avaliação do potencial terapêutico das células-tronco...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

CAROLINA CALIÁRI OLIVEIRA

Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em

feridas ocasionadas por queimaduras em ratos

Ribeirão Preto

2010

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CAROLINA CALIÁRI OLIVEIRA

Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em

feridas ocasionadas por queimaduras em ratos

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada

Orientador: Prof. Dr. Júlio César Voltarelli

Ribeirão Preto

2010

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO

CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Caliári -Oliveira, Carolina

Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por queimaduras em ratos. Ribeirão Preto, 2010.

127 p. il. 30cm. Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador:

Voltarelli, Júlio César

1. Queimaduras. 2. Células-tronco mesenquimais. 3. Terapia celular. 4. Cicatrização de feridas. 5. Célula multipotente mesenquimal estromal .

6. Medicina regenerativa.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Carolina Caliári Oliveira

Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por

queimaduras em ratos

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. __________________________________________________________________________

Instituição: _______________________________ Assinatura: _______________________________

Prof. Dr. __________________________________________________________________________


Prof. Dr. __________________________________________________________________________


Dedico este trabalho à minha mãe, por me

fazer ser, a cada dia, uma pessoa melhor.

Agradeço imensamente,

aos profissionais sem os quais esse trabalho não teria sido realizado...

Reinaldo e Ramon (Biotério da FCFRP/USP)

Ana Cristine Silva Ferreira (Dpto. Imunologia Básica e Aplicada FMRP/USP)

Patrícia V.B. Palma e Camila C.B.O. Menezes (FUNDHERP)

Cici (Laboratório de Dermatologia do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto)

Dr. Marco Andrey C. Frade (Depto. de Clínica Médica da FMRP)

Alessandra Almeida (FUNDHERP)

Rodrigo Gomes Teixeira e Cíntia Almeida da Silva Santos (FUNDHERP)

Dra. Leandra Naíra Z. Ramalho (Laboratório de Patologia da FMRP/USP)

Sr. Dejano e Sr. Otávio (Oficina de Precisão/USP)

Carmem (FUNDHERP)

Dra. Daniela Carlos (Laboratório de Farmacologia da FMRP/USP)

Dr. Marcelo D. Baruffi (FCFRP/USP)

Dra. Cristina R. B. Cardoso (FMTM/Uberaba)

Dra. Maria Aparecida C. Fontes (FUNDHERP)

Maria Emília N. Bonifácio da Silva (Laboratório de Análises Clínicas FCFRP/USP)

Sandra Navarro (FUNDHERP)

Rodrigo Gomes Teixeira (FUNDHERP)

Cíntia Almeida da Silva Santos (FUNDHERP)

Elaine e Renata (FUNDHERP)

Dra. Rita de Cássia Carrara (FUNDHERP)

...também aos funcionários da limpeza, da segurança, da copa, da

manutenção e da jardinagem da FUNDHERP por tornarem a realização deste

trabalho mais agradável.

À Daurea,

por ter plantado essa idéia...

Ao Jorge,

por ter aceito o desfio e me ensinado os primeiros passos da

cultura de células...

Ao Dr. Júlio,

por ter confiado em mim...

Às meninas Voltarelli,

por terem me recebido....

À Ju,

pela enorme colaboração (em todos os sentidos) e por todas as coisas

que ainda virão...

À Gabi,

pelas discussões produtivas e pela objetividade...

À Má,

por picotar tecido adiposo alheio, pelas fotos, IHQ... pela alegria...

À Kelen,

por ter me recebido e ajudado...

Ao Willian,

por ter me acompanhado...

Ao pessoal do laboratório de T. gênica,

pela parceria freqüente...

Às meninas Voltarelli que chegaram depois,

pela companhia...

Ao meu irmão Ricardo,

pela câmera fotográfica, pela formatação da tese e por todo o

tempo perdido...

À Kelen e à Isabella,

pela correção da tese (pensou que eu ia esquecer?)...

À comissão julgadora de defesa de dissertação,

por me ouvir...

À minha família (pais, irmãos, tios, tias...),

pelo apoio constante sem o qual o que eu sou não

seria possível...

Os meus mais sinceros agradecimentos.

RESUMO

Caliari-Oliveira, C. Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco

mesenquimais na regeneração de feridas ocasionadas por queimaduras em ratos.

2010. 127p. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, SP.

Queimaduras extensas de pele são de difícil tratamento, principalmente porque levam ao

comprometimento do sistema imunológico e de outros órgãos, podendo levar o paciente ao

óbito em poucos dias. O paciente com queimaduras graves e extensas requer cuidados

especiais e longos tempos de internação. Uma alternativa terapêutica recente para o tratamento

de úlceras de pele é a utilização de células-tronco mesenquimais (CTMs) para acelerar o

processo de cicatrização da pele. Vários fatores são favoráveis à utilização das CTMs no

tratamento de queimaduras extensas, tais como suas propriedades de angiogênese,

regeneração e imunoregulação. No entanto, pacientes com queimaduras graves necessitam de

tratamento com urgência e a expansão de CTMs autólogas é um processo relativamente

demorado o que inviabilizaria a utilização das mesmas em grandes queimados. Com isto, faz-se

necessário a utilização de culturas de CTMs alogênicas, previamente estabelecidas de outros

doadores saudáveis. Dessa forma, o objetivo do presente foi avaliar o potencial terapêutico das

CTMs xenogênicas no tratamento de úlceras ocasionadas por queimaduras extensas e graves

em ratos. Para isto, CTMs foram isoladas a partir da medula óssea (MO) de camundongos FVB

GFP+ e expandidas in vitro. Ratos Wistar foram submetidos à queimadura experimental através

do contato de chapa de metal aquecida a 200˚C por 25 segundos em contato com o dorso

tricotomizado dos mesmos, esse procedimento originou queimaduras extensas e graves. As

CTMs foram aplicadas pela via intradérmica (ID) nos animais pertencentes ao grupo tratado

CTM-ID, enquanto foi aplicado PBS via ID nos animais pertencentes ao grupo controle (PBS-

ID). Uma diminuição da taxa de mortalidade pós-queimadura foi observada nos animais CTM-ID

(23.81%) quando comparada aos animais PBS-ID (39.14%). A partir do quadragésimo quinto

dia após injúria térmica uma melhora do processo de cicatrização foi observada nos animais

CTM-ID (72.95 ± 5.170) em comparação aos animais PBS-ID (57.74 ± 2.016) p= 0.0179.

Análises microbiológicas revelaram que o principal tipo de microorganismo encontrado na pele

dos animais de ambos os grupos foi o gênero Staphylococcus sp. Foram acompanhadas as

alterações das populações celulares TCD4+ e CD8+ no baço e na região das feridas dos

animais, bem como a porcentagem de neutrófilos na região da pele lesada pela queimadura.

Durante a avaliação final do processo de cicatrização, no período referente ao sexagésimo dia

após injúria térmica a porcentagem de cicatrização dos animais CTM-ID (90.81 ± 5.054) foi

maior que a porcentagem de cicatrização dos animais PBS-ID (76.11 ± 3.457), p = 0.0335,

evidenciando o recobrimento mais rápido da ferida nos animais CTM-ID. Dessa forma, esse

estudo mostrou resultados positivos, encorajando o uso das CTMs no tratamento de

queimaduras extensas e profundas em modelo animal. O potencial terapêutico das CTMs na

regeneração de úlceras da pele é interessante não só para o tratamento de pacientes com

queimaduras, mas também para o tratamento de pacientes com outras doenças que acometem

a pele. Os resultados desse trabalho de pesquisa poderão embasar a terapia regenerativa com

CTMs para que a mesma possa se tornar uma alternativa terapêutica rápida e eficaz para o

tratamento de pacientes com queimaduras extensas e graves que necessitam de cuidados

imediatos.

Palavras chave: Queimaduras, células-tronco mesenquimais, terapia celular, cicatrização

de feridas.

ABSTRACT

Caliari-Oliveira, C. Evaluation of the mesenchymal stem cells therapeutic potential in

rat burn wounds. 2010. 127p. Medicine Faculty of Ribeirão Preto, São Paulo University,

SP.

Burns in the skin are difficult to treat, once they lead to an impairment of the immune system

and other organs, leading the patient to death in a few days. Patients with deep burn require

special care and long periods of hospitalization. A recent therapeutic alternative to treat skin

ulcer is the use of mesenchymal stem cells (MSC) to accelerate the process of wound

healing. Several factors are favorable to the use of MSCs in the treatment of deep burn, such

as their properties of angiogenesis, regeneration and immunoregulatory function. However,

patients with deep burns need urgent treatment and the expansion of autologous MSCs is a

relatively lengthy process, becoming unfeasible its use in full thickness thermal burns. Thus it

is necessary the use of allogeneic MSCs, previously established from other healthy donors.

Therefore the objective of this study was to evaluate the therapeutic potential of xenogeneic

MSCs in the treatment of ulcers caused by deep burn in mice. MSCs were isolated from the

bone marrow (BM) of FVB GFP+ mice and expanded in vitro. Wistar rats were submitted to

experimental burn through the contact with brass bar to 200˚C for 25 seconds in contact with

dorsal shaved, this procedure originated deep burn. MSCs were given by via intradermal (ID)

in animals belonging to the treated group MSC-ID, and PBS was given via ID in animals

belonging to the group control (PBS-ID). A decrease in the post burning mortality rate was

observed in animals MSC-ID (23.81%) when compared to the animals PBS-ID (39,14%).

From the 45th day after thermal injury, an improvement in the healing process was observed

in animals MSC-ID (72.95 ± 5.170) in comparison to the animals PSB-ID (57.74 ± 2.016) p=

0.0179. Microbiological analyses showed that the main type of microorganism found in the

animal skin of both groups was the genus Staphylococcus sp. Alterations in the cell

population T CD4+ and CD8+ in spleen and in the area of damaged skin, as well as the

percentage of neutrophils in the damaged area by burn were observed. During the final

evaluation of healing process, period concerning the 60th day after the thermal injury, the

percentage of healing in animals MSC-ID (90.81 ± 5.054) was bigger than the healing

percentage in animals PBS-ID (76.11 ± 3.457), p = 0.0335, evidencing a faster in the healing

of animals MSC-ID. This way, this study indicated the effectiveness of MSCs in the treatment

of deep burn in animal model. The therapeutic potential of MSCs in wound healing is

interesting for the treatment of patients with burns, as well as for the treatment of patients

with other diseases related to skin. The results of this study may serve as a base for

regenerative therapy with MSCs in order to become a fast and effective therapeutic

alternative for the treatment of patients with deep burn in need of immediate care.

Key words: Burns, mesenchymal stem cell, cellular therapy, wound healing.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 01: Determinação da superfície corporal total queimada. Regra dos nove para

medida de área corporal queimada ..................................................................................... 19

Figura 02: Determinação da profundidade das queimaduras. Classificação da

queimadura de acordo com sua profundidade .................................................................... 20

Figura 03: Esquema de quadrantes utilizado para realização da queimadura ..................... 43

Figura 04: Histogramas representativos da população de CTMs de camundongos

FVB GFP+. .......................................................................................................................... 52

Figura 05: Avaliação da multipotencialidade das CTMs isoladas de medula óssea de

camundongos FVB GFP ...................................................................................................... 53

Figura 06: Análise da sobrevida dos animais submetidos ao procedimento de injúria

térmica experimental............................................................................................................ 55

Figura 07: Análise da massa corporal dos animais submetidos ao procedimento de

injúria térmica experimental por um período de sessenta dias ............................................. 56

Figura 08: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais

pertencentes ao subgrupo PBS-ID no início do experimento (0d) ........................................ 59

Figura 09: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais

pertencentes ao subgrupo CTM-ID no início do experimento ............................................... 59


pertencentes ao subgrupo PBS-ID no sétimo dia após o início do experimento .................. 63


pertencentes ao subgrupo CTM-ID no sétimo dia do início do experimento. ....................... 63

Figura 12: Área da queimadura, em pixels, no sétimo dia após o início do

experimento ......................................................................................................................... 64

Figura 13: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais sete dias após o

início do experimento ........................................................................................................... 65

Figura 14: População de células CD8+ no baço dos animais sete dias após o início do

experimento ......................................................................................................................... 66

Figura 15: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais sete dias após o início

do experimento. .................................................................................................................. 67

Figura 16: População de células CD8+ na pele dos animais sete dias após o início do

experimento ......................................................................................................................... 67

Figura 17: Cortes histológicos da pele dos animais no 7d após a injúria térmica ................. 68

Figura 18: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos

animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no sétimo dia após início do experimento .........

70


pertencentes ao subgrupo PBS-ID no décimo quinto dia após o início do

experimento. ............................................................................................................... 73


pertencentes ao subgrupo CTM-ID no décimo quinto dia após o início do

experimento. ....................................................................................................................... 73

Figura 21: Área da queimadura, em pixels, no décimo quinto dia após o início do

experimento ......................................................................................................................... 74

Figura 22: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais quinze dias após o


Figura 23: População de células CD8+ no baço dos animais quinze dias após o início

do experimento .................................................................................................................... 76

Figura 24: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais quinze dias após o


Figura 25: População de células CD8+ na pele dos animais quinze dias após o início

do experimento .................................................................................................................... 77


animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no décimo quinto dia após início do

experimento ......................................................................................................................... 79


pertencentes ao subgrupo PBS-ID no trigésimo dia após o início do experimento .............. . 82


pertencentes ao subgrupo CTM-ID no trigésimo dia após o início do experimento ............. . 82

Figura 29: Porcentagem de cicatrização trinta dias após injúria térmica experimental ......... 83

Figura 30: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais trinta dias após o

início do experimento. ......................................................................................................... 84

Figura 31: População de células CD8+ no baço dos animais trinta dias após o início

do experimento .................................................................................................................... 85

Figura 32: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais trinta dias após o

início do experimento. População ........................................................................................ 86

Figura 33: População de células CD8+ na pele dos animais trinta dias após o início do

experimento ........................................................................................................................ . 86

Figura 34: Cortes histológicos da pele dos animais corados por HE .................................... 87


animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no trigésimo dia após início do

experimento ........................................................................................................................ . 88


pertencentes ao subgrupo PBS-ID no quadragésimo quinto dia após o início do

experimento ........................................................................................................................ 91


pertencentes ao subgrupo CTM-ID no quadragésimo quinto dia após o início do

experimento ........................................................................................................................ . 91

Figura 38: Porcentagem de cicatrização quarenta e cinco dias após injúria térmica

experimental ....................................................................................................................... . 92

Figura 39: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais quarenta e cinco dias

após o início do experimento .............................................................................................. . 93

Figura 40: População de células CD8+ no baço dos animais quarenta e cinco dias

após o início do experimento ............................................................................................... 94

Figura 41: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais quarenta e cinco dias


Figura 42: População de células CD8+ na pele dos animais quarenta e cinco dias



animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no quadragésimo quinto dia após início do

experimento ......................................................................................................................... 97


pertencentes ao subgrupo PBS-ID no sexagésimo dia após o início do experimento ......... 101


pertencentes ao subgrupo CTM-ID no sexagésimo dia após o início do experimento ......... 101

Figura 46: Porcentagem final de cicatrização após injúria térmica experimental .................. 102

Figura 47: Cortes histológicos da pele dos animais corados por HE sessenta dias

após injúria térmica experimental......................................................................................... 103

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Associação entre a superfície corporal total queimada e o número de

mortes no Hospital das Clínicas da faculdade de Medicina de Ribeirão Preto ..................... 21

Tabela 02: Terapia celular experimental com CTMs ............................................................ 30

Tabela 03: Distribuição dos animais utilizados nos experimentos ........................................ 44

Tabela 04: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à

injúria térmica no dia 0 ......................................................................................................... 57


injúria térmica no terceiro dia após o início do experimento ................................................. 60


injúria térmica no sétimo dia após o início do experimento .................................................. 62

Tabela 07: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e úlcera no

sétimo dia após injúria térmica ............................................................................................. 69


injúria térmica quinze dias após o início do experimento ..................................................... 71

Tabela 09: Avaliação histopatológica da interface entre a pele normal e a úlcera no

décimo quinto dia após a injúria térmica .............................................................................. 78


injúria térmica no trigésimo dia após o início do experimento .............................................. 80

Tabela 11: Avaliação histopatológica da interface entre a pele normal e a úlcera no

trigésimo dia após injúria térmica ......................................................................................... 88


injúria térmica no quadragésimo quinto dia após o início do experimento ............................ 90

Tabela 13: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e a úlcera no

quadragésimo quinto dia após injúria térmica ...................................................................... 96


injúria térmica no sexagésimo dia após o início do experimento .......................................... 99

Tabela 15: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e a úlcera no

quadragésimo quinto dia após injúria térmica ...................................................................... 104

LISTA DE ABREVIATURAS

ALFA-MEM: meio essencial mínimo

CT: célula-tronco

CTH: célula-tronco hematopoiética

CTM: célula-tronco mesenquimal

DMEM: meio essencial modificado

EAE: encefalomielite autoimune experimental

EGF: fator de crescimento endotelial

FGF: fator de crescimento de fibroblastos

FITC: isotiocianato de fluoresceína

GFP: proteína verde fluorescente

HE: hematoxilina/eosina

ID: intradérmico

IL-10: interleucina 10



MHC: complexo principal de histocompatibilidade

MMPs: metaloproteases

MO: medula óssea

MPO: mieloperoxidase

PBS: tampão fosfato tamponado

PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas

PE: ficoeritrina

PGE2: prostaglandina 2

SBF: soro bovino fetal

SIRS: síndrome da resposta inflamatória sistêmica

SRAC: síndrome da resposta antiinflamatória compensatória

STC: superfície corporal total

T CD4+: linfócitos T CD4+

T CD8+: linfócitos T CD8+

TGF-β: fator transformador de crescimento beta

TNF-α: fator de necrose tumoral alfa

TNF-α: fator de necrose tumoral alfa

VEGF: fator de crescimento vascular endotelial

Treg: linfócitos T reguladores

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 19

1.1. Paciente queimado ......................................................................................... 19

1.2. Lesão da pele em queimados ......................................................................... 23

1.3. Terapia celular e células-tronco mesenquimais .............................................. 26

1.4. Terapia com células-tronco mesenquimais na cicatrização de úlceras ........... 30

1.5. Terapia com células-tronco mesenquimais em queimaduras ......................... 34

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 37

2.1. Objetivo geral .................................................................................................. 37

2.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 37

3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 38

3.1. Considerações gerais ..................................................................................... 38

3.2. Isolamento das células-tronco mesenquimais (CTMs) de medula óssea de camundongos FVB GFP+ ...................................................................................... 39

3.2.1. Extração da medula óssea dos camundongos FVB GFP+ ....................... 39

3.2.2. Cultura das células-tronco mesenquimais ................................................ 40

3.2.3. Tripsinização das células-tronco mesenquimais ....................................... 40

3.3. Imunofenotipagem de MSCs murinas ............................................................. 41

3.4. Ensaio de diferenciação in vitro das células CTMs murinas ........................... 41

3.5. Procedimento experimental ............................................................................ 42

3.6. Monitoramento fotográfico das lesões obtidas a partir da injúria térmica ........ 45

3.6.1. Cálculo da porcentagem de cicatrização .................................................. 45

3.7. Coleta, processamento e análise de materiais biológicos ............................... 46

3.7.1. Obtenção de plasma dos animais ............................................................. 46

3.7.2. Coleta do baço .......................................................................................... 46

3.7.3. Obtenção de esplenócitos dos animais .................................................... 47

3.7.4 Imunofenotipagem das subpopulações linfocitárias................................... 47

3.7.5 Coleta de pele ............................................................................................ 48

3.7.6 Realização da atividade de dosagem de mieloperoxidase (MPO) ............. 48

3.7.7 Análises histológicas .................................................................................. 49

3.7.8. Teste microbiológico ................................................................................. 50

3.7.9. Análise de dados ...................................................................................... 51

4. RESULTADOS ...................................................................................................... 52

4.1. Obtenção das células-tronco mesenquimais a partir da medula óssea de camundongos FVB GFP+ ...................................................................................... 52

4.2. Análise da multipotencialidade das células-tronco mesenquimais .................. 53

4.3. Procedimento de injúria térmica experimental ................................................ 53

4.4. Curva de sobrevida dos animas ...................................................................... 54

4.5. Acompanhamento da massa corporal dos animais ......................................... 56

4.6. Avaliação dos animais no início do experimento ............................................. 57

4.7. Avaliação microbiológica dos animais três dias após o início do experimento ........................................................................................................... 60

4.8. Avaliação dos animais sete dias após o início do experimento....................... 61

4.8.1. Grupo GR60d ........................................................................................... 61

4.8.1.1. Análise microbiológica das feridas ..................................................... 61

4.8.1.2. Análise fotográfica das feridas ocasionadas por injúria térmica ......... 62

4.8.2. Grupo GR7d ............................................................................................. 64

4.8.2.1. Análise das populações de linfócitos TCD4+ e células CD8+ do baço dos animais por citometria de fluxo ........................................................ 65

4.8.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ da pele dos animais por citometria de fluxo ......................................................... 66

4.8.2.3. Análises histopatológicas das lesões ................................................. 68

4.8.2.4. Dosagem de MPO da pele da região da ferida dos animais ............... 69

4.9. Avaliação dos animais quinze dias após o início do experimento ................... 70

4.9.1. Grupo GR60d............................................................................................ 70

4.9.1.1. Análise microbiológica das feridas ..................................................... 71

4.9.1.2. Análise fotográfica das lesões por queimadura .................................. 72

4.9.2. Grupo GR15d ........................................................................................... 74

4.9.2.1. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ no baço dos animais por citometria de fluxo ........................................................ 75

4.9.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ na pele dos animais por citometria de fluxo ......................................................... 76

4.9.2.3. Análises histopatológicas das lesões ................................................. 78

4.9.2.4. Dosagem de MPO da pele da região da ferida dos animais ............... 79

4.10. Avaliação dos animais trinta dias após o início do experimento ................... 80

4.10.1. Grupo GR60d.......................................................................................... 80

4.10.1.1. Análise microbiológica das feridas ................................................... 80

4.10.1.2. Análise fotográfica das lesões por queimadura ................................ 81

4.10.2. Grupo GR30d.......................................................................................... 83

4.10.2.1. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ do baço dos animais por citometria de fluxo ........................................................ 84

4.10.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ na pele dos animais por citometria de fluxo ......................................................... 85

4.10.2.3. Análises histopatológicas das lesões ............................................... 87

4.10.2.4. Dosagem de MPO na pele da região da ferida dos animais ............. 88

4.11. Avaliação dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento . 89

4.11.1 Grupo GR60d........................................................................................... 89

4.11.1.1. Análise microbiológica das feridas ................................................... 89

4.11.1.2. Análise fotográfica das lesões por queimadura ................................ 90

4.11.2. Grupo GR45d.......................................................................................... 92

4.11.2.1. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ no baço dos animais por citometria de fluxo ........................................................ 93

4.11.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ da pele dos animais por citometria de fluxo ......................................................... 94

4.11.2.3. Análises histopatológicas das lesões ............................................... 96

4.11.2.4. Dosagem de MPO da pele da região da ferida dos animais ............. 97

4.12. Avaliação dos animais sessenta dias após o início do experimento ............. 98

4.12.1. Análise microbiológica das feridas .......................................................... 98

4.12.2. Análise fotográfica das lesões por queimadura .................................... 100

4.12.3. Análises histopatológicas das lesões .................................................... 102

5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 105

6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 118

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................... 120

Introdução

19

1. INTRODUÇÃO

1.1. Paciente queimado

Queimaduras na pele o maior órgão do sistema imunológico acarretam

prejuízos ao organismo como um todo. Queimaduras na pele são de difícil

tratamento, principalmente porque levam ao comprometimento do sistema

imunológico e de órgãos, o que pode levar o paciente ao óbito. O paciente queimado

requer cuidados especiais e longos tempos de internação. Casos graves de

queimaduras podem levar o paciente ao óbito em poucos dias (revisado por

ALGÖER et al., 1995).

Após internação do paciente queimado a correta determinação da superfície

total corporal queimada (STC) é fundamental para que o tratamento possa ser

iniciado (figura 01). É considerado grande queimado aquele que apresenta

queimadura de extensão igual ou superior a vinte por cento da STC.

Figura 01: Determinação da superfície corporal total queimada. Regra dos nove para medida de área corporal queimada, adaptado de Hiettiarathy e Papini, 2004.

Introdução

20

O paciente queimado desenvolve várias complicações sendo necessária a

realização de procedimentos especiais como a transferência de fluídos, o monitoramento

do balanço eletrolítico, cuidados sépticos com a ferida, suporte nutricional, respiratório e

renal, além do tratamento das infecções, e em casos mais graves, tratamento de sepse e

de síndrome de falência de múltiplos órgãos (BISHARA, et al., 2005).

Além da correlação com a STC a gravidade da injúria por queimadura está

diretamente relacionada à sua profundidade (figura 02). As queimaduras de menor

gravidade não atingem todas as camadas da pele, já queimaduras graves danificam

não só as camadas da pele como o tecido subcutâneo (revisado por

HETTIARATCHY e PAPINI, 2004).

Figura 02: Determinação da profundidade das queimaduras. Classificação da queimadura de acordo com sua profundidade, adaptado de Hiettiarathy e Papini, 2004.

A principal causa de queimaduras é o contato direto com chamas ou líquidos

quentes. Já as queimaduras químicas ou ocasionadas por condução elétrica são

menos comuns. Vale ressaltar que a fonte de queimadura está relacionada à idade

do paciente (revisado por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004).

Cerca de sessenta por cento dos pacientes queimados, apresenta idade entre

quinze e sessenta e quatro anos, sendo que a maioria das queimaduras em indivíduos

com essa faixa etária está relacionada a acidentes ocupacionais, principalmente contato

com a chama. Vinte por cento dos pacientes queimados são crianças com idade a cima

de quatro anos, sendo que o tipo de queimadura mais comum em indivíduos dessa idade

são as queimaduras acidentais por escaldadura. Na faixa etária entre cinco e quatorze

anos encontram-se dez por cento dos pacientes queimados, afligidos principalmente por

Introdução

21

queimaduras por combustíveis ou queimaduras elétricas são as mais representativas

(revisado por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004).

Alguns fatores como idade avançada, grande STC queimada e a presença de

injúria por inalação aumentam o risco de mortalidade em queimados (revisado por

HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004). Em trabalho publicado a partir de um

estudo multicêntrico nos Estados Unidos, Ryan et al., 1998, encontraram maiores

taxas de mortalidade em pacientes com idade acima de sessenta anos, com injúria

por inalação e queimaduras em quarenta por cento ou mais da STC. Nesse estudo,

a associação de, dois ou mais desses fatores aumentaram consideravelmente a

morbidade dos pacientes.

Em estudo realizado no Brasil De-Souza et al., 1998, apontaram as

queimaduras ocupacionais ou decorrentes de acidentes domésticos como a principal

causa de internação de pacientes com idade superior a dezoito anos na Unidade de

Queimados da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Nesses pacientes a

mortalidade foi maior nos indivíduos do sexo masculino. Além disso, a letalidade das

injúrias decorrentes de acidentes ocupacionais e domésticos foi menor do que a

letalidade observada em pacientes internados em decorrência de tentativa de

suicídio. Esse trabalho evidencia que a mortalidade em pacientes queimados pode

ser influenciada pelo gênero e intencionalidade da queimadura.

Dentre todos os fatores de risco de morte em pacientes queimados a

porcentagem corporal queimada e a profundidade dos ferimentos são determinantes

cruciais para o prognóstico do paciente. A tabela 01 evidencia a porcentagem de

mortalidade observada de acordo com a porcentagem de superfície corporal

queimada observada em pacientes da unidade de Queimados da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto.

Tabela 01: Associação entre a superfície corporal total queimada e o número de mortes no Hospital das Clínicas da faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Superfície corporal total

queimada (STC) Mortalidade

0.1-20% 1.4%

20-40% 4.3%

40-60% 18.5%

60-80% 78.9%

80-100% 100%

* Adaptado de De Souza, et al., 1998.

Introdução

22

Jeschke et al., 2007, demonstrou que o aumento da mortalidade de pacientes

pediátricos com grande STC está relacionado principalmente ao aumento da

inflamação e do hipermetabolismo. A resposta hipermetabólica que segue a injúria

térmica é iniciada aproximadamente cinco dias após a injúria podendo persistir por

cerca de vinte e quatro meses após a queimadura. O hipermetabolismo do paciente

queimado é caracterizado pelo aumento do consumo de O2 e glicose, aumento da

produção de CO2, aumento da temperatura corporal e exacerbação da

gliconeogênese, bem como pelo aumento da proteólise e da lipólise. Esse fenômeno

acarreta além de perda de massa corporal a diminuição da densidade óssea e um

prejuízo na cicatrização da pele queimada (HERNDON e TOMPKINS, 2004).

O súbito aumento da temperatura na região queimada resulta em uma

imediata resposta local. Essa resposta promove vasodilatação com o intuito de

dissipar o calor proveniente da injúria térmica. Além disso, ocorre um aumento da

secreção de mediadores inflamatórios iniciando uma cascata de reações locais

(revisado por ARTURSON, 1996). A resposta inflamatória local, caracterizada pela

produção exacerbada de mediadores químicos e ativação de leucócitos e células

endoteliais pode contribuir para os efeitos sistêmicos observados após o trauma

térmico (revisado por ARTURSON, 1996).

Em grandes queimados, mediadores inflamatórios liberados podem causar

broncoconstrição acarretando insuficiência respiratória. O desenvolvimento de

hipermetabolismo e imunossupressão afetando tanto a imunidade mediada por

células quanto a imunidade humoral também são comumente observados (revisado

por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004).

Queimaduras que atingem mais trinta por cento da STC, induzem efeitos

sistêmicos consideráveis no organismo. Esses efeitos são desencadeados pela

secreção de citocinas e outros mediadores inflamatórios. Nesses pacientes há um

aumento da permeabilidade capilar que ocasiona a perda intravascular de proteínas

e fluidos para o compartimento intersticial. Paralelamente, a contratilidade do

miocárdio é diminuída provavelmente devido à secreção de TNF-α. Essas alterações

somadas à perda de fluidos pelo ferimento resultam em hipotenção sistêmica e

hipoperfusão em órgãos (HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004).

A secreção exacerbada de citocinas como a IL-6, IL-1 e TNF-α está

relacionada aos efeitos negativos sistêmicos em pacientes queimados. Essas

citocinas provavelmente são responsáveis pela manutenção prolongada da ativação

Introdução

23

de macrófagos e esses, por sua vez, produzem mediadores lipídicos, como

prostaglandinas e leucotrienos. Esses mediadores ativam cascatas enzimáticas que

conseqüentemente levam à imunossupressão do paciente queimado (revisado por

SPARKES, 1997).

A injúria grave, especialmente a injúria térmica prejudica os mecanismos de

defesa do organismo. A imunossupressão decorrente da injúria térmica causa um

aumento da suscetibilidade do paciente a infecções. Em conseqüência, as infecções em

pacientes queimados estão associadas a um maior risco de mortalidade. A principal

porta de entrada de patógenos em pacientes queimados é o trato respiratório,

acarretando principalmente pneumonia nesses pacientes. Por outro lado, as infecções

locais nas feridas ocasionadas pela injúria térmica representam uma importante fonte

de sepse sistêmica (revisado por O´SULLIVAN e O´CONNOR, 1997).

Além disso, pacientes queimados com má evolução podem freqüentemente

apresentar o desenvolvimento de SIRS (síndrome da resposta imune sistêmica),

síndrome da angústia respiratória do adulto (SARA) e síndrome da disfunção de

múltiplos órgãos (SDMO) que podem ocasionar progressiva falência de órgãos e

morte (revisado por ARTURSON, 1996).

A introdução do procedimento de reposição de fluidos por Underhill em 1930

representou um ganho para o tratamento de pacientes queimados e esse

procedimento continua sendo atualmente o padrão ouro para esse tipo de injúria. A

administração adequada de fluidos é crítica para a prevenção de choque e outras

complicações decorrentes da injúria térmica (revisado por BENSON et al., 2006).

Além disso, nos últimos 50 anos, a menor incidência de infecções das feridas,

menor ocorrência de sepse sistêmica e menor taxa de mortalidade dos pacientes

queimados têm sido atribuídas aos avanços substanciais no cuidado de queimados,

particularmente ao desbridamento precoce (revisado por CHURCH et al., 2006).

1.2. Lesão da pele em queimados

Por um longo período o tegumento foi considerado um órgão de proteção

passiva. Porém atualmente a pele tem sido considerada um órgão

imunologicamente competente (revisado por ALLGÖWER, 1995).

Introdução

24

A pele constitui a primeira barreira de defesa do corpo humano,

desempenhando importantes funções na proteção contra uma grande variedade de

agressões ambientais e na manutenção da homeostasia através da termo-regulação

e do balanço de fluidos (revisado por BARTHEL e ABERDAM, 2005).

O epitélio cutâneo é composto por três estruturas bem definidas

histologicamente: a epiderme, os folículos pilosos e as glândulas sebáceas (revisado

por FUCHS e RAGHAVAN, 2002). A epiderme compreende a camada mais externa

da pele sendo constituída por um tecido estratificado e escamoso posicionado sobre

uma membrana basal que o separa do tecido subjacente, a derme. As células da

lâmina basal são mitoticamente ativas, o que confere sua grande capacidade

regenerativa (revisado por GHAZIZADEH e TAICHMAN, 2001).

A população celular da epiderme é compreendida principalmente por

queratinócitos e células de Langerhans. Os queratinócitos que correspondem a

aproximadamente 95% da população de células epidérmicas, expressam

normalmente em sua superfície antígenos do complexo maior de

histocompatibilidade de classe I (MHC-I), mas em algumas situações patológicas

passam também a expressar antígenos MHC de classe II. Já as células de

Langerhans que compreendem de 3-4% da população das células epidérmicas,

expressam em sua superfície principalmente moléculas do tipo CD1, podendo

expressar também moléculas MHC de classe II (MHC-II). As principais funções das

células de Langerhans são o reconhecimento, captura e apresentação de antígenos

para os linfócitos T CD4+ (revisado por ALGÖWER, et al., 1995). Na derme, as

células presentes em maior número (cerca de 80% na região papilar) são os

dendrócitos. Esse tipo celular encontra-se intimamente associado à

microvascularização cutânea, agindo tanto como célula apresentadora de antígenos

quanto como célula fagocítica. (ALGÖWER, et al., 1995).

A injúria por queimadura, além de lesar o tegumento permitindo a invasão do

organismo por agentes externos, pode provocar alterações vasculares como

descamação das células endoteliais e trombose microvascular, o que dificulta a

chegada de componentes do sistema imune ao local da lesão. Fatores pró-

inflamatórios como o TNF-α, IL-2 e IL-6 são impedidos pela barreira mecânica de

chegarem à área queimada, o que diminui consideravelmente a resposta

inflamatória e imunológica do organismo (MORAN e MUNSTER, 1987; ONO et al,

1995).

Introdução

25

Três diferentes zonas são detectáveis no ferimento por queimadura, segundo

Jackson, 1947: a zona de coagulação, a zona de estase e a zona de hiperaemia. O

dano máximo causado pela injúria térmica é observado na zona de coagulação,

onde o dano ao tecido é irreversível devido à coagulação das proteínas

constituintes. A região ao redor da zona de coagulação,compreende a zona de

estase, onde há uma diminuição da perfusão. Porém esta representa uma área

predisposta à recuperação através principalmente do procedimento ressuscitação de

fluidos que aumenta a reperfusão local prevenindo danos subseqüentes. A região

mais externa, denominada região de hiperanemia é caracterizada por perfusão

aumentada, nessa região, o tecido é comumente recuperado (revisado por

HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004).

O processo de cicatrização de úlceras/úlceras de pele compreende três fases

distintas: a fase inflamatória, a proliferativa e a fase de remodelamento. Todas essas

fases são reguladas pela atuação de diversos fatores de crescimento (revisado por

WITTE e BARBUL, 1997). A interrupção vascular seguida pelo extravasamento de

plasma ocorrido após a injúria funciona como um sinal para que um coágulo de

fibrina temporário seja formado na superfície lesada com o intuito de restabelecer a

homeostasia e promover um substrato temporário para que ocorra a agregação

plaquetária. As plaquetas aderidas ao coágulo secretam fatores de crescimento,

citocinas e componentes da matriz extracelular. Esses mediadores inflamatórios

recrutam macrófagos e neutrófilos os quais, por sua vez, secretam outros fatores

específicos orquestrando o processo de reepitelização (revisado por SANTORO e

GAUDINO, 2005).

A fase inflamatória é essencial para o processo normal de cicatrização de

úlceras. Essa fase é caracterizada pelo aumento da permeabilidade vascular,

liberação de citocinas, óxido nítrico (iNOS) e fatores de crescimento e conseqüente

quimiotaxia das células da circulação para a superfície lesada (revisado por WITTE

e BARBUL, 1997). Durante a fase inflamatória, os macrófagos controlam a

degradação do tecido conectivo extracelular através da secreção de enzimas e de

fagocitose. Além disso, os macrófagos promovem a cicatrização através da

produção de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento derivado de

plaquetas (PDGF), o TGF-, o TNF- e outras interleucinas (revisado por STEED,

1997).

Introdução

26

Fibroblastos e células endoteliais são as primeiras células a iniciarem a fase

proliferativa. Tanto a quimiotaxia quanto a proliferação de fibroblastos no local da

injúria são reguladas por fatores de crescimento, tais como o PDGF, EGF (fator de

crescimento epidermal), FGF (fator de crescimento de fibroblastos) e TGF-. A

matriz de fibronectina fornece o substrato para ancoragem das células. Nessa fase

proliferativa, as células endoteliais iniciam o processo de angiogênese (revisado por

WITTE e BARBUL, 1997). Fibroblastos estimulados por EGF e TGF-β iniciam o

processo de síntese de colágeno, característico da fase de remodelamento da

cicatrização. A deposição de colágeno representa um ponto crítico do processo à

medida que define a qualidade do processo cicatricial (revisado por WITTE e

BARBUL, 1997). Além da atuação dos fatores de crescimento, as integrinas e as

metaloproteinases são reguladores imprescindíveis para o processo de

remodelamento tecidual (SANTORO e GAUDINO, 2005).

A perda da integridade do tegumento como ocorre em pacientes queimados é

associada à alta morbidade e mortalidade devido à perda de fluidos, proteínas e

eletrólitos e ao aumento da susceptibilidade do indivíduo a infecções e a sepse

(revisado por FALABELLA, 2001). O rápido recobrimento da área de pele perdida ou

danificada representa uma melhora do prognóstico do indivíduo sendo que o padrão

ouro para esse tipo de trauma é o auto-enxerto de pele, porém grandes queimados

dificilmente apresentam disponibilidade de área não queimada para a realização

desses enxertos (BUTLER, 2003).

1.3. Terapia celular e células-tronco mesenquimais

Células-tronco (CT) são células indiferenciadas e não especializadas,

capazes de se multiplicar por um longo período de tempo, mantendo-se

indiferenciadas, de forma que um pequeno número pode originar uma grande

população de células semelhantes, além disso, as CT são capazes de se diferenciar

em células especializadas de um tecido particular (ZAGO e COVAS, 2006).

As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram descritas pela primeira vez por

Friedenstein et al., em 1966, que observaram a presença de uma população celular

peculiar em células mononucleares da medula óssea de camundongos, essa

Introdução

27

população era representada por células de formato fibroblastóide e apresentava a

propriedade de formar colônias in vitro, sendo dessa forma denominadas de

unidades formadoras de colônias fibroblástóides.

Atualmente, sabe-se que a medula óssea (MO) contém além das células-

tronco hematopoiéticas e das células-tronco endoteliais, uma população rara de

células-tronco, que corresponde a 0,001% a 0,01% de todas as células nucleadas

medulares, constituídas pelas CTMs. Na MO as CTMs são responsáveis por dar

suporte à hematopoese (revisado por ZAGO e COVAS, 2006).

Segundo a Sociedade Internacional para Terapia Celular (ISTC) a

nomenclatura célula-tronco mesenquimal não é a mais adequada para designar

essa população celular, sendo mais apropriada a denominação de células

multipotentes mesenquimais estromais, (HORWITZ, et al., 2005), porém para efeito

didático continuaremos nos referindo a essa população como CTMs.

CTMs são rotineiramente isoladas da MO e de tecidos de origem

mesodérmica, tais como o tecido adiposo, muscular, ósseo e cartilaginoso. As

células estromais multipotentes tem sido isoladas também a partir de outros tecidos,

de origem não mesodérmica (PITTENGER et al., 1999; ERICES et al., 2000; BAKSH

et al., 2004).

Em estudo recente foi demonstrado o isolamento de CTMs a partir de

cérebro, baço, fígado, rins, pulmões, MO, músculo, timo e pâncreas de

camundongos (da SILVA MEIRELLES et al., 2006).

Dessa forma, as CTMs existem virtualmente em todos os órgãos (revisado

por da SILVA MEIRELLES, et al., 2008) podendo ser facilmente isoladas a partir de

diversos tecidos. Para justificar a vasta distribuição desse tipo celular pelo

organismo vários estudos têm sugerido a natureza perivascular das CTMs. Em

trabalho realizado em 2003, Shi e Gronthos demonstraram que populações

ontogenicamente distintas de CTMs, as células estromais da MO e as células tronco

da polpa dentária encontram-se associadas à microvasculatura de seus respectivos

tecidos (SHI e GRONTHOS, 2003).

Em 2008, Covas et al., propuseram a existência de CTMs e células de

pericitos na parede vascular, não só coexistindo como compartilhando

características como a diferenciação em outros tipos celulares. Para os autores essa

conformação constitui um compartimento de CTMs que se estende por todo o

organismo responsável não só pela manutenção de tecidos como também pelo

Introdução

28

reparo em situações de injúria (COVAS et al., 2008). Posteriormente, foi

demonstrada a origem perivascular de CTMs provenientes de múltiplos órgão

adultos e fetais.

Paralelamente, Crisan et al., 2008, isolaram células perivasculares a partir de

tendão adulto, músculo esquelético fetal, pâncreas fetal, placenta, coração fetal, pele

fetal, pulmões, cérebro, olhos, intestino, medula óssea, cordão umbilical e

observaram que essas células expressavam nativamente marcadores comuns às

CTMs, indicando que esses tipos celulares estariam intimamente relacionados em

tecidos intactos.

Dessa forma, esses trabalhos sugerem a hipótese de que as CTMs estejam

distribuídas por todo o corpo como pericitos, estabilizando os vasos sanguíneos e

contribuindo para a homeostase de tecidos e do sistema imune sob condições

fisiológicas. Em situações de injúria, quando os mecanismos de reparo tecidual são

acionados, ocorre um aumento da proliferação e atividade dessas células, que

passam secretar fatores bioativos os quais atuam na proteção, reparo e/ou

regeneração do tecido em questão; dessa forma os pericitos atuam como uma fonte

local de CTMs com finalidade terapêutica (revisado por da SILVA MEIRELLES,

2008).

Nos últimos anos, a expansão do conhecimento sobre a biologia das CTMs

abriu perspectivas para sua utilização terapêutica, sendo que sua

multipotencialidade favorece sua utilização na medicina regenerativa e/ou

reconstrutiva. Pittenger, et al., 1999, demonstrou que as CTMs são células

multipotentes passíveis de se diferenciarem em células de tecidos mesodérmicos

como osso, cartilagem, gordura, tendão, músculo e estroma da MO.

Trabalhos posteriores demonstraram que as CTMs são capazes de se

diferenciar em tipos celulares como células endoteliais (REYES, et al., 2002),

hepatócitos (SATO, et al., 2005) e células neurais (KANG, et al., 2004) e células da

epiderme (SASAKI, et al., 2008) in vitro. Adicionalmente as CTMs poderiam se

diferenciar in vivo em células tecido-específicas em resposta ao nicho encontrado

em diferentes órgãos (revisado por JIANG, et al., 2002).

Além do potencial de diferenciação o potencial regenerativo das CTMs deve-

se à secreção de um largo espectro de moléculas bioativas como citocinas e fatores

de crescimento que podem estruturar o microdesevolvimento de regiões injuriadas

(revisado por CAPLAN, 2007).

Introdução

29

Além de seu potencial de diferenciação e regenerativo, importantes para o

processo de regeneração tecidual, as CTMs apresentam propriedade

imunoreguladora. As CTMs apresentam propriedades

imunoreguladoras/imunomodulatoras in vitro e in vivo, sendo capazes de modular a

função imunológica de várias populações celulares do sistema imune, tais como

células apresentadoras de antígenos, células T, células B e células NK

(RAMUSSON, 2006). Ademais, por não expressarem moléculas co-estimulatórias,

as CTMs apresentam limitada imunogenicidade, sendo fracamente reconhecidas

pelo HLA de hospedeiros incompatíveis (UCELLI e PISTOIA, 2006).

De acordo com critérios estabelecidos pela ISTC, são características mínimas

para a definição de CTMs: a. a propriedade de aderir ao plástico quando mantidas

em garrafas de cultura; b. expressão dos marcadores de superfície celular CD105,

CD73 e CD90 e a expressão menor que 2% ou ausência de expressão dos

marcadores de superfície celular CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α ou CD19 e

HLA classe II e c. a capacidade, se diferenciarem em adipócitos, condrócitos e

osteócitos após a indução específica in vitro (DOMINICI et al., 2006).

Dessa forma, características como o fácil isolamento, multipotencialidade,

potencial regenerativo e imunomodulador favorecem o uso das CTMs para terapia

celular de várias patologias (tabela 02) o que é especialmente interessante para a

medicina regenerativa e a engenharia de tecidos (KOLF et al., 2007).

Introdução

30

Tabela 02: Terapia celular experimental com CTMs

Doença Modelo animal

Órgão alvo Mecanismos ação CTMs Rota

administração

Co-infusão CTMs e CTHs

Ovelha Hematopoéticos Aumento da hematopoese Sistêmica

Infarto miocárdio

Camundongo Coração Desenvolvimento novos miócitos e

estruturas vasculares Local

Rejeição enxerto pele

Macaco Pele Inibição linfócitos T Sistêmica

Derrame Rato SNC Liberação de fatores tróficos e

indução de neurogênese Sistêmica

Falência renal aguda

Rato Rins Inibição citocinas próinflamatórias

e liberação fatores tróficos e antiapoptóticos

Sistêmica

EAE Camundongo SNC Inibição linfócitos mielina-

específios e indução tolerância periférica

Sistêmica

Diabetes Camundongo Pâncreas e glomérulos

renais

Indução céls progenitoras locais e inibição de infiltrado de

macrófagos Sistêmica

Artrite reumatóide

Camundongo Articulações Inibição céls T e geração céls

Tregs Sistêmica

Degeneração retina

Rato Olho Produção de fatores tróficos e

antiapoptóticos Local

Injúria pulmonar

aguda Camundongo Pulmão Inibição citocinas próinflamatórias Sistêmica

Falência hepática

Rato Fígado Inibição da invasão leucocitária via

liberação citocinas

Meio condicionado

por CTMs

*Adaptado de Uccelli, et al., 2008.

1.4. Terapia com células-tronco mesenquimais na cicatrização de úlceras

A perspectiva de utilização de CTs no tratamento de úlceras de pele é

promissora, uma vez que trabalhos têm mostrado que essas células têm capacidade

de acelerar o processo de cicatrização desse tecido via efeito parácrino e

transdiferenciação em tipos celulares importantes para a cicatrização. A

reepitelização mais rápida impede complicações posteriores como subseqüentes

infecções

Introdução

31

O co-cultivo de queratinócitos com três tipos de tecido de origem

mesenquimal: CTMs derivadas da MO, preadipócitos ou fibroblastos dermais em

modelo de reconstrução de pele in vitro foi capaz de regenerar a epiderme (AOKI, et

al., 2004). Nesse estudo, CTMs foram capazes de diminuir a apoptose dos

queratinócitos e de promover a neo-formação organizada dos componentes da

epiderme. Mecanismos autócrinos e parácrinos possivelmente estão envolvidos

nesse processo, sendo que o contato célula a célula é imprescindível para que

ocorresse a regeneração da epiderme nesse modelo (AOKI, et al., 2004).

Em modelo de feridas excisionais cutâneas em ratos a infusão única de CTMs

alogênicas derivadas da MO, vinte e quatro horas após a excisão, ou múltiplas

infusões de CTMs por quatro dias subseqüentes à excisão, não só reduziu o tempo

de cicatrização como também aumentou a elasticidade do tecido associada ao

aumento da deposição de colágeno na área da lesão. Além disso, nesse modelo a

infusão de CTMs alogênicas foi mais eficiente em promover a reepitelização das

feridas do que a infusão de fibroblastos singênicos (McFARLIN et al., 2006).

No trabalho realizado por Goldenberg et al. (2006) foi avaliada a dinâmica da

cicatrização de úlceras provocadas cirurgicamente em camundongos de acordo com

a concentração de CTMs aplicadas na superfície da ferida. Goldenberg et al.,

observaram uma diminuição da quantidade de CTMs na superfície da lesão a partir

do 3º dia, devido à possível diferenciação das mesmas no local e um aumento de

células precursoras estromais nos tecidos hematopoéticos durante o processo de

cicatrização.

Com o intuito de avaliar o potencial terapêutico tópico das CTMs em úlceras

crônicas isquêmicas e não isquêmicas, Volk et al., 2007, demonstraram que as

CTMs foram mais efetivas na promoção da cicatrização das feridas que células

mononucleares da medula óssea. As CTMs não só aceleraram a formação de tecido

de granulação, como também aumentaram a deposição de colágeno auxiliando a

reepitelização através de mecanismos diretos como a diferenciação em

miofibroblastos e indiretos ou efeito parácrinos como a produção de fatores, tais

como os fatores de crescimento bFGF, VEGF e PDGF (VOLK, et al. 2007).

Em estudo clínico Falanga et al. (2007) comprovaram que CTMs contribuem

significativamente para a cicatrização de úlceras crônicas de membros inferiores em

pés de pacientes que apresentavam insuficiência venosa crônica e neuropatia

diabética ou úlceras agudas após a remoção cirúrgica de alguns tipos de cânceres

Introdução

32

de pele. Em ambos os casos os pacientes foram tratados com aplicação tópica de

CTMs autólogas e um spray de fibrina foi utilizado como veículo. Os pacientes do

grupo portador de úlceras crônicas apresentavam um histórico prévio de insucesso

dos tratamentos de rotina para cicatrização de úlceras e todos os indivíduos tinham

úlceras persistentes por mais de um ano. Nesse grupo, o decréscimo do tamanho

das úlceras ou a cicatrização completa puderam ser observados em torno de 16-20

semanas. Destacou-se o caso de uma paciente portadora de artrite reumatóide com

úlcera venosa existente há mais de 10 anos, cuja ferida cicatrizou completamente

nesse período.

No caso das úlceras agudas, o tratamento com CTMs autólogas foi iniciado

logo após a cirurgia. Para isso foi realizada uma aspiração da MO dos pacientes,

duas semanas antes do procedimento cirúrgico e essas células foram cultivadas em

meio de cultura seletivo para CTMs. Foram aplicadas 2 x 106 cels/cm² entre as 2ª e

4ª passagens. Nesse grupo, as CTMs foram efetivas na cicatrização das lesões

desses pacientes. Os autores demonstraram a formação de novas fibras elásticas,

cerca de oito dias e a cicatrização total das úlceras oito semanas após o início do

tratamento com CTMs (FALANGA et al., 2007).

Úlceras crônicas acometem cerca de 25-50% dos indivíduos diabéticos, o que

representa um custo anual para os sistemas de saúde de todo o mundo em cerca de

8-9 bilhões de dólares (JAVAZON, et al., 2007). Dessa forma, é um problema de

saúde que têm despertado o interesse de vários grupos de pesquisa. A cicatrização

em diabéticos é prejudicada entre outros fatores devido ao aporte sanguíneo local

ineficiente e a capacidade de recrutamento de células inflamatórias reduzida para o

local da lesão cutânea.

Javazon et al. (2007) demonstraram que a aplicação tópica de CTMs da MO

em úlceras de camundongos diabéticos db/db, diferentemente do observado nos

grupos que receberam células da MO e PBS, aumentou a reepitelização, a formação

de tecido de granulação e a neovascularização através de mecanismos indiretos

(efeito parácrino).

Com o objetivo de definir se as CTMs persistem no local da lesão após o

tratamento e se a mesmas teriam capacidade de originar novas estruturas, Falanga

et al. (2007) utilizaram um modelo animal de ferida cirúrgica em camundongos

diabéticos db/db e CTMs que expressavam GFP. Nesse experimento, pôde-se

observar que as CTMs foram capazes de penetrar na ferida por volta do 5º dia,

Introdução

33

porém, poucas células GFP+ foram encontradas na lesão cicatrizada e as mesmas

pareceram não ter se diferenciado em queratinócitos. Vale ressaltar o aparecimento

de estruturas endoteliais, como vasos sanguíneos marcados positivamente por GFP,

evidenciando a possível diferenciação das CTMs nessas estruturas e seu importante

papel para o processo de neo angiogênese (FALANGA et al., 2007).

A injeção de CTMs GFP+ derivadas da MO de camundongos ao redor das

úlceras foi capaz de acelerar o processo de proliferação celular, angiogênese e

reepitelização tanto em camundongos normais, quanto em camundongos diabéticos

db/db, quando comparada à aplicação de fibroblastos dermais alogênicos neonatais

ou de veículo controle (WU et al., 2007). Os pesquisadores demonstraram ainda a

possível diferenciação das CTMs GFP+ em queratinócitos na derme do tecido

cicatrizado. Além disso, em um período mais tardio, foram observadas estruturas

glandulares GFP+. Wu et al. (2007) constataram ainda um aumento significativo da

expressão gênica de fatores de crescimento vasculares e endoteliais e de

angiopoetina-1, evidenciando o potencial pró-angiogênico das CTMs.

Badillo et al. (2007) trataram úlceras de camundongo diabético (db/db) com

CTMs isoladas a partir de fígado fetal e observaram ao 7º dia uma diminuição

significativa do espaçamento entre as bordas da úlcera, além do aumento da

formação de tecido de granulação e da presença de células CD31+ no local. Foi

observado um aumento da expressão dos genes EGF, TGF-β1, VEGF e SDF1-α em

biópsias das úlceras. Badillo et al. (2007) também observaram no grupo de animais

tratado com CTMs um aumento da contractilidade do tecido neo-formado,

característico de um processo de deposição de colágeno eficiente durante o

processo cicatricial.

Kwon et al., 2008, trataram úlceras em ratos diabéticos com CTMs isoladas de

MO. O diabetes foi induzido nos ratos pela aplicação de estreptozotocina e foram

testadas duas vias de aplicação das CTMs, a infusão intravenosa e a aplicação local.

Os autores observaram uma melhor reepitelização nos animais tratados associada ao

aumento da dos níveis de colágeno do tipo I e V no leito da ferida, bem como o

aumento da expressão de fatores solúveis como TGF-β, KGF, EGF, VEGF e PDGF.

Recentemente, foi demonstrado que o efeito parácrino das CTMs derivadas da

MO de camundongos é capaz de aumentar a proliferação de macrófagos, progenitoras

endoteliais e a secreção de diversos fatores de crescimento importantes para o

processo de cicatrização em modelo de ferida excisional em camundongos. A aplicação

Introdução

34

tópica do sobrenadante concentrado das culturas de CTMs nas lesões foi mais eficiente

que a aplicação tópica do sobrenadante das culturas de fibroblastos dermais

aumentando não só o número de macrófagos e células progenitoras endoteliais no local

da lesão, mas também a quantidade de fatores de crescimento tais como VEGF, EGF,

SDF-1 e angiopoetina-1 secretadas (CHEN, et al., 2008).

A maioria dos trabalhos realizados utilizando CTMs na cicatrização de feridas

têm destacado seu potencial parácrino, sendo que poucos trabalhos demonstraram

a transdiferenciação das mesmas em outros tipos celulares capazes de promover a

cicatrização cutânea.

Nesse contexto, Sasaki e et al., 2008, demonstraram que CTMs isoladas da

MO de camundongos GFP+ são capazes de se diferenciar em queratinócitos e

células endoteliais in vitro. Além disso, os pesquisadores infundiram CTMs GFP+

intravenosamente em camundongos submetidos à realização de ferida cirúrgica. Foi

observado através de imunohistoquímica que uma pequena porcentagem de CTMs

GFP+ foi capaz de se diferenciar em queratinócitos in vivo (0,14%), enquanto 13,2%

das células endoteliais no leito da ferida eram GFP+. Uma porcentagem

relativamente maior de células GFP+ (33%) estava localizada na parede de capilares

e foram positivas para o marcador α-SMA e negativas para CD31, sendo

identificadas como pericitos. Os autores descartaram a possibilidade da ocorrência

de fusão entre as células GFP+ e as células da pele pela técnica de hibridização in

situ por fluorescência, onde os mesmos observaram que todas as células GFP+

continham cromossomos XY, enquanto os animais recipientes eram XX. Sasaki, et

al., (2008) demonstraram também que a aplicação intradérmica da quimiocina

SLC/CCL21 aumentou a migração de CTMs para o local da lesão e contribuiu para o

processo de cicatrização via transdiferenciação.

1.5. Terapia com células-tronco mesenquimais em queimaduras

Em um modelo experimental de queimaduras em camundongos, Shumakov et

al. (2003) mostraram que a utilização de CTMs autólogas ou alogênicas e de células

fibroblastóides embrionárias acelerou o processo de regeneração da pele quando

comparados aos controles que não receberam tratamento com células. Os

Introdução

35

resultados mostraram uma diminuição da infiltração de células imunocompetentes

nas úlceras e aceleração do processo de formação de vasos e de tecido de

granulação no local afetado pelas queimaduras profundas.

Em outro estudo, Fu et al. (2006) mostraram que CTMs alogênicas isoladas

de mini-porcos e induzidas em cultura com VEGF ou cultivadas em meio de cultura

epitelial suplementado com EGF, foram capazes de se transdiferenciar em células

com fenótipo epidermal e endotelial. Quando associadas à um selante de fibrina e

implantadas ex vivo em queimaduras no dorso de mini-porcos, as CTMs foram

capazes de acelerar o processo de regeneração originando células especializadas

como células endoteliais, células epidermais e células do ducto sebáceo (FU et al.,

2006).

Rasulov et al. (2006) compararam o potencial terapêutico do transplante de

fibroblastos fetais e de CTMs alogênicas na cicatrização de queimaduras em ratos.

Esse estudo demonstrou que ambas as CTs utilizadas topicamente nas lesões

reduziram a quantidade de infiltrado inflamatório na superfície lesada, bem como

promoveram a formação de novos vasos sanguíneos e de tecido de granulação.

Em humanos, Rasulov et al. (2005) mostraram a possibilidade de tratamento

de queimaduras utilizando CTMs alogênicas. Neste caso, uma paciente com 45

anos apresentando queimaduras de I, II, III A-B em 40% da área corporal foi tratada

com as técnicas habituais em casos de queimaduras graves, incluindo o

procedimento de auto-enxertos de pele que foram rejeitados. Após 20 dias de

internação foi observada a ausência de “pega” dos enxertos e a piora do estado

clínico da paciente, com progressão da insuficiência cardiovascular, hepática e

respiratória. Neste momento foi introduzida a terapia células utilizando CTMs

alogênicas. Três dias após implante de pele com CTMs alogênicas houve um

aumento da angiogênese nas regiões queimadas, e após oito dias, foi observada a

normalização dos valores bioquímicos sanguíneos da paciente, aceleração do

processo de reepitelização e conseqüente recobrimento da ferida. Aparentemente

não houve rejeição dos enxertos quando estes foram implantados

concomitantemente às CTMs alogênicas, o que possibilita a utilização deste tipo

celular associada a implantes de enxertos no período inicial do tratamento

(RASULOV et al., 2005).

Em um estudo recente, Liu et al., 2008, demonstraram que a utilização de

CTMs alogênicas isoladas de MO e adicionadas à matriz de colágeno foi eficiente

Introdução

36

para promover a reepitelização de queimaduras dérmicas superficiais em mini

porcos. Quatro semanas após a queimadura, foi observada uma maior densidade de

vasos sanguíneos nos animais que receberam a matriz colágena contendo as

CTMs. Nesse período também foi observado no grupo tratado uma maior

queratinização e a migração das CTMs da matriz colágena para tecidos subjacentes

compreendidos pela neo-epiderme e neo-derme (LIU, et al., 2008).

Objetivos

37

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Estabelecer modelo de queimadura grave em ratos Wistar e avaliar o

potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais nesse modelo experimental.

2.2. Objetivos específicos

Estabelecer e caracterizar um modelo de queimadura experimental grave e

extensa em ratos Wistar;

Avaliar a freqüência das subpopulações de células T CD4+ e CD8+ no baço

dos animais, em vários períodos após a queimadura experimental;

Avaliar a freqüência das subpopulações de células T CD4+ e CD8+ na região

da ferida ocasionada pela queimadura nos animais, em vários períodos após

a queimadura experimental;

Avaliar a quantidade de neutrófilos presentes na região da ferida ocasionada

pela queimadura nos animais em vários períodos após a queimadura

experimental;

Avaliar os achados histopatológicos encontrados na pele dos animais em

vários períodos após a queimadura experimental;

Determinar os microorganismos colonizadores da região da ferida ocasionada

pela queimadura nos animais, em vários períodos após a queimadura

experimental;

Estabelecer uma cinética dos acontecimentos observados durante a evolução

das queimaduras graves e extensas por período total de sessenta dias,

relacionando a freqüência de linfócitos T CD4+ e células CD8+ no baço e na

região da ferida, a quantidade de neutrófilos presentes na região da ferida e

os achados histopatológicos e microbiológicos das feridas.

Material e Métodos

38

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Considerações gerais

Para a realização deste estudo foram utilizadas como fonte de células-tronco

mesenquimais (CTMs) medulas ósseas de camundongos da linhagem FVBGFP+

machos. As matrizes dos camundongos FVBGFP+ foram adquiridas do laboratório

de criação The Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org) e foram mantidas pelo

biotério de criação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo.

Para a realização do experimento de injúria térmica foram utilizados ratos

Wistar machos fornecidos pelo Biotério Central da Universidade de São Paulo do

Campus de Ribeirão Preto. Esses animais foram aclimatados por um período

aproximado de uma semana antes da realização dos experimentos. A aclimatação

foi feita no Biotério de Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, após o procedimento de injúria

térmica experimental, os ratos Wistar foram mantidos no Biotério de Experimentação

da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo até o final dos experimentos.

Os animais dos quais foram retirados materiais biológicos (sangue, baço e

pele) durante o experimento foram sacrificados por decapitação, enquanto os

animais que foram avaliados no período máximo estipulado no experimento,

equivalente há sessenta dias após o início do experimento, foram sacrificados em

câmara de CO2.

Os procedimentos experimentais utilizando animais estão de acordo com as

normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e o presente

trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA)

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

(Processo número: 115/2007).

http://jaxmice.jax.org/

Material e Métodos

39

3.2. Isolamento das células-tronco mesenquimais (CTMs) de medula óssea de

camundongos FVB GFP+

3.2.1. Extração da medula óssea dos camundongos FVB GFP+

Camundongos FVB GFP+ foram sacrificados e submetidos à remoção

cirúrgica dos fêmures e tíbias, dos quais foi extraída a medula óssea (MO). Os ossos

foram mantidos em placa de Petri contendo PBS.

Em seguida, as epífises (extremidades) dos fêmures e das tíbias foram

retiradas com o auxílio de uma tesoura. Em uma das extremidades do orifício do

osso foi acoplada uma agulha de 0.3cc fixa à seringa de 1mL contendo PBS. Em

seguida, a extração da MO foi realizada através do procedimento de lavagem do

osso (conhecido por “flushing”) com PBS. Durante o “flushing” os ossos foram

posicionados sobre o tubo coletor em posição vertical, com o auxílio de uma pinça.

O procedimento foi repetido até que a ausência dos componentes da medula óssea

no interior do fêmur fosse visualmente perceptível.

Após a coleta, as células mononucleares da medula óssea foram

centrifugadas por 10 minutos à 1200rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet

ressuspenso em 1mL de meio de cultura RPMI (Gibco, USA) 10%SFB para a

contagem das células obtidas. Cada animal forneceu cerca de 7 x 107 células totais

da medula óssea.

Todos esses procedimentos foram realizados em capela de fluxo laminar em

condições estéreis, utilizando material cirúrgico esterilizado e seringas e tubos

descartáveis.

Cerca de 7 x 107 células mononucleares da MO foram plaqueadas em meio

de cultura -MEM (Gibco, USA) com baixa concentração de glicose contendo 15%

de soro fetal bovino (SFB), em garrafas de cultura (75cm2) para isolamento das

CTMs pela propriedade de aderência ao plástico.

Material e Métodos

40

3.2.2. Cultura das células-tronco mesenquimais

Garrafas de cultura de 75cm2 contendo as células mononucleares da MO dos

camundongos FVB GFP+ foram mantidas em 20mL de meio de cultura -MEM

contendo baixa concentração de glicose (Gibco, USA) acrescido de 15% SFB, em

estufa contendo 5% de CO2, à temperatura de 37˚C em atmosfera umidificada. Após

setenta e duas horas as células não aderentes foram retiradas através da troca de

todo o meio de cultura, em seguida 20mL de meio de cultura -MEM 15%SFB foram

adicionados à garrafa de cultura e a mesma foi mantida por mais setenta e duas

horas nas condições especificadas anteriormente. Nesse momento foi realizada a

primeira troca de metade do meio de cultura (10mL) e esse procedimento foi

realizado a cada setenta e duas horas até que a cultura primária de CTMs atingisse

cerca de 80% de confluência.

Ao atingir em torno de 80% de confluência, a cultura primária passou pelo

procedimento de tripsinização para que as células aderentes fossem desprendidas e

o primeiro repique fosse feito. A tripsinização foi realizada toda vez que a

confluência de 80% foi atingida, de modo que a cada passagem a população de

CTMs foi tornando-se mais homogênea e pura. As culturas de CTMs foram mantidas

até a terceira ou quarta passagens e em seguida usadas nos experimentos.

3.2.3. Tripsinização das células-tronco mesenquimais

Ao atingirem cerca de 80% de confluência as culturas de CTMs foram

tripsinizadas. A tripsinização foi feita após a retirada de todo o meio de cultura da

garrafa e da lavagem cuidadosa das células aderidas com 10mL de PBS por três

vezes.

Após a retirada do PBS, 5mL de solução de tripsina/EDTA (0,05%

Tripsina/0,53 mM EDTA, Gibco, USA) foram adicionadas à garrafa de cultura. Após

cinco minutos a solução de tripsina foi inativada através da adição de 10mL de RPMI

10%SFB. A suspensão celular foi centrifugada por 10min à 1200rpm, o

sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em PBS e centrifugado

Material e Métodos

41

novamente por 10min à 1200rpm. Esse procedimento de lavagem das células em

PBS foi repetido por mais uma vez.

Imediatamente após a segunda lavagem das células em PBS as mesmas

foram ressuspensas em meio de cultura α-MEM 15%SFB e contadas. Após a

contagem das células, alíquotas das mesmas foram destinadas ao requipe para

expansão , e/ou à imunofenotipagem por citometria de fluxo, e/ou diferenciação in

vitro e/ou procedimento experimental de terapia celular em modelo de queimadura

experimental.

3.3. Imunofenotipagem de MSCs murinas

Alíquotas de 100 l de contendo 1x106 células/mL foram incubadas por 20

minutos a TA no escuro com 5l de anticorpos monoclonais ou isotipos controles

diretamente conjugados ao fluorocromo ficoeritrina (PE). Foram feitas marcações

simples para a análise dos diversos marcadores. Após a incubação, as células foram

centrifugadas por cinco minutos a 1800rpm, lavadas duas vezes com PBS,

ressuspensas em 200L de PBS e analisadas imediatamente no citômetro de fluxo

FACSort (Becton-Dickson). Foram adquiridos 20000 eventos/amostra com base nos

parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC). As análises foram

realizadas utilizando-se o software Cellquest (BD). Para a caracterização

imunofenotípica das MSCs murinas foram utilizados os anticorpos monoclonais

contra os marcadores CD45, CD34, CD105, CD31 e CD73 (eBioscience, EUA).

3.4. Ensaio de diferenciação in vitro das células CTMs murinas

Para avaliar a multipotencialidade das CTMs murinas, uma alíquota das

células expandidas foi reservada no momento do processamento para utilização na

terapia célular (3ª passagem). As CTMs foram plaqueadas em placas de 24 poços

contendo lamínulas previamente esterilizadas na concentração de 1,0 x 104

Material e Métodos

42

células/poço. A avaliação do potencial de diferenciação das CTMs em adipócitos e

osteócitos in vitro foi realizada.

Nos poços destinados a diferenciação em adipócitos foi adicionado o meio

indutor de adipogênese (meio α-MEM suplementado com 15% de soro fetal bovido,

1 µM de dexametasona, 10 µg/mL de insulina e 100 µM de indometacina) e nos

poços para osteócitos o meio indutor de osteogênese (meio α-MEM suplementado

com 7,5% de soro fetal bovino, 0,1 µM de dexametasona, 200µM de ácido ascórbico

e 10 mM de β-glicerolfosfato). O acompanhamento das mudanças morfológicas ao

longo do cultivo foi feito por meio de um microscópio invertido com contraste de fase

(Zeiss, modelo Axioskop. 2.0., Alemanha). Após quinze dias do início do processo

de indução de diferenciação das CTMs, as lamínulas foram retiradas, lavadas três

vezes em PBS. As células diferenciadas em adipócitos e os seus controles foram

fixados em paraformaldeído (Electron Microscopy Science, EUA) a 4% por 15

minutos a TA, em seguida lavadas em água destilada e incubadas em álcool 70%

por 2 a 3 minutos. Posteriormente, as células foram coradas com a solução de

sudan II-escarlate por 2 a 5 minutos, lavadas em álcool 70% em água corrente e

contra-coradas com hematoxilina de Harris por 2 minutos. O material foi montado em

glicerina.

As células diferenciadas em osteócitos e os seus controles foram fixados em

paraformaldeído a 4% por 15 minutos a TA, lavadas em água destilada e coradas

com solução de nitrato de prata a 5% no escuro por 30 minutos. Em seguida, foram

lavadas em água destilada, expostas a lâmpada de 100W por 60 minutos (coloração

Von Kossa) e então lavadas rapidamente com tiossulfato de sódio a 5%.

Posteriormente, as células foram contra-coradas com hematoxilina de Harris,

submetidas ao processo de diafinização e montadas em Permout SP 15.

3.5. Procedimento experimental

Ratos Wistar pesando em torno de 250g foram fornecidos pelo Biotério

Central da Universidade de São Paulo Campus Ribeirão Preto e aclimatados no

Biotério de Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da mesma

Universidade antes da realização do experimento. Os animais foram mantidos em

Material e Métodos

43

temperatura e ciclos claro/escuro controlados e com água e alimentação ad libtum,

durante todo o período do experimento. Os animais foram divididos aleatoriamente

em grupos e subgrupos mostrados na Tabela 03.

Todos os animais utilizados no experimento foram anestesiados, por via

intraperitoneal, com 400μL de solução na concentração de 1:1 de quetamina 10%

(Agener União, Brasil) e xilazina 20mg/mL (Dopaser-Calier, Espanha). Após

anestesia, os animais foram tricotomizados. A tricotomia foi realizada em duas

etapas, em um primeiro momento os pêlos dos animais foram removidos com o

auxílio de máquina elétrica (PHILIPS, Brasil), em um segundo momento, o mesmo

animal teve a região dorsal recoberta por creme depilatório (Depilart, Brasil) por 5

minutos, esse creme foi removido com auxílio de gaze úmida. A pele recém

tricotomizada foi seca com auxílio de papel toalha e em seguida foi realizada a

queimadura experimentalutilizando um aparelho com controle digital de temperatura

confeccionado pela Oficina de Precisão da Universidade de São Paulo. O aparelho

consiste basicamente em um resistor que aquece uma placa de metal de tamanho

aproximado de 2cm x 3cm. Com a chapa de metal a uma temperatura de 200˚C

foram realizadas quatro queimaduras de duração de 25 segundos cada uma. As

queimaduras foram realizadas na região dorsal do animal formando um retângulo de

tamanho correspondente a quatro vezes o tamanho da chapa de metal como

evidenciado na Figura 04 A e B.

Figura 03: Esquema de quadrantes utilizado para realização da queimadura. A. Aparência final da queimadura. B. Estabelecimento dos quadrantes e dos pontos da aplicação intradérmica de PBS ou CTMs.

Material e Métodos

44

Aproximadamente 30 minutos após a realização da queimadura experimental

os animais ainda encontravam-se anestesiados quando foram submetidos à

aplicação intradérmica (ID) de PBS ou de CTMs, em volume total de 2000μL

aplicado em 10 doses de 200μL em pontos pré-estabelecidos (Figura 04 B).

Tabela 03: Distribuição dos animais utilizados nos experimentos.

Grupo n Procedimento Sub-

grupos n

Aplicação ID de PBS PBS-ID 7

GR60d 14

Aplicação ID de CTMs CTM-ID 7


GR45d 10



GR30d 10



GR15d 10



GR7d 10


Os animais foram mantidos em gaiolas individuais com água e alimentação ad

libtum e sem a utilização de antibióticos durante o período de realização do

experimento.

Material e Métodos

45

3.6. Monitoramento fotográfico das lesões obtidas a partir da injúria térmica

A avaliação clínico-fotográfica das lesões foi realizada pela porcentagem de

cicatrização das ulcerações, observado a partir da captura e análise de imagens

pelo programa Image J®.

O Image J® – Image Processing and Analysis in Java (Bethesda, Maryland, EUA)

é um programa de análise de imagem de domínio público desenvolvido por Wayne

Rasband do National Institutes of Health (NIH), é um sucessor do NIH Image possuindo

a vantagem de ter aplicação multidisciplinar, na pesquisa e na prática clínica.

A captura de imagens foi realizada imediatamente após a queimadura

experimental (0d) e nos períodos de 7, 15, 30, 45 e 60 dias após o início do

experimento. No momento da captura das imagens os animais foram anestesiados

por via intraperitoneal com 200μL de solução na concentração de 1:1 de quetamina

10% (Agener União, Brasil) e xilazina 20mg/mL (Dopaser-Calier, Espanha).

Utilizando o programa Image J®, a mensuração dimensional de imagens

constitui um método de análise não-invasivo importante para o acompanhamento do

dinamismo da cicatrização de úlceras cutâneas. Foi acompanhado fotograficamente

um grupo composto por 14 ratos Wistar (n=14), sendo que sete animais foram

submetidos à aplicação intradérmica de PBS (PBS-ID) e sete ratos foram

submetidos ao tratamento intradérmico (ID) com CTMs (CTM-ID).

No momento da captura da imagem uma régua foi colocada ao lado de cada

animal fotografado o que permitiu a calibração do programa e posterior análise

computacional. As imagens foram capturadas por uma câmera fotográfica digital Fuji

Film Finepix S2000HD com resolução de 10.0 megapixels, nos períodos acima

citados e analisadas pelo software Image J® (versão 1.40g para WindowsTM),

disponível gratuitamente na internet.

3.6.1. Cálculo da porcentagem de cicatrização

A porcentagem de cicatrização foi avaliada através dos dados fornecidos pelo

programa Image J®. A medida da área da lesão em pixels fornecida, pelo programa

Material e Métodos

46

Image J®, foi aplicada à uma fórmula para cálculo da porcentagem de cicatrização. A

fórmula em questão considera a área inicial da lesão bem como a área final e está

demonstrada abaixo:

Porcentagem de cicatrização = 100 - Área final da úlcera (pixels) x 100

Área inicial da úlcera (pixels)

3.7. Coleta, processamento e análise de materiais biológicos

3.7.1. Obtenção de plasma dos animais

Nos períodos que equivalentes aos 7º, 15º, 30º e 45º dias após o

procedimento experimental, cerca de 10 animais submetidos ao tratamento com

CTMs ID ou não, foram sacrificados por decaptação. O sangue desses animais foi

colhido em tubos contendo solução anticoagulante. O sangue foi centrifugado por

15min a 1800rpm e o plasma contido no sobrenadante foi coletado e armazenado à -

80˚C para possíveis análises posteriores.

3.7.2. Coleta do baço

Após o sacrifício dos animais os baços dos mesmos foram removidos

cirurgicamente, pesados e mantidos em placas de Petri estéreis contendo 2-3mL de

meio de cultura RPMI incompleto (sem adição de soro fetal bovino) a 4°C. Um

pequeno fragmento foi separado e pesado para ser submetido à análise das

subpopulações de linfócitos por citometria de fluxo, o restante do órgão foi

imediatamente congelado à -80˚C para possíveis análises futuras.

Material e Métodos

47

3.7.3. Obtenção de esplenócitos dos animais

O fragmento extraído do baço total foi divulsionado até obtenção de uma

suspensão celular turva. Essa suspensão foi centrifugada a 400g durante 10 min, a

4o C, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em 4 ml de tampão de

lise de hemáceas (Tris 0,17M e NH4Cl 0,16M) por 4 minutos. Para inativação do

tampão de lise foram acrescentados 5 mL de RPMI completo (10% SFB). As células

foram centrifugadas a 400g durante 10 min a 4o C e posteriormente a concentração

celular foi ajustada para o experimento de imunofetipagem das células por citometria

de fluxo.

3.7.4 Imunofenotipagem das subpopulações linfocitárias

Alíquotas de 100 l de solução de esplenócitos, contendo 2 x 106 células/mL,

foram incubadas por 20 minutos a TA, no escuro, com 2l de anticorpos

monoclonais diretamente conjugados ao fluorocromo isotiocianato de fluoresceína

(FITC) ou ficoeritrina (PE) ( eBioscience, EUA). Foram feitas marcações duplas para

a análise das subpopulações linfocitárias. Todas as incubações foram realizadas no

escuro para evitar perda de fluorescência. As células foram centrifugadas por 5

minutos a 500g, lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 200 l de PBS e

analisadas imediatamente no citômetro de fluxo FACSort (BD).

As seguintes subpopulações linfocitárias foram analisadas: CD3+ (linfócitos T

totais), CD3+CD4+ (linfócitos T helper ou auxiliares) e CD8+ (linfócitos T citotóxicos e

NK).

Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de

linfócitos (R1), estabelecida com base nos parâmetro de tamanho (FSC) por

parâmetros de granularidade (SSC). Foram adquiridos 10000 eventos/amostra. As

análises foram realizadas utilizando-se o software Cellquest (BD). Os eventos da

gate de linfócitos (R1) foram analisados para marcação com os diferentes anticorpos

por dot plots de fluorescência 1 (FL1, FITC), por fluorescência 2 (FL2, PE).

Material e Métodos

48

3.7.5 Coleta de pele

Após o sacrifício, nos períodos que equivalentes ao 7º, 15º, 30º e 45º dia após

o procedimento experimental, foram extraídas cirurgicamente amostras de pele de

aproximadamente 1cm2, contendo a região da borda da lesão cutânea

compreendida por um pequeno fragmento de pele saudável e pela área da lesão

propriamente dita. As amostras foram armazenadas em formaldeído 10% ou

congeladas em Tissue Tek para realização de análises histológicas (HE) e por

imunohistoquímica (IH), respectivamente.

Outras amostras de pele foram pesadas e acondicionadas em tubos contendo

200 μL de tampão contendo NaCl 0,1M, NaPO4 0,02M, NaEDTA 0,015 M gelado.

Os fragmentos de pele foram homogeneizados em POLITRON PT 3100 a

13000rpm. O homogeinato foi congelado à -80˚C para a realização do ensaio de

produção de mieloperoxidase (MPO), o qual quantifica a atividade de neutrófilos no

local da lesão.

Um terceiro grupo de amostras de pele, coletadas nos respectivos períodos,

foi destinado à quantificação da porcentagem de células T CD4+ e T CD8+ por

citometria de fluxo. Essas amostras foram pesadas, dilaceradas em placa de Petri e

mantidas em 1mL de meio de cultura RPMI incompleto onde foram tratadas com

10% Liberase Blendzyme 2 (Roche) por 1 hora. Após esse período foi realizada a

inativação da liberase através da adição do mesmo volume de meio RPMI contendo

10% SFB. Essa solução foi passada por uma peneira de nylon para a retirada dos

fragmentos de pele e centrifugada por 10min a 400g. O pellet contendo células foi

ressuspenso em PBS para ser feita a análise das subpopulações de linfócitos da

região da lesão por citometria de fluxo.

3.7.6 Realização da atividade de dosagem de mieloperoxidase (MPO)

Para a realização da dosagem de mieloperoxidase (MPO), enzima produzida

através da atividade de neutrófilos (explicar, fragmentos de pele foram colhidos e

acondicionadas em tubos eppendorfs com 200 μL de tampão 1 (NaCl 0,1M, NaPO4

Material e Métodos

49

0,02M, NaEDTA 0,015 M; pH 4,7) gelado, a -70ºC até a dosagem. Os fragmentos

foram homogeneizados em POLITRON PT 3100 a 13000rpm. Em seguida, o

homogeinato foi centrifugado em 3000rpm por 15 minutos a 4°C. Foi realizado então

um choque hipotônico no pellet de células com 600 μL de NaCl 0,2%, seguido de

600μL de uma solução de NaCl 1,6% e glicose 5%. Depois de uma nova

centrifugação a 3000rpm por 15 minutos a 4°C, o pellet celular foi ressuspenso em

tampão 2 (NaPO4 contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio; pH 5,4) e

novamente homogeneizado. A seguir, o homogeinato foi submetido a um

procedimento de choque térmico que consiste no congelamento em nitrogênio

líquido e descongelamento, por três vezes, para lise dos neutrófilos e liberação do

conteúdo (MPO) de seus grânulos. Em seguida, o homogeinato foi centrifugado à

20000rpm por 15 minutos a 4°C. Após centrifugação, 5μL do sobrenadante das

amostras foram colocadas em placa de 96 poços para o ensaio. Em cada poço

foram adicionados 25μL de TMB (“3, 3´, 3, 3´ - tetramethylbenzidine” – 1,6 mM final

na placa) e a placa foi incubada por 5 minutos a 37º C. Logo após, 100μL de H2O2

(concentração final de 0,5 M l) foram adicionados aos poços e a placa foi incubada

por mais 5 minutos a 37º C. A seguir, a reação foi interrompida com ácido sulfúrico 4

M. A quantificação dos neutrófilos foi feita a partir de uma curva padrão de

neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal, 6 horas após os camundongos serem

injetados com carragenina. Os neutrófilos foram diluídos seriadamente em tampão

NaPO4 0,08M (1 x 105 neutrófilos/poço em 50μL de tampão). Foi determinada a

absorbância em leitor de ELISA (SPECTRA MAX 250; Molecular Devices) em

comprimento de onda de 450nm. Os resultados foram expressos em número de

neutrófilos x 106/mg de tecido.

3.7.7 Análises histológicas

Amostras de pele da região da queimadura foram colhidas dos animais de

todos os grupos. As amostras foram retiradas da interface queimadura e pele

saudável e mantida em formaldeído 10% por no mínimo quarenta e oito horas antes

de serem processadas para a histologia.

Material e Métodos

50

Após serem retirados do formaldeído, os tecidos foram incluídos em parafina

líquida e cortados em micrótomo com espessura 5μm. Em seguida foram montadas

lâminas contendo os cortes histológicos de pele que foram corados por hematoxilina

e eosina (HE). As lâminas foram observadas sob microscópio ótico para a análise

morfológica das estruturas da pele.

As análises histológicas foram realizadas no laboratório de Patologia da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, sob a

responsabilidade da médica patologista Prof. Dra. Leandra Naira Zambeli Ramalho.

Foram determinadas duas regiões a serem analisadas nos cortes histológicos

da pele: a região da borda e a região da úlcera propriamente dita. Foram observadas

em ambas as regiões as características do epitélio, presença de inflamação,

presença de colágeno, presença de tecido de granulação e de vasos sanguíneos.

Para a análise dessas características foi estabelecido um esquema de

pontuação variando de 0 a 3, onde: 0, corresponde a achado histopatológico

ausente; 1, achado histopatológico pontual; 2, achado histopatológico moderado; e

3: achado histopatológico considerável.

3.7.8. Teste microbiológico

Após o procedimento de queimadura, fez-se a coleta de material

microbiológico passando uma haste de algodão estéril sobre uma área de

aproximadamente 1cm2 da ferida. Este procedimento foi repetido duas vezes mais,

tomando-se o cuidado de girar a haste de algodão em sentido horário para que toda

sua superfície entrasse em contato com a ferida.

Como recomendado pela ANVISA, a coleta foi feita em regiões significativas

(LEVY, 2004), onde era mais provável o aparecimento de infecções.

Terminada a coleta, as hastes de algodão foram introduzidos em tubos

contendo 1mL de soro fisiológico estéril em capela de fluxo laminar (LEVY, 2004).

Em seguida, as amostras foram encaminhadas imediatamente para o laboratório de

análises clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo (LAC-FCFRP), sob responsabilidade da microbiologista

Maria Emília Nadaletto Bonifácio da Silva, para análise microbiológica.

Material e Métodos

51

No LAC-FCFRP, o material foi semeado em ágar CLED (Cystine Lactose

Electrolyte Deficient Agar) e o crescimento dos microorganismos foi avaliado após

48 horas de incubação.

3.7.9. Análise de dados

Para determinação da curva de sobrevida dos animais submetidos às

queimaduras foi utilizada uma análise exploratória dos dados, composta de

estatísticas descritivas, seguida de estimativas, gráficos de Kaplan-Meier e para os

resultados foi utilizado o teste não paramétrico com modificação Peto & Peto

(Gehan- Wilcoxon) para se ter uma idéia do comportamento das variáveis em

estudo.

As outras análises estatísticas realizadas no trabalho basearam-se na

comparação de uma variável entre dois grupos experimentais, dessa forma foi

utilizado somente o Teste t não paramétrico para determinar as diferenças

existentes entre os grupos experimentais. As diferenças foram consideradas

estatisticamente significantes quando p valor foi menor que 5% (p <0,05). Esses

testes foram realizados com auxílio do programa estatístico PRISMA 5.0.

Resultados

52

4. RESULTADOS

4.1. Obtenção das células-tronco mesenquimais a partir da medula óssea de

camundongos FVB GFP+

As células-tronco mesenquimais (CTMs) isoladas a partir da medula óssea

(MO) de camundongos machos FVB GFP+ foram mantidas em cultura em meio α-

MEM até atingirem a 3ª-4ª passagem. Nessas passagens as CTMs foram

imunofenotipadas, submetidas à análise de multipotencialidade e utilizadas na

terapia celular das feridas de pele por queimadura. A Figura 04 mostra uma

caracterização imunofenotípica representativa, por citometria de fluxo, da população

de CTMs cultivadas e utilizadas nos experimentos.

Figura 04: Histogramas representativos da população de CTMs de camundongos FVB GFP+. Histogramas obtidos por citometria de fluxo, representativos da população de CTMs de camundongos FVB GFP+ em quarta passagem.

Resultados

53

4.2. Análise da multipotencialidade das células-tronco mesenquimais

Para testar a multipotencialidade das CTMs utilizadas no experimento, as

mesmas foram induzidas à diferenciação in vitro em adipócitos e osteócitos por 15

dias, conforme descrito em Material e Métodos.

A Figura 05 mostra uma fotomicrografia representativa de CTMs

diferenciadas em adipócitos e osteócitos.

Figura 05: Avaliação da multipotencialidade das CTMs isoladas de medula óssea de camundongos FVB GFP+ A. Fotomicrografia em contraste de fase de CTMs na segunda passagem (40X). B. CTMs submetidas à diferenciação adipogênica; A adipogênese demonstrada pela formação de vacúolos lipídicos corados com Sudan II-escarlate (aumento 40X). C. CTMs submetidas à diferenciação osteocítica; osteogênese demonstrada pela deposição de matrix mineralizada revelada pela coloração de von Kossa (aumento 40X).

4.3. Procedimento de injúria térmica experimental

Ratos Wistar submetidos à queimadura experimental foram previamente

aclimatados no biotério de experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas

de Ribeirão Preto. Após o período de aclimatação esses animais foram pesados,

depilados e submetidos à queimadura experimental com auxílio de chapa de metal

com controle de temperatura a 200˚C.

A realização das queimaduras foi padronizada utilizando-se a placa de metal

aquecida à 200˚C em contato com o dorso do animal depilado por um período de 25

segundos. A pressão aplicada pela placa ao dorso dos animais foi mínima

Resultados

54

correspondendo apenas ao peso da própria placa. A queimadura realizada nos

animais ocupou uma extensa superfície do dorso dos mesmos, com área de

aproximadamente 24cm2, sendo que essa área corresponde a aplicação da chapa

de metal por quatro vezes, em quatro quadrantes não sobrepostos.

Posteriormente à injúria térmica, os animais foram subdivididos em cinco

grupos experimentais de acordo com o período em que foram sacrificados: 7, 15, 30,

45 ou 60 dias pós-injúria. Além disso, os animais foram subdivididos em dois

subgrupos, de acordo com o tratamento a que foram submetidos: o subgrupo

controle (PBS-ID) que recebeu aplicação intradérmica (ID) de PBS e o subgrupo

tratado (CTM-ID) que recebeu aplicação intradérmica de 5 x 106 CTMs. Os animais

foram mantidos em gaiolas individuais.

4.4. Curva de sobrevida dos animas

Para a avaliação da sobrevida dos animais após o procedimento experimental

de injúria térmica, foram analisados um total de cinqüenta e seis animais (n=56),

sendo que trinta animais pertenciam ao subgrupo PBS-ID (n=30) e vinte e seis

animais pertenciam ao subgrupo CTM-ID (n=26). A sobrevida dos animais foi

observada diariamente em ambos os subgrupos e a Figura 06 representa as curvas

de sobrevida dos animais pertencentes ao grupo PBS-ID e ao grupo CTMs-ID nos

primeiros nove dias após início do experimento.

Resultados

55

Figura 06: Análise da sobrevida dos animais submetidos ao procedimento de injúria térmica experimental. Curvas de sobrevida de ratos Wistar submetidos à queimadura experimental e tratados com PBS (grupo controle PBS-ID; N=30; linha cinza) ou com CTMs (grupo tratado ou CTM-ID; N=26; linha preta).

No dia 0, referente ao dia em que foi realizado o experimento nenhum animal

morreu. O subgrupo CTM-ID não apresentou óbitos até o dia 3 após início do

experimento, já o subgrupo PBS-ID apresentou o seu primeiro óbito vinte e quatro

horas após o início do experimento.

O período mais crítico durante a realização do experimento para os animais do

subgrupo PBS-ID ocorreu entre os dias 2 e 3 pós-injúria, nos quais morreram 19,57% dos

animais. No dia subseqüente morreram mais 13,04% dos animais submetidos ao

experimento, totalizando 32,61% de óbitos no grupo controle até o quarto dia pós-injúria.

Já para o subgrupo CTM-ID o período mais crítico observado ocorreu entre os dias

3 e 4, nos quais 11,91% dos animais tratados foram a óbito. Entretanto, entre os dias 4 e 5

houve uma taxa de mortalidade baixa nesse grupo (4,76%), ao contrário do observado no

subgrupo PBS-ID que apresentou uma alta taxa de mortalidade nesse período

A partir dos períodos críticos poucos animais morreram, sendo que a partir do

dia 7 da curva de sobrevida não foram observados mais óbitos significativos em

ambos os subgrupos. Dessa forma, ao final de sete dias o subgrupo PBS-ID

apresentou uma taxa de sobrevida de 60,86%, enquanto o subgrupo CTM-ID

apresentou uma taxa de sobrevida de 76,19%. Essa diferença da taxa de

sobrevivência dos animais não foi estatisticamente significativa (p=0,07).

Resultados

56

4.5. Acompanhamento da massa corporal dos animais

Os animais pertencentes aos subgrupos PBS-ID e CTM-ID foram avaliados

no período referente ao início do experimento (0d) e nos períodos subseqüentes:

sete dias (7d), quinze dias (15d), trinta dias (30d), quarenta e cinco dias (45d) ou

sessenta dias (60d) após início do experimento de injúria térmica. Nesses períodos,

foram observadas características como a variação da massa corporal, presença de

alterações comportamentais e presença de infecção nas feridas. A Figura 07

demonstra a variação da massa corporal dos animais PBS-ID e dos animais CTM-ID

durante o período de acompanhamento. Os animais pertencentes aos subgrupos

PBS-ID e CTM-ID que foram acompanhados por um período igual ou maior que

sessenta dias fizeram parte do grupo denominado GR60d.

Figura 07: Análise da massa corporal dos animais submetidos ao procedimento de injúria térmica experimental por um período de sessenta dias. Massa corporal de ratos Wistar (em gramas) submetidos à queimadura experimental. Subgrupo controle ou PBS-ID (n=7; linha preta) e subgrupo tratado ou CTM-ID (n=7; linha cinza).

Dias

Resultados

57

Foi observada uma diminuição da massa corporal de ambos os grupos na

primeira semana após queimadura experimental. Esse fato ocorreu associado a

alterações comportamentais, já que os animais apresentaram-se menos ativos

nesse período após o procedimento da injúria térmica. Além disso, os animais

provavelmente apresentaram dificuldade para se alimentarem o que levou à perda

de massa corporal. Em torno da segunda semana após a injúria térmica, não foi

mais observada perda de peso em ambos os subgrupos. Ao contrário, foi observado

a partir desse período um aumento crescente da massa corpórea dos animais.

4.6. Avaliação dos animais no início do experimento

O dia em que o experimento foi iniciado foi considerado o dia zero (0d). Antes

do início do experimento, no 0d, os animais foram pesados (Figura 07) e em

seguida anestesiados e submetidos à depilação para a realização da queimadura.

No momento seguinte à realização da queimadura foi colhida uma amostra de

material de dez animais (n=10) com o auxílio de uma haste de algodão estéril para

realização de testes microbiológicos a fim de determinar os microorganismos

colonizadores da pele dos animais. Dos dez animais em que foram realizados os

testes microbiológicos da pele no dia zero, cinco animais pertenciam ao subgrupo

PBS-ID (n=5) e cinco animais pertenciam ao subgrupo CTM-ID (n=5). O material foi

semeado em placa de Petri contendo ágar CLED e cultivado por 48 horas para

verificação do crescimento de colônias. O resultado das análises microbiológicas

das feridas no dia 0 para ambos os subgrupos é mostrado na Tabela 04.

Tabela 04: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no dia 0.

PBS-ID Microorganismo CTM-ID Microorganismo

1

A: Pseudomonas sp. B: Bacilo gram

negativo não fermentador

1

A: Pseudomonas sp. B: Bacilo gram

negativo não fermentador

2 2

3 3

4 4

5 5

Resultados

58

As análises microbiológicas demonstraram que no início do experimento (0d)

a pele de todos os animais pertencentes a ambos os grupos continha exatamente os

mesmos microorganismos colonizadores: Pseudomonas sp. e bacilo gram negativo

não fermentador.

Após a realização dos testes microbiológicos da pele dos animais os mesmos

foram submetidos à aplicação intradérmica de PBS ou de 1x106 CTMs em 10 pontos

preestabelecidos (Figura 03). Em ambos os subgrupos (controles ou PBS-ID e

tratados ou CTM-ID) foi utilizado um volume total de 2000μL, sendo aplicado

intradermicamente em cada ponto um volume de 200μL.

Em seguida, os animais de ambos os subgrupos foram fotografados. As

Figuras 08 e 09 mostram o aspecto inicial das úlceras obtidas imediatamente após

a realização das queimaduras (0d) e representam um total de quatorze animais que

foram destinados à avaliação fotográfica do início ao fim do experimento (dia 0 ao

dia 60 pós-injúria térmica) e constituem o grupo GR60d. Do total de quatorze

animais destinados a essa avaliação, sete animais pertenciam ao grupo PBS-ID

(Figura 08) e sete animais pertenciam ao grupo CTM-ID (Figura 09).

Além de serem fotografados no início do experimento (0d) e no final do

experimento (60d) esses animais também foram fotografados nos períodos

intermediários referentes aos dias 7 (7d), 15 (15d), 30 (30d) e 45 (45d) pós-injúria

térmica.

Resultados

59

Figura 08: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no início do experimento (0d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo PBS-ID no 0d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no 0d após a realização da queimadura experimental.

Figura 09: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no início do experimento (0d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo CTM-ID no 0d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no 0d após a realização da queimadura experimental.

Resultados

60

4.7. Avaliação microbiológica dos animais três dias após o início do

experimento

Após o início do experimento foi estabelecido um ponto intermediário entre o

dia inicial e o primeiro dia de avaliação fotográfica (7d) onde os animais foram

submetidos somente à análise microbiológica. Esse período correspondeu ao

terceiro dia (3d) após queimadura experimental. A Tabela 05 representa o conteúdo

microbiológico encontrado nas feridas dos animais no 3d após a queimadura

experimental.

Tabela 05: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no terceiro dia após o início do experimento.


1

A. Pseudomonas sp. B. Bacilo gram negativo não fermentador C. Staphylococcus coagulase negativa

1 A. Pseudomonas sp. B. Staphylococcus coagulase negativa


2 A. Pseudomonas sp. B. Bacilo gram negativo não fermentador

3

A. Pseudomonas sp. B. Bacilo gram negativo não fermentador

3

A. Pseudomonas sp. B. Bacilo gram negativo não fermentador C. Staphylococcus coagulase negativa


4

A. Pseudomonas sp. B. Bacilo Gram negativo não fermentador C. Staphylococcus coagulase negativa

5 Pseudomonas sp. 5 A. Pseudomonas sp. B. Staphylococcus coagulase negativa

Resultados

61

No terceiro dia após o início do experimento foi observada uma alteração dos

microorganismos colonizadores da queimadura, sendo que apenas Pseudomonas

sp. que se encontrava colonizando a ferida no 0d permaneceu presente em todos os

animais no 3d pós-injúria térmica.

Nesse período, não foram observadas diferenças entre as espécies de

microorganismos colonizadores do grupos PBS-ID e CTM-ID. Além de

Pseudomonas sp., foi observada nos animais de ambos os grupos a presença de

Staphylococcus coagulase negativa e de bacilo gram negativo não fermentador.

4.8. Avaliação dos animais sete dias após o início do experimento

4.8.1. Grupo GR60d

Transcorridos sete dias do início do experimento os animais do grupo GR60d

foram fotografados, pesados e submetidos à análise microbiológica e análise

fotográfica das feridas ocasionadas pela queimadura.

4.8.1.1. Análise microbiológica das feridas

Os animais pertencentes ao grupo GR60d (n=10) foram submetidos à análise

da população de microrganismos presente na pele queimada no período referente

ao sétimo dia após início do experimento. Os microorganismos colonizadores

presentes na pele queimada dos animais pertencentes aos subgrupos PBS-ID (n=5)

CTM-ID (n=5) no sétimo dia após início do experimento estão mostrados na Tabela

06.

Resultados

62

Tabela 06: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no sétimo dia após o início do experimento.


1 Staphylococcus coagulase negativa


2 A. Enterobacter sp. B. Staphylococcus coagulase negativa

2 A. Enterococcus sp. B. Staphylococcus coagulase negativa

3

A. Enterococcus sp. B. Staphylococcus coagulase negativa

3

A. Enterococcus sp. B. Staphylococcus coagulase negativa C. Escherichia coli

4

A. Enterococcus sp. B. Staphylococcus coagulase negativa C. Escherichia coli




Foram encontrados microorganismos em comum colonizando a pele dos

animais de ambos os subgrupos. Esses microorganismos foram: Enterococcus sp.,

Staphylococcus coagulase negativa e Escherichia coli. Entretanto a bactéria do

gênero Enterobacter sp. foi encontrada apenas em feridas dos animais do subgrupo

PBS-ID.

4.8.1.2. Análise fotográfica das feridas ocasionadas por injúria térmica

As Figuras 10 e 11 mostram o aspecto das feridas ocasionadas pelas

queimaduras nos animais dos subgrupos PBS-ID (Figura 10) e CTM-ID (Figura 11)

do grupo GR60d.

Resultados

63

Figura 10: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no sétimo dia após o início do experimento (7d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo PBS-ID no 7d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no 7d após a realização da queimadura experimental.

Figura 11: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no sétimo dia do início do experimento (7d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo CTM-ID no 7d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no 7d após a realização da queimadura experimental.

Resultados

64

O primeiro período no qual os animais do grupo GR60d foram submetidos à

avaliação fotográfica foi estipulado como sendo sete dias após o início do

experimento. Nesse período inicial, não foram observadas diferenças entre as

feridas dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID. Os dados em pixels para

cálculo da área da região de pele queimada dos animais fornecidos pelo programa

Image J, demonstraram que do início do experimento até o 7d ocorreu um aumento

da área das lesões em ambos os grupos devido ao início do processo de necrose na

região da borda da ferida, no sentido da pele não queimada. Esse aumento modesto

do tamanho das lesões no sétimo dia após início do experimento foi observado tanto

nos animais do subgrupo PBS-ID (42.61 ± 4.627) (Figura 12 A), quanto nos animais

do subgrupo CTM-ID (49.55 ± 4.557) (Figura 12 B). A média da área das lesões

iniciais (no 0d) dos animais do subgrupo PBS-ID era de 40.10 ± 1.115 e dos animais

do subgrupo CTM-ID era de 48.72 ± 2.111.

Figura 12: Área da queimadura, em pixels, no sétimo dia após o início do experimento. A. Comparação da área da lesão, em pixels, no 0d e no 7d nos animais do subgrupo PBS-ID. B. Comparação da área da lesão, em pixels, no 0d e no 7d dos animais do subgrupo CTM-ID.

4.8.2. Grupo GR7d

Um grupo de dez animais (GR7d), cinco pertencentes ao subgrupo PBS-ID

(n=5) e cinco pertencentes ao subgrupo CTM-ID (n=5) foi sacrificado para análise

das subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ presentes no baço e na pele

Resultados

65

queimada por citometria de fluxo, dosagem de mieloperoxidase (MPO) na pele

queimada e análises histológicas de pele normal e queimada por coloração

hematoxilina/eosina (HE).

4.8.2.1. Análise das populações de linfócitos TCD4+ e células CD8+ do baço dos

animais por citometria de fluxo

Os animais pertencentes ao grupo GR7d foram sacrificados por decapitação e

o baço dos mesmos foi removido cirurgicamente. Um fragmento do baço de cada

animal foi divulsionado para obtenção de esplenócitos livres que foram lavados com

PBS e marcados com anticorpos anti-CD3 anti-CD4 ou anti-CD8, associados à

fluorocromos. Os esplenócitos marcados foram analisados por citometria de fluxo. A

figura 13 representa a população de células T CD3+CD4+ do baço dos animais

obtida por citometria de fluxo.

Figura 13: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais sete dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 no 7d.

Resultados

66

A análise da porcentagem de linfócitos T CD3+CD4+ no baço dos animais

sacrificados sete dias após o início do experimento não revelou diferenças

estatisticamente significativas entre os subgrupos PBS-ID (21.55 ± 3.024) e CTM-ID

(29.74 ± 2.772) (Figura 13). A porcentagem de células CD8+ nos baços dos animais

do subgrupo PBS-ID (18.58 ± 1.069) e do subgrupo CTM-ID (17.70 ± 1.985), (Figura

14) transcorridos sete dias do início do experimento, também não demonstrou

diferença estatística.

Figura 14: População de células CD8+ no baço dos animais sete dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 7d.

4.8.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ da pele dos

animais por citometria de fluxo

Amostras de pele da região da queimadura foram colhidas após o sacrifício

dos animais e digeridas enzimaticamente. As células da pele, obtidas a partir da

digestão enzimática dos componentes da matriz extracelular, foram lavadas com

PBS, incubadas com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 ou anti-CD8 e analisadas por

citometria de fluxo. A porcentagem de linfócitos T CD4+ e CD8+ na pele dos animais

sacrificados nesse período está mostrada nas Figura 15 e 16, respectivamente.

Resultados

67

Figura 15: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais sete dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4no 7d.

A análise por citometria de fluxo revelou a presença de uma pequena

população de linfócitos T CD4+ na pele dos animais de ambos os grupos. A

porcentagem de linfócitos T CD4+ da pele dos animais PBS-ID (0.1600 ± 0.03642)

não foi estatisticamente diferente da porcentagem de linfócitos T CD4+ na pele dos

animais do grupo CTM-ID (0.1080 ± 0.07024) nesse período.

Figura 16: População de células CD8+ na pele dos animais sete dias após o início do experimento. População celular da pele dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 7d.

Resultados

68

Apesar de não serem observadas diferenças estatísticas significativas, a

freqüência de células CD8+ foi um pouco menor na pele dos animais do grupo CTM-

ID (0.0520 ± 0.02871) do que no grupo PBS-ID (0.1200 ± 0.04066) (Figura 16).

4.8.2.3. Análises histopatológicas das lesões

Fragmentos de pele da interface entre a pele saudável e a úlcera térmica,

extraídos dos animais do subgrupo PBS-ID (n=4) e subgrupo CTM-ID (n=4) no 7d

após o início do experimento, foram processados e corados por hematoxilina e

eosina (HE) (Figura 17) e submetidos à análise histopatológica. As análises

histopatológicas foram realizadas com base em esquema de pontuação indicando a

freqüência do achado histopatológico observado na pele do animal em questão

(Tabela 07). Foram estabelecidas duas regiões a serem abordadas pela análise: a

região da borda e a região da úlcera.

Figura 17: Cortes histológicos da pele dos animais no 7d após a injúria térmica. Os cortes foram corados por HE. A. Pele normal (40x). B. Pele da região da úlcera de um animal pertencente ao subgrupo CTM-ID, evidenciando a lesão ocasionada na região da queimadura (100x). C. Pele da região da úlcera de um animal pertencente ao subgrupo PBS-ID, evidenciando a lesão ocasionada na região da queimadura (100x).

Resultados

69

Tabela 07: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e úlcera no sétimo dia após injúria térmica.

Animal Borda Úlcera

epitélio inflamação colágeno epitélio granulação vasos inflamação

PBS-ID 1 1 0 0 0 0 0 0

PBS-ID2 2 1 0 0 0 1 0

PBS-ID 3 2 1 0 0 0 0 0

PBS-ID 4 2 1 0 0 1 0 2

CTM-ID 1 2 2 0 1 1 1 3

CTM-ID 2 2 1 0 1 1 0 2

CTM-ID 3 1 1 0 0 0 0 0

CTM-ID 4 2 0 0 0 0 0 0

Com base nas pontuações obtidas a partir da avaliação histopatológica dos

animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, pôde-se observar que não houve

diferença entre os subgrupos na região da borda. Enquanto que, na região da úlcera

propriamente dita, observou-se o início da formação de um novo epitélio somente

nos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID. Nesse subgrupo também pareceu

ocorrer um processo inflamatório mais evidente do que o observado nos animais do

subgrupo PBS-ID nesse período inicial.

4.8.2.4. Dosagem de MPO da pele da região da ferida dos animais

Amostras de pele da região da ferida ocasionada pela injúria térmica foram

colhidas dos animais do grupo GR7d para a realização do ensaio de produção de

mieloperoxidase (MPO). A MPO é uma enzima produzida durante o metabolismo de

neutrófilos. Dessa forma, a produção da mesma na pele dos animais, comparada a

uma curva padrão da produção de MPO por neutrófilos, fornece o número de

neutrófilos por grama de tecido analisado. Para a realização desse ensaio as

amostras de pele foram extraídas cirurgicamente, pesadas e submetidas à digestão

mecânica em tampão adequado. A Figura 18 indica o número de neutrófilos

encontrado por grama de tecido (pele) dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-

ID.

Resultados

70

Figura 18: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no sétimo dia após início do experimento. Número de neutrófilos por grama de tecido (pele) indicado pela dosagem de MPO no homogeinato da ferida dos animais.

Sete dias após a queimadura experimental, a pele da região lesada dos

animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID apresentou 2.950 (± 2.360) x 106

neutrófilos/grama de tecido, enquanto que a pele da mesma região dos animais do

subgrupo CTM-ID apresentou 1.9 (±1.384) x 106 neutrófilos/grama de tecido. Não

houve diferença estatisticamente significativa entre a quantidade de neutrófilos por

grama de pele entre os grupos tratado e controle no período em questão.

4.9. Avaliação dos animais quinze dias após o início do experimento

4.9.1. Grupo GR60d.

Quinze dias após injúria térmica o grupo GR60d foi pesado, fotografado e foi

colhido material da ferida para análise microbiológica.

Resultados

71


O resultado da análise microbiológica das úlceras ocasionadas por

queimadura nos animais pertencentes aos subgrupos PBS-ID e CTM-ID está

mostrado na Tabela 08.

Tabela 08: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica quinze dias após o início do experimento.



1

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Proteus vulgaris

2

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Enterococcus sp. C. Enterobacter cloacae

2

A. Enterococcus sp B. Proteus vulgaris

3

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Escherichia coli C. Proteus mirabilis

3

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Escherichia coli C. Enterococcus sp.

4

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Escherichia coli


5

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Enterococcus sp. C. Proteus vulgaris D. Enterobacter sp.


A maioria dos microorganismos identificados encontrou-se presentes na pele

lesada tanto dos animais do subgrupo PBS-ID quanto nos animais do subgrupo

CTM-ID, sendo esses: Staphylococcus coagulase negativa, Enterococcus sp.,

Escherichia coli e Proteus vulgaris. Outros microorganismos, tais como Enterobacter

cloacae, Proteus mirabilis e Enterobacter sp., foram encontrados exclusivamente na

pele lesada dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID.

Resultados

72

4.9.1.2. Análise fotográfica das lesões por queimadura

No décimo quinto dia após injúria térmica experimental as úlceras dos animais

passaram a apresentar grande quantidade de material necrótico. Foram observadas

também regiões de crosta já desprendidas evidenciando a profundidade da lesão.

As fotografias obtidas das feridas dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID

estão mostradas nas Figuras 19 e 20, respectivamente.

Resultados

73

Figura 19: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no décimo quinto dia após o início do experimento (15d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo PBS-ID no 15d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no 15d após a realização da queimadura experimental.

Figura 20: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no décimo quinto dia após o início do experimento (15d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo CTM-ID no 15d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no 15d após a realização da queimadura experimental.

Resultados

74

Através das análises realizadas no programa Image J, pode-se observar que

no décimo quinto dia após o procedimento de injúria térmica experimental as feridas

dos animais tiveram sua área sutilmente diminuída (Figura 21 A e B), aproximando-

se da área inicial observada no 0d, tanto nos animais do subgrupo PBS-ID (40.00 ±

2.620), quanto do subgrupo CTM-ID (45.40 ± 2.280).

Figura 21: Área da queimadura, em pixels, no décimo quinto dia após o início do experimento. A. Comparação da área da lesão, em pixels, no 0d e no 15d nos animais do subgrupo PBS-ID. B. Comparação da área da lesão, em pixels, no 0d e no 15d dos animais do subgrupo CTM-ID.

4.9.2. Grupo GR15d

Um grupo de animais (GR15d) foi sacrificado quinze dias após o início dos

experimentos, esse grupo GR15d continha dez animais (n=10) sendo que esses dez

animais estavam subdivididos entre os subgrupos PBS-ID (n=5) e CTM-ID (n=5). O

grupo GR15d foi submetido às análises por citometria da população CD3+CD4+ e

CD8+ das células do baço, análise por citometria da população CD3+CD4+ e CD8+

das células da pele da região queimada, dosagem da produção de MPO na pele

queimada e análises histológicas.

Resultados

75

4.9.2.1. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ no baço

dos animais por citometria de fluxo

O baço dos animais do GR15d foi extraído cirurgicamente e divulsionado, as

células obtidas foram lavadas em PBS e foram feitas marcações com anticorpos

anti-CD8, anti-CD3 e anti-CD4. As Figuras 22 e 23 mostram a porcentagem de

linfócitos T CD4+ e células CD8+, respectivamente, no baço dos animais dos

subgrupos PBS-ID e CTM-ID.

Figura 22: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais quinze dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4no 15d.

Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre a

freqüência das populações de linfócitos T CD4+ do baço dos animais PBS-ID (23.62

± 3.129%) e CTM-ID (27.16 ± 5.257%).

Resultados

76

Figura 23: População de células CD8+ no baço dos animais quinze dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais do subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 15d.

Igualmente, não foram observadas diferenças estatísticas significativas na

porcentagem de células CD8+ presentes no baço dos animais controle e tratados,

embora a porcentagem de células CD8+ no baço dos animais do subgrupo PBS-ID

(22.69 ± 1.773) tenha sido um pouco maior do que a encontrada no baço dos

animais do subgrupo CTM-ID (17.99 ± 0.7638), transcorridos quinze dias do início do

experimento.

4.9.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ na pele


A pele dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID foi extraída no período

de quinze dias do início do experimento. Fragmentos de pele foram digeridos

enzimaticamente e as células obtidas foram lavadas e imunofenotipadas.

A porcentagem de linfócitos T CD4+ e células CD8+ presentes na pele dos

animais pertencentes aos subgrupos PBS-ID e CTM-ID quinze dias após

queimadura experimental, está mostrada nas Figura 24 e 25, respectivamente.

Resultados

77

Figura 24: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais quinze dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 no 15d.

Apesar do subgrupo PBS-ID apresentar uma porcentagem de linfócitos T

CD4+ (0.1517 ± 0.07054) menor do que o subgrupo CTM-ID (0.3650 ± 0.2133), essa

diferença não é estatisticamente significativa.

Figura 25: População de células CD8+ na pele dos animais quinze dias após o início do experimento. População celular da pele dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 15d.

Resultados

78

Da mesma forma, não foram observadas diferenças estatisticamente

significantes entre a freqüência de células CD8+ encontradas na pele dos animais do

subgrupo PBS-ID (0.09167 ± 0.03816 %) e do subgrupo CTM-ID (0.1075 ± 0.04905

%), no período referente há quinze dias após início do experimento.


No décimo quinto dia após a injúria térmica fragmentos de pele foram

processados para a confecção de lâminas que foram coradas por HE. A análise

histopatológica dos cortes histológicos foi realizada com base no sistema de

pontuação descrito em Material e Métodos. A pontuação dos animais pertencentes

ao grupo GR15 está evidenciada na Tabela 09.

Tabela 09: Avaliação histopatológica da interface entre a pele normal e a úlcera no décimo quinto dia após a injúria térmica.



PBS-ID 1 2 1 0 0 1 0 2

PBS-ID 2 2 1 1 0 1 0 2

PBS-ID 3 2 1 1 0 3 1 3

PBS-ID 4 2 1 0 0 1 1 2

PBS-ID 5 2 1 0 0 3 0 2

CTM-ID 1 2 1 2 0 3 1 3

CTM-ID 2 2 1 0 0 3 2 3

CTM-ID 3 2 1 0 0 1 1 1

Não foram observadas grandes diferenças entre os achados histopatológicos

na pele dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID no 15d pós-injúria térmica.

Porém, é interessante notar que nesse período todos os animais pertencentes ao

subgrupo CTM-ID apresentaram a presença de novos vasos sanguíneos na região

da úlcera, enquanto que apenas dois em cinco animais do subgrupo PBS-ID

apresentaram vasos sanguíneos pontuais na região da úlcera.

Resultados

79


No décimo quinto dia após a queimadura experimental foram extraídos

fragmentos da pele queimada dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-

ID,destinados à dosagem de MPO. O número de neutrófilos por grama de tecido

(pele), calculados pela dosagem de MPO no homogeinato de pele dos animais dos

subgrupos PBS-ID e CTM-ID no 15d após injúria térmica, está demonstrado na

Figura 26.

Figura 26: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no décimo quinto dia após início do experimento. Número de neutrófilos por grama de tecido (pele) indicado pela dosagem de MPO no homogeinato da ferida dos animais.

Apesar do número de neutrófilos encontrado por grama de pele dos animais

controles ou PBS-ID ser menor (3.878 ± 1.093 x 106) do que nos animais tratados ou

CTM-ID (9.360 ± 5.218 x 106) no 15d após a injúria térmica, não houve diferença

estatística os subgrupos.

Resultados

80

4.10. Avaliação dos animais trinta dias após o início do experimento

4.10.1. Grupo GR60d

Trinta dias após o início do experimento os animais do grupo GR60d foram

fotografados, pesados e submetidos à análise microbiológica.


No período referente ao trigésimo dia após início do experimento, foi colhido

material para análise microbiológica dos animais pertencentes ao grupo GR60d (n=10). A

Tabela 10 evidencia os microorganismos encontrados na região da ferida dos animais

dos subgrupos PBS-ID (n=5) e CTM-ID (n=5) no período trinta dias após injúria térmica.

Tabela 10: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no trigésimo dia após o início do experimento.


1 A. Proteus mirabilis B. Staphylococcus aureus

1

A. Staphylococcus coagulase negativa B.Bacilo gram negativo não fermentador C.Coco gram negativo não fermentador

2

Ausência de crescimento 2

Citrobacter diversus

3

Staphylococcus aureus 3

A. Staphylococcus aureus B. Escherichia coli

4

Staphylococcus aureus 4 Ausência de crescimento

5

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Bacilo gram negativo não fermentador

5

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Bacilo gram negativo não fermentador

Resultados

81

Transcorridos trinta dias após serem submetidos à queimadura, as feridas dos

animais pertencentes ao grupo GR60d permaneceram intensamente colonizadas por

microorganismos. Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negativa e

bacilo gram negativo não fermentador foram microorganismos comuns aos

subgrupos PBS-ID e CTM-ID. Proteus mirabilis foi encontrado exclusivamente no

grupo controle (PBS-ID) e coco gram negativo não fermentador, Citrobacter diversus

e Escherichia coli foram microorganismos encontrados apenas nos animais

pertencentes ao grupo tratado (CTM-ID).


Foram capturadas imagens das lesões ocasionadas por queimadura dos

animais pertencentes aos subgrupos PBS-ID (Figura 27) e CTM-ID (Figura 28). As

fotografias obtidas dos animais do grupo GR60d evidenciaram o início do processo

de reepitelização, perceptível visualmente, principalmente na região das bordas das

lesões

Resultados

82

Figura 27: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no trigésimo dia após o início do experimento (30d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo PBS-ID no 30d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no 30d após a realização da queimadura experimental.

Figura 28: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no trigésimo dia após o início do experimento (30d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo CTM-ID no 30d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no 30d após a realização da queimadura experimental.

Resultados

83

A partir do trigésimo dia após injúria térmica a área das lesões da pele dos

animais passou a decrescer em conseqüência do processo de reepitelização, no

sentido das bordas para o interior da lesão, A medida da área em pixels fornecida

pelo programa Image J foi utilizada para o cálculo da porcentagem de cicatrização

(Figura 29) no trigésimo dia após o procedimento de queimadura experimental.

Figura 29: Porcentagem de cicatrização trinta dias após injúria térmica experimental. Porcentagem de cicatrização encontrada nos subgrupos PBS-ID e CTM-ID trinta dias após o início do experimento.

Não houve diferença estatística significativa entre a porcentagem de

cicatrização dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID (29.10 ± 6.413) e a

porcentagem de cicatrização dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID (46.14

± 5.570) no período referente há trinta dias após injúria térmica experimental.

4.10.2. Grupo GR30d

Trinta dias após o início do experimento, um grupo (GR30d) de dez animais

(n=10) foi sacrificado, sendo cinco animais do subgrupo PBS-ID (n=5) e cinco

animais do subgrupo CTM-ID (n=5). Os animais pertencentes ao grupo GR30d

foram submetidos à análise da população de linfócitos T CD4+ e de células CD8+ no

Resultados

84

baço, análise da população de linfócitos T CD4+e de células CD8+ na pele por

citometria de fluxo, dosagem de MPO e análises histológicas.

4.10.2.1. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ do baço


Os esplenócitos obtidos a partir do baço dos animais do grupo GR30d foram

lavados e marcados com anticorpos anti-CD3+anti-CD4 ou anti-CD8 e as

populações celulares foram analisadas por citometria de fluxo. As Figuras 30 e 31

mostram a porcentagem de célulasT CD4+ e células CD8+ no baço dos animais dos

sub-grupos PBS-ID e CTM-ID, respectivamente,no período correspondente a trinta

dias após injúria térmica.

Figura 30: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais trinta dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4no 30d.

Não houve diferenças significativas entre as porcentagens de linfócitos T

CD4+ do subgrupo PBS-ID (18.53 ± 3.076) e do subgrupo CTM-ID (20.90 ± 2.451)

nesse período.

Resultados

85

Figura 31: População de células CD8+ no baço dos animais trinta dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais do subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 30d.

Igualmente, transcorridos trinta dias do início do experimento, não ocorreram

diferenças estatisticamente significativas entre a freqüência células CD8+ entre o

subgrupo PBS-ID (20.13 ± 1.795 %) e o subgrupo CTM-ID (19.55 ± 1.540).

4.10.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ na pele


Através da citometria de fluxo também foram determinadas as porcentagens

de células T CD3+CD4+ e células CD8+ presentes na pele acometida pela injúria

térmica. A porcentagem de células T CD4+ e células CD8+ da pele dos animais do

GR30d estão mostradas nas Figuras 32 e 33, respectivamente.

Resultados

86

Figura 32: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais trinta dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4no 30d.

Trinta dias após o início do experimento, a porcentagem de linfócitos T CD4+

na pele injuriada dos animais do subgrupo PBS-ID (0.6200 ± 0.322) foi muito

semelhante à porcentagem de linfócitos T CD4+ na pele dos animais pertencentes

ao subgrupo tratado ou CTM-ID (0.4620 ± 0.1610), dessa forma não houve diferença

estatística significativa.

Figura 33: População de células CD8+ na pele dos animais trinta dias após o início do experimento. População celular da pele dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 30d.

Resultados

87

Uma leve diminuição da porcentagem de células CD8+ foi observada na pele

dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID (0.1420 ± 0.05652) quando

comparado subgrupo PBS-ID (0.4300 ± 0.3504), porém, essa diferença não é

estatisticamente significante.


Transcorridos trinta dias após a queimadura experimental os cortes

histológicos da região das lesões na pele dos animais do grupo GR30d foram

corados por HE (Figura 34), para avaliação histopatológica nesse período.

Figura 34: Cortes histológicos da pele dos animais corados por HE. A. Pele da região da úlcera de animal pertencente ao subgrupo CTM-ID sacrificado trinta dias após o início do experimento, evidenciando a presença de vasos sanguíneos na região de borda da úlcera (40x). B. Pele da região da úlcera de animal pertencente ao subgrupo CTM-ID sacrificado trinta dias após injúria térmica, evidenciando o início do processo de reepitelização no sentido da borda para o centro da lesão (40x).

A pontuação das análises histopatológicas das lesões dos animais

pertencentes ao subgrupo controles ou PBS-ID CTM-ID, no trigésimo dia após o

início do procedimento de injúria térmica experimental é mostrada na Tabela 11.

Resultados

88

Tabela 11: Avaliação histopatológica da interface entre a pele normal e a úlcera no trigésimo dia após injúria térmica.



PBS-ID 1 1 1 0 0 1 1 1

PBS-ID 2 2 1 0 0 2 2 2

PBS-ID 3 0 0 0 0 0 0 1

PBS-ID 4 2 1 1 0 2 2 3

CTM-ID 1 1 1 0 0 2 0 2

CTM-ID 2 2 0 0 0 2 2 2

CTM-ID 3 2 0 0 0 3 1 3

CTM-ID 4 3 0 0 0 3 2 3

CTM-ID 5 3 1 0 0 3 3 3

4.10.2.4. Dosagem de MPO na pele da região da ferida dos animais

Fragmentos da pele dos animais pertencentes ao grupo GR30d foram

submetidos à dosagem de MPO. A Figura 35 demonstra o número de neutrófilos

encontrados por grama de tecido analisada dos animais pertencentes aos subgrupos

PBS-ID e CTM-ID, trinta dias após do início do experimento.

Figura 35: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no trigésimo dia após início do experimento. Número de neutrófilos por grama de tecido (pele) indicado pela dosagem de MPO no homogeinato da ferida dos animais.

Resultados

89

O número de neutrófilos por grama de tecido encontrou-se muito reduzido nos

animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID (2.068 ± 0.5011) quando comparado ao

subgrupo CTM-ID (9.360 ± 5.218), no trigésimo dia após início do experimento.

Porém, porém essa diferença não é estatisticamente significante , provavelmente

devido à grande variância apresentada entre os animais pertencentes ao subgrupo

CTM-ID.

4.11. Avaliação dos animais quarenta e cinco dias após o início do

experimento

4.11.1 Grupo GR60d

Quarenta e cinco dias após o início do experimento os animais do grupo

GR60d foram fotografados, pesados e submetidos à análise microbiológica.


O material da região da ferida para análise microbiológica da região em

questão foi realizado no período referente à quarenta e cinco dias após injúria

térmica. A Tabela 12 mostra os microorganismos presentes na pele lesada dos

animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID nesse período.

Resultados

90

Tabela 12: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no quadragésimo quinto dia após o início do experimento.


1

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Staphylococcus aureus

1

A. Bacilo gram negativo não fermentador B. Corynebacterium sp.

2 Staphylococcus coagulase negativa 2

Staphylococcus aureus

3 Staphylococcus aureus

3

A. Staphylococcus aureus B. Escherichia coli C. Staphylococcus coagulase negativa


4

A. Staphylococcus aureus B. Morganella morganii C. Staphylococcus coagulase negativa D. Corynebacterium sp.


5 *

* Animal não foi avaliado no período 30d porque morreu durante a anestesia

Na pele dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID foi encontrada apenas

uma espécie de microorganismo no período referente a quarenta e cinco dias após

injúria térmica: Staphylococcus. No entanto, foram encontradas nos animais desse

subgrupo duas subespécies de Staphylococcus; Staphylococcus aureus e

Staphylococcus coagulase negativa. Já na pele dos animais do subgrupo CTM-ID,

além de Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase negativa, também

foram encontrados microorganismos das espécies Corynebacterium sp., Escherichia

coli, Morganella morganii e bacilo gram negativo não fermentador.


A avaliação fotográfica realizada após quarenta e cinco dias do início do

experimento demonstrou um evidente processo de cicatrização em curso. A crosta

da ferida da maioria dos animais já havia se desprendido nesse período, permitindo

com que o tecido neo-formado antes encoberto pela mesma pudesse ser observado.

Essas características apareceram tanto nos animais do subgrupo PBS-ID (Figura

36), quanto nos animais do subgrupo CTM-ID (Figura 37).

Resultados

91

Figura 36: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no quadragésimo quinto dia após o início do experimento (45d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo PBS-ID no 45d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no 45d após a realização da queimadura experimental.

Figura 37: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no quadragésimo quinto dia após o início do experimento (45d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo CTM-ID no 45d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no 45d após a realização da queimadura experimental.

Resultados

92

O crescente processo de cicatrização, observado visualmente quarenta e

cinco dias após o início do experimento, foi confirmado através das análises

fornecidas pelo programa Image J. A porcentagem de cicatrização de ambos os

subgrupos, PBS-ID e CTM-ID, está demonstrada na Figura 38.

Figura 38: Porcentagem de cicatrização quarenta e cinco dias após injúria térmica experimental. Porcentagem de cicatrização encontrada nos subgrupos PBS-ID e CTM-ID quarenta e cinco dias após o início do experimento.

A porcentagem de cicatrização da ferida dos animais do subgrupo PBS-ID

(57.74 ± 2.016) foi significativamente maior (p=0.0179) do que a porcentagem de

cicatrização das feridas dos animais do subgrupo CTM-ID (72.95 ± 5.170)

(p=0.0179), demonstrando que transcorridos quarenta e cinco dias do início do

experimento o processo de cicatrização das feridas dos animais tratados com CTMs

foi consideravelmente melhor do que o processo de cicatrização observado no

subgrupo controle. Isto sugere um importante papel das CTMs no processo de

cicatrização e regeneração tecidual.

4.11.2. Grupo GR45d

Transcorridos quarenta e cinco dias do início do experimento um grupo

(GR45d) de dez animais (n=10) foi sacrificado, a esse grupo pertenciam cinco

Resultados

93

animais do subgrupo PBS-ID (n=5) e cinco animais do subgrupo CTM-ID (n=5). Os

animais do grupo GR45 dias foram submetidos à análise por citometria de fluxo dos

linfócitos T CD4 do baço e da pele, análise por citometria de fluxo das populações

celulares CD8+ do baço e da pele. Além disso, foram realizadas a dosagem de MPO

e avaliações histológicas da pele queimada. Após o sacrifício, o material biológico

proveniente dos animais (baço e pele) foi extraído cirurgicamente e destinado às

análises.

4.11.2.1. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ no baço


As Figuras 39 e 40 demonstram as porcentagens de células T CD4+ e células

CD8+ no baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, respectivamente.

Figura 39: População de linfócitos T CD4+ no baço dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4no 45d.

Não houve diferença entre a porcentagem de linfócitos T CD4+ encontrados

no baço dos animais do subgrupo PBS-ID (32.99 ± 1.358) e do subgrupo CTM-ID

(34.77 ± 5.959) no período referente a quarenta e cinco dias após injúria térmica.

Resultados

94

Figura 40: População de células CD8+ no baço dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais do subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 45d.

Da mesma forma, não foi encontrada diferença estatística significativa entre a

população de células CD8+ entre os subgrupos PBS-ID (17.68 ± 2.481) e CTM-ID

(14.28 ± 0.7286).

4.11.2.2. Análise das populações de linfócitos T CD4+ e células CD8+ da pele


Após a digestão enzimática dos fragmentos de pele extraídos dos animais do

grupo GR45d, as células obtidas foram lavadas, incubadas com anticorpos

monoclonais específicos e analisadas por citometria de fluxo. As porcentagens de

células T CD4+ e células CD8+ na região da ferida dos animais dos subgrupos PBS-

ID e CTM-ID estão demonstradas nas Figuras 41 e 42, respectivamente.

Resultados

95

Figura 41: População de linfócitos T CD4+ na pele dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento. População celular do baço dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, duplamente marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 no 45d.

A freqüência de linfócitos T CD4+ da pele injuriada foi relativamente maior nos

animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID (1.073 ± 0.2983 %) do que nos animais

do subgrupo CTM-ID (0.6233 ± 0.1114%), porém essa diferença não foi

estatisticamente significante.

Figura 42: População de células CD8+ na pele dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento. População celular da pele dos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, marcadas com anticorpos anti-CD8 no 45d.

Resultados

96

A porcentagem de células CD8+ encontrada na região da ferida nos animais

pertencentes ao subgrupo CTM-ID (0.1633 ± 0.01202) foi menor quando comparada

ao subgrupo PBS-ID (0.5500 ± 0.2517), porém essa diferença não é significativa

estatisticamente.


A pontuação dos achados histológicos estabelecida para os animais de

ambos os subgrupos (PBS-ID e CTM-ID) está mostrada na Tabela 13. No período

referente a quarenta e cinco dias do início do experimento, algumas diferenças

modestas entre os sub-grupos puderam ser observadas através da avaliação

histológica da região da borda da ferida. De maneira geral, os animais pertencentes

ao subgrupo tratado com CTMs (CTM-ID) apresentaram uma maior deposição de

colágeno na borda da lesão no período em questão, além de apresentarem um

processo inflamatório nessa mesma região, mais evidente que o observado nos

animais controle (pertencentes ao subgrupo PBS-ID).

Tabela 13: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e a úlcera no quadragésimo quinto dia após injúria térmica.



PBS-ID 1 1 0 0 0 1 1 2

PBS-ID 2 3 1 0 0 3 2 3

PBS-ID 3 1 0 0 0 3 2 3

PBS-ID 4 3 1 1 0 3 1 3

PBS-ID 5 2 0 0 0 3 2 3

CTM-ID 1 2 1 2 0 3 2 3

CTM-ID 2 3 2 0 0 3 2 3

CTM-ID 3 3 1 1 1 2 2 2

CTM-ID 4 3 1 1 0 3 1 3

Resultados

97


Fragmentos de pele triturados dos animais correspondentes ao grupo GR45d

foram submetidos à dosagem de MPO e os resultados obtidos para os animais dos

subgrupos PBS-ID e CTM-ID estão mostrados na Figura 43.

Figura 43: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no quadragésimo quinto dia após início do experimento. Número de neutrófilos por grama de tecido (pele) indicado pela dosagem de MPO no homogeinato da ferida dos animais.

Foi observada uma relevante diferença numérica entre o número de

neutrófilos por grama de pele avaliada dos animais do subgrupo PBS-ID (2.967 ±

1.530 x 106) e do subgrupo CTM-ID (22.64 ± 12.53 x 106) nesse período. Porém, o

número de neutrófilos por grama de tecido encontrado nos animais do subgrupo

CTM-ID apresentou grande variação individual. . Dessa forma, a diferença

observada não apresentou significância estatística.

Resultados

98

4.12. Avaliação dos animais sessenta dias após o início do experimento

No período final do experimento, equivalente há sessenta dias após o início

do mesmo, foram realizadas análises apenas com o grupo GR60d, que consistiram

na avaliação fotográfica, microbiológica e histológica das lesões ocasionadas por

injúria térmica.

4.12.1. Análise microbiológica das feridas

A análise microbiológica demonstrou que sessenta dias após o início do

experimento, a região da lesão (muitas vezes quase totalmente reepitelizada) ainda

apresentava-se intensamente colonizada, sendo o número de espécies de

microorganismos colonizadores nesse período muito maior do que o número de

espécies colonizadoras encontradas no período do início do experimento (0d). A

Tabela 14 mostra os microorganismos colonizadores presentes nas feridas dos

animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID sessenta dias após a queimadura

experimental.

Resultados

99

Tabela 14: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no sexagésimo dia após o início do experimento.


1

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Staphylococcus aureus

1

A. Staphylococcus coagulase negativa B. Bacilo gram negativo não fermentador C. Staphylococcus aureus

2

A. Staphylococcus aureus B. Staphylococcus coagulase negativa C. Bacilo gram positivo esporulado


3

A. Staphylococcus aureus B. Bacilo gram positivo esporulado

3

A. Staphylococcus aureus B. Staphylococcus coagulase negativa

4 *

4


5


5 *

* Animal não foi avaliado no período 60d porque morreu durante a anestesia

A maioria dos animais, tanto do subgrupo PBS-ID quanto do subgrupo CTM-

ID continham dois tipos de microorganismos em comum na região da ferida:

Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase negativa. Por outro lado, o

bacilo gram negativo esporulado esteve presente exclusivamente na pele de animais

pertencentes ao subgrupo PBS-ID e o bacilo gram negativo não fermentador foi

encontrado somente na pele lesada dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID.

Resultados

100

4.12.2. Análise fotográfica das lesões por queimadura

A avaliação fotográfica dos animais do grupo GR60d evidenciou que muitos

animais já se encontravam em processo final de reepitelização. Além disso, foram

observadas grandes diferenças entre o processo de cicatrização dos animais

pertencentes ao subgrupo PBS-ID (Figura 44) e ao subgrupo CTM-ID (Figura 45).

Resultados

101

Figura 44: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no sexagésimo dia após o início do experimento (60d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo PBS-ID no 60d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no 60d após a realização da queimadura experimental.

Figura 45: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no sexagésimo dia após o início do experimento (60d). A. Aspecto geral de um animal pertencente ao subgrupo CTM-ID no 60d após a realização da queimadura experimental. B-H. Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura no dorso dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no 60d após a realização da queimadura experimental.

Resultados

102

A porcentagem de cicatrização obtida com base nas análises feitas no

programa Image J demonstrou que no período final de avaliação da cicatrização, os

animais do subgrupo tratado ou CTM-ID apresentaram uma maior cicatrização das

úlceras (90.81 ± 5.054 %) em relação aos animais do subgrupo controle ou PBS-ID

(76.11 ± 3.457 %) (Figura 46).

Figura 46: Porcentagem final de cicatrização após injúria térmica experimental. Porcentagem de cicatrização encontrada nos subgrupos PBS-ID e CTM-ID sessenta dias após o início do experimento.

4.12.3. Análises histopatológicas das lesões

As análises histológicas realizadas através da observação de lâminas

contendo tecidos corados por HE do último período analisado,foram realizadas em

torno de sessenta dias após o procedimento de injúria térmica experimental. Nesse

período a maioria dos animais de ambos os subgrupos apresentavam uma alta

porcentagem de cicatrização. Cortes histológicos referentes ao processo de

cicatrização dos animais nesse período encontram-se evidenciados na Figura 47.

Resultados

103

Figura 47: Cortes histológicos da pele dos animais corados por HE sessenta dias após injúria térmica experimental. A. Pele da região da úlcera de animal pertencente ao subgrupo PBS-ID evidenciando o processo de reepitelização recente (40X). B. Pele da região da úlcera de animal pertencente ao subgrupo CTM-ID evidenciando o processo de reepitelização recente (40X). C. Pele da região da úlcera pertencente ao subgrupo CTM-ID evidenciando o processo de reepitelização recente (100X). D. Pele da região da úlcera pertencente ao subgrupo CTM-ID evidenciando o processo de reepitelização recente (100X)

A pontuação atribuída a partir dos achados histológicos observados nos

animais do grupo GR60d indicou que nesse período ainda havia evidências de

inflamação na região da borda da úlcera dos animais do subgrupo PBS-ID enquanto

o processo inflamatório na borda da lesão dos animais do subgrupo CTM-ID

encontrava-se finalizado (Tabela 15). Além disso, um maior número de vasos

sanguíneos foi observado na região da úlcera dos animais pertencentes ao

subgrupo tratado com CTMs (CTM-ID) aos sessenta dias após injúria térmica.

Resultados

104

Tabela 15: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e a úlcera no quadragésimo quinto dia após injúria térmica



PBS-ID 1 2 1 1 0 2 1 3

PBS-ID 2 2 0 0 2 0 0 0

PBS-ID 3 2 1 0 2 3 1 2

PBS-ID 4 2 2 0 2 3 1 2

CTM-ID 1 2 0 0 2 0 3 0

CTM-ID 2 2 0 0 2 0 2 0

CTM-ID 3 3 0 0 3 0 2 1

CTM-ID 4 3 0 0 2 0 1 0

Discussão

105

5. DISCUSSÃO

Nesse trabalho, demonstramos que a terapia celular xenogênica utilizando

CTMs murinas isoladas a partir da MO de camundongos da linhagem FVB GFP+ é

efetiva para o tratamento de queimadura experimental em ratos.

Para tanto, a MO dos camundongos foi isolada através do procedimento de

flushing e as CTMs foram purificadas principalmente pelo processo de aderência ao

plástico. O cultivo de CTMs a partir de MO de camundongos é relativamente bem

padronizado, porém a sabe-se que durante as primeiras passagens a população

celular obtida não é homogênea. Contaminantes hematopoiéticos são freqüentes

durante as primeiras passagens (NADRI e SOLEIMANI, 2009) e em nosso estudo

confirmamos esse fato.

As culturas utilizadas no experimento encontravam-se entre a terceira e a

quarta passagem. Em CTMs obtidas a partir de MO humana as culturas em terceira

passagem apresentam um excelente grau de pureza, porém a pureza ideal para a

cultura de CTMs murinas só é atingida em passagens mais tardias ou através do

cultivo em baixa densidade (NADRI e SOLEIMANI, 2009) o que seria inviável para

nosso trabalho já que a terapia celular em modelo de queimadura experimental

exige um grande número de células.

As populações celulares utilizadas no experimento encontravam-se na

terceira e na quarta passagens. Na quarta passagem, cerca de 80,11% das células

eram CD105+, 69,09% CD73+, 0,10% CD34+ e 9,46% CD45+ positivas, além de

apresentarem formato fibroblastóide típico de CTMs (figura 05 e 06A).

Apesar dos contaminantes, ao serem induzidas à diferenciação em adipócitos

e osteócitos in vitro, essas mesmas culturas, apresentaram sua multipotencialidade

preservada, diferenciando-se nos tipos celulares em questão (figura 06),

demonstrando que a contaminação hematopoiética não foi capaz de afetar o

potencial de diferenciação em outros tipos celulares das CTMs.

Já durante a padronização do modelo de queimadura experimental em ratos,

maiores dificuldades foram encontradas. A literatura na área é controversa diferindo

quanto ao tempo de exposição, temperaturas utilizadas e gravidade da injúria

(SHUMAKOV, et al. 2003, MEYER, et al,. 1999).

Discussão

106

Primeiramente, visando uniformizar as queimaduras idealizamos uma chapa

de metal com controle digital de temperatura que foi confeccionada pela Oficina de

Precisão da Universidade de São Paulo, Campus Ribeirão Preto. Essa chapa

permite que durante a realização da queimadura (contato com a pele do animal) a

variação da temperatura seja mínima, cerca de 1-2˚C.

Outra dificuldade consistiu na determinação da profundidade e da extensão

das queimaduras em pele de rato. A classificação das queimaduras em

profundidade como: a. primeiro grau: queimaduras que atingem a derme; b. segundo

grau: queimaduras que afetam a derme e a epiderme; c. terceiro grau: queimaduras

que afetam além das três camadas da pele o tecido subcutâneo; d. quarto grau:

queimaduras que afetam outros tecidos além da pele; foi estabelecida para a pele

humana, porém a pele do rato é estruturalmente diferente da pele humana.

Para a determinação da extensão da queimadura é utilizada em humanos a

regra dos nove (figura 01), porém esse procedimento é perceptivelmente inviável em

ratos, devido às grandes diferenças anatômicas encontradas entre ambos.

Dessa forma, procedemos durante a padronização baseados nas situações

reais observadas em nossas condições. Realizamos um estudo piloto onde foram

testados dois tipos de queimaduras experimentais, a primeira utilizando a chapa de

metal a 100˚C por 20 segundos e a segunda utilizando a chapa de metal a 200˚C

por 25 segundos, alguns animais do grupo piloto foram sacrificados no dia seguinte

à realização das queimaduras e foram feitas necropsias e análises histológicas da

pele da região da queimadura, já outros animais foram acompanhados por sessenta

dias.

As necropsias, bem como as avaliações histológicas demonstraram que

ambas as queimaduras afetavam as três camadas da pele do rato, porém a

observação dos animais que não foram sacrificados demonstrou que os animais

submetidos à queimadura a 100˚C apresentavam 100% de sobrevida, além do

fechamento da ferida muito mais rápido quando comparado ao fechamento das

feridas apresentado pelos animais submetidos à queimadura a 200˚C.

Como o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial terapêutico das CTMs

em queimaduras graves, capazes de induzir efeitos sistêmicos próximos dos

observados em grandes queimados humanos, optamos pelo modelo experimental

de queimadura a 200˚C. Devido às dificuldades em classificar a queimadura em

Discussão

107

ratos, durante a realização deste trabalho adotamos apenas o termo queimadura

extensa e profunda.

A partir da padronização do modelo de queimadura procedemos com o

estudo experimental de utilização de CTMs para a terapia celular em nosso modelo

experimental, dessa forma, foram estabelecidos os grupos e subgrupos e realizadas

as queimaduras experimentais. Os animais submetidos às queimaduras

experimentais foram mantidos em gaiolas individuais e não foram adotados

procedimentos como a reposição hidro-eletrolítica, antibioticoterapia ou analgesia.

A antibioticoterapia poderia interferir no resultado real dos experimentos e a

analgesia não foi necessária, pois queimaduras profundas são menos dolorosas que

queimaduras superficiais, já que as primeiras lesam as terminações nervosas. Foi

observado em alguns animais, uma atrofia transitória dos membros posteriores, esse

fato pode ter ocorrido devido à postura antálgica, lesão de nervo relacionado à

movimentação das patas ou lesão de vaso importante da região. Todos os animais

que apresentaram essa complicação foram excluídos do estudo.

Os animais que receberam as CTMs xenogênicas localmente, aparentemente

não desenvolveram o processo de rejeição das mesmas. É possível que os

contaminantes hematopoiéticos tenham originado algum tipo de resposta do

hospedeiro, porém as CTMs podem ter modulado essa resposta do hospedeiro,

permitindo a manutenção dessa população celular sem que fossem desenvolvidas

respostas agudas (BARTHOLOMEW, et al., 2002).

A primeira característica observada após o início do experimento foi que os

animais submetidos à terapia intradérmica com CTMs (CTM-ID) tiveram melhor

sobrevida (76,19%) em comparação aos animais controles do experimento onde foi

aplicado intradermicamente apenas PBS (PBS-ID), que tiveram uma sobrevida de

60,86%.

O soro dos animais submetidos a ambos os tratamentos foi coletado, porém

não foram realizadas dosagens de citocinas pró inflamatórias. Devido às

propriedades imunoregulatórias das CTMs (revisado por da SILVA MEIRELLES, et

al., 2009) é possível que as mesmas tenham regulado a resposta inflamatória

desenvolvida após a injúria térmica. Sabe-se que imediatamente após a queimadura

é induzida localmente uma resposta inflamatória exacerbada (O´SULLIVAN e

O´CONNOR, 1997), através do aumento da secreção de fatores antiinflamatórios

Discussão

108

como TGF-β e PGE2 as CTMs podem ter atuado diminuindo a exacerbação inicial

da resposta imunológica local e influenciando na sobrevida dos animais.

Na semana que se seguiu à injúria térmica todos os animais perderam peso,

isso ocorreu provavelmente devido a alterações comportamentais, bem como devido

a dificuldades durante a alimentação. Também pode ter ocorrido uma resposta

hipermetabólica, comum em indivíduos queimados, porém essa hipótese é menos

provável já que a partir da segunda semana os animais não só retomaram o peso

inicial como passaram a ganhar peso semanalmente e uma resposta

hipermetabólica comumente duraria um maior período de tempo (HERNDON e

TOMPKINS, 2004).

Imediatamente após a queimadura, a região lesada deveria estar estéril,

porém os testes microbiológicos realizados imediatamente após a realização das

queimaduras demonstraram a presença de dois tipos de bactérias na região

queimada: Pseudomonas e bacilo gram negativo não fermentador, essas bactérias

possivelmente encontravam-se nas regiões do entorno das lesões fazendo parte da

microbiota normal da pele dos animais.

Algumas bactérias gram positivas como Staphylococcus sp. podem sobreviver

à grandes temperaturas principalmente por localizarem-se no interior das glândulas

sebáceas e folículos pilosos, dessa forma, são capazes de infectar a superfície

rapidamente, cerca de quarenta e oito horas após a injúria térmica (revisado por

CHURCH, et al., 2006).

Devido à rápida colonização bacteriana da pele, estabelecemos um período

intermediário entre o dia da realização do experimento e o sétimo dia (primeiro

período em que foram realizadas as outras análises) no qual avaliamos somente a

colonização das feridas, dessa forma, no terceiro dia foi encontrado no

microambiente da lesão um grande número de microorganismos, porém não foram

observadas diferenças entre os microorganismos colonizadores dos animais PBS-ID

e CTM-ID.

Os microorganismos presentes no primeiro dia avaliado (Pseudomonas sp. e

bacilo gram negativo não fermentador) se mantiveram presentes em ambos os

grupos e como esperado, três dias após a injúria térmica além desses dois

microorganismos observamos a presença de Staphylococus sp..

Transcorridos sete dias após injúria térmica foi observada através da análise

fornecida pelo programa Image J um aumento das áreas das lesões ocasionadas

Discussão

109

pelas queimaduras, esse fato ocorreu provavelmente devido à progressão da região

necrótica no sentido da borda da lesão para a pele saudável. Nesse período foi

observado o extravasamento de líquidos por regiões de fístulas, na maioria dos

animais de ambos os subgrupos.

O aumento da área das lesões na maioria dos animais não permitiu o cálculo

da porcentagem de cicatrização nos períodos iniciais pós injúria térmica. Dessa

forma, os resultados nesses períodos foram apresentados em pixels, (indicadores da

área das lesões fornecidos pelo programa Image J).

A região da ferida é rica em proteínas e o tecido avascular necrótico é o

microambiente ideal para a colonização e proliferação bacteriana, devido à

existência desse microambiente ideal, após injúria térmica, a região é rapidamente

colonizada, principalmente por bactérias endógenas. Cerca de cinco a sete dias

após a queimadura a região queimada passa a ser colonizada por outros

microorganismos, incluindo bactérias gram positivas e gram negativas provenientes

principalmente do trato gastrointestinal e respiratório do próprio paciente (revisado

por CHURCH, et al., 2006).

O aumento do tecido necrótico favoreceu o crescimento bacteriano nas

lesões, dessa forma, sete dias após a injúria térmica a região das lesões foi

intensamente colonizada. Além dos microorganismos que já se encontravam

anteriormente no local, foram observadas bactérias possivelmente provenientes do

trato gastrointestinal dos animais como Enterococcus sp. e Escherichia coli, ambas

pertencentes à família Enterobacteriaceae, essa família de bactérias é responsável

por cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias (LEVY, 2004).

Sete dias após injúria não foram observadas diferenças significativas entre as

porcentagens de linfócitos T CD4 encontrados no baço dos animais, porém a

porcentagem de células T CD4 positivas no baço dos animais CTM-ID foi sutilmente

maior que a porcentagem de células T CD4 presentes no baço dos animais PBS-ID.

Já a porcentagem de células CD8+ no baço dos animais nesse período não foi

alterada entre os grupos PBS-ID e CTM-ID.

Quando avaliamos a resposta local, analisando a população de células T CD4

e CD8+ na pele dos animais também não observamos diferenças significativas nas

proporções das mesmas entre os grupos, porém os animais PBS-ID apresentaram

um número um pouco maior tanto de células T CD4, quanto de células CD8+ na pele

nesse período inicial.

Discussão

110

As análises histopatológicas das lesões no sétimo dia após injúria térmica

demonstraram um alto grau de comprometimento estrutural na pele dos animais de

ambos os grupos, já que estruturas como epitélio e vasos sanguíneos foram

praticamente inexistentes. Nos animais CTM-ID um princípio de neo-epitelização

pôde ser observado, bem como o início de um processo inflamatório local, enquanto

nos animais PBS-ID esses dois processos estão ausentes nesse período.

A dosagem de MPO da região da ferida nesse período demonstrou que os

animais PBS-ID apresentaram um maior número de neutrófilos na região da lesão,

embora a diferença entre o número de neutrófilos na ferida dos animais PBS-ID e

CTM-ID não seja significativa. É possível que haja uma correlação entre o maior

número de linfócitos T CD4 na região da lesão dos animais PBS-ID com o maior

número de neutrófilos observado na mesma região, já que células T CD4 ao

exibirem um padrão de resposta do tipo TH1, secretam citocinas pró-inflamatórias

como IFN-γ que induzem a proliferação de neutrófilos.

Quinze dias após a injúria térmica os animais apresentavam grande

quantidade de tecido necrótico nas lesões ocasionadas por queimadura. As feridas

de todos os animais estavam recobertas por uma crosta espessa e

conseqüentemente, nesse período, um maior número de microorganismo foi

encontrado na área de pele lesada.

Nesse período foi observado também uma substituição dos microorganismos

encontrados inicialmente, representados por Pseudomonas sp. e bacilos gram

negativos não fermentadores, que possivelmente seriam colonizadores não

patogênicos, por microorganismos potencialmente patogênicos como Proteus sp.,

característicos do trato genito-urinário e responsáveis por graves infecções renais

(ALLISON, et al., 1992).

Sabe-se que o processo cicatricial é extremamente prejudicado em pacientes

queimados. Além de a própria ferida atuar como uma barreira mecânica impedindo a

chegada de citocinas e fatores de crescimento importantes para o processo de

cicatrização a síndrome da resposta antiinflamatória compensatória desenvolvida

após a SIRS causa imunossupressão sistêmica inibindo a fase inflamatória inicial,

importante para o desenvolvimento de uma boa resposta cicatricial (revisado por

ARTHUSON, 1996).

Dessa forma, quinze dias após o procedimento de queimadura experimental,

as úlceras tanto dos animais CTM-ID, quanto dos animais PBS-ID permaneciam com

Discussão

111

a área praticamente inalterada. Nesse período houve uma pequena diminuição das

mesmas com relação ao período de sete dias após a injúria térmica, porém, quando

comparadas ao tamanho inicial, as áreas das úlceras não apresentaram diminuição.

A análise da população de linfócitos T CD4 no baço dos animais demonstrou

que nesse período as diferenças numéricas na porcentagem desse tipo celular entre

os animais PBS-ID e CTM-ID diminuíram, porém os animais CTM-ID continuaram

apresentando um número um pouco mais elevado de linfócitos T CD4 no baço

quando comparado à porcentagem de linfócitos T CD4 do baço dos animais PBS-ID.

Já a análise das células CD8+ no baço dos animais apresenta correlação

inversa à observada para linfócitos TCD4. A população celular representada pelas

células CD8+ encontra-se levemente aumentada no baço dos animais PBS-ID

quando comparada a essa mesma população celular no baço dos animais CTM-ID.

Quando observamos a população de linfócitos T CD4 na região da ferida dos

animais nesse período, pudemos observar, da mesma forma que observado no baço

dos animais nesse mesmo período que o grupo CTM-ID apresenta uma maior

proporção desse tipo celular no tecido injuriado, apesar dessa diferença não ser

estatisticamente significante. Já a população celular CD8+ encontrada na região da

queimadura não diferiu entre os animais PBS-ID e os animais CTM-ID nesse

período.

A partir de análises histológicas das regiões das lesões, observamos que

quinze dias após a injúria térmica, os achados histopatológicos da região mais

externa das feridas, compreendida pela borda, estavam praticamente inalterados

entre os animais PBS-ID e CTM-ID. Nesse período pôde ser observado o início da

formação de epitélio, bem como um processo inflamatório modesto e o início da

deposição de colágeno na borda da lesão.

Já na região compreendida pela ferida propriamente dita, durante esse

período há o surgimento de tecido de granulação. O tecido de granulação é o

primeiro tecido a ser formado em regiões de epitélio lesado, apesar de ser um tecido

desorganizado, onde ainda não estão evidenciadas estruturas fundamentais da pele,

é um tecido extremamente importante, principalmente por ser um tecido

vascularizado. Além disso, estão presentes no tecido de granulação, células

imunologicamente competentes (revisado por WITTE e BARBUL, 1997).

Transcorridos quinze dias do início do experimento também foi observado

tanto na região das úlceras dos animais PBS-ID quanto na região das úlceras dos

Discussão

112

animais CTM-ID, grande presença de infiltrado inflamatório, porém não há diferença

na quantidade de infiltrado inflamatório entre os grupos. Já a presença de vasos

sanguíneos na região da lesão parece ser mais evidente nos animais CTM-ID.

As CTMs apresentam grande potencial angiogênico principalmente por a

secretarem VEGF. Em modelo animal de isquemia de membros em rato, foi

demonstrado que as CTMs são capazes de induzir a neo-vascularização e aumentar

o fluxo sanguíneo no membro isquêmico (AL-KHALDI, et al., 2003). CTMs também

foram capazes de aumentar a densidade capilar em modelo de isquemia de

miocárdio em ratos (NAGAYA, et al., 2004). Dessa forma, fatores pró-angiogênicos

secretados pelas CTMs podem ter induzido a neo-formação de vasos sanguíneos na

região da injúria térmica.

Quando investigamos o conteúdo de neutrófilos na região da lesão no décimo

quinto dia após a queimadura experimental, observamos que nesse período o

número desse tipo celular na região da injúria dos animais CTM-ID foi um pouco

elevado quando comparado ao número de neutrófilos existentes na região da ferida

dos animais PBS-ID, ao contrário do que foi observado no período inicial sete dias

após a realização da lesão por queimadura experimental.

Trinta dias após o início do experimento as feridas dos animais

permaneceram intensamente colonizadas destacando o surgimento nesse período

do microorganismo Staphylococcus aureus. S. aureus é encontrado comumente

infectando pacientes queimados, antes do emprego de antibioticoterapia o

microorganismo Streptococcus pyogenes era o patógeno predominantemente

encontrado em úlceras de queimados e a maior causa de mortalidade em

queimados graves. Após a introdução da penicilina S. pyogenes foi virtualmente

exterminado como causa de infecção em pacientes queimados. Atualmente o

principal microorganismo encontrado em úlceras ocasionadas por queimaduras é o

S. aureus (revisado por CHURCH, et al., 2006). Em estudo realizado com pacientes

queimados por um período de três anos na Suécia, S. aureus foi o microorganismo

que causou o maior número de infecções na região das lesões ocasionadas por

queimadura (APPERLGREN et al., 2002).

Já foram descritos no Brasil, casos de infecções causadas por S. aureus

parcialmente resistentes aos antibióticos mais potentes como a vancomicina e

relatos da capacidade que os Staphylococcus têm de desenvolver resistência a

Discussão

113

antibióticos, assim há a necessidade de uma identificação rápida e eficiente de todos

os casos em que esses microorganismos se apresentem (LEVY, 2004).

No período referente há trinta dias após a injúria térmica as úlceras dos

animais encontravam-se abertas e a maior parte das crostas já havia se

desprendido. Esse período foi o primeiro momento em que a diminuição das úlceras

ficou evidente. Esse fato foi confirmado pelos dados fornecidos pelo programa

Image J. Dessa forma, ao aplicarmos à área em pixels fornecida pelo Image J à

fórmula para cálculo da porcentagem de cicatrização pudemos observar nesse

período além do processo de reepitelização uma melhor porcentagem de

cicatrização nos animais CTM-ID quando comparada à porcentagem de cicatrização

dos animais PBS-ID, porém essa diferença entre os grupos não apresenta

relevância significativa.

Ao avaliarmos a população de linfócitos T CD4 no baço dos animais nesse

período, não foram observadas diferenças entre os animais PBS-ID e os animais

CTM-ID; o mesmo foi observado para a população de células CD8+ do baço dos

animais, trinta dias após injúria térmica. Já ao observarmos a população de linfócitos

TCD4 e de células CD8+ local, percebemos uma diminuição dessas duas

populações celulares nos animais CTM-ID. Essa diminuição foi mais evidente na

população celular CD8+ da pele dos animais da mesma forma que fora observado

em períodos anteriores.

As análises histopatológicas do trigésimo dia pós-queimadura, demonstraram

uma melhora do processo cicatricial de ambos os grupos, evidenciada pela presença

de epitélio neo-formado, tecido de granulação e vasos sanguíneos em todos os

animais, porém não houve diferenças histopatológicas entre os grupos PBS-ID e

CTM-ID nesse período.

Quanto ao conteúdo de neutrófilos na região da lesão as diferenças entre os

grupos PBS-ID e CTM-ID se tornaram mais perceptíveis nesse período, sendo que

os animais CTM-ID apresentaram um maior número de neutrófilos, no entanto, esse

resultado não apresenta relevância significativa provavelmente devido à grande

variação individual entre os animais de um mesmo grupo.

Sabe-se que neutrófilos são células da imunidade inata que apresentam

grande importância na erradicação de microorganismos, porém o pico da atividade

desse tipo celular ocorre em períodos muito iniciais, não sendo descritos picos tão

tardios como os observados nesse trabalho por outros pesquisadores em trabalhos

Discussão

114

com modelos de queimadura. Esse tipo celular poderia estar relacionado a uma

diminuição do conteúdo microbiológico das lesões, porém as análises

microbiológicas realizadas não nos permitem fazer essa correlação, já que não

foram observadas diferenças entre a colonização microbiológica dos animais PBS-ID

e CTM-ID.

Quarenta e cinco dias após a injúria térmica os microorganismos encontrados

nas feridas dos animais PBS-ID e nas feridas dos animais CTM-ID não diferiram

consideravelmente. Nesse período a bactéria Staphylococcus sp. estava presente

na maioria dos animais de ambos os subgrupos.

Já a análise da porcentagem de cicatrização demonstrou que a reepitelização

dos animais CTM-ID encontrava-se em estágio nitidamente avançado quando

comparada à porcentagem de cicatrização dos animais PBS-ID. A maioria dos

animais pertencentes ao grupo CTM-ID apresentavam uma taxa de cicatrização de

cerca de 80% nesse período, enquanto os animais do grupo PBS-ID apresentaram

cerca de 60% de porcentagem de cicatrização no período em questão. Essa

diferença foi estatisticamente significante (p=0.0179).

Transcorridos quarenta e cinco dias do início do experimento, a análise da

população celular TCD4 positiva e CD8 positiva do baço dos animais não

demonstrou diferenças entre os grupos, já na pele dos animais foi observado um

aumento não significativo tanto de células TCD4 positivas, quanto de células CD8

positivas nos animais do grupo PBS-ID.

As análises histológicas do período também não demonstraram grandes

diferenças entre os achados histopatológicos de animais PBS-ID e CTM-ID, nesse

período foi observada uma grande presença de vasos sanguíneos e tecido de

granulação em ambos os grupos. Os animais CTM-ID só começaram a apresentar

deposição de colágeno na região da borda da lesão remanescente no período

referente a quarenta e cinco dias do início do experimento.

O ensaio de dosagem de MPO da região da ferida nesse período demonstrou

que existia uma quantidade numericamente maior de neutrófilos na região

remanescente de ferida dos animais CTM-ID, porém essa diferença não apresentou

relevância significativa devido à grande variância observada. Nesse período também

não foi possível correlacionar o grande número de neutrófilos a aumento ou

diminuição de infecção.

Discussão

115

Picos da quantidade de neutrófilos na pele queimada são observados vinte e

quatro horas após a injúria térmica permanecendo os valores elevados por até uma

semana após a injúria em modelo de queimaduras extensas em ratos (BASKARAN,

et al., 1999). É provável que tenhamos perdido o primeiro pico de ativação de

neutrófilos na pele queimada por não termos avaliado a produção de MPO em

períodos anteriores à sete dias.

O processo de cicatrização requer o balanço entre a acumulação de

componentes colágenos e seu remodelamento pela matriz de metaloproteases

(LOBMANN et al., 2002). Neutrófilos secretam colagenases do tipo metaloproteases

(MMPs) ativamente, dessa forma o papel do aparecimento tardio de neutrófilos na

região da pele injuriada pode estar relacionado ao processo de remodelamento da

ferida através da secreção de colagenases e não ao controle de infecções. As

colagenases, como as MMPs são importantes para a degradação de componentes

da matriz extracelular e conseqüente diminuição de fibrose local (revisado por GILL

e PARKS, 2008), em contraste a elevada produção de colagenases está associada

à má cicatrização de úlceras crônicas em diabéticos (LOBMANN, et al., 2002).

No sexagésimo dia após injúria térmica, grande parte das úlceras dos animais

encontrava-se em processo final de reepitelização, porém nesse período as úlceras

ainda apresentavam intensa colonização, sendo que os microorganismos do gênero

Staphylococcus continuaram sendo os colonizadores mais representativos.

Nesse período final, os dados fornecidos pelo Image J demonstraram que

grande parte das úlceras dos animais do grupo CTM-ID encontravam-se totalmente

reepitelizadas (cerca de quatro animais dos sete avaliados), ao contrário do

observado nas úlceras dos animais PBS-ID, onde apenas um animal apresentou em

torno de 100% de reepitelização, esse resultado demonstrou-se estatisticamente

significativo. As análises histopatológicas realizadas nesse período confirmaram a

presença de maior reepitelização nos animais CTM-ID.

Dessa forma, a terapia celular com CTMs em modelo de queimadura

experimental grave foi efetiva, promovendo não só um aumento da sobrevida dos

animais pós-injúria térmica, como acelerando o processo cicatricial. Os mecanismos

envolvidos nesse processo não foram elucidados durante o estudo.

É descrito que a resposta de linfócitos TCD4 do tipo TH1 em queimados é

protetora. Essa resposta é desenvolvida mediante o aumento da secreção de

citocinas do tipo IL-2 e IFN-γ. Porém, o trauma por queimadura comumente induz a

Discussão

116

inflamação exacerbada e o desenvolvimento de SIRS nos pacientes em um período

inicial pós-trauma (revisado por, O´SULLIVAN e O´CONNOR, 1997).

Conseqüentemente, em um segundo momento, em resposta à SIRS

pacientes submetidos a grandes traumas, como pacientes queimados desenvolvem

a síndrome da resposta antiinflamatória compensatória (SRAC) visando desativar o

sistema imunológico e culminando com a imunossupressão sistêmica (revisado por

WARD, et al., 2008).

Dessa forma freqüentemente observa-se que em pacientes queimados ocorre

uma polarização da resposta de linfócitos do TCD4 para o padrão TH2,

acompanhada da produção de citocinas antiinflamatórias como IL-4 e IL-10,

características desse subtipo. Além disso, acompanhando esse padrão de resposta

prejudicial para o grande queimado, é observado um aumento da proporção de

linfócitos TCD8. Essa alteração do padrão de resposta imunológica e desequilíbrio

entre as populações de linfócitos T CD4 e T CD8 em pacientes queimados é

associada ao mau prognóstico da patologia (revisado por, O´SULLIVAN e

O´CONNOR, 1997).

Baue et al., 1999, demonstraram a ocorrência dessas alterações nas

proporções dos subtipos de linfócitos no sangue periférico de pacientes queimados,

demonstrando que a polarização da resposta de linfócitos TCD4 para o padrão TH2

está associada ao aumento da proporção de linfócitos TCD8 e ao aumento da

mortalidade nos pacientes, além disso, o grupo observou a existência de

discrepâncias do tipo de resposta imunológica desenvolvida entre os indivíduos dos

grupos analisados.

Em nosso trabalho, o aumento não significativo da população de células T

CD4 e a conseqüente diminuição da população de células CD8 positivas foi

observada ao longo da maior parte do tempo avaliado para o grupo submetido à

terapia celular com CTMs, podendo indicar uma possível manutenção do padrão de

resposta do tipo TH1.

As CTMs podem ter atuado em um período inicial secretando fatores

antiinflamatórios e diminuindo a ocorrência de SIRS, dessa forma, os animais CTM-

ID apresentam uma menor SRAC o que seria suficiente para impedir o

desenvolvimento de um padrão de resposta imunológica do tipo TH2, diminuindo

conseqüentemente a imunossupressão pós-trauma térmico.

Discussão

117

Citocinas diretamente relacionadas ao padrão TH1 como IFN-γ estimulam a

proliferação de neutrófilos o que explicaria o aumento desse tipo celular nas feridas

dos animais CTM-ID e esses por sua vez, seriam importantes para a qualidade e

rapidez do processo cicatricial.

Dessa forma, em nosso modelo de queimadura experimental as CTMs podem

estar sendo efetivas promovendo uma maior rapidez da cicatrização não só através

de seu potencial angiogênico e regenerativo, mas também através de seu potencial

imunomodulatório, já que em queimados a dificuldade de cicatrização está

comumente relacionada ao estado de imunossupressão sistêmica desenvolvida pós-

SIRS.

Porém maiores investigações mostram-se necessárias a fim de confirmar

essas hipóteses.

Conclusões

118

6. CONCLUSÕES

O tratamento intradérmico local com CTMs xenogênicas, isoladas a partir de

MO de camundongos FVB GFP+ interferiu positivamente na sobrevida de ratos

Wistar submetidos à injúria térmica grave.

As CTMs foram efetivas ao promoverem uma melhora da cicatrização, bem

como o fechamento mais rápido das feridas ocasionadas por queimaduras a partir

do quadragésimo quinto dia após injúria térmica, sendo que transcorridos sessenta

dias a partir da realização das queimaduras experimentais, a maioria das lesões

térmicas dos animais tratados com a aplicação intradérmica de CTMs já havia

reepitelizado, ao contrário do observado nos animais controles do experimento.

Histopatologicamente a melhora na cicatrização dos animais tratados

intradermicamente também pôde ser observada, sendo que esse grupo apresentou

um processo cicatricial mais precoce e dinâmico quando comparado ao grupo

controle do experimento (aplicação intradérmica de PBS). Esse processo foi

caracterizado principalmente pela presença de inflamação local, tecido de

granulação e vasos sanguíneos em um primeiro momento nos animais CTM tratados

e em momento posterior nos animais que receberam aplicação intradérmica de PBS.

Não foram observadas diferenças entre os microorganismos colonizadores

das feridas dos animais tratados intradérmicamente com CTMs e dos animais

submetidos à aplicação intradérmica de PBS, porém foram observadas alterações

constantes da microbiota do local da injúria de acordo com a evolução das lesões e

o tempo pós queimadura.

Ao avaliarmos as populações celulares T CD4+ e CD8+ do baço dos animais

pôde-se observar que a manutenção do equilíbrio entre células T CD4+ e células

CD8+ característico da homeostase do sistema imunológico foi aparentemente

mantido nos animais queimados e submetidos à aplicação intradérmica de CTMs,

enquanto um desbalanço nessa proporção, característico da patologia da injúria

térmica foi observado ao avaliarmos essas populações celulares no baço dos

animais do grupo controle.

Alterações nas populações celulares TCD4+ e CD8+ positivas na região da

pele injuriada foram observadas com o transcorrer do processo cicatricial tanto nos

Conclusões

119

animais submetidos à aplicação intradérmica de PBS, quanto nos animais

submetidos à aplicação intradérmica de CTMs.

Um aumento do número de neutrófilos por grama de tecido proveniente do

local da injúria foi observado nos animais tratados com CTMs, esse fato

aparentemente não está relacionado às infecções na região da injúria térmica. O

aparecimento tardio de neutrófilos no local da lesão pode estar associado à

secreção de colagenases necessárias durante o processo de remodelamento da

ferida.

Referências

120

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