UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA

Faculdade de Medicina Veterinria

AVALIAO DE UMA METODOLOGIA DE ATPmetria NA MONITORIZAO DA HIGIENE FABRIL

ANA CARINA FERNANDES FERREIRA

CONSTITUIO DO JRI Professor Doutor Jos Antnio Mestre Prates Professora Doutora Yolanda Maria Vaz Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

ORIENTADORA Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

2008

LISBOA

UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA

Faculdade de Medicina Veterinria

AVALIAO DE UMA METODOLOGIA DE ATPmetria NA MONITORIZAO DA HIGIENE FABRIL

ANA CARINA FERNANDES FERREIRA

DISSERTAO DE MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA VETERINRIA

CONSTITUIO DO JRI Professor Doutor Jos Antnio Mestre Prates Professora Doutora Yolanda Maria Vaz Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

ORIENTADORA Professora Doutora Marlia Catarina Leal Fazeres Ferreira

2008

LISBOA

iii

Dedicatria

A

todos aqueles que sempre acreditaram em mim...

iv

v

Agradecimentos Gostaria de agradecer minha orientadora, Professora Marlia Ferreira, todo o empenho, apoio, carinho e ateno que me deu ao longo deste projecto. Existem professores que marcam geraes, mas tambm existem aqueles que nos marcam para a vida! Ao Professor Antnio Barreto pelo seu contributo para a realizao deste estgio. Professora Maria Joo Fraqueza pelos seus ensinamentos. Lena, Zzinha e D. Maria pela forma carinhosa e familiar como me acolheram no laboratrio, por todo o que aprendi com elas, o meu muito obrigado! Na indstria, gostaria de agradecer o carinho com que fui acolhida bem como os ensinamentos transmitidos, ao Dr. Armindo Loureno, Dra. Rosrio Barata, Eng. Ftima Fernandes, ao Sr. Rui Oliveira, e ao Eng. Paulo Almeida, e de uma forma especial Eng. Paula Ferreira, pelo seu carinho e amizade. Gostaria igualmente de agradecer a todas as pessoas que trabalham na sala de fatiados, em especial D. Ermelinda, pela sua disponibilidade e ajuda na realizao deste projecto. Ao Azores Team, sinnimo do incio, meio e fim desta longa caminhada que foi o nosso curso, a vossa amizade permanecer para sempre, Ana Catarina Bastos, Joanna Franco, Mariana Messias e Patrcia Simes. Ao quase Aoriano Gonalo Antunes, obrigado pela enorme pacincia demonstrada, no fcil lidar com tanta Aoriana junta! A todos os meus colegas, de turma e de ano, que comigo se cruzaram ao longo destes seis anos, o meu muito obrigado. Com receio de me esquecer de algum no citarei nomes! A todos os meus amigos... sabe bem saber que esto sempre l! Aos meus pais, Lcia e Antnio, um muito obrigado ser muito pouco para lhes agradecer tudo o que fizeram por mim! Sem eles as etapas difceis no tinham sido ultrapassadas e esta longa caminhada no tinha chegado ao fim! Muito Obrigado! Ao meu irmo, Paulo, companheiro de todas as horas, um importante pilar da minha vida, e minha cunhada Ana, o meu agradecimento por estarem sempre presentes. Aos meus avs maternos, Felcia e Henrique, e a toda a minha famlia, peas muito importantes na minha vida, um obrigado muito especial. Ao meu namorado, Steven, obrigado pela pacincia, apoio, carinho, suporte e acima de tudo amizade. Apesar de longe nunca deixaste de estar presente... Muito Obrigado! Meno de apoio Este projecto foi totalmente financiado pela indstria de produtos alimentares onde decorreu.

vi

vii

Avaliao de uma metodologia de ATPmetria na monitorizao da higiene fabril

Resumo

Nas ltimas dcadas tem-se assistido a uma grande evoluo, quer nos mtodos de

produo dos alimentos, quer nos controlos necessrios para garantir a produo de

alimentos seguros.

Tornou-se necessrio aplicar mtodos mais rpidos do que os da microbiologia

clssica de forma a verificar a eficcia dos planos de higienizao das indstrias

alimentares, no momento exactamente anterior ao incio de fabrico, de forma a que as

superfcies que contactam directamente com os alimentos possam ser novamente

higienizadas, caso seja detectada uma situao no conforme.

De forma a implementar um mtodo expedito que permitisse avaliar a higienizao

efectuada em equipamentos de uma indstria alimentar, neste estudo compararam-se

mtodos clssicos de deteco de microrganismos (aerbios totais a 30 C e

Enterobacteriaceae), com mtodos ditos rpidos, designadamente deteco de ATP por

bioluminescncia e deteco de protena.

O estudo decorreu na sala de fatiados, na lmina e no tapete de duas das trs

mquinas presentes. As colheitas para os 3 testes foram realizadas em simultneo, aps

higienizao, sob as mesmas condies. Registou-se, igualmente, a observao visual das

superfcies onde se realizaram as colheitas.

Os resultados dos testes estatsticos McNemar e coeficiente Kappa revelaram

respectivamente os valores p= 0,022 e kappa= 0,410 para a comparao entre aerbios

totais e ATP por bioluminescncia; p= 0,146 e kappa= 0,428 para a comparao entre

aerbios totais e deteco de protena; p= 0,581 e kappa= 0,398 para a comparao entre

ATP por bioluminescncia e deteco de protena.

Tendo em ateno os resultados estatsticos obtidos, as caractersticas desta

indstria e os objectivos pretendidos, verificou-se que o teste de protena no trazia

nenhuma mais-valia, pelo que a escolha recaiu sobre o teste de leitura de ATP por

bioluminescncia, como o mais adequado na monitorizao da higiene.

Palavras-chave: planos de higienizao, microbiologia clssica, deteco ATP por bioluminescncia e deteco de protena

viii

ix

Evaluation of a methodology based on ATP bioluminescence for food industry hygiene monitoring

Abstract

In the last decades there were relevant improvements on the methods used in food

production, as well as on the necessary controls to make it more safe.

It has became necessary to apply more rapid tests then the ones in use in classical

microbiology, to allow the verification of the efficacy of the hygiene plans on food industries

just before the beginning of the production, and guarantee the hygiene conditions of surfaces

in contact with food, and consequently providing an answer almost at real time.

In the present work, in order to implement a more expedite method that could enable

the evaluation of hygiene conditions in food equipments, different classical methods of

detection of microorganisms (total viable counts and Enterobacteriaceae) and rapid

methods, such as ATP bioluminescence and protein detection assay, were compared. The study was developed in the slided room, on the conveyor belt and on the blades

of two slicer machines, using three different testes. The samples were collected

simultaneously, after hygiene procedures, under the same conditions. Data on visual

observations of the contact surfaces where samples were taken, were also registered.

The results of statistic tests, McNemar and Kappa coefficient showed respectively the

value p= 0,022 and kappa= 0,410 for comparation between total viable counts and ATP

bioluminescence; p= 0,146 and kappa= 0,428 for comparation total viable counts and protein

detection; p= 0,581 and kappa= 0,398 for comparation ATP bioluminescence and protein

detection.

Considering the results of the statistic tests, characteristics of the industry, and the

proposed aims, we concluded that the protein test assay doesnt show advantages,

becoming evident that the ATP bioluminescence is more suitable, for the purpose of hygiene

monitoring.

Key-words: hygiene procedures, classical microbiology, ATP bioluminescence and protein detection.

x

xi

ndice

Dedicatria ______________________________________________________________ iii Agradecimentos__________________________________________________________ v Meno de apoio _________________________________________________________ v Resumo________________________________________________________________ vii Abstract ________________________________________________________________ ix ndice __________________________________________________________________ xi ndice de figuras ________________________________________________________ xiii ndice de tabelas ________________________________________________________ xiv Lista de abreviaturas_____________________________________________________ xiv Introduo ______________________________________________________________ 1 1. Reviso Bibliogrfica ___________________________________________________ 3

1.1 Higienizao/Plano de higienizao ____________________________________________ 3 1.1.1 Programa de higienizao ___________________________________________________________5

1.1.1.1 Tipos de sujidade _______________________________________________________________________5 1.1.1.2 As superfcies __________________________________________________________________________6 1.1.1.3 A gua ________________________________________________________________________________7 1.1.1.4 Mtodos de higienizao __________________________________________________________________7 1.1.1.5 Detergentes e desinfectantes ______________________________________________________________8

1.1.2 Higiene Pessoal __________________________________________________________________11 1.1.3 Monitorizao de um plano de limpeza ________________________________________________12

1.2 Mtodos Microbiolgicos Clssicos___________________________________________ 12 1.2.1 Determinao de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae _____________13

1.3 Teste de deteco de ATP por Bioluminescncia ________________________________ 16

1.4 Mtodos de deteco de protena e de acares, fosfatos e hidratos de carbono _____ 21

2. Materiais e Mtodos ___________________________________________________ 25

2.1 Meios de Cultura___________________________________________________________ 28

2.2 Preparao da soluo de diluio____________________________________________ 28

2.3 Esterilizao ______________________________________________________________ 28

2.4 Anlises microbiolgicas____________________________________________________ 28 2.4.1 Colheita e preparao de amostras ___________________________________________________28 2.4.2 Contagem de microrganismos a 30 C ________________________________________________29 2.4.3 Contagem de Enterobacteriaceae ____________________________________________________29

2.5 Mtodos rpidos ___________________________________________________________ 29 2.5.1 Colheita de amostras ______________________________________________________________29 2.5.2 Material utilizado no teste de ATP ____________________________________________________29 2.5.3 Leitura do ATP por bioluminescncia__________________________________________________30 2.5.4 Material utilizado no teste de deteco de protena_______________________________________30 2.5.5 Leitura das zaragatoas de PRO-Clean ________________________________________________31

2.6 Anlise estatstica _________________________________________________________ 31

xii

3. Resultados____________________________________________________________ 33 3.1 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C____________________________ 33

3.2 Contagem de Enterobacteriaceae _____________________________________________ 35

3.3 Deteco de ATP por bioluminescncia________________________________________ 38

3.4 Visualizao da deteco de protena _________________________________________ 40

3.5 Registo da observao visual ________________________________________________ 42

4. Discusso ____________________________________________________________ 47 5. Concluses ___________________________________________________________ 57 Bibliografia _____________________________________________________________ 59 Anexos_________________________________________________________________ 63

xiii

ndice de figuras Figura 1 Reaco de deteco de ATP por bioluminescncia.____________________________ 18 Figura 2 Reaco do biureto para deteco de protena. ________________________________ 22 Figura 3 Lmina de ao inoxidvel de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas. ____ 27 Figura 4 Tapete de uma das mquinas onde se efectuaram as colheitas. ___________________27 Figura 5 Lmina da fatiadora e placas de delimitao das superfcies de colheita de amostras.__ 27 Figura 6 Tapete transportador com placas, para delimitao das superfcies de colheita de amostras. ______________________________________________________________________ 27 Figura 7 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por bioluminescncia e respectiva zaragatoa descartvel Ultrasnap. ____________________________________________________ 30 Figura 8 Luminmetro utilizado para a medio de ATP por bioluminescncia, preparado para efectuar medio. ________________________________________________________________ 30 Figura 9 Zaragatoa PRO-Clean. ___________________________________________________ 31 Figura 10 Zaragatoas PRO-Clean, aps colheita das amostras de superfcies com diferentes quantidades de protena. __________________________________________________________ 31 Figura 11 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina da mquina 1, nas 11 colheitas. ______________________________________________________________________ 34 Figura 12 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. ______________________________________________________________________ 34 Figura 13 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. ______________________________________________________________________ 35 Figura 14 Contagem de microrganismos aerbios totais a 30 C no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas._______________________________________________________________________ 35 Figura 15 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. _______ 36 Figura 16 Contagem de Enterobacteriaceae na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. _______ 37 Figura 17 Contagem de Enterobacteriaceae no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas. _______ 37 Figura 18 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina da mquina 1, nas 11 colheitas.____ 38 Figura 19 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete da mquina 1, nas 11 colheitas. ____ 39 Figura 20 Medio de ATP por bioluminescncia na lmina da mquina 3, nas 13 colheitas. ___ 39 Figura 21 Medio de ATP por bioluminescncia no tapete da mquina 3, nas 13 colheitas. ____ 40 Figura 22 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios na lmina da mquina 1. _____________________________________________________________ 40 Figura 23 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 11, ensaios no tapete da mquina 1. _____________________________________________________________ 41 Figura 24 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, na lmina da mquina 3. _____________________________________________________________ 41 Figura 25 Resultados, dos testes de visualizao de deteco de protena nos 13 ensaios, no tapete da mquina 3. _____________________________________________________________ 42 Figura 26 Resultados, dos registos da observao visual lmina da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 42 Figura 27 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete da mquina 1, nas 11 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 43 Figura 28 Resultados, dos registos da observao visual lmina da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 43 Figura 29 Resultados, dos registos da observao visual ao tapete da mquina 3, nas 13 colheitas realizadas.______________________________________________________________________ 44 Figura 30 Anlise de concordncia entre os vrios testes, assim como da observao visual. ___ 45

xiv

ndice de tabelas

Tabela 1 Contagens de microrganismos aerbios totais a 30 C, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo.................................................................................................................................... 33 Tabela 2 Contagens de Enterobacteriaceae, nas duas mquinas e nos dois locais em estudo. ..... 36 Tabela 3 Valores de ATP medidos por bioluminescncia, nas amostras recolhidas, nas duas mquinas de fatiar e nos dois locais em estudo.. ................................................................................. 38 Tabela 4 Resumo dos resultados dos testes estatsticos de McNemar e do Coeficiente Kappa ..... 46 Tabela 5 Colheitas no concordantes entre si nos 3 testes .............................................................. 52

Lista de abreviaturas

AOAC International Association of Official Analytical Chemistry International

ATP Adenosina trifosfato

BCA cido bicinchoninico

BPH Boas Prticas de Higiene

CDM Contagem directa ao microscpio

DNA cido desoxirribonucleico

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point

NAD+ Nicotinamida adenina dinucleotdeo

ISO International Organization for Standardization NASA National Aeronautics and Space Administration

NP Norma Portuguesa

PCC Ponto Crtico de Controlo

PPM Partes por milho

RLU Relative Light Units / Unidades Relativas de Luz

UFC Unidade Formadora de Colnia

1

Introduo

O meu estgio curricular do Mestrado Integrado em Medicina Veterinria foi realizado

na rea cientfica de Segurana Alimentar e teve a durao aproximada de 5 meses, com

uma mdia de 8 horas dirias. Decorreu no Laboratrio de Tecnologia dos Produtos Animais

da Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade Tcnica de Lisboa e numa indstria

de transformao de produtos crneos.

No Laboratrio de Tecnologia dos Produtos Animais, acompanhei as diversas

actividades do laboratrio de microbiologia alimentar. De salientar a participao em

anlises microbiolgicas a zaragatoas, para controlo e monitorizao de higiene, a produtos

alimentares de origem animal (peixe, carne de bovino e suno, doces variados e molhos) e a

guas. As anlises eram efectuadas a solicitao do exterior, no regime de prestao de

servios.

Estas anlises, efectuadas segundo as tcnicas descritas nas Normas especficas

portuguesas ou europeias em vigor, incluram a pesquisa e/ou contagem de alguns

microrganismos, nomeadamente microrganismos aerbios totais a 30 C,

Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, esporos de Clostrdeos sulfito

redutores, Salmonella spp, Listeria monocytogenes, fungos (bolores e leveduras) e Vibrio

spp.

As anlises de gua, de acordo com o estipulado no Decreto-lei n. 306/2007,

constaram da pesquisa de Enterococos e Escherichia coli em 100 ml.

Concomitantemente a essas tarefas, estive integrada num estudo solicitado por uma

empresa de carnes, no qual se pretendia avaliar as alteraes microbiolgicas e qumicas

sofridas pela carne de bovino desde o corte e embalagem at ao consumo final, quando

armazenada em atmosfera protectora e colocada nas prateleiras de um supermercado, nas

condies usuais de venda aos consumidores.

Acompanhei a colheita desses produtos quer no local de corte e embalagem, quer

nos supermercados, de acordo com o desenho experimental do estudo. No laboratrio,

realizaram-se anlises microbiolgicas, nomeadamente a pesquisa de bactrias cido

lcticas (ISO 15214:1998), Brochothrix (ISO 13722:1996), microrganismos aerbios totais a

30 C (NP 4405:2002) e Pseudomonas spp (ISO 13720:2000).

Na indstria de transformao de produtos crneos, com trs linhas de produo

(fatiados, pastas e cozidos), fui integrada no Departamento da Qualidade, acompanhando e

participando como estagiria nas tarefas a desenvolvidas. Entre outras tarefas, acompanhei

processos de fabrico nas diferentes linhas, verifiquei menes de rotulagem em embalagens

e latas e procedi a colheitas de produtos para anlise microbiolgica. A amostragem era

2

aleatria e realizada sobre os produtos produzidos ao longo da semana (em mdia 6

produtos por semana).

As determinaes microbiolgicas, incluram contagens de microrganismos aerbios

a 30 C (NP 4405:2002), Enterobacteriaceae (NP 4137:1991), bactrias cido lcticas (ISO

15214:1998), Staphylococcus aureus (NP 2260:1986), Escherichia coli e coliformes

(utilizando o meio RAPID`E.coli 2 Agar da Bio-Rad Laboratrios, aprovado pela AOAC

international Association of Official Analytical Chemistry International), alm de pesquisa

de esporos de clostrdeos sulfito redutores (NP 2262:1986).

Efectuava-se, ainda, a todas as matrias-primas recebidas na fbrica, a pesquisa de

Staphylococcus aureus.

Participei na apreciao das provas de estabilidade (provas de estufa) das conservas

alimentares realizadas na indstria (salsichas, pasta de fgado e de carne). De cada ciclo de

esterilizao eram retiradas, no mnimo, 3 latas, das quais uma era mantida temperatura

ambiente, uma a 35 C e outra a 55 C, durante 7 dias.

Aps a incubao, eram escolhidas 20 latas aleatoriamente, das mantidas

temperatura ambiente, para realizao das determinaes ponderais (pesagem do produto e

do excipiente quando presente). O resultado das determinaes ponderais, de acordo com

padres pr-definidos, determina a aprovao ou reprovao de todo o lote. As restantes

latas eram abertas para se verificar a integridade do produto, suas caractersticas

macroscpicas (cor, textura, superfcie e contagem das unidades) e do excipiente, quando

presente.

Observei os grficos de cada esterilizao (com meno temperatura e presso),

tendo especial ateno para os diferentes tipos de grficos, correspondentes a um tipo de

conserva, uma vez que existem programas pr-definidos que tm que ser respeitados para

que a esterilizao possa ser considerada vlida.

Para alm disso, procedi a um estudo que tinha em vista a escolha de um mtodo

dito rpido para monitorizar e verificar a aplicao dos planos de higiene numa sala de

fatiagem de produtos prontos a serem consumidos, uma vez que esta etapa considerada

um PCC (Ponto Crtico de Controlo) no plano HACCP (Hazard Analysis and Critical Control

Point). Para o efeito, compararam-se dois mtodos expeditos ditos rpidos, a saber, a

pesquisa de ATP (Adenosina trifosfato) por bioluminescncia e a deteco de protena, com

mtodos de microbiologia clssica, onde se fez a avaliao da presena de alguns dos

principais indicadores de higiene, nomeadamente microrganismos aerbios totais a 30 C e

Enterobacteriaceae.

O objectivo deste trabalho foi, ento, nas condies em presena, escolher o mtodo

expedito que mais se adequa monitorizao do PCC considerado.

3

1. Reviso Bibliogrfica

1.1 Higienizao/Plano de higienizao

A palavra higiene teve a sua origem na Grcia Antiga. Na mitologia grega, aparece

Asclepius, filho de Apollo, referido como o Deus da medicina e da cura, e sua irm Hygeia

ficou conhecida como a Deusa da cura, estando esse poder directamente relacionado com a

limpeza (Lelieveld, Mostert & Holah, 2005).

Hipcrates, um dos mais famosos mdicos da Grcia Antiga, conseguiu restabelecer

a sade de alguns dos seus pacientes atravs de dieta apropriada e higiene conveniente

(Lelieveld et al., 2005).

Alguns antropologistas defendem que o homem tem uma tendncia natural para

viver com higiene e num ambiente ordenado, evitando o consumo de alimentos sujos. E em

meados do sculo XIX, na Europa, o mdico hngaro Ignc Flp Semmelweis (estabeleceu

relao entre o decrscimo da febre puerperal e a higienizao conveniente das mos

aquando dos cuidados mdicos) e o cirurgio Joseph Lister (introduziu a asspsia na

cirurgia), introduziram na sociedade moderna, os cuidados higinicos (Lelieveld et al., 2005).

Desde ento, inmeros investigadores concentraram-se no estudo da higiene, de

uma maneira geral e de uma forma especfica na higiene alimentar, uma vez que muitos

alimentos podem funcionar como veculos transportadores e causadores de doenas.

Assim, introduziram-se as Boas Prticas de Higiene (BPH) na manipulao de alimentos ao

longo de toda a cadeia alimentar, de forma a garantir a segurana alimentar.

As BPH esto previstas na legislao nacional e internacional, e so muito

frequentemente consideradas pr-requisitos num sistema de segurana alimentar baseado

nos princpios do HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point), conceito que foi

introduzido por Bauman, no ano de 1970, e alterou os conceitos de segurana alimentar at

ento em vigor (Hawronskyj & Holah, 1997; Metaxopoulos, Kritikos & Drosinos, 2003).

Prevenir a contaminao dos alimentos, a chave de um sistema de segurana

alimentar. A contaminao ocorre, muitas vezes, devido proliferao indesejvel de

microrganismos, deficiente separao dos produtos crus e processados, ao inadequado

controlo de temperatura durante o processo de fabrico ou armazenamento, inadequada

higienizao ou a contaminao cruzada, especialmente por microrganismos patognicos

ou suas toxinas, em refeies prontas a consumir (Easter, 2003; WHO/FAO, 2003; Legnani,

Leoni, Berveglieri, Mirolo & lvaro, 2004).

O controlo higinico eficaz fundamental para evitar as consequncias nefastas para

a sade humana e para a economia das doenas e leses causadas por alimentos e

4

deteriorao de alimentos (WHO/FAO, 2003). Blankenfeld-Enkvist & Brnnback (2002),

defendem mesmo que os contaminantes microbiolgicos nos alimentos so um dos mais

importantes problemas no que se refere a custos econmicos.

A infeco instala-se quando h ingesto de alimentos contaminados com bactrias

patognicas viveis, cuja quantidade tem de ser suficiente para ultrapassar a barreira cida

do estmago; passada esta barreira, os microrganismos sobreviventes chegam ao intestino

delgado, onde se multiplicam e provocam o aparecimento de sintomas (Soares, 2007).

Todos os intervenientes, incluindo agricultores e criadores, fabricantes e

processadores, manipuladores de alimentos e consumidores, tm a responsabilidade de

garantir que os alimentos so seguros e adequados ao consumo (WHO/FAO, 2003). Os

consumidores esperam dispor de alimentos de alta qualidade, isentos de microrganismos

patognicos e toxinas, pelo que a adequada higienizao indispensvel, no podendo ser

substituda por nenhuma outra aco (Wildbrett, 2000).

Para garantir a correcta aplicao dos planos de higienizao, todas as tarefas

devem estar registadas em documentos devidamente arquivados, permitindo posterior

consulta, especialmente os desvios e aces correctivas implementadas (Baptista, 2003).

Efectuar de forma adequada o plano de higienizao tem uma importncia

econmica elevada. Os custos tm que ver com o tempo despendido e a mo-de-obra,

equipamento e consumveis utilizados e se a higienizao no for realizada da forma mais

correcta e eficaz, o custo inerente a estas aces poder ser muito superior ao benefcio

que delas advm (Easter, 2003).

A matria orgnica remanescente, derivada de resduos de alimentos ou

incrustaes, pode funcionar como suplemento nutricional que favorece a sobrevivncia e a

proliferao dos microrganismos, diminuindo a eficcia dos detergentes e desinfectantes

(Patel, 1994).

Muitas vezes, na indstria, existem as condies ideais para o desenvolvimento de

biofilmes em qualquer superfcie. Estes, podem demorar dias ou semanas para iniciar o seu

desenvolvimento, que ocorre quando os microrganismos se agregam nas superfcies e

segregam uma matriz extracelular protectora, constituda por polissacridos e

glicoprotenas. Remover um biofilme, recorrendo a limpeza e desinfeco, pode revelar-se

tarefa impossvel, pelo que extremamente importante, impedir a adeso e reduzir a

incidncia de agregao de microrganismos, principalmente os patognicos, a estas

superfcies (Jessen & Lammmert, 2003; Lelieveld et al., 2005). O design higinico dos

equipamentos e o Layout da planta, tambm so aspectos importantes na preveno e

controlo dos biofilmes (Forsythe, 2002).

Um plano de higienizao deve especificar as reas, equipamentos e utenslios a

serem limpos, a responsabilidade por tarefas especficas, o mtodo e a frequncia da

limpeza e as medidas de monitorizao. De forma clara e directa deve responder a

5

perguntas como: o que limpo, como limpo, quando limpo e quem limpa (WHO/FAO,

2003).

A limpeza deve ser feita das reas menos contaminadas para as mais contaminadas,

e a eliminao da sujidade deve ser efectiva, assim como a destruio ou a reduo de

microrganismos, at nveis considerados aceitveis e que no coloquem em risco a sade

dos consumidores e a qualidade do produto, nomeadamente os potencialmente patognicos

e os que provocam deteriorao dos alimentos (Noronha, n.d.).

Idealmente, o plano de higiene dever ser pensado logo quando se inicia o desenho

e a construo do edifcio e a escolha dos equipamentos, uma vez que a sua configurao

deve permitir a correcta manuteno, limpeza e desinfeco. A contaminao pelo ar deve

ser prevenida ou minimizada e deve verificar-se a existncia de proteco efectiva contra a

entrada e permanncia de pragas. O projecto das instalaes deve privilegiar o fluxo de

produtos das zonas mais contaminadas para as menos contaminadas, prevenindo desta

forma as recontaminaes. Todos os documentos inerentes construo devem ser

criteriosamente catalogados, validados e armazenados (Noronha & Baptista 2003; Lelieveld

et al., 2005).

Os estabelecimentos fabris devem estar afastados de reas ambientalmente

poludas e de actividades industriais que constituam risco grave de contaminao, de reas

sujeitas a inundaes, salvo se forem tomadas precaues suficientes, de reas com

especial predisposio infestao por pragas e de reas em que os resduos, lquidos ou

slidos, no possam ser eficazmente removidos (WHO/FAO, 2003).

1.1.1 Programa de higienizao

Para se realizar um programa de higienizao com sucesso, essencial conhecer a

natureza da sujidade que vai ser removida, o tipo de superfcies que vo ser higienizadas, a

qualidade da gua, os mtodos de higienizao mais adequados e utilizar agentes de

limpeza e desinfeco compatveis com a indstria alimentar. igualmente importante

escolher o mtodo mais indicado para avaliar e monitorizar a eficcia do processo

implementado, o que permitir no s detectar precocemente um problema mas, acima de

tudo, evitar a sua perpetuao.

1.1.1.1 Tipos de sujidade

Definir o tipo de sujidade um dos elementos mais importantes quando se pretende

implementar um plano de higiene, pois est intimamente relacionado com o mtodo e

6

detergente mais indicado para a sua remoo (Noronha, n.d.). Assim, quanto origem, a

sujidade pode classificar-se em animal, vegetal e mineral; quanto sua composio

qumica, em inorgnica, proveniente de resduos metlicos, alcalinos ou de gua dura, e

orgnica, resultante sobretudo de resduos de alimentos (Baptista, 2003).

Numa indstria de carnes, a sujidade orgnica , sem dvida, a que maiores

problemas causa; os resduos de gordura, protenas e hidratos de carbono, resultantes da

laborao, necessitam ser correctamente higienizadas para que sejam cumpridos os pr-

requisitos estabelecidos no Cdigo de Boas Prticas (Noronha, n.d.).

A gordura, insolvel em gua e em solues alcalinas e cidas, facilmente

removida na presena de agentes tensioactivos e com ajuda de temperatura (40 C a 60C);

as protenas so pouco solveis em gua, ligeiramente solveis em soluo alcalina, mas a

sua remoo relativamente fcil; os hidratos de carbono, solveis em gua, permitem

igualmente uma remoo relativamente fcil (Noronha, n.d.).

1.1.1.2 As superfcies

A escolha dos materiais utilizados na indstria deve ser cuidada, devendo optar-se

pelos materiais durveis, no porosos, que no apresentem facilmente corroso, estveis

temperatura e aos produtos qumicos neles utilizados, passveis de manter e limpar

(Noronha & Baptista, 2003; WHO/FAO, 2003).

O melhor material utilizado , sem dvida, o ao inoxidvel, devido s suas

propriedades qumicas. o mais resistente corroso, tem superfcie suave e impermevel,

fcil de limpar e resistente a altas temperaturas. Contudo, no totalmente incuo, porque

na sua superfcie facilmente se forma uma camada de xido de crmio, que rapidamente

destruda pelo contacto com o ar. Inadequadamente utilizam-se materiais abrasivos para a

remover, danificando irremediavelmente a superfcie (Jullien, Bnzech, Carpentier, Lebret

& Faille, 2003).

As superfcies de metal enferrujam devido a detergentes cidos ou com cloro; os

galvanizados previnem esse enferrujamento. Nas superfcies de borracha, deve optar-se

pelas no porosas ou esponjosas, e por utilizar detergentes alcalinos que no afectam a sua

estrutura, ao contrrio do que acontece quando se utilizam solventes orgnicos e cidos

fortes (Noronha, n.d.).

Superfcies de beto podem ser danificadas e fragmentar devido ao contacto com

alimentos cidos e agentes de limpeza. O vidro, quando utilizado, deve ser suave e

impermevel e para proceder sua limpeza deve recorrer-se a detergentes alcalinos suaves

ou neutros, que no alteram a sua estrutura (Noronha, n.d.).

A madeira est contra-indicada na indstria alimentar, uma vez que no possvel

realizar uma higienizao conveniente, porque a sua superfcie rugosa facilita a fixao dos

7

microrganismos, para alm do que absorve facilmente humidade, gorduras e leos

(Noronha, n.d.).

1.1.1.3 A gua

Quando se pretende por em prtica um plano de higienizao, um dos factores

determinantes a ter em conta a qualidade na gua, que deve ser prpria para consumo

humano (ausncia de odor, sabor, cor e sedimentos estranhos, salubre, limpa,

desejavelmente equilibrada na sua composio, livre de microrganismos e no corrosiva),

(Noronha, n.d.; Decreto Lei n 306/2007).

De acordo com o Decreto-Lei n 306/2007, a gua destinada ao consumo humano

fornecida por redes de distribuio, por fontanrios no ligados rede de distribuio, por

pontos de entrega, por camies ou navios-cisterna, por reservatrios no ligados rede de

distribuio ou utilizada numa indstria alimentar, deve ser analisada quanto a parmetros

microbiolgicos, parmetros qumicos e parmetros indicadores. igualmente neste

Decreto-Lei que se encontram estabelecidas as frequncias mnimas de amostragem e de

anlise para a realizao do controlo de qualidade da gua.

O abastecimento, armazenamento e distribuio de gua potvel, assim como o

controlo de temperatura, deve estar disponvel, de forma a garantir a segurana e a

adequao aos alimentos. A utilizao de gua no potvel est prevista na indstria, desde

que se destine exclusivamente a controlo de incndios, produo de vapor, refrigerao ou

aco semelhante que no contacte com os alimentos. Os sistemas de gua no potvel,

devem estar identificados para que no haja refluxo para os sistemas de gua potvel

(WHO/FAO, 2003).

Em alguns locais da indstria, dada a natureza das operaes a realizadas,

igualmente importante controlar a temperatura ambiente, de forma a garantir a segurana

dos alimentos. O inadequado controlo desta varivel uma das causas mais comuns das

doenas com origem nos alimentos.

1.1.1.4 Mtodos de higienizao

As prticas de higiene, devero ser realizadas de forma adequada, para garantir que

os microrganismos so removidos e inactivados durante a limpeza e desinfeco (Tompkin,

2004).

A limpeza pode recorrer utilizao combinada de mtodos fsicos, como o calor, a

frico, o fluxo turbulento, a limpeza a vcuo ou outros mtodos que evitem o uso de gua,

e mtodos qumicos utilizando detergentes e/ou desinfectantes (WHO/FAO, 2003).

8

Os mtodos e materiais de limpeza utilizados dependem da natureza da indstria

(processo de fabrico, tipo de produto, tipo de superfcies) e nvel de higiene requerido,

podendo ser efectuada apenas uma limpeza ou uma limpeza seguida de desinfeco.

Por vezes, por razes relacionadas com a economia de tempo e energia, h

interesse em limpar e desinfectar em simultneo (sanificao), todavia, em muitos casos,

esta operao conjunta levanta reservas, porque a sujidade que envolve os microrganismos

reduz a eficcia da desinfeco; para compensar a perda de eficcia provocada pela

sujidade, utilizam-se sempre quantidades mais elevadas de sanificador do que seria

necessrio para uma superfcie previamente limpa (Wildbrett, 2000).

O processo de higienizao inicia-se com o enxaguamento, para remoo de

partculas de sujidade e de alguns microrganismos pouco aderidos, seguindo-se lavagem

com a aplicao do detergente, que actua sobre as partculas de sujidade que se encontram

aderidas, diminuindo a sua ligao s superfcies; segue-se a fase de enxaguamento, para

remoo completa das partculas entretanto libertadas, do detergente aplicado e de alguns

microrganismos (Noronha, n.d.; Wildbrett, 2000; Cruz, Cenci & Maia, 2006).

Nos casos em que se realiza desinfeco, aplica-se ento o desinfectante que se

deixa actuar durante algum tempo; ocorre nesta fase uma reduo considervel do nmero

de microrganismos. Segue-se novo enxaguamento para remoo completa do

desinfectante, etapa dispensvel para alguns desinfectantes (Noronha, n.d.).

A desinfeco, no ser efectiva, sempre que algum dos passos anteriores do

processo de higienizao, no for eficazmente realizado (Lelieveld et al., 2005).

Por fim realiza-se a secagem, cuja principal finalidade a remoo de gua em

excesso, eliminando a humidade residual que poderia favorecer o crescimento de

microrganismos (Noronha, n.d.). Realiza-se recorrendo a ar seco ou qualquer outro material

disponvel como, por exemplo, papel descartvel, de forma a que a recontaminao seja

mnima (Lelieveld et al., 2005).

1.1.1.5 Detergentes e desinfectantes

Os detergentes utilizados nos processos de limpeza, devem obedecer a alguns

requisitos, como a dissoluo rpida e completa na gua, penetrao rpida na sujidade,

capacidade de condicionar ou neutralizar a dureza da gua, e de manter a sujidade em

suspenso, facilidade de enxaguar, biodegradvel e no txico. Agrupam-se em trs

classes, detergentes alcalinos, cidos e enzimticos (Noronha & Baptista, 2003).

Os detergentes alcalinos possuem pH entre 7 e 14; os altamente alcalinos, so

utilizados para a remoo de impurezas incrustadas ou queimadas, os moderadamente

alcalinos so eficientes na remoo de gorduras e os alcalinos suaves so vulgarmente

utilizados na limpeza manual de reas ligeiramente sujas.

9

Os detergentes cidos, removem os materiais que esto secos ou incrustados nas

superfcies e dissolvem os minerais. So especialmente eficazes na remoo de depsitos

formados pelos detergentes alcalinos.

Existem detergentes cidos orgnicos e inorgnicos. Os primeiros no corroem as

superfcies, so adequados para limpezas manuais e reduzem a dureza da gua. Os

inorgnicos so excelentes para remover e controlar depsitos minerais, mas bastante

corrosivos para as superfcies (Noronha, n.d.).

Os detergentes enzimticos constituem uma alternativa aceitvel, quando os

equipamentos no podem ser expostos a condies excessivamente cidas ou alcalinas,

uma vez que as enzimas actuam de forma especfica sobre a sujidade (Baptista, 2003).

Escolhido o detergente mais adequado, de acordo com as caractersticas da

indstria, fundamental seguir as recomendaes do fabricante sobre concentrao, tempo

e temperatura de utilizao; , tambm, importante a remoo prvia das sujidades, por

aco mecnica. A alterao de apenas um destes factores pode comprometer

irremediavelmente a eficcia do detergente (Langsrud, Sidhu, Heir & Holck, 2003).

A principal funo da desinfeco, reduzir o nmero de microrganismos viveis,

principalmente os patognicos, e prevenir o crescimento microbiano durante a produo;

especialmente importante em superfcies hmidas, onde as condies so mais favorveis

proliferao microbiana (Noronha, n.d.).

Actualmente o mercado disponibiliza trs tipos de desinfeco: por calor, por

radiao ou qumica.

A desinfeco por calor, um bom mtodo, actua sobre todos os microrganismos,

no corrosivo, contudo apresenta como principais limitaes a no aplicabilidade em

superfcies sensveis ao calor, bem como o seu elevado custo.

A desinfeco por radiao mais usada em hospitais e laboratrios; na indstria

alimentar os restos de alimentos e outras sujidades, absorvem a radiao e tm um efeito

protector dos microrganismos, o que, por si s, j uma grande desvantagem.

A desinfeco qumica , sem dvida a mais vulgarmente utilizada, contudo,

necessrio escolher o desinfectante mais apropriado de acordo com os microrganismos que

se pretendem eliminar; os mais utilizados so o cloro e compostos de cloro, compostos de

iodo e compostos de amnio quaternrio (Noronha, n.d.).

O cloro e compostos de cloro, so bons antibacterianos, contudo ineficientes na

presena de alguns produtos orgnicos; as solues muito concentradas podem ser

corrosivas para as ligas de alumnio. Dentro dos compostos de cloro, os mais utilizados so

os hipocloritos de clcio e sdio, cujo uso, nas concentraes adequadas, no alteram as

qualidades organolpticas dos produtos (Noronha, n.d.; Jessen & Lammmert, 2003).

Os compostos de iodo, podem combinar-se com agentes de limpeza cidos; as

solues preparadas devem ter concentraes entre 25-50 mg/l de iodo activo e pH inferior

10

a 4. O seu tempo de actuao bastante baixo, contudo este composto pode ser corrosivo,

o que implica a necessidade de enxaguamento abundante com gua limpa. Elimina um

largo espectro de bactrias, mas a presena de resduos alimentares e de sujidade inactiva-

o; apresenta cor amarela quando o iodo se mantm activo, e a alterao da cor significa a

inactividade do composto.

Os compostos de amnio quaternrio tm boa capacidade de higienizao, no so

txicos nem corrosivos, contudo tendem a permanecer nas superfcies, da a importncia de

enxaguar cuidadosamente com gua limpa. Devem ser usados em concentraes entre

200-1200 mg/l; se a gua de lavagem for dura, deve aumentar-se a concentrao, mas

nunca se pode misturar quaisquer detergentes ou agentes higienizantes aninicos

(Noronha, n.d.).

A escolha do desinfectante deve considerar o tempo de contacto, temperatura,

concentrao, pH, limpeza prvia e dureza da gua, os quais so factores importantes que

condicionam a sua eficcia (Cruz et al., 2006).

Ainda muito comum, na indstria, a realizao da limpeza manual, efectuada pelos

prprios manipuladores de alimentos. Devido grande heterogeneidade de resultados que

se podem obter, requerida uma cuidada monitorizao. Para auxiliar limpeza manual

pode recorrer-se a mangueiras com pistolas de gua, com tamanho adequado ao local a

higienizar, de forma a evitar quedas de presso ou disperso da sujidade, e a escovas,

preferencialmente de nylon, pois tm fibras resistentes, uniformes e no absorvem gua

(Noronha, n.d.).

O uso de raspadores est condicionado limpeza de zonas de dimenso reduzida e

os mecanismos abrasivos, vulgarmente conhecidos por palha-de-ao, esto restritos a

zonas que no contactem directamente com os alimentos.

Contudo, podem ainda utilizar-se outros mtodos, tais como imerso, alta presso

(recorrendo a bombas de gua de alta presso ou pistolas de vapor), espuma e gel (evita

aco mecnica e reduz custos de mo de obra), limpeza de equipamentos em circuitos

fechados (implica instalao de equipamentos especficos) e pulverizao, recorrendo a

nebulizantes e fumigantes ou a sistemas de asperso (Noronha, n.d.).

O equipamento utilizado na limpeza da rea de fabrico deve estar criteriosamente

identificado, para no ocorrer troca com o equipamento utilizado em reas de no produo;

deve ser manuseado com cuidado e de acordo com as instrues do fabricante, se for o

caso.

Aps higienizao, devem-se lavar, desinfectar e secar os utenslios e equipamentos

e armazen-los em lugar prprio. Os detergentes e desinfectantes devem ser colocados em

local fechado, longe dos gneros alimentcios, evitando o risco de contaminao (Noronha,

n.d.).

11

1.1.2 Higiene Pessoal

A roupa usada no exterior da fbrica, deve ser diferente da usada no interior da

mesma, principalmente nas zonas de processamento de alimentos. Idealmente cada

funcionrio deve possuir equipamento de proteco individual de cor clara, constitudo por

touca ou barrete, camisa, camisola ou bata, calas e calado apropriado. Eventualmente

avental, com bolsos abaixo do nvel da cintura, de forma que os objectos pessoais a

guardados que possam cair, vo directamente para o pavimento (Baptista & Saraiva, 2003).

As pessoas que entram em contacto directo ou indirecto com os alimentos, devem

manter um nvel adequado de limpeza pessoal, e comportamentos e modos de operao

adequados de forma a no contaminarem os alimentos por contaminao cruzada, quer

devido a infeces bacterianas, quer virais. Os operadores envolvidos no processo de

limpeza, devem receber formao em higiene pessoal e alimentar, para que sejam

prevenidas as contaminaes cruzadas dos alimentos, resultantes da disseminao da sua

flora corporal, principalmente as que resultam dos microrganismos com uma dose infectante

baixa, como seja a Escherichia coli O157 (WHO/FAO, 2003; Lelieveld et al., 2005).

As contaminaes cruzadas podem ocorrer de forma directa, quando o alimento

directamente contaminado a partir de outro alimento ou superfcie com que contacte e ainda

atravs do ar (Legnani et al., 2004). A contaminao indirecta envolve um processo bem

mais complexo, em que a contaminao ocorreu em um ou mais locais ao longo da cadeia

alimentar, tendo permanecido resduos nos tecidos (Lelieveld et al., 2005).

As reas de processamento devem ter acesso restrito ou controlado, podendo ser

necessrio lavar as mos ou desinfect-las antes da entrada nestas reas. O equipamento

de uso pessoal dever ser o mais apropriado e a sua utilizao exclusiva do local de

trabalho; dever apresentar-se limpo e ser trocado com frequncia, de forma a reduzir a

potencial de contaminao durante o processo laboral.

Os lavatrios para lavagem das mos devem estar equipados com gua quente e

fria. As mos devem ser higienizadas com sabo especfico, e a desinfeco realizada com

produtos adequados; devem ser secas com toalhas descartveis. O Staphilococus aureus,

constituinte comum da flora cutnea habitual pode continuar presente, mesmo tendo os

cuidados citados, pelo que pode ser aconselhvel o uso de luvas descartveis quando se

manipulam alimentos (WHO/FAO, 2003).

A lavagem das mos e da zona dos antebraos exposta, dever ocorrer

obrigatoriamente no incio da laborao, aps ida casa de banho, aps as refeies,

sempre que se manusear alimentos crus ou material contaminado, antes de se colocar ou

12

mudar de luvas e depois de se contactar com detergentes ou desinfectantes (Baptista &

Saraiva, 2003).

1.1.3 Monitorizao de um plano de limpeza

Optimizar e monitorizar, o programa de limpeza, reduz custos em material e tempo,

minimiza a contaminao ambiental, diminui as perdas por avarias e aumenta o tempo de

vida til dos produtos alimentares. Normalmente, a monitorizao avalia a presena de

resduos, recorrendo a inspeco visual e faz a avaliao microbiolgica, atravs do recurso

a tcnicas de microbiologia clssica ou a mtodos mais expeditos, como as placas de

contacto.

Por outro lado, pode recorrer-se utilizao de mtodos rpidos para monitorizao

do plano de limpeza, nomeadamente ATPmetria, que mede a quantidade de ATP presente

numa determinada superfcie, ou zaragatoas especficas que permitem detectar protena

(importante na indstria de carnes) ou lactose (indstrias de lacticnios).

De acordo com Baptista (2003), uma elevada percentagem de intoxicaes e

infeces alimentares, resulta da contaminao dos equipamentos, o que refora a noo

da importncia fundamental da higienizao, na indstria alimentar.

1.2 Mtodos Microbiolgicos Clssicos

De acordo com Prescott, Harley, & Klein (2005), a microbiologia pode ser definida

como o estudo de organismos e agentes demasiado pequenos para serem claramente

vistos a olho nu.

Mesmo antes de os microrganismos poderem ser visualizados, alguns autores

suspeitavam da sua existncia e responsabilizavam-nos por doenas. Entre estes encontra-

se o filsofo romano Lucretius (98-55 A.C.) e o fsico Girolamo Fracastoro (1478-1553), que

sugeriram, cada um a seu tempo, que as doenas eram causadas por criaturas vivas

invisveis (Prescott et al., 2005).

Antony van Leeuwenhoek, um microscopista amador, foi o primeiro a observar e

descrever microrganismos, publicando os resultados das suas primeiras observaes de

bactrias e protozorios em 1677 (Ferreira & Sousa, 2000; Prescott et al., 2005).

Contudo, s no sculo XIX (1857), Louis Pasteur, demonstrou que a fermentao

cido lctica era produzida por microrganismos, iniciando desta forma a era moderna da

microbiologia alimentar (Prescott et al., 2005).

13

A anlise microbiolgica, designada clssica, tradicional ou convencional, remonta

aos anos de 1920-1930, contudo nessa poca no existia metodologia especfica.

Anteriormente a esta data, a nica forma de verificar se um local estava ou no

correctamente higienizado, seria recorrer inspeco visual, alis um mtodo ainda

bastante utilizado na indstria alimentar. Isoladamente no um bom mtodo, porque

apenas detecta os detritos maiores (Baptista, 2003), todavia associado com outros pode-se

revelar bastante til, por exemplo, quando combinado com luz ultravioleta, pode detectar

detritos de p ou de leo em stios pouco acessveis.

Actualmente, as tcnicas de anlise microbiolgica baseiam-se na colheita de

amostras e respectivo processamento em laboratrio, de acordo com mtodos descritos em

Normas Portuguesas (NP) ou Internacionais (EN, ISO, entre outros).

As amostras podem ser slidas, lquidas, de ar ou amostras de superfcies, e os

mtodos, solutos, meios de cultura e diluies utilizados dependem do tipo de material

colhido, da estrutura da superfcie e da expectativa do tipo e nvel de contaminao.

At aos anos 80, o controlo da eficcia dos planos de higienizao numa indstria

alimentar era feito com recurso microbiologia dita clssica (Easter, 2003), recolhendo

amostras com zaragatoas estreis, determinando para o efeito contagens de

microrganismos a 30 C e de Enterobacteriaceae, cujas diluies eram semeadas em meios

de cultura especficos ou no, conforme os microrganismos avaliados. Geralmente,

procuravam-se microrganismos aerbios mesfilos e microrganismos indicadores de

higiene, nomeadamente os de origem fecal.

A metodologia microbiolgica clssica , ainda hoje, considerada o Gold Standard,

quando as monitorizaes so requeridas em regulamentos nacionais e internacionais,

constituindo os mtodos oficiais de controlo (Blankenfeld-Enkvist & Brnnback, 2002).

1.2.1 Determinao de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae

Atravs da contagem os microrganismos a 30 C, percebe-se da contaminao

presente, na amostra, uma vez que engloba a grande maioria dos microrganismos com

importncia na indstria, inclusive os potencialmente patognicos de maior interesse.

Por outro lado, as Enterobacteriaceae, incluem um vasto leque de microrganismos,

constitudo por bacilos Gram negativos, aerbios-anaerbios facultativos, fermentadores da

glucose, catalase positivos e citrocromo-oxidase negativos. Os principais gneros desta

famlia so: Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Eschericia, Salmonella, Proteus, Shigella,

Yersinia e Klebsiella (Prescott et al., 2005).

14

A presena de Enterobacteriaceae em alimentos processados fornece uma boa

indicao de um tratamento inadequado ou de recontaminao aps o processamento. A

presena de Enterobacteriaceae nas superfcies, equipamentos e mos dos manipuladores

pode aumentar o nmero de Unidades Formadoras de Colnias (UFC) nos alimentos, se

durante o armazenamento, transporte ou distribuio ocorrer um aumento de temperatura

(Crowley et al., 2005).

Crowley et al. (2005) referem que as Enterobacteriaceae e outros microrganismos

indicadores de higiene avaliam a qualidade dos alimentos e as condies de higiene durante

o processamento. No entanto, os autores ressalvam que no seguro associar estes

microrganismos indicadores a microrganismos patognicos contaminantes dos alimentos.

De acordo com Tebbutt (2007), a contagem de Enterobacteriaceae e de

microrganismos aerbios totais a 30 C, providenciam adequada informao para verificar o

sistema HACCP.

As tcnicas clssicas de colheita e processamento de amostras so amplamente

usadas na indstria. Tm a grande vantagem de permitir detectar e quantificar

microrganismos especficos, mas apresentam desvantagens, como sejam no detectarem

resduos de produtos resultantes de uma m higienizao, ou por outro lado o tempo que

medeia entre a realizao da anlise e a obteno de resultados, alm da necessidade de

mo-de-obra especializada para as realizar (Lelieveld et al., 2005). O custo inerente a este

mtodo tambm constitui um factor limitante, tendo em conta que o mesmo se encontra

associado ao nmero de amostras processadas, isto , ao custo da realizao da colheita,

transporte para o laboratrio, bem como do processamento de anlise propriamente dita em

laboratrio (Tompkin, 2004). Constituem, no obstante, uma ferramenta importante, quando

em presena de uma toxinfeco, ou quando se pretende implementar um programa de

pesquisa e controlo de um microrganismo potencialmente patognico especfico, por

exemplo, Listeria em superfcies.

A maioria dos protocolos de colheita de amostras em superfcies baseiam-se na

tcnica de Manheiner & Yheunez descrita em 1917. Esta tcnica utiliza zaragatoas

esterilizadas, com uma haste mais ou menos flexvel e uma substncia fibrosa na

extremidade, mergulhada num soluto diluidor isotnico. A colheita da amostra faz-se por

esfregao na superfcie a testar. Os microrganismos transferidos para a zaragatoa podem

ser semeados, num meio de cultura adequado, directamente ou aps diluies em soluto

apropriado (Lelieveld et al., 2005).

O registo da data de colheita, do processamento, bem como do operador que a

realizou, assim como a temperatura a que a amostra entregue no laboratrio, so dados

extremamente importantes, principalmente na presena de resultados incomuns ou

significativamente diferentes, pois podem auxiliar na interpretao dos mesmos.

15

Aps incubao, a contagem das colnias desenvolvidas nos meios, fornece uma

indicao sobre a abundncia ou no de contaminao na superfcie testada.

A recolha feita de forma assptica, recorrendo a um maarico ou lamparina de

lcool. As superfcies testadas podem ter diferentes reas, e so geralmente delimitadas por

placas metlicas ou de outro material esterilizvel, com janelas quadrangulares.

Regra geral, a zaragatoa consegue remover os microrganismos da rea em estudo,

todavia, a sua remoo pode ser dificultada quando se est em presena de detritos

incrustados e, particularmente de biofilmes. Nestas situaes, as contagens podem ficar

diminudas e os resultados eventualmente falseados.

Geralmente, as zaragatoas para colheita das amostras encontram-se mergulhadas

em solues, neutralizantes, isotnicas e redutoras do stress fisiolgico, cujo principal

objectivo manter a viabilidade dos microrganismos recolhidos das superfcies. O soluto

neutralizante tem a funo de neutralizar a presena de resduos de detergentes ou

desinfectantes que permaneam remanescentes na superfcie, mesmo aps o

enxaguamento. Sem o soluto neutralizante, os resduos de detergente e de desinfectante

poderiam inactivar os microrganismos, fazendo com que artificialmente o seu nmero fosse

reduzido.

Algumas empresas adicionam substncias surfactantes s solues contidas nos

tubos das zaragatoas, com o objectivo de reduzir a tenso superficial e melhorar a captao

de microrganismos, aquando da realizao da recolha da amostra. Em alguns casos, a

presena de surfactante provoca um aumento do nmero de colnias, por desagregao de

grupos de organismos, aumentando deste modo, falsamente, o nmero de UFC (Lelieveld et

al., 2005).

Idealmente, as zaragatoas devero ser processadas logo aps a recolha da amostra,

contudo essa situao nem sempre possvel, especialmente se a colheita realizada

longe do laboratrio. Ento, as zaragatoas tm que ser transportadas a temperaturas

inferiores a 5 C, mas sem permitir a sua congelao. Esta condio faz com que as

diferenas microbiolgicas sejam mnimas, quando comparadas com zaragatoas que so

processadas logo aps a colheita (Lelieveld et al., 2005).

Em qualquer indstria alimentar, fundamental a resposta rpida das anlises

efectuadas a determinado produto, equipamento ou superfcie, uma vez que a presena de

contaminao microbiolgica pode implicar a perda de produto ou mesmo um problema de

sade pblica, com todos os custos que isso implica.

J quando se trata de indstria onde existem planos de HACCP implementados, a

questo agudiza-se, porque na monitorizao de Pontos Crticos de Controlo, de um

fluxograma, so muitas vezes necessrios resultados quase imediatos, para que possam

ser reproduzidas aces correctivas em tempo til.

16

As desvantagens apontadas anteriormente anlise microbiolgica clssica,

particularmente no que se refere ao tempo de resposta so factores muito importantes

nestes casos, o que ter a na base, entre outros factores, da procura de um mtodo

microbiolgico de resultados mais expeditos.

Os principais objectivos dos mtodos rpidos so contribuir para aumentar a

eficincia dos laboratrios, simplificar o trabalho, aumentar a capacidade analtica e reduzir

os custos (Hygiena, n.d.; Easter, 2003), o que permitiu o crescimento acelerado do mercado

dos mtodos rpidos.

Entre os vrios testes propostos, referem-se o teste de deteco de ATP por

bioluminescncia e o teste de deteco de protena.

1.3 Teste de deteco de ATP por Bioluminescncia

O ATP, importante fonte de energia intracelular, est presente em todos os seres

vivos; sendo usado em diversas funes celulares, desempenha um papel importante na

troca de energia nos sistemas biolgicos, servindo como dador de energia.

Resduos de produtos alimentares, contm elevada quantidade de ATP; as clulas

microbianas tambm contm ATP; aps higienizao de equipamentos e superfcies de

contacto com produtos alimentares, a quantidade de ATP dever ser reduzida.

A descrio bioqumica da reaco de bioluminescncia foi feita em 1940, e a

determinao de ATP usando o sistema luciferina/luciferase foi descrito em 1949

(Hawronskyj & Holah, 1997; Patel, 1994). Contudo, o desenvolvimento e aplicao de

mtodos baseados na deteco de ATP, teve incio nos anos 80, com a empresa Lumac

(Easter, 2003); nessa altura, a medio de ATP por bioluminescncia, destinava-se

deteco de microrganismos nos alimentos e monitorizao da higiene, um indicador rpido

do nvel de material biolgico presente em superfcies e em lquidos, principalmente nos

sistemas aeroespaciais da NASA (National Aeronautics and Space Administration).

Estes testes dispensam a sementeira e cultura em meios apropriados e os resultados

surgem em segundos ou minutos, contrariamente a horas ou dias como acontece com as

metodologias clssicas. Pode considerar-se que representam a verdadeira inspeco ao

processo de higienizao, porque para alm dos microrganismos detectam tambm

resduos de alimentos, resultantes de uma higienizao deficiente.

Estes resduos, podem potenciar o desenvolvimento de microrganismos presentes se

as condies ambientais forem propcias, em termos de tempo e temperatura, alm de

17

poderem ser origem de contaminao cruzada de outros alimentos e nalguns casos,

alergias alimentares (Patel, 1994; Lelieveld et al., 2005).

A ATPmetria um mtodo que detecta baixos nveis de contaminao (Redsven et

al., 2007), e por isso pode ser utilizada, em todos os locais onde se processam alimentos,

sejam hospitais, restaurantes, supermercados ou indstrias diversas, locais onde a rpida

avaliao de contaminao e do nvel higinico das superfcies e gua tem elevado

interesse, uma vez que contribui para a produo de alimentos seguros, de qualidade e

reduz os custos inerentes deteriorao de alimentos.

uma tcnica amplamente utilizada, todavia a interpretao do que se avalia nem

sempre simples. Simm, Andrade, Mendona, Passos & Chaves (2006) realizaram um

estudo de ATPmetria, com substncias orgnicas vulgarmente detectadas em indstrias

alimentares, em superfcies de ao inoxidvel, nomeadamente -casena (3,5; 7,0 e 11,0 mg/ml) representando protenas, sacarose (0,6; 1,2 e 11,0 mg/ml) representando os

acares e banha de porco (7,0; 14,0 e 21,0 mg/ml) representando as gorduras. Estas

concentraes foram determinadas em ensaios prticos, e representam os valores destes

compostos, determinados nas referidas superfcies aps finalizada a higienizao. O mesmo

estudo, incluiu tambm concentraes de Staphilococus carnosus (5,4 x 109 e 5,4 x 104

CDM/ml) e Bacillus subtilis (2,9 x 107 e 2,9 x 103 CDM/ml), bactrias obtidas por contagem

directa ao microscpio (CDM).

O estudo mostrou que as solues contendo substncias orgnicas isoladas ou

associadas entre si ou com esporos de Bacillus subtilis forneciam resultados considerados

satisfatrios, ainda que ressalvando a importncia dos resultados falso negativos, porque a

concentrao de ATP do esporo bacteriano 10000 vezes menor que a prpria bactria.

Suspenses de Staphilococus carnosus associados s substncias orgnicas ou

isoladamente, forneceram resultados insatisfatrios. Os seus autores concluem que esta

tcnica pode ser usada para monitorizao da higiene, desde que associada com outros

mtodos como a contagem microbiana.

A bioluminescncia um fenmeno amplamente observado na natureza, ocorrendo

nas profundezas dos oceanos, em alguns insectos, bactria, fungos e numa variedade de

outros organismos (Patel, 1994; Liu, Vico & Lindh, 2008).

A bioluminescncia, (do grego bios vivo e do latim lumen luz) a luz produzida

num sistema biolgico, com uma taxa de eficincia de 96% (Rocha, 2007).

O fenmeno de luminescncia ocorre (Fig. 1) quando uma molcula excitada pela

absoro de energia, proveniente de uma reaco qumica, retoma ao seu estado inicial

com emisso luminosa. Nestas reaces os substratos so de origem biolgica, as enzimas

luciferases (oxigenases), utilizam o oxignio molecular para oxidar o substrato (luciferina),

traduzindo-se esta reaco pela emisso de um foto por cada molcula de ATP (Liu et al.,

2008).

18

Figura 1 Reaco de deteco de ATP por bioluminescncia (Adaptado de: Liu, Vico & Lindh,

2008).

A medio do ATP por bioluminescncia requer usualmente a amostragem de uma

rea com, aproximadamente, 100 cm2 (Moore & Griffith, 2002b Hygiena, n.d.).

A luz emitida tem caractersticas muito precisas em termos de cor, intensidade e

polarizao e a sua quantidade proporcional ao valor total de ATP na superfcie e, por

conseguinte, sua limpeza (Rocha, 2007). A quantidade de ATP no interior das clulas

varia com o tipo de clula, e com a fase da curva de crescimento em que se encontra

(clulas em stress ou na fase estacionria de crescimento contm menor quantidade de

ATP).

O complexo luciferina-luciferase (a luciferase pode ser obtida do pirilampo

Americano, Photinus pyralis), converte a energia qumica associada ao ATP em luz, numa

reaco em que h proporo molar, ou seja, um foto de luz produzido pela hidrlise de

uma molcula de ATP. Os reagentes esto formulados de forma que haja emisso de uma

luz verde amarelada. A luz emitida medida em relative light units (RLU) (Hawronskyj &

Holah, 1997; Aycicek, Oguz & Karci, 2006).

As leituras obtidas devero ser comparadas com as leituras padro, determinando se

uma superfcie se encontra limpa ou no. Em poucos minutos, esta tcnica permite afirmar

se a superfcie em estudo se encontra ou no apta para entrar em contacto com alimentos.

A formulao qumica dos reagentes varia com a marca do aparelho, contudo, todos

contm o complexo luciferina-luciferase, ies de magnsio, soluo tampo e extractores

(para remover o ATP das clulas vivas). Variam quanto ao prazo de validade, uma vez que

o mesmo est relacionado com a sua composio assim como com a temperatura de

armazenamento (Lelieveld et al., 2005).

A reaco catalisada pela enzima luciferase, a qual utiliza a energia contida numa

molcula de ATP (rica em energia), conduzindo descarboxilao oxidativa da luciferina,

cujo resultado a produo de luz, com um pico de ocorrncia aos 0,3 segundos (Patel,

1994).

A actuao ptima das enzimas luciferases est condicionada a certas condies:

pH 7,75 e temperatura entre 20-22 C (Hawronskyj & Holah, 1997; Niza Ribeiro, Cerqueira,

Santos & Louz, 2002). Alteraes de pH, temperatura, presena de ies metlicos (Zn2+,

Cd2+ e Hg2+), podem reduzir a luz emitida ou detectada (Patel, 1994).

19

Algumas indstrias reclamam um teste que se mantenha estvel temperatura

ambiente, contudo essa varia consideravelmente em funo do clima, o que obrigaria as

indstrias produtoras destes aparelhos e das zaragatoas a produzirem diferentes produtos

de acordo com a amplitude trmica do pas (Lelieveld et al., 2005).

O valor de ATP varia consideravelmente de acordo com o gnero alimentcio em

presena. Alguns alimentos frescos, como tomate, apresentam valores elevados, enquanto

outros alimentos, especialmente os muito processados, ricos em gordura, leo ou acar,

mostram valores de ATP muito baixos (Lelieveld et al., 2005).

Na produo de leite em p, ou na mistura de farinhas e de acares, os

procedimentos de limpeza no removem todos os detritos, pelo que, nestes casos, no

possvel utilizar a tcnica de deteco de ATP por bioluminescncia.

Os detergentes usados na limpeza, podem provocar uma diminuio ou aumento dos

indcios de ATP. Por este motivo, desejvel, para haver consistncia nos resultados,

garantir que os agentes de limpeza, so removidos por enxaguamento, antes de o teste ser

executado. Contudo, para reduzir ao mximo essa interferncia, muitos kits comerciais

contm na sua constituio substncias neutralizantes como a lecitina, tween 80 ou a

ciclodextrina (Forsythe, 2002; Lelieveld et al., 2005).

De acordo com Costa, Andrade, Brando, Passos & Soares (2006), o hidrxido de

sdio, utilizado na higienizao da indstria de lacticnios no interfere com a deteco de

ATP por bioluminescncia. Esta opinio contrria de outros autores que comprovaram a

aco inibitria dos sais de sdio sobre a luciferina (Rodionova & Petushkov, 2006).

A repetibilidade e confiana dos instrumentos e dos seus testes podem variar

consideravelmente de acordo com os fabricantes, mas regra geral so superiores aos testes

realizados recorrendo microbiologia clssica com recurso ao uso de zaragatoas (Lelieveld

et al., 2005).

A sensibilidade dos instrumentos disponveis, bem como dos seus testes varivel,

e tem sido discutido qual o limite de sensibilidade adequado aos testes. A resposta a essa

questo prende-se com o facto de cada teste, numa indstria, ter a capacidade de distinguir

entre uma superfcie eficientemente limpa de uma ineficientemente limpa.

Os testes altamente sensveis so mais adequados quando, por exemplo, se

pesquisam microrganismos potencialmente patognicos, ou em situaes em que difcil

distinguir se uma superfcie est efectivamente limpa ou no.

Contudo, alguns estudos referem que a tcnica de deteco de ATP por

bioluminescncia apenas detecta microrganismos quando a sua contagem for superior a 103

ou 104 UFC/cm2, enquanto que outros se referem a 100 cm2 ou zaragatoa, o que mostra

que no h unanimidade de opinies de autores, e parece ser uma limitao do mtodo,

quando comparado com os mtodos tradicionais que conseguem detectar

20

A ATPmetria pode ainda ser adaptada num teste para determinao de resduos de

substncias alergnicas, sendo para tal necessrio que detecte entre 0,1 e 5 ppm (partes

por milho) de alergnios em resduos de alimentos (Lelieveld et al., 2005).

A dimenso dos primeiros luminmetros condicionava-os ao uso exclusivo em

laboratrio; os seus reagentes eram fornecidos sob a forma de p liofilizado, em frascos

contendo 25 ou 50 testes e aps re-hidratao duravam apenas 1 a 2 dias, o que os tornava

muito dispendiosos. O seu manuseamento apenas podia ser realizado por um analista

especializado (Easter, 2003).

Actualmente, os luminmetros possuem um tamanho reduzido, o que possibilita o

seu transporte, facilitando desta forma a sua utilizao quer em laboratrio quer fora deste,

por exemplo na prpria rea de produo. Adquiriram desta forma uma dupla vantagem

por um lado as amostras podem ser imediatamente lidas, minimizando a possibilidade de

alterao dos resultados, por outro lado, os responsveis pela higienizao da fbrica

verificam se esta foi realizada de forma eficaz ou no (Easter, 2003).

Alguns luminmetros, mais recentes, podem ser ligados a um computador ou

directamente a uma impressora. Os valores das leituras so transferidos para um programa

de software apropriado, permitindo a percepo dos locais onde a higienizao est a ser

bem ou mal realizada (Lelieveld et al., 2005).

Os programas informticos associados a este tipo de instrumentos, facilitam a

identificao das amostras e armazenam informao para posterior anlise. Futuramente,

pretendem-se luminmetros verdadeiramente portteis (do tamanha da palma da mo), sem

que isso implique uma diminuio da capacidade de realizao (performance) dos testes, ou

aumento do custo do aparelho (Lelieveld et al., 2005).

Os dispositivos de amostragem e respectivos reagentes, bem como as embalagens

tm igualmente evoludo; os reagentes encontram-se em compartimentos separados nas

zaragatoas de colheita, facilitando a realizao da tcnica e diminuindo os custos. Para

activar os reagentes segura-se com firmeza o tubo contendo a zaragatoa e usa-se o polegar

e o indicador para quebrar a vlvula. Agita-se levemente durante 5 a 10 segundos e o

dispositivo est pronto para ser colocado no luminmetro e realizada a leitura, at 1 minuto

aps a sua activao.

A extremidade da zaragatoa de colheita encontra-se acima do nvel de leitura, para

eliminar interferncias, aquando da leitura no luminmetro.

A empresa fornecedora dos luminmetros e respectivas zaragatoas faculta valores

recomendados em RLU para cada superfcie, determinados com base em mtodos

clssicos de microbiologia, relacionando-os com as leituras de ATP. Contudo, quem realiza

os testes tambm pode estabelecer os seus limites com base na mdia e desvio padro dos

resultados da sua amostragem. Assim, um resultado est inserido na categoria conforme,

quando o seu valor menor ou igual mdia dos resultados; na categoria cautela, quando

21

superior mdia mas inferior ou igual mdia adicionada ao desvio padro; na categoria

no conforme quando o valor superior mdia adicionada ao desvio padro (Hygiena,

n.d.). Quando se estabelecerem limites utilizando estas ferramentas, fundamental analisar

os resultados e, se necessrio, recalcular os limites, pelo menos uma vez por ano, ou

sempre que o programa de higiene ou alguns dos seus procedimentos seja alterado, de

forma a optimizar os resultados e obter uma melhoria contnua dos padres.

Os dispositivos de amostragem, quando armazenados refrigerados entre 2 C e 8 C

tm uma validade de cerca de 12 meses, mas se estiverem armazenados entre 8 C e 25 C

duram apenas 6 semanas. Os dispositivos de amostragem devem manter-se temperatura

ambiente durante 2-5 minutos antes da utilizao (Easter, 2003; Hygiena, n.d.).

As principais vantagens de ATPmetria so a rapidez, o baixo nvel de deteco,

incluso de todos os tipos de microrganismos activos, fcil interpretao dos resultados,

automatizao e anlise local; a principal desvantagem a no indicao da presena de

microrganismos potencialmente patognicos nas superfcies (Hawronskyj & Holah, 1997;

Rocha, 2007).

O teste ideal deveria detectar microrganismos e resduos alimentares com

sensibilidade suficiente, a sua eficcia deveria ser semelhante quando realizado sobre

superfcies secas ou hmidas, deveria ter boa repetibilidade e reprodutibilidade, deveria ser

fcil de manusear, pouco dispendioso, rpido, resistente e deveria possibilitar o

armazenamento dos dados (Lelieveld et al., 2005).

Larson et al. (2003) estabeleceram uma correlao significativa entre contagem de

microrganismos aerbios totais a 30 C e os valores provenientes das leituras de ATP, em

superfcies de diversos locais existentes em casas particulares.

Os testes alternativos ditos rpidos, devero ser encarados como um complemento

microbiologia clssica, num sistema integrado de controlo da qualidade, especialmente

quando se pretende estabelecer a relao entre a contaminao microbiana e risco de

doena infectante (Larson et al., 2003; Aycicek et al., 2006).

1.4 Mtodos de deteco de protena, fosfatos e hidratos de carbono

Alm do desenvolvimento e aplicao do teste de deteco de ATP por

bioluminescncia, como meio de monitorizar a limpeza, foram desenvolvidos outros testes

para detectar componentes de resduos alimentares e avaliar a eficcia da higiene.

Com o teste de deteco de protena pretendia-se desenvolver um teste

independente de instrumentos, cromognio, barato, simples e funcional, extensvel a

22

resduos qumicos, incluindo protenas, aucares redutores, NAD+ (nicotinamida adenina

dinucletdo) e fosfatos, individualmente ou combinados.

De acordo com os seus fabricantes, so apropriados para grandes e pequenas

indstrias de gneros alimentcios, assim como restaurantes e mercados, entre outros

(Easter, 2003).

Os testes conduzem, usualmente, produo de uma cor nica ou de uma

sequncia de cores. Aps um tempo determinado, entre 1 a 10 minutos, a alterao visual

da cor pode ser avaliada qualitativamente. A subjectividade do teste aumenta

consideravelmente quando utilizado em superfcies moderadamente sujas; a

subjectividade diminui em superfcies muito limpas ou muito sujas (Lelieveld et al., 2005).

Alguns testes tm o formato de zaragatoas, outros apresentam-se sob a forma de

tiras de plstico ou almofadas de material absorvente impregnado com os reagentes

apropriados.

De acordo com Griffith, Cooper, Gilmore, Davies & Lewis (2000), testes

independentes do uso de instrumentos e economicamente acessveis podem ser utilizados

em estabelecimentos de produo de alimentos, muitas vezes criticados pela baixa

sensibilidade para a monitorizao de higiene.

Em ensaios alternativos ao uso do ATP, os mtodos que detectam protena possuem

grande potencial, quando se trata de resduos de alimentos resultantes, por exemplo, de

carne de aves, bovinos ou sunos ou de produtos lcteos, devido ao seu elevado contedo

em protena. De notar, no entanto que, em testes realizados a alguns alimentos no

proteicos, se verificou a reduo dos componentes da reaco do biureto, e consequente

mudana de cor, o que representa afinal, tambm, ausncia de limpeza (Lelieveld et al.,

2005).

A maior parte dos testes que se baseiam na deteco de protena, utilizam a reaco

do Biureto (Fig. 2).

Figura 2 Reaco do biureto para deteco de protena (Adaptado de: Forsythe, 2002 ).

Assim, sob condies alcalinas, as ligaes peptdicas das protenas formam um

complexo com o Cobre II (Cu2+) do reagente biureto.

Esta reaco, adicionada de cido bicinchoninico (bicinchoninic acid BCA), produz

uma intensa cor roxa. Neste teste, a palavra de ordem usada dever ser if its green its

23

clean se est verde, est limpo. A cor verde significa limpo, os resultados mais

pretendidos; cor cinzenta indica resultado medocre, deve voltar-se a enxaguar ou a

higienizar ou a repetir o teste; cor roxa sinnimo de resultado negativo, tem que se voltar a

higienizar (Lelieveld et al., 2005).

Desinfectantes em concentraes normais no causam interferncia ou falsos

positivos; em alguns casos elevadas concentraes de produtos alcalinos podem originar

resultados falso-negativos, enquanto que desinfectantes base de perxidos podem causar

uma reaco de mudana de cor com resultado falso positivo (Hygiena, n.d.).

boa prtica aguardar um perodo de tempo adequado aps a limpeza, antes de se

realizar a anlise superfcie. importante, em qualquer programa de colheita de amostras,

estabelecer um procedimento de amostragem consistente e fcil de reproduzir.

Para assegurar melhores resultados, a colheita dever ser feita aps a limpeza com

o detergente ou aps enxaguamento, mas antes da desinfeco final. A presena de

resduos na superfcie aps a limpeza com detergente reduz a eficcia do desinfectante, por

este motivo a realizao do teste nesta fase previne desperdcios de tempo e de produtos

qumicos.

O teste no foi concebido como ferramenta de deteco microbiolgica, mas se

existirem mais de 107 UFC a colorao do teste altera-se como quando na presena de

protena (Hygiena, n.d.).

O armazenamento a temperatura entre 2 e 25 C permite uma validade de 12 meses.

Entre 26 e 35 C, a sua validade significativamente reduzida para 2 semanas. Em situao

alguma se deve congelar os testes (Hygiena, n.d.).

As zaragatoas devem ser mantidas temperatura ambiente uns minutos antes da

sua utilizao, o que aumenta a rapidez da reaco e aumenta a sensibilidade. A ttulo de

exemplo, quando as zaragatoas esto temperatura ambiente (15 25 C) tm capacidade

de detectar 500 g/100 l, enquanto as mantidas a temperaturas superiores (37 C), nas mesmas condies, apenas conseguem detectar 100 g/100 l (Hygiena, n.d.). Sendo um teste semi-quantitativo, d uma ideia aproximada da concentrao de

protena presente. Quando a cor obtida verde, a concentrao varia entre 0-30 g/100 l de protena; cinzento corresponde a uma concentrao de protena entre 50-80 g/100 l e roxo corresponde a uma concentrao superior a 100 g/100 l protena (Hygiena, n.d.). Trata-se de uma tcnica mais rpida do que as de microbiologia tradicional, mais

barata que a bioluminescncia por ATP, mas, dependendo do tipo de alimento analisado, ao

mesmo tempo, menos sensvel do que esta (Forsythe, 2002; Lelieveld et al., 2005).

A intensidade da cor e a rapidez da sua produo funcionam como indicadores do

nvel de sujidade, se bem que os resultados so usualmente fornecidos em termos de limpo

ou no limpo.

24

Curiosamente, a tcnica de deteco de protenas serviu de base, segundo

Lipscomb, Pinchin, Collin, Harris & Keevil (2006), para o desenvolvimento de uma nova

tcnica de epifluorescncia utilizando um corante fluorescente, designada comercialmente

por SYPRO Ruby. Detecta protenas e pries, especialmente em instrumentos cirrgicos, os

quais, segundo os mesmos autores, so muitas vezes responsveis por infeces

nosocomiais, muitas das quais com desfecho fatal.

O NAD+ e compostos semelhantes so resduos qumicos, extensamente distribudos

no material biolgico, incluindo nos alimentos e nos microrganismos. Desta forma, o nvel de

NAD+ em superfcies, fornece informao relativa sujidade orgnica. detectado numa

reaco qumica que conduz uma reaco visvel, com cores que alteram gradualmente de

amarelo a roxo numa escala de 0 6, em 5 minutos (Lelieveld et al., 2005).

Nos kits de deteco de resduos qumicos, a ausncia de reaco positiva no

implica, necessariamente, ausncia de microrganismos. Estes testes podem ser mais ou

menos sensveis, e importante test-los e ter em conta o tipo de alimento produzido.

Outros testes baseados em zaragatoas, podem ser usados para detectar glucose ou

glucose e lactose, este ltimo com efeito prtico na indstria dos lacticnios. Os resultados

so obtidos em 60 segundos. Devido colorao resultante da reaco, os resultados

devem ser lidos, if it turns green it isnt clean se se torna verde no est limpo, o que

pode causar alguma confuso com os resultados dos testes da protena.

Na maior parte dos casos, um teste menos sensvel do que o teste do ATP, mas

considerado para alguns resduos de alimentos como razovel, e rpido para um teste no

baseado em instrumentos (Lelieveld et al., 2005).

Outra opo um teste de fitas, contendo enzimas que detectam fosfatos e hidratos

de carbono. Por aco da capilaridade as fitas absorvem resduos de alimentos de

superfcies molhadas com os reagentes do teste. Quando as tiras do teste j esto

suficientemente molhadas adquirem tom cinzento-escuro; em presena de resduos de

alimentos, a sua cor altera-se para roxo em 120 segundos. As vantagens deste teste,

quando comparado com testes recorrendo a zaragatoas, prende-se com a sua simplicidade,

baixo custo de produo e transporte. Pode tambm ser utilizado para monitorizao da

higiene das mos (Lelieveld et al., 2005).

Estes testes so menos sensveis do que o de leitura ATP por bioluminescncia, mas

facultam um teste simples e semi-quantitativo, para avaliao de higiene fabril.

Estes mtodos no tm necessariamente que substituir os tradicionais, utilizando

meios de cultura. Tm, antes, que ser vistos como uma informao adicional ao programa

de segurana alimentar, adquirida num curto espao de tempo, facilitando desta forma uma

aco correctiva imediata, optimizando o processo e reduzindo os custos associados a

alimentos alterados.

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2. Materiais e Mtodos

O objectivo deste estudo foi tentar obter algum tipo de relao entre os resultados

obtidos pelas contagens de microrganismos aerbios totais a 30 C e de Enterobacteriaceae

e os resultados obtidos atravs de deteco de ATP por bioluminescncia e de deteco de

protena, tendo em vista, adoptar um dos mtodos ditos rpidos, na verificao da eficcia

do plano de higienizao implementado.

O estudo foi realizado numa sala de acesso restrito, mantida a 12 C, onde se fatiam

produtos transformados base de carne, prontos a consumir, acondicionados em atmosfera

protectora, nomeadamente presunto, fiambre, toucinho fumado, paio, mortadela e fiambre

de frango.

Utilizaram-se no estudo duas das trs fatiadoras existentes na sala. Na fatiadora

nmero 1, fatiam-se, maioritariamente, produtos de marca prpria, pelo que durante o dia se

verifica pouca alternncia de produtos. Na fatiadora nmero 3, fatiam-se produtos de

diferentes marcas, logo, ao longo do dia, fatiam-se uma grande heterogeneidade de

produtos.

Foram efectuadas 48 recolhas para cada tipo de anlise, divididas entre as 2

mquinas de fatiar; em cada mquina colhiam-se amostras na lmina (local 1) e no tapete -

tela transportadora (local 2). Desta forma, na mquina 1 colheram-se 11 amostras de cada

local e na mquina 3, 13 amostras, igualmente de cada local.

Em cada mquina trabalha um grupo de 4 a 5 pessoas, constante, salvo raras

excepes, responsvel pelas operaes de fabrico e limpeza. Cada funcionrio usa

equipamento de proteco individual, constitudo por calas e tnica brancas, botas de

borracha branca, touca, luvas, mscaras, aventais e manguitos descartveis, colocados

apenas no momento de entrada na sala de fatiados. O acesso a esta sala est condicionado

por uma desinfeco das mos, por meio de um sensor automtico, que ao mesmo tempo

abre automaticamente a porta.

Os ensaios realizados nas mquinas 1 e 3, ocorreram durante a higienizao

intermdia, ou seja, entre o fim de fatiagem de um produto e o incio da de outro, excepto

um caso, em ambas as mquinas que ocorreu no incio da laborao, ou seja, a

higienizao foi realizada no dia anterior.

Na mquina 1, 5 ensaios aps terminar a fatiagem do presunto e antes de iniciada a

do fiambre; 2 quando terminou a fatiagem do fiambre e se iniciou a da mortadela; outros 2

na passagem de toucinho fumado a fiambre; 1 de paio para fiambre e 1 no incio da

laborao, ou seja, a higienizao tinha sido realizada no dia anterior.

Na mquina 3, 3 a