,88 q (H-7); 6,27 d (H-2’); 5,30 m (H-1); 3,83 (H-9, OCH3, OH);
2,80, 2,40 m (H-6); 2,04 m (H-3); 1,80, 1,70 m (H-2); 1,23 s (H-14); 1,03 s
(H-13); 0,96 s (H-15). RMN 13C (CDCl3 75,5 MHz) 201,4 (C-11); 192,2 (C-
12); 166,4 (C-1’); 161,5 (C-7’); 148,2 (C-7); 145,4 (C-3’); 141,3 (C-8); 130,0
(C-5’, C-9’); 126,9 (C-4’); 115,2 (C-2’); 114,3 (C-6’, C-8’), 78,1 (C-5); 77,0
(C-1, C-9); 55,3 (OCH3); 46,6 (C-10); 38,0 (C-4); 34,4 (C-3); 32,1 (C-6);
27,2 (C-13); 25,0 (C-14); 24,0 (C-2) 13,6 (C-15). C25H30O6.
1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2): sólido amorfo branco. RMN 1H
(CDCl3 300 MHz) 9,75 d (H-11); 9,32 s (H-12); 7,62 d (H-3’); 7,42 d (H-6’,
H-8’); 7,16 sl (H-7); 6,85 d (H-5’, H-9’); 6,26 d (H-2’); 4,88 dd (H-1); 3,29
sl (H-9); 1,86, 1,85 m (H-2); 1,57 m (H-3); 1,43 dd (H-5); 1,09 s (H-13); 1,03
s (H-14); 0,98 s (H-15). RMN 13C (CDCl3 75,5 MHz) 200,0 (C-11); 193,2 (C-
12); 166,6 (C-1’); 160,6 (C-7’); 153,3 (C-7); 145,6 (C-3’); 140,9 (C-8); 131,0
(C-5’, C-9’); 127,0 (C-4’); 116,6 (C-6’, C-8’); 115,9 (C-2’); 81,5 (C-1); 58,9
(C-9); 48,8 (C-5); 42,3 (C-10); 39,9 (C-3); 33,4 (C-4); 32,7 (C-13); 24,9 (C-
6); 23,3 (C-2); 22,2 (C-14); 10,9 (C-15). C24H28O5.
1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3): sólido amorfo amarelo claro.
RMN 1H (CDCl3 300 MHz) 9,80 d (H-11); 9,32 s (H-12); 7,58 d (H-3’); 7,47
62
d (H-5’, H-9’); 7,07 sl (H-7); 6,91 d (H-6’, H-8’); 6,29 d (H-2’); 4,85 m (H-
1); 3,83 (OCH3); 3,32 sl (H-9); 2,45 m (H-6); 1,90, 1,70 m (H-2); 1,55 m (H-
3); 1,39 dd (H-5); 1,06 s (H-13); 1,00 s (H-14); 0,96 s (H-15). RMN 13C
(CDCl3 75,5 MHz) 200,4 (C-11); 192,3 (C-12); 166,3 (C-1’); 161,4 (C-7’);
152,0 (C-7); 145,3 (C-3’); 140,2 (C-8); 129,9 (C-5’, C-9’); 126,8 (C-4’);
115,1 (C-2’); 114,2 (C-6’, C-8’); 81,3 (C-1); 59,1 (C-9); 55,2 (OCH3); 48,7
(C-5); 42,2 (C-10); 39,1 (C-3); 32,6 (C-4); 32,5 (C-13); 24,4 (C-2); 24,0 (C-
6); 22,0 (C-14); 10,5 (C-15). C25H30O5.
4.2.1 Análise dos extratos por CCD
Para análise qualitativa dos extratos por CCD, os mesmos foram
dissolvidos (10 mg/mL) em acetona e aplicados 20 µL (0,2 mg) da amostra
em cromatoplacas de sílica gel com os padrões de interesse previamente
isolados [drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) e 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial (3)]. As placas cromatográficas foram eluídas com
uma mistura de hexano e acetato de etila na proporção 6:4. Para a
visualização dos compostos foi utilizado como revelador físico a radiação
ultravioleta no comprimento de onda 254 nm e como revelador químico a
solução de anisaldeído sulfúrico a quente (FRATONI et al., 2014).
4.2.2 Análise dos extratos por CG
Para a análise dos extratos por CG foi utilizado um cromatógrafo gasoso
com detector de ionização de chama (CG-FID) da marca Shimadzu® modelo
GC-2010, equipado com injetor automático modelo AOC-20i. A coluna
cromatográfica utilizada foi a RTX-1 com 30 m de comprimento, 0,25 mm
de diâmetro e 0,1 μm fase estacionária. As condições cromatográficas foram:
gás de arraste, hélio, com fluxo de 0,75 mL/min constante; temperatura do
injetor: 290º C; tipo de injeção "split"; volume injetado 1 μL; programação
da coluna, 100 ºC por 1 min, 25 ºC/min até 310 ºC por 11 min; tempo total
20,40 min. O programa de temperatura da coluna foi otimizado a fim de
garantir uma boa resolução cromatográfica.
As soluções foram preparadas a partir de 5 mg de extrato e dissolvidas
em 1 mL de diclorometano. 1 μL das soluções dos extratos e padrões foram
injetadas automaticamente no cromatógrafo. O valor das áreas obtidos do
respectivo marcador foi registrado pelo software Empower®.
63
4.2.3 Análise dos extratos por CLAE
Na análise dos extratos por CLAE foi utilizado o método desenvolvido
por Athayde (2015). A fase móvel utilizada foi acetonitrila:água acidificada
(com ácido acético pH 4,18) em proporções iniciais de 25:75, variando-se até
70:30, com retorno a proporção inicial após 42 minutos em fluxo de 1
mL/min a 35ºC. Os solventes utilizados foram grau HPLC, filtrados a vácuo
com membrana de celulose regenerada 47 mm de diâmetro e 0,45 μm de
porosidade e degaseificados em ultrassom. O software LC Solution® foi
utilizado para registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos. A
separação dos fitoconstituintes foi executada em uma coluna de fase reversa
C18 Kinetex (150 X 4,6 mm X 2,6 µm) Phenomenex®.
As soluções foram preparadas a partir de 2 mg dos extratos e dissolvidas
em 1 mL de mistura de acetonitrila:água acidificada (pH 4,18) na proporção
de 8:2. Cada amostra foi filtrada em membrana de PTFE modificada de 0,45
µm e transferida para viais para posterior análise por CLAE.
As concentrações dos drimanos foram obtidas através da análise de
regressão linear realizada também por Athayde (2015) através das seguintes
equações da reta:
Drimanial (1): y = 13181,2x - 4958,152 (1)
1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2): y = 41293,07x + 1174,009 (2)
1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3): y = 17736,39x - 20204,710 (3)
4.2.4 Apresentação e análise dos resultados do processo extrativo
Para a análise estatística do processo extrativo foi empregado o software
Statistica® versão 10.0. Os dados foram avaliados pela análise de covariância,
utilizando regressão linear para determinar a relação da covariável com a
variável dependente, seguido de ANOVA e teste de Tukey para estabelecer a
significância entre as variáveis dependentes e independentes. Os valores de p
< 0,05 foram considerados significativos.
64
4.3 Estudo de citotoxicidade
4.3.1 Cultura de células
As linhagens celulares utilizadas nesse estudo foram de leucemia
mieloide crônica (K562), leucemia linfoblástica aguda B (Nalm6), linfoma
de Burkitt (RAMOS e RAJI), linfoma histiocítico difuso (U937), leucemia
linfoblástica aguda de célula T (MOLT4), leucemia linfoide aguda (REH e
B15), osteossarcoma (HOS) e carcinoma de pulmão (NCI-H1299). As células
foram cultivadas em garrafas plásticas apropriadas com meio de cultura
Dulbecco’s Modified Eagle’s Minimum Essential Medium (DMEM)
suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 10%, 10 mM de ácido
etanosulfônico de hidroxietil-piperazina (HEPES), 1,5 g/L de bicarbonato de
sódio, 100 U/mL de penicilina G, 100 μg/mL de estreptomicina, 50 μg/mL
de anfotericina B, em estufa umidificada a 37 ºC com 5% CO2.
Os testes in vitro foram realizados no CIPOI – UNICAMP sob a
supervisão de Alexandre Eduardo Nowill e Gilberto Carlos Franchi Jr.
4.3.2 Ensaio de citotoxicidade
A citotoxicidade das substâncias isoladas dos extratos foi avaliada por
meio da viabilidade celular pelo método do MTT, que se baseia na utilização
de um corante, o sal de tetrazólio solúvel em água que é convertido em
formazan púrpura após redução pelas desidrogenases mitocondriais de
células viáveis (MOSMANN, 1983).
Antes da realização dos experimentos o número de células viáveis foi
determinado pelo método de exclusão com azul de tripan, cuja contagem foi
realizada em câmara de Neubauer. As células foram plaqueadas usando o
equipamento epMotion® 5070 (Eppendorf, Vaudaux, Schonenbuch,
Switzerland) que distribuiu 2 x 104 células por poço em placas de 96 poços e
incubadas com as substâncias testes em diferentes concentrações (0,01; 0,1;
1; 10; 100 ou 1000 μg/mL) por 48 h a 37 ºC em 5% CO2. Para solubilização
das substâncias testes foi utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração
máxima de 0,1% poço/tratamento, cuja concentração não apresenta
citotoxicidade para as células. Como controle positivo, foram utilizadas as
substâncias vincristina e daunorrubicina, nas mesmas concentrações das
substâncias testadas. Decorrido o tempo de tratamento, o meio foi retirado e
65
adicionado 100 μL de uma solução de MTT (0,5 mg/mL) em meio de cultura
e incubado por 4 horas. Após esse tempo, o meio foi retirado e o precipitado
de formazan foi dissolvido com 100 μL de DMSO/poço e a leitura feita em
leitor de microplacas a 540 nm (Bio-Tek Power Wave XS). Os testes foram
realizados em triplicata. A densidade óptica obtida do grupo controle, células
sem tratamento (incubadas somente com meio de cultura), foi considerada
como 100% de células viáveis a fim de estabelecer as curvas concentrações
vs resposta, portanto, a CI50 (concentração que inibe 50% do crescimento
celular), conforme a equação 4.
Viabilidade relativa = Absorbância da amostra teste x100 (4)
Absorbância do controle
4.3.3 Apresentação e análise dos resultados de citotoxicidade
Para a análise estatística dos resultados obtidos foi utilizada ANOVA e
para comparação das médias dos grupos testados foi utilizado o teste de
Tukey, empregando o software Statistica® versão 10.0. Os valores de p<0,05
foram considerados indicativos de significância.
4.4 Ensaios toxicológicos
Para avaliação toxicológica foi preparado o extrato hidroetanólico das
cascas de D. brasiliensis. As cascas foram secas a 40 ºC por 2 dias, trituradas
(200 g) e posteriormente extraídas com etanol (96 ºGL; 2,5 L) em temperatura
ambiente por 8 horas por maceração dinâmica. O extrato foi concentrado em
rotaevaporador sob pressão reduzida, resultando um resíduo de 10,31 g
(5,15% de rendimento em relação às cascas).
4.4.1 Animais
O estudo de toxicologia utilizou ratos Wistar fêmeas pesando entre 180-
250 g, com 8 a 12 semanas, procedentes do biotério da Universidade do Vale
do Itajaí (UNIVALI). Os animais foram retirados do biotério uma semana
antes da realização do experimento para ambientação, mantidos em caixas de
polipropileno, contendo maravalha. A sala foi mantida com em constante
temperatura de 22 – 25 ºC e ciclos controlados de claro/escuro de 12 horas
66
cada, umidade de 40 - 60%, com ração e água ad libitum. Nas oito horas
anteriores aos experimentos, os animais foram mantidos em jejum e com livre
acesso à água. Como agente anestésico foi utilizado cloridrato de quetamina
90 mg/kg e cloridrato de xilazina 10 mg/kg administrado pela via
intraperitoneal.
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios
éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e aprovados pelo comitê de
ética CEUA/UNIVALI sob o protocolo n. 028/16 (Anexo A). Os animais
foram submetidos a processos cirúrgicos para retirada de órgãos e coleta de
sangue.
4.4.2 Toxicologia aguda (dose fixa)
Após 8 horas de jejum, os animais (n = 5) foram tratados com o extrato
hidroetanólico de D. brasiliensis (2000 mg/kg) e veículo. A dose foi
escolhida com base no protocolo da Organization for economic co-operation
and development (OECD) 420 (OECD, 2001), que define esta dose para
substância sem descrição de potencial toxicológico na literatura. Após a
administração do tratamento, durante as primeiras 12 horas, nos períodos de
15, 30 e 60 minutos e a cada 4 horas os sinais tóxicos de caráter geral foram
observados, sendo avaliados os seguintes parâmetros: atividade geral, frêmito
vocal, irritabilidade, resposta ao toque, aperto da cauda, contorção, trem
posterior, tônus corporal, força de agarrar, ataxia, tremores, convulsões,
estimulações, cauda em straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptoses,
piloereção, respiração e cianose. A partir da 4ª hora até 14º dia após a
administração da dose, foi observado a cada 2 dias a variação de peso, o
consumo hídrico e de ração. Ao fim do período de observação, os animais
foram anestesiados com quetamina e xilazina e realizado a coleta de sangue
(15 mL), o que ocasionou a eutanásia dos animais por hipovolemia. No
sangue coletado foram analisados os parâmetros hematológicos (hemograma
completo) e bioquímicos (glicemia, alanina aminotransferase – ALT,
aspartato aminotransferase – AST, fosfatase alcalina – ALP, colesterol, ureia
e creatinina). Após a coleta do sangue os animais foram autopsiados, sendo
observadas as características macroscópicas dos pulmões, rins, intestinos,
fígado, baço e coração, bem como o peso desses órgãos.
67
4.4.3 Ensaio do micronúcleo
Após 8 horas de jejum, os animais (n = 5) foram tratados por gavagem
com o extrato hidroetanólico de D. brasiliensis (2000 mg/kg), veículo (água)
e metil-metano-sulfóxido (MMS) (50 mg/kg). 24 h após os tratamentos os
animais foram eutanasiados em câmara de CO2 para retirada dos fêmures. As
células foram obtidas do canal medular, lavado três vezes com 1 mL de meio
de cultura SFB. O material coletado foi submetido à centrifugação a 1000 g
durante 10 minutos para formação do sedimento. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento ressuspendido em 500 µL de SBF. A viabilidade
celular foi verificada utilizando a técnica de exclusão por azul de trypan.
Desta suspensão foram realizados os esfregaços das células. As laminas
foram fixadas e coradas pelo método de Rosenfeld. 100 eventos por lâmina
foram avaliados, no qual serão observados o número de eritrócito
policromáticos (EPC) e de eritrócitos contendo micronúcleo (EPCMN) e a
proporção entre eles (KRISHNA; HAYASHI, 2000; MAVOURNIN et al.,
1990; OECD, 1997;).
4.4.4 Atividade hemolítica
A atividade hemolítica do extrato hidroetanólico de D. brasiliensis foi
investigada de acordo com o método de Parnham Wetzig (1993). O sangue
foi coletado dos animais do experimento de micronúcleo do grupo veículo
(descrito acima), em tubos contendo heparina, esses foram centrifugados a
1000 g durante 10 minutos. O sedimento foi lavado três vezes com tampão
fosfato-salino (PBS) (pH 7,4) gelado, através de centrifugação a 1000 g
durante 10 minutos e ressuspendidos com o mesmo tampão. Diferentes doses
do extrato hidroetanólico de D. brasiliensis em PBS (0,1, 1, 10, 100 e 1000
µg/mL) foram adicionadas à suspensão de eritrócitos e incubadas durante 1 h
a 37 ºC. Após o período de incubação, as células foram centrifugadas e o
sobrenadante foi usado para mensurar a absorbância da hemoglobina (Hb)
liberada em 540 nm. O valor médio foi calculado a partir de ensaios em
duplicata. A hemólise completa foi permitida utilizando 0,2% de Triton X-
100 obtendo-se o 100% como valor de controle positivo. Como controle
negativos foram utilizados tubos contendo apenas PBS. Menos de 10% de
hemólise foi considerada efeito não-tóxico. Os dados observados foram
expressos como % de liberação Hb em comparação com 100% de hemólise
68
do mesmo número de células utilizando 0,2% de Triton X-100 (PARNHAM;
WETZIG, 1993; SUGANTHY et al., 2014).
4.4.5 Apresentação e análise dos resultados toxicológicos
Para a análise estatística dos resultados obtidos foi utilizada ANOVA e
para comparação das médias dos grupos testados foi utilizado o teste de
Tukey, empregando os softwares Statistica® versão 10.0 e GraphPad Prism®
versão 6.0. Os valores de p < 0,05 foram considerados indicativos de
significância.
4.5 Isolamento de compostos das folhas de D. brasiliensis
4.5.1 Obtenção do extrato
As folhas de D. brasiliensis (200 g) foram secas a 40 ºC em estufas por
2 dias e moídas. Foi utilizado clorofórmio (CHCl3) como solvente extrator
(500 mL) em temperatura ambiente por 7 dias. O solvente foi evaporado em
rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se 19,58 g do extrato (9,79%
de rendimento em relação as folhas).
4.5.2 Procedimentos experimentais gerais
Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) foram
registrados em espectrômetros Bruker, modelos DPX-300 operando a 300
MHz para o núcleo do hidrogênio e a 75 MHz para o núcleo do carbono-13.
Clorofórmio-d e Piridina-d (Aldrich) foram usados como solventes, sendo o
pico residual do derivado não deuterado empregado como padrão interno. Os
espectros de infravermelho (IV) foram registrados no aparato IRPrestige-21
Shimadzu® (filme KBR). Para o espectro de massas usou-se o cromatógrafo
gasoso acoplado com detector de massa (CG/EM) da marca Shimadzu®
modelo GCMS-QP2010, equipado com injetor automático modelo AOC-20i.
A coluna cromatográfica que foi utilizada é uma RTX-1 com 30 m de
comprimento, 0,25 mm de diâmetro e 0,1 μm de fase estacionária. As
condições cromatográficas foram: gás de arraste, hélio, com fluxo de 0,75
mL/min constante; temperatura do injetor: 290º C; tipo de injeção "splitless";
volume injetado 1 μL; programação da coluna, 120 ºC por 2 min, 25 ºC/min
69
até 310 ºC por 18 min; tempo total 25,80 min. Para as separações
cromatográficas em coluna foram utilizados gel de sílica (Merck, 230-400
mesh) como fase estacionária e como fase móvel hexano, acetato de etila e
etanol (Vetec), enquanto que para as separações por cromatografia em
camada delgada foi utilizado gel de sílica 60 PF254 (Merck). Os reveladores
cromatográficos utilizados foram luz UV em 254 e 365 nm e anisaldeído
sulfúrico.
4.5.3 Isolamento e identificação dos compostos das folhas de D. brasiliensis
Parte do extrato das folhas (13,68 g) foi submetido a cromatografia em
coluna aberta (ϕi 4,0 cm) utilizando como fase estacionária sílica gel (150 g).
A eluição iniciou com hexano e gradualmente foi enriquecida com acetato de
etila (AcOEt) 0:100 (v/v) e posteriormente etanol (EtOH) 0:100 (v/v),
rendendo 60 frações, a qual foi denominada Coluna A (CA). Na fração 19-33
eluída com hexano-AcOEt 85:15 (v/v) proveniente da CA um sólido branco
foi isolado, denominado de DBFA 19-33 (0,112 g) rendendo 0,57% em
relação ao extrato bruto.
A fração 34 (1,13 g) eluída com hexano-AcOEt 50:50 (v/v) foi
submetida a novo procedimento cromatográfico, utilizando-se sílica gel
como fase estacionária (25,56 g, ϕi 2 cm) e eluída com hexano-AcOEt
gradativamente. Foram coletados 35 frações com aproximadamente 20 mL
cada, a coluna foi denominada de Coluna B (CB). Proveniente da CB a fração
14 foi isolada como um sólido branco denominado DBFA 14 (0,016 g) com
rendimento de 0,08%.
A fração 35-49 (6,61 g) obtida da CA foi empacotada com sílica gel
(59,56 g, ϕi 2 cm) e eluída com hexano-AcOEt e posteriormente EtOH, foram
coletados 36 frações de 10 mL cada, a coluna foi denominada de Coluna C
(CC). A fração 20-24 (0,84 g) da CC foi submetida a novo procedimento
cromatográfico, utilizando como fase estacionária sílica gel (49,09 g, ϕi 2 cm)
e eluída com hexano-AcOEt e EtOH, foi denominada como Coluna D (CD).
Proveniente da CD, na fração 26 eluída com AcOEt-EtOH 50:50 (v/v) foi
isolado sólido amarelo claro (0,018 g) com rendimento de 0,12% em relação
ao extrato bruto e foi denominada de DBFA 26.
A fração 25-28 (1,14 g) oriunda da CC foi recromatografada, utilizando
como fase estacionária sílica gel (34,44 g, ϕi 2,5 cm) e hexano-AcOEt como
eluentes, foram coletados 82 frações de 10 mL cada, esta foi denominada
70
Coluna E (CE). A fração 25-28 eluída com hexano-AcOEt 45:55 (v/v) foi
isolado como um sólido amorfo de cor amarela, com uma massa de 0,023 g
(0,12% em relação ao extrato bruto), este foi denominado de DBFA 25-28.
Todos os compostos isolados foram submetidos a técnicas
espectroscópicas para posterior identificação.
71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Otimização do processo de extração dos drimanos
Com o intuito de obter um extrato com maiores concentrações dos
sesquiterpenos drimanos 1, 2 e 3, várias condições de extração foram
testadas, incluindo diferentes solventes, proporção droga vegetal:solvente e
tempo de extração. As cascas de D. brasiliensis permaneceram em contato
com o solvente nas proporções 1:10 e 1:20 (m/v), durante 2 e 6 h por
maceração dinâmica. Os solventes selecionados foram hexano, solvente
apolar, e diclorometano, solvente de média polaridade. A escolha do solvente
foi baseada em estudos anteriores, no qual extratos obtidos com CHCl3,
solvente de média a baixa polaridade, resultaram em maiores concentrações
dos sesquiterpenos drimanos do que extratos realizados com metanol,
solvente polar (MALHEIROS, 2001). Os drimanos 1, 2 e 3 foram escolhidos
para serem quantificados nos extratos devido às atividades biológicas
apresentadas, principalmente a citotóxica frente a algumas células
cancerígenas (FRATONI et al., 2016).
Os rendimentos dos extratos obtidos após a evaporação do solvente
estão apresentados na Tabela 1. Na análise de covariância realizada observa-
se que os rendimentos dos extratos são maiores e estatisticamente diferentes
(p < 0,05) para o solvente DCM em relação ao hexano. Quando utilizado
hexano como solvente extrator, a proporção droga vegetal:solvente e o tempo
não influenciaram no rendimento dos extratos, sendo todos iguais (p > 0,05).
Para o solvente DCM a proporção droga vegetal:solvente não apresentou
influência na extração, enquanto o tempo de maceração apresentou influência
no rendimento (p < 0,05) (Figura 5).
Para todas as análises os extratos obtidos com DCM tiveram o
rendimento aproximadamente 10 vezes maior em relação aos obtidos com
hexano. Portanto para obter um melhor rendimento em massa de extrato com
a redução na quantidade de solvente orgânico a condição ideal é utilizar
DCM, na proporção 1:10 e no tempo de 6 h.
72
Tabela 1 – Rendimento dos extratos das cascas de Drimys brasiliensis.
Solvente Proporção
(m/v)
Tempo
(h)
Rendimento ± s*
(g)
Rendimento
(%)
Hexano
1:10
2 9,70 ± 0,60 0,24a
6 14,10 ± 2,00 0,35a
1:20
2 8,00 ± 0,10 0,20a
6 16,20 ± 0,80 0,40a
DCM
1:10
2 86,50 ± 0,50 2,16b
6 112,40 ± 10,20 2,81cd
1:20
2 98,40 ± 5,30 2,46bc
6 124,80 ± 9,30 3,12d
s = desvio padrão; DCM = Diclorometano; *média das réplicas dos extratos; letras
iguais correspondem à médias estatisticamente iguais (p > 0,05).
5.1.1 Análise dos extratos por CCD
Os extratos obtidos foram avaliados inicialmente por CCD, juntamente
com os padrões dos drimanos de interesse previamente isolados. Na Figura 6
está apresentada a placa de CCD dos diferentes extratos com os compostos
isolados. Pode-se evidenciar a presença dos 3 drimanos em ambos os líquidos
extratores. O fator de retenção (Rf do inglês retention factor) de cada drimano
foi mensurado, drimanial (1) Rf = 0,26, 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2)
Rf = 0,35 e 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3) Rf = 0,59. A fase móvel
escolhida foi hexano e acetato de etila 60:40 (v/v), pois os compostos eluiram
com Rf distintos e o revelador escolhido foi o solvente anisaldeído sulfúrico
a quente por ser seletivo para terpenos.
73
Figura 5 – Rendimento (g) dos extratos das cascas de D. brasiliensis na avaliação do
líquido extrator, proporção droga vegetal:solvente e tempo de extração.
Hexano
DCMTempo: 2 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Rendim
ento
(%
)
Tempo: 6 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
Figura 6 – CCD dos extratos obtidos em hexano e DCM, 2 e 6 h na proporção 1:20 e
drimanos 1-3 extraídos das cascas de D. brasiliensis.
a) 2 horas b) 6 horas
H= extrato em hexano; D = extrato em DCM; (1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-
poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial.
Todos os extratos apresentaram perfis fitoquímicos semelhantes e neles
todos os drimanos foram visualizados. Quantidades iguais de extrato foram
aplicadas em cada ponto, então pode-se dizer que, onde há manchas mais
fortes há maior concentração das substâncias. Nota-se que a intensidade da
H D 1 2 3 H D 1 2 3
74
cor é menor para os extratos obtidos com o solvente hexano, independente da
proporção ou tempo utilizado.
A técnica de CCD foi útil para análise qualitativa dos drimanos nos
extratos de D. brasiliensis. A CCD é uma técnica barata, de fácil acesso e
manuseio e que trouxe informações qualitativas relevantes.
5.1.2 Análise dos extratos por CG
Os extratos obtidos das cascas de D. brasiliensis foram avaliados por
CG devido à característica apolar dos mesmos. A cromatografia gasosa é uma
técnica eficiente para a separação de substâncias voláteis, sendo muito
empregada para a análise qualitativa e quantitativa (COLLINS; BRAGA;
BONATO, 2006). Inicialmente os drimanos isolados foram avaliados e após
alguns ajustes no método, foi possível detectar picos com TR de 14,86, 14,86
e 13,17 respectivamente para os drimanos 1, 2 e 3 conforme apresentado na
Figura 7.
Os cromatogramas dos diferentes extratos estão apresentados nas
Figuras 8 e 9. Os picos presentes nos cromatogramas são de substâncias que
se volatilizam na temperatura definida no método. Assim só substâncias
voláteis, ou que se volatilizam, podem ser detectadas pelo cromatógrafo. O
perfil cromatográfico dos extratos é semelhante, mas como a intensidade dos
picos está relacionada com a concentração, pode-se perceber concentrações
diferentes de alguns metabólitos nos distintos extratos. É possível observar
nos cromatogramas que há presença de vários picos com TR abaixo de 8 min,
caracterizando um perfil de extração de compostos de baixa polaridade. Os
drimanos avaliados apresentam tempo de retenção acima de 12 min e nessa
região poucos picos são detectados. O drimano 2 está em pequena quantidade
nos extratos e, em alguns, pode ser confundido com o ruído. Já os drimanos
1 e 3 são facilmente detectados.
Na Tabela 2 estão apresentadas as áreas em porcentagem dos 3
drimanos obtidos por CG. O drimano 1 apresentou as maiores áreas entre os
3 compostos avaliados, sendo que nos extratos com o solvente DCM ele está
em maior quantidade quando comparado com o hexano. O drimano 2 teve as
menores áreas, ele está no limite de detecção para alguns extratos e assim
dificultou a sua análise. As áreas do drimano 3 se mantiveram muito próximas
nos diferentes extratos.
75
Figura 7 – Perfil cromatográfico por CG dos padrões 1-3.
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial.
Figura 8 – Perfil cromatográfico por CG dos extratos em hexano e DCM das cascas
de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 2 horas.
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial.
(1) Hexano 1:10
DCM 1:10
Hexano 1:20
DCM 1:20
(3)
(2)
76
Figura 9 – Perfil cromatográfico por CG dos extratos em hexano e DCM das cascas
de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 6 horas.
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial.
A técnica de CG se mostrou eficiente, com o preparo da amostra e tempo
de análise rápidos, ela obteve informações qualitativas relevantes dos extratos
de D. brasiliensis.
5.1.3 Análise dos extratos por CLAE
A quantificação dos drimanos drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-
poligodial (2) e 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3) nos extratos obtidos
com diferentes solventes, proporção droga vegetal:solvente e tempo de
extração foi realizada por CLAE seguindo a metodologia desenvolvida por
Athayde (2015), a fim de estabelecer qual extrato apresenta uma maior
concentração dos drimanos.
A presença dos drimanos de interesse nos diferentes extratos foi
confirmada por CLAE através da comparação do tempo de retenção e perfil
de absorção no ultravioleta dos compostos comparados com os padrões
puros. Nas Figuras 10 e 11 estão apresentados os cromatogramas dos extratos.
Os tempos de retenção para os drimanos 1, 2 e 3 foram 25,26 ± 0,01; 24,14 ±
0,01 e 33,03 ± 0,01 min respectivamente. O detector utilizado para as análises
foi o UV. Foram observados dois máximos de absorção em 227 e 310 nm
para os 3 drimanos. O comprimento de onda selecionado foi 310 nm por
apresentar uma melhor seletividade, pois outros grupos cromóforos podem
interferir na análise em 227 nm.
Hexano 1:10
DCM 1:10
Hexano 1:20
DCM 1:20
(1) (2)
(3)
77
Tabela 2 – Área em porcentagem dos compostos 1-3 nos extratos das cascas de D. brasiliensis por CG.
Solvente Proporção
(m/v)
Tempo
(h)
1
(área %) ± s*
2
(área %) ± s*
3
(área %) ± s*
Hexano
1:10 2 4,83 ± 0,62a 1,39 ± 0,60ab 6,28 ± 0,64abc
6 6,10 ± 0,59a 1,17 ± 0,22ab 7,83 ± 0,55a
1:20 2 8,10 ± 2,33ab 2,07 ± 0,84b 6,64 ± 0,18ab
6 5,23 ± 0,84a 0,86 ± 0,44ab 6,83 ± 0,38ab
DCM
1:10 2 12,79 ± 0,97c 0,24 ± 0,03a 4,49 ± 0,86cd
6 14,26 ± 0,05c 0,36 ± 0,22a 5,91 ± 0,08bc
1:20 2 12,92 ± 0,46c 0,32 ± 0,13a 3,70 ± 0,31d
6 11,88 ± 0,29bc 0,32 ± 0,04a 5,95 ± 0,08bc
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial; s = desvio padrão; CV = coeficiente de
variação; *média das réplicas dos extratos; letras iguais na mesma coluna correspondem à médias estatisticamente iguais (p > 0,05).
78
Figura 10 – Perfil cromatográfico por CLAE dos extratos em hexano e DCM das
cascas de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 2 horas.
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial.
Figura 11 – Perfil cromatográfico por CLAE dos extratos em hexano e DCM das
cascas de D. brasiliensis na proporção 1:10 e 1:20 em 6 horas.
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial.
Os 3 drimanos foram quantificados nos extratos usando a curva analítica
de cada um dos marcadores estabelecidas por Athayde (2015). Na Tabela 3
estão apresentadas as concentrações em mg/g de extrato de cada drimano e a
porcentagem total nos diferentes processos extrativos.
Inicialmente foi realizada análise de correlação linear entre o
rendimento em massa de cada extrato com a concentração de cada drimano.
Pode-se observar na Figura 12 que o drimanial (1) e o 1-β-(p-cumaroiloxi)-
poligodial (2) apresentaram uma forte correlação com o rendimento dos
extratos, como valores de r = 0,9676 e r = 0,9671, respectivamente. Assim
pode-se afirmar que quanto maior a massa extraída maior a quantidade dos
Hexano 1:10
DCM 1:10
Hexano 1:20
DCM 1:20
(3)
(1) (2)
Hexano 1:10
DCM 1:10
Hexano 1:20
DCM 1:20
(3)
(1) (2)
79
drimanos 1 e 2 nos extratos. Já o 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3)
apresentou uma fraca correlação com o rendimento em massa do extrato, com
valor de r = 0,4145, devido a facilidade deste composto ser extraído nos
diferentes solventes, a concentração deste se mostra igual, indiferente do
rendimento em massa de cada extrato avaliado.
Figura 12 – Correlação linear do rendimento em massa (%) dos extratos com o
rendimento do drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) e 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial (3) (mg/g de extrato).
(1) (2)
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Drimanial (mg/g de extrato)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Ren
dim
ento
(%
)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16
1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (mg/g de extrato)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Ren
dim
ento
(%
)
(3)
40 60 80 100 120 140 160 180
1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (mg/g de extrato)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Ren
dim
ento
(%
)
80
Tabela 3 – Concentração dos compostos 1-3 em mg/g dos extratos obtidos das cascas de D. brasiliensis.
Solvente Proporção
(m/v)
Tempo
(h)
1
(mg/g de extrato)
± s*
2
(mg/g de extrato)
± s*
3
(mg/g de extrato)
± s*
Drimanos totais
(%)
Hexano
1:10 2 14,03±0,63a 0,96±0,02a 63,18±14,34ac 7,82
6 28,57±5,31b 0,76±0,06a 131,10±42,79abc 16,04
1:20 2 16,83±0,91ab 0,72±0,02a 54,62±4,87c 7,22
6 19,38±0,56ab 0,30±0,00a 138,35±19,85ad 15,50
DCM
1:10 2 55,23±0,93c 6,62±0,14b 84,09±5,39ace 14,59
6 70,39±1,91d 11,67±1,14c 134,29±11,93ab 21,63
1:20 2 51,20±5,71c 7,31±0,76b 97,00±12,18acf 15,55
6 80,77±6,40d 14,9±1,59c 152,43±14,83bdef 24,73
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial; s = desvio padrão; *média das réplicas dos
extratos; letras iguais correspondem à médias estatisticamente iguais (p > 0,05).
81
Para cada composto foi realizado a análise de covariância, a fim de
demonstrar qual o melhor processo de extração. O drimanial (1) foi
quantificado em todos os extratos. O solvente e o tempo foram os fatores que
influenciaram na extração deste composto (p < 0,05). As concentrações de
drimanial (1) nos extratos com o solvente DCM foram estatisticamente
diferentes e superiores as encontradas nos extratos com hexano. O tempo de
extração em 6 h também se mostrou mais eficiente para a extração do drimano
1 do que o tempo de 2 h. Em relação a proporção droga vegetal:solvente, 1:10
foi tão eficaz quanto 1:20 na extração deste drimano (p > 0,05). Assim, a
melhor condição de extração para o composto 1 foi utilizando solvente DCM,
em uma proporção 1:10 (menor volume de solvente) e com o tempo de
extração de 6 h (Figura 13).
O 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) foi o composto com as menores
concentrações em todos os extratos. Os fatores solvente e tempo de extração,
como para o composto 1 também influenciaram na extração do composto 2
(p < 0,05). Já a proporção não foi um fator importante, no qual a concentração
do drimano foi estatisticamente igual para 1:10 e 1:20 (p > 0,05). O DCM e
o tempo de 6 h novamente se mostram superiores ao solvente hexano e o
tempo de 2 h (p < 0,05). Neste caso, o DCM, na proporção 1:10 e no tempo
de 6 h de extração também foi a melhor condição para obter um maior
rendimento do composto 2 (Figura 14).
O drimano 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3) teve uma fraca
correlação com o rendimento dos extratos brutos, e essa diferença também
pode ser observada nas suas concentrações nos diferentes processos
realizados (Tabela 3). O teor do composto 3 não apresentou diferença quando
avaliados os diferentes solventes e proporções (p > 0,05), no entanto o tempo
de extração influenciou, quando utilizado 6 h de extração os valores foram
superiores ao extraídos em 2 h (p < 0,05) (Figura 15). O drimano 3 por ter
uma característica mais apolar do que os outros 2 drimanos, foi facilmente
extraído com os dois solventes.
A porcentagem de drimanos presente em cada extrato também foi
determinada, conforme mostrado na Tabela 3. Os extratos apresentaram de
7,22 a 24,73% de drimanos. Os procedimentos realizados com DCM em 6
horas foram mais eficazes, uma vez que quase um quarto do extrato obtido
são os drimanos 1, 2 e 3.
82
Figura 13 – Concentração do drimanial (1) nos extratos das cascas de D. brasiliensis
na avaliados por CLAE.
Hexano
DCMTempo: 2 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Dri
man
ial
(mg
/g d
e ex
trat
o)
Tempo: 6 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
Figura 14 – Concentração do 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) nos extratos das
cascas de D. brasiliensis na avaliados por CLAE.
Hexano
DCMTempo: 2 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1-β-(
p-c
um
aro
iloxi)
-poligodia
l (m
g/g
de e
xtr
ato
)
Tempo: 6 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
83
Figura 15 – Concentração do 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3) nos extratos das
cascas de D. brasiliensis na avaliados por CLAE.
Hexano
DCMTempo: 2 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
1-β-(
p-m
eto
xic
inam
il)-
po
lig
od
ial
(mg
/g d
e ex
trat
o)
Tempo: 6 h
1:10 1:20
Proporção droga:solvente
Athayde (2015) realizou estudo para a otimização do processo de
extração para os sesquiterpenos drimanos a partir das cascas de D.
brasiliensis, utilizou como líquido extrator misturas de etanol e água. A
melhor condição estabelecida foi utilizando etanol 96 ºGL, proporção droga
vegetal:solvente 1:10 e maceração dinâmica por 8 h. Na Tabela 4 estão
apresentadas as concentrações de cada drimano obtida pela autora comparado
ao melhor processo extrativo do presente estudo. Pode ser observado que as
concentrações dos drimanos obtidas no presente estudo foram superiores aos
encontrado por Athayde (2015). Devido os drimanos apresentarem uma
polaridade mais baixa, eles foram facilmente extraídos com o DCM, assim,
utilizar um solvente de média polaridade, manter as cascas em menor tempo
de contato com o solvente e utilizar uma menor quantidade deste, possibilita
uma extração eficiente sesquiterpenos drimanos das cascas de D. brasiliensis.
84
Tabela 4 – Comparação das concentrações dos compostos 1-3 em mg/g dos extratos
obtidos das cascas de D. brasiliensis.
Drimanos
Processos extrativos
96 ºGL; 1:10; 8 h
(mg/g de extrato ± s)*#
DCM; 1:10; 6 h
(mg/g de extrato ± s)*
1 42,16 ± 0,09 70,39 ± 1,91
2 7,19 ± 0,08 11,67 ± 1,14
3 83,66 ± 0,11 134,29 ± 11,93
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial; s = desvio padrão; *média das réplicas; #Athayde (2015).
Na tentativa de verificar se a CG seria uma técnica possível para a
quantificação dos drimanos foi avaliada a área em porcentagem direta, tendo
em vista que esta prática é mais usada para determinar a composição de óleos
essenciais. Todos os compostos presentes em um óleo essencial têm por
característica volatilizarem na temperatura que são submetidos a análise por
CG, e assim, o processo de quantificação da área em porcentagem pode ser
facilmente determinado. No presente estudo por se tratar de um extrato, no
qual muitas substâncias são extraídas, não foi possível afirmar que todos os
compostos foram voláteis na temperatura que a análise foi submetida, e assim
detectados. Este foi um fator que pode ter influenciado na análise por CG.
Na Figura 16 está a comparação das concentrações dos compostos 1-3
nos extratos de D. brasiliensis avaliados por CLAE (mg/mL) e CG (área em
porcentagem). Pela análise por CLAE o composto 3 está em maior
quantidade, seguido do 1 e 2, no entanto por CG a relação de área do
composto 1 é maior. Outra divergência encontrada é com relação aos
compostos 2 e 3 nos extratos obtidos com hexano. A porcentagem em área e
é maior nos extratos em hexano do que nos extratos em DCM quando
analisados por CG.
A metodologia realizada por CLAE para a quantificação dos drimanos
nos extratos de D. brasiliensis foi validada, e a concentração de cada
composto foi determinada pela equação da reta obtida por uma curva
analítica, por isso se tem maior confiabilidade nos resultados obtidos por essa
técnica. Assim, pode-se estabelecer que a análise da área direta por CG não
foi precisa para a quantificação dos drimanos, mas se mostrou eficiente e
rápida quando avaliados qualitativamente. Realizar uma curva analítica para
cada drimanos na CG, e obter através da equação da reta os rendimentos dos
compostos seria uma proposta mais precisa para a quantificação, uma vez que
o tempo de análise é muito menor comparado com o da CLAE. Em quanto a
85
análise por CLAE foi de 50 min, a CG levou 20 min para a obtenção dos
cromatogramas. Outro aspecto é a utilização de solventes, que na CLAE um
grande volume é usado para a fase móvel.
Figura 16 – Comparação das concentrações dos compostos 1-3 nos extratos de D.
brasiliensis avaliados por CLAE e CG.
a) Análise por CLAE
b) Análise por CG
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-
poligodial; Hex = hexano; DCM = diclorometano.
Por todos esses aspectos as técnicas de CCD e CG foram eficientes e
rápidas para a análise qualitativa dos extratos e a CLAE mais precisa para a
quantificação dos drimanos. Assim pode-se estabelecer que o melhor
0
50
100
150
200
250
300
350
Hex
1:10
Hex
1:20
DCM
1:10
DCM
1:20
Hex
1:10
Hex
1:20
DCM
1:10
DCM
1:20
2 horas 6 horas
Co
nce
ntr
ação
(m
g/m
L)
1
2
3
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Hex
1:10
Hex
1:20
DCM
1:10
DCM
1:20
Hex
1:10
Hex
1:20
DCM
1:10
DCM
1:20
2 horas 6 horas
Co
nce
ntr
ação
(%
de
área
)
1
2
3
86
processo extrativo que proporcionaram maiores rendimentos em massa e
altas concentrações dos drimanos nos extratos foi utilizando o solvente DCM,
na proporção droga vegetal:solvente 1:10, e com tempo de 6 h de maceração
dinâmica.
5.2 Atividade citotóxica
Recentemente Fratoni et al. (2016) avaliaram os drimanos 1-3 em
células K562 e Nalm6, e obtiveram resultados de citotoxicidade
significativos. No presente estudo os extratos previamente quantificados
(hexano, 1:20 – 6 h; DCM, 1:20 – 6 h) e o extrato hidroetanólico (96 ºGL,
1:10 – 8 h) realizado por Athayde (2015) foram avaliados nas mesmas células
a fim de correlacionar a quantidade dos drimanos presentes nos extratos com
a atividade citotóxica. Os valores de CI50 (g/mL) estão listados na tabela
abaixo.
Tabela 5 – Avaliação da viabilidade celular dos extratos das cascas de D. brasiliensis
nas linhagens celulares.
Amostra K562
CI50 ±s (µg/mL)
Naml6
CI50 ±s (µg/mL)
Extrato hexano (1:20 – 6 h) 13,07 ± 0,47a 11,91 ± 1,38a
Extrato DCM (1:20 – 6 h) 20,37 ± 4,13b 14,72 ± 3,19ab
Extrato etanol (96 ºGL, 1:10 – 8 h) 29,85 ± 0,39c 20,31 ± 2,61b
Drimanial (1)* 11,12 ± 0,31 9,79 ± 0,23
1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2)* 1,40 ± 0,08 3,24 ± 0,05
1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial (3)* 5,32 ± 0,47 5,22 ± 0,15
Vincristina >20,00 ± 0,0b 2,7 ± 2,12c
s = desvio padrão; K562 = leucemia mieloide crônica; Nalm6 = linfoblástica aguda;
letras iguais na mesma coluna correspondem à médias estatisticamente iguais (p >
0,05); *Fratoni et al. (2016).
Os resultados obtidos na análise citotóxica foram comparados de acordo
com Fouche et al. (2008), no qual para a avaliação de extratos ele estabelece
a inibição total de crescimento (TGI) em quatro categorias de avaliação:
inativo (TGI > 50 µg/mL), atividade fraca (15 µg/mL < TGI < 50 µg/mL),
atividade moderada (6,25 µg/mL < TGI < 15 µg/mL) e atividade potente (TGI
< 6,25 µg/mL).
Os extratos hexano, DCM e hidroetanólico quando avaliados na célula
K562 apresentaram diferença estatística nos valores de CI50, no qual o extrato
87
de hexano exibiu uma maior atividade citotóxica, sendo esta moderada,
enquanto os extratos DCM e hidroetanólico obtiveram uma atividade fraca.
Quando avaliada a célula Nalm6 os extratos realizados em hexano e DCM
não apresentaram diferença estatística nos valores de CI50 e obtiveram uma
atividade citotóxica moderada. O valor de CI50 do extrato hidroetanólico foi
estatisticamente igual ao obtido pelo extrato em DCM, mas biologicamente
apresentou uma atividade citotóxica fraca frente a célula avaliada.
O extrato de hexano exibiu os resultados mais significativos para ambas
as células, mesmo sendo este o que apresentou menor quantidade dos
drimanos, seguido do DCM e hidroetanólico. Por se tratar de uma matriz
complexa, o extrato em hexano possui outros compostos de caráter apolar,
que podem estar auxiliando na atividade. Quando analisado a atividade
citotóxica dos drimanos isolados reportados por Fratoni et al. (2016) nas
mesmas linhagens celulares, observa-se que os valores de CI50 são inferiores
aos apresentados pelos extratos, sendo assim a atividade mais significativa.
Porém a concentração de cada drimano encontrada nos extratos é muito
menor do que quando são avaliados isoladamente.
Os drimanos 1-3 também foram avaliados em células de linfoma de
Burkitt (RAMOS e RAJI), linfoma histiocítico difuso (U937), leucemia
linfoblástica aguda de célula T (MOLT4), leucemia linfoide aguda (REH e
B15), osteossarcoma (HOS) e carcinoma de pulmão (NCI-H1299). Os dados
estão apresentados na Tabela 6. Os resultados de CI50 variaram de 10,13 a
13,86 µM para o composto 1, 1,29 a 14,35 µM para o 2 e de 0,13 a 12,31 µM
para o 3. O composto 2 demonstrou resultados significativos para as células
U937, MOLT4 e B15 com valores de IC50 1,29, 1,77 e 1,74 μM, no entanto
entre os drimanos avaliados o 3 foi o que apresentou os melhores resultados
com valores de CI50 de 0,80, 0,13 e 1,17 μM para as células RAJI, MOLT4 e
REH, respectivamente. A atividade citotóxica do drimano 3 para as células
RAJI e MOLT4 foram estatisticamente iguais as apresentadas pelo controle
positivo daunorrubicina.
Quando se compara os valores de CI50 entre os drimanos 1 e 3, cuja
única diferença é a presença do grupamento hidroxila no carbono C-5 no
composto 1, observa-se uma diminuição da atividade. Em relação ao
composto 2, que não apresenta o grupamento hidroxila no carbono C-5, mas
sim no carbono C-7’ do grupamento cinamil os valores também são melhores
em relação ao composto 1.
88
Alguns valores de CI50 devem ser revistos, como os resultados do
composto 2 para as células RAMOS, RAJI, MOLT4 e o composto 3 para a
célula RAMOS e estes tiveram um desvio padrão elevado, indicando que o
teste não foi muito reprodutível, entretanto os valores das médias mostram
que estes compostos apresentam uma efetiva atividade frente essas células.
5.3 Toxicologia
5.3.1 Toxicologia aguda
Na medicina tradicional assume-se que a plantas são seguras, devido ao
longo tempo de uso. No entanto, as avaliações toxicológicas dos extratos de
plantas medicinais são indispensáveis para definir a segurança de seu
tratamento (FENNELL et al., 2004; SPONCHIADO et al., 2016). Assim,
neste trabalho foi avaliado a toxicidade do extrato hidroetanólico das cascas
de D. brasiliensis, para estabelecer possíveis efeitos adversos da planta.
Os resultados obtidos no estudo de toxicologia aguda não demonstraram
mortalidade na dose administrada por via oral (2000 mg/kg), assim a DL50 do
extrato das cascas de D. brasiliensis é superior a 2000 mg/kg e o extrato foi
considerado não-tóxico. Ainda, os animais tratados com o extrato não
apresentaram sinais tóxicos como irritabilidade, contorções, tremores,
convulsões, movimento straub, hipnose, sinais de anestesia, aumento ou
diminuição na micção ou defecação, piloereção ou cianose, comparados ao
grupo controle.
Comumente, a mudança do peso corporal e peso relativos dos órgãos
tem sido aceito como um sensível indicador de efeitos tóxicos causado por
xenobióticos (MICHAEL et al., 2007). No estudo não foi observado
diferença estatística no consumo de água e ração entre o grupo tratado e o
grupo veículo como pode ser visualizado na Tabela 7. Os animais tratados
com o extrato de D. brasiliensis apresentaram um consumo maior de
alimento, no entanto isto não alterou o peso desses animais quando
comparados ao veículo (Figura 17). Em adição, também não foi observado
diferença no peso relativo dos órgãos entre os grupos (Tabela 8) e não foram
observadas lesões e alterações macroscópicas nos órgãos vitais que poderia
ser atribuída ao tratamento com D. brasiliensis.
89
Tabela 6 – Avaliação da viabilidade celular dos compostos 1-3 nas linhagens celulares.
CI50 ± s (M)
Amostra RAMOS RAJI U937 MOLT4 REH B15 HOS H1299
1 10,13 ±
0,11a
10,38 ±
0,12a
10,74 ±
0,07a
12,42 ±
0,41a
13,86 ±
0,24a
11,88 ±
0,22a
13,72 ±
0,52a
11,58 ±
0,31a
2 4,09 ±
3,72bc
6,54 ±
3,90a
1,29 ±
0,04b
1,77 ±
1,28b
1,62 ±
0,04b
1,74 ±
0,13b
14,35 ±
0,57a
14,03 ±
0,59b
3 7,24 ±
2,53ab
0,80 ±
0,10b
10,63 ±
0,35a
0,13 ±
0,01bc
1,17 ±
0,08c
10,65 ±
0,04c
12,31 ±
0,27b
11,76 ±
0,30a
Daunorrubicina 0,21 ±
0,18c
0,02 ±
0,01b
0,11 ±
0,01c
0,001 ±
0,000c
0,01 ±
0,00d
0,09 ±
0,00d
0,08 ±
0,06c
0,09 ±
0,06c
(1) drimanial; (2) 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial; (3) 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial; s = desvio padrão; RAMOS e RAJI = linfoma
de Burkitt; U937 = linfoma histiocítico difuso; MOLT4 = leucemia linfoblástica aguda de célula T; REH e B15 = leucemia linfoide
aguda; HOS = osteossarcoma; NCI-H1299 = carcinoma de pulmão; letras iguais na mesma coluna correspondem à médias
estatisticamente iguais (p > 0,05).
90
Na literatura foi encontrado um estudo toxicológico realizado por
Gomes et al. (2013), que avaliaram o peso dos órgãos e sinais de toxicidade
dos animais, sob o efeito do óleo essencial das folhas de D. brasiliensis. O
óleo foi administrado por via oral nas doses de 175, 550 e 1000 mg/kg. Os
autores não observaram diferença no peso dos órgãos do grupo tratado com
o grupo controle, no entanto sinais tóxicos como redução da atividade
locomotora, ptose, exoftalmia, micção, diarreia, salivação, tremores, aumento
da taxa de respiração e contorção foram observados.
Nas folhas de D. brasiliensis são encontrados compostos como álcoois
e ácidos graxos, lignanas, sesquiterpenos e monoterpenos. A composição
química das folhas e das cascas são diferentes, todos os trabalhos encontrados
mostram que os drimanos presentes nas folhas não apresentam o grupamento
aldeídos ligados ao C-11 e C-12, e sim o grupamento lactona, no entanto nas
cascas estes estão em maior proporção, principalmente os compostos 1, 2, 3
e 4 (CLAUDINO, 2011; MALHEIROS, 2001; SILVA, 2009).
Tabela 7 – Consumo de água e ração dos animais tratados com o extrato de D.
brasiliensis e grupo veículo.
Tratamento
Consumo Veículo ± EPM (n = 5) D. brasiliensis ± EPM (n = 5)
Ração (g) dia 7 135,56 ± 78,80 180,07 ± 30,60
dia 14 119,33 ± 36,10 171,14 ± 46,53
Água (mL) dia 7 351,67 ± 62,74 472,00 ± 48,57
dia 14 312,00 ± 89,72 494,33 ± 73,13
EPM = erro padrão da média; *p < 0,05 vs grupo veículo.
Figura 17 – Peso acumulado dos animais tratados com extrato de D. brasiliensis e
grupo veículo.
0 7 14
0
2
4
6
8
10D. brasiliensisVeículo
Dias
% d
e p
eso
acum
ula
do
91
Tabela 8 – Peso dos órgãos dos animais do grupo veículo e o grupo tratado com
extrato de D. brasiliensis.
Tratamento
Órgão Veículo ± EPM (n = 5) D. brasiliensis ± EPM (n = 5)
Coração Absoluto 0,96 ± 0,07 0,92 ± 0,04
Relativo 0,36 ± 0,02 0,35 ± 0,01
Pulmão Absoluto 1,27 ± 0,05 1,28 ± 0,03
Relativo 0,48 ± 0,01 0,49 ± 0,01
Fígado Absoluto 7,25 ± 0,50 6,12 ± 0,28
Relativo 2,71 ± 0,16 2,34 ± 0,08
Baço Absoluto 0,74 ± 0,03 0,77 ± 0,05
Relativo 0,28 ± 0,01 0,29 ± 0,02
Rim
esquerdo
Absoluto 1,09 ± 0,06 0,96 ± 0,04
Relativo 0,41 ± 0,03 0,36 ± 0,01
Rim
direito
Absoluto 1,07 ± 0,07 0,92 ± 0,04
Relativo 0,40 ± 0,03 0,35 ± 0,01
EPM = erro padrão da média; *p < 0,05 vs grupo veículo.
Os marcadores bioquímicos são parâmetros indispensáveis para a
avaliação do funcionamento destes órgãos. Altos níveis no soro de AST, ALT
e ALP podem predizer danos hepáticos (SEIF, 2016), assim como, ureia e
creatinina em altas concentrações indicam danos renais (MODARRESI et al.,
2014). Os valores dos parâmetros bioquímicos de AST, ALT, ALP, ureia e
creatinina dos animais tratados não estão alterados, quando comparadas com
o grupo controle (Tabela 9). Os exames histopatológicos do fígado e rins dos
animais tratados apresentaram arquitetura normal e conservada, sem lesões
degenerativas ou inflamatórias (Figura 18). Em conjunto esses resultados
demonstram que o tratamento agudo com D. brasiliensis na concentração de
2000 mg/kg não produz danos hepáticos ou renais.
92
Figura 18 – Observações histopatológicas do fígado e rim dos animais tratados com
extrato de D. brasiliensis e o grupo veículo. Aumento: 400 x
Veículo D. brasiliensis
Fígado
Rim
Tabela 9 – Parâmetros bioquímicos dos animais do grupo veículo e tratados com
extrato de D. brasiliensis.
Tratamento
Parâmetros Veículo ± EPM (n = 5) D. brasiliensis ± EPM (n = 5)
Glicose (mg/dL) 102,00 ± 28,48 92,83 ± 6,18
AST (U/L) 159,75 ± 6,01 232,60 ± 32,60
ALT (U/L) 32,25 ± 3,42 33,33 ± 2,53
ALP (U/L) 20,10 ± 3,68 19,35 ± 3,69
Colesterol total (mg/dL) 70,50 ± 9,16 45,00 ± 11,84
Ureia (mg/dL) 40,00 ± 2,12 35,00 ± 1,57
Creatinina (mg/dL) 0,41 ± 0,04 0,33 ± 0,05
EPM = erro padrão da média; AST = alanina aminotransferase; AST = aspartato
aminotrasferase; ALP = fosfatase alcalina; *p < 0,05 vs grupo veículo.
A fim de avaliar os efeitos toxicológicos do extrato de D. brasiliensis
sobre os parâmetros sanguíneos, medidas hematológicas foram realizadas
como eritrócitos (RBC), hematócrito (HTC), hemoglobina (Hb), volume
corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM),
concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), distribuição das
93
células vermelhas (RDW), plaquetas, leucócitos (WBC), neutrófilos,
linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos.
No presente estudo, pode-se observar uma diferença entre o número de
WBC do grupo tratado em relação ao grupo controle. A diferença estatística
não é biologicamente relevante, uma vez que o valor está dentro da faixa
normal para a espécie em estudo, segundo dados do biotério Charles Rivers
(LIMA et al., 2014). Os restantes dos parâmetros avaliados não apresentaram
diferença significativa em relação ao grupo controle (Tabela 10).
Tabela 10 – Parâmetros hematológicos dos animais do grupo veículo e tratados com
extrato de D. brasiliensis.
Tratamento
Parâmetros Veículo ± EPM (n = 5) D. brasiliensis ± EPM (n = 5)
RBC (106/mm3) 5,83 ± 0,16 5,90 ± 0,17
Hb (g/dL) 12,37 ± 0,58 12,75 ± 0,29
HCT (%) 32,43 ± 0,97 32,82 ± 0,90
VCM (fL) 55,63 ± 0,54 55,63 ± 0,46
HCM (pg) 21,2 ± 0,49 21,60 ± 0,17
CHCM (g/dL) 38,13 ± 0,62 38,85 ± 0,28
RDW (%) 12,97 ± 0,29 13,28 ± 0,24
Plaquetas (10³/mm³) 520,00 ± 82,95 563,00 ± 12,96
WBC (103/mm3) 1,67 ± 0,12 2,43 ± 0,13*
Neutrófilos (%) 11,00 ± 5,86 12,67 ± 3,00
Linfócitos (%) 87,33 ± 6,33 87,00 ± 2,78
Monócitos (%) 1,67 ± 0,88 0,83 ± 0,31
Eosinófilos (%) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Basófilos (%) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
EPM = erro padrão da média; RBC = eritrócitos, Hb = hemoglobina; HTC =
hematócrito; VCM = volume corpuscular médio; MHC = hemoglobina corpuscular
média; CHCM = concentração de hemoglobina corpuscular média; RDW =
distribuição das células vermelhas; WBC = leucócitos; *p < 0,05 vs grupo veículo.
94
5.3.2 Teste do micronúcleo e atividade hemolítica
A exposição de substâncias exógenas ou endógenas podem causar
danos no DNA, que resultam em erros na transcrição e replicação do DNA,
consequentemente ocorrem à alteração no mecanismo celular e integridade
genética, levando ao desenvolvimento de várias patologias entre elas, o
desenvolvimento do câncer (MAJIDINIA; YOUSEFI, 2016; PEARL et al.,
2015).
O teste do micronúcleo é utilizado para mensurar a segurança de
substâncias exógenas, classificando ou não como mutagênico. Os
micronúcleos representam fragmentos cromossômicos ou cromossomas
deixados para trás na anáfase. É basicamente um teste para avaliar compostos
que causam rupturas cromossômicas (agentes clastogênicos) e que interferem
na divisão celular (ALBAS et al., 2014).
A Tabela 11 apresenta a porcentagem dos eritrócitos policromáticos
(PCE) e com micronúcleos (PCEMN), obtidos do grupo veículo, grupos
tratados com o extrato de D. brasiliensis (2000 mg/kg) e MMS (50 mg/kg).
O MMS produz significativamente aberrações cromossomal nas células
eritrocitárias. Pode-se observar que a quantidade de PCEMN no grupo MMS
foi de 11,90%, já no grupo veículo e tratado com o extrato os valores não
ultrapassaram 2%. Através da análise estatística foi possível observar que o
valor de PCEMN do grupo MMS é superior e estatisticamente diferente do
grupo tratado. Quando comparado o grupo veículo com o tratado os valores
são estatisticamente iguais, assim o extrato hidroetanólico de D. brasiliensis
não apresentou genotoxicidade na dose 2000 mg/kg por via oral.
Tabela 11 – Porcentagem dos eritrócitos policromáticos (PCE) e contento
micronúcleos (PCEMN) dos animais tratados com extratos da D. brasiliensis e grupo
veículo.
Grupo Dose (mg/kg) ± EPM
(n = 5)
PCEMN/1000PCE (%) ± EPM
(n = 5)
Veículo - 0,33 ± 0,33
MMS 50 11,90 ± 1,09*
D. brasiliensis 2000 1,37 ± 0,23
EPM = erro padrão da média; MMS = metil-metano-sulfóxido; *p < 0,05 vs grupo
veículo.
95
A hemólise é considerada um bom método para avaliar a citotoxicidade,
sendo recomendada pela OECD 487 (OECD, 2014), na qual é verificada
através do extravasamento da hemoglobina por consequência da ruptura dos
eritrócitos. Os ensaios de hemólise são importantes para triagens
toxicológicas e biológicas de produtos derivados de plantas, uma vez que elas
são amplamente utilizadas na medicina popular (PEREIRA et al., 2016).
No teste de atividade hemolítica as concentrações iniciais de 0,1, 10 e
100 µg/mL do extrato não apresentaram hemólise nos eritrócitos e foram
estatisticamente diferentes do grupo Triton-X e iguais ao grupo veículo. A
concentração de 1 µg/mL embora tenha mostrado diferença estatística
comparado ao grupo veículo, também foi diferente do grupo Triton-X (Figura
19). Em média foi observado menos de 5% de hemólise para as concentrações
iniciais. No entanto, na concentração extrapolada de 1000 µg/mL, foi
observado 100% de hemólise. Essa concentração não refere toxicidade in
vivo, somente in vitro.
Figura 19 – Porcentagem de hemólise dos eritrócitos do grupo veículo, tratado com
extrato de D. brasiliensis e Triton-X.
Triton
-X
Veí
culo 0,
1 1 10 100
1000
0
2
4
6
8
1050
60
70
80
90
100
Drimys brasiliensis (g/mL)
* **
**
# #
#
Hem
óli
se (
%)
*p < 0,05 vs grupo Triton-X; #p < 0,05 vs grupo veículo.
Em conjunto, todos os resultados obtidos com o tratamento do extrato
de D. brasiliensis não demonstraram alterações no funcionamento dos
órgãos, principalmente fígado e rins, nos parâmetros bioquímicos e
hematológicos, também não apresentou mutagenicidade e hemólise das
96
células. Vale ressaltar que se faz necessário outros testes para estabelecer que
o extrato não apresenta toxicidade, como testes de doses repetidas e ensaio
de toxicidade crônico, e também analisar os drimanos isolados,
principalmente os que apresentaram atividade biológica significativa nos
ensaios de citotoxicidade.
5.4 Identificação dos compostos das folhas de D. brasiliensis
Na literatura existem poucos relatos sobre a composição química e
atividade biológica das folhas de D. brasiliensis. Alguns trabalhos descrevem
a presença de compostos das classes das lignanas, sesquiterpenos e
monoterpenos, como o drimenol (13), cubebina (20), sabineno (21),
biciclogermacreno (22) e ciclocolorenono (28) (GOMES, 2012; GOMES et
al., 2013; LAGO et al., 2010; LIMBERGER et al., 2007; MALHEIROS,
2001). As atividades biológicas descritas na literatura são atribuídas ao óleo
essencial das folhas, como a anti-inflamatória, nociceptiva (LAGO et al.,
2010) e citotóxica (GOMES, 2012).
Tendo em vista que se conhece pouco sobre a composição química das
folhas, este trabalho pretende auxiliar na investigação fitoquímica das folhas.
Desta forma, a partir de procedimentos cromatográficos realizados com o
extrato CHCl3 foi possível isolar e identificar 4 compostos. Na Figura 20 está
apresentado o fluxograma dos procedimentos realizados.
97
Figura 20 – Fluxograma dos procedimentos cromatográficos do extrato clorofórmico das folhas de D. brasiliensis.
CA = coluna A; CB = coluna B; CC = coluna C; CD = coluna D; CE = coluna E.
98
5.4.1 Composto DBFA 19-33
A substância DBFA 19-33 foi isolada como um sólido branco com
rendimento de 0,112 g e por meio de análises espectroscópicas de massas e
IV foi possível determinar a estrutura como um álcool graxo.
No espectro de IV (Figura 21) são observadas as bandas em 2848 cm-1
referente a estiramento de C-H de carbono sp3, deformação de C-H em 1469
cm-1, estiramento de O-H em 3300 cm-1 e em 1130 cm-1 estiramento de C-O.
Figura 21 – Espectro de IV do composto DBFA 19-33.
No espectro de massas (Figura 22) é possível observar o pico base em
m/z = 57 e as quebras referente a série homóloga de CH2 em m/z = 43, 57,
71, 85, 99. Com os dados em conjunto é possível sugerir que a estrutura se
trata de um álcool graxo de cadeia longa.
Figura 22 – Cromatograma e espectro de massas do composto DBFA 19-33.
99
5.4.2 Composto DBFA 14
A substância DBFA 14 foi isolada após procedimentos cromatográficos
como um sólido branco, com rendimento de 0,016 g e foi solúvel em
clorofórmio e acetona. A estrutura foi identificada através de análises
espectroscópicas de IV, massas, RMN de 1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC,
COSY e NOESY como uma lignana a (8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R)-
bicubebina (54), trata-se de um dímero da cubebina (20), esta foi previamente
isolada das folhas de D. brasiliensis por Malheiros (2001).
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
2
5
6
79
9'7'
6'
5'
2'
9''
9'''
7'' 2''
5''6''
7'''
2''' 6'''
5'''
(8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R)-bicubebina (54)
No espectro de IV (Figura 26) foi observado bandas em 1610, 1498,
1485 e 1140 cm-1 referente ao estriamento de C=C dos aromáticos, uma banda
em 1242 cm-1 de estiramento de C-O e as bandas em 1850 e 1750 cm-1 relativo
as harmônicas de aromáticos.
100
Figura 23 – Espectro de IV do composto DBFA 14.
A amostra foi avaliada por CG e um único pico foi visualizado com um
tempo de retenção de 9,35 min (Figura 27). No espectro de massas (Figura
28) não foi possível visualizar o íon molecular em 694 referente a massa do
(8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R)-bicubebina (54). O pico com m/z = 338 refere-se
a quebra permanecendo o monômero cubebina (20) e eliminando uma
molécula de H2O. Outras fragmentações observadas no espectro em m/z =
77, 81, 135 e 202 são referentes a outros fragmentos da molécula que estão
apresentados na Figura 29.
Figura 24 – Perfil cromatográfico por CG do composto DBFA 14.
101
Figura 25 – Espectro de massas do composto DBFA 14.
Figura 26 – Principais fragmentações do DBFA 14.
Os espectros de 1H, 13C e DEPT estão apresentados nas Figuras 30, 31
e 32. Os valores de deslocamento químicos de 1H e 13C foram comparados
com algumas lignanas, entre elas a cubebina (20) e a
(8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55) (PASCOLI; NASCIMENTO;
LOPES, 2006). Os deslocamentos de 1H e 13C foram confirmado pelo
espectro de HSQC (Figura 33) que estabelece correlação a uma ligação entre
os carbonos e seus respectivos hidrogênios. Nas Tabelas 12 e 13 estão
102
apresentados os valores de deslocamentos químicos da
(8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55) e do DBFA 14 e similaridade
entre os hidrogênios e carbonos dos dois compostos foi observada.
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
2
5
6
79
9'7'
6'
5'
2'
9''
9'''
7'' 2''
5''6''
7'''
2''' 6'''
5'''
(8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55)
Figura 27 – Espectro de RMN 1H (300 MHz, Piridina-d/TMS) do composto DBFA
14.
103
Figura 28 – Espectro de RMN ¹3C (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto DBFA
14.
Figura 29 – Espectro de DEPT (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto DBFA 14.
O espectro de HMBC (Figura 34) apresenta correlações a 2 ou 3
ligações entre carbono e hidrogênio. Para o DBFA 14 foi observado
correlações entre a unidade do carbono anomérico com uma unidade do
hidrogênio anomérico (C:104,2 com H: 5,69 e C: 99,3 com H: 5,69) o que
sugere que as unidades estão ligadas C-9 → O → C-9’’ conforme trabalho de
Pascoli, Nascimento e Lopes (2006). Os valores de deslocamento químico
atribuidos aos C-9 e C-9’’ do DBFA 14 (C 104,2/CH; 99,3/CH) e estão
104
diferentes do composto (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55) (C
108,6/CH; 104,2/CH), o que sugere mudanças na conformação espacial dos
hidrogênios em questão. Em adição o espectro de COSY (Figura 35) mostrou
as correlações entre 1H-1H (1H-9 com 1H-8; 2H-9’ com 1H-8’; 1H-9’’ com
1H-8’’; 2H-9’’’ com 1H-8’’’).
Para confirmar a conformação espacial da substância o espectro de
NOESY foi obtido (Figura 36). Este correlaciona 1H-1H espacialmente. O H-
8 apresentou interação espacial com o H-9 ( 5,69), H-7 ( 2,48) e H-7’ (
2,48) o que sugere que o grupo metilenodioxibenzil está na conformação
trans ao H-9. O H-8’ correlacionou com H-7 ( 2,63) e com o H-9’ ( 4,18)
e não apresentou correlação com o H-8, sugerindo que o grupo
metilenodioxibenzil ligado ao C-8’ está trans ao mesmo grupo ligado ao C-
8. O mesmo acontece ao grupo ligado ao C-8’’, pois o H-8’’ mostrou
correlação com o H-9’’ ( 5,69), H-7’’ ( 3,18) e H-7’’’ ( 2,50),
estabelecendo que o grupo metilenodioxibenzil está na conformação trans ao
H-9’’ e o H-8’’’ correlacionou com H-7’’ ( 2,87) e com o H-9’’’ ( 4,36) e
não apresentou correlação com o H-8’’. Assim o grupo metilenodioxibenzil
também está na conformação trans ao mesmo grupo ligado ao C-8’’.
Figura 30 – Correlações espacial entre 1H-1H (↔) obtidas do espectro de NOESY do
composto DBFA 14.
105
Tabela 12 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 1H para o composto
DBFA 14 e (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55).
(continua)
Posição
DBFA 14 1H (ppm) mult. J
(Hz)
55* 1H (ppm) mult. J
(Hz)
DBFA 14
1D-NOESY
1
2 6,82 sl (J = 2,0) 6,46 d (J = 1,5)
3
4
5 6,83 d (J = 8,1) 6,6 d (J = 8,0)
6 6,75 dd (J = 8,1; 2,0) 6,4 dd (J = 8,0; 1,5)
7 2,48 dd (J = 13,5; 8,0)
2,63 dd (J = 13,5; 8,0)
2,32 dd (J = 13,5; 8,0)
2,47 dd (J = 13,5; 7,5)
H-8’
8 2,51 m 2,11 dddd (J = 8,0; 7,5;
6,0; 2,0)
H-7, H-7’
9 5,69 sl 4,76 d (J = 2,0) H-8
1’
2’ 6,82 sl 6,43 d (J = 1,5)
3’
4’
5’ 6,75 d (J = 8,1) 6,58 d (J = 8,0)
6’ 6,75 dd (J = 8,1; 2,0) 6,42 dd (J = 8,0; 1,5)
7’ 2,48 dd (J = 13,5; 8,0)
2,82 dd (J = 13,5; 8,0) 2,51 d (J = 8,0)
H-8
8’ 2,3 m 2,04 dddt (J = 8,5; 7,5;
6,0; 8,0)
H-7, H-9’
9’ 4,18 t (J = 8,1)
4,08 t (J = 8,1)
3,92 t (J = 8,5)
3,62 dd (J = 8,5; 7,5)
H-8’
1’’
2’’ 7,11 sl 6,51 d (J = 2,0) H-7’’
3’’
4’’
5’’ 6,72 d (J = 8,0) 6,60 d (J = 8,5)
6’’ 6,90 d (J = 8,0) 6,44 dd (J = 8,5; 2,0)
7’’ 3,18 dd (J = 13,5; 10,0)
2,87 dd (J = 13,5, 10,0)
2,49 dd (J = 13,5; 8,5)
2,43 dd (J = 13,5; 6,5)
H-2’’
8’’ 2,1 m 1,95 tdd (J = 8,5; 6,5;
5,0)
H-7’’, H-
7’’’
9’’ 5,69 sl 4,81 d (J = 5,0) H-8’’
1’’’ 6,54 d (J = 2,0)
106
Tabela 12 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 1H para o composto
DBFA 14 e (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55).
(conclusão)
Posição
DBFA 14 1H (ppm) mult. J
(Hz)
55* 1H (ppm) mult. J
(Hz)
DBFA 14
1D-NOESY
2’’’ 6,85 sl
3’’’
4’’’
5’’’ 6,81 d (J = 8,0) 6,64 d (J = 8,0)
6’’’ 6,90 d (J = 8,0) 6,50 dd (J = 8,0; 2,0)
7’’’ 2,75 dd (J = 13,5; 10,0)
2,50 dd (J = 13,5; 10,0)
2,36 dd (J = 13,5; 9,5)
2,60 dd (J = 13,5; 5,0)
8’’’ 2,73 m 2,27 dddt (J = 9,5; 7,0;
5,0; 8,5)
H-7’’, H-
9’’’
9’’’ 4,36 t (J = 8,0)
3,77 t (J = 8,0)
3,51 dd (J = 8,5; 7,0)
4,0 t (J = 8,5)
H-8’’’, H-
9’’’
OCH2O 8x 5,95 sl
5,77 d (W1/2 1,5)
5,82 d (W1/2 1,5)
6x 5,85 br s
Solvente Piridina-d - 300 MHz CDCl3 - 500 MHz Piridina-d -
300 MHz
*Pascoli, Nascimento e Lopes (2006); 55 = (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin
Tabela 13 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 13C e DEPT para o
composto DBFA 14 e (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55).
(continua)
Posição DBFA 14
13C (ppm)/DEPT
55* 13C (ppm)/DEPT
DBFA 14
2D-HBMC
1 135,9/C 133,4/C
2 109,9/CH 109,0/CH
3 148,5/C 147,7/C OCH2O
4 146,5/C 145,8/C OCH2O
5 108,8/CH 108,1/CH
6 122,3/CH 121,7/CH
7 39,3/CH2 38,5/CH2 H-6, H-9, H-2,
H-8’
8 54,3/CH 52,7/CH H-9’, H-9,
H-8’
9 104,2/CH 108,6/CH H-9’’
1’ 135,4/C 134,6/C H-8’
107
Tabela 13 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 13C e DEPT para o
composto DBFA 14 e (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55).
(conclusão)
Posição DBFA 14
13C (ppm)/DEPT
55* 13C (ppm)/DEPT
DBFA 14
2D-HBMC
2’ 110,2/CH 109,0/CH
3’ 148,5/C 147,6/C OCH2O
4’ 146,6/C 146,0/C OCH2O
5’ 108,8/CH 108,2/CH
6’ 122,3/CH 121,4/CH
7’ 39,6/CH2 39,4/CH2 H-9’, H-8’
8’ 46,9/CH 45,4/CH H-9’, H-9
9’ 72,2/CH2 72,4/CH2 H-9, H-8’
1’’ 134,1/C 134,1/C H-7’’, H-8’’
2’’ 110,4/CH 109,1/CH H-7’’
3’’ 147,7/C 147,7/C OCH2O
4’’ 145,7/C 145,7/C H-2’’, OCH2O
5’’ 108,7/CH 108,1/CH
6’’ 122,6/CH 121,3/CH H-7’’, H-2’’
7’’ 34,8/CH2 33,9/CH2 H-2’’, H-6’’, H-
8’’
8’’ 53,1/CH 51,7/CH H-9’’’, H-9’’,
H-7’’
9’’ 99,3/CH 104,2/CH H-9’’’, H-7’’,
H-8’’, H-9
1’’’ 134,2/C 134,2/C
2’’’ 109,9/CH 109,0/CH
3’’’ 147,6/C 147,6/C OCH2O
4’’’ 145,8/C 145,8/C OCH2O
5’’’ 108,9/CH 108,2/CH
6’’’ 122,7/CH 121,5/CH
7’’’ 40,0/CH2 39,4/CH2 H-9’’’
8’’’ 44,2/CH 43,6/CH H-9’’, H-9’’’,
H-7’’, H-8’’
9’’’ 72,6/CH2 72,4/CH2 H-9’’
OCH2O 4X 101,6/CH2 4x 100,8/CH2
Solvente Piridina-d - 300 MHz CDCl3 - 500 MHz Piridina-d - 300
MHz
*Pascoli, Nascimento e Lopes (2006); 55 = (8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin
108
Figura 31 – Espectro de HSQC (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto DBFA 14.
Figura 32 – Espectro de HMBC (75,5 MHz, Piridina-d/TMS) do composto DBFA
14.
109
Figura 33 – Espectro de COSY (300 MHz, Piridina-d/TMS) do composto DBFA 14.
Figura 34 – Espectro de NOESY (300 MHz, Piridina-d/TMS) do composto DBFA
14.
O composto (8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R)-bicubebina (54) está sendo
reportado pela primeira vez na literatura. Seu isômero
(8R,8’R,8’’R,8’’’R,9R,9’’S)-bicubebin (55), foi isolado somente das raízes de
110
Aristolochia lagesiana e dos tubérculos de Aristolochia pubescens
(PASCOLI; NASCIMENTO; LOPES, 2006).
Na gênero Drimys o monômero cubebina (20) foi isolado, Malheiros
(2001) relata a presença nas folhas de D. brasiliensis. Esta também foi
encontrada em plantas do gênero Aristolochia (KUO; LI; WU, 2011), Justicia
(TRUJILLO et al.; 1990), Virola (CAVALCANTE; YOSHIDA;
GOTTLIEB, 1990), Cinnamomum (ADFA et al., 2016), Lychnophora
(BORSATO et al., 2000), Zanthoxyllum (BASTOS et al., 2001; SOUZA et
al., 2004) e Piper (GON; SCHAEFER, 2016; NIWA et al., 2013; PRABHU;
MULCHANDANI, 1984; RAJALEKSHMI et al., 2016; REZENDE et al.,
2016). Algumas atividades biológicas são atibuídas a cubebina (20) como
citotóxica (ADFA et al., 2016; NIWA et al., 2013; RAJALEKSHMI et al.,
2016), analgésico e antiinflamatório (BASTOS et al., 2001; BORSATO et al.
2000; SOUZA et al., 2004) antimicrobiano (REZENDE et al., 2016),
antitripanossoma (ESPERANDIM et al., 2013; DE SOUZA et al., 2005),
antihistamínico e vasodilatadora (PISSURNO; LAURENTIZ, 2017).
Na literatura não foram encontrados relatos de atividade biológica para
o dímero, mas menciona para o isômero, asssim se faz necessário avalia-lo,
principalmente frente as atividades já produzidas pela cubebina (20).
5.4.3 Composto DBFA 26
O composto DBFA 26 (0,018 g) foi isolado das folhas de D. brasiliensis
como um sólido amarelo e foi solúvel em acetona e clorofórimio. Ele foi
submetido a processos espectroscópicos de massas e RMN de 1H, 13C e
DEPT, sua estrutura foi elucidada como sendo o criptomeridiol (15),
composto pertecente a classe dos sesquiterpenos.
OH
12
OH
12
34
56
7
89
10
11
1314
15
Criptomeridiol (15)
O composto criptomeridiol possui uma massa molecular de M+ = 240,
porém no espectro de massas (Figura 37) foi observado o último pico em m/z
111
= 225. Este é relativo a perda de uma unidade de CH3. Outras fragmentações
também podem ser observadas como m/z = 149, referente a perda da hidroxila
e metila ligada ao carbono C-4 e o grupo isopropanol ligado ao carbono C-7.
O pico em m/z = 59 é respectivo ao grupo isopropanol e o pico base em m/z
= 43 é referente ao fragmento C3H7. Estas fragmentações estão representadas
na Figura 38.
Figura 35 – Espectro de massa do composto DBFA 26.
Figura 36 – Principais fragmentações do DBFA 26.
Na Tabela 14 estão apresentados os valores de deslocamento químicos
de 1H, 13C e DEPT do composto isolado DBFA 26 comparados com os dados
da literatura do criptomeridiol (15) (TEBBAA et al., 2011). Nos espectros de 1H e 13C (Figuras 39 e 40) são observados sinais característicos do núcleo
sesquiterpênico. Os sinais no espectro de 13C em δ 72,65 e 73,27 ppm são
relativos a carbonos oxigenados de álcool terciário, evidenciando a presença
de OH nos carbonos C-4 e C-11, respectivamente.
112
Figura 37 – Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do composto DBFA 26.
Figura 38 – Espectro de RMN ¹3C (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto DBFA 26.
113
Figura 39 – Espectro de DEPT (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto DBFA 26.
No cromatograma obtido pelo CG (Figura 42), é observado um único
sinal, referente ao DBFA 26. Este encontra-se com 94 % de pureza,
justificando a presença do sinal em C 29,70/CH2 no espectro de 13C, referente
a resíduos de silicone utilizados nas conexões de vidros do rotaevaporador.
Figura 40 – Perfil cromatográfico por CG do composto DBFA 26.
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
(x10,000,000)
114
Tabela 14 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 1H e 13C para o composto DBFA 26 e dados da literatura para o
criptomeridiol (15).
Posição DBFA 26
1H (ppm) mult. J (Hz)
Criptomeridiol* 1H (ppm) mult. J (Hz)
DBFA 26 13C (ppm) / DEPT
Criptomeridiol* 13C (ppm) / DEPT
1 1,10-2,00 m 1,05-1,80 m 40,9/CH2 41,1/CH2
2 1,10-2,00 m 1,05-1,80 m 20,1/CH2 20,1/CH2
3 1,10-2,00 m 1,05-1,80 m 43,3/CH2 43,5/CH2
4 72,6/C 72,3/C
5 1,24 s 1,22 m 54,6/CH 54,8/CH
6 1,10-2,00 m 1,05-1,80 m 22,7/CH2 22,5/CH2
7 1,10-2,00 m 1,05-1,80 m 49,9/CH 49,9/CH
8 1,10-2,00 m 1,05-1,80 m 21,4/CH2 21,5/CH2
9 1,10-2,00 m 1,05-1,80 m 44,6/CH2 44,6/CH2
10 34,5/C 34,5/C
11 73,3/C 72,9/C
12 1,19 s 1,20 s 26,5/CH3 27,3/CH3
13 1,18 s 1,20 s 27,5/CH3 27,1/CH3
14 0,86 s 0,86 s 22,5/CH3 22,6/CH3
15 1,09 s 1,12 s 18,7/CH3 18,6/CH3
Solvente CDCl3 - 300 MHz CDCl3 - 300 MHz CDCl3 – 75,5 MHz CDCl3 - 75 MHz
*Tebba et al. (2011).
115
Todos os dados espectroscópicos corroboram com os encontrados na
literatura, assim o composto DBFA 26 foi elucidado e confirmado como o
criptomeridiol (15).
No gênero Drimys o criptomeridiol (15) foi isolado anteriormente
somente das folhas de D. winteri (CRUZ; SILVA; SAMMES, 1973;
SIERRA; LÓPES; CORTÉS, 1986), sendo a primeira vez encontrado na
espécie D. brasiliensis. Na literatura é relatada sua presença nos gêneros
Hedychium (HARTATI; SUGANDA; FIDRIANNY, 2014), Esenbeckia
(RIOS; DELGADO, 2002), Artemisia (IRWIN; GEISSMAN, 1973),
Cryptomeria (SU; FANG; CHENG, 1994), Sphaeranthus (ROJATKAR;
NAGASAMPAGI, 1992), Flourensia (RIOS et al., 2013), Chenopodium
(MATA et al., 1987), Carissa (ACHENBACH, WAIBEL, ADDAE-
MENSAH, 1985), Blumea (SUJARWO et al., 2015), Cymbopogon (EVANS
et al., 1982; TEBBA et al., 2011), Goniothalamus (MOHARAM et al., 2012)
Juglans (LEE et al., 2002) e Trichilia (PUPO et al., 2002).
O criptomerediol apresenta algumas atividades biológicas, como
antifúngica (SUJARWO et al., 2015), citotóxica (LEE et al., 2002) e inibição
do fator de ativação plaquetária (MOHARAM et al., 2012).
5.4.4 Composto DBFA 25-28
A substância DBFA 25-28 foi isolada como um sólido amorfo amarelo
solúvel em clorofórmio e acetona com rendimento de 0,023 g. A estrutura foi
identificada através de análises espectroscópicas de RMN de 1H, 13C, DEPT
como o 1-β-(p-metoxicinamil)dendocarbin-A (56), da classe dos
sesquiterpenos drimanos.
12
34
56
7
O
O
13
O
O
OH
O9
10
1112
1'2'
3'4'
5'
6'
7'
8'
9'
14
15
8
1-β-(p-metoxicinamil)dendocarbin-A (56)
Os dados espectroscópicos obtidos foram comparados ao composto
dendocarbin-A (36) (SAKIO et al., 2001) para confirmar o núcleo drimano e
116
com o drimanial (1) (MALHEIROS et al., 2001) para estabelecer o
grupamento p-metoxicinamil. Nas Tabelas 15 e 16 estão apresentados os
valores de deslocamento químico de 1H, 13C e DEPT para todos os
compostos.
No espectro de RMN de 1H (Figura 43) não foram detectados sinais
entre 9,00 a 10,00 ppm e no espectro de RMN 13C (Figura 44) entre 190,0 a
203,0 ppm, evidenciando a ausência de grupos aldeídos presentes na estrutura
do drimanial. O deslocamento químico no RMN de 13C em δ 132,1 ppm (C-
7), 126,8 ppm (C-8) e 172,2 ppm (C-12) sugerem a presença do grupo éster
conjugado ao grupo lactona. Outros sinais encontrados entre δ 132,1 ppm (C-
5’, 9’) e δ 114,4 ppm (C-6’, 8’) e o dubletos em δ 7,67 ppm (H-5’, 9’) e δ
6,91 ppm (H-6’, 8’), típicos de grupamento aromático, juntamente com o
sinal em δ 3,85 referente a presença do grupo p-metoxicinamil.
O sinal em C 29,70/CH2 no espectro de 13C, também é visualizado para
este composto, e novamente se refere a resíduos de silicone.
Figura 41 – Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3/TMS) do composto DBFA 25-
28.
117
Figura 42 – Espectro de RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto DBFA 25-
28.
Figura 43 – Espectro de DEPT (75,5 MHz, CDCl3/TMS) do composto DBFA 25-28.
118
Tabela 15 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 1H para o composto
DBFA 25-28 e dados da literatura para o dendocarbin-A (36) e drimanial (1).
Posição DBFA 25-28
1H (ppm)
Dendocarbin-A* 1H (ppm)
Drimanial** 1H (ppm)
1 1,35; 1,83 m 1,33; 1,85 m 5,35 dd
2 1,48; 1,59 m 1,53; 1,66 m 1,82 m
3 1,29; 1,53 m 1,29; 1,52 m 2,04; 1,27 m
4
5 1,39 m 1,39 m
6 2,17 s 2,18; 2,47 m 2,93 dt; 2,52 dddd
7 6,92 s 6,90 s 7,04 q
8
9 2,63 s 2,57 s 3,73 s
10
11 9,78 d
12 9,36 s
13 0,96 s 0,98 s 1,06 s
14 1,1 s 1,02 s 1,23 s
15 0,91 s 0,93 s 1,17 s
1’
2’ 6,33 d (J = 15,9) 6,35 d (J = 16,0)
3’ 7,62 d (J = 15,9) 7,60 d (J = 16,0)
4’
5’, 9’ 7,67 d (J = 8,7) 7,64 d (J = 8,9)
6’, 8’ 6,91 d (J = 8,7) 6,99 d (J = 8,9)
7’
OMe 3,85 s 3,86 s
Solvente CDCl3 - 300
MHz CD3OD Acetona-d
*Sakio et al. (2001); **Malheiros et al. (2001).
119
Tabela 16 – Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN 13C para o composto
DBFA 25-28 e dados da literatura para o dendocarbin-A (36) e drimanial (1).
Posição DBFA 25-28
13C (ppm) / DEPT
Dendocarbin-A* 13C (ppm)
Drimanial** 13C (ppm)
1 81,3/CH 41,3/CH2 77,6/CH
2 24,2/CH2 20,1/CH2 25,0/CH2
3 39,2/CH2 44,1/CH2 35,1/CH2
4 37,1/C 34,6/C 38,9/C
5 54,5/CH 51,4/CH 78,1/C
6 22,7/CH2 26,6/CH2 32,6/CH2
7 132,1/CH 137,8/CH 150,7/CH
8 126,8/C 130,6/C 141,4/C
9 57,4/CH 60,4/CH 56,3/CH
10 37,1/C 36,2/C 47,4/C
11 98,5/CH 201,2/CH
12 172,2/C 171,1/C 193,2/CH
13 32,4/CH3 34,4/CH3 27,7/CH3
14 22,4/CH3 22,6/CH3 25,6/CH3
15 14,1/CH3 15,6/CH3 13,5/CH3
1’ 166,5/C 166,4/C
2’ 115,5/CH 116,7/CH
3’ 144,7/CH 145,2/CH
4’ 126,7/C 127,9/C
5’, 9’ 132,1/CH 130,8/CH
6’, 8’ 114,4/CH 115,2/CH
7’ 161,9/C 162,5/C
OMe 55,4/CH3 55,6/CH3
Solvente CDCl3 – 75,5 MHz CD3OD Acetona-d
*Sakio et al. (2001); **Malheiros et al. (2001).
Os dados em conjunto permitem estabelecer que a substância se trata do
1-β-(p-metoxicinamil)dendocarbin-A (56) e está sendo relatada pela primeira
vez na literatura.
O núcleo dendocarbin A (36) havia sido isolado anteriormente nas
cascas de D. winteri (PAZ et al., 2015; ROBLES et al., 2014) e Warburgia
ugandensis (XU et al., 2009) e também foi encontrado em espécies de
moluscos, Doriopsilla pelseneeri e Dendrodoris carbunculosa (GASPAR et
al., 2005; SAKIO et al., 2001). Na literatura não há relatos que o mesmo
apresente atividade biológica.
120
Os compostos com grupamento cinamil ligado ao C-1 do núcleo
drimano são amplamente encontrados no gênero Drimys, principalmente nas
cascas das espécies D. angustifolia e D. brasiliensis. Os sesquiterpenos
drimanos drimanial (1), 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial (2) e 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial (3) são exemplos dessa classe de compostos. Nas
folhas de D. brasiliensis compostos com este grupamento nunca haviam sido
isolados.
Portanto, das folhas de D. brasiliensis foi possível isolar 4 compostos,
no qual o criptomeridiol (15), (8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R)-bicubebina (54) e
1-β-(p-metoxicinamil)dendocarbin-A (56) foram encontrados pela primeira
vez na espécie, e o 54 e 56 relatados pela primeira vez na literatura.
121
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos foi possível concluir que:
- Os extratos obtidos das cascas de D. brasiliensis com o solvente DCM
na proporção 1:10 com o tempo de extração em 6 h, apresentaram rendimento
em massa superior aos outros processos, em função da semelhança entre a
polaridade do solvente e dos drimanos;
- O solvente DCM e tempo de 6 h foram os fatores que influenciaram
significativamente na extração dos sesquiterpenos drimanos drimanial, 1-β-
(p-cumaroiloxi)-poligodial e 1-β-(p-metoxicinamil)-poligodial;
- As técnicas de CCD e CG se mostraram eficientes para a análise
qualitativa dos extratos, uma vez que os drimanos de interesse foram
visualizados. A proporção entre eles foi previamente estabelecida pela
intensidade da cor da mancha na CCD e no tamanho do pico por CG;
- A análise dos drimanos pela técnica de CLAE possibilitou a
quantificação destes, obtendo-se uma boa correlação linear com os
rendimentos dos extratos brutos;
- O método por CG não foi eficiente para quantificar os drimanos por
área direta em porcentagem;
- Os diferentes extratos (DCM e hexano; 1:20; 6 h) apresentaram
atividade citotóxica moderada para células K562 e Nalm6 e a quantidade dos
drimanos presente não influenciou na ação;
- Os compostos isolados demonstraram resultados significativos de
citotoxicidade frente as células RAMOS, RAJI, U937, MOLT4, REH, B15,
HOS e NCI-H1299. Os drimanos 1-β-(p-cumaroiloxi)-poligodial e 1-β-(p-
metoxicinamil)-poligodial foram os mais citotóxicos para as células U937,
MOLT4 e B15 e RAJI, MOLT4 e REH, respectivamente;
- A análise de toxicologia realizada com o extrato hidroetanólico das
cascas não exibiu toxicidade por meio do teste de toxicologia aguda de dose
fixa. O extrato não apresentou mutagenicidade e hemólise das células
eritrocitárias;
- Do extrato clorofórmico das folhas foi possível isolar 4 compostos:
uma lignana, a 8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R-bicubebina, os sesquiterpenos
criptomeridiol e o 1-β-(p-metoxicinamil)dendocarbin-A e um álcool graxo.
Os compostos (8S,8’S,8’’R,8’’’R,9S,9’’R)-bicubebina e 1-β-(p-
122
metoxicinamil)dendocarbin-A estão sendo relatado pela primeira vez na
literatura.
Em conjunto os resultados obtidos mostram a importância do
desenvolvimento de um processo de extração para se obter um extrato rico
nos drimanos ativos, e posteriormente o desenvolvimento de fitoterápico ou
até mesmo o isolamento de uma maior quantidade destes compostos para a
produção de um fitofármaco ou derivado. Ainda, as cacas não apresentam
toxicidade e as folhas da D. brasiliensis possuem diferentes metabólitos de
interesse medicinal.
123
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ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO
DE ANIMAIS – CEUA/UNIVALI
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