avaliação dos efeitos genotóxicos da exposição ocupacional a pesticidas sobre agentes...
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Avaliação dos efeitos genotóxicos da Avaliação dos efeitos genotóxicos da exposição ocupacional a pesticidas exposição ocupacional a pesticidas
sobre agentes sanitários da Fundação sobre agentes sanitários da Fundação Nacional de Saúde do Estado de Nacional de Saúde do Estado de
Minas GeraisMinas Gerais
Fernanda de Souza Gomes KehdyFernanda de Souza Gomes KehdyOrientadora: Profª Maria Cristina Lima de CastroOrientadora: Profª Maria Cristina Lima de CastroCo-orientadora: Profª Cleusa Graça da FonsecaCo-orientadora: Profª Cleusa Graça da Fonseca
IntroduçãoIntrodução
• PesticidasPesticidas
• Seletividade dos pesticidasSeletividade dos pesticidas
Risco tóxico para humanos
IntroduçãoIntrodução
• Tipos de intoxicações:Tipos de intoxicações:
- AgudaAguda
- Sub-crônicaSub-crônica
- CrônicaCrônica
IntroduçãoIntrodução
Potencial genotóxico Potencial genotóxico
CARCINOGÊNESE
• Biomonitoramento genotoxicológico
IntroduçãoIntrodução
• Biomarcadores:Biomarcadores:
- análise de aberrações cromossômicas;- análise de aberrações cromossômicas;
- análise de troca entre cromátides irmãs;- análise de troca entre cromátides irmãs;
- frequência de micronúcleos; - frequência de micronúcleos;
IntroduçãoIntrodução• Micronúcleos:Micronúcleos:
• Efeito aneugênicoEfeito aneugênico
IntroduçãoIntrodução• Micronúcleos:Micronúcleos:
• Efeito clastogênicoEfeito clastogênico
IntroduçãoIntrodução
• Micronúcleosagentes clastogênicos
agentes aneugênicos
- Teste de genotoxicidade in vitro;
- Biomarcador p/ efeito de exposição a genotóxicos;
(Norppa et al.,2003)
IntroduçãoIntrodução
• Vantagens do teste do micronúcleo: Vantagens do teste do micronúcleo:
- Mais simples;- Mais simples;
- Treinamentos mais curtos;- Treinamentos mais curtos;
- Mais rápido;- Mais rápido;
- Requer menos custo;- Requer menos custo;
- Maior poder estatístico;- Maior poder estatístico;
IntroduçãoIntrodução
Inibição do ciclo celular
Reparo do DNA
Apoptose
Danos ao DNA
Ativaçãooncogenes
p53
• Fator de risco p/ câncer p53;Fator de risco p/ câncer p53;
IntroduçãoIntrodução
• p53:p53:
-- Gene TP53; Gene TP53;
-- Cromossomo17p13.1; Cromossomo17p13.1;
- - 393 aminoácidos;393 aminoácidos;
p53 PolimorfismoPro72
Arg72Apoptose
IntroduçãoIntrodução
• Estado de Minas GeraisEstado de Minas Gerais::- ~ 3000 agentes sanitários vinculados à ~ 3000 agentes sanitários vinculados à
FUNASA – aplicam pesticidas para o controle FUNASA – aplicam pesticidas para o controle de vetores de doenças (180 reg. metropolitana) de vetores de doenças (180 reg. metropolitana)
- Sexo masculinoSexo masculino- Idade: 30 a 50 anosIdade: 30 a 50 anos- Pesticidas: piretróides e organofosforadosPesticidas: piretróides e organofosforados- Não foi feita análise dos efeitos genotóxicos Não foi feita análise dos efeitos genotóxicos
dos pesticidas sobre estes trabalhadores;dos pesticidas sobre estes trabalhadores;
IntroduçãoIntroduçãoN ° indiv.N ° indiv.
(exp/cont)(exp/cont)
ExposiçãoExposição DuraçãoDuração
(anos)(anos)
BiomarcadorBiomarcador ResultadoResultado ReferênciaReferência
50/4750/47 Piretróides, Piretróides, DDTDDT
1-251-25 CACA PosPos (Ruppa et (Ruppa et al.,1989)al.,1989)
26/2626/26 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo
radosrados
2-182-18 CACA PosPos (Ruppa et (Ruppa et al.,1991)al.,1991)
48/5048/50 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo
radosrados
4-504-50 SCESCE NegNeg (Pasquini et (Pasquini et al.,1996)al.,1996)
22/1622/16 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo
radosrados
77 MNMN NegNeg (Venegas et (Venegas et al.,1998)al.,1998)
71/7571/75 Piretróides, Piretróides, organofosfoorganofosfo
radosrados
2-552-55 MNMN PosPos (Bolognesi (Bolognesi et al.,1998)et al.,1998)
IntroduçãoIntrodução
• Falta de concordância entre os resultados:Falta de concordância entre os resultados:-- diferentes condições de exposição diferentes condições de exposição (magnitude, (magnitude,
uso de equipamentos de proteção);uso de equipamentos de proteção);
-- nº de pesticidas utilizados; nº de pesticidas utilizados;-- combinação de pesticidas; combinação de pesticidas;-- tempo e frequência de exposição; tempo e frequência de exposição;-- características do indivíduo características do indivíduo (idade, sexo, hábito de (idade, sexo, hábito de
fumar e ingerir bebidas alcoólicas, estado fumar e ingerir bebidas alcoólicas, estado nutricional); nutricional);
(Bolognesi, 2003)
Objetivo geralObjetivo geral
Avaliar os efeitos genotóxicos da Avaliar os efeitos genotóxicos da exposição ocupacional a pesticidas em agentes exposição ocupacional a pesticidas em agentes sanitários vinculados à FUNASA, através do sanitários vinculados à FUNASA, através do biomonitoramento genotoxicológico destes biomonitoramento genotoxicológico destes indivíduos, utilizando como biomarcador a indivíduos, utilizando como biomarcador a frequência de micronúcleos em cultura de frequência de micronúcleos em cultura de linfócitos isolados e estabelecer o genótipo do linfócitos isolados e estabelecer o genótipo do gene TP53 em relação ao polimorfismo do gene TP53 em relação ao polimorfismo do códon 72 para fins prognósticos.códon 72 para fins prognósticos.
Objetivos específicosObjetivos específicos
• Delineamento das amostras;Delineamento das amostras;• Padronização das condições de cultura de linfócitos Padronização das condições de cultura de linfócitos
isolados;isolados;• Produção de lâminas;Produção de lâminas;• Determinação da frequência de MN;Determinação da frequência de MN;• Verificação, através de testes estatísticos, de relação Verificação, através de testes estatísticos, de relação
entre a frequência de MN e exposição a pesticidas; entre a frequência de MN e exposição a pesticidas; • Amplificação, través de PCR, de fragmento do TP53 Amplificação, través de PCR, de fragmento do TP53
para detecção do genótipo em relação ao códon 72; para detecção do genótipo em relação ao códon 72;
MetodologiaMetodologia1)1) Grupos amostrais:Grupos amostrais:- Grupo experimental: 30 agentes sanitários Grupo experimental: 30 agentes sanitários
vinculados a FUNASA, do sexo masculino, vinculados a FUNASA, do sexo masculino, idade entre 30 e 50 anos, ocupacionalmente idade entre 30 e 50 anos, ocupacionalmente expostos a pesticidas;expostos a pesticidas;
- Grupo controle: 30 indivíduos do sexo Grupo controle: 30 indivíduos do sexo masculino, idade entre 30 e 50 anos, sem masculino, idade entre 30 e 50 anos, sem história de exposição a pesticidas; história de exposição a pesticidas;
2)2) Entrevista. Entrevista. (idade, hábitos e exposição) (idade, hábitos e exposição)
3)3) Teste do MNTeste do MN Metodologia Metodologia
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
MetodologiaMetodologia
(Adaptado de Fenech,2000)
Tempo de cultura (h)Tempo de cultura (h) Substâncias a serem Substâncias a serem acrescentadas na culturaacrescentadas na cultura
00 PHAPHA
2424
4848 Ct-BCt-B
7272
9696 Colher célulasColher células
MetodologiaMetodologia
Célula binucleada
MetodologiaMetodologia• Características do Micronúcleo:Características do Micronúcleo:- Morfologia idêntica a dos núcleos principais;Morfologia idêntica a dos núcleos principais;- Diâmetro entre 1/16 e 1/3 dos núcleos Diâmetro entre 1/16 e 1/3 dos núcleos
principais;principais;- Mesma coloração dos núcleos;Mesma coloração dos núcleos;- Não apresentar refringências;Não apresentar refringências;- Não estar conectado a um dos núcleos;Não estar conectado a um dos núcleos;- Não estar sobreposto a nenhum dos núcleos;Não estar sobreposto a nenhum dos núcleos;
(Fenech, 2000)
MetodologiaMetodologia
• Parâmetros a serem considerados:Parâmetros a serem considerados:
-- Frequência de MN/1000 cél. binucleadas; Frequência de MN/1000 cél. binucleadas;
-- Frequência de células binucleadas Frequência de células binucleadas micronucleadas/1000 cél. binucleadas; micronucleadas/1000 cél. binucleadas;
-- Distribuição de cél. binucleadas com 0, 1, 2, 3 Distribuição de cél. binucleadas com 0, 1, 2, 3 ou mais MN;ou mais MN;
(Fenech, 2000)
MetodologiaMetodologia
Célula binucleada apresentando 1 MN
MetodologiaMetodologia
Célula binucleada apresentando 2 MN
MetodologiaMetodologia
Células binucleadas apresentando 3 MN
MetodologiaMetodologia
Células binucleadas apresentando mais de 3 MN
MetodologiaMetodologia4) Análises estatísticas:
-frequência de MNs
- idade
- hábito de fumar
- ingestão de bebidas alcoólicas
- exposição a pesticidas
(tempo e frequência)
Teste do
qui-quadrado
MetodologiaMetodologia
5)5) Amplificação do TP53: Amplificação do TP53:
MetodologiaMetodologia
PrimersPrimers SequênciaSequência Tamanho do Tamanho do produtoproduto
p53+/p53Arg-p53+/p53Arg- p53+: 5’TCCCCCTTGCCGTCCCAAp53+: 5’TCCCCCTTGCCGTCCCAA
p53Arg-: 5’ CTGGTGCAGGGGCCACGCp53Arg-: 5’ CTGGTGCAGGGGCCACGC
Alelo ArgAlelo Arg
141 pb141 pb
p53Pro+/p53-p53Pro+/p53- p53Pro+: 5’GCCAGAGGCTGCTCCCCCp53Pro+: 5’GCCAGAGGCTGCTCCCCC
p53-: 5’CGTGCAAGTCACAGACTTp53-: 5’CGTGCAAGTCACAGACTT
Alelo ProAlelo Pro
177pb177pb
MetodologiaMetodologia6) Aspectos éticos:
- Consentimento livre e esclarecido;
- Princípios éticos, aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG.
Obrigada!!!Obrigada!!!