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Avaliação dos genes acessórios de HIV e polimorfismos humanos no sucesso terapêutico contra AIDS
Avaliação dos genes acessórios de HIV e polimorfismos humanos no sucesso terapêutico contra AIDS
Renato S. AguiarLaboratório de Virologia Molecular
Universidade Federal do Rio de Janeiro
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HIV AIDS
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gp120
gp 41
matrix
envelope
CapsidViral RNA
Family: Retroviridae (Reverse Transcriptase – RT)
Genus: Lentivirus (enveloped virus with a conical capsid and slow progression)
HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS - HIV
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HIV-1 GENOMA
nef
~ 9 kb5’ LTR 3’ LTR
gag
MA CA NC P6
PRO RT INT
pol
vif
vprenvSU TMvpu
tat
rev
vpr
nef
~ 9 kb
Genoma duas moléculas de vRNA (DIS)
Proteínas sintetizadas como poliproteínas precursorasProteínas essenciais: Gag, Pol e Env
Proteínas regulatórias: Tat, Rev e Nef
Proteínas acessórias: Vpr, Vpu e Vif
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Receptors Fusion Uncoating
IntegrationReverse transcription
REPLICATIVE CYCLE – REPLICATIVE CYCLE – early stagesearly stages
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HIV replication – Late stepsHIV replication – Late steps
Transcription Translation Env proteins
Assembly Budding
Imat
ure
Mat
ure
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InfecçãoPrimária
Infeçção aguda ao HIV
Semanas
Tempo de InfecçãoTempo de InfecçãoAnos
InfecçãoOportunística
Morte
Latência Clinica
Começo dosSintomas
Cél
ula
s T
CD
4+ (
célu
las/
Cél
ula
s T
CD
4+ (
célu
las/
L)
L)
Có
pia
s de R
NA
do
HIV
(cóp
ias/mL
pla
sma)
Có
pia
s de R
NA
do
HIV
(cóp
ias/mL
pla
sma)
PATOLOAIDS PATOLOGIA
AIDSAIDS
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ANTIRETROVIRALS TARGETS
Protease Inhibitors
INIBIDORES NNRT DE RT
NNRT Inhibitors
NRT Inhibitors
Fusion Inhibitors
Integrase Inhibitors
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Fatores que Influenciama Falha Terapêutica
• Fatores Virais (IAS,2011)
Aderência
• Fatores do HospedeiroVariaçãoGenética
Mutaçõesde
Resistência
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1o salto da RT
RNase H degrada RNA, exceto PPT
RT utiliza PPT como primer fita +
2o salto da RT
Ausência de atividade revisora
Taxa de mutação da RT: ~ 2,5 x 10-4 mut / nt / ciclo replicativo
Geração de partículas: 109 a 1010 por ciclo replicativo.
TRANSCRIPTASE REVERSA - RT
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EVOLUÇÃO DE HIV
12
345
6
7
8
9
PACIENTES:
Vírus isolados de 9 pacientes coletados em diferentes datas e de diferentes compartimentos. Árvore filogenética construída a partir do gene de envelope (1.122
sequências de 822 pares de bases)
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(IAS, 2011)
Mutações Virais
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Dinâmica viral na resistência
Coffin JM, 1995
Camacho, R (2000)
Resistência secundária
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Além da atividade da RT para a geração de diversidade de HIV, vamos adicionar a atividade
da APOBEC.
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HIV-1 restriction of Apobec proteins
G→A Hypermutations
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All proteins in this family have one or two CDA motifs harboring one histidine and two cysteine residues, and the glutamic acid residue that are involved in the
hydrolytic deamination of cytosine. The zinc-binding motif is highlighted.
CYTOSINE DEAMINATION DOMAIN - CTD
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HYPERMUTATIONS IN HIV SAMPLES FROM PATIENTS
• high content of mutations• stop codons creation
• viral proteins inactivation• decrease of viral replication
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APOBEC proteins family
• A1
• AID
• A2
•A3 (A3A – A3H)
apoB mRNA edition (colesterol transport)
Somatic hypermutation antibody gene diversification
Unknow function
Inate Immunity
Antiviral restriction (HIV, SIV, MLV, MMTV, HBV e HTLV-1)
Retroelements inhibition
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If APOBEC proteins are so effecient in HIV restriction WHY
virus still replicates?
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HIV-1 genes
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A3GA3F
cytidine deamination(G to A transitions)
RT
DNA degradationmutant HIV
Vif
A3G, A3F
Ub SCF
RTreverse transcription
Integration
productive infection
non-productive infection
producer cells
target cells
26S
HIVVif
HIV
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The mechanism of Vif-dependent APOBEC3G degradation
Vif binds APOBEC3G and forms a complex that recruits the cellular proteinselongin B and elongin C, which then mediate cullin-5 dependent ligation of ubiquitin
(Ub) to APOBEC3G and posterior degradation.
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NO ENTANTO, se existirem mutações em vif que diminuam sua atividade mas não com perda de
função o genoma viral pode ser hipermutado por APOBEC gerando diversidade e resistência aos
antiretrovirais.
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They show that naturally occurring HIV-1 Vif point mutants with suboptimal anti-APOBEC3G activity induce the appearance of proviruses with lamivudine (3TC) drug resistance-associated mutations before any drug exposure
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Using a subtype B standard, 11 samples profile hypermutation P <0.09, 7 samples showed hypermutation profile of P <0.05. Mutation M36I, L63P, L89M, I93L at the protease, K103N, M184V at the RT more frequently.
640 samples of individuals with treatment failure, using RT and protease inhibitor from clinical follow-up in the Brazilian program National Network of HIV-1 genotyping (RT e PRO)
The levels of hypermutations of each sequence were evaluated using the software: www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html.
We found other vif polymorphism with high frequency between amino acids 33-39, and 122-128
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Dra. Mariza MorgadoDra. Caroline Passaes
“Avaliação da atuação das proteínas APOBEC na integrase de pacientes
controladores”
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Long Term Non Progressors
Controladores de elite (EC) Controladores virêmicos (VC)
● Pacientes com carga viral indetectável (<50 cópias/ml).
● Apresentam contagem alta de células T CD4+.
● Apresentam contagem baixa de células T CD8+.
● Pacientes com carga viral detectável (<2000 cópias/ml).
● Apresentam contagem alta de células T CD4+.
● Apresentam contagem baixa de células T CD8+.
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Tabela 1: Características clínicas dos pacientes controladores do HIV
NA – não analisados
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Analisar integrase e o vif de um mesmo controlador
NL43-Luc ΔIN
+ PCR da integrase
+ A3G+ NL43-Luc ΔVif
Funcional INFuncional Vif
Transfectar em 293T
Transfectar em 293T
amplificação dessa região
● DNAg
● primers externos
● primers internos
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hipermutadosIN de paciente EC13
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Analisar integrase e o vif de um mesmo controlador
NL43-Luc ΔIN
+ PCR da integrase
+ A3G+ NL43-Luc ΔVif
Funcional INFuncional Vif
Transfectar em 293T
Transfectar em 293T
amplificação dessa região
● DNAg
● primers externos
● primers internos
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Fatores que Influenciama Falha Terapêutica
Mutações• Fatores Virais de (IAS,2011)
Resistência
Aderência
• Fatores do HospedeiroVariaçãoGenética
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VARIAÇÃO GENÉTICA
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Mecanismos de Entrada
HOSPEDEIRO
Drogas
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Mecanismos de Entrada
HOSPEDEIRO
Drogas
Mutação
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Mecanismos de Efluxo
HOSPEDEIRO
Efluxode
Drogas
Droga
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Mecanismos de Efluxo
HOSPEDEIRO
Efluxode
Drogas
Droga
Mutação
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Variações Genéticas - Polimorfismos
Single-Nucleotide Polymorphism – SNP
Genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e ABCB1
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CROMOSSOMO
6
6q25.3
SLC22A3
SLC22A2
SLC22A1
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SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3
Transportadores de Cátions OrgânicosOCT-1, OCT-2, OCT-3
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7q21.12
CROMOSSOMO
7
ABCB1
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ABCB1Proteína Associada à Resistência a Múltiplas Drogas
Glicoproteína P
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Objetivo Geral
Caracterizar a associação entre os polimorfismos de base única (SNPs) dos
genes relacionados ao transporte de antirretrovirais com a falha terapêutica na população de pacientes HIV+ da região sul
do Brasil
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• Caracterizar a frequência dos SNPs e dos haplótipos dos genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e ABCB1 na população de pacientes HIV+ da região sul do Brasil;
• Caracterizar a associação dos SNPs dos genes SLC22A1, SLC22A2, SLC22A3 e ABCB1 com a falha terapêutica;
• Caracterizar o impacto dos SNPs associados com a falha terapêutica em ensaios funcionais.
Objetivos Específicos
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Amostras – Projeto sul (2008)
Curitiba, Porto Alegre – 350
Pacientes em Tratamento
120 117
CONTROLESucesso
terapêutico desde a 1ª linha de
tratamento, com acompanhamento de pelo menos 6
meses
CASOFalha
terapêutica na 1ª linha de
tratamento
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Variáveis Demográficas
Controle Caso Valor p
♂
♀
76 (63,33%)
43 (35,83%)
68 (58,12%)
47 (40,17%)>0,05*
PR
RS
70 (58,33%)
50 (41,67%)
74 (63,25%)
43 (36,75%)>0,05*
Idade 38,84 ±10,12 34,50 ±10,04 <0,05**
Me Idade 38 (21-68) 33 (9-61) -
*Teste Chi2; **Teste Mann-Whitney
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Diluição das amostras para 50ng/L
Qiaamp DNA Mini and Blood Mini Handbook
NanoPhotometer™ Pearl
Spectrophotometer
Preparação das Amostras
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SNaPshot®
SLC22A1
Amplificação de 7 fragmentos que contêm os 10 SNPs por MULTIPLEX®
10 SNPs tipados – informação de 21 SNPs
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Padronização
Multiplex®
C- 177 251 273 433 492 534 583
100bp
1kbplus
100
200
300
400
500
100
200
300
400
500
TESTE PRIMERS
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Reação de SNaPshot®
CTCCAACACGACATCGCCGCA
TGCCCTTTTCTTCTTTGCTGTTTGC
TGATTGCTTATTTATTTATTTTAACTCCAA
MULTIPLEXSNAPSHOT
PolimorfismoAncestral
TGATTGCTTATTTATTTATTTTAACTCCAA G
Purificação com SAP e ExoIPurificação SAP
AT
CG
H
H
H
H
H
H
H
H
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24bp
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OpenArray®
SLC22A2
12 SNPs tipados – informação de 38 SNPs
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SLC22A3
4 SNPs tipados – informação de 11 SNPs
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ABCB1
16 SNPs tipados – informação de 86 SNPs
Total de Marcadores
156
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Ensaio TaqMan®
Média/Larga EscalaTotal de genótipos/amostras por lâmina – 3072/96
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AA
AG
GG
96amostras
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RESULTADOS
Open Arrayrs1045642
AA
AG
GG
384amostras
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GeneMapper
(SNaPshot)
TaqManGenotyper
(OpenArray)
R
Equilíbriode HW
Desequilíbriode Ligação
Regressão Logística(com ou sem ajuste)
Correção paracomparações
múltiplas(Bonferroni, FDR)
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ResultadosEstudo de Desequilíbrio de Ligação
SLC22
A1
SLC22
A2
SLC22
A3
Medida de associação – r2
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Resultados
Tabela de p Valorrs9282564 0.65301 rs3842 0.04544 rs17588242 0.64928
rs17327624 0.95093 rs1867351 0.23927 rs10945657 0.30444
rs1202172 0.72461 rs683369 0.40158 rs315978 0.91938
rs10280623 0.76100 rs628031 0.33814 rs316003 0.37963
rs1202170 0.03931 rs35167514 0.00050 rs316002 0.62532
rs1128503 0.04411 rs1382785 0.89969 rs3103352 0.58021
rs2235035 0.09278 rs622591 0.03768 rs2292334 0.27222
rs6961419 0.03394 rs316019 0.94504 rs2048327 0.19087
rs11760837 0.43903 rs2279463 0.60016 rs1810126 0.08060
rs1045642 0.63961 rs315996 0.66321 rs3088442 0.28258
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rs35167514 – 420del (A)SLC22A1 (éxon)
Genótipo N frequência Modelo de Regressão Logística
Modelo de Regressão Logística com Correção (Idade, Sexo,
Região)
Casos Controles OR (p value) IC 95% OR (p value) IC 95%
AA 47 (46,5) 76 (73,1) Referência Referência Referência Referência
A_ 51 (50,5) 27 (26,0) 3,05 1,69-5,52 3,17 1,71-5,86
__ 3 (3,0) 1 (1,0) 4,85 0,49-48,01 5,27 0,50-55,92
101 104 0,0005 0,0004965
>1 = Risco de Falha
OR
<1 = Proteção
Resultados
Estudo de Associação
FRAMESHIFT
0.0001261
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Perspectivas
• Análise multivariada das 237 amostras tipadas considerando ancestralidade e tratamento;
• Analisar o desfecho mutação de resistência para os SNPs que se mostraram associados;
• Confirmar a associação encontrada por sequenciamento;
• Validar os SNPs significativos em testes funcionais.
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• Amilcar Tanuri - UFRJ
• Rodrigo Brindeiro – UFRJ
• Cynthia Chester - UFRJ
• Mariza Morgado – Fiocruz
• Carolina Passaes - Fiocruz
• Juliana Dias - UFRJ
• Veronica Bichara
Agradecimentos
UFRJ-Brazil
contact: [email protected]
Secretaria de Vigilância em
Saúde