avaliação do efeito do tratamento com benznidazol em ... · a todos os amigos do laboratório de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Avaliação do efeito do tratamento com benznidazol em combinação com

derivados azólicos na infecção experimental por Trypanosoma cruzi

Lívia de Figueiredo Diniz

.Orientadora: Profa Maria Terezinha Bahia

Ouro Preto

Novembro de 2013

Dedico esse trabalho ao meu pai, Márcio Diniz (in memorian), que apesar da

ausência, é sempre meu incentivo para caminhar...

Agradecimentos

ii

Este trabalho contou com o suporte financeiro da DNDi, CNPq, CAPES,

FAPEMIG e UFOP.

Agradecimentos

iii

A Deus, por todo o amor e misericórdia; amparo, fortaleza e esperança que

movem o meu viver...Obrigada por nos enviar seu filho Jesus Cristo; caminho, verdade

e vida.

A todas as pessoas que foram essenciais, de várias formas, para a realização

desse trabalho...

À Professora Maria Terezinha Bahia, exemplo de pesquisadora no qual me

espelho há alguns anos... Agradeço por todos os ensinamentos, confiança, amizade e

carinho. Obrigada por ter orientado não apenas a minha formação acadêmica e

profissional, mas também pessoal.

Ao Ivo Caldas, companheiro de longa data, pela amizade, disponibilidade e

colaboração durante todos esses anos;

Agradeço de forma especial a todos os alunos que não mediram esforços,

trabalhando sempre com muito zelo e responsabilidade, quer seja nas laboriosas

curvas de parasitemia, quer seja nos experimentos in vitro, aos feriados e finais de

semana, para a realização deste trabalho.

Em especial, à Ludmilla, Ana Lia, Nicole, Luís, Hilda, Álvaro e Dário, pelo

envolvimento comprometido com este trabalho; Ana Luiza, Karol e Arlete pela

disponibilidade em ajudar sempre;

A todos os amigos do laboratório de doença de Chagas (e são muitos!) pela

excelente convivência!

À Dra. Nazaré Soeiro, Marcos Meuser e Elen Melo por todosos conselhos que

tanto nos ajudaram nos experimentos in vitro;

Aos amigos, funcionários e professores do Nupeb, em especial ao Prof. André

Talvani, pela colaboração e amizade, Profa Karen Martinez pelo fornecimento das

células H9c2 e ao Prof. Luís Carlos Crocco por ter nos cedido diversos equipamentos;

Agradecimentos

iv

Aos funcionários do Centro de Ciência Animal da UFOP pelo fornecimento e

cuidado com os animais; Ana Salomé pelo cuidado com o laboratório de doença de

Chagas;

À Universidade Federal de Ouro Preto, por subsidiar toda a minha formação

acadêmica;

Aos órgãos de fomento FAPEMIG; CAPES e CNPq;

À DNDi pelo auxílio financeiro e pelo brilhante trabalho na luta contra

doenças negligenciadas;

E agradeço algumas pessoas, não pelo envolvimento direto nesse trabalho, mas

por estarem presentes na minha vida...

Agradeço ao meu marido Cristiano, pelo companheirimo, doação constante e

incentivo que foram essenciais para que eu pudesse prosseguir a cada etapa; por ter

sido pai e mãe, nas muitas breves horas em que eu estive ausente;

Ao meu filho Pedro, que, tem a mesma idade dessa tese... E faz meu mundo tão

melhor... Obrigada por alegrar os meus dias e ter acompanhado, bem de pertinho,

todos os momentos desse trabalho... Suavizando a rotina e sempre me mostrando o lado

bom das coisas...

À Nilza, por cuidar todos os dias do meu filho como se fosse o seu;

À minha família... Por compreender os vários momentos de ausência e

compensá-los com amor e incentivo... Ao meus pais, Márcio Diniz e Sebastiana,

alicerces da minha formação, obrigada pela minha vida. Às minhas irmãs, Blenda e

Tarsila, meu irmão Frederico e à minha tia Regina por fazerem parte dela...

Aos amigos que todos esses anos em Ouro Preto me proporcionaram... Em

especial às meninas, amigas e ex-alunas da república Bicho do Mato, minha casa para

sempre...

Sumário

iv

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos gerais relacionados à doença de Chagas ................................................ 2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. A doença de Chagas e Trypanosoma cruzi ........................................................... 7

2.2. Tratamento etiológico da doença de Chagas ......................................................... 9

2.3. Modelos de estudo e a quimioterapia experimental ............................................. 11

2.4. Fármacos e estratégias promissoras ..................................................................... 13

2.5. A terapia de combinação......................................................................................15

3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 20

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo geral ..................................................................................................... 22

4.2. Objetivos específicos .......................................................................................... 22

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Cepas de Trypanosoma cruzi ............................................................................... 24

5.2. Fármacos e reagentes .......................................................................................... 24

5.3. Experimentos in vitro

5.3.1. Cultivos de células H9c2 ............................................................................... 26

5.3.2. Obtenção do parasito ................................... Erro! Indicador não definido.26

5.3.3. Otimização da utilização do método colorimétrico para quantificar a

proliferação de diferentes tipos celulares ................................................................. 27

5.3.4. Avaliação da atividade anti-Trypanosoma cruzi do ravuconazol e benznidazol

contra formas epimastigotas .................................................................................... 29

5.3.5. Ensaios de citotoxicidade ............................................................................... 30

5.3.6. Avaliação da atividade anti-Trypanosoma cruzi do ravuconazol e benznidazol

contra amastigotas intracelulares ............................................................................. 31

5.3.7. Interação entre benznidazol e ravuconazol in vitro ....................................... 32

5.3.8. Análise estatística .......................................................................................... 34

Sumário

v

5.4. Experimentos in vivo

5.4.1. Animais ......................................................................................................... 35

5.4.2. Infecção experimental de camundongos por Trypanosoma cruzi................. 35

5.4.3. Esquemas terapêuticos .................................................................................. 35

5.4.3.1. Posaconazol e benznidazol....................................................................36

5.4.3.2. E1224 e benznidazol..............................................................................39

5.4.4. Métodos utilizados para avaliação da eficácia terapêutica.............................41

5.4.5. Avaliação da influência do tratamento nos níveis de IgG e IgG1.................43

5.4.6. Quantificação do infiltrado inflamatório ......................................................44

5.4.7. Análise estatística ......................................................................................... 44

6. RESULTADOS

6.1. Capítulo 1 – Avaliação in vivo da atividade do benznidazol em combinação

com o posaconazol na infecção experimental por Trypanosoma cruzi ......................... 46

6.2. Capítulo 2 - Avaliação in vitro e in vivo da atividade do benznidazol em

combinação com o ravuconazol na infecção experimental por Trypanosoma

cruzi..............................................................................................................................53

6.2.1. Interação in vitro entre o benznidazol e o ravuconazol.............................53

6.2.2. Interação in vivo entre o benznidazol e o E1224........................... ...........67

7. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 85

8. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 97

9. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 99

Figuras e tabelas

vi

FIGURA 1: Isobolograma representativo das possíveis interações resultantes da

combinação de dois compostos.......................................................................................18

FIGURA 2: Estrutura química dos fármacos avaliados no estudo ................................25

FIGURA 3: Linha do tempo na avaliação da eficácia da quimioterapia.........................39

FIGURA 4: Número máximo de formas tripomastigotas detectadas no sangue periférico

de camundongos infectados pela cepa Y de Trypanosoma cruzi e tratados com 25, 50 ou

100mpk de benznidazol (Bz) ou 5, 10 ou 20mpk de posaconazol (Ps) isoladamente ou

em combinação, por 7 dias consecutivos.........................................................................47

FIGURA 5: Ganho de peso observado em animais inoculados com a cepa Y do

Trypanosoma.cruzi e tratados com 100mpk e 25mpk de benznidazol (Bz) isoladamente

ou em combinação com 20mpk e 5mpk de posaconazol (Ps), isoladamente ou

combinação (Bz+Ps), a partir do 4° dia de infecção, durante 20 dias

consecutivos....................................................................................................................48

FIGURA 6: Percentual de cura parasitológica observada em camundongos inoculados

com a cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados, a partir do 4o dia com diferentes doses

de benznidazol (Bz) ou posaconazol (Ps), isoladamente ou combinação, durante 20 dias

consecutivos.....................................................................................................................49

FIGURA 7: Número máximo de formas tripomastigotas detectadas no sangue periférico

de camundongos infectados com a cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com

100mg/kg de peso corporal (mpk) de benznidazol (Bz) e 10, 20 ou 40-mpk de

posaconazol (Ps) por 20 dias consecutivos......................................................................52

FIGURA 8: Efeito do número de epimastigotas sobre o percentual de redução do

corante resazurina............................................................................................................54

FIGURA 9: Atividade do benznidazol (Bz) e do ravuconazol (Rv) sobre epimastigotas

das cepas Y e Colombiana do Trypanosoma cruzi..........................................................55

FIGURA 10: Efeitos antiproliferativos das combinações de benznidazol e ravuconazol

sobre formas epimastigotas da cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi: curvas dose-

resposta produzidas a partir do método de proporções fixas...........................................56

FIGURA 11: Isobolograma representativo da interação in vitro entre benznidazol e

ravuconazol contra epimastigotas da cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi.............58

FIGURA 12: Efeito do número de células H9c2 sobre o percentual de redução do

corante resazurina............................................................................................................59

FIGURA 13: Percentual de redução da resazurina por células H9c2 incubadas por 72

horas com diferentes concentrações de benznidazol (Bz), ravuconazol (Rv), com

combinações de benznidazol e ravuconazol (Bz+Rv) e com dimetilsulfóxido

(DMSO)...........................................................................................................................60

Figuras e tabelas

vii

FIGURA 14: Atividade do benznidazol (Bz) e do ravuconazol (Rv) sobre a infecção de

células H9c2 pela cepa Y do Trypanosoma cruzi............................................................61

FIGURA 15: Atividade do benznidazol (Bz) e do ravuconazol (Rv) sobre a infecção de

células H9c2 pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi...........................................62

FIGURA 16: Curvas de dose-resposta representativas da interação in vitro entre

ravuconazol e benznidazol sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y de

Trypanosoma cruzi..........................................................................................................63

FIGURA 17: Isobolograma representativo da interação in vitro contra amastigotas da

cepa Y de Trypanosoma cruzi.........................................................................................64

FIGURA 18: Curvas de dose-resposta representativas da interação in vitro entre

ravuconazol e benznidazol sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Colombiana de


FIGURA 19: Isobolograma representativo da interação in vitro entre benznidazol e

ravuconazol contra amastigotas da cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi................66

FIGURA 20: Eficácia do E1224 e Bz em suprimir a parasitemia de camundongos

infectados pela cepa Y de Trypanosoma cruzi................................................................68

FIGURA 21: Curva ponderal dos animais tratados com E1224 ou benznidazol............69

FIGURA 22: Níveis de anticorpos IgG e IgG1, detectados por ELISA, no soro de

animais infectados ou não e tratados com E1224 ou benznidazol, 30 e 180 dias após o

tratamento........................................................................................................................71

FIGURA 23: Número de núcleos celulares no miocárdio de camundongos infectados

pela cepa Y e tratados ou não com benznidazol ou E1224.............................................72

FIGURA 24: Curva ponderal (A) e ganho de peso (B) dos animais inoculados com a

cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 4o dia com E1224-50mpk

e Bz (benznidazol) 100mpk, isoladamente ou em combinação.......................................75

FIGURA 25: Eficácia do E1224 e Bz, isoladamente ou em combinação, em suprimir a

parasitemia de camundongos infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma

cruzi.................................................................................................................................76

FIGURA 26: Número máximo de formas tripomastigotas detectadas no sangue

periférico de camundongos infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi e

tratados com benznidazol ou E1224, isoladamente e em combinação, a partir do 4o dia

de infecção.......................................................................................................................78

FIGURA 27: Níveis de anticorpos IgG (A) e IgG1 (B) detectados no soro dos animais

(30 e 180 dias após o tratamento) infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma

cruzi e tratados com E1224 (50 e 37,5 mpk) ou benznidazol (100 e 75mpk) em

monoterapia e em combinação........................................................................................79

Figuras e tabelas

viii

FIGURA 28: Eficácia do E1224 e Bz, isoladamente ou em combinação, em suprimir a

parasitemia de camundongos infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma

cruzi.................................................................................................................................80

FIGURA 29: Curva ponderal (A) e ganho de peso (B) dos animais inoculados com a

cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 10o dia com E1224 a

50mpk e Bz (benznidazol) 100mpk, isoladamente ou em combinação..........................81

FIGURA 30: Número máximo de formas tripomastigotas detectadas no sangue

periférico de camundongos infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi e

tratados com benznidazol ou E1224, isoladamente e em combinação, a partir do 10o dia

de infecção.......................................................................................................................83

FIGURA 31: Níveis de anticorpos IgG (A) e IgG1 (B) detectados no soro dos animais

(30 e 180 dias após o tratamento) infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma

cruzi e tratados com E1224 (50 e 37,5 mpk) ou benznidazol (100 e 75mpk) em

monoterapia e em combinação. O tratamento foi iniciado no 10o dia após a infecção e

administrado por 20 dias consecutivos............................................................................84

Figuras e tabelas

ix

TABELAS

TABELA 1: Características das cepas de Trypanosoma cruzi utilizadas no estudo.......24

TABELA 2: Proporções de benznidazol e ravuconazol utilizadas no experimento de

combinação in vitro – Método de proporções fixas........................................................33

TABELA 3: Grupos experimentais avaliados no experimento para determinação do

efeito dose-resposta do tratamento com benznidazol e posaconazol sobre a cepa Y de


TABELA 4: Grupos experimentais utilizados para avaliação da atividade curativa do

posaconazol e benznidazol, isoladamente ou em combinação, no tratamento de

camundongos infectados pela cepa Y de Trypanosoma cruzi........................................38

TABELA 5: Grupos experimentais utilizados para avaliação da atividade curativa da

terapia sequencial com posaconazol e benznidazol na fase aguda da infecção murina

pela cepa Y de Trypanosoma cruzi.................................................................................38

TABELA 6: Grupos experimentais utilizados para avaliação da atividade curativa do

posaconazol e benznidazol em combinação no tratamento de camundongos infectados

pela cepa VL-10 de Trypanosoma cruzi..........................................................................39

TABELA 7: Grupos experimentais utilizados para avaliação do efeito do tratamento

com benznidazol e E1224, isoladamente ou em combinação aos 4 ou 10 dias após a

infecção de camundongos pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi......................41

TABELA 8: Efeito do tratamento com benznidazol e/ ou posaconazol, durante 7 dias,

na supressão da parasitemia e mortalidade de camundongos infectados pela cepa Y de


TABELA 9: Eficácia do tratamento com a terapia sequencial de benznidazol e

posaconazol no tratamento da infecção pela cepa Y de Trypanosoma cruzi.................50

TABELA 10: Eficácia do tratamento por 20 dias com benznidazol e/ou posaconazol na

fase aguda da infecção pela cepa VL-10 de Trypanosoma cruzi....................................51

TABELA 11: Efeitos antiproliferativos do benznidazol e ravuconazol em combinação

sobre epimastigotas da cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi: FICs da IC50.........57


no tratamento de células H9c2 infectadas pela cepa Y de Trypanosoma cruzi: FICs da

IC-50................................................................................................................................64


no tratamento de células H9c2 infectadas pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi:

FICs da IC-50..................................................................................................................66

TABELA 14: Eficácia do tratamento com E1224 ou benznidazol na fase aguda da

infecção de camundongos pela cepa Y de Trypanosoma cruzi.......................................70

Figuras e tabelas

x

TABELA 15: Eficácia do tratamento com E1224 ou benznidazol na fase aguda da

infecção de camundongos pelas cepas Colombiana e VL-10 de Trypanosoma cruzi.....74

TABELA 16: Eficácia do tratamento com E1224 e benznidazol, isoladamente e em

combinações, a partir do 4º dia da infecção de camundongos pela cepa Colombiana de


TABELA 17: Efeito do tratamento com benznidazol ou E1224, em monoterapia ou em

combinação, a partir do 10o dia do tratamento de camundongos infectados pela cepa

Colombiana de Trypanosoma cruzi..............................................................................82

Figuras e tabelas

xi

% Percentual

µg Micrograma

µl Microlitros

µM Micromolar

Bz Benznidazol

Cy Ciclofosfamida

CYP51 c14α-demetilase

DNA Ácido desoxirribonucléico

k-DNA DNA do cinetoplasto

DMEM Dulbecos Medium

DNDi Drugs for Neglected Disease

initiative

dNTP’s Desoxinucleotideos

DTU Discrete typing units

EDTA Ácido etilenodietiletanolamínico

ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent

Assay

E1224 pró-droga do ravuconazol

HCl Ácido clorídrico

HE Hematoxilina – Eosina

IBE Inibidor da Biossíntese de

Ergosterol

IFN-γ Interferon gama

IgG Imunoglobulina G

IgG1 ImunoglobulinaG-isotipo 1

LIT Liver Infusion Tryptose

mpk Miligramas por kilograma

NADH Nicotinamida Adenina

Dinucleotídeo reduzido

Nfx Nifutimox

OMS Organização Mundial da Saúde

PCR Reação em Cadeia Polimerase

Ps Posaconazol

R-NO2 Radicais nitroaniônicos instáveis

Rv Ravuconazol

SFB Soro fetal bovino

SIDA Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida

Resumo

vii

A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é um importante

problema de saúde pública e o tratamento dessa parasitose apresenta limitações

relacionadas à eficácia e toxicidade dos fármacos disponíveis. Nesse sentido, a terapia

de combinação de fármacos parece ser uma abordagem ideal na busca de novos

tratamentos, pois pode possibilitar aumento da eficácia, redução da toxicidade e da

probabilidade de desenvolvimento de resistência. O objetivo deste estudo foi avaliar o

efeito do tratamento com benznidazol (Bz) quando combinado com os inibidores da

enzima esterol C14α-demetilase (CYP51), os derivados azólicos posaconazol (Ps) e

ravuconazol (Rv) (ou a pró- droga do Rv, o E1224), na infecção por T. cruzi in vitro e in

vivo. Inicialmente foi avaliada a eficácia do Ps em combinação com Bz durante a

infecção aguda de camundongos pela cepa Y de T. cruzi. O tratamento combinado,

utilizando doses subótimas, foi mais eficaz em induzir cura parasitológica quando

comparado com a utilização de cada fármaco isoladamente, indicando uma interação

positiva entre Bz e Ps. Quando avaliada a eficácia do tratamento sequencial com Bz ou

Ps administrados em doses ótimas durante um curto intervalo de tempo (10 dias cada),

verificou-se que a ordem de administração dos fármacos interfere no resultado do

tratamento, sendo a sequência Bz seguido de Ps mais eficaz. Além disso, a terapia

combinada induziu uma redução significativa da carga parasitária em camundongos

infectados pela cepa VL-10 de T. cruzi, altamente resistente ao Bz, quando comparada

às drogas administradas em monoterapia. Considerando esses resultados promissores,

foi a seguir investigada a atividade da combinação do Bz com o Rv. Inicialmente foram

realizados experimentos in vitro para definir a natureza da interação entre esses

fármacos. A princípio, foram determinados os valores de IC-50 do Bz e do Rv sobre

formas epimastigotas e amastigotas das cepas Y e Colombiana de T. cruzi. A seguir, o

efeito de combinações de Rv e Bz, preparadas de acordo com o método de proporções

fixas, foi avaliado nesses modelos. A análise dos resultados foi feita por meio do

cálculo das concentrações inibitórias fracionárias (FICs) e do somatório das FICs

(ΣFICs) para cada combinação. A natureza da interação foi classificada em função do

ΣFICs: sinergismo se ΣFIC≤0,5; indiferença (aditividade) se 0,5<ΣFIC<4 e

antagonismo se ΣFIC>4. As combinações de Rv e Bz mostraram-se aditivas, com

valores de ΣFIC próximo a 1 para ambas as cepas e diferentes formas evolutivas do

parasito estudadas. Dessa forma, o próximo passo foi avaliar o efeito do Rv (em forma

de pró-fármaco, o E1224) em combinação com o Bz na infecção por T. cruzi in vivo.

Inicialmente foi realizado um experimento para definição das doses de E1224 a serem

utilizadas em monoterapia. O pró-fármaco foi efetivo em curar camundongos infectados

pela cepa Y de T. cruzi de forma mais eficiente do que o composto precursor, o

ravuconazol. Não foi observado efeito dose-dependente; os tratamentos com doses de

10 a 50mg/kg de peso induziram 71 % a 100 % de cura. De forma diferente, o

tratamento dos animais infectados pelas cepas Colombiana e VL -10 foi eficaz em

induzir uma intensa redução da carga parasitária, mas não em induzir cura. Finalmente,

o tratamento com combinações de Bz e E1224 administrado a camundongos infectados

pela cepa Colombiana resultou em maior taxa de cura, em relação às monoterapias,

quando a terapêutica foi iniciada aos 4 dias após a infecção. Entretanto, quando usado

um protocolo mais estringente, no qual o tratamento foi iniciado aos 10 dias após a

infecção, houve redução significativa da carga parasitária, mas ausência de cura

parasitológica. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram o benefício da terapia da

combinação usando derivados azólicos e benznidazol no tratamento da infecção

experimental por T. cruzi e ampliam os dados pré-clínicos relacionados ao uso de

combinações de fármacos no tratamento de protozooses.

Abstract

viii

Chagas disease, caused by the protozoan pathogen Trypanosoma cruzi, remains a

challenging infection due to the unavailability of safe and efficacious drugs. Combined

therapy is envisioned as an ideal approach since it may improve treatment efficacy

whilst decreasing toxicity and the likelihood of resistance development. The objective

of this study was to evaluate the effect of treatment with Bz when combined with sterol

14α-Demethylase (CYP51) inhibitors posaconazole (Ps) and E1224 (pro-drug of

ravuconazole - Rv) in experimental infection with T. cruzi. Initially, we evaluated the

efficacy of Ps in combination with Bz during acute infection of mice with T. cruzi Y

strain. The drugs were administered individually or in combination for 20 consecutive

days. Bz/Ps combined treatments were found to be significantly more efficacious in

inducing higher parasitological cure rates than those observed when the drugs were used

alone, indicating a positive interaction between Bz and Ps. In addition, the combined

therapy induced a significant reduction of parasite load in mice infected with VL-10, a

benznidazole-resistant T. cruzi strain, compared to single administration of drugs.

Subsequently, sequential therapy experiments were carried out with Bz or Ps over a

short interval (10 days), followed by the second drug administered for the same period

of time. It was found that the sequence of Bz followed by Ps provided cure rates

comparable with those obtained with the full treatments with either drug alone, with no

cures observed for the short treatments with drugs given alone. Considering these

promising results, the next step was to investigated the activity of Bz and Rv

combinations. First, we performed in vitro experiments to define the nature of

interaction between Bz and Rv. IC-50 values for Bz and Rv were determined upon

epimastigotas and amastigotes of Y and Colombian strains of T. cruzi. The drug

combinations were evaluated on the same models. Drug susceptibility was assessed

with a modified fixed ratio isobologram method. Fractional inhibitory concentrations

(FICs), sum FICs (∑FICs) and an overall mean ∑FIC were calculated for each

combination. The nature of interaction was classified on the basis of the mean ∑FIC as

follows: synergy as mean ∑FIC<0.5, indifference as mean between 0.5 and 4.0 and

antagonism as mean ∑FIC>4. The interaction between Bz and Rv was indifferent with

ΣFIC near to 1 for both strains. In this way, it was evaluated the effect of Rv (pro-drug,

E1224) in combination with Bz upon in vivo infection. First, an experiment to define the

optimal dose of E1224 in monotherapy was performed. The pro-drug of Rv, showed

activity higher than demonstrated previously for the parent compound in the model of

acute murine infection by strain Y. There was no dose-dependent effect, the treatments

with 10 up to 50mg/kg weight for 20 consecutive days induced 71% to 100% of cure.

Differently, the treatment of animals infected with Colombian or VL-10 strains was

very effective in reducing the parasitemia, but led to nil cure rates. Finally, the effect of

the E1224 and Bz combination against epimastigote and amastigote of Y and

Colombian strains was evaluated. Additionally, the treatment of mice with E1224 in

combination with Bz induced higher cure rate in mice infected with Colombian strain

when the treatment started 4 days after infection or a significant reduction of parasite

load in treatments started 10 days after infection, compared to single administration of

drugs. This study expands the preclinical data on drug combinations and provides the

basis for further studies as anti-T. cruzi chemotherapy is moving towards multidrug

treatment regimens.

1. Introdução

Introdução

2

1.1. Aspectos gerais relacionados à doença de Chagas

A doença de Chagas, descoberta e denominada tripanossomíase americana em

1909 pelo Dr. Carlos Chagas, resulta da infecção pelo protozoário hemoflagelado

T. cruzi (Chagas, 1909). Médico e cientista brasileiro, Carlos Chagas descobriu, de

maneira ímpar na história da medicina, uma nova doença, o agente etiológico, o vetor,

os principais hospedeiros do parasito, as manifestações clínicas, além de descrever, de

maneira fiel, a epidemiologia da doença. E já naquela época alertava às autoridades

sobre a importância da endemia, antecipando suas consequências sociais (Dias et al.,

1939).

Atualmente, a doença de Chagas ainda é um importante problema médico e social

que afeta cerca de oito milhões de pessoas em diversos países endêmicos na América

Latina (WHO, 2007). A principal forma de transmissão se dá por via vetorial, por meio

de mecanismo contaminativo, após a deposição de formas tripomastigotas metacíclicas

juntamente às fezes e urina de triatomíneos infectados, durante ou após o repasto

sanguíneo. Entretanto, a enfermidade pode ser adquirida por mecanismos não vetoriais,

como por via congênita, transmissão oral, por transfusão sanguínea ou transplante de

órgãos, dentre outros (Brener et al., 1987; Dias et al., 1999).

Historicamente, há uma relação bem estabelecida entre as condições sócio-

econômicas e a doença de Chagas, sendo mais afetadas as populações carentes de áreas

rurais da América latina. Essa relação deriva das condições inadequadas de moradia,

falta de educação em saúde, condições sanitárias, bem como intervenções no meio

ambiente, que favorecem a invasão e colonização do domicílio e peridomicílio pelos

vetores, aliadas ainda à falta de assistência à saúde e cuidados pré-natais (Dias et al.,

1999; Prata et al., 2011; Bern et al., 2011).

O hemíptero Triatoma infestans, principal espécie transmissora de T. cruzi no

Brasil, era encontrada em cerca de 710 municípios até 1980. A partir dos programas de

controle implementados na década de 80, avanços significativos foram alcançados no

controle da transmissão vetorial e transfusional da enfermidade; a certificação de

eliminação do principal transmissor, o T. infestans, foi dada em 2006, ao Chile, Uruguai

e Brasil (Coura e Junqueira, 2012). Entretanto, atualmente ainda persistem áreas de alta

endemicidade na América Latina, nas quais as medidas de controle, quando presentes,

são heterogêneas e apresentam impacto variável (Gurevitz et al., 2011). Além disso, em

muitos locais, há limitações na disponibilidade e acesso aos dois únicos fármacos

Introdução

3

disponíveis para o tratamento da doença, o benznidazol e o nifurtimox (Manne et al.,

2013). Diversos outros fatores ameaçam ou limitam o controle da doença; nos últimos

anos, devido às migrações de indivíduos oriundos de regiões endêmicas, o número de

casos tem aumentado em países não endêmicos da Europa e América do Norte.

Estimam-se, apenas nos Estados Unidos e Canadá, cerca de quatrocentos mil casos da

doença, considerando as estimativas mais otimistas (Bern et al., 2011; Hotez et al.,

2013). Ainda, recentes surtos de transmissão oral, atribuídos principalmente ao

consumo de açaí e caldo de cana têm sido notificados no Brasil e Venezuela, causando

óbitos em número significativo na fase aguda (Dias et al., 2008 a; Nobrega et al., 2009;

Beltrão et al., 2009). Outras evidências, como domiciliação de espécies de triatomíneos

vetoras em potencial em áreas com transmissão controlada, bem como resistência dos

insetos aos piretróides em algumas regiões, somam-se às anteriores e evidenciam a

fragilidade do controle da parasitose (Coura e Junqueira, 2012).

A doença de Chagas é responsável por elevada morbidade; caso não tratada

durante a fase aguda, a enfermidade torna-se crônica e em cerca de 30% dos indivíduos

infectados, evoluirá, ao longo dos anos, para o acometimento cardíaco (cardiopatia

chagásica crônica) ou do trato gastrointestinal (megassíndromes) (Prata, 2001). Ambas

as formas clínicas são responsáveis por elevada morbidade em adultos jovens,

economicamente produtivos, sendo o acometimento cardíaco a manifestação mais grave

e frequente, levando tipicamente a arritmias, fenômenos tromboembólicos, falência

cardíaca e morte súbita (Chapadeiro, 1999; Nunes et al., 2012).

Para o tratamento dos indivíduos infectados, são disponibilizados dois

medicamentos, o nifurtimox (Nfx), um derivado nitrofurano, produzido pela Bayer sob

a marca Lampit®; e o benznidazol (Bz), um derivado nitroimidazólico, inicialmente

fabricado pela Roche como Rochagan® ou Rodanil® e agora produzido pelo Lafepe

(Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco), no Brasil e como Abarax® pelo

Laboratório ELEA, na Argentina (Machado de Assis et al., 2013). Ambos os fármacos

são utilizados desde a década de 70 para o tratamento da doença de Chagas, entretanto,

a eficácia terapêutica é especialmente dependente da fase da doença na qual o

tratamento foi instituído.

Índices de cura elevados são obtidos quando o tratamento com Bz ou Nfx é

iniciado durante a fase aguda da doença, nos casos de transmissão congênita e, em

geral, nos casos de infecções crônicas, porém recentes, de crianças e adolescentes

(Andrade et al., 1992; Bahia-Oliveira et al., 2000, Cançado, 2002; Andrade et al., 1996;

Introdução

4

2004; Soza-Estani et al.,1998; 1999; Silveira et al., 2000; Streiger et al., 2004). Por

outro lado, em certas regiões, foi constatada baixa eficácia no tratamento das infecções

recentes (Yun et al., 2009). Adicionalmente, não há tratamento eficaz para os indivíduos

na fase crônica da doença, a qual é a mais prevalente, em áreas endêmicas e não

endêmicas (Ferreira, 1990; Viotti et al., 1994, 2006; Suasnábar et al., 2000; Braga et al.,

2000; Lauria-Pires et al., 2000; Cançado, 2002).

Além dos baixos índices de cura obtidos com o tratamento de pacientes crônicos,

outra limitação do tratamento com o Bz e o Nfx diz respeito às significativas reações

adversas induzidas por ambos. Alguns dos efeitos colaterais, como dermatite esfoliativa

ou polineurite periférica, são suficientes para o paciente abandonar o tratamento

(Jackson et al., 2010).

Estas informações ilustram as limitações do tratamento disponível atualmente e

a evidenciam a necessidade da avaliação de novos fármacos ou novos regimes de

tratamento que apresentem atividade anti-T. cruzi. Por muitos anos, devido a hipóteses

que atribuíam à auto-imudidade o papel de mantenedora das lesões teciduais

características da doença (Cunha Neto e Kalil, 1995), o papel do parasito como

condição essencial para desenvolvimento da patologia foi subestimado.

Consequentemente, o interesse em pesquisa e desenvolvimento de tratamento etiológico

foi desestimulado. Aliado a isso, a doença de Chagas é caracterizada como uma doença

negligenciada, do ponto de vista terapêutico, devido à falta de investimento em novas

terapias por parte da indústria farmacêutica, o que decorre das características

socioeconômicas da população majoritariamente afetada. Adicionalmente, a ausência de

marcadores de cura e da progressão da patologia também dificulta o desenvolvimento

de testes clínicos de novos fármacos. Esse conjunto de fatos limitou, em parte, a busca

por novos alvos e estratégias terapêuticas mais eficazes.

Entretanto, o atual cenário dos estudos sobre a quimioterapia da doença de

Chagas é mais animador. Um grande estudo multicêntrico (BENEFIT) está sendo

realizado para avaliar o benefício do tratamento com benznidazol nos pacientes

portadores de cardiopatia chagásica crônica (Marin Neto et al., 2009). Diversos novos

compostos têm sido avaliados em estudos pré-clínicos e um grande esforço tem sido

realizado no intuito de encontrar novos fármacos ou estratégias terapêuticas mais

eficazes para o tratamento da infecção por T. cruzi. Esta mudança de perspectiva se

deve ao menos a três fatores, que de certa forma estão interligados: (i) à compreensão da

importância do parasito na gênese direta e indireta das lesões cardíacas da doença de

Introdução

5

Chagas (Higuchi et al., 1993; Higuchi et al., 1995; Tarleton et al., 2003), que

evidenciou a necessidade do tratamento etiológico e deu novo vigor ao estudo de novos

alvos contra o parasito; (ii) à parceria de diversas iniciativas, organizações e instituições

público-privadas; formando uma rede, através da qual há a otimização do processo de

desenvolvimento farmacológico, desde as etapas de triagem de compostos até a

disponibilização (como a DNDi- Drugs for neglected tropical diseases initiative, MSF-

Médicos Sem Fronteiras); (iii) à maior visibilidade da doença de Chagas no panorama

mundial; antes uma doença que afetava estritamente regiões marginalizadas, e que agora

torna-se global (Hotez et al., 2013).

A partir dessas iniciativas foi desenvolvida em 2010 uma formulação em doses

pediátricas (12,5mg; versus 100mg da forma farmacêutica tradicional) do benznidazol,

fruto de uma parceria de 3 anos entre a DNDi e o Laboratório Farmacêutico de

Pernambuco (LAFEPE). Esta formulação é de fácil desintegração em água ou suco, e

confere maior segurança e facilidade de administração do fármaco, em dose exata, às

crianças de até dois anos de idade. Dentro das novas possibilidades de tratamento, dois

compostos já se encontram em ensaios clínicos de fase II em indivíduos chagásicos

crônicos (o posaconazol e o E1224, disponível em

http://clinicaltrials.gov/show/NCT01377480 e

http://clinicaltrials.gov/show/NCT01489228). A terapia de combinação etilizando

benznidazol e posaconazol está também sendo avaliada em ensaios clínicos de fase II

(disponível em http://clinicaltrials.gov/show/NCT01377480) e ainda, o fexinidazol, um

derivado nitroimidazólico, será avaliado em breve (Bahia et al., 2012).

O E1224 (pró-fármaco do ravuconazol) e o posaconazol são derivados azólicos,

desenvolvidos originalmente como drogas antifúngicas e que apresentam eficácia no

tratamento da infecção por T. cruzi in vitro e in vivo. Considerando o contexto de busca

de novas estratégias terapêuticas para a doença de Chagas, o objetivo do presente estudo

foi avaliar o efeito do tratamento com benznidazol quando combinado com posaconazol

e com o ravuconazol (ou sua pró-droga, o E1224) na infecção experimental por T. cruzi

in vitro e in vivo.

http://clinicaltrials.gov/show/NCT01489228


2. Revisão da Literatura

Revisão da literatura

7

2.1. A doença de Chagas e Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas resulta da infecção de mamíferos pelo protozoário T. cruzi.

Esse parasito digenético, pertencente à ordem Kinetoplastida, família

Trypanosomatidae, tem um complexo ciclo de vida, envolvendo várias formas

evolutivas nos diversos hospedeiros vertebrados e nos insetos vetores, hemípteros da

subfamília Triatominae (Brener et al., 1987; Dias et al., 1992; Prata, 2001; Remme et

al., 2006).

A história da infecção por T. cruzi iniciou-se há milhares de anos, como uma

doença enzoótica de animais silvestres, envolvendo o protozoário, seus reservatórios

mamíferos e insetos vetores da família Triatominae. Existem indícios de que a infecção

humana por esse parasito ocorre há pelo menos sete mil anos antes de Cristo, época em

que populações nômades do deserto de Atacama (Chile) estabeleceram uma rota entre o

mar e as montanhas: em múmias da época, recuperadas desta Região, foram

identificados resquícios moleculares do T. cruzi (Carlier et al, 2002). Mais tarde, há

cerca de 200 a 300 anos, esta infecção teria se tornado endêmica, especialmente em

decorrência das precárias relações de produção de uma população rural crescente, das

moradias rurais de má qualidade, das migrações humanas e das ações antrópicas sobre o

meio ambiente, promovendo assim a adaptação de insetos silvestres ao ambiente

doméstico, na procura de nova fonte alimentar. E essa adaptação dos insetos vetores às

moradias certamente foi o fator preponderante para o estabelecimento da doença

humana; a infecção, antes não patogênica para a maioria dos mamíferos reservatórios,

passou a ser patogênica para o homem (Prata et al, 2011).

A infecção por T. cruzi determina no homem quadros clínicos com características

variadas (Dias 1992; Prata 2001; Macedo et al., 2004; Coura 2007). A evolução natural

da doença é divida em duas fases subsequentes, aguda e crônica. Durante a fase aguda,

há intensa proliferação do parasito em diversos tecidos, com consequente reação

inflamatória. Na ausência de tratamento específico, podem ocorrer manifestações gerais

inespecíficas e alterações sistêmicas que incluem febre, mal-estar, cefaléia, astenia,

aumento do volume dos linfonodos, hepato e esplenomegalia que podem persistir por

até dois meses. A mortalidade na fase aguda acomete de 2-8% dos indivíduos

infectados, principalmente em crianças e indivíduos imunodeprimidos, devido à

meningoencefalite e miocardite (Barret et al., 2003; Remme et al., 2006).


8

Com o estabelecimento da resposta imune inata e adquirida, as manifestações da

fase aguda regridem e instala-se gradativamente a fase crônica, na qual a parasitemia e o

parasitismo podem permanecer escassos por toda a vida do indivíduo não tratado (Dias,

1992). A forma clínica crônica assintomática é a mais frequente, entretanto 30 a 40%

dos pacientes chagásicos crônicos apresentam graus variáveis de miocardiopatia e 8 a

10% apresentam a forma digestiva, variando as formas clínicas e seu percentual entre

países e, no interior de cada país, entre distintas áreas endêmicas (Dias, 1992)

A grande diversidade de manifestações clínicas, em diferentes regiões

geográficas ainda não pode ser explicada; entretanto fatores como características

genéticas e resposta imune do hospedeiro, exposição à reinfecção e carga parasitária,

bem como a variabilidade genética do parasito têm sido sugeridos como determinantes

da evolução para as diferentes formas clínicas da doença de Chagas crônica (Andrade et

al., 1998; Sosa-Estani et al., 1998).

O T. cruzi é uma espécie heterogênea constituída por várias subpopulações do

parasito que circulam nos ambientes silvestre e doméstico, entre os seres humanos,

animais reservatórios e os vetores. A primeira evidência da heterogeneidade desse

parasito foi identificada por Carlos Chagas, com a observação de formas

tripomastigotas largas, delgadas e intermediárias, que associou essa diversidade

morfológica com aspectos biológicos do parasito (Chagas, 1911).

A partir dos trabalhos de Andrade (1974) a diversidade intraespecífica do T.

cruzi assumiu grande importância epidemiológica; foram definidos distintos

“Biodemas”, que constituíam grupos de cepas do parasito que apresentavam semelhança

em parâmetros morfobiológicos e comportamentais na infecção murina. Dentre esses

parâmetros, características morfológicas, parasitemia, virulência e patogenicidade,

tropismo tecidual no modelo murino e susceptibilidade a drogas, composição antigênica

e resposta imune foram considerados (Andrade et al., 1974; Kretlli e Brener, 1976;

Brener, 1977; Andrade, 1985).

Entretanto, a partir do desenvolvimento de novas metodologias de pesquisa e

com o crescente número de isolados do parasito, passou-se a demonstrar a

heterogeneidade do parasito por métodos bioquímicos e moleculares, com a utilização

de metodologias variadas (Miles et al. 1977; Morel, 1980; Romanha et al., 1982;

Tibaurenc e Ayala, 1988; Macedo et al., 1992; Souto e Zingáles, 1993; Clarck e Pung,

1994; Brisse et al., 2001; Freitas et al., 2006).


9

Em 2009 foi promovido um encontro satélite com o objetivo de normatizar a

nomenclatura do T. cruzi. Esta nova nomenclatura tem permitido a melhor comunicação

entre os pesquisadores, com relação ao entendimento de questões de biologia básica, de

características eco-epidemiológicas e de patogenicidade dos diferentes grupos

genéticos. Neste encontro o T. cruzi foi classificado em seis grupos (T. cruzi I a VI),

sendo cada grupo denominado DTU (“discrete typing unit”), onde DTU é definido com

um conjunto de isolados que é geneticamente semelhante e que pode ser identificado

por marcadores moleculares ou imunológicos comuns (Tibayrenc, 1998; Zingales,

2009).

Os impactos da diversidade biológica e genética de T. cruzi são amplamente

estudados na doença humana e na infecção experimental há diversas décadas, na

tentativa de estabelecer alguma relação entre a diversidade do parasito com o largo

espectro de manifestações clínicas da doença e com a baixa eficácia do tratamento

etiológico quando administrado na fase crônica da infecção (Andrade et al., 1985;

Toledo et al., 2003; Camandaroba et al., 2003; Moreno et al., 2010).

2.2. Tratamento etiológico da doença de Chagas

A quimioterapia específica para a doença de Chagas, que é baseada em

compostos nitroheterocíclicos, é insatisfatória. O benznidazol (Bz) (Benznidazol,

Lafepe; um nitroimidazol) e o nifurtimox (Nfx) (Lampit, Bayer; um nitrofurano) são

as únicas alternativas disponíveis para o tratamento há mais de quatro décadas. Tanto o

Bz quanto o Nfx atuam como pró-drogas que necessitam ser reduzidas por uma

nitroredutase do parasito a fim de se tornarem ativas (Wilkinson et al., 2008). O Bz gera

metabólitos glioxal tóxicos para o parasito, enquanto o Nfx libera cátions nitroaniônicos

e abre cadeias de nitrilas. Ambos os compostos interagem com uma série de

biomoléculas, formando ligações com DNA e grupos tiol e gerando substâncias

altamente reativas (Hall et al., 2011).

Os resultados de diferentes estudos clínicos usando Bz ou Nfx têm demonstrado

que quanto mais cedo o diagnóstico é feito e o tratamento específico iniciado, maiores

são as chances de se obter a cura parasitológica. Na doença de Chagas congênita, o

tratamento de recém-nascidos com Bz ou Nfx é efetivo em 66% a 100% dos casos

(Russomando et al., 1998; Blanco et al., 2000; Schijman et al., 2003; Chippaux et al.,

2010). Em estudos clínicos realizados durante a fase aguda da infecção 40% a 76% de


10

cura parasitológica (indicada pela negativação dos testes parasitológicos e sorológicos)

tem sido obtida (Andrade et al., 1992; Bahia-Oliveira et al., 2000, Cançado, 2002).

Estudos prospectivos mostraram sucesso significativo da quimioterapia com Bz entre

crianças e adolescentes com infecções crônicas recentes; estudos realizados na

Argentina e no Brasil demonstraram 62% a 87% de cura parasitológica (Andrade et al.,

1996; 2004; Soza-Estani et al.,1998; 1999; Silveira et al., 2000; Streiger et al., 2004).

Por outro lado, o tratamento com o Bz induziu baixos índices de cura (5,4%) ou não foi

efetivo em induzir cura em crianças e adolescentes de diferentes regiões da Bolívia

(Yun et al., 2009). A variabilidade aparente na eficácia do tratamento de crianças e

adolescentes pode ser reflexo das diferenças genéticas entre as populações de parasitos e

de hospedeiros presentes nas diferentes regiões.

Apesar do tratamento na fase aguda resultar em altos índices de cura, a doença

de Chagas, por ser uma doença de evolução silenciosa, é geralmente diagnosticada

quando o indivíduo está na fase crônica. E não há tratamento eficaz para os indivíduos

que se encontram nessa fase, que é a mais prevalente, tanto em áreas endêmicas quanto

não-endêmicas. Todos os estudos clínicos publicados mostram que o tratamento com

Nfx ou Bz apresenta uma baixa eficácia entre os pacientes crônicos tratados durante

essa fase, com taxas de cura variáveis, mas nunca superiores a 19,1% (Ferreira, 1990;

Viotti et al., 1994, 2006; Suasnábar et al., 2000; Braga et al., 2000; Lauria-Pires et al.,

2000; Cançado, 2002; Lana et al., 2009).

As razões para a grande diferença na eficácia antiparasitária dos compostos

nitroheterocíclicos nas fases aguda e crônica da doença não são bem determinadas

(Cançado, 2002). Entretanto, podem estar relacionadas às propriedades

farmacocinéticas desfavoráveis destes compostos, como a meia-vida relativamente curta

e a limitada penetração tecidual (Raaflaub & Ziegler, 1979; Raaflaub, 1980; Workman e

cols., 1984; Urbina & Docampo, 2003) que limitam a atividade na fase crônica da

doença, quando há predominantemente parasitos intracelulares, em processo de

replicação (Urbina and Docampo, 2003; Buckner, 2008 apud Urbina, 2009). Além

disso, tem sido demonstrada a importância da resposta imune no desfecho do tratamento

(Ferraz et al., 2007). Estas informações ilustram as limitações do tratamento disponível

atualmente e a necessidade de novas alternativas terapêuticas, especialmente

considerando a utilização um painel de cepas incluídas nas diferentes linhagens

genéticas do parasito.


11

2.3. Modelos de estudo e a quimioterapia experimental

2.3.1. Estudos in vitro

O ciclo biológico do T. cruzi é facilmente reproduzido in vitro, permitindo a

utilização de qualquer uma das formas evolutivas do parasito para a avaliação da

sensibilidade do parasito a diferentes fármacos. O modelo de avaliação da atividade de

compostos sobre formas amastigotas é considerado o melhor indicador da atividade in

vivo, entretanto, devido ao menor custo, facilidade de cultivo e possibilidade de testar de

um grande número ou concentrações de compostos, as formas epimastigotas são mais

amplamente utilizadas para triagem de compostos in vitro. Diversos estudos mostram

uma forte correlação entre a atividade de fármacos sobre epimastigotas e sua eficácia in

vivo (Croft et al., 1986; Urbina et al., 2003; Molina et al., 2000), enquanto outros não

observaram qualquer correlação (Luna et al., 2010; Moreno et al., 2010). Entretanto, é

consenso que os valores de IC-50 (concentração do composto que induz 50% de efeito)

dos fármacos para epimastigotas e amastigotas variam em grandes ordens de magnitude,

sendo os valores observados para a forma intracelular do parasito geralmente inferiores

(Urbina et al., 1998; 2003; Benaim et al., 2006). As formas tripomastigotas têm sido

usadas principalmente para a avaliação do potencial de compostos na utilização em

bancos de sangue; esse estágio do parasito também permite a realização de ensaios

similares aos realizados para a forma epimastigota, já que é extracelular (da Silva et al.,

2008).

Devido à capacidade de T. cruzi de infectar uma grande variedade de células,

diversos tipos celulares podem ser utilizados para avaliação da atividade tripanocida de

novos compostos. Entretanto, de forma diferente do que é observado para estudos de

fármacos antibacterianos, cujos protocolos de avaliação da sensibilidade dos

microrganismos a antibióticos in vitro estão muito bem estabelecidos, não há consenso

com relação aos procedimentos de avaliação da atividade anti-T. cruzi de compostos in

vitro. Em 2010, a partir de um encontro satélite que reuniu expertises na área de

quimioterapia experimental, foram propostos protocolos de avaliação in vitro e in vivo

de atividade anti-T. cruzi de fármacos (Romanha et al., 2010). As recomendações

incluíram a utilização de determinadas formas evolutivas e cepas do parasito, tipos

celulares, ensaios de toxicidade, procedimentos automatizados e determinação de

pontos de corte (Romanha et al., 2010). Apesar dessa tentativa, permanece a falta de


12

consenso nos estudos de quimioterapia experimental da doença de Chagas no que diz

respeito a protocolos apropriados de avaliação da atividade anti-T. cruzi in vitro de

novas drogas. Geralmente as avaliações são feitas utilizando metodologias diferentes,

com variados tipos celulares e distintas cepas ou clones do parasito, o que dificulta a

comparação de resultados e a avaliação mais objetiva da atividade antiparasitária de

novos compostos.

De qualquer forma, a abordagem in vitro proporciona importantes informações

relativas à atividade anti-T. cruzi permitindo a triagem rápida de um grande número de

compostos, direcionando, assim, os experimentos in vivo. Naturalmente, a simplificação

oferecida por esta abordagem não permite a extrapolação direta dos resultados para

situações in vivo, pois, com o contato direto da droga a ser testada com a célula

infectada, a influência do metabolismo e da resposta imune do hospedeiro não podem

ser avaliadas (Jorge e Castro, 2002).

2.3.2. Estudos in vivo

A maioria dos experimentos de quimioterapia da doença de Chagas é realizada

em modelo murino. De fácil obtenção, manutenção e manuseio, esses animais têm sido

usados há décadas para avaliação da atividade anti-T. cruzi in vivo. De extrema

inportância foram os esquemas de tratamento de longa duração (20 dias) introduzidos

por Brener na quimioterapia experimental e a padronização de ensaios para

acompanhamento da eficácia terapêutica (Brener, 1962). Entretanto, ainda hoje não há

um modelo consensual estabelecido com relação à linhagem, sexo e qualidade sanitária

dos animais; cepa do parasito, tamanho do inóculo, dia de início do tratamento e mesmo

de avaliação da eficácia terapêutica. Além disso, muitos estudos são realizados sem a

utilização de um grupo controle tratado com o fármaco de referência. Esses fatos

limitam a compreensão acerca do real benefício de novas terapias, dificultando a

comparação de resultados e o estabelecimento de pontos de corte para a determinação

da eficácia.

Apesar da ausência de um modelo claro e bem definido, alguns parâmetros são

mais amplamente reconhecidos nos estudos de quimioterapia experimental. Entre eles, a

avaliação do efeito do tratamento na carga parasitária, na mortalidade e na evolução das

lesões teciduais decorrentes da infecção. Quanto ao controle de cura, os estudos têm


13

utilizado diferentes metodologias, como o exame de sangue a fresco, a imunossupressão

com ciclofosfamida, a detecção e/ou quantificação do kDNA ou DNA genômico do

parasito no sangue ou tecidos do hospedeiro (PCR), a hemocultura, o xenodiagnóstico e

a sub-inoculação em camundongos jovens. A dosagem de anticorpos IgG anti T-cruzi,

usada na clínica para monitorar a resposta ao tratamento, é também de grande valia na

quimioterapia experimental (Caldas et al., 2008).

De forma geral, os estudos iniciais de novos compostos ou estratégias

terapêuticas concentram-se na avaliação da fase aguda da infecção. E, depois de

demonstrada a atividade in vivo, os ensaios prosseguem para a avaliação da eficácia

terapêutica na fase crônica da infecção (Bahia et al., 2012).

2.3.3. Fármacos e estratégias promissoras

Para uma busca racional de novos fármacos para a quimioterapia de doenças

infecciosas devem ser levados em consideração o alvo e o composto candidato. O

desenho racional de drogas é usualmente baseado em diferenças moleculares,

bioquímicas e/ou fisiológicas entre o patógeno e o hospedeiro, bem como no padrão de

toxicidade do composto candidato. Nesse sentido, já foram identificados diversos alvos

promissores para a quimioterapia da doença de Chagas incluindo os inibidores da

biossíntese do ergosterol, da via de salvação de purinas, inibidores de cisteíno-

proteinases, do metabolismo de pirofosfato, derivados nitroimidazólicos, dentre outros

(Urbina & Docampo, 2003; Guedes et al., 2002; Doyle et al., 2010; Bahia et al., 2012).

Os inibidores da biossíntese de ergosterol (IBE) etsão atualmente entre os

candidatos mais promissores para o tratamento específico da infecção por T. cruzi. O

ergosterol atua essencialmente como biorregulador da fluidez, assimetria e integridade

da membrana plasmática de fungos e protozoários (Carrillo et al., 2006), sendo

indispensável à proliferação desses organismos. Uma vez que esse lipídeo é o esterol

mais abundante na membrana celular de T. cruzi e o parasito não é capaz de utilizar a

oferta de colesterol disponível pelo organismo do mamífero hospedeiro (Urbina 1998,

2009), a via de biossíntese dessa molécula constitui-se de um alvo atrativo para o

desenvolvimento de fármacos (Furlong, 1989; Duschak e Couto, 2007).

A atividade anti-T. cruzi de vários alvos envolvendo a via de biossíntese do

ergosterol tem sido investigada in vitro e/ou em infecções experimentais, como:


14

esqualeno sintase (Urbina, 2009), esqualeno epoxidase (Urbina, 2009), oxidoesqualeno

ciclase (Buckner et al, 2001) e esterol C14α-demetilase (CYP51) (Urbina, 2009;

Buckner, 2008; Buckner et al., 2011; Soeiro et al., 2013). Entre os mais avançados

IBE’s encontram-se os compostos azólicos, incluindo os derivados imidazólicos e

triazólicos, os quais inibem a C14-demetilação do lanosterol por meio da inibição da

CYP51. Derivados azólicos, comercialmente disponíveis como o itraconazol ou

cetoconazol, foram testados para o tratamento da infecção por T. cruzi na infecção

humana e experimental. Embora ambos sejam extremamente efetivos contra o T. cruzi

in vitro (Urbina, 1997, 1999), taxas de curas variáveis (entre 0% a 100%) foram

observadas na infecção experimental em camundongos inoculados com diferentes cepas

do parasito (McCabe et al., 1998; Brener et al., 1993). Apt et al. (2003) e Zulantay et al.

(1988) descreveram taxas de cura de 53% e 61,61% em pacientes tratados durante a fase

crônica da infecção no Chile. Não obstante, estudos realizados no Brasil mostraram que

ambos os compostos, cetoconazol ou itraconazol, não foram eficazes em erradicar o

parasito em pacientes cronicamente infectados ou em infecções experimentais, e

também não foram eficazes em interromper a progressão da doença (Brener et al.,

1993).

Por outro lado, compostos triazólicos de gerações mais recentes, como o D0870,

o albaconazol, o TAK-187, o posaconazol e o ravuconazol, com potente e seletiva ação

anti-T. cruzi, além de propriedades farmacocinéticas favoráveis no homem (amplo

volume de distribuição e longa meia vida plasmática), foram capazes de induzir

distintos níveis de cura parasitológica em vários modelos animais em ambas as fases da

doença, aguda e crônica (revisado por Urbina, 2009). Além disso, estes IBE’s

apresentaram efeitos tóxicos mínimos ou indetectáveis para o mamífero hospedeiro na

dose terapêutica (Molina et al., 2000; Urbina 2001, 2002, 2003; Diniz et al., 2010).

Dentre esses IBE, o posaconazol e o ravuconazol (em forma do pró-farmaco, o E1224),

estão em ensaio clínico de fase II, sendo avaliados em pacientes chagásicos crônicos.

O posaconazol é um IBE desenvolvido e registrado em 2005 na União Européia

e Austrália para o tratamento de infecções invasivas por fungos, e em 2006 nos Estados

Unidos para o tratamento de candidíases resistentes à quimioterapia (Urbina, 2009). O

posaconazol possui ação anti-T. cruzi potente e seletiva, tanto in vitro como in vivo

(Urbina et al., 1998; Silva et al.; 2006; Molina et al., 2000; Ferraz et al., 2007 e 2009;

Olivieri et al., 2010; dos Santos et al., 2012; Diniz et al., 2013), apresentando atividade


15

inclusive na infecção murina por cepas resistentes. Entretanto, devido à alta

complexidade da molécula, o custo de produção do posaconazol é extremamente alto, o

que poderia limitar sua utilização no tratamento dos pacientes chagásicos. Além disso

esse fármaco induz reações adversas, principalmente relacionadas à administração oral,

como náuseas, vômito, dor de cabeça, dor abdominal e diarreia (Lepesheva et al., 2013).

Foi demonstrado ainda, em avaliações experimentais, que o posaconazol pode induzir a

expressão de mRNA da CYP51de parasitos tratados, levando à resistência de T. cruzi

aos derivados azólicos (Lepesheva et al., 2013).

O ravuconazol, assim como o posaconazol é um derivado triazólico de terceira

geração. Urbina et al. (2003) demonstraram que essa molécula possui intensa atividade

anti T. cruzi in vitro, entretanto sua atividade in vivo em modelos experimentais (Urbina

et al., 2003; Diniz et al., 2010) foi limitada, provavelmente devido às propriedades

farmacocinéticas desfavoráveis nesses modelos (camungongos e cães). Neste contexto,

foi desenvolvido o E1224, que é uma pró-droga solúvel do ravuconazol. A pró-droga,

após metabolização é convertida na substância ativa, o ravuconazol; esta modificação

garantiu melhora na absorção e biodisponibilidade do composto.

Desta forma, dentre os motivos que fundamentam o estudo dos derivados

azólicos como potenciais fármacos para o tratamento da doença de Chagas incluem-se a

potente atividade in vitro contra as formas amastigotas, superior à dos fármacos de

referência (ordem de nano a sub-nanomolar) e as propriedades farmacocinéticas

favoráveis no organismo humano. Dentre estas propriedades, o longo tempo de meia-

vida e o alto volume de distribuição aparente são características muito importantes para

a manutenção de níveis sustentados dos fármacos nos tecidos do hospedeiro.

Entretanto, especialmente considerando a possibilidade de desenvolvimento de

resistência que pode ocorrer devido ao tratamento prolongado com derivados azólicos, e

ainda o alto custo desses compostos, estratégias farmacológicas que possibilitem a

redução das doses e/ou do tempo de tratamento são salutares.

2.4. A terapia de combinação

A combinação de compostos é uma estratégia já utilizada com sucesso no

tratamento de várias patologias, como doenças cardiovasculares, câncer e algumas

doenças infecciosas, como tuberculose e SIDA (Fivelman et al., 2004). Essa


16

modalidade de tratamento pode utilizar associações que atuem diretamente em múltiplos

alvos terapêuticos a fim de melhorar a resposta ao tratamento, minimizar a possibilidade

de desenvolvimento de resistência e mesmo de reações adversas, além dos custos.

Diversas combinações de fármacos já foram testadas para o tratamento da

infecção por T. cruzi, tanto em modelos in vitro como in vivo. Urbina et al. (1988)

mostraram in vitro, a interação entre dois inibidores da biossíntese do ergosterol, o

cetoconazol e uma alilamina (SF-86327). Essas drogas, que atuam em diferentes pontos

da via biossintética do esterol, apresentaram interação sinérgica na eliminação de

formas epimastigotas e amastigotas do parasito. Mais tarde, o mesmo autor demonstrou,

in vitro e in vivo (Urbina et al., 1993), que a lovastatina, que não apresenta atividade

contra formas amastigotas do parasito, pode potenciar os efeito tripanocida do

cetoconazol, resultando em interação sinérgica.

Outros estudos também demonstraram a interação in vitro (Lazardi et al., 1990;

Santa Rita et al., 2005; Benaim et al., 2006; dos Santos et al., 2012) e/ou in vivo

(Maldonado et al., 1993; Araújo et al., 2000; Benaim et al., 2006; Fáundez et al., 2008;

Valdez et al., 2011; Cencing et al., 2012; Batista et al.,2012) e a maior parte desses

estudos encontrou boa correlação entre os resultados in vitro e in vivo. Entretanto, não

há ainda uma definição clara de sinergismo ou mesmo métodos de análise estatística

direcionados para a análise do efeito de combinações de fármacos anti-T. cruzi in vivo.

Deste modo, nos estudos de avaliação do efeito de combinações de fármacos in vivo

costuma-se sugerir aumento ou redução do efeito quando comparado aos fármacos

usados isoladamente. Urbina et al. (1993) utilizaram o termo sinergismo quando o

efeito da combinação foi maior do que a soma do efeito de cada um dos compostos

quando usados isoladamente.

2.4.1. Modelos para avaliação da interação entre fármacos

A terapia de combinação de fármacos está bem avançada no campo das

infecções bacterianas e modelos de avaliação de interação entre fármacos in vitro já

estão bem estabelecidos. Nesses estudos, há evidências de correlação entre os resultados

in vitro e in vivo, visto que combinações de compostos que se mostraram sinérgicas in

vitro, foram associadas a um desfecho clínico favorável nos pacientes tratados (White et


17

al., 1996). Também na quimioterapia experimental antimalárica, vários ensaios de

sensibilidade têm sido usados para estimar a atividade de diferentes combinações de

fármacos na infecção por Plasmodium (Fivelman et al., 2004; Co et al., 2009).

Os estudos de terapia combinada in vitro não necessariamente determinam a

eficácia de uma determinada combinação no tratamento do hospedeiro, já que a

farmacocinética dos compostos, dentre outros fatores, são importantes. Entretanto, as

interações in vitro fundamentam os estudos pré-clínicos in vivo.

Três desfechos podem ser esperados quando diferentes fármacos são utilizados

em combinação: sinergismo, aditividade ou antagonismo. Sinergismo resulta da

interação positiva entre os dois compostos; nesse caso o efeito com a utilização da

combinação é maior do que o obtido para cada fármaco isoladamente. A ausência de

interação é referida como efeito aditivo; o efeito da combinação é semelhante ao

observado com a utilização das drogas em monoterapia. Já nas interações antagônicas, a

mistura dos compostos resulta em efeito menor que o esperado (Chou, 1984; Chou

2006).

Há alguns modelos de desenhos experimentais para medir os efeitos de

combinações de compostos, entretanto, dentre os estudos de quimioterapia

antiparasitária os métodos mais difundidos são o de “tabuleiro de damas”

(chequerboard) (Berembaum, 1989) e o método das proporções fixas (Hall et al., 1983).

Esses métodos diferem entre si devido ao modo pelo qual as diferentes combinações são

feitas. O primeiro é mais simples, e utiliza uma série bidimensional dos fármacos em

concentrações diluídas em série, de forma que lembra um tabuleiro de damas. O

segundo utiliza proporções fixas das drogas, cujas concentrações iniciais são definidas a

partir dos valores de IC-50 de cada fármaco em monoterapia. Em ambos os métodos,

“chequerboard” ou “proporções fixas”, as interações podem ser calculadas a partir da

concentração inibitória fracionária (FIC) de cada fármaco; a FIC equivale à

concentração efetiva em dado nível (IC-50 ou IC-90) do fármaco em combinação

dividida pela concentração efetiva quando usado em monoterapia. O somatório das

FICs (∑FIC) de ambos os fármacos da combinação define a natureza da interação. A

maioria dos estudos de combinação de fármacos in vitro aceita que ∑FIC menor que 1

indica interação sinérgica; se superior a 1, interação antagônica e igual a 1, indica

ausência de interação, também denominado efeito aditivo. O ∑FIC é também referido

como índice de combinação (Fivelman et al., 2004; Chou, 2006). Entretanto, tem sido

discutido que não é racional fazer interpretação em fina escala em torno dos valores de


18

∑FIC próximos de 1; tirar conclusões que interações são aditivas, antagônicas ou

mostram sinergismo parcial a partir de dados de ∑FIC ligeiramente acima ou abaixo da

crítica teórica de corte 1,0 parece dar uma interpretação positiva sobre as conclusões

que, dentro dos limites do erro experimental, realmente indicam apenas ausência de

interação entre os compostos (Odds, 2003). Nesse sentido, atualmente os autores têm

sido estimulados a definir a natureza da interação como sinérgica se ∑FIC≤0,5;

antagônica se ∑FIC>4 e ausência de interação se 0,5<∑FIC≤ 4.

A representação gráfica dos efeitos de dois compostos quando combinados é

denominada isobolograma. Em cada ponto do isobolograma é plotado o valor da IC-50

(ou da FIC da IC-50) de cada fármaco, bem como os valores da IC-50 (ou o valor do

∑das FICs) para cada mistura (Figura 1).

Figura 1: Isobolograma representativo dos diferentes tipos de interações possíveis a partir da

combinação de dois fármacos. FIC A e FIC B correspondem à concentração inibitória fracionária de A e

B, respectivamente. A´corresponde à isóbole de aditividade; S´ corresponde a uma interação sinérgica e

M´ a um interação antagônica.

Considerando que a terapia de combinação é uma estratégia promissora no

tratamento da doença de Chagas, é de grande valor a avaliação da natureza da interação

in vitro entre compostos que apresentem atividade tripanossomicida, a fim de orientar a

execução de experimentos in vivo utilizando combinações de fármacos.

3. Justificativa

Justificativa

20

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, as doenças podem ser

classificadas como globais, negligenciadas e extremamente negligenciadas. As doenças

globais, como o câncer, doenças cardiovasculares e mentais representam os objetivos da

maioria das indústrias farmacêuticas na busca de novos fármacos. Já para as doenças

negligenciadas, a exemplo da doença de Chagas, leishmanioses, malária, tuberculose,

não há investimento das indústrias farmacêuticas tradicionais em pesquisa e

desenvolvimento de terapias, devido à falta de mercado significativo. Além do

negligenciamento terapêutico, e em consequência dele, essas enfermidades afetam

milhões de indivíduos que vivem em condições de vida precárias, em países em

desenvolvimento ou subdesenvolvidos. O progresso para o tratamento destas doenças

tem melhorado nas últimas décadas, com o surgimento de parcerias público-privadas e

em função dos avanços nas tecnologias e técnicas de descoberta de drogas. Apesar

disso, as atuais terapias para estas doenças apresentam graves deficiências e, dessa

forma, há a necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas para o cuidado

com os pacientes e controle das enfermidades. Um estudo recente mostrou que dos 850

novos produtos farmacêuticos registrados de 2000 a 2011, apenas 1% corresponde a

novos medicamentos para o tratamento de doenças negligenciadas como um todo. Por

outro lado, essas mesmas doenças geram um impacto global relacionado à morbidade e

mortalidade estimado em 11%. Para o tratamento da doença Chagas há dois fármacos

disponíveis, entretanto a terapêutica apresenta sérias limitações, principalmente

relacionadas à baixa eficácia na fase crônica da enfermidade, que é a mais prevalente

em zonas endêmicas e não endêmicas; associada à intensa indução de reações adversas.

As principais estratégias utilizadas no desenvolvimento de novas terapias para essa

parasitose incluem triagem, utilizando a infecção murina, de compostos que apresentam

efeito antiparasitário in vitro e a pesquisa racional de novos alvos farmacológicos,

baseados em vias metabólicas do parasito compartilhadas com outros microorganismos,

como os inibidores da C14-α demetilase. Outra abordagem seria a terapia combinada de

drogas já comercializadas e que apresentam eficácia terapêutica na infecção por T.

cruzi, o que permitiria a sua rápida utilização no tratamento da infecção humana, caso

identificado aumento da eficácia terapêutica decorrente da combinação. Nesse sentido o

presente trabalho justifica-se por avaliar o efeito de dois derivados azólicos, já

licenciados para o uso humano e com reconhecida atividade anti-T. cruzi, quando

combinados ao benznidazol, que é o fármaco de primeira escolha para o tratamento da

doença de Chagas.

4. Objetivos

Objetivos

22

4.1. Objetivo geral

Avaliar os efeitos do tratamento com benznidazol quando combinado com o

posaconazol ou com o ravuconazol e seu pró-fármaco (E1224) na infecção experimental

por diferentes cepas de T. cruzi in vitro e in vivo.

4.2. Objetivos específicos

1- Avaliar a eficácia terapêutica do benznidazol quando associado ao posaconazol,

de forma concomitante ou sequencial, no tratamento da infecção aguda

experimental de camundongos pelas cepas Y e VL-10 de T. cruzi;

2- Avaliar a atividade do ravuconazol in vitro, isoladamente ou em combinação com

o benznidazol, sobre formas epimastigotas das cepas Y e Colombiana de T. cruzi;

3- Determinar o efeito da utilização do benznidazol em combinação com o

ravuconazol no tratamento de células H9c2 infectadas pelas cepas Y e

Colombiana de T. cruzi;

4- Avaliar, in vivo, a eficácia terapêutica do E1224, um pró-fármaco do

ravuconazol, no tratamento da infecção aguda murina pelas cepas Y e VL-10 de

T. cruzi;

5- Identificar eficácia terapêutica da combinação de benznidazol com E1224 na

infecção aguda murina pela cepa Colombiana de T. cruzi, comparativamente à

administração isolada dos fármacos, utilizando protocolos distintos de

tratamento;

6- Verificar o impacto do tratamento com benznidazol e E1224 (isoladamente ou

em combinação), sobre os níveis de anticorpos IgG e IgG1 anti-T. cruzi aos 30 e

180 dias após o tratamento, comparativamente às monoterapias e ao grupos não

tratados;

7- Avaliar o efeito do tratamento com benznidazol e E1224 (isoladamente ou em

combinação), no infiltrado inflamatório do músculo cardíaco de camundongos

infectados experimentalmente por T. cruzi, comparativamente aos animais não

tratados.

5. Material e Métodos

Material e Métodos

24

5.1. Cepas de Trypanosoma cruzi

Foram utilizadas as cepas Colombiana (DTU I), Y e VL-10 (ambas DTU II) de

T. cruzi (Tabela 1). Essas cepas possuem o perfil de resistência à terapia de referência

bem caracterizado, sendo a cepa Y parcialmente sensível e as cepas Colombiana e VL-

10 resistentes ao benznidazol e ao nifurtimox (Filardi e Brener, 1987). As cepas Y e

Colombiana foram utilizadas nos experimentos in vitro e in vivo e a cepa VL-10 apenas

in vivo.

Tabela 1: Características das cepas utilizadas no estudo.

Cepa Origem

geográfica

Hospedeiro

(fase da

doença/vetor)

DTU* Referência

Colombiana Colômbia Homem (crônica) I Frederici et al (1964)

Y SP/Brasil Homem (aguda) II Silva e Nussenzweig (1963)

VL-10 MG/Brasil Homem (crônica) II Schlemper et al (1982)

*Utilizou-se a nomenclatura proposta por Zingáles et al (2009), onde Discrete Typing Units (DTU) definem-se como

conjuntos de cepas do parasito que são geneticamente relacionados e identificáveis por marcadores genéticos,

moleculares ou imunológicos comuns (Zingáles et al. 2009). Os parasitos foram mantidos através de passagens

sanguíneas sucessivas em camundongos Swiss e em meio de cultura acelular (LIT).

5.2. Fármacos e reagentes

(i) Benznidazol (Bz): 2-nitro-imidazole-(N-benzil-2-nitro-1imidazoleacetamide),

(Lafepe), usado como fármaco de referência nos experimentos in vitro e in vivo;

(ii) Posaconazol (Ps): (2)-4-[4-[4-[4-[[(2Rcis)-5-(2,4-difluorophenyl)-

tetrahydro-5-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)furan-3-yl]methoxy]phenyl]-2,4-dihydro2-

[(S)-1-ethyl-2(S)-hydroxypropyl]-3H-1,2,4-triazol-3-one (Noxafil®, Schering Plough

Research Institute), avaliado apenas nos experimentos in vivo;

(iii) Ravuconazol (Rv): ([R-(R*,R*)]-4-[2-[2-(2,4-difluorophenyil)-2-hydroxy-1-

metlyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)propyl]-4-thiazolyl]benzonitrile),(Eisai, Japão), avaliado

nos experimentos in vitro;

(iv) E1224: pró-fármaco do ravuconazol. É um sal (monolisina-fosfato)

fosforilado derivado do ravuconazol (Eisai, Japão), avaliado nos experimentos in vivo;

(v) Ciclofosfamida (N,N-bis(2-chloroethyl)-1,3,2-oxazaphosphinan-2-amine 2-

oxide) (Genuxal),utilizada para imunossupressão dos animais;

Material e Métodos

25

(vi) Resazurina: Sal dissódico (Sigma), utilizada como indicador da proliferação

celular através de reação colorimétrica.

A figura 2 mostra a estrutura química dos diferentes fármacos utilizados:

Benznidazol

Posaconazol

Ravuconazol

Figura 2: Estrutura química dos fármacos utilizados no estudo. Posaconazol e ravuconazol são

derivados azólicos; benznidazol é um derivado nitoimidazólico.

Para utilização nos experimentos in vitro, as soluções-estoque de cada fármaco

(Bz-100mM; Rv-10mM) foram preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO, Merck,

Germany) e armazenadas a -20º C. No momento do uso os compostos foram diluídos

em meio de cultura fresco, sendo a concentração final máxima de DMSO na solução

igual ou menor que 0.06%. Para utilização nos experimentos in vivo, Bz e Ps foram

preparados na forma de suspensão usando carboximetilcelulose (CMC - Sigma) 0,5%

contendo 0,5% de Tween-80, enquanto o E1224 foi solubilizado em água destilada

estéril. A ciclofosfamida foi diluída em água destilada estéril e usada na concentração

de 50mg/kg. A resazurina foi diluída em PBS (Phosphate Buffered Saline) de forma a

garantir concentração de uso igual a 1mM.

Material e Métodos

26

5.3. Experimentos in vitro

5.3.1. Cultivos de células H9c2

Células da linhagem H9c2 (American Type Culture Collection, ATCC: CRL

1446) provenientes de cardiomioblastos de ratos neonatos foram mantidas em meio

DMEM suplementado com 10% de SFB, 1% de glutamina 2mM e 0,2% de gentamicina

200µg/ml. Garrafas de cultura de 75 cm2

contendo as células (mantidas a 37oC e 5% de

CO2), foram tripsinizadas semanalmente ou quando atingiam confluência. Para

utilização nos experimentos, foram plaqueadas 1x104células/poço, sobre lamínulas de

13mm, em placas de 24 poços. Após 24 horas de incubação, nas mesmas condições

descritas, as células foram infectadas por T. cruzi na razão de 10:1 (parasitos/célula)

para a cepa Y e 40:1 para a cepa Colombiana.

5.3.2. Obtenção do parasito

(i) Cultivo das formas epimastigotas

As formas epimastigotas das cepas Y e Colombiana foram cultivadas de forma

axênica utilizando meio LIT (Liver Infusion Triptose), suplementado com 10% de soro

fetal bovino (SFB), mantidas em estufa BOD, a 28ºC. Para o crescimento exponencial,

foi adicionado o meio de cultura, a cada 2 dias, em cada cultura e estas então

submetidas a um repique semanal. Com objetivo de manter as características biológicas

de cada cepa, após cerca de oito semanas, os parasitos foram homogeneizados em meio

LIT contendo 10% de glicerina (Sigma) e submetidos à criopreservação em nitrogênio

líquido.

(ii) Obtenção de formas tripomastigotas metacíclicas

As formas tripomastigotas metacíclicas da cepa Colombiana foram obtidas a

partir de formas epimastigotas mantidas em meio LIT. Cinco mililitros de cultura, em

fase exponencial, foram adicionados a 15 mL de meio Grace (Grace’s Insect medium,

Sigma), pH 7,0. Essa suspensão de parasitos foi mantida em garrafa de cultura (75 cm3),

a 28º C, por 12 dias. Após esse período o sobrenadante foi coletado e centrifugado a

2100g, 4ºC, por 15 minutos. Determinou-se o número de parasitos através de contagem

Material e Métodos

27

em câmara de Neubauer e a percentagem de formas metacíclicas foi avaliada após

confecção de um esfregaço da cultura, fixação com metanol por 5 minutos e coloração

pelo Giemsa (10% em água destilada). No mínimo, 200 parasitos foram contados em

cada lâmina. Nessas condições, em geral observa-se cerca de 65% de metaciclogênese.

(iii) Obtenção de formas tripomastigotas de cultura celular

As formas tripomastigotas da cepa Y utilizadas para infectar os diferentes tipos

celulares foram obtidas a partir do sobrenadante de cultura de células de mamíferos

infectadas. Para isso, células H9c2 foram cultivadas em meio DMEM suplementado

com 10% de SFB. Ao atingir cerca de 70% de confluência, a cultura foi infectada com

tripomastigotas sanguíneos (proporção de 10 parasitos por célula) oriundos do sangue

de camundongos infectados pela cepa Y, no pico de parasitemia (8o dia de infecção).

Após 24 horas de incubação a 37ºC, 5% CO2, o meio de cultura foi removido e os

parasitos não internalizados retirados através de sucessivas lavagens com PBS. As

células foram novamente incubadas a 33ºC por 72 a 96 horas, quando o sobrenadante

foi coletado e centrifugado, a 110g, 24ºC, por 2 minutos, para remoção dos debris

celulares. Posteriormente, o sobrenadante, rico em parasitos, foi centrifugado a

2100rpm, 4ºC, 15 minutos e o sedimento ressuspendido em meio de cultura para

posterior utilização nos experimentos. Apenas parasitos recém-liberados das células

foram utilizados nos experimentos.

5.3.3. Otimização das condições experimentais para a utilização do corante

resazurina a fim de quantificar a inibição da proliferação de diferentes tipos celulares

A resazurina é um indicador colorimétrico de viabilidade e proliferação celular

que se baseia na redução química do reagente devido à atividade metabólica das células.

Através de reações de oxi-redução, o corante passa da cor azul (forma oxidada e não

fluorescente) para rosa (forma reduzida, fluorescente), e esta mudança de cor pode ser

medida pela leitura colorimétrica ou fluorimétrica (Fields e Lancaster, 1993; Ahmed et

al., 1994).

A resazurina é o principal componente do Alamar Blue (O’Brien et al., 2000),

reagente já utilizado para avaliação da proliferação de diversos tipos celulares (REF) e

também da atividade anti-T. cruzi de alguns compostos sobre formas epimastigotas e

Material e Métodos

28

tripomastigotas de T. cruzi e T. brucei (Santos SL, 2008; Rolón et al., 2006). Entretanto,

diferentemente do Alamar Blue, a resazurina é um corante de baixo custo financeiro.

As duas variáveis que mais afetam a resposta das células à resazurina são o

tempo de incubação e o número de células plaqueadas, sendo necessário padronizar

esses parâmetros para cada tipo celular. Como a resazurina foi utilizada para estimar a

toxicidade dos fármacos para células H9c2, bem como para formas epimastigotas de T.

cruzi, inicialmente foram realizados experimentos para otimizar o número de células

utilizadas, bem como o tempo de incubação necessário com o corante para proceder a

leitura da reação para cada tipo celular.

(i) Construção da curva-padrão de epimastigotas

Epimastigotas das cepas Y e Colombiana foram contadas em câmara de

Neubauer e a concentração ajustada para 5x106 parasitos/mL. Duzentos microlitros (µL)

dessa suspensão foram pipetados em placas de 96 poços, em triplicata. Foram feitas 7

diluições seriadas na proporção de 1:2 (sendo 200 µL de volume final em cada poço) e a

placa então incubada por 72 horas em estufa BOD, a 28ºC. Após esse período foram

adicionados 20µL de resazurina 1mM (concentração previamente padronizada) a cada

poço. A reação foi lida com intervalos de uma hora até que o corante fosse

completamente reduzido, a fim de encontrar o intervalo de tempo no qual a leitura de

diferentes concentrações fosse linear. Como as duas formas do corante (oxidada ou

reduzida) absorvem luz em comprimentos de onda diferentes, as leituras de absorbância

foram feitas a 570 (detecção da forma reduzida) e 600 nm (detector da forma oxidada)

em leitor de microplacas (Epoch). A porcentagem de redução do corante, em cada

tempo, foi calculada de acordo com a fórmula abaixo:

Redução da resazurina = [A570 –(A600 X R0)]

Nessa fórmula, A570= absorbância a 570nm, A600= absorbância a 600nm e R0 é o

fator de correção, calculado a partir dos valores de absorbância do controle negativo

(C), que continha LIT e resazurina na ausência de células [R0=(A570C /A600C)]. A curva-

padrão foi construída plotando-se o número de parasitos versus a porcentagem de

redução do corante. Dessa forma definiu-se a quantidade ideal de epimastigotas, bem

como o tempo ótimo de incubação a fim de se obter uma reação linear.

Material e Métodos

29

(ii) Construção da curva-padrão de células H9c2 utilizando resazurina

Uma série de seis diluições na proporção 1:2, partindo da concentração de 1x104

células H9c2/mL foi pipetada em placa de 96 poços (200 µL/poço). Após 24 horas de

incubação a 37ºC, 5% de CO2, o meio de cultura foi trocado e a placa incubada

novamente por 72 horas, nas mesmas condições. Como controle negativo da reação,

replicatas contendo 200 µL de meio de cultura puro, sem células, foram utilizadas. Após

esse período, foram adicionados 20 µL de resazurina 1mM em cada poço, procedimento

seguido de nova incubação a 37ºC. A leitura da reação foi realizada a 570nm e 600nm, a

cada 1 hora, até que fosse alcançado 100% de redução. Os cálculos de percentual de

redução e construção da curva-padrão foram feitos de maneira similar aos

procedimentos descritos no item anterior.

5.3.4. Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos fármacos benznidazol e ravuconazol

contra formas epimastigotas – definição da IC-50

Para a avaliação do efeito anti-epimastigota do Bz e Rv, duas cepas de T. cruzi

foram utilizadas: Y e Colombiana. As formas epimastigotas foram mantidas como

previamente descrito. Para quantificar a atividade de cada composto sobre o parasito,

utilizou-se a reação colorimétrica previamente padronizada. Após contagem em câmara

de Neubauer, ajustou-se o número de parasitos para a concentração de 10x106/mL. Cem

microlitros dessa suspensão foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços, em

triplicata. Logo após, concentrações decrescentes das drogas, em um volume de 100 µL

(diluições previamente preparadas em outra placa), foram adicionadas aos poços

contendo epimastigotas. Seis diluições de cada fármaco foram testadas em triplicata,

sendo a concentração inicial de Rv igual a 50 µM e de Bz, 100 µM. As placas foram

incubadas em estufa BOD, a 28ºC, por 72 horas. Foram adicionados, a cada placa,

controles negativos (meio), controles positivos (meio+parasitos), controles para avaliar

o potencial dos fármacos (meio+droga, na ausência de parasitos) ou do DMSO (meio

+DMSO) em reduzir o corante. Como controle de morte celular foi adicionado, em

triplicata, DMSO a 40% em LIT. Após esse período foram adicionados 20 µL de

resazurina/poço e após 3 horas foi realizada a leitura da reação a 570nm e 600nm,

utilizando um leitor de microplacas. A porcentagem de inibição da proliferação foi

calculada a partir da fórmula:

Material e Métodos

30

% inibição = 100 – [ A570-(A600xR0) Tratado / A570-(A600xR0) Controle+] x100.

Nessa fórmula, A570= absorbância a 570nm, A600= absorbância a 600nm e R0 é o

fator de correção, calculado a partir dos valores de absorbância do controle negativo, ou

seja, apenas meio de cultura e resazurina na ausência de parasitos [Ro = (A570 /A600)].

A partir do percentual de inibição de cada concentração dos fármacos foi

calculada a IC-50 (concentração inibitória do fármaco, que induz 50% do efeito

analisado), utilizando o programa CalcuSyn. As curvas de dose-resposta mostradas

nesse trabalho foram construídas no Graph Pad Prism 5. Todos os experimentos com

formas epimastigotas foram realizados em triplicata, com no mínimo 2 repetições.

5.3.5. Ensaios de citotoxicidade

Para avaliar os efeitos tóxicos das drogas sobre as células hospedeiras, culturas

de células H9c2 não infectadas por T. cruzi foram tratadas com concentrações dos

fármacos muito superiores aos valores de IC-50 para benznidazol (Bz) e ravuconazol

(Rv). Duzentos microlitros de suspensão das células H9c2, na concentração de

5x103/mL, foram pipetados em placas de 96 poços e incubados a 37º, 5% CO2, por 24

horas. O meio de cultura foi removido e substituído por 200 µL de meio contendo ou

não concentrações decrescentes de Bz (6 diluições 1:2, a partir de 200µM) ou Rv (6

diluições 1:2, a partir de 1 µM) isoladamente ou em combinação, e a placa novamente

incubada por 72 horas. Foram adicionados à cada placa: controles negativos

(meio+resazurina), controles negativos (meio), controles positivos (meio+células),

controles para avaliar o potencial dos fármacos (meio+droga, na ausência de parasitos)

ou do DMSO (meio+DMSO) em reduzir o corante. A fim de avaliar a eficácia do

método em detectar a morte celular, foram utilizadas concentrações decrescentes de

DMSO que são sabidamente tóxicas para as células (3% e 30%). Após as 72 horas de

incubação a 37ºC, foram adicionados 20 µL de resazurina 1mM a cada poço e a placa

foi lida em leitor de microplacas (570 nm e 600nm). A porcentagem de inibição da

proliferação induzida pelos compostos foi calculada utilizando-se a fórmula abaixo:

% inibição = 100 – [A570-(A600xR0) Tratado / A570-(A600xR0) Controle+] x100

Material e Métodos

31

Nessa fórmula, A570= Absorbância a 570nm, A600= Absorbância a 600nm,

Controle + é o poço contendo células, meio e resazurina, na ausência do fármaco. R0 é

o fator de correção, calculado a partir dos valores de absorbância do controle negativo

(C-), ou seja, apenas meio de cultura e resazurina na ausência de células [Ro = (A570

/A600)C-].

A DL-50 (concentração da droga que reduz a viabilidade celular em 50%) para

cada composto em diferentes tipos celulares, bem como para as combinações foi

estimada, quando possível, utilizando-se o software CalcuSyn.

5.3.6. Avaliação da atividade anti-T. cruzi dos fármacos benznidazol e ravuconazol

sobre formas amastigotas intracelulares: definição da IC-50

A avaliação do efeito do tratamento com Bz e Rv sobre as cepas Y e Colombiana foi

realizada utilizando células H9c2 como hospedeiras. Após 24 horas de incubação das

células em placas de 24 poços, a 37ºC, 5% CO2, formas tripomastigotas foram utilizadas

para infecção em uma razão de 20:1 parasitos: células para os experimentos com a cepa

Y e 30:1 para aqueles realizados com a cepa Colombiana. Após 24 horas de interação, o

sobrenadante foi removido e cada poço foi lavado no mínimo três vezes com PBS

estéril, a fim de remover os parasitos não internalizados. Meio de cultura fresco

contendo ou não os fármacos em diferentes concentrações foi adicionado a cada poço,

em um volume total de 1mL. As células foram novamente incubadas por 72h, a 37ºC.

As concentrações iniciais de cada composto foram definidas a partir de experimentos

preliminares (dados não mostrados). Foram testadas no mínimo 8 diluições de cada

fármaco, partindo de uma concentração inicial de 60µM de Bz (cepa Y) e 120 µM (cepa

Colombiana) e 10nM de Rv (cepa Y) e 60nM (cepa Colombiana), em diluições seriadas

de 1:2 ou 1:3.

Em todos os experimentos foram mantidas, como controles, células não infectadas,

tratadas ou não e infectadas e não tratadas. Independente da cepa utilizada para a

infecção, após 72 horas de incubação com os fármacos, o sobrenadante de cada poço foi

coletado e armazenado a -70ºC. As lamínulas contendo as células foram lavadas com

PBS, fixadas com metanol por 5 minutos e em seguida, coradas pela solução de Giemsa

Material e Métodos

32

(10% em água destilada). Após secagem das lamínulas e montagem em lâmina com

Entellan (Merck), determinou-se a percentagem de células infectadas em uma contagem

de no mínimo 200 células ao microscópio ótico (aumento de 1000x). Apenas as formas

do parasito com morfologia característica foram consideradas na avaliação da infecção.

O percentual de infecção observado nos poços tratados foi utilizado para calcular o

percentual de redução do número de células infectadas com relação àqueles infectados e

não tratados. Esse percentual de inibição foi então utilizado para a construção de curvas

de dose-efeito e cálculo da IC-50 com auxílio dos softwares Graph Pad Prism 5 e

CalcuSyn. Todos os experimentos com amastigotas foram realizados em duplicatas,

com no mínimo 2 repetições.

5.3.7. Avaliação da ocorrência de interação entre Bz/Rv in vitro

Os experimentos para avaliar o tipo de interação entre Bz e Rv in vitro

(epimastigotas e amastigotas intracelulares), foram realizados com base no método de

proporções fixas modificado (Fivelman et al., 2004). Os valores de IC-50 obtidos nos

experimentos com cada fármaco isoladamente, foram utilizados para determinar as

concentrações iniciais de Bz e Rv a serem usadas nos experimentos de combinação, de

forma a garantir que o IC-50 de cada composto estivesse próximo da quarta diluição de

uma série de 8 diluições. Dessa forma, as concentrações iniciais de Bz e Rv definidas a

partir da IC-50 (diferentes para epimastigotas e amastigotas) foram usadas para o

preparo de soluções contendo ambos os fármacos, sempre em proporções fixas, numa

razão de 5:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 e 0:5 de Bz:Rv (tabela 2).

Material e Métodos

33

Tabela 2- Proporções de benznidazol e ravuconazol utilizadas no experimento de combinação in

vitro – Método de proporções fixas*

Benznidazol

(A)

Monoterapia

(5A +0B)

Mistura 1

(4A +1B)

Mistura 2

(3A +2B)

Mistura 3

(2A +3B)

Mistura 4

(1A +4B)

Ravuconazol

(B)

Monoterapia

(0A +5B)

10µM A 8µM A+

10µM B

6uM A+

20uM B 4uM A+

30uM B 2uM A+

40uM B 50uM B

5uM A 4uM A+

5uM B

3uM A+

10uM B 2uM A+

15uM B 1uM A +

20µM B 25 µM B

2,5 µM A 2µM A+

2,5µM B

1,5µM A+

5µM B 1µM A+

7,5µM B 0,5µM A+

10µM B 12,5µM B

1,25µM A 1µM A+

1,25 µM B 0,75µM A+

2,5µM B 0,5µM A+

3,75µM B 0,25µM A+

5µM B 6,75µM B

0,625µM A 0,5µM A+

0,625 µM B 0,375µM A+

1,25µM B 0,25µM A+

1,875µM B 0,125µM A+

2,5µM B 3,875µM B

0,312µM A 0,25µM A+

0,325µM B 0,1875µM A+

0,625µM B 0,125µM A+

0,937µM B 0,0625µM A+

1,25µM B 1,975µM B

Para a utilização do modelo de proporções fixas foram realizadas diluições variando de 6 (amastigotas) a

8 (epimastigotas) pontos, em séries de 1:2. Os valores de IC-50 de cada fármaco aproximam-se daquele

observado na terceira ou quarta diluição de cada fármaco isoladamente (monoterapia). Cada mistura é

obtida a partir de proporções definidas de Bz (benznidazol) e Rv (ravuconazol). As concentrações

apresentadas na tabela são representativas. * Modificado por Fivelman et al. (2004).

Considerando então os valores de IC-50 para cada fármaco para as diferentes

cepas e formas do parasito estudadas, foram estabelecidas as concentrações iniciais de

Bz e Rv a fim de realizar os experimentos de combinação.

5.3.7.1. Interação entre Bz e Rv contra as formas epimastigotas

Para avaliação da interação entre Bz e Rv no “tratamento” de culturas de

epimastigotas, utilizou-se a cepa Colombiana. Após contagem em câmara de Neubauer,

ajustou-se o número de parasitos para a concentração de 10x106/mL. Cem microlitros

dessa suspensão foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços, em triplicata.

Material e Métodos

34

Logo após, concentrações decrescentes das drogas, isoladamente e em combinação, em

um volume de 100 µL (diluições previamente preparadas em outra placa), foram

adicionadas aos poços contendo os parasitos. As concentrações iniciais de Bz e Rv

foram 100µM. As proporções de cada fármaco em cada uma das misturas e diluições

podem ser observadas na tabela 2. Além dos poços tratados, foram adicionados à cada

placa controles negativos (apenas LIT), controles de redução da droga (LIT+droga, na

ausência de parasitos) e controles positivos (LIT+parasitos). As placas foram incubadas

em estufa BOD, a 28ºC por 72 horas. Após esse período foram adicionados 20 µL de

resazurina/poço e após 3 horas, as placas foram lidas a 570nm e 600nm, utilizando um

leitor de microplacas. Os cálculos dos percentuais de redução do corante e de inibição

da proliferação do parasito foram realizados de maneira idêntica ao mostrado no item

5.3.4.

5.3.7.2. Interação de Bz/Rv sobre formas amastigotas

A interação entre Bz e Rv foi avaliada sobre amastigotas das cepas Y e

Colombiana em células H9c2. Em todos os experimentos de combinação em células

infectadas, foram utilizadas 6 diluições 1:2 de cada fármaco isoladamente, bem como

das misturas. Como controles, foram avaliadas células não infectadas e tratadas ou não,

a fim de avaliar toxicidade da terapia combinada, bem como células infectadas e não

tratadas. A infecção e o tratamento das células foi realizado como descrito

anteriormente. As concentrações iniciais de Bz e Rv, utilizadas isoladamente e no

preparo das misturas foram, respectivamente, 10µM e 0,2nM nos experimentos

realizados com a cepa Y. Para os experimentos realizados com a cepa Colombiana a

concentração inicial de Bz foi 20µM (diluições 1:2) e Rv, 1,2 nM. Após 72 horas de

incubação a 37ºC, o sobrenadante foi removido, e as células então lavadas em PBS,

fixadas e coradas para avaliação do percentual de infecção, como já descrito.

5.3.8. Análise estatística – experimentos in vitro

Os valores de IC-50 foram obtidos através do software CalcuSyn, que utiliza o

plot de efeito médio (median effect plot).

Para classificar a natureza da interação entre Bz e Rv in vitro, utilizou-se a

fração de concentração inibitória (FIC) e análise do isobolograma. FICs e a soma dos

Material e Métodos

35

FICs (∑FICs) foram calculadas da seguinte forma: FIC Bz= IC50 Bz na

combinação/IC50 Bz em monoterapia. A mesma equação foi aplicada ao Rv. Esse

cálculo foi feito para os valores obtidos para cada uma das diluições. ∑FICs=FIC Bz +

FIC Rv. A média do ∑ FICs calculada foi usada para classificar a natureza da interação.

Se ≤ 0,5 indica sinergismo; 0,5 < FIC ≤ 4, aditividade e se >4 indica antagonismo

(Odds, 2003). Os isobologramas foram construídos plotando-se a FIC da IC50 do Bz

versus Rv.

5.4. Experimentos in vivo

5.4.1. Animais

Foram utilizados camundongos Swiss, fêmeas, com idade entre 28 a 30 dias,

pesando entre 18 e 24g. Os animais foram fornecidos e mantidos pelo Centro de Ciência

Animal da Universidade Federal de Ouro Preto. Todos os experimentos e protocolos

experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o uso de animais em

pesquisa do COBEA (Colégio Brasileiro de experimentação) e aprovados pelo Comitê

de Ética em Pesquisa da UFOP (números 2009/17 e 2011/15).

5.4.2. Infecção experimental de camundongos por T. cruzi

Camundongos Swiss foram infectados, por via intraperitoneal, com 5x103 formas

tripomastigotas sanguíneas de diferentes cepas, obtidos por punção do plexo venoso

retro-orbital de camundongos infectados, no dia do pico de parasitemia. Foi avaliada a

atividade tripanossomicida do posaconazol sobre as cepas Y e VL-10 e a atividade do

E1224 (pró-fármaco do ravuconazol) sobre as cepas Y, Colombiana e VL-10.

5.4.3. Esquemas de tratamento

Neste estudo foi avaliado o potencial terapêutico do posaconazol e do E1224

(pró-fármaco do ravuconazol) quando utilizados isoladamente ou em combinação com o

benznidazol (o fármaco de referência) para o tratamento da infecção murina por T.

cruzi. Todos os compostos foram administrados por via oral, através de gavagem, em

um volume aproximado de 0,2mL. Quando utilizados em combinação, a administração

de cada composto foi realizada separadamente, com cerca 30 minutos de intervalo,

sendo o E1224 administrado antes do Bz. O benznidazol e o posaconazol foram

Material e Métodos

36

administrados em uma dose diária, enquanto o E1224 foi administrado em duas doses

diárias.

5.4.3.1. Utilização do posaconazol no tratamento da infecção aguda murina por

T. cruzi, isoladamente ou em combinação com o benznidazol

Em todos os experimentos realizados visando avaliar a eficácia terapêutica do

posaconazol (Ps) quando associado ao benznidazol (Bz) sobre a cepa Y, o tratamento

foi iniciado no 4º dia após a infecção, momento da detecção da parasitemia.

Inicialmente foi realizado um experimento para análise do efeito de dose-

resposta, no qual animais infectados pela cepa Y (n=60) foram tratados durante 7 dias

com uma dose diária de benznidazol (Bz) ou posaconazol (Ps), em monoterapia ou em

combinação. Para o tratamento com cada fámaco isoladamente, três doses foram

selecionadas: (i) as doses curativas de Bz (100 mg/kg-mpk) e Ps (20mpk), previamente

padronizadas por Filardi e Brener (1987) e Molina et al. (2000); (ii) metade e (iii) um

quarto da dose curativa. Dose curativa refere-se àquela capaz de induzir cura

parasitológica em camundongos infectados pela cepa Y de T. cruzi, quando utilizado o

período completo de tratamento (nos estudos de quimioterapia experimental da doença

de Chagas em modelo murino, a eficácia terapêutica é usualmente determinada

observando-se o período de tratamento de 20 dias consecutivos). Para o tratamento em

combinação foram utilizadas as seguintes dosagens: 25, 50 ou 100mpk de Bz associados

a 5, 10 ou 20 mpk de Ps. Três parâmetros foram utilizados para verificar a eficácia dos

diferentes esquemas terapêuticos: supressão da parasitemia, redução da mortalidade e

pico máximo de parasitemia após o tratamento.

A tabela 3 mostra os grupos experimentais avaliados, bem como as doses de

cada fármaco, sendo o número de animais em cada grupo igual a 6.

Material e Métodos

37

Tabela 3: Grupos experimentais avaliados no experimento para determinação do efeito dose-

resposta do tratamento com benznidazol e posaconazol sobre a cepa Y do Trypanosoma cruzi.

Bz/Ps

(mpk)

Ps (0) Ps (5) Ps (10) Ps (20)

Bz (0) CINT Mono Mono Mono

Bz (25) Mono Comb1 - -

Bz (50) Mono - Comb2 -

Bz (100) Mono - - Comb3

Os animais foram inoculados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 4o dia de

infecção. mpk-miligramas de droga/quilograma de peso corporal; CINT- grupo infectado e não tratado

Bz- benznidazol; Ps- posaconazol; Mono- monoterapia; Comb- grupos tratados com combinação de

Ps/Bz nas doses indicadas.

Uma vez que foram obtidos resultados satisfatórios no experimento de dose-

resposta, o próximo passo foi avaliar a capacidade dos compostos, quando combinados,

em induzir cura parasitológica. Para essa avaliação o tratamento foi realizado por 20

dias consecutivos e a eficácia do tratamento em induzir cura foi avaliada de acordo com

os métodos descritos na figura 2 . Os seguintes grupos experimentais foram avaliados,

sendo n=10/grupo:

Material e Métodos

38

Tabela 4: Grupos experimentais utilizados para avaliação da atividade curativa do posaconazol e

benznidazol, isoladamente ou em combinação, no tratamento de camundongos infectados pela cepa

Y do Trypanosoma cruzi.

Bz/Ps

(mpk)

Ps (0) Ps (5) Ps (10) Ps (20)


Bz (25) Mono Comb1 Comb2 Comb3




Os animais foram inoculados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos a

partir do 4o dia de infecção. mpk- miligramas de droga/quilograma de peso corporal; CINT- grupo

infectado e não tratado; Bz- benznidazol; Ps- posaconazol; Mono- grupos tratados com cada droga

isoladamente; Comb- grupos tratados com combinação de Ps/Bz nas doses indicadas.

Em seguida, avaliou-se o efeito do tratamento sequencial empregando Ps e Bz

em induzir cura parasitológica, quando comparado ao esquema terapêutico

convencional. Para isso camundongos Swiss infectados pela cepa Y foram tratados, com

Bz e/ou Ps, de acordo com a tabela abaixo, sendo n=10/grupo:

Tabela 5: Grupos experimentais utilizados para avaliação da atividade curativa da terapia

sequencial com posaconazol e benznidazol na fase aguda da infecção murina pela cepa Y do

Trypanosoma cruzi.

Grupo Tratamento 1

(mpk/ 10 dias)

Tratamento 2

(mpk/10 dias)

Sequencial 1 Bz (100) Ps (20)

Sequencial 2 Ps (20) Bz (100)

Monoterapia Bz Bz (100) -

Monoterapia Ps Ps (20) -

Tratamento padrão Bz Bz (100) Bz (100)

Tratamento padrão Ps Ps (20) Ps (20)

Os animais foram inoculados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 4o dia de

infecção. mpk- miligramas de droga/Kg de peso corporal. Sequencial 1- Tratamento com Bz100mpk por

10 dias, seguido do tratamento com Ps20mpk por mais 10 dias; Sequencial 2 –Tratamento com Ps 20mpk

por 10 dias seguido do tratamento com Bz100mpk por outros 10 dias. Monoterapia – Apenas 10 dias de

tratamento com cada fármaco; Tratamento padrão – tratamento com cada fármaco por 20 dias.

Material e Métodos

39

Um segundo conjunto de experimentos foi realizado para determinar a eficácia

da combinação de posaconazol e benznidazol no tratamento de camundongos infectados

pela cepa VL-10 de T. cruzi. Oitenta e seis camundongos foram inoculados com 5000

formas tripomastigotas sanguíneas da cepa VL-10. O tratamento foi iniciado no

primeiro dia de parasitemia patente, que para a cepa VL-10 equivale ao 10o dia pós-

infecção. Devido à alta resistência dessa cepa ao Bz e ao Nfx, foram utilizadas as doses

mais altas de cada composto, tanto em monoterapia como em combinação. Deve ser

ressaltado que foi incluído ainda um grupo de animais tratados com o dobro da dose

ótima de Ps; esse grupo de animais foi tratado com 2 doses diárias de Ps de 20mpk

cada, por 20 dias consecutivos. A seguir os grupos experimentais avaliados:

Tabela 6: Grupos experimentais utilizados para avaliação da atividade curativa do posaconazol e

benznidazol em combinação no tratamento de camundongos infectados pela cepa VL-10 do

Trypanosoma cruzi.

Bz/Ps

(mpk)

Ps 0 Ps 10 Ps 20 Ps 40


Bz (50) Comb1 Comb2

Bz (100) Mono Comb3 Comb4

Os animais foram inoculados com a cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 10o dia de

infecção. mpk- miligramas de droga/quilograma de peso corporal; CINT- grupo infectado e não tratado;

Bz- benznidazol; Ps- posaconazol; Mono- grupos tratados com cada droga isoladamente; Comb- grupos

tratados com combinação de Ps/Bz nas doses indicadas.

5.4.3.2. Utilização doE1224 (pró-fármaco do ravuconazol) no tratamento na infecção

aguda murina por T. cruzi, isoladamente ou em combinação com o benznidazol

Inicialmente foi realizado um experimento para avaliar a capacidade de

diferentes doses de E1224 em induzir a cura parasitológica de animais infectados pelas

cepas Y, Colombiana e VL-10 de T. cruzi. Assim, camundongos Swiss foram

inoculados com o parasito e tratados a partir do 4o dia de infecção. Para os animais

infectados com a cepa Y foram testadas as seguintes doses de E1224: 10, 20, 30, 40 e

50mpk (miligramas por quilograma de peso corporal) durante 20 dias, sendo n=7/

Material e Métodos

40

grupo. Os animais infectados pelas cepas Colombiana e VL-10 receberam apenas a dose

de 50mpk, considerando a resistência, já bem estabelecida, dessas cepas aos fármacos

de referência. As doses foram divididas em duas administrações por dia, em função do

tempo de meia vida estimado do E1224 no plasma de camundongos. Sete animais,

infectados por cada cepa foram tratados com a droga de referência no esquema

terapêutico padrão (Bz 100mpk, 20 dias) e seis animais permaneceram não tratados.

Outros 5 animais constituíram o grupo controle negativo, não infectado e não tratado.

Em um segundo conjunto de experimentos, foi avaliada a atividade do E1224 em

combinação com o Bz, no tratamento da fase aguda da infecção de camundongos pela

cepa Colombiana, altamente resistente a ambos os fármacos quando administrados

isoladamente. Nesse experimento foram utilizados dois protocolos diferentes. No

primeiro protocolo, 54 camundongos Swiss, fêmeas, 18-20g foram infectados com

5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Colombiana e o tratamento foi

iniciado no 4o dia após a infecção, isto é, quando a infecção era subpatente.

Considerando o caráter de resistência a drogas dessa cepa, foram testadas as doses mais

altas de cada fármaco, tanto em monoterapia como em combinação. Já no segundo

protocolo, 60 camundongos receberam o mesmo inóculo da cepa Colombiana,

entretanto o tratamento foi iniciado no 10o dia de infecção. Nesse caso, o início do

tratamento se deu no período patente, quando a infecção estava bem estabelecida,

caracterizando um protocolo de maior estringência.

Os grupos experimentais estabelecidos para cada experimento, com um n=7 a

10 animais/grupo são mostrados na tabela 7. Foram ainda incluídos os grupos controle

infectado e não tratado e não infectado.

Material e Métodos

41

Tabela 7: Grupos experimentais utilizados para avaliação do efeito do tratamento com benznidazol

e E1224, isoladamente ou em combinação aos 4 ou 10 dias após a infecção de camundongos pela

cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi.

Bz/Ps

(mpk)

E1224

(0)

E1224

(37.5)

E1224

(50)

Bz (0) CINT Mono Mono

Bz (75) Mono Comb 1 -

Bz (100) Mono - Comb 2

Os animais foram inoculados com a cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 4o ou

10o dia de infecção. mpk- miligramas de droga/quilograma de peso corporal; CINT- grupo infectado e

não tratado; Bz- benznidazol; Mono- grupos tratados com cada fármaco isoladamente; Comb- grupos

tratados com combinação de Bz/E1224 nas doses indicadas.

5.4.4. Avaliação da mortalidade e alterações de peso dos camundongos

A partir do quarto dia pós-infecção, a mortalidade dos animais foi avaliada

diariamente, até 30 dias após o término do tratamento. Os camundongos tratados, bem

como os controles, infectados ou não, foram pesados no dia do início do tratamento, aos

10 dias e no último dia de tratamento. O ganho de peso foi calculado subtraindo-se o

peso inicial (primeiro dia de tratamento) do peso final (último dia de tratamento). Em

alguns experimentos foi ainda avaliada a diferença entre o peso no último dia de

tratamento e 10 dias após o término.

5.4.5. Métodos utilizados para avaliação da eficácia terapêutica

De forma geral, a metodologia utilizada para o controle de cura está descrita na

figura 3 e foi determinada segundo Caldas et al (2009), baseada em dois testes

independentes: exame de sangue a fresco antes e após imunossupressão com

ciclofosfamida (Cy-I), seguida por ensaio de PCR realizado em amostras de sangue dos

animais que não apresentaram reativação da parasitemia. Animais com resultados

negativos nos dois testes foram considerados curados.

Material e Métodos

42

Figura 3: Linha do tempo na avaliação da eficácia da quimioterapia – O exame de sangue a fresco foi

realizado durante e até 30 dias após o tratamento para detectar a ocorrência da supressão e/ou a reativação

natural da parasitemia após o término do tratamento. Os animais que não apresentaram reativação da

parasitemia após a tratamento foram submetidos a 3 ciclos de 50mpk de Ciclofosfamida (Baxter

Oncology, Alemanha) (CY-I), sendo cada ciclo de 4 dias consecutivos, com intervalo de 3 dias entre cada

ciclo. A parasitemia foi avaliada diariamente durante a imunossupressão e até 10 dias após o término dos

ciclos. A PCR foi realizada aos 30 e 180 dias após o tratamento, apenas nos animais que apresentaram

resultados negativos nos testes anteriores. A avaliação do impacto do tratamento nos níveis de IgG e IgG1

(sorologia) foi realizada em amostras coletadas aos 30 e 180 dias após o tratamento.

5.4.5.1. Avaliação da parasitemia

O exame de sangue a fresco foi realizado diariamente desde a detecção da

parasitemia e até 30 dias após o término do tratamento, a fim de determinar a supressão

e/ou a reativação natural da parasitemia. Cinco microlitros de sangue foram coletados

da veia caudal dos camundongos, sendo a quantificação dos parasitos realizada segundo

a técnica descrita por Brener (1962). Os animais que não apresentaram reativação

natural da parasitemia foram submetidos à imunossupressão com ciclofosfamida (Cy-I),

a qual consistiu de três ciclos de administração de ciclofosfamida, por via

intraperitoneal, na dose de 50mg/Kg de peso corporal. Durante cada ciclo o

imunossupressor foi administrado por 4 dias, seguidos de 3 dias de intervalo. A

parasitemia desses animais foi avaliada durante os ciclos de CyI, bem como até 10 dias

após o término da imunossupressão.

Considerou-se supressão da parasitemia a ausência de parasitos, detectados no

exame de sangue a fresco, por um período de no mínimo 5 dias consecutivos e mantido

até o término do tratamento.

5.4.5.2. Extração do DNA e realização da PCR

A extração de DNA genômico do sangue total dos animais infectados por T.

cruzi e tratados ou não, foi realizada utilizando-se o kit comercial Wizard®

GenomicDNA Purification Kit, Promega. O procedimento foi realizado de acordo com

Inoculação com formas

tripomastigotas

20 dias

Tratamento

180 dias

Detecção da parasitemia

30 dias

CY - I

18 dias

Exame de sangue a fresco

PCR e sorologia PCR e sorologia

10 dias

Eutanásia e Coleta

do coração para

avaliar inflamação

Material e Métodos

43

as instruções do fabricante. A amostra consistiu de 200 μL de sangue coletado de cada

animal, adicionado de 35µL de anticoagulante (citrato). Além das amostras dos animais

tratados, em cada extração foram incluídas uma amostra de sangue sabidamente

contaminado por T. cruzi (formas epimastigotas) e uma amostra de sangue de

camundongo não infectado. Após extração, as amostras de DNA foram armazenadas a

4ºC até a realização da PCR e posteriormente armazenadas a -20ºC. Antes da

amplificação, a quantidade de DNA de cada amostra foi dosada e uma alíquota foi

diluída com água ultrapura, a fim de se ajustar a concentração para 25ng de DNA/µL.

Para a realização da PCR, cada amostra foi analisada em duplicata, sendo que a reação

continha 2μL de DNA genômico (50ng), 0,35μM de oligonucleotídeos iniciadores

específicos para a repetição de 195 pares de bases (pb) do DNA de T. cruzi, TCZ-F 5’-

GCTCTTGCCCACAMGGGTGC-3’, onde M = A ou C (InvitrogenTM), e TCZ-R 5’-

CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG-3’, (Moser et al. 1989, modificado por Cummings

& Tarleton 2003) os quais amplificam um produto de 182pb, 5μL de Sybr®Green PCR

Mastermix, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10μL. Separadamente,

para cada amostra (50ng DNA genômico) foi também realizada uma reação em

duplicata para dosar o TNF-α, utilizado como controle endógeno, contendo 0,50μM de

oligonucleotídeos iniciadores TNF-5241 5’- TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA-

3’ e TNF-5411 5’-CAGCA AGCATCTATGCACTTAGACCCC-3’ (Cummings &

Tarleton, 2003), sendo amplificado um produto de 170pb, 5 μL de “Sybr® Green PCR

Mastermix”, e água Milli-Q para um volume final de reação de 10 μL. As reações foram

distribuídas em placas de 96 poços e levadas ao termociclador ABI7300 (Apllied

Biosystems). O programa de termociclagem consistiu de aquecimento a 95oC por 10

minutos, 40 ciclos de 94o C por 15 segundos e 64,3

oC por 1 minuto, com aquisição da

fluorescência a 64,3oC. A amplificação foi imediatamente seguida por um programa de

melting com desnaturação inicial a 95oC por 15 segundos, resfriamento a 60

oC por 1

minuto e aumento gradual de temperatura de 0,3o C/s até 95

oC. Cada placa conteve um

controle negativo da extração (proveniente de camundongo normal), em duplicata e um

controle negativo da PCR, em duplicata, com água no lugar de DNA, para a reação com

oligonucleotídeos iniciadores de T. cruzi e do TNF-α.

Material e Métodos

44

5.4.6. Avaliação da infuência do tratamento específico nos níveis dos anticorpos da

classe IgG e sub-classe IgG1

A dosagem de anticorpos da classe IgG e do isotipo IgG1 foi realizada pela

técnica ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). As amostras de soro foram

obtidas a partir de 500µL de sangue dos animais, coletado no seio venoso retro-orbital,

30 e 180 dias após o tratamento. ELISA foi realizada segundo a metodologia descrita

por Voller et al., (1976) utilizando microplacas de poliestireno de 96 poços (Costar)

sensibilizadas com 100µL/poço de antígeno obtido por lise alcalina de formas

epimastigotas da cepa Y de T. cruzi, cultivadas em meio LIT. O a ntígeno foi diluído em

tampão carbonato de pH 9,6 e as placas incubadas overnight a 4°C. Após a incubação e

lavagem das placas (com solução de NaCl 0.9% contendo 0,5% de Tween 20), as

mesmas foram bloqueadas com 100µL/poço de PBS com soro fetal bovino, a fim de

evitar ligações inespecíficas. Depois de submetidas a uma nova lavagem, realizou-se

nova etapa de incubação com 100µL/poço do soro dos camundongos, na diluição de

1:80, durante 45 minutos a 37°C. As placas foram novamente lavadas e incubadas com

100µL/poço do conjugado anti-IgG e anti- IgG1 de camundongo, marcado com

peroxidase. Após nova lavagem, adicionou-se a solução de substrato (3mg de orto-

fenileno-diamino, OPD, 3µL de água oxigenada 30 volumes e 15mL de tampão citrato-

fosfato) e incubou-se a 37°C por cerca de 10minutos. A reação foi interrompida com

adição de 32µL de H2SO4 a 2,5M e a leitura foi feita em leitor de microplacas, a 490nm,

imediatamente após a adição do ácido.

Em todas as placas foram incluídos 2 soros de camundongos infectados

(controles positivos) e 10 soros de camundongos não infectados (controles negativos).

A absorbância discriminante foi determinada pelos valores médios de absorbância

referentes aos 10 soros controle negativos somados a dois desvios-padrão (Gusmão et

al., 1982). Considerou-se positiva a amostra de soro cuja leitura da absorbância foi

maior que a absorbância discriminante.

5.4.7. Quantificação do infiltrado inflamatório

Aos 180 dias após o término do tratamento os animais foram eutanasiados por

deslocamento cervical. Após incisão torácica, o coração foi removido, lavado em PBS,

pesado e seccionado longitudinalmente. A metade direita foi imediatamente congelada

em nitrogênio líquido e armazenada a -80

o C; essa se destina à extração de DNA e RNA.

Material e Métodos

45

Já a metade esquerda foi imersa em formalina a 10% tamponada por no mínimo 48

horas. Após desidratados e embebidos em parafina, os blocos formados foram cortados

em secções de 4μm de diâmetro, corados pela Hematoxilina & Eosina, para

evidenciação do infiltrado inflamatório.

Foram quantificados os núcleos celulares presentes em 20 imagens aleatórias,

representativas de todas as regiões do miocárdio, percorrendo uma área total de 1,49 x

106 µm

2. As imagens, visualizadas pela objetiva de 40x, foram digitalizadas através de

microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite,versão 2.4.0R1) e processadas

por meio do programa analisador de imagens Leica QwinV3.

5.4.8 Análise estatística

Os resultados dos níveis de parasitemia, níveis de anticorpos, quantificação de

infiltrado inflamatório e peso dos animais foram expressos como a média±erro padrão

para cada conjunto de dados. As três primeiras variáveis foram analisadas pelo teste não

paramétrico Tukey de múltipla comparação. Os dados de peso foram avaliados pelo

teste T de Studant. Os dados foram considerados significativos quando a probabilidade

de erro foi menor que 5% (p< 0,05).

6. Resultados

Resultados

45

6.1- Capítulo 1. Avaliação da atividade anti-T. cruzi do benznidazol em

combinação com posaconazol, de forma concomitante ou sequencial.

Inicialmente foi realizado um experimento para análise do efeito de dose-

resposta no qual animais infectados pela cepa Y foram tratados durante 7 dias com

diferentes doses de benznidazol (Bz) ou posaconazol (Ps), em monoterapia e em

combinação. Três parâmetros foram utilizados para verificar a eficácia dos diferentes

esquemas terapêuticos: supressão da parasitemia, redução da mortalidade e pico

máximo de parasitemia após o tratamento.

Os resultados demonstraram que a dose mais alta de cada composto foi capaz de

suprimir a parasitemia e a mortalidade de todos os camundongos tratados, enquanto no

grupo não tratado observou-se, como esperado, 100% de mortalidade. Para as menores

doses de Bz, a supressão da parasitemia foi verificada apenas nos animais tratados com

50 mpk. De forma similar, a sobrevida nos grupos tratados com essas doses também foi

menor: 66,6% e 33,3% para os grupos tratados com 50 e 25 mpk de Bz,

respectivamente. Pôde-se observar a maior potência do Ps, demonstrada pela supressão

da parasitemia dos animais tratados com todas as doses (20, 10 ou 5 mpk) e pela menor

taxa de mortalidade (Tabela 8).

Resultados

46

Tabela 8: Efeito do tratamento com benznidazol e/ ou posaconazol, durante 7 dias, na supressão da

parasitemia e mortalidade de camundongos infectados pela cepa Y de T. cruzi.

Grupo

No de doses para supressão da

parasitemia1

No de animais vivos

/total2 (%)

CNI - 6/6 (100%)

CINT - 0/6 (0%)

Bz 100mpk 1.83±0.75 6/6 (100%)

Ps 20mpk 1.5±0.74 6/6 (100%)

Bz+Ps (100+20mpk) 1.0±0 6/6 (100%)

Bz 50mpk 1.33±0.51 4/6 (66,7%)

Ps 10mpk 1.17±0.41 6/6 (100%)

Bz+Ps (50+10mpk) 1.4±0.55 5/6 (83,3%)

Bz 25mpk ND 2/6 (33,3%)

Ps 5mpk 1.17±0.41 4/6 (66,7%)

Bz+Ps (25+5mpk) 1.16±0.41 6/6 (100%)

Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103formas tripomastigotas da cepa Y de T.

cruzi e tratados por 7 dias consecutivos, a partir do 4o dia de infecção. mpk-miligramas de

droga/quilograma de peso corporal; Bz- benznidazol; Ps- posaconazol; Bz+Ps- combinações das drogas

nas doses indicadas. CNI- grupo controle não infectado; CINT – grupo controle infectado e não tratado;

ND – não detectado. 1Supressão da parasitemia foi considerada a partir de 5 dias de ausência de

parasitemia patente durante o tratamento. 2Mortalidade considerada até 30 dias após o tratamento.

A análise do efeito do tratamento com as combinações durante 7 dias revelou

que a associação de Bz/Ps foi mais eficiente em controlar a infecção quando comparada

tanto à terapia com cada dose sub-ótima isolada, quanto às doses ótimas de cada

composto. A associação dos fármacos permitiu o aumento da sobrevida dos animais,

bem como a redução dos níveis máximos de parasitemia, quando comparados ao

tratamento com Bz ou Ps em monoterapia (Tabela 8 e figura 4). Especialmente o

esquema empregando Bz- 25mpk+Ps-5mpk, que utilizando um quarto da dose ótima de

cada droga, induziu 100% de sobrevida e redução significativa na parasitemia,

mostrando claramente o benefício da terapia combinada.

Resultados

47

CI

Bz1

00m

pk

Ps

20m

pk

Bz+

Ps(

100+

20m

pk)

Bz5

0mpk

Ps1

0mpk

Bz+

Ps(

50+1

0mpk)

Bz2

5mpk

Ps

5mpk

Bz+

Ps(

25+5

mpk)

0

200000

400000

600000

800000.0

1000000.0

1200000.0

1400000.0

1600000.0

Para

sit

os/0

,1m

L d

e s

an

gu

e

* * *

Figura 4: Efeito do tratamento com posaconazol e benznidazol isoladamente ou em combinação

sobre a parasitemia. Número máximo de formas tripomastigotas detectadas no sangue periférico de

camundongos infectados pela cepa Y de T. cruzi e tratados com 25, 50 ou 100mpk de benznidazol (Bz)

ou 5, 10 ou 20mpk de posaconazol (Ps) isoladamente ou em combinação, por 7 dias consecutivos. CI-

grupo controle infectado e não tratado. mpk- miligramas de droga por quilograma de peso corporal. *

indica diferença significativa em relação ao tratamento com as monoterapias nas mesmas doses.

Este modelo de avaliação (7 dias) possibilitou a análise comparativa da

atividade anti-T. cruzi de cada composto e permitiu inferir sobre o benefício da terapia

combinada. Dessa forma, foi realizado um novo experimento a fim de avaliar a

capacidade da terapia de combinação utilizando Bz e Ps em induzir cura parasitológica.

Dessa forma, diferentes doses de Ps (5, 10 e 20mpk) e Bz (25, 50, 75 e 100 mpk) foram

administradas em monoterapia e diferentes combinações, a camundongos infectados

pela cepa Y. O tratamento foi mantido por 20 dias consecutivos.

Nesse esquema terapêutico, não foram observadas alterações comportamentais,

queda de pelo ou perda de peso decorrentes do tratamento combinado. Em concordância

com o efeito benéfico do tratamento, a mortalidade foi suprimida em todos os animais

tratados, exceto no grupo que recebeu Bz-25mpk, cuja mortalidade foi de 14% (dados

não mostrados). A figura 5 ilustra o ganho de peso observado nos grupos tratados com

as maiores e menores doses de cada composto, isoladamente ou em combinação. Houve

perda de peso acentuada apenas no grupo tratado com a menor dose de Bz (25mpk),

provavelmente devido à alta parasitemia observada nesses animais. Nos demais grupos

as médias de peso foram similares.

Resultados

48

Bz-100 Ps-20 100+20 Bz-25 Ps-5 25+5

-4

-2

0

2

4

Bz-25

mpk mpk mpkBz+Ps

mpk

Bz+Ps

mpk

mpk

Gan

ho

de p

eso

(g

)

Figura 5: Efeito do tratamento com benznidazol e/ou posaconazol no ganho de peso de

camundongos Swiss infectados por T. cruzi. Ganho de peso observado em animais inoculados com a

cepa Y de T. cruzi e tratados com 100mpk e 25mpk de benznidazol (Bz) isoladamente ou em combinação

com 20mpk e 5mpk de posaconazol (Ps), isoladamente ou combinação (Bz+Ps), a partir do 4° dia de

infecção, durante 20 dias consecutivos. mpk-mg/quilograma de peso corporal. O ganho de peso foi obtido

a partir do peso do último dia de tratamento menos o peso do primeiro dia de tratamento.

De maneira similar ao observado no experimento de dose-resposta, o Ps foi

efetivo em induzir a supressão da parasitemia em todas as doses testadas, a partir do

primeiro ou segundo dias de tratamento. Com relação ao Bz, não se identificou

supressão da parasitemia nos animais tratados com 25 mpk.

Novamente, todas as associações resultaram em índices de cura maiores do que

aqueles alcançados com a utilização de cada fármaco administrado em monoterapia e

igual ou maiores quando comparados aos resultados utilizando as doses ótimas de Bz ou

Ps (Figura 6).

Resultados

49

Bz-

100m

pk

Bz-

75m

pk

Bz-

50m

pk

Bz-

25m

pk

Ps-

20m

pk

Ps-

10m

pk

Ps-

5mpk

25+5

mpk

25+1

0mpk

25+2

0mpk

50+5

mpk

50+1

0mpk

50+2

0mpk

75+5

mpk

75+1

0mpk

75+2

0mpk

100+

5mpk

100+

10m

pk

100+

20m

pk

0

20

40

60

80

100

& &

monoterapias Combinações Bz + Ps

Cu

ra p

ara

sit

oló

gic

a (

%)

Figura 6: Atividade anti-T. cruzi de combinações de benznidazol e posaconazol versus

monoterapias. Percentual de cura parasitológica observado em camundongos inoculados com a cepa Y

do Trypanosoma cruzi e tratados, a partir do 4o dia com diferentes doses de benznidazol (Bz) ou

posaconazol (Ps), em monoterapias ou combinação, durante 20 dias consecutivos. mpk- mg/kg de peso

corporal.

Enquanto o tratamento padrão (Bz-100mpk) induziu 70% de cura, a

administração de 75 mpk curou apenas 35% dos animais e as doses de 50 ou 25 mpk de

Bz, não foram suficientes para induzir cura parasitológica. O tratamento com doses sub-

ótimas de Ps foi mais efetivo: a utilização da dose padrão de Ps, 20mpk, induziu 80% de

cura, enquanto Ps-10mpk e Ps-5mpk induziram 43 e 14% de cura, respectivamente. De

forma interessante, quando testadas em combinação, 80% a 90% de eficácia foi

observada em camundongos que receberam 25, 50 or 75 mpk de Bz combinados com 5

ou 10 mpk de Ps. Apenas os animais tratados com Bz-25mpk + Ps-5mpk apresentaram

índice de cura menor (60%) do que o tratamento referência, porém maior do que quando

as drogas foram administradas em doses sub-ótimas. Noventa a 100% de cura foi

detectada em camundongos tratados com a dose ótima de Bz em combinação com 5, 10

ou 20 mpk de Ps.

Considerando os resultados animadores obtidos com a terapia de combinação,

quando as drogas foram administradas concomitantemente, o próximo passo foi avaliar

o efeito da terapia empregando Bz e Ps de forma sequencial. Os resultados sugeriram

que a eficácia do tratamento relacionou-se à ordem de administração dos fármacos:

quando o tratamento foi realizado com 100 mpk de Bz por 10 dias seguido de 20mpk de

Ps durante mais 10 dias, observou-se 80% de cura. De forma surpreendente, ao

inverter-se a ordem de administração das drogas, ou seja, 10 dias de Ps 20mpk seguidos

Resultados

50

de outros 10 dias de Bz 100mpk, o percentual de cura caiu para 30%. Por outro lado, ao

se administrar apenas 100mpk de Bz por 10 dias ou 20mpk de Ps por 10 dias, não foi

observada cura parasitológica (Tabela 9).

Tabela 9: Eficácia do tratamento com a terapia sequencial de benznidazol e posaconazol no

tratamento da infecção pela cepa Y do Trypanosoma cruzi.

Grupo

No de

animais

vivos/no total

No de ESF

negativos/no total

No de ensaios

de PCR

negativos/

no total

Total de testes

negativos/

no total

Não infectado 10/10 10/10 10/10 10/10 (100%)

Infectado e não tratado 0/10 0/10 0/10 0/10 (0%)

Bz100mpk-20dias 10/10 8/10 7/10 7/10 (70%)

Ps20mpk- 20dias 10/10 10/10 8/10 8/10 (80%)

Bz100mpk- 10 dias 7/7 0/7 NR 0/7 (0%)

Ps20mpk- 10 dias 7/7 0/7 NR 0/7 (0%)

Bz 100mpk + Ps20mpk 10/10 10/10 8/10 8/10 (80%)

Ps 20mpk + Bz100mpk 10/10 3/10 3/10 3/10 (30%)

Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103

formas tripomastigotas da cepa Y de

Trypanosoma cruzi e tratados por 10 ou 20 dias a partir do 4o dia de infecção. mpk- miligramas de

droga/quilograma de peso corporal. Bz-100+Ps-20- tratamento com Bz-100mpk por 10 dias seguido do

tratamento com Ps-20mpk por mais 10 dias; Ps-20+Bz-100: Tratamento com Ps-20mpk por 10 dias

seguido do tratamento com Bz-100mpk por outros 10 dias; ESF-exame de sangue a fresco; NR-não

realizado.

Baseado no aumento da eficácia obtido pela terapia combinada/sequencial no

tratamento de animais infectados por uma cepa parcialmente resistente ao Bz, na etapa

seguinte foi avaliada a eficácia do tratamento com as combinações de Bz+Ps na

infecção aguda de animais infectados por uma cepa resistente ao Bz. Foi utilizada a

cepa VL-10 e, devido à alta resistência intrínseca dessa cepa ao Bz, foram administradas

apenas as maiores doses de Ps e Bz. Quando utilizados isoladamente, estes compostos

não foram capazes de induzir cura parasitológica, uma vez que foi observada reativação

natural da parasitemia em 100% dos animais tratados. Por outro lado, detectou-se

reativação da parasitemia em apenas 50% dos animais que receberam Bz-100 mpk

combinados com Ps-10 ou 20 mpk de (Tabela 10).

Resultados

51

Tabela 10: Eficácia do tratamento por 20 dias com benznidazol e/ou posaconazol na fase aguda da

infecção pela cepa VL-10 de Trypanosoma cruzi.

Grupo N

o de animais

vivos/no total

1

No de ESF

negativos/

no total

No de ensaios de

PCR negativos/

no total

Total de testes

negativos/

no total

2(%)

Não infectado 10/10 10/10 10/10 10/10


Bz-100mpk 10/10 0/10 0/10 0/10 (0%)

Ps-403mpk 10/10 1/10 0/1 0/10 (0%)

Bz+Ps (100+20mpk) 10/10 5/10 3/5 3/10 (30%)

Bz+Ps (50+20mpk) 10/10 0/10 NR 0/10 (0%)

Bz+Ps (100+10mpk) 10/10 5/10 2/5 2/10 (20%)

Bz+Ps (50+10mpk) 10/10 0/10 0/10 0/10 (0%)

Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103 formas tripomastigotas da cepa VL-10 de

Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias a partir do 10o dia de infecção. Bz- benznidazol; Ps-

posaconazol; Bz+Ps- combinações das drogas nas doses indicadas. CNI – grupo controle não infectado;

CINT – grupo controle infectado e não tratado. mpk-miligramas de droga/quilograma de peso corporal.

1 Mortalidade foi avaliada até 30 dias após o tratamento.

2 Total de testes negativos realizados 30 e 180

dias após o tratamento. 340mpk divididos em duas doses diárias de 20mpk cada, durante 20 dias. NR-não

realizado.

Os resultados da PCR foram negativos em 20-30% das amostras de sangue

obtidas dos animais que receberam doses de Bz-100 mpk combinadas com Ps-10 ou 20

mpk. De forma similar ao observado para a cepa Y, todos os tratamentos induziram

redução significativa dos níveis parasitêmicos quando comparados ao grupo controle

infectado e não tratado, entretanto, o número de parasitos detectado nos animais que

receberam as combinações de Bz-100+Ps-10 ou 20mpk foi significativamente menor

(p< 0,001) do que o observado quando as drogas foram adminstradas isoladamente, ou

seja, em monoterapia (Figura 7). Dessa forma, apesar da alta resistência dessa cepa ao

posaconazol, assim como é observado também para os derivados nitroimidazólicos,

como o benznidazol, foi possível observar certo grau de interação entre os fármacos, na

medida em que houve 20 a 30% de cura parasitológica nos grupos tratados com as

combinações desses fármacos.

Resultados

52

Bz-

100m

pk

Ps-

40 m

pk

Bz/Ps(

100+

20 m

pk)

Bz/Ps

(50+

20m

pk)

Bz/Ps(

100+

10m

pk)

Bz/Ps(

50+1

0mpk) C

I0

50

100

150

200

200

600

1000

1400

1800

b b

a

aa

a

c

Pa

ras

ito

s/0

.1 m

L d

e s

an

gu

e x

10

00

Figura 7: Efeito da terapia combinada usando posaconazol e benznidazol na parasitemia de

camundongos infectados pela cepa VL-10. Número máximo de formas tripomastigotas detectadas no

sangue periférico de camundongos infectados com a cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com

100mg/kg de peso corporal (mpk) de benznidazol (Bz) e 10, 20 ou 40-mpk de posaconazol (Ps) por 20

dias consecutivos. CI- grupo controle infectado e não tratado. Letras diferentes indicam diferença

significativa ao nível de p<0,05.

Esses resultados evidenciaram o benefício da terapia combinada entre Bz e Ps no

tratamento da infecção murina por T. cruzi e indicaram a importância da avaliação de

novas estratégias terapêuticas, incluindo a terapia de combinação de fármacos, contra

essa parasitose. Ainda sim, é importante ressaltar que a avaliação de novos

fármacos/estratégias terapêuticas promissoras deve ser feita utilizando diferentes

modelos de infecção, visto que a eficácia terapêutica pode ser marcadamente

influenciada pela cepa do parasito.

Resultados

53

6.2- Capítulo 2. Avaliação da atividade anti- T. cruzi do benznidazol em

combinação com ravuconazol ou seu pró-fármaco (E1224) in vitro e

in vivo

6.2.1 Estudos in vitro

6.2.1.1- Avaliação da atividade do ravuconazol, isoladamente ou em combinação com

o benznidazol, sobre formas epimastigotas das cepas Y e Colombiana de T. cruzi

(i) Otimização da reação colorimétrica utilizando a resazurina

A fim de avaliar a sensibilidade de formas epimastigotas de diferentes cepas de

T. cruzi à terapia combinada empregando benznidazol (Bz) e ravuconazol (Rv), foi

otimizado um protocolo para utilização do indicador colorimétrico de viabilidade e

proliferação celular, a resazurina. Desse modo, inicialmente avaliou-se a reação de

redução da resazurina por formas epimastigotas das duas cepas de T. cruzi utilizadas no

estudo, a fim de determinar o número de parasitos a serem testados, bem como o tempo

de incubação ótimo com o corante. Os dados obtidos para ambas as cepas mostraram

uma correlação significativa (r2 > 0,95; p < 0,05) entre os valores do percentual de

redução do corante e o número de parasitos em todos os tempos avaliados (Figura 8).

A capacidade de redução do corante foi relacionada à cepa utilizada. No

experimento realizado com formas epimastigotas da cepa Colombiana, foi detectado o

percentual máximo na primeira leitura após a adição do corante, ou seja, uma hora após

a adição da resazurina. Dessa forma, não foram realizadas leituras adicionais para essa

cepa. Já nos experimentos utilizando a cepa Y, foram realizadas 3 leituras até que fosse

atingido o percentual de 100% de redução nos poços que continham a maior

concentração de células (Figura 8). Considerando que os parasitos foram incubados por

72 horas antes da adição da resazurina, esse resultado provavelmente está relacionado à

proliferação diferencial dos parasitos de ambas as cepas durante esse período (Figura 8).

Resultados

54

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

20

40

60

80

100

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

20

40

60

80

100

T3T2T1

Número de epimastigotas (x106)/poço

Re

du

çã

o d

a r

esa

zu

rin

a (

%)

ColombianaY

Figura 8: Efeito do número de epimastigotas sobre o percentual de redução do corante resazurina.

Parasitos das cepas Y e Colombiana do Trypanosoma cruzi foram diluídos em série a partir de

1x106parasitos/poço (200µL) e incubados por 72 horas a 28°C. A reação de redução da resazurina foi lida

a cada 1 hora após a adição do corante, até que fosse obtido 100% de redução. T1, T2, T3 – leitura 1, 2 e

3 horas após a adição do corante, respectivamente.

O limite mínimo de detecção da reação, na faixa de tempo analisada, foi de

0,125x106

e 0,0625x106 epimastigotas/mL (concentração inicial) para as cepas Y e

Colombiana, respectivamente, já que para concentrações inferiores a essas, o percentual

de redução foi similar entre as diferentes concentrações.

Considerando os resultados descritos, foi definida a utilização da concentração

de 1x106 parasitos/100 µL (10x10

6/mL) para ambas as cepas e o tempo de leitura de 1 e

3 horas após a adição da resazurina para as cepas Colombiana e Y, respectivamente.

(ii) Definição da IC-50 e efeito da combinação entre Bz e Rv

O protocolo otimizado empregando a resazurina foi utilizado para avaliar o

efeito do tratamento com Rv ou Bz sobre formas epimastigotas das cepas Y e

Colombiana de T. cruzi. As concentrações iniciais de cada composto foram 100µM de

Bz e 50 µM de Rv. Foram testadas 8 diluições seriadas (1:2) de cada composto, em um

período de 72 horas de tratamento. A percentagem de inibição da proliferação do

parasito foi calculada levando-se em consideração a absorbância dos poços contendo

parasitos na ausência dos fármacos, como explicado no item 5.3.4. As linhas de

tendência, baseadas nas médias de absorbância de cada concentração das drogas, foram

Resultados

55

obtidas por fitting sigmoidal dose-resposta (Graph Pad Prism 5) e as curvas estão

apresentadas na figura 9.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

25

50

75

100

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

25

50

75

100

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

25

50

75

100

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

25

50

75

100

Cep

a C

olo

mb

ian

aC

epa

Y

log[benznidazolM]log[ravuconazolM]

Inib

ição

da

pro

life

raçã

o (

%)

IC-50=13,16 M IC-50=15,71 M

IC-50=12,5 M IC-50=21,58 M

Figura 9: Atividade do benznidazol (Bz) e do ravuconazol (Rv) sobre epimastigotas das cepas Y e

Colombiana de Trypanosoma cruzi. 1x106 formas epimastigotas das cepas Y e Colombiana foram

incubadas na presença ou ausência de concentrações descrescentes de benznidazol e ravuconazol, por 72

horas. A atividade tripanocida foi medida pelo teste de redução da resazurina. Cada ponto das curvas de

dose-resposta correnponde à média de 2 experimentos independentes. O cálculo de IC-50 foi realizado

utilizando-se o software CalcuSyn.

Os valores de IC50 do Bz foram similares para ambas as cepas; sendo 21,58

±0,43µM e 15,71±0,53µM para as cepas Y e Colombiana, respectivamente. O Rv

também apresentou um IC-50 semelhante para as cepa Y (12,48±3,19µM) e

Colombiana (13,16±0,94µM).

O próximo passo foi avaliar o efeito do tratamento com combinações de Bz+Rv

sobre epimastigotas da cepa Colombiana, dada a resistência in vivo demonstrada por

essa cepa tanto ao benznidazol quanto ao ravuconazol. Os fármacos foram testados

isoladamente e em 4 diferentes misturas, de acordo com proporções de 5:0; 4:1; 3:2;

2:3; 1:4 e 0:5 partes de benznidazol:ravuconazol. A figura 10 mostra as curvas de dose-

resposta produzidas utilizando a percentagem de inibição da proliferação de

Resultados

56

epimastigotas induzida pelas drogas isoladamente ou em combinação. Na figura 9A

estão representadas as curvas de dose resposta considerando a concentração de Bz em

cada mistura ou isoladamente, e em B, as curvas para o ravuconazol. Nestas curvas,

pode ser observado que a percentagem de inibição produzida por cada composto

isoladamente é sempre menor (mas próximo) ao obtido quando o fármaco é utilizado

em combinação, sugerindo um efeito aditivo.

Figura 10: Efeitos antiproliferativos das combinações de benznidazol e ravuconazol sobre formas

epimastigotas da cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi: curvas dose-resposta. 1x106 formas

epimastigotas da cepa Colombiana foram incubadas na presença ou ausência de concentrações

descrescentes de benznidazol e ravuconazol e diferentes combinações, por 72 horas. As combinações

foram preparadas a partir do método de proporções fixas: 5:0; 4:1; 3:2; 2:3; 1:4 e 0:5 partes de

benznidazol e ravuconazol. A atividade tripanocida foi medida pelo teste de redução da resazurina. Cada

ponto das curvas de dose-resposta correnponde à média de 2 experimentos independentes. O cálculo de

IC-50 foi realizado utilizando-se o software CalcuSyn. Cada ponto é a média de dois experimentos

independentes.

Para confirmar estas observações os resultados foram analisados utilizando o

método de FICs. Este método considera a IC-50 de cada fármaco isoladamente e sua

proporção na combinação. A classificação da natureza da interação foi feita através do

somatório das FICs; se ≤0,5 indicou sinergismo; >4, antagonismo, se entre 0,5 e 4, efeito

aditivo (Tabela 11).

Inib

ição d

a p

rolif

era

ção (

%)

Inib

içã

o d

a p

rolif

era

çã

o (

%)

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0

20

40

60

80

100

Mistura 1 Benznidazoll Mistura 2

Mistura 3 Mistura 4

A

log benznidazol µM

0 1 2 0

20

40

60

80

100

Ravuconazol Mistura 1 Mistura 2

Mistura 3 Mistura 4

B

log ravuconazol nM

Resultados

57

Tabela 11: Efeitos antiproliferativos do benznidazol e ravuconazol em combinação sobre

epimastigotas da cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi: FICs da IC-50.

Fármacos /

Misturas

Média das FICs ±DP – IC-50

FIC Bz+ FIC Rv

FIC Bz

FIC Rv

∑ FICs

Bz

(monotrapia) 1

0

1

Bz+Rv (4+1) 0,75±0,09

0,11±0,12

0,86

Bz+Rv (3+2) 0,73±0,28

0,29±0,17

1,02

Bz+Rv (2+3) 0,59±0,17

0,37±0,37

0,95

Bz+Rv (1+4)* 0,7*

0,45*

1,15*

Rv

(monoterapia) 0

1

1

Média 0,69±0,15

0,30±0,22

0,99

*apenas 1 experimento

A análise das FICs confirmou o perfil que foi observado nas curvas de dose-

efeito; os valores do somatório das FICs para todas as misturas foram superiores a 0,5 e

menores que 4, indicando efeito aditivo.

A figura 11 mostra o isobolograma, que é a representação gráfica da interação

entre Bz e Rv, construído a partir dos valores de FIC da IC-50. Pode-se perceber

novamente que as interações ficaram muito próximas da linha de aditividade.

Resultados

58

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

FIC - Benznidazol

FIC

- R

avu

co

nazo

l

Figura 11– Isobolograma representativo da interação in vitro entre benznidazol e ravuconazol

contra epimastigotas da cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi. Os números na abcissa representam

os FICs da IC50 do ravuconazol e os na ordenada, do benznidazol. Os dados representam a média de 2

experimentos independentes.

6.2.2- Determinação da citotoxicidade dos compostos avaliados e de suas

combinações para a linhagem de células H9c2

Inicialmente foi otimizada a reação com resazurina, a 1 mM, para avaliação da

viabilidade das células H9c2. Para todas as diluições avaliadas, foi observado aumento

da redução do corante de maneira proporcional ao número de células. Entretanto,

correlação mais alta (r > 0,95) foi observada com a utilização de até 1x103 células/poço.

A partir dessa concentração, a redução não se deu de forma linear nos diferentes

períodos de tempo avaliados (Figura 12). Deste modo, a concentração de 1x103

células/poço e o tempo de leitura de 6 horas, foram utilizados na realização dos

experimentos de citotoxicidade.

Resultados

59

Figura 12: Efeito do número de células H9c2 sobre o percentual de redução do corante resazurina.

Células H9c2 foram diluídas em série a partir de 2x103células/poço (200µL) e incubadas a 37°C por 72

horas. A reação de redução da resazurina foi lida a cada 1 hora após a adição do corante, durante 6 horas.

Com o objetivo de validar o experimento de citotoxicidade, células na presença

de concentrações tóxicas de DMSO foram avaliadas em paralelo. O teste da resazurina

foi capaz de identificar essa toxicidade, visto que o percentual de redução das células

em DMSO foi significativamente reduzido. Não foi observada interferência do diluente

ou dos diferentes fármacos na capacidade de redução do corante pelas células. A

utilização de concentrações de até 1µM de Rv não induziu qualquer toxicidade, uma vez

que foram identificados percentuais de redução similares entre as células na presença ou

ausência de Rv. Por outro lado, a maior dose de Bz (200µM), interferiu de forma

significativa na viabilidade celular, induzindo cerca de 30% de inibição na proliferação

das células tratadas quando comparadas às não tratadas. Adicionalmente, não foi

observada toxidade resultante da combinação de Rv+Bz (Figura 13).

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.000

25

50

75

100

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Nº de células (x103)

Re

du

ção

da r

esazu

rin

a (

%)

Resultados

60

CNT

200

100 50 25 1

0.1

0,05

0,02

5

100+

0.1

50+0.

0530

% 3%

0

50

100

150

Bz(M) Rv(nM) Bz+Rv

(M+nM)

DMSO (%)

Re

du

ção

da r

esazu

rin

a (

%)

*

*

*

Figura 13: Efeito da incubação com benznidazol e ravuconazol isoladamente ou em combinação na

viabilidade de células H9c2. Percentual de redução da resazurina por células H9c2 incubadas por 72

horas com diferentes concentrações de benznidazol (Bz), ravuconazol (Rv), com combinações de

benznidazol e ravuconazol (Bz+Rv). O dimetilsulfóxido (DMSO) foi utilizado como controle de morte

celular. CNT – células na ausência de fármacos. A leitura da reação foi feita seis horas após a adição do

corante. * indica diferença significativa, com relação ao controle não tratado, ao nível de p<0,001.

6.2.3. Avaliação da atividade anti-T. cruzi do ravuconazol e benznidazol utilizando

células H9c2 infectadas pela cepa Y

A análise in vitro da eficácia do Rv no tratamento de células H9c2 infectadas

pela cepa Y confirmou a potente atividade anti- T. cruzi deste composto sobre as formas

amastigotas, diferentemente do que foi observado para epimastigotas. A incubação das

células infectadas (percentual mínimo de infecção de 45%) por 72 horas com diferentes

concentrações dos fármacos reduziu, de forma dose-dependente, o número de células

infectadas, resultando numa IC-50 de 0,031 ± 0,01 nM para o Rv e de 2,92±0,54 µM

para o Bz (figura 14).

Resultados

61

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

20

40

60

80

100

log [Benznidazol (M)]

-4 -2 0 20

20

40

60

80

100

log [Ravuconazol (nM)]

Re

du

çã

o n

o p

erc

en

tua

l d

e in

fec

çã

o

Concentração dos fármacos

IC-50= 2,92M IC-50= 0,031nM

Figura 14: Atividade do benznidazol (Bz) e do ravuconazol (Rv) sobre a infecção de células H9c2

pela cepa Y de Trypanosoma cruzi. 1x104 células foram infectadas pela cepa Y e posteriormente

incubadas na presença ou ausência de concentrações decrescentes de benznidazol e ravuconazol, por 72

horas. Cada ponto das curvas de dose-resposta corresponde à média de 2 experimentos independentes. O

IC-50 foi calculado utilizando-se o software CalcuSyn.

O Rv foi também foi muito eficaz em reduzir o percentual de infecção das

células H9c2 infectadas pela cepa Colombiana, sendo o efeito também dependente da

concentração. De forma interessante, o IC-50 observado para essa cepa foi cerca de

vinte vezes maior do que o observado nos experimentos realizados com a cepa Y, mas,

ainda sim em escala subnanomolar (0,62 ± 0,37nM). O valor da IC-50 do Bz foi

4,78±0,72 µM (Figura 15).

Resultados

62

Figura 15: Atividade do benznidazol (Bz) e do ravuconazol (Rv) sobre a infecção de células H9c2

pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi. 1x104 células foram infectadas pela cepa Colombiana e

posteriormente incubadas na presença ou ausência de concentrações descrescentes de benznidazol e

ravuconazol, por 72 horas. Cada ponto das curvas de dose-resposta correnponde à média de 2

experimentos independentes. O cálculo de IC-50 foi realizado utilizando-se o software CalcuSyn.

A partir dos valores de IC-50 obtidos para ambos os fármacos, o próximo passo

foi avaliar a ocorrência de interação resultante do uso do Bz quando combinado ao Rv,

nas células H9c2 infectadas pela cepa Y e Colombiana de T. cruzi. Devido à variação

nos valores de IC-50 para ambas as cepas, as concentrações iniciais usadas no preparo

das misturas foram 0,2nM de Rv e 10µMde Bz para o tratamento das células infectadas

pela cepa Y e 1,2 nM de Rv e 20µM de Bz para a avaliação sobre a cepa Colombiana.

As curvas de dose-resposta contruídas com os dados deste experimento

sugeriram novamente efeito bem próximo da aditividade entre os dois compostos, como

pode observado pela posição da curva de cada composto utilizado isoladamente sempre

abaixo, porém próximo das curvas em combinação (Figura 16).

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50

20

40

60

80

100

log [Benznidazol (M)]

-2 -1 0 1 20

20

40

60

80

100

log [Ravuconazol (nM)]Re

dução

no

pe

rce

ntu

al d

e in

fecção

Concentração dos fármacos

IC-50= 4,78 M IC-50= 0,62 nM

Resultados

63

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.50

20

40

60

80

100

benznidazole

Mistura 1 Mistura 2 Mistura 3 Mistura 4

log da concentração de benznidazol ( M)

Inib

ição

da p

rolife

ração

(%

)

-4 -3 -2 -10

20

40

60

80

100

ravuconazol

Mistura 1 Mistura 2 Mistura 3 Mistura 4

log da concentração de ravuconazol (nM)

Inib

ição

da p

rolife

ração

(%

)

Figura 16: Curvas de dose-resposta representativas da interação in vitro entre ravuconazol e

benznidazol sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y de Trypanosoma cruzi. 1x104 células foram

infectadas pela cepa Y e posteriormente incubadas na presença ou ausência de concentrações

descrescentes de benznidazol e ravuconazol, isoladamente ou em combinação de proporções fixas, por 72

horas. As combinações foram preparadas a partir do método de proporções fixas: 5:0; 4:1; 3:2; 2:3; 1:4 e

0:5 partes de benznidazol e ravuconazol. Cada ponto das curvas de dose-resposta correnponde à média de

2 experimentos independentes. O cálculo de IC-50 foi realizado utilizando-se o software CalcuSyn.

A tabela 12 mostra os valores de FICs e, em concordância com a observação das

curvas de dose-respota, não houve interação entre Rv e Bz, sendo os valores superiores

a 0,5.

Resultados

64

Tabela 12: Efeitos antiproliferativos do benznidazol e ravuconazol em combinação no tratamento

de células H9c2 infectadas pela cepa Y do Trypanosoma cruzi: FICs da IC50.

De maneira similar, o isobolograma representado na figura 17 ilustra o efeito

aditivo entre Bz e Rv.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

FIC- Benznidazol

FIC

-Ravu

co

nazo

l

Figura 17 – Isobolograma representativo da interação in vitro contra amastigotas da cepa Y do

Trypanosoma cruzi. Os números na abcissa representam os FICs da IC50 do ravuconazol e os na

ordenada, do benznidazol. Os dados representam a média de 2 experimentos independentes.

Fármacos /

Misturas

Média das FICs ±DP - IC-50

FIC-Bz+ FIC-Rv

FIC Bz

FIC Rv

∑ FICs

Bz

(monotrapia) 1

0

1

Bz+Rv (4+1) 0,69±0,04

0,12±0,12

0,76

Bz+Rv (3+2) 0,58±0,06

0,25±0,15

0,83

Bz+Rv (2+3) 0,42±0,16

0,44±0,30

0,86

Bz+Rv (1+4) 0,26±0,18

0,72±0,035

0,98

Rv

(monoterapia) 0

1

1

Médias ±DP 0,47±0,15

0,39±0,15

0,86

Resultados

65

Para verificar se a cepa de T. cruzi, especialmente considerando o nível de

resistência ao Bz, poderia ter influência no tipo de interação entre os dois compostos, foi

realizado um novo experimento utilizando a cepa Colombiana. As curvas dose-resposta

apresentadas a seguir sugerem uma interação próxima da aditividade entre os dois

compostos.

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.50

20

40

60

80

100 A

Benznidazol Mistura 1 Mistura 2

Mistura 3 Mistura 4

log da concentração de benznidazol

Inib

ição

da p

rolife

ração

(%

)

-2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.50

20

40

60

80

100

Ravuconazol Mistura 1 Mistura 2

Mistura3 Mistura 4

B

log da concentração de ravuconazol

Inib

ição

da p

rolife

ração

(%

)

Figura 18: Curvas de dose-resposta representativas da interação in vitro entre ravuconazol e

benznidazol sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi. 1x104

células foram infectadas pela cepa Colombiana e posteriormente incubadas na presença ou ausência de

concentrações descrescentes de benznidazol e ravuconazol, isoladamente ou em combinação de

proporções fixas, por 72 horas. As combinações foram preparadas a partir do método de proporções fixas:

5:0; 4:1; 3:2; 2:3; 1:4 e 0:5 partes de benznidazol e ravuconazol. Cada ponto das curvas de dose-resposta

correnponde à média de 2 experimentos independentes. O cálculo de IC-50 foi realizado utilizando-se o

software CalcuSyn.

Os valores calculados de FICs mostrados na Tabela 13 confirmam a observação

acima, sendo os valores de FICs calculados para todas as proporções avaliadas

inferiores a 4, excluindo assim uma antagônica, entretanto, maiores que 0,5. Assim, foi

constatado efeito aditivo entre os dois compostos quando utilizada a cepa Colombiana

para a infecção das células H9c2.

Resultados

66

Tabela 13: Efeitos antiproliferativos do benznidazol e ravuconazol em combinação no tratamento

de células H9c2 infectadas pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi: FICs da IC50

Fármacos /

Misturas

Média das FICs ±DP – IC-50

FIC Bz+ FIC Rv

FIC Bz

FIC Rv

∑ FICs

Bz

(monotrapia) 1

0

1

Bz+Rv (4+1) 0,76±0,19

0,34±0,15

1,10±0,04

Bz+Rv (3+2) 0,75±0,04

0,81±0,37

1,56±0,32

Bz+Rv (2+3) 0,42±0,25

1,05±0,09

1,45±0,16

Bz+Rv (1+4) 0,15±0,07

1,015±0,26

1,16±0,19

Rv

(monoterapia) 0

1

1

Média 0,52±0,29

0,79±0,32

1,31±0,21

Da mesma forma, o isobolograma representado na figura 19 mostra a ausência

de interação entre Bz e Rv, resultando em efeito aditivo.

0.0 0.5 1.00.0

0.5

1.0

FIC - Benznidazol

FIC

- R

avu

co

nazo

l

Figura 19 – Isobolograma representativo da interação in vitro entre benznidazol e ravuconazol

contra amastigotas da cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi. Os números na abcissa representam os

FICs da IC50 do ravuconazol e os na ordenada, do benznidazol. Os dados representam a média de 2

experimentos independentes.

Considerando os valores de IC-50 obtidos para as diferentes misturas de Bz e Rv

e ainda os valores relativos à viabilidade das células H9c2 quando incubadas com esses

Resultados

67

fármacos (Figura 14), são sempre obtidos valores de índice de seletividade superiores a

50, demonstrando a ausência de toxicidade in vitro das combinações de benznidazol e

ravuconazol.

Em conjuntos os resultados evidenciaram a importância do estudo das

combinações de Rv e Bz em modelos de infecção por T. cruzi in vitro. Ainda,

forneceram evidências para a avaliação de combinações de Bz e Rv in vivo, pois apesar

de não haver uma interação sinérgica entre esses compostos, não há também

antagonismo e o efeito aditivo pode ser considerado um efeito positivo.

6.2.2. Avaliações in vivo ravuconazol (E1224- pró-droga) em monoterapia e em

combinação com o benznidazol

Inicialmente foi avaliada a atividade tripanocida do E1224, a pró-droga do

ravuconazol em monoterapia. O primeiro experimento foi desenhado para definir as

doses de E1224 capazes de induzir cura parasitológica em camundongos infectados pela

cepa Y de T. cruzi. Os animais foram tratados por 20 dias consecutivos, a partir do 4o

dia de infecção, utilizando 10, 20, 30, 40 ou 50mpk de E1224; sendo cada dose dividida

em 2 administrações diárias. Essas concentrações de E1224 foram escolhidas com base

nas doses utilizadas por Urbina et al. (2003) e na massa de ravuconazol contida na pró-

droga.

Todas as doses de E1224 testadas (10, 20, 30 40 e 50 mpk) induziram supressão

da parasitemia a partir do primeiro dia de tratamento (Figura 20). O inserto da figura 19

representa as médias de parasitemia quando excluído o grupo infectado e não tratado,

possibilitando assim a visualização da parasitemia dos grupos E1224 e Bz durante todo

o período de tratamento. Em função da potente supressão da parasitemia, o E1224, em

todas as doses avaliadas, garantiu proteção completa contra a mortalidade, sendo o

mesmo efeito observado com o Bz na dose de 100mpk. De forma diferente, 100% dos

animais infectados e não tratados, morreram em um prazo de 18 dias de infecção.

Resultados

68

0 6 12 18 24 300

500

1000

1500

CI E1224-10mpk Bz-100mpk

Dias após a infecção

Pa

ras

ito

s/0

.1 m

L d

e s

an

gu

ex

10

3

0 10 20 300

2

4

6

8

10


Pa

ras

ito

s/0

.1 m

L d

e s

an

gu

ex

10

3

Figura 20: Eficácia do E1224 e Bz em suprimir a parasitemia de camundongos infectados pela cepa

Y do Trypanosoma cruzi. Média e desvio padrão da parasitemia dos animais inoculados pela via

intraperitoneal com 5x103formas tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias

consecutivos, a partir do 4o dia de infecção com E1224 ou Bz. Bz-benznidazol na dose de 100mg/kg de

peso corporal; E1224-pró-fármaco do ravuconazol nas doses de 10 mg/kg de peso corporal (a dose de

10mg/kg é representativa de todas as outras doses de E1224 utilizadas, pois todas induziram a supressão

da parasitemia). CI–grupo controle infectado e não tratado. O inserto representa as médias de parasitemia

para Bz e E1224-10mpk quando excluídas da análise as médias de parasitemia dos animais infectados e

não tratados, a fim de possibilitar a visualização de baixos níveis parasitêmicos.

O tratamento com E1224 foi bem tolerado e não foram observadas reações

adversas, como queda de pelos ou alteração de comportamento. Além disso, ambos os

fármacos protegeram os animais da perda de peso provocada pela infecção. A figura 21

mostra a curva ponderal dos animais tratados com 10 ou 50 mpk de E1224,

comparativamente ao tratamento com Bz e com os animais controle infectados e não

tratados. A partir do 9o dia após a infecção, observou-se uma queda brusca no peso nos

animais não tratados, que coincide com a elevada parasitemia e posterior mortalidade.

Já os animais tratados não apresentaram queda de peso, apenas uma prevenção do ganho

que foi observado para o grupo não infectado. Não houve diferença estatística entre o

ganho de peso dos animais tratados e não infectados. Após o término do tratamento,

houve tendência de maior ganho de peso, especialmente para os animais tratados com a

maior dose de E1224, 50mpk (Figura 21).

Resultados

69

0 5 10 15 20 25 30 35 4020

25

30

35

40

CNI CI

E1224-10mpk E1224-50mpk

Bz


Peso

(g

)

Figura 21: Curva ponderal dos animais tratados com E1224 ou benznidazol. Média e desvio padrão

do peso médio (em gramas) dos animais inoculados pela via intraperitoneal com 5x103

formas

tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a partir do 4o dia de

infecção com E1224 ou Bz. Bz-benznidazol na dose de 100mg/kg de peso corporal; E1224-pró-fármaco

do ravuconazol nas doses de 10 e 50 mg/kg de peso corporal. CI–grupo controle infectado e não tratado.

CNI – grupo controle não infectado. mpk- mg/kg de peso corporal.

Após o tratamento houve reativação natural da parasitemia em um animal

tratado com Bz e um tratado com E1224-50mpk. Após o período de imunossupressão,

detectou-se parasitos circulantes em apenas um animal do grupo tratado com E1224-

20mpk; nos demais não houve reativação da parasitemia (Tabela 14).

A tabela 14 resume os dados de mortalidade e reativação da parasitemia e indica

os resultados dos ensaios de PCR realizados após extração do DNA de amostras de

sangue coletadas 30 e 180 dias após o tratamento. Identificaram-se índices de cura de

71,42% (tratamento com E1224-20 e 40mpk) a 85,72% (tratamento com E1224-30 e

50mpk e Bz-100mpk). A dose de E1224-10mpk induziu 100% de cura demonstrando a

ausência de efeito dose-dependente dentro da faixa de concentrações de E1224

utilizada.

Resultados

70

Tabela 14: Eficácia do tratamento com E1224 ou benznidazol na fase aguda da infecção de

camundongos pela cepa Y de Trypanosoma cruzi.

Grupo N

o de animais

vivos/no total

1

No de ESF

negativos/no total

No de ensaios

de PCR

negativos/no

total

Total de

testes

negativos/

no total

2(%)

Não infectado 7/7 - - -


Bz-100mpk 7/7 6/7 6/6 6/7 (85,7%)

E1224 – 10mpk 7/7 7/7 7/7 7/7 (100%)

E1224 – 20mpk 7/7 6/7 1/6 5/7 (71,4%)

E1224 – 30mpk 7/7 7/7 6/7 6/7 (85,7%)

E1224 – 40mpk 7/7 7/7 5/7 5/7 (71,4%)

E1224 – 50mpk 7/7 6/7 6/6 6/7 (85,7%)


formas tripomastigotas da cepa Y do

Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias a partir do 4o dia de infecção. mpk-miligramas de fármaco/kg

de peso corporal; Bz- benznidazol; 1A mortalidade foi avaliada até 30 dias após o tratamento.

2Total de

testes negativos realizados 30 e 180 dias após o tratamento.

A análise comparativa dos níveis de anticorpos IgG e sub-classe IgG1 anti-T.

cruzi entre os grupos foi realizada em amostras coletadas 30 e 180 dias após o

tratamento. Uma vez que a mortalidade foi de 100% no grupo de animais infectados e

não tratados, dois soros de animais infectados com um subinóculo da cepa Y foram

incluídos quando da realização da técnica de ELISA, a fim de permitir a comparação

com os níveis de anticorpos detectados no soro dos animais tratados. Os níveis de IgG

total 30 dias após o tratamento foram semelhantes entre os diferentes grupos tratados e

significativamente menores (p<0.001) do que aqueles detectados nos soros dos animais

do grupo controle infectado, mas ainda superiores aos detectados no soro dos animais

saudáveis, exceto para os camundongos tratados com 10mpk de E1224, cujos níveis de

IgG foram similares ao grupo não infectado (Figura 22A). Já aos 180 dias após o

tratamento, todos os grupos permaneceram com níveis de IgG menores do que o

observado para os animais infectados e não tratados (p<0,0001); adicionalmente, os

animais tratados com E1224 nas doses de 40 e 50mpk e com Bz-100mpk apresentaram

níveis similares aos observados para os animais saudáveis (Figura 21 A). De forma

diferente, 180 dias após o tratamento, todos os animais tratados apresentaram níveis de

anticorpos da subclasse IgG1 similares aos dos animais saudáveis (p>0.05) e

significativamente menores (p<0.001) do que os níveis detectados no soro dos animais

incluídos no grupo controle infectado, exceto para o grupo tratado com Bz, cujos níveis

Resultados

71

de IgG foram similares aos obsercados para os animais infectados e não tratados (Figura

22B).

Figura 22: Níveis de anticorpos IgG (A) e IgG1 (B), detectados por ELISA, no soro de animais

infectados ou não e tratados com E1224 ou benznidazol, 30 e 180 dias após o tratamento. Os

camundongos foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103formas tripomastigotas da cepa Y do

Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a partir do 4o dia de infecção com E1224 ou Bz.

Bz-benznidazol na dose de 100mg/kg de peso corporal; E1224-pró-fármaco do ravuconazol nas doses de

10, 20, 30, 40 e 50mg/kg de peso corporal. CI–grupo controle infectado e não tratado. DAT- Dias após o

tratamento. Obs: os soros dos animais do grupo controle infectado (CI) foram obtidos de animais

infectados com inóculos baixos da cepa Y. Os * indicam semelhança (p>0.05) com o grupo não infectado

e δ indica diferença (p< 0,001) com relação ao grupo infectado e não tratado para os mesmos períodos de

avaliação.

Em seguida foi avaliado o impacto do tratamento com E1224 e benznidazol no

desenvolvimento/evolução da miocardite induzida pela infecção. Em concordância com

a potente atividade dos fármacos no tratamento da infecção aguda de camundongos

infectados pela cepa Y, níveis similares de núcleos celulares foram quantificados entre

os animais infectados e tratados com E1224 e aqueles não infectados. De forma

diferente, nos animais tratados com Bz o número de núcleos celulares detectados no

tecido muscular cardíaco foi significativamente maior em relação aos animais tratados

com E1224 e aqueles do grupo controle não infectado (Figura 23).

10 20 30 40 50 Bz CI CNI0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

E1224

IgG

- a

bsorb

ância

a 4

90nm

A

**

**

10 20 30 40 50 Bz CI CNI0.0

0.4

0.8

1.2

30DAT 180DAT

IgG

1 -

ab

so

rbâ

ncia

a 4

90

nm

E1224

B

*

*

*

*

*

*

Resultados

72

Figura 23: Número de núcleos celulares no miocárdio de camundongos infectados pela cepa Y e

tratados ou não com benznidazol ou E1224. Os camundongos foram inoculados pela via intraperitoneal

com 5x103formas tripomastigotas da cepa Y do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a

partir do 4o dia de infecção com E1224 ou Bz. Bz-benznidazol na dose de 100mg/kg de peso corporal;

E1224-pró-fármaco do ravuconazol nas doses de 10, 20, 30, 40 e 50-mg/kg de peso corporal. mpk-mg/kg

de peso corporal. CI–grupo controle infectado e não tratado. CNI-grupo controle não infectado e não

tratado. * indica diferença estatística em relação ao grupo não infectado ao nível de p<0,0001.

Considerando a eficácia do E1224 sobre a cepa Y, o passo seguinte foi a

avaliação do efeito do tratamento com E1224 na infecção de camundongos pelas cepas

Colombiana e VL-10, ambas resistentes ao tratamento com Bz.

Uma vez que as cepas Colombiana e VL-10 são resistentes ao tratamento com

Bz, os animais foram tratados com a dose mais alta de E1224, 50mpk. Além disso,

nestes experimentos o tratamento foi iniciado no 4o dia após a infecção, permitindo,

assim, uma avaliação comparativa com resultados da avaliação de outros compostos da

mesma classe, publicados anteriormente por outros autores.

O tratamento com E1224 foi efetivo em suprimir a parasitemia, tanto dos

animais infectados com a cepa Colombiana, quanto naqueles inoculados com a cepa

VL-10, normalmente após a administração da primeira dose do fármaco. Este mesmo

resultado foi observado no tratamento de animais infectados pela cepa Colombiana que

receberam Bz. De forma diferente, nos animais infectados pela cepa VL-10 a supressão

da parasitemia pelo Bz ocorreu apenas a partir do 8o dia de tratamento. Além disso, os

10-m

pk

20-m

pk

30-m

pk

40-m

pk

50-m

pk

BZ-1

00m

pkCNI

0

100

200

300

E1224

*

Nú

me

ro d

e n

úcle

os c

elu

lare

s/1

,5x10

6

m2

Resultados

73

diferentes tratamentos foram eficazes em suprimir a mortalidade dos animais infectados

com a cepa Colombiana (não foi observada mortalidade entre os animais infectados e

não tratados com a cepa VL-10). De forma diferente dos resultados observados no

tratamento dos animais infectados pela cepa Y, após o término do tratamento o parasito

ou o seu DNA foram detectados no sangue de todos os animais infectados pelas cepas

Colombiana e VL-10, indicando que o fármaco avaliado foi ineficaz em induzir cura na

infecção murina causada por essas populações de T. cruzi nos regimes terapêuticos

avaliados. Resultados similares foram observados em relação ao tratamento com Bz,

apesar de ter sido detectado 25% (2 de 8) de cura entre os animais infectados pela cepa

Colombiana (Tabela 15).

Resultados

74

Tabela 15: Eficácia do tratamento com E1224 ou benznidazol na fase aguda da infecção de

camundongos pelas cepas Colombiana e VL-10 de Trypanosoma cruzi.

Grupos experimentais

Parâmetros de Avaliação

No de vivos/ n

o total

Supressão da

Parasitemia

Reativação da

parasitemia ou PCR+2

(%)

Cepa Colombiana

E1224-50mpk 10/10 10/10 10/10 (100%)

Bz-100mpk 8/8 8/8 6/8 (75%)

CI 2/7 0/7 7/7 (100%)

Cepa VL-10

E1224-50mpk 7/7 7/7 7/7(100%)

Bz-100mpk 7/7 7/7 7/7 (100%)

CI 7/7 0/7 7/7 (100%)


formas tripomastigotas das cepas

Colombiana ou VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias a partir do 4o dia de infecção com

50mpk de E1224, 100mpk de benznidazol (Bz). CI – grupo controle infectado e não tratado. mpk-

miligramas de fármaco/kg de peso corporal. 1A mortalidade foi avaliada até 30 dias após o tratamento.

2Total de testes negativos realizados 30 e 180 dias após o tratamento.

Em decorrência da falha terapêutica do E1224 observada nos animais infectados

pelas cepas Colombiana e VL-10, um novo experimento foi realizado para a avaliação

do efeito do tratamento do E1224 em combinação com o Bz em animais infectados pela

cepa Colombiana. Considerando a resistência dessa cepa a ambos os fármacos e aos

resultados da avaliação in vitro mostrada anteriormente, foram escolhidas as maiores

doses e ¾ da maior dose de cada fármaco para a administração combinada. Desta forma,

os animais foram tratados a partir do 4o dia de infecção com 37,5 e 50mpk de E1224,

isoladamente ou associados a 75 e 100mpk de Bz, respectivamente.

O E1224 foi bem tolerado e não se observou queda de pelos ou alterações

comportamentais em nenhum animal. A curva ponderal dos animais submetidos aos

diferentes esquemas terapêuticos mostrou que a média de peso dos animais tratados

com Bz ficou próxima à média observada para os animais não infectados (Figura 24A).

Já o tratamento com E1224 isoladamente foi capaz de prevenir a perda de peso

observada nos animais infectados e não tratados. A utilização de Bz-100 mpk em

combinação com E1224-50mpk, retardou o ganho de peso dos animais nos primeiros 10

dias de tratamento. Entretanto, após o término do tratamento o peso foi recuperado, de

Resultados

75

maneira diferente ao observado nos animais infectados e não tratados. De qualquer

forma, os valores de peso para os animais tratados foram similares aos observados para

os animais não infectados. A figura 24B mostra o ganho de peso dos camundongos após

o tratamento, que foi calculado subtraindo-se o peso no último dia de tratamento do

peso observado 15 dias após o tratamento. Em todos os grupos tratados o ganho de peso

foi significativamente maior quando comparado aos camundongos infectados e não

tratados.

Figura 24: Curva ponderal (A) e ganho de peso (B) dos animais inoculados com a cepa Colombiana

de Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 4o dia com E1224-50mpk e Bz (benznidazol) 100mpk,

isoladamente ou em combinação. Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103

formas tripomastigotas da cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a

partir do 4o dia de infecção com benznidazol e E1224 isoladamente ou em combinação (Bz100+E1224-

50mpk). mpk-miligramas de fármaco/kg de peso corporal; Bz- benznidazol; CI-grupo controle infectado e

não tratado; CNI-grupo controle não infectado e não tratado. O ganho de peso foi calculado através da

diferença do peso 15 dias após o tratamento menos o peso do último dia de tratamento. Letras diferentes

significam diferença estatística; p=0,0032.

O tratamento com E1224 e Bz, tanto isoladamente como em combinação, foi

capaz de suprimir a parasitemia durante o período de tratamento (Figura 25), bem como

proteger todos os animais tratados da mortalidade que acometeu 75% do grupo não

tratado em um período de até 30 dias após o término do tratamento. Entretanto, o

parasito ou o seu DNA foram detectados no sangue periférico dos animais que

receberam os diferentes esquemas de tratamento em monoterapia, exceto em dois dos

animais tratados com 100mpk de Bz. De forma diferente, o tratamento em combinação

induziu cura parasitológica em 40% (4 de 10) e em 100% (10 de 10) dos animais

tratados com 37,5+75mpk ou 50+100mpk de E1224+Bz, respectivamente (Tabela 16).

-6

-4

-2

0

2

4

Bz

100-mpk

E1224

50-mpk

Bz+E1224

100+50-mpk CNI

CI

B

Gan

ho

de p

eso

(g

)

a a

a

b

0 5 10 15 20 25 30 35 4015

20

25

30

35

CI

E1224-50mpk

Bz-100mpk

Bz100+E122450-mpk

CNI

A


Peso

(g

)

Resultados

76

Figura 25: Eficácia do E1224 e Bz, isoladamente ou em combinação, em suprimir a parasitemia de

camundongos infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi. Média e desvio padrão da

parasitemia dos animais inoculados pela via intraperitoneal com 5x103formas tripomastigotas da cepa

Colombiana do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a partir do 4o dia de infecção com

E1224-50mpk e E1224-37,5mpk e/ou Bz-100mpk e Bz-75mpk, isoladamente e em combinação. Bz-

benznidazol; E1224-pró-fármaco do ravuconazol. mpk-mg/kg de peso corporal. CI–grupo controle

infectado e não tratado. O inserto representa as médias de parasitemua dos grupos tratados quando

excluídas as médias do grupo infectado e não tratado.

0 20 40 60

0

750

1500

2250

3000

3750

E1224-50mpkBz 100mpk

Bz-75mpk E1224-37.5mpk Bz+E1224 (75+37.5mpk)

CIBz+E1224 (100+50)mpk

Dias pós-infecção

Tri

po

ma

sti

go

tas

/0.1

mL

de

sa

ng

ue

20 30 40 50 60

0

200

400

600


Tri

po

ma

sti

go

tas

/0.1

mL

de

sa

ng

ue

Resultados

77

Tabela 16: Eficácia do tratamento com E1224 e benznidazol, isoladamente e em combinações, a

partir do 4º dia da infecção de camundongos pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi.


formas tripomastigotas da cepa

Colombiana do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias a partir do 4o dia de infecção. mpk-miligramas

de droga/quilograma de peso corporal; Bz- benznidazol; ND-não detectado.1A mortalidade foi avaliada

até 60 dias após o tratamento. 2

Picos máximos de parasitemia observados até 60 dias de infecção.Todos

os resultados apresentados como média±desvio padrão.

Por outro lado, mesmo quando o tratamento não foi capaz de induzir cura

parasitológica, os níveis de parasitemia observados nos animais tratados foram

significativamente menores (p<0,0001) do que aqueles observados nos animais

infectados e não tratados (Figura 26). Esses resultados demonstram a redução na carga

parasitária induzida pelo tratamento com E1224 e Bz, em monoterapia e em

combinação.

Grupo N

o de vivos/

no total

1

No de dias para

reativação da

parasitemia2

No de resultados de PCR

negativos/no total

Infectado e não

tratado 2/8 - 0/8 (0%)

Bz-100mpk 8/8 24,16±10,89 2/8 (25%)

E1224-50mpk 9/10 28,85±3,98 0/10 (0%)

Bz+E1224

(100+50mpk) 10/10 ND 10/10 (100%)

Bz -75mpk 7/7 19,00±3,60 0/7 (0%)

E1224 - 37.5mpk 7/7 18,40±3,79 0/7 (0%)

Bz +1224

(75+37.5mpk) 1/10 37,75±7,63 4/10 (40%)

Resultados

78

Bz-

75m

pk

E12

24-3

7.5m

pk

E12

24(7

5+37

.5m

pk)

Bz-

100m

pk

E12

24-5

0mpk

E12

24+B

z(50

+100

mpk) C

I0

250

500

750

1000

2000

3000

4000

5000

Para

sit

os/0

,1m

L d

e s

an

gu

ex10

3

*

* * *

*

Figura 26: Atividade anti- T. cruzi do benznidazol e E1224, administrados em monoterapia ou

combinação, a partir do 4º dia de infecção de camundongos pela cepa Colombiana. Os animais

foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103

formas tripomastigotas da cepa Colombiana de

Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a partir do 4o dia após a inoculação, com

benznidazol (100mpk e 75mpk) e E1224 (50mpk e 37,5mpk), isoladamente ou em combinação

(Bz100+E1224-50mpk). mpk-miligramas de fármaco/kg de peso corporal; Bz- benznidazol; CI-grupo

controle infectado e não tratado; CNI-grupo controle não infectado e não tratado. Os * indicam diferença

estatística em relação ao grupo infectado e não tratado ao nível de p<0,0001.

Os resultados das dosagens dos anticorpos da classe IgG e do isotipo IgG1 anti-

T. cruzi nos soros dos animais foram concordantes com aqueles obtidos na avaliação

parasitológica. Tanto os níveis de IgG quanto os de IgG1 se mantiveram estáveis, ou

apresentaram uma ligeira queda nos soros dos animais que apresentaram resultados

negativos nos exames parasitológicos. Além disso, os níveis de absorbância foram

próximos aos detectados nos soros dos animais saudáveis. De forma diferente a

evolução dos níveis de anticorpos nos soros dos animais com resultados positivos nos

testes parasitológicos foi semelhante aos dos animais infectados e não tratados,

mostrando uma tendência de elevação após o tratamento (Figura 27 A e B).

Resultados

79

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Bz- 75mpk E1224- 50mpk E1224- 37.5mpkBz- 100mpk

Bz+E1224

(100+50mpk)

Bz+E1224

(75+37.5mpk)NIC

IgG

- a

bso

rbân

cia

a 4

90 n

m

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

IC

A

30 DAT 180 DAT

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

ab

so

rban

ce 4

92n

m

Bz- 100mpk Bz- 50mpk E1224- 50mpk E1224- 37.5mpkBz- 100mpk

Bz+E1224

(100+50mpk)

Bz+E1224

(75+37.5mpk)

NIC

IgG

1 -

ab

so

rbân

cia

a 4

90 n

m

0.0

0.5

1.0

1.5

ab

so

rban

ce 4

92n

m

IC

B

Figura 27: Impacto do tratamento com benznidazol e/ou E1224, administrado a partir do 4o dia de

infecção, na resposta imune humoral. Níveis de anticorpos IgG (A) e IgG1 (B) detectados no soro dos

animais infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi e tratados com E1224 (50 e 37,5 mpk)

ou benznidazol (100 e 75mpk) em monoterapia e em combinação. O tratamento foi iniciado no 4o dia

após a infecção e administrado por 20 dias consecutivos. 30 DAT- 30 dias após o tratamento (cíerculos

vermelhos); 180DAT – 180 dias após o tratamento (círculos azuis). CNI-grupo controle não infectado,

CINT- grupo controle infectado e não tratado. mpk – mg de fármaco/kg de peso.

Tendo em vista a eficácia terapêutica da combinação de Bz e E1224 no

tratamento da infecção pela cepa Colombiana quando a terapia foi iniciada aos 4 dias

após a inoculação, o passo seguinte foi avaliar os mesmos esquemas terapêuticos

quando utilizados em um protocolo mais estringente. Nesse novo protocolo, o

Resultados

80

tratamento foi iniciado 10 dias após a inoculação, quando a infecção está bem

estabelecida e os animais apresentam níveis ascendentes de parasitemia.

O E1224, de forma similar ao Bz, foi capaz de proteger todos os animais contra

a mortalidade (75% no grupo não tratado) e controlar a parasitemia durante o período de

tratamento, independente do esquema terapêutico utilizado. Não houve diferença

significativa (p>0,01) no número de dias necessário para ocorrer a supressão da

parasitemia nos animais tratados com as diferentes doses, o que ocorreu entre 4 a 6 dias

após o início do tratamento (Figura 28).

0 20 40 60

0

1000

2000

3000

4000

E1224 50mpkBz 100mpk

E1224 - 37.5mpk Bz 75mpk Bz+E1224 (75+37.5)mpk

CIBz+E1224 (100+50)mpk


Tri

po

ma

sti

go

tas

/0.1

mL

de

sa

ng

ue

30 40 50 60

0

50

100

150

200

250


Tri

po

mas

tig

ota

s/0

.1m

L d

e s

an

gu

e

Figura 28: Eficácia do E1224 e Bz, isoladamente ou em combinação, em suprimir a parasitemia de

camundongos infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi. Média e desvio padrão da

parasitemia dos animais inoculados pela via intraperitoneal com 5x103formas tripomastigotas da cepa

Colombiana do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a partir do 10o dia de inoculação,

com E1224-50mpk e E1224-37,5mpk e/ou Bz-100mpk e Bz-75mpk, isoladamente e em combinação. Bz-

benznidazol; E1224-pró-fármaco do ravuconazol. mpk-mg/kg de peso corporal. CI–grupo controle

infectado e não tratado. O inserto representa as médias de parasitemua dos grupos tratados quando

excluídas as médias do grupo infectado e não tratado.

Adicionalmente, os diferentes tratamentos não induziram perda de peso em

nenhum animal, sendo o ganho de peso após o tratamento significativamente maior nos

grupos tratados quando comparados ao grupo controle infectado e não tratado. Por outro

lado, as médias de peso, durante o período avaliado, foram significativamente menores

do que as observadas nos animais saudáveis (Figura 29).

Resultados

81

Bz-

100

E12

24-5

0mpk

Bz+

E12

24 CNI

-2

0

2

4

6

8

CI

Gan

ho

de p

eso

(g

)

Figura 29: Curva ponderal (A) e ganho de peso (B) dos animais inoculados com a cepa Colombiana

de Trypanosoma cruzi e tratados a partir do 10o dia com E1224-50mpk e Bz (benznidazol) 100mpk,

isoladamente ou em combinação. Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103

formas tripomastigotas das cepas Colombiana do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos,

a partir do 10o dia de inoculação, com benznidazol e E1224 isoladamente ou em combinação

(Bz100+E1224-50mpk). mpk-miligramas de fármaco/kg de peso corporal; Bz- benznidazol; CI-grupo

controle infectado e não tratado; CNI-grupo controle não infectado e não tratado. O ganho de peso foi

calculado através da diferença do peso 15 dias após o tratamento menos o peso do último dia de

tratamento.

Apesar da potente supressão da parasitemia (Figura 28) e proteção contra a

mortalidade, detectou-se reativação da parasitemia em todos os animais após o término

do tratamento. De maneira curiosa, nos grupos tratados com E1224, tanto na dose de 50

mpk como 37,5mpk, a reativação ocorreu mais precocemente do que foi observado para

os animais tratados com Bz (Tabela 17).

0 5 10 15 20 25 30 35 4020

25

30

35

40

CI

E1224-50mpk Bz-100mpk Bz+E1224

CNI


Peso

(g

)

Resultados

82

Tabela 17: Efeito do tratamento com benznidazol ou E1224, em monoterapia ou em combinação, a

partir do 10o dia do tratamento de camundongos infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma

cruzi.

Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x10 3formas tripomastigotas da cepa

Colombiana do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias a partir do 10º dia de infecção. mpk-miligramas

de droga/quilograma de peso corporal; Bz- benznidazol;ND-não detectado.1A mortalidade foi avaliada até

30 dias após o tratamento. 2Picos máximos de parasitemia observados até 60 dias de infecção.Todos os

resultados apresentados como média±desvio padrão.

De qualquer forma, os níveis de parasitemia atingidos após a reativação e

avaliados até 30 dias após o término do tratamento, foram significativamente menores

(p<0,0001) do que aqueles observados nos animais não tratados, no mesmo período

(Figura 30).

Grupo No de vivos/

nºtotal1

No de dias para

reativação da

parasitemia2

Nº de resultados de PCR

negativos/nºtotal (%)

Infectado e não

tratado 2/8 - 0/8 (0%)

Bz-100mpk 7/7 22,14±4,94 0/7 (0%)

E1224-50mpk 7/7 10,17±3,50 0/7 (0%)

Bz+E1224

(100+50mpk) 7/7 29,51±3,35 0/7 (0%)

Bz -75mpk 7/7 23,45±4,42 0/7 (0%)

E1224 - 37.5mpk 7/7 10,28±1,11 0/7 (0%)

Bz +1224

(75+37.5mpk) 7/7 28,57±4,85 0/7 (0%)

Resultados

83

Bz-

75m

pk

E12

24-3

7.5m

pk

E12

24(7

5+37

.5m

pk)

Bz-

100m

pk

E12

24-5

0mpk

E12

24+B

z(50

+100

mpk) C

I0

50

100

150

200

250

3000

4000

5000

**

*

*

*

*

Para

sit

os/0

,1m

L d

e s

an

gu

ex106

Figura 30: Atividade anti- Trypanosoma cruzi do benznidazol e E1224, administrados em

monoterapia ou combinação, a partir do 10o dia de infecção de camundongos pela cepa

Colombiana. Os animais foram inoculados pela via intraperitoneal com 5x103

formas tripomastigotas da

cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi e tratados por 20 dias consecutivos, a partir do 10o dia de

infecção com benznidazol (100mpk e 75mpk) e E1224 (50mpk e 37,5mpk), isoladamente ou em

combinação (Bz100+E1224-50mpk). mpk-miligramas de fármaco/kg de peso corporal; Bz- benznidazol;

CI-grupo controle infectado e não tratado; CNI-grupo controle não infectado e não tratado. Os * indicam

diferença estatística em relação ao grupo infectado e não tratado ao nível de p<0,0001.

Também nesta avaliação, a evolução dos níveis de anticorpos anti-T. cruzi da

classe IgG e da subclasse IgG1 no soro dos camundongos foi concordante com os

resultados dos testes parasitológicos. Após o término do tratamento (30 dias após o

tratamento) os níveis de anticorpos foram significativamente menores do que aqueles

detectados no soro dos animais do grupo controle infectado e não tratado. Entretanto,

após este período foi observado um aumento destes anticorpos, que atingiram níveis

similares aos dos animais infectados e não tratados 180 dias após o tratamento (Figura

31 A e B).

Resultados

84

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Bz- 75mpk E1224- 50mpk E1224- 37.5mpkBz- 100mpk

Bz+E1224

(100+50mpk)

Bz+E1224

(75+37.5mpk)CNI

IgG

- a

bso

rbân

cia

a 4

90n

m

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

CINT

A

30 DAT 180 DAT

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

0.0

0.5

1.0

1.5

Bz- 100mpk Bz- 75mpk E1224- 50mpk E1224- 37.5mpkBz- 100mpk

Bz+E1224

(100+50mpk)

Bz+E1224

(75+37.5mpk)

CNI

IgG

1 -

ab

so

rbân

cia

a 4

90 n

m

0.0

0.5

1.0

1.5

CINT

B

Figura 31: Impacto do tratamento com benznidazol e/ou E1224, administrado a partir do 10o dia de

infecção, na resposta imune humoral. Níveis de anticorpos IgG (A) e IgG1 (B) detectados no soro dos

animais infectados pela cepa Colombiana de Trypanosoma cruzi e tratados com E1224 (50 e 37,5 mpk)

ou benznidazol (100 e 75mpk) em monoterapia e em combinação. O tratamento foi iniciado no 10o dia

após a infecção e administrado por 20 dias consecutivos. 30DAT- 30 dias após o tratamento (círculos

vermelhos); 180 DAT: 180 dias após o tratamento (círculos azuis). CNI-grupo controle não infectado,

CINT- grupo controle infectado e não tratado. mpk – mg de fármaco/kg de peso.

Os resultados apresentados demonstram a potente atividade do E1224 em

induzir cura parasitológica em animais infectados pela cepa Y de T. cruzi e indicam a

necessidade de utilização de protocolos mais estringentes, especialmente em relação à

escolha das cepas do parasito, ao período da infecção para o início do tratamento e ao

Resultados

85

esquema terapêutico utilizado para a avaliação de atividade anti-T. cruzi de novos

compostos ou novas estratégias de tratamento.

7. Discussão

Discussão

85

Muitos avanços foram alcançados no controle da doença de Chagas em diversas

regiões, entretanto há a necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas mais

eficientes, seguras e acessíveis para o tratamento da infecção por T. cruzi,

particularmente na fase crônica da doença (Urbina et al, 2009).

A pesquisa de novos medicamentos para doença de Chagas foi negligenciada por

muitos anos. Além da falta de interesse por parte das indústrias farmacêuticas devido à

relação histórica da enfermidade com a pobreza, o reconhecimento da associação das

lesões da fase crônica essencialmente a componentes auto-imunes (Cunha Neto e Kalil,

1996), desestimulou os estudos acerca do tratamento etiológico. Porém, a partir da

compreensão da importância da presença de T. cruzi como desencadeador e mantenedor

do processo patológico, aliada a avanços substanciais na compreensão da fisiologia e

bioquímica do agente etiológico, bem como dos mecanismos patogênicos, novo vigor

foi dado aos estudos de novos alvos e estratégias terapêuticas para a parasitose. Nos

últimos anos, diversos estudos apresentaram novos compostos com atividade anti-T.

cruzi promissora, ou mesmo uma nova abordagem para aqueles já existentes, (Nogueira

e Silva et al., 2008; Buckner et al., 2011; 2012; Maximiano et al., 2011; Bahia et al.,

2013; Soeiro et al., 2013).

Particularmente um conjunto de fármacos tem se destacado por apresentar

potente atividade anti-T. cruzi; são os inibidores da C-14α-demetilase (CYP51). O

bloqueio dessa enzima leva à depleção da síntese de ergosterol, um esterol de membrana

que é essencial para o parasito. Além disso, causa o acúmulo de intermediários tóxicos,

sendo letal em organismos unicelulares. T. cruzi depende exclusivamente da síntese

endógena desse lipídio para sua proliferação e sobrevivência, já que não consegue

utilizar o aporte de colesterol do hospedeiro vertebrado. Dentre outros inibidores da

CYP51 (Soeiro et al., 2013; Lepescheva et al., 2011), os compostos azólicos de

gerações mais recentes, desenvolvidos originalmente como antifúngicos para o

tratamento de micoses sistêmicas (Urbina et al., 2009), têm se mostrado promissores

como alternativas para o tratamento da doença de Chagas, por apresentarem potente

atividade anti-T. cruzi e ainda propriedades farmacocinéticas favoráveis para o

tratamento de infecções sistêmicas em mamíferos (Urbina et al 2010). No entanto, há a

possibilidade do desenvolvimento de resistência do patógeno a esses fármacos no caso

do uso prololongado, devido a alguns mecanismos já bem descritos em fungos

(Lepesheva et al., 2007), sendo observada in vitro, através da indução de resistência a

Discussão

86

derivados azólicos mediada pelo cultivo do parasito com fluconazol (Buckner et al.,

1998).

Dois derivados azólicos apresentaram atividade anti-T. cruzi comprovada em

modelos pré-clínicos, o posaconazol e o ravuconazol (e o seu pró-farmaco, E1224).

Diversos estudos já comprovaram a potente atividade anti-T. cruzi do posaconazol in

vitro (Urbina et al., 1998; Molina et al., 2000; Benaim et al., 2006, dos Santos et al.,

2012) ou in vivo (Molina et al., 2000, Cencig et al., 2012, Ferraz et al., 2007; Olivieri et

al., 2010). Esse composto induz efeito curativo nas fases aguda e crônica da infecção

experimental por T. cruzi (Molina et al 2000) e em um caso de infecção humana

(Pinazo et al, 2010). Entretanto, apresenta um alto custo de produção devido à

complexidade da molécula (Diniz et al., 2013) e induz reações adversas que incluem

náuseas, vômito, dor de cabeça, dor abdominal e diarréia (Lepesheva et al, 2013). Já o

ravuconazol apresenta potente atividade anti- T. cruzi in vitro (Urbina et al., 2003);

entretanto, sua ação in vivo no modelo de infecção aguda em camundongos e cães foi

limitada (Urbina et al., 2003; Diniz et al., 2010). O E1224 é o pró-farmaco do

ravuconazol, que, após metabolização hepática, é convertido a ravuconazol, levando ao

aumento da absorção e biodisponibilidade do fármaco (http://www.dndi.org/diseases-

projects/portfolio/azoles-e1224.html).

Os dados promissores acerca da atividade desses compostos em modelos de

avaliação de eficácia terapêutica na infecção por T. cruzi in vitro contribuíram para a

avaliação do posaconazol e do E1224 em ensaios clínicos de fase II (prova de conceito)

para o tratamento etiológico da doença de Chagas crônica

(http://clinicaltrials.gov/show/NCT01377480 e

http://clinicaltrials.gov/show/NCT01489228). Recentemente foram divulgados os

resultados preliminares desses ensaios; embora ambos os compostos tenham presentado

perfis de segurança e tolerabilidade favoráveis, os níveis de falha terapêutica foram

superiores a 90% (Molina, 2012; Torrico, 2013). Esses resultados evidenciaram ainda

mais a necessidade por novas estratégias terapêuticas a serem desenvolvidas utilizando

o arsenal de compostos que apresentem atividade anti-T. cruzi.

Considerando esses antecedentes, o presente trabalho buscou avaliar a eficácia

terapêutica do Bz quando combinado ao posaconazol ou ao E1224 no tratamento da

infecção experimental aguda por T. cruzi. Além disso, foram estudados os efeitos da

utilização combinada do Bz com Rv sobre a infecção por diferentes cepas, in vitro.



Discussão

87

Os resultados evidenciaram o benefício da utilização do Bz em combinação com

o Ps no tratamento da infecção pela cepa Y de T. cruzi e forneceram indícios que a

associação desses fármacos poderia possibilitar a redução nas concentrações dos

fármacos administradas, ou mesmo no número de doses necessárias para a obtenção do

mesmo efeito contra o parasito obtido com as doses ótimas de cada composto. Esta

estratégia poderia permitir a redução da toxicidade e dos custos do tratamento. Além

disso, a utilização de dois fármacos que atuem em diferentes vias metabólicas ou alvos

do parasito contribui para diminuir a chance de desenvolvimento de resistência. Altos

níveis de atividade in vivo foram observados para Bz e Ps, conferindo completa

proteção contra a morte em animais infectados quando utilizados nas doses de 100 e 20

mpk, respectivamente. Foi observado efeito de dose-dependência, já que o tratamento

de camundongos com doses menores foi incapaz de induzir cura parasitológica ou

proteção total contra a morte. Esses dados corroboram os achados de outros autores

(Filardi e Brener, 1987; Molina et al., 2000; Olivieri et al., 2010). Quando uma

avaliação rigorosa do efeito curativo do Bz e do Ps usados isoladamente e em

combinação foi realizada até 180 dias após o término do tratamento, confirmou-se que o

uso concomitante de doses sub-ótimas dos fármacos administradas por 20 dias foi capaz

de prevenir a morte dos animais e induziu cura parasitológica com eficácia igual ou

superior à observada quando os fármacos foram administrados isoladamente, mesmo em

doses ótimas. Especialmente interessantes foram os resultados da combinação das

menores doses de cada fármaco (Ps 5 e Bz 25). A dose de 25mpk de Bz não é eficaz em

induzir cura em animais infectados pela cepa Y e o tratamento com 5mpk de Ps induziu

apenas 10% de cura. Quando essas doses foram administradas em combinação, os

níveis de cura aumentaram para 60%, mostrandoo claramente a interação positiva entre

os dois compostos.

A administração sequencial de doses ótimas pela metade do tempo padrão de

tratamento (10 dias) também revelou eficácia similar à observada com o tratamento

padrão utilizando ambos os fármacos; entretanto, curiosamente o índice de cura foi

relacionado à ordem de administração dos fármacos: a administração de Ps seguida de

Bz reduziu significativamente o índice de cura quando comparado à terapia padrão e ao

esquema inverso (Bz seguido de Ps). As razões para os diferentes índices de cura

observados na terapia sequencial podem ser relacionadas, ao menos em parte, ao

mecanismo de ação de ambos os fármacos. O posaconazol, a exemplo de outros

derivados azólicos, causa morte do parasito através da interferência em estruturas de

Discussão

88

membrana e é especialmente efetivo em afetar as estruturas proliferativas do parasito,

no caso, as formas amastigotas presentes nas células do hospedeiro. Já o Bz exerce

toxicidade sobre o parasito via mecanismos de stress redutivo após ativação de

nitroredutases, entretanto, sua baixa solubilidade em água e propriedades

farmacocinéticas o fazem menos disponível nos tecidos do hospedeiro, sendo

particularmente efetivo na eliminação das formas tripomastigotas do sangue e interstício

(Urbina, 2009). Considerando as características da infecção pela cepa Y, altamente

virulenta, apresentando altos níveis de parasitemia nos primeiros dias de infecção (pico

no 8o dia de infecção), pode-se inferir que o tratamento inicial com Bz, levaria a uma

redução mais rápida da parasitemia. Adicionalmente, o posaconazol, cujas propriedades

farmacocinéticas são mais favoráveis em tecidos de mamíferos, e eficaz contra formas

amastigotas, controlaria de forma mais eficaz o parasitismo tecidual. Corraborando com

os resultados deste estudo, Olivieri et al., (2010) mostraram que o tratamento com Ps

leva a um “clearance” mais rápido do parasitismo cardíaco.

Com relação à cepa VL-10, o tratamento com a combinação de Bz e Ps induziu

cura em apenas 30% dos animais (3 de 10) tratados com as doses mais altas de cada

composto (Bz -100mpk e Ps-20mpk). Considerando a alta resistência dessa cepa aos

fármacos quando utilizados em monoterapia, ainda sim foi evidenciado o benefício da

terapia combinada em reduzir a carga parasitária. De forma diferente, Molina et al

(2000) observaram cerca de 50% de cura parasitológica em camundongos infectados

pela cepa VL-10 e tratados com Ps na fase aguda da infecção. Entretanto, devem ser

consideradas as diferentes metodologias utilizadas pelos dois estudos, tanto no que diz

respeito ao dia de início do tratamento quanto aos métodos para avaliação de cura.

Considerando os resultados promissores da terapia combinada entre Bz e Ps, o

próximo passo foi avaliar a atividade anti-T. cruzi de outro derivado azólico, o E1224,

em combinação com o Bz. A atividade anti-T. cruzi do Rv foi fundamentada pelo

trabalho de Urbina et al. (2003), já que esse composto apresentou potência in vitro igual

ou superior aos mais potentes compostos azólicos testados até então, incluindo o

posaconazol. Entretanto, falhou em induzir cura parasitológica na fase aguda e crônica

de camundongos (Urbina et al., 2003) e na infecção aguda de cães (Diniz et al, 2010),

provavelmente devido às propriedades farmacocinéticas desfavoráveis da droga nesses

modelos experimentais. Especialmente o tempo de meia vida plasmática, que

corresponde a 4 horas em camundongos (Urbina et al., 2003) e a 8 horas em cães (Diniz

et al., 2010), o que indica a necessidade do tratamento com múltiplas doses para manter

Discussão

89

níveis sustentados do fármaco nos tecidos. Por outro lado, as propriedades

farmacocinéticas do ravuconazol no organismo humano são mais favoráveis, sendo o

tempo de meia vida de 120 horas (Grasela et al. 2000). Considerando esses dados e

ainda que o custo de produção do ravuconazol é inferior ao do posaconazol, a DNDi

(Drugs for Neglected Diseases initiative) em parceria com a EISAI (indústria

farmacêutica japonesa), desenvolveu o E1224, o pró-fármaco do ravuconazol.

A fim de fundamentar a utilização da combinação entre E1224 e Bz na infecção

murina, foram realizados inicialmente experimentos in vitro com o Rv (já que o E1224

necessita metabolização hepática para ser convertido a Rv). Utilizou-se o teste

colorimétrico de redução da resazurina para avaliar o efeito da incubação com Rv sobre

formas epimastigotas da cepa Y e Colombiana de T. cruzi. O método se baseia na

redução química do corante por células metabolicamente ativas, provocando uma

mudança de cor que pode ser detectada por colorimetria ou fluorimetria. O’Brien et al

(2000) demonstraram a identidade da resazurina como principal componente do Alamar

Blue, e alta correlação entre os ensaios utilizando os dois reagentes. A resazurina foi

também validada em estudos para avaliação da sensibilidade de formas epimastigotas e

tripomastigotas de T. cruzi e T. brucei a alguns fármacos e mostra alta correlação com

outras metodologias já bem estabelecidas para essas análises, como o MTT (Rolón et

al., 2006; Muélas Serrano et al., 2007; Roldos et al., 2008). Em concordância com esses

dados, neste estudo foi identificada uma correlação linear entre a redução do corante e o

número de parasitos vivos ao longo do tempo. Além disso, o corante mostrou-se eficaz

em identificar a morte dos parasitos em presença dos fármacos e suas combinações.

Como vantagens sobre os métodos tradicionalmente usados, o teste de redução da

resazurina é mais objetivo do que o método de contagem em câmara de Neubauer, pois

apresenta baixo custo, é prático de ser realizado, não necessita de fixação ou

permeabilização e a reação pode ser lida por método colorimétrico ou fluorimétrico.

Os valores de IC-50 do Rv foram de aproximadamente 13µM para ambas as

cepas, bem próximos aos obtidos para o Bz (média 15,5 e 21,7µM para as cepas

Colombiana e Y respectivamente, valores estatisticamente similares). Os valores de IC-

50 do Bz são concordantes com os obtidos em outros estudos (Luna et al., 2009;

Moreno et al., 2010). Entretanto, o Rv apresentou valores de IC-50 muito superiores

àqueles observados por Urbina et al (2003), que identificaram a concentração inibitória

mínima de 300nM de Rv para a cepa Y. No presente estudo, o tempo de incubação dos

parasitos com o fármaco foi de 72 horas, enquanto o trabalho anterior avaliou um

Discussão

90

período de incubação de até 240 horas. Esse fator pode ter sido determinante na

discordância dos resultados, visto que a interrupção da proliferação e subsequente lise

celular induzida pelos derivados azólicos sobre T. cruzi tem sido relacionada com a

depleção completa dos esteróis endógenos do parasito, o que ocorre aproximadamente

após 120 horas de tratamento (Urbina et al., 2003).

Por outro lado, assim como observado por Urbina et al. (2003), o Rv apresentou

potência muito aumentada sobre as formas intracelulares da cepa Y do parasito,

alcançando valores de IC-50 em escala sub-nanomolar e IC-90 abaixo de 1nM. De

forma interessante, o valor de IC-50 do Rv para a cepa Colombiana foi cerca de dez

vezes superior, utilizando o mesmo protocolo de avaliação, mas ainda em escala sub-

nanomolar.

Apesar da diferença nos valores de IC-50 observados para as diferentes formas

evolutivas do parasito, quando os fármacos foram utilizados em monoterapia, resultados

similares foram obtidos em relação à natureza da interação in vitro entre Rv e Bz. Foi

identificado efeito aditivo nos experimentos realizados com as formas epimastigotas da

cepa Colombiana (média do ∑FIC=0,99), bem como em resultado da combinação de Bz

e Rv contra amastigotas intracelulares da mesma cepa (média dos ∑FIC=1,31). De

forma interessante, o efeito do tratamento combinado foi similar quando utilizadas as

formas amastigotas da cepa Y (média do∑FICs=0,86) ou da cepa Colombiana (média

do∑FICs=1,31). Considerando que não houve interação antagônica entre Rv e Bz e

ainda que o efeito aditivo observado pode refletir em aumento da eficácia do tratamento,

os resultados evidenciaram benefício da associação entre Bz e Rv. Por outro lado, como

os exprimentos in vitro não incluem a interpretação de interações farmacodinâmicas e

farmacocinéticas, é importante avaliar o efeito das combinações de Rv e Bz utilizando

um modelo de infecção por T. cruzi in vivo.

As avaliações de combinações de fármacos sobre as formas amastigotas de T.

cruzi in vitro, geralmente não têm sido descritas em detalhes no que diz respeito às

questões metodológicas. Entretanto, a maior parte dos estudos até agora realizados

utiliza o método de checkerboard (Urbina et al., 1988; Lazardi et al., 1990; Urbina et

al., 1993; Santa Rita et al., 2005; Benaim et al., 2006). A estratégia de combinação

empregada por esse método, que depende da pré-determinação dos valores de IC-50

para ambos os fármacos, consiste em manter fixa a concentração de um fármaco,

enquanto varia a do outro e vice e versa. Entretanto, apresenta algumas limitações

técnicas, especialmente no que diz respeito às pequenas variações interexperimento dos

Discussão

91

valores de IC-50. Essas variações podem levar a uma alteração na curva de dose-

resposta, e resultar em valores de IC-50 diferentes daqueles observados previamente,

interferindo assim no cálculo de IC-50 dos fármacos nas diferentes combinações. No

presente trabalho foi descrito detalhadamente o método de combinação utilizando

proporções fixas, que apresenta algumas vantagens com relação ao anterior.

Inicialmente, as curvas de dose-resposta dependem da razão entre a concentração dos

fármacos, e não dos valores de IC-50; desta forma pequenas variações nesses valores

ainda produzirão resultados válidos. Outra vantagem está no largo intervalo de

concentrações no qual são construídas as curvas de dose-resposta, possibilitando níveis

de 0% a 100% de inibição, a depender do número de diluições avaliadas.

Neste estudo, também foi avaliada a atividade in vivo do E1224, utilizando

inicialmente o modelo de infecção aguda pela cepa Y de T. cruzi. Esse modelo permite

uma avaliação inicial das doses dos fármacos capazes de suprimir a parasitemia e

reduzir a mortalidade quando o tratamento é administrado por 7 dias, como foi

realizado nos experimentos com posaconazol. Entretanto, devido aos resultados obtidos

por Urbina et al(2003), cujo índice de cura com a administração desse fármaco foi de

70% para cepa Y, e considerando o fato da pró-droga aumentar a biodospinibilidade do

Rv, os experimentos para definição da dose efetiva foram realizados empregando o

tratamento de 20 dias.

O E1224 foi altamente efetivo em induzir supressão da parasitemia e conferir

100% de proteção contra a mortalidade nos animais infectados pela cepa Y e tratados

com 10 a 50mg/Kg de peso. Os resultados deste estudo mostraram que o pró-fármaco

foi mais eficaz que o composto precursor, o Rv, em induzir cura nos animais infectados

pela cepa Y. Urbina e al. (2003) encontraram 58% de cura ao utilizarem 30mpk de Rv

no mesmo modelo de infecção aguda pela cepa Y de T. cruzi; já para o E1224 esses

valores chegaram de 72% a 100% de cura. Adicionalmente, de forma diferente do que

foi observado para o Rv, o tratamento com E1224 induziu a supressão da parasitemia

nos animais infectados pela cepa Colombiana. É importante ressaltar ainda que no

presente estudo foi utilizada uma metodologia de controle de cura robusta que incluiu

imunossupressão, PCR em tempo real, além da sorologia, enquanto Urbina et al (2003)

utilizaram sub-inoculação em animais, xenodiagnóstico, hemocultura, e anticorpos

líticos anti T. cruzi. De forma interessante, em ambos os estudos ficou evidenciada a

ausência de efeito dose-resposta do fármaco, visto que a dose de 10mpk de E1224 foi

eficaz em induzir 100% de cura parasitológica nos animais, enquanto as demais doses e

Discussão

92

o Bz induziram níveis inferiores a esse; já o tratamento com uma dose diária nas

concentrações de 20, 40 ou 60 mpk de Rv levaram a 70, 40 e 30% de cura,

respectivamente. Entretanto, o E1224 não foi eficaz em induzir cura parasitológica em

animais infectados pelas cepas Colombiana e VL-10 de T. cruzi. Estes resultados foram

similares aos obtidos no tratamento com posaconazol de camundongos infectados pela

cepa VL-10 de T. cruzi (Diniz et al., 2013). De forma diferente, Molina et al (2000)

mostraram que o posaconazol foi capaz de curar 50% dos animais infectados pela cepa

Colombiana quando o tratamento foi iniciado no 4o dia de infecção administrado por 20

dias consecutivos, e 75% quando o tratamento foi administrado por 43 dias,

demonstrando, mais uma vez, a importância do protocolo usado no resultado do

tratamento.

De forma geral, os resultados do tratamento de camundongos infectados pela

cepa Y com E1224 indicaram que esse pró-fármaco foi altamente eficaz em induzir cura

parasitológica e redução da miocardite. Foi demonstrado que nos animais tratados com

E1224, o número de núcleos de células inflamatórias no miocárdio foi similar ao

observado nos animais não infectados. Este mesmo efeito não foi observado nos

animais tratados com Bz. Entretanto, não foi possível comparar esses níveis com os

observados em animais infectados e não tratados, uma vez que a infecção por essa cepa

determina mortalidade dos animais não tratados em um curto prazo de infecção.

Entretanto, estudos recentes do nosso grupo (resultados ainda não publicados)

utilizando o mesmo modelo experimental (cepa Y) mostraram que animais tratados com

diferentes fármacos ou suas combinações e não curados apresentam o número de

núcleos celulares significativamente aumentado no tecido muscular cardíaco. Estes

resultados estão de acordo com estudos anteriores que demostram que a cura ou mesmo

a redução da carga parasitária estão relacionadas com a redução das lesões teciduais e

com os sintomas da doença crônica (Bahia et al., 2013; Diniz et al.,2010; Soeiro et al., ;

Olivieri et al., 2010; Garcia et al. 2005; Hyland et al.2007).

O efeito benéfico da terapia combinada do E1224 com o Bz foi verificado pela

sua eficácia em curar 100% dos camundongos infectados pela cepa Colombiana,

enquanto os fármacos administrados isoladamente não induziram cura (E1224) ou

induziram baixos nívies de cura (25% com o Bz). Entretanto, este resultado foi

dependente do protocolo utilizado, pois quando o tratamento foi iniciado em animais

com uma infecção estabelecida, com parasitemia em níveis ascendentes, o tratamento

combinado também não foi eficaz em curar animais infectados pela cepa Colombiana.

Discussão

93

Todavia, nos animais tratados com os diferentes esquemas terapêuticos e não curados,

os níveis de parasitemia foram significativamente menores do que os observados nos

animais infectados e não tratados.

Esses resultados são particularmente importantes, pois mostram a necessidade

da utilização de protocolos mais estringentes para a avaliação da atividade tripanocida

de novos compostos ou novas estratégias de tratamento, tanto no que se refere ao

controle de cura utilizado quanto ao protocolo de avaliação, que deve considerar as

cepas do parasito, o inóculo, o tempo de infecção para o início do tratamento, bem como

as doses e os esquemas terapêuticos utilizados.

Neste estudo, foi avaliada ainda a interferência dos diferentes tratamentos nos

níveis de anticorpos anti-T. cruzi da classe IgG e da subclasse IgG1. Os níveis dos

anticorpos aos 30 dias após a infecção encontraram-se significativamente menores do

que o observado para os animais não tratados. Resultados similares foram observados

por Hyland et al. (2007) e Guedes et al. (2004), os quais mostraram, em diferentes

modelos experimentais, que o tratamento com Bz administrado na primeira semana

após a infecção reduz a magnitude da resposta humoral. Considerando a hipótese que o

parasito dispara uma cadeia de alterações na resposta imune, nossos resultados são

consistentes com a intensa redução na carga parasitária induzida pelo tratamento com

Bz e/ou E1224 na fase aguda da infecção. Entretanto, em uma fase mais tardia (180 dias

após o tratamento) foi verificado que os níveis de imunoglobulinas detectadas no soro

dos animais foi dependendente da resposta terapêutica. Neste período, os níveis de IgG

e IgG1 foram significativamente menores do que o observado para o grupo controle

infectado apenas nos animais curados. A influência do tratamento precoce da infecção

pela cepa Colombiana também foi observada nos níveis de imunoglobulinas, uma vez

que nos animais tratados com as combinações de fármaco e curados, a produção de

anticorpos foi significativamente reduzida nos dois períodos avaliados.

Considerando que as cepas para as quais o tratamento não foi efetivo são, em

geral, resistentes a múltiplos fármacos (Filardi e Brener, 1987; Urbina et al., 1998;

Soeiro et al. 2013), como por exemplo a cepa VL-10, demonstrada nesse trabalho ser

resistente ao Bz, Ps e E1224, pode-se supor um caráter único de resistência de algumas

cepas a diversas moléculas. No entanto, a cepa Berenice-78 (DTU II), considerada

100% sensível ao tratamento com Bz ou Nfx, foi resistente ao tratamento com o Rv e

com outro derivado azólico, o albaconazol (Guedes et al. 2004; Diniz et al. 2010) no

modelo canino da fase aguda da infecção. A despeito da ausência de resistência in vitro,

Discussão

94

esses achados evidenciam o caráter de resistência natural in vivo de algumas cepas a

diferentes inibidores da biossíntese de ergosterol, a exemplo do que ocorre com o Bz e o

Nfx e indicam mecanismos seletivos no processo de resistência às diferentes classes de

compostos.

O mecanismo de resistência de T. cruzi a diferentes fármacos ainda não foi

elucidado. Entretanto, alguns estudos sugerem que a resistência aos compostos nitro-

heterocíclicos pode estar ligada à baixa expressão ou atividade de nitroredutases, já que

o Bz e o Nfx devem ser ativados por essas enzimas para exercerem os efeitos

citotóxicos (Wilkinson et al., 2007). Por outro lado, alterações na expressão de

superóxido dismutase e de outras enzimas antioxidantes poderiam atuar no processo de

detoxificação, protegendo o parasito dos danos oxidativos da terapia, resultando em um

fenótipo de resistência. Resistência de T. cruzi a derivados azólicos foi induzida in vitro

por Buckner et al (1998); formas amastigotas intracelulares desenvolveram resistência

cruzada a vários azóis, mas não ao Bz, após o cultivo do parasito em meio contendo

fluconazol. O fenótipo de resistência foi estável mesmo na ausência do fluconazol e os

parasitos foram resistentes ao cetoconazol quando testados em camundongos.

Considerando esse cenário, a terapia de combinação apresenta-se promissora. O

potencial da terapia de combinação para aumentar a eficácia e reduzir o risco de

selecionar resistência a drogas é claro, e tem sido introduzido nos últimos anos para o

tratamento de várias parasitoses, como malária, leishmaniose visceral e tripanosomíase

africana (Smithis et al., 2010; Van Griesnven et. al., Checchi et al., 2007). Estudos

usando modelos experimentais tem demonstrado a eficácia da terapia de combinação

usando diferentes classes farmacológicas no tratamento da doença de Chagas. Benaim et

al. (2006) mostraram que o composto antiarrítmico amiodarona, o qual bloqueia a

síntese endógena no nível da esqualeno sintase e rompe a homeostase de Ca2+

tem um

efeito anti-T. cruzi sinérgico quando utilizado com o posaconazol, in vitro e in vivo.

Araújo et al. (2000) demonstraram que o cetoconazol, outro derivado azólico

que inibe a CYP51 de T. cruzi, mas que não apresenta importante atividade curativa na

infecção experimental ou humana por T. cruzi, tem interação sinérgica quando

combinado ao Bz no tratamento da infecção murina aguda. Mais recentemente,

diferentes estudos têm demonstrado aumento de eficácia de diferentes compostos

quando associados ao Nfx ou ao Bz (Faúndez et al., 2008; Batista, et al., 2012).

Os resultados obtidos com a combinação Bz/Ps são especialmente importantes

quando são consideradas as limitações de ambos os fármacos; a maior limitação do Bz

Discussão

95

na fase aguda é a indução de reações adversas que podem levar à descontinuação do

tratamento, possibilitando o desenvolvimento de resistência. Já a maior limitação do Ps

é o alto custo de produção, associado à possibilidade da indução de resistência devido a

tratamentos prolongados. Diante dessas considerações, a possibilidade de redução das

doses para o tratamento da doença de Chagas é muito promissora, pois poderia levar à

diminuição na ocorrência ou intensidade das reações adversas. Considerando os

resultados da terapia sequencial (Bz/Ps), que usou tratamento de curta duração, esse

esquema poderia ser considerado para avaliação da fase aguda em humanos, bem como

os casos de reativação ou doença congênita, especialmente considerando o efeito

terapêutico do Ps é menos dependente do sistema imune quando comparado à do Bz

(Ferraz et al., 2009; 2010).

Com relação ao E1224, apesar de não ser efetivo no tratamento das infecções

pelas cepas Colombiana e VL-10, apresentou excelente atividade no modelo de infecção

aguda pela cepa Y, induzindo cura similar ou superior ao do Bz, com a utilização de

doses inferiores. Adicionalmente, o tempo de meia-vida do E1224 no plasma humano é

de aproximadamente 120 horas (Grasela et al., 2000), muito superior ao observado no

modelo murino. Esse dado é de extrema importância, já que para exercer o efeito

antiparasitário é necessário a manutenção de níveis sustentados do fármaco nos tecidos.

Além disso, essa característica pode apresentar vantagens no regime de doses, na

medida em que as doses não necessitarão ser administradas diariamente. Outro fato

importante, que torna os estudos com o E1224 ainda mais necessários, é o baixo custo

financeiro. Foi firmado um acordo entre DNDi e a EISAI, para o fornecimento desse

fármaco a um baixo custo, visando ao tratamento de populações das zonas endêmicas.

De forma geral, os resultados deste estudo apresentam novas perspectivas para a

quimioterapia da doença de Chagas e enfatizam a necessidade de avaliação de novos

compostos ou estratégias terapêuticas em diferentes modelos de infecção por T. cruzi.

8. Conclusões

Conclusões

97

Os resultados obtidos permitem concluir que:

1- Combinações de doses subótimas de benznidazol e posaconazol induzem

efeito semelhante ou superior às doses ótimas desses fármacos quando

administrados isoladamente no tratamento da infecção aguda por T. cruzi em

modelo murino;

2- A terapia sequencial utilizando benznidazol seguido de posaconazol nas

doses ótimas possibilitou reduzir o número de doses de cada fármaco pela

metade enquanto mantém o efeito terapêutico;

3- Uma vez que o posaconazol e benznidazol são disponíveis comercialmente,

o uso da associação desses compostos deve ser considerado no tratamento da

doença de Chagas humana;

4- Os estudos sobre combinações de fármacos in vitro fornecem importantes

informações para o conhecimento das suas interações farmacológicas,

importantes para o direcionamento dos estudos in vivo;

5- Há efeito aditivo resultante da combinação de ravuconazol e benznidazol in

vitro sobre formas amastigotas intracelulares das cepas Y e Colombiana e

formas epimastigotas da cepa Colombiana de T. cruzi;

6- O composto E1224 apresenta potente atividade anti-T. cruzi, induzindo altos

níveis de cura em animais infectados por uma cepa parcialmente resistente

ao benznidazol e significativa redução da carga parasitária em animais

infectados por cepas resistentes a esse medicamento;

7- O protocolo de tratamento exerce influência marcante no resultado da

terapia, havendo maior chance de cura quando os fármacos são

administrados no período de parasitemia sub-patente após a infecção

experimental de camundongos por T. cruzi;

8- A utilização combinada de benznidazol e E1224 no tratamento da fase aguda

da infecção de camundongos pela cepa Colombiana resulta em efeito aditivo,

induzindo maiores índices de cura ou redução da carga parásitária.

Conclusões

98

9. Referências

Referências bibliográficas

99

AHMED, S.A.; GOGAL, R.M.JR; WALSH, J.E. 1994. A new rapid and simple non-

radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an

alternative to [3h]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Metho. 170; 211-224.

ANDRADE, S.G. 1974. Caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas no

Recôncavo baiano. Rev. Pat. Trop. 1; 65-121.

ANDRADE, A.L.; MARTELLI, C.M.; OLIVEIRA, R.M.; SILVA, S.A.; AIRES, A.I.;

SOUSSUMI, L.M.; COVAS, D.T.; SILVA, L.S.; ANDRADE, J.G.; TRAVASSOS,

L.R.; ALMEIDA, I.C. 2004. "Short report: benznidazole efficacy among Trypanosoma

cruzi-infected adolescents after a six-year follow-up." Am. J. Trop. Med. Hyg. 71 (5)

594-597.

ANDRADE, A.L.; ZICKER, F.; OLIVEIRA, R.M.; SILVA, S.A.; LUQUETTI, A.;

TRAVASSOS, L.R.; ALMEIDA, I.C.; ANDRADE, S.S.; ANDRADE, J.G.;

MARTELLI, C.M.T. 1996. Randomised trial of benznidazole in treatment of early

Trypanosoma cruzi infection. Lancet. 348; 1407-1413.

ANDRADE, S.G.; MAGALHÃES, J.B.; PONTES, A.L. 1985. Evaluation of

chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in mice infected with Trypanosoma

cruzi strains of different types. Bulletin of the World Health Organization, 63 (4): 721-

726.

ANDRADE, S. G.; RASSI, A.; MAGALHÃES, J.B.; FERRIOLLI FILHO, F.;

LUQUETTI, AO. 1992. Specific chemotherapy of Chagas disease: a comparison

between the response in patients and experimental animals inoculated with the same

strains. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 86 (6) 624-626.

APT, W.; AGUILERA, X.; ARRIBADA, A.; PÉREZ, C.; MIRANDA, C.; SÁNCHEZ,

G.; ZULANTAY, I.; CORTÉS, P.; RODRIGUEZ, J.; JURI, D. 1998. Treatment of

chronic Chagas disease with Itraconazole and Allopurinol. Am. J. Trop. Med. Hyp. 59

(1) 133-138.

ARAÚJO, M.S.S.; MARTINS-FILHO, AO; PEREIRA, M.E.S.; BRENER, Z. 2000. A

combination of benznidazole and ketoconazole enhances efficacy of chemotherapy of

experimental Chagas disease. J. Antimicrob. Chemother. 45; 819-824.

AYO, C.M.; DALALIO, M.M.; VISENTAINER, J.E.; REIS, P.G.; SIPPERT, EÂ.;

JARDULI, L.R.; ALVES, H.V.; SELL, A.M. 2013. Genetic susceptibility to Chagas

disease: an overview about the infection and about the association between disease and

the immune response genes. Biomed. Res. Int. 284729.

BAHIA, M.T.; ANDRADE, I.M.; MARTINS, T.A.F.; NASCIMENTO, A.F.D.S.;

DINIZ, L.F. 2012. Fexinidazole: A Potential New Drug Candidate for Chagas Disease.

PLoS Negl. Trop. Dis. 6(11).

BAHIA-OLIVEIRA, L. M.; GOMES, J.A.; CANÇADO, J.R.; FERRARI, T.C.;

LEMOS, E.M.; LUZ, Z.M.; MOREIRA, M.C.; GAZZINELLI, G; CORREA-

OLIVEIRA, R. 2000. Immunological and clinical evaluation of chagasic patients

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Rassi%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Magalhaes%20JB%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ferriolli%20Filho%20F%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Luquetti%20AO%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ayo%20CM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dalalio%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Visentainer%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reis%20PG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sippert%20E%C3%82%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jarduli%20LR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Alves%20HV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sell%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24069594

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24069594


100

subjected to chemotherapy during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection 14-30

years ago. J.Infect.Dis. 182.2 : 634-38.

BATISTA D.G.; BATISTA, M.M.; DE OLIVEIRA, G.M.; BRITTO, C.C.;

RODRIGUES, A.C.; SOEIRO, M.N. 2012. Combined treatment of heterocyclic

analogues and benznidazole upon Trypanosoma cruzi in vivo. PLoS One 6(7):e22155.

BARRETT, M.P.; BURCHMORE, R.J.; STICH, A.; LAZZARI, J.O.; FRASCH, A.C.;

CAZZULO, J.J.; KRISHNA, S. 2003. The trypanosomiases. Lancet. 362; 1469-1480.

BELTRAO, B. 2009. Investigation of two outbreaks of suspected oral transmission of

acute Chagas disease in the Amazon region, Para State, Brazil, in 2007. Trop. Doct. 39;

231–232.

BENAIM, G.; SANDERS, J.M.; GARCIA-MARCHÁM, Y.; COLINA, C.; LIRA, R.;

CALDEIRA, A.R.; PAYARES, G.; SANOJA, C.; BURGOS, J.M.; LEON-ROSSELL,

A.; CONCEPCION, J.L.; SCHIJMAN, A.G.; LEVIN, M.; OLDFIELD, E.; URBINA

JA. 2006. Amidarone has intrinsic anti-Trypanosoma cruzi activity and acts

synergistically with posaconazole. J. Med. Chem. 49:892-899.

BERENBAUM, M. C. 1989. What is Synergy? Pharmacol. Rev. 41; 93-141.

BERN, C.; KJOS, S.; YABSLEY, M.J.; MONTGOMERY, S.P. 2011. Trypanosoma

cruzi and Chagas’ Disease in the United States. Clin. Microbiol. Rev. 24 (4) 655–681.

BLANCO, S.B.; SEGURA, E.L.; CURA, E.N.; CHUIT, R.;TULIÁN, L.; FLORES, I.;

GARBARINO, G.; VILLALONGA, J.F.; GÜRTLER, R.E. 2000. Congenital

transmission of Trypanosoma cruzi: an operational outline for detecting and treating

infected infants in north-western Argentina. Trop. Med. Int. Health. 5; 293-301.

BRAGA, M.S.; LAURIA-PIRES, L.; ARGAÑARAZ, E.R.; NASCIMENTO, R.J.;

TEIXEIRA, A.R.L. 2000. Persistent infections in chronic Chagas’ disease patients

treated with anti-Trypanosoma cruzi nitroderivatives. Rev. Inst. Med. Trop. de São

Paulo. 42; 157-161.

BRENER, Z. 1977. Intraspecific Variations in Trypanosoma cruzi: Two Types of

Parasite Populations Presenting Distinct Characteristics. Pan American Health

Organization, Washington.

BRENER, Z. 1987. "Laboratory-acquired Chagas disease: comment”. Trans. R. Soc.

Trop. Med.Hyg. 81(3) 527.

BRENER, Z. 1962. Therapeutic activity and criterion of cure in mice experimentally

infected with Trypanosoma cruzi. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 4; 389-396.

BRENER, Z.; CANÇADO, J.R.; GALVÃO, L.M.; DA LUZ, Z.M.; FILARDI, L.S.;

PEREIRA, M.E.; SANTOS, L.M.; CANÇADO, C.B. 1993. An experimental and

clinical assay with ketoconazole in the treatment of Chagas disease. Mem. Inst.

Oswaldo Cruz. 88; 143-149.


101

BRENER, Z. E CHIARI, E. 1963. Variações morfológicas observadas em diferentes

amostras de Trypanosoma cruzi. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo. 5 (5) 220-224.

BRISSE, S.; VERHOEF, J.; TIBAYRENC, M. 2001. Characterization of large and

small subunit rRNA and mini-exon genes further supports the distinction of six

Trypanosoma cruzi lineages. Int. J. Parasitol. 31; 1218-1226.

BUCKNER, F.S. 2008. Sterol 14-demethylase inhibitors for Trypanosoma cruzi

infections. Adv. Exp. Med. Biol. 625; 61- 80.

BUCKNER, F.S.; URBINA, J.A. 2012. Recent developments in sterol 14-demethylase

inhibitors for Chagas disease. Internat. Journal for Parasitol. 2; 236-242.

CAMANDAROBA, E. L.; REIS, E.A.; GONÇALVES, M.S.; REIS, M.G.;

ANDRADE, S.G. 2003. Trypanosoma cruzi: susceptibility to chemotherapy with

benznidazole of clones isolated from the highly resistant Colombian strain.

Rev.Soc.Bras.Med.Trop. 36 (2) 201-209.

CALDAS, I.S.; TALVANI, A.; CALDAS, S.; CARNEIRO, C.M.; DE LANA, M.;

GUEDES, P.M.M.; BAHIA, M.T. 2008. Benznidazole therapy during acute phase of

Chagas disease reduces parasite load but does not prevent chronic cardiac lesions.

Parasitol. Res. 103; 413-421.

CALDAS, S.; SANTOS, F.M.; DE LANA, M.; DINIZ, L.F.; MACHADO-COELHO,

G.L.; VELOSO, V.M.; BAHIA, M.T. 2008. Trypanosoma cruzi: acute and long-term

infection in the vertebrate host can modify the response to benznidazole. Exp. Parasitol.

118; 315-323.

CANÇADO JR. 2002. Long term evaluation of etiological treatment of chagas disease

with benznidazole. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo. 44:29-37.

CHAGAS,C. 1909. Nova Tripanozomíase Humana. Estudo sobre a morfologia e o ciclo

evolutivo do Schizotripanum cruzi. n. gen., n. SP. agente etiológico de nova entidade

mórbida do homem. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 1:159-218.

CARRILLO-MUÑOZ, A.J.; GIUSIANO, G.P.; EZKURRA, P.A.; QUINDÓS, G. 2006.

Antifungal agents: Mode of action in yeast cells. Rev. Esp. Quimioterap. 19 (2); 130-

139.

CARLIER, Y.; DIAS, J.C.P.; LUQUETTI, A.O.; HONTEBEIRYER, M.; TORRICO,

F.; TRUYENS, C. 2002. Trypanosomiase américaine ou maladie de Chagas.

Encyclopedie Médico Chirurgicale. Paris. 8 (505-A) 20-21.

CENCIG, S.; COLTEL, N.; TRUYENS, C.; CARLIER, Y. 2012. Evaluation of

benznidazole treatment combined with nifurtimox, posaconazole or AmBisome® in

mice infected with Trypanosoma cruzi strains. Int. J. Antimicrob. Agents. 40(6) 527-

532.

CHAGAS, C. 1911. Nova entidade mórbida do homem. Resumo geral de estudos

etiológicos e clínicos. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 3(2) 219-275.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Reis%20EA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Gon%C3%A7alves%20MS%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Reis%20MG%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Andrade%20SG%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVCitation

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cencig%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23063742

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Coltel%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23063742

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Truyens%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23063742

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Carlier%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23063742



102

CHAPADEIRO, E. 1999. Clinical evolution and morbi-mortality in Chagas disease.

Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 94(1) 309-310.

CHECCHI, F.; PIOLA, P.; AYIKORU, H.; THOMAS, F.; LEGROS, D. 2007.

Nifurtimox plus Eflornithine for late-stage sleeping sickness in Uganda: a case series.

PLoS Negl. Trop. Dis. 7;1(2):e64

CHIPPAUX, J.P.; CLAVIJO, A.N.; SANTALLA, J.A.; POSTIGO, J.R.; SCHNEIDER,

D.; BRUTUS, L. 2010. Antibody drop in newborns congenitally infected by

Trypanosoma cruzi treated with benznidazole. Trop. Med. and Int. Health. 15; 87-93.

CHOU, T.C. 2006. Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized

Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies.

Pharmacological Reviews. Vol. 58, 3, 623-574.

CHOU TC, TALALAY P. 1984. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the

combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Advances in Enzyme

Regulation. 22; 27-55.

CLARK, C.G.; PUNG, O.J. 1994. Host specificity of ribosomal DNA variation in

sylvatic Trypanosoma cruzi from North America. Mol. Biochem. Parasitol. 66; 175-

179.

CO, E.M.A.; Waters, N.C.; Richard, D.J. A. Dennull, Drew D. Reinbold. 2009.

Assessment of Malaria In Vitro Drug Combination Screening and Mixed-Strain

Infections Using the Malaria Sybr Green I-Based Fluorescence Assay. Antimicrob.

Agents Chemother. 53(6); 2557.

COURA, J.R. 2007. Chagas disease: what is known and what is needed-a background

article. Mem.Inst.Oswaldo Cruz. 102 (1); 113-122.

COURA, J. R.; JUNQUEIRA, A.C.V. 2012. Risks of endemicity, morbidity and

perspectives regarding the control of Chagas disease in the Amazon Region. Mem. Inst.

Oswaldo Cruz, 107(2) 145-154.

CROFT, S.L. 1986. In vitro screens in the experimental chemotherapy of leishmaniasis

and trypanosomiasis. Parasitol Today 2; 64-69.

CUMMINGS, K.L.; TARLETON, R.L. 2003. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi

in host tissue by real-time PCR. Mol.Biochem.Parasitol. 129; 53-59.

CUNHA-NETO E, KALIL J. 1995. Autoimmunity in Chagas' heart disease. Med J. 113(2)

757-66.

DA SILVA, C. F.; BATISTA, M.M.; BATISTA, D.G.J.; DE SOUZA, E.M.; DA

SILVA, P.B.; DE OLIVEIRA, G.M.; MEUSER, M.; SHAREEF, A.R.; BOYKIN,

D.W.; SOEIRO, M.N. 2008. In vitro and in vivo studies of the trypanocidal activity of a

diarylthiophene diamidine against Trypanosoma cruzi. Antimicrob. Agents Chemother.

52; 3307-3314.



103

DE NOYA, B. A. 2010. Large urban outbreak of orally acquired acuteChagas disease at

a school in Caracas, Venezuela. J. Infect. Dis. 201; 1308-1315.

DIAS, E. 1939. O gênero Schizotrypanun Chagas, 1909. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio

de Janeiro.

DIAS, J.C.P. 1992. Epidemiology of Chagas disease (American trpanosomiasis): Its

impact on Transfusion and Clinical Medicine. ISBT, São Paulo 49-80.

DIAS, J. C.; BASTOS, C.; ARAUJO, E.; MASCARENHAS, A.V.; MARTINS, N E.;

GRASSI, F.; SILVA, M.; TATTO, E.; MENDONCA, J.; ARAUJO, R.F.; SHIKANAI-

YASUDA, M.A.; ARAS, R. 2008. Acute Chagas disease outbreak associated with oral

transmission. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 41; 296-300.

DIAS, J.; SCHOFIELD, C.J. 1999. The evolution of Chagas Disease control after 90

years since Carlos Chagas Discovery. Mem Inst Oswaldo Cruz., 94 (1):103-121.

DIAS, J. C.; SILVEIRA, A. C.; SCHOFIELD, C.J. 2002. The impact of Chagas disease

control in Latin America: a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 97; 603-612.

DINIZ, L.F.; CALDAS, I.S.; GUEDES, P.M.M.; CREPALDE, G.; LANA, M.;

CARNEIRO, C.M.; TALVANI, A.; URBINA, J.A.; BAHIA, M.T. 2010. Effects of

ravuconazole treatment on parasite load and immune response in dogs experimentally

infected with Trypanosoma cruzi. Antimicrob. Agent. Chemother. 54; 2979-2986.

DINIZ, L.F.; URBINA, J.A.; DE ANDRADE, I.M.; MAZZETI, A.L.; MARTINS,

T.A.F. 2013. Benznidazole and Posaconazole in Experimental Chagas Disease: Positive

Interaction in Concomitant and Sequential Treatments. PLoS Negl. Trop. Dis. 7(8):

e2367.

DOS SANTOS, P. V., BARRIASA, E. S., SANTOS, J. F. C. A.; BARROS, T. L.;

MOREIRA, A., ULISSES DE CARVALHO, T. M.; URBINA, J. A.; DE SOUZA, W.

2012. Effects of amiodarone and posaconazole on the growth and ultrastructure of

Trypanosoma cruzi. Int. Journal Antimicrob. Agents. 40 (1) 61-71.

DOYLE, P.S.; CHEN, C.K.; JOHNSTON, J.B. 2010. A nonazole CYP51 inhibitor

cures Chagas’ disease in a mouse model of acute infection. Antimicrob. Agents

Chemother. 54; 2480-2488.

DUSCHAK, V.G.; COUTO, A.S. 2007. An insight on targets and patented drugs for

chemotherapy of Chagas disease. Recent. Pat. Antiinfect. Drug Discov. 2; 19-51.

FAÚNDEZ, M.; LÓPEZ-MUNÕZ, R.; TORRES, G.; MORELLO, A.; FERREIRA, J.

2008. Buthionine Sulfoximine Has Anti-Trypanosoma cruzi Activity in a Murine Model

of Acute Chagas’ Disease and Enhances the Efficacy of Nifurtimox. Antimicrob.

Agents Chemother. 52; 1837–1839.

FERRAZ, M.L.; GAZZINELLI, R.T.; ALVES, R.O.; URBINA, J.A.; ROMANHA,

A.J. 2009. Absence of CD4 T Lymphocytes, CD8 T Lymphocytes, or B Lymphocytes

Has Different Effects on the Efficacy of Posaconazole and Benznidazole in Treatment




104

of Experimental Acute Trypanosoma cruzi Infection. Antimicrob. Agents Chemother.

53(1) 174-179.

FERREIRA HO. 1990. Tratamento da forma indeterminada da doença de Chagas com

nifurtimox e benznidazol. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 23; 209-211.

FIELDS, R.D.; LANCASTER, M.V. 1993. Dual-attribute continuous monitoring of cell

proliferation/cytotoxicity. Am. Biotechnol. Lab. 11; 48-50.

FILARDI, L.S.; BRENER, Z. 1987. Susceptibility and natural resistance of

Trypanosoma cruzi strains to drugs used clinically in Chagas disease. Trans. R. Soc.

Trop. Med. Hyg. 81(5) 755-759.

FIVELMAN, Q.L.; ADAGU, I.S.; WARHUST, C.W. 2004. Modified Fixed-Ratio

Isobologram Method for Studying in vitro Interactions between Atovaquone and

Proguanil or Dihydroartemisinin against Drug-Resistant Strains of Plasmodium

falciparum. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (11) 4097- 4102.

FREDERICI, E. E.; ABELMANN, W. H.; NEVA, F. A. 1964. Chronic and Progressive

Myocarditis and Myositis in C3h Mice Infected with Trypanosoma cruzi. Am. J. Trop.

Med. Hyg. 13; 272-280.

FREITAS, J.M.; AUGUSTO-PINTO, L.; PIMENTA, J.R.; BASTOS-RODRIGUES, L.;

GONÇALVES, O.; MACEDO, A.M.; MACHADO, C.R.; PENA, S.D. 2006. Ancestral

Genomes, Sex, and the Population Structure of Trypanosoma cruzi. PLoS Pathog. e26;

226-235.

FURLONG, S.T. 1989. Sterols of parasitic protozoa and helminths. Exp. Parasitol. 68;

482–485.

GARCIA, S.; RAMOS, C.O. SENRA, J.F.V.; VILAS-BOAS, F.; RODRIGUES, M.M.;

CAMPOS-DE-CARVALHO, A.C.; RIBEIRO-DOS-SANTOS, R.; SOARES, M.B.P.

2005. Treatment with benznidazole during the Chronic Phase of Experimental Chagas’

Disease Decreases Cardiac Alterations. Antimicrob. Agents Chemother. 49 (4) 1521-

1528.

GRASELA, D.M.; OLSEN, S.J.; MUMMANENI, V. 2000 Ravuconazole: multiple

ascending oral dose study in healthy subjects. ICAAC Abst; 40:839.

GUEDES, P.M. 2006. Correlação entre as lesões cardíacas e a resposta imune em cães

da raça Beagle infectados experimentalmente com diferentes cepas do Trypanosoma

cruzi. Tese (Doutorado em Parasitologia), Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

GUEDES, P. M.; URBINA, J.A.; DE LANA, M. AFONSO, L.C.; VELOSO, V.M.;

TAFURI, W.L.; MACHADO-COELHO, G.L.; CHIARI, E. BAHIA, M.T. 2004.

Activity of new triazole derivate albaconazole against Trypanosoma (Schizotrypanum)

cruzi in dog host. Antimicrob. Agents Chemother. 48; 4286-4292.

GUREVITZ, J.M.; CEBALLOS, L.A.; GASPE, M.S.; ALVARADO-OTEGUI, J.A.;

ENRI´QUEZ, G.F. 2011. Factors Affecting Infestation by Triatoma infestans in a Rural


105

Area of the Humid Chaco in Argentina: A Multi-Model Inference Approach. PLoS

Negl. Trop. Dis. 5(10): e1349.

HALL, B.S.; WILKINSON, S.R. 2011. Activation of benznidazole by trypanosomal

type I nitroreductases results in glyoxal formation. Antimicrob. Agents Chemother. 56;

115-123.

HALL, M.J.; MIDDLETON, R.F.; E WESTMACOTT, D. 1983. The fractional

inhibitory concentration (FIC) index as a measure of synergy. J. Antimicrob.Chemother.

11; 427-433.

HIGUCHI, M.L. 1995. O parasita e a patogenia da forma crônica da doença de Chagas.

Arq. Bras. Cardiol. 64; 251-254.

HIGUCHI, M.L.; BRITO, T.; REIS, M.M.; BARBOSA, A.; BELLOTI, G.; PEREIRA-

BARRETO, A.C.; PILEGGI, F. 1993. Correlation between Trypanosoma cruzi and

myocardial infiltrate in chronic chagasic myocarditis: light microscopy and

immunohistochemical findings. Cardiovasc. Pathol. 2; 101-106.

HOTEZ, P.J.; DUMONTEIL, E.; CRAVIOTO, M.B.; BOTTAZZI, M.E.; TAPIA-

CONYER, R. 2013. An Unfolding Tragedy of Chagas Disease in North America. PLoS

Negl. Trop. Dis. 7(10); e2300.

HYLAND, K.V.; LEON, J.S.; DANIELS, M.D.; GIAFIS, N.; WOODS, L.M.; BAHK,

T.J.; WANG, K.; ENGMAN, D.M. 2007. Modulation of autoimmunity by treatment of

an infectious disease. Infec.t Immun. 75; 3641–3650.

JACKSON, Y.; ALIROL, E.; GETAZ, L.; WOLFF, H.; COMBESCURE, C.;

CHAPPUIS, F. 2010. Tolerance and safety of nifurtimox in patients with chronic

Chagas disease. Clin. Infect. Dis. 51; 69-75.

JORGE, T.C.A; CASTRO, SL. 2000. Doença de Chagas: manual para experimentação

animal [online]. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ. 368 p. Antropologia e Saúde

collection. ISBN 85-85676-75-2.

KRETTLI, A.U.; BRENER, Z. 1976. Protective effects of specific antibodies in

Trypanosoma cruzi infections. J. Immunol. 116; 755-760.

LANA, M.; LOPES, L.A.; MARTINS, H.R. 2009. Clinical and laboratory status of

patients with chronic Chagas disease living in a vector-controlled area in Minas Gerais,

Brazil, before and nine years after aetiological treatment. Mem. Inst. Oswaldo Cruz.

104; 1139-1147.

LAURIA-PIRES, L.; BRAGA, M.S.; VEXENAT, A.C.; NITZ, N.; SIMÕES-

BARBOSA, A.; TINOCO, D.L.; TEIXEIRA, A.R.L. 2000. Progressive chronic Chagas

heart disease ten years after treatment with anti-Trypanosoma cruzi nitroderivatives.

Am. J. Trop. Med. Hyg. 63; 111-118.

LAZARDI, K.; URBINA, J.A.; DE SOUZA, W. 1990. Ultrastructural alterations

induced by two ergosterol biosynthesis inhibitors, ketoconazole and terbinafine, on


106

epimastigotes and amastigotes of Trypanosoma (schizotrypanum) cruzi. Antimicrob.

Agents Chemother. 34; 2097–2105.

LEPESHEVA, G.I.; HARGROVE, T.Y.; ANDERSON, S.; KLESHCHENKO, Y.;

FURTAK, V.; WAWRZAK, Z.; VILLALTA, F.; WATERMAN, M.R. 2010. Structural

insights into inhibition of sterol 14alpha-demethylase in the human pathogen

Trypanosoma cruzi. J. Biol. Chem. 285; 25582–25590.

LEPESHEVA, G.I.; OTT, R.D.; HARGROVE, T.Y.; KLESHCHENKO, Y.Y.;

SCHUSTER, I.; NES, W.D.; HILL, G.C.; VILLALTA, F.; WATERMAN, M.R. 2007.

Sterol 14alpha-demethylase as a potential target for antitrypanosomal therapy: enzyme

inhibition and parasite cell growth. Chem. Biol. 14; 1283-1293.

LUNA, K.P.; HERNÁNDEZ, I.P.; RUEDA, C.M.; ZORRO, M.M.; CROFT, S.L. 2009.

In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi strains from Santander, Colombia, to

hexadecylphosphocholine (miltefosine), nifurtimox and benznidazole. Biom. 29; 448-

445.

MACEDO, A.M.; MACHADO, C.R.; OLIVEIRA, R.P.; PENA, S.D. 2004.

Trypanosoma cruzi: genetic structure of populations and relevance of genetic variability

to the Pathogenesis of chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 99; 1-12.

MACEDO, A.M.; MARTINS, M.S.; CHIARI, E.; PENA, S.D. 1992. DNA

fingerprinting of Trypanosoma cruzi: a new tool for characterization of strains and

clones. Mol. Biochem. Parasitol. 55; 147-153.

MACHADO-DE-ASSIS, G.F.; DINIZ, G.A.; MONTOYA, R.A.; DIAS, J.C.P.;

COURA, J.R.; MACHADO-COELHO, G.M.C.; ALBAJAR-VIÑAS, P.; TORRES,

R.M.; DE LANA, M. 2013. A serological, parasitological and clinical evaluation of

untreated Chagas disease patients and those treated with benznidazole before and

thirteen years after intervention. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1-8.

MALDONADO, R.A.; MOLINA, J.; PAYARES, G.; URBINA, J.A. 1993.

Experimental chemotherapy with combinations of ergosterol biosynthesis inhibitors in

murine models of Chagas’ disease. Antimicrob. Agents Chemother. 37; 1353–1359.

MANNE, J.M.; SNIVELY, C.S.; RAMSEY, J.M.; SALGADO, M.O.;

BA¨RNIGHAUSEN, T. 2013. Barriers to Treatment Access for Chagas Disease in

Mexico. PLoS Negl. Trop. Dis. 7(10): e2488.

MARIN-NETO, J.A.; RASSI JR, J.; AVEZUM, A.JR.; MATTOS, A.C.; RASSI, A.

2009. The BENEFIT trial: testing the hypothesis that trypanocidal therapy is beneficial

for patients with chronic Chagas heart disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 104 (1) 319-

324.

MAXIMIANO, F.P.; DE PAULA, L.M.; FIGUEIREDO, V.P.; DE ANDRADE,

I.M.; TALVANI, A.; SÁ-BARRETO, L.C.; BAHIA, M.T.; CUNHA-FILHO, M.S.

Benznidazole microcrystal preparation by solvent change precipitation and in vivo

evaluation in the treatment of Chagas disease. Eur J Pharm Biopharm 2011; 78:377-84.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Andrade%20IM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21397015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Andrade%20IM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21397015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Talvani%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21397015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=S%C3%A1-Barreto%20LC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21397015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bahia%20MT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21397015

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cunha-Filho%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21397015


107

McCABE, R.E.; REMINGTON, J.S.; ARAUJO, F.G. 1987. Ketoconazole promotes

parasitological cure of mice infected with Trypanosoma cruzi. Trans. Roy. Soc. Trop.

Med. Hyg. 81; 613-615.

MEIRELLES, M.N.L.; ARAÚJO-JORGE, T.C.; MIRANDA, C.F.; DE SOUZA, W.;

BARBOSA, H.S. 1986. Interaction of T. cruzi with heart muscle cells: ultrastructural

and cytochemical analysis of endocytic vacuole formation and effect upon myogenesis

in vitro. Eur. J. Cell Biol. 41; 198-206.

MILES, M.A.; TOYE, P.J.; OSWALD, S.C.; GODFREY, D.G. 1977. The identification

by isoenzyme patterns of two distinct strain-groups of Trypanosoma cruzi, circulating

independently in a rural area of Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 71; 217-225.

MOLINA, I. 2012. International Congress of Tropical Medicine and Malaria 2012 First

clinical trial with posaconazole and benznidazole for the treatment of chronic Chagas

disease. Disponível em http://ictmm2012.ioc.fiocruz.br/program_25_sept.html

MOLINA, J.; MARTINS-FILHO, O.; BRENER, Z.; ROMANHA, A.J.;

LOEBENBERG, D.; URBINA, J.A. 2000 Activities of the triazole derivative SCH

56592 (posaconazole) against drug-resistant strains of the protozoan parasite

Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi in immunocompetent and immunosuppressed

murine hosts. Antimicrob. Agents Chemother. 44; 150-155.

MOREL, C.; CHIARI, E.; CAMARGO, E.P.; MATTEI, D.M.; ROMANHA, A.J.;

SIMPSON, L. 1980. Strains and clones of Trypanosoma cruzi can be characterized by

pattern of restriction endonuclease products of kinetoplast DNA minicircles. Proc. Natl.

Acad. Sci.U.S.A. 77; 6810-6814.

MORENO, M.; D'AVILA, D.A.; SILVA, M.N.; GALVAO, L.M.; MACEDO, A.M.;

CHIARI, E.; GONTIJO, E.D.; ZINGALES, B. 2010. Trypanosoma cruzi benznidazole

usceptibility in vitro does not predict the therapeutic outcome of human Chagas disease.

Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 105; 918-924.

NEAL, R.A.; VAN BUEREN, J. 1988. Comparative studies of drug susceptibility of

five strains of Trypanosoma cruzi in vivo and in vitro. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.

82; 709–14.

NOBREGA, A. A.; GARCIA, M.H.; TATTO, E.; OBARA, M.T.; COSTA, E.; SOBEL,

J. E ARAUJO,W.N. 2009. Oral transmission of Chagas disease by consumption of açai

palm fruit, Brazil. Emerg.Infect.Dis.15; 653-655.

NUNES, M.C.P.; LOPES DO CARMO, A.S.; ROCHA, M.O.C.; RIBEIRO, A.L. 2012.

Mortality prediction in Chagas heart disease. Exp. Rev. Card. Therapy. 10(9) 1173-

1184.

O'BRIEN, J.; WILSON, I.; ORTON, T.; POGNAN, F. 2000. Investigation of the

Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell

cytotoxicity. Eur J Biochem. 267(17):5421-6.


108

OLIVIERI, B.P.; MOLINA, J.T.; DE CASTROB, S.L.; PEREIRA, M.C.; CALVET,

C.M.; URBINA, J.A.; ARAÚJO-JORGE, T.C. 2010. A comparative study of

posaconazole and benznidazole in the prevention of heart damage and promotion of

trypanocidal immune response in a murine model of Chagas disease. Internat. Journal

Antimicrob. Agents. 36; 79–83.

PEDRIQUE, B.; STRUB-WOURGAFT, N.; SOME, C.; OLLIARO P.; TROUILLER,

P.; FORD, N.; PÉCOUL, B.; BRADOL, J. 2013. The drug and vaccine landscape for

neglected diseases (2000–11): a systematic assessment. The Lancet.

http://dx.doi.org/10.1016/

PRATA, A. 2001. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet

Infect. Dis. 1; 92-100.

PRATA, A.; Dias, J.C.P.; COURA, JR. 2011. The begining of the Disease. Mem. Inst.

Oswaldo Cruz. 44; 6-11.

RAAFLAUB, J. 1980. Multiple-dose kinetics of the trypanosomicide benznidazole in

man. Arzneimittelforschung. 30; 2192-2194.

RAAFLAUB, J.E.; ZIEGLER, W.H. 1979. Single-dose pharmacokinetics of the

trypanosomicide benznidazole in man. Arzneim. Forsch. 29; 1611-1614.

REMME, J.H.F.; FEENSTRA, P.; LEVER, P,R,; MEDICI, A.C.; MOREL, C.M.;

NOMA, M.; RAMAIAH, K.D.; RICHARDS, F.; SEKETELI, A.; SHMINIS, VAN

BRAKEL, W.H.; VASSAL, A. 2006. Tropical diseases targeted for elimination: Chagas

disease, lymphatic filariasis, onchocerciasis and leprosy. Disease Control Piorities in

Developing Countries. 22; 433-447.

ROLÓN, M.; VEIGA, C.; ESCARIO, J. A.; GÓMEZ-BARRIO, A. 2006. Development

of resazurin microtiter assay for drug sensibility testing of Trypanosoma cruzi

epimastigotes. Parasitol. Res. 99; 103–107.

ROMANHA, A.J. 1982. Heterogeneidade enzimática em Trypanosoma cruzi. Tese de

doutorado, Belo Horizonte, UFMG, 110pp.

ROMANHA, A.J.; CASTRO, S.L.; SOEIRO, M.N.; et al. In vitro and in vivo

experimental models for drug screening and development for Chagas disease. Mem.

Inst. Oswaldo Cruz. 105; 233–238.

RUSSOMANDO, G.; DE TOMASSONE, M.M.; DE GUILLEN, I.; ACOSTA, N.;

VERA, N.; ALMIRON, M.; CANDIA, N.; CALCENA, M.F.; FIGUEREDO, A. 1998.

Treatment of congenital Chagas' disease diagnosed and followed up by the polymerase

chain reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg. 59; 487-491.

SALGADO, J.A.; GARCEZ, P.N.; OLIVEIRA, C.A.; GALLIZI, J. 1962. Revisão

clínica atual do primeiro caso humano descrito de doença de Chagas. Rev. Inst. Med.

Trop. São Paulo. 4; 330-337.

SALVATELLA, R.A. 2007. Achievements in controlling Chagas disease in Latin

America. WHO (World Health Organization), Geneva.

http://dx.doi.org/10.1016/


109

SANTA-RITA, R.M.; LIRA, R.; BARBOSA, H.S.; URBINA, J.A.; CASTRO, S.L.

2005. Anti-proliferative synergy of lysophospholipid analogues and ketoconazole

against Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae): cellular and

ultrastructural analysis. Journal Antimicrob. Chemother. 55; 780-84.

SCHIJMAN, A.G.; ALTCHEH, J.; BURGOS, J.M.; BIANCARDI, M.; BISIO, M.;

LEVIN, M.J.; FREILIJ, H. 2003. Aetiological treatment of congenital Chagas'disease

diagnosed and monitored by the polymerase chain reaction. J. Antimicrob. Chemother.

52; 441-449.

SCHLEMPER, B.R.Jr. 1982. Characterization of strains of Trypanosoma cruzi isolated

from pacients wirh different clinical forms of Chagas disease. Rio de Janeiro; s.n; 1982.

131 p. ilus.

SCHMUNIS, G.A. Epidemiology of Chagas disease in nonendemic countries : the role

of international migration.2007. Mem. Inst. Oswaldo Cruz; 102 (1) 75-85.

SCHMUÑIS, G.A.; YADON, Z.E. 2009. Chagas disease: A Latin American health

problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115(1–2) 14-21.

SILVA, L.H.P.; NUSSENZWEIG, V. 1953. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi

altamente virulenta para o camundongo branco. Folia Clin. Biol. 20; 191-203.

SILVA, D.T.A.; MEIRELLES, M.N.S.L.; URBINA, J.A.; PEREIRA, M.C.S. 2006.

Cytoskeleton reassembly in cardiomyocytes infected by Trypanosoma cruzi is triggered

by treatment with ergosterol biosynthesis inhibitors. Int. Journal Antimicrob. Agents.

27; 530-537.

SILVEIRA, C.A.; CASTILHO, E.; CASTRO, C. 2000. Evaluation of a specific

treatment for Trypanosoma cruzi in children, in the evolution of the indeterminate

phase. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 33; 191-196.

SMITHUIS. F.; KYAW, M.K.; PHE, O.; WIN, T.; AUNG, P.P. 2010. Effectiveness of

five artemisinin combination regimens with or without primaquine in uncomplicated

falciparummalaria: an open-label randomised trial. Lancet Infect. Dis. 10(10) 673-681.

SOEIRO, M.N.C.S.; DE DOUZA, E.M.; DASILVA, C.F.; BATISTA, D.G.J.;

BATISTA,M.M.B.; PAVÃO, B.P. 2013. In vitro and in vivo Studies of the Antiparasitic

Activity of Sterol 14_-Demethylase (CYP51) Inhibitor VNI against Drug-Resistant

Strains of Trypanosoma cruzi. Antimicrob. Agents Chemother. 57(9); 4151.

SOSA ESTANI, S.; SEGURA, E.L. 1999. Treatment of Trypanosoma cruzi infection in

the undetermined phase. Experience and current guidelines of treatment in Argentina.

Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 94; 363-365.

SOSA ESTANI, S.; SEGURA, E.L.; RUIZ, A.M.; VELAZQUEZ, E.; PORCEL, B.M.;

YAMPOTIS, C. 1998. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the

indeterminate phase of Chagas’ disease. Am. J. Trop. Med. Hyg. 59; 526-529.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/0001706X/115/1


110

SOUTO, R.P.; ZINGALES, B. 1993. Sensitive detection and strain classification of

Trypanosoma cruzi by amplification of a ribosomal RNA sequence. Mol.

Biochem.Parasitol. 62; 45-52.

STREIGER, M.L.; BARCO, M.L.; FABBRO, D.L.; ARIAS, E.D.; AMICONE, N.A.

2004. Longitudinal study and specific chemotherapy in children with chronic Chagas’

disease, residing in a low endemicity area of Argentina. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 37:

365-375.

SUASNÁBAR, F.; ARIAS, E.; STREIGER, M. 2000. Evolutive behaviour towards

cardiomyopathy of treated (nifurtimox or benznidazole) and untreated chronic chagasic

patients. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo. 42; 99-109.

TARLETON, R.L. 2003. Chagas disease: a role for autoimmunity? Trends. Parasitol.

19; 447-451.

TIBAYRENC, M.; AYALA, F.J. 1988. Isozyme variability in Trypanosoma cruzi, the

agent of Chagas disease: genetical, taxonomical, and epidemiological significance.

Evolution. 277-292.

TOLEDO, M.J.; BAHIA, M.T.; CARNEIRO, C.M.; LANA, M.L. 2003. Chemotherapy

with benznidazole and itraconazole for mice infected with different Trypanosoma cruzi

clonal Genotypes. Antimicrob. Agents Chemother. 47:223-230.

URBINA, J.A. 2009. Chemotherapy of Chagas disease. Curr. Pharm. Des. 8; 287-295.

URBINA, J.A. 2010. Specific chemotherapy of Chagas disease: Relevance, current

limitations and new approaches. Acta Trop.

URBINA, J.A. 2002. Specific treatment of Chagas disease: current status and new

developments. Curr. Opin. Infect. Dis. 14:733-741.

URBINA, J.A.; DOCAMPO, R. 2003a. Specific chemotherapy of Chagas disease:

controversies and advances. Trends Parasitol. 19 (11) 495-501.

URBINA, J.A.; LAZARDI, K.; AGUIRRE, T.; PIRAS, M.M.; PIRAS, R. 1988.

Antiproliferative synergism of the allylamine SF-86327 and ketoconazole on

epimastigotes and amastigotes of Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi . Antimicrob.

Agents Chemother. 32; 1237-1242.

URBINA, J.A.; PAYARES, G.; CONTRERAS, L.M.; LIENDO, A.; SANOJA, C.;

MOLINA, J.; PIRAS, M.; PIRAS, R.; PEREZ, N.; WINCKER, P.; LOEBENBERG, D.

1998. Antiproliferative Effects and Mechanism of Action of SCH 56592 against

Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi: In Vitro and In Vivo Studies. Antimicrob. Agents

Chemother. 1771–1777.

URBINA, J.A.; PAYARES, G.; SANOJA, C.; MOLINA, J.; LIRA, R.; BRENER, Z. E

ROMANHA, A.J. 2003b. In vitro and in vivo activities of ravuconazole on

Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Int. J. Antimicrob. Agents,

21; 27-38.


111

VALDEZ, R. H.; TONIN, L.T.D.; NAKAMURA, T.U.; SILVA, S.L.; FILHO, B.P.D.;

KANESHIMA, E.N.; OGATTA, YAMAUCHI, L.M.; SARRAGIOTTO;

NAKAMURO, C.V. 2011. In vitro and in vivo trypanocidal synergistic activity of N-

butyl-1-(4-dimethylamino)phenyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxamide

associated with benznidazole. Antimicrob. Agents Chemother. 56(1) 507-512.

VAN GRIENSVEN, J.; BALASEGARAM, M.; MEHEUS, F.; ALVAR, J.; LYNEN, L.

2010 Combination therapy for visceral leishmaniasis. Lancet Infect. Dis. 10(3) 184-194.

VILLARREAL, D.; BARNABÉ, C.; SERENO, D.; TIBAYRENC, M. 2004. Lack of

correlation between in vitro susceptibility to Benznidazole and phylogenetic diversity of

Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease. Exp. Parasitol. 108(1-2) 24-31.

VIOTTI, R.; VIGLIANO, C.; ARMENTI, H.; SEGURA, E. 1994. Treatment of chronic

Chagas disease with benznidazole: clinical and serological evolution of patients with

long-term follow-up. Am. Heart J. 127; 151-162.

VIOTTI, R., VIGLIANO, C.; LOCOCO, B.; BERTOCCHI, G.; PETTI, M.;

ALVAREZ, M.G.; POSTAN, M. E ARMENTI, A. 2006. Long-term cardiac outcomes

of treating chronic Chagas disease with benznidazole versus no treatment: a

nonrandomized trial. Ann. Int. Med., 144(10) 724-734.

VOLLER, A.; BIDWELL, D.E.; BARTLETT, A. 1976. Enzyme immunoassays in

diagnostic medicine. Theory and practice. Bull. WHO. 53; 55-65.

WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION) Special Programme for Research and

Training in Tropical Diseases (TDR), 2007. Report of scientific group in Chagas

disease. Buenos Aires, Argentina, April 17-20, 2005.Update July 2007.

WILKINSON, S.R.; KELLY, J.M. 2009. A mechanism for crossresistance to

nifurtimox and benznidazole in trypanosomes. Exp. Rev. Mol. Med. 11; e31.

WORKMAN, P.; WHITE, R.A.; WALTON, M.I.; OWEN, L.N. E TWENTYMAN,

P.R. 1984. Preclinical pharmacokinetics of benznidazole. Br. J. Cancer. 50; 291-303.

ZINGALES, B.; ANDRADE, S.G.; BRIONES, M.R.S.; CAMPBELL, D.A.; CHIARI,

E.; FERNANDES, O.; GUH, F.; LAGES-SILVA, E.; MACEDO, A.M.; MACHADO,

C.R.; MILES, M.A.; ROMANHA, A.J.; STURM, N.R.; TIBAYRENC, M.;

SCHIJMAN, A.G. 2009. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific

nomenclature: second revision meeting recommends TcI to TcVI. Mem. Inst. Oswaldo

Cruz. 104(7) 1051-1054.

YUN, O.; LIMA, M.A.; ELLMAN, T.; CHAMBI, W.; CASTILLO, S.; FLEVAUD, L.;

RODDY, P.; PARREÑO, F.; ALBAJAR VIÑAS, P.; PALMA, P.P. 2009. Feasibility,

drug safety, and effectiveness of etiological treatment programs for Chagas disease in

Honduras, Guatemala, and Bolivia: 10-year experience of Médecins Sans Frontières.

PLoS Negl. Trop. Dis. 3(7):e488.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Villarreal%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15491545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Barnab%C3%A9%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15491545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sereno%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15491545

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tibayrenc%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15491545


112

avaliação do efeito do tratamento com benznidazol em ... · a todos os amigos do laboratório de...

Documents