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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA ULTRAESTRUTURA E AÇÃO DE DESINFETANTES
EM Trypanosoma vivax (Ziemann, 1905)
Darling Mélany de Carvalho Madrid
Orientadora: Valéria de Sá Jayme
GOIÂNIA
2017
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DARLING MÉLANY DE CARVALHO MADRID
AVALIAÇÃO DA ULTRAESTRUTURA E AÇÃO DE DESINFETANTES
EM Trypanosoma vivax (Ziemann, 1905)
Dissertação apresentada para obtenção de título de Mestre
em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da
Universidade Federal de Goiás.
Área de concentração:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos
Orientadora:
Profa. Dra. Valéria de Sá Jayme- EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Profa. Dra. Maria Auxiliadora Andrade- EVZ/UFG
Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares - EVZ/UFG
GOIÂNIA
2017
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AGRADECIMENTOS
Um grande abraço e minha gratidão a todos que me apoiaram durante todo o
decorrer do mestrado. São muitos os que me ajudaram com opiniões, força de trabalho, ideias
ou, as vezes, uma mão amiga e palavras de incentivo
Agradeço a minha orientadora, professora doutora Valéria de Sá Jayme pela
infinita paciência e carinho. Aos meus co-orientadores, professora doutora Maria Auxiliadora
de Andrade e professor Guido Coelho Linhares por todo o apoio, principalmente durante a
elaboração do projeto. Ao professor doutor Welber Daniel Zanetti Lopes, pelo apoio na
elaboração do projeto e opiniões pertinentes.
À professora doutora Walquíria Arruda, do Instituto de Ciências Biológicas da
UFG, pelo apoio incondicional e por me esclarecer tantas dúvidas na elaboração dos
protocolos de microscopia. Ao LABMIC da UFG e todos seus técnicos, em especial ao
Henrique Santiago de Camargo.
Aos meus colegas de pós-graduação e aos amigos, que além de me apoiarem
emocionalmente, sempre me auxiliaram nos trabalhos. Vocês são muitos para citar mas, em
especial, obrigada a Leda Castaño, Thiago Souza, Luiza de Paula, Rayssa Galvão e Felipe
Sales.
Aos meus pais e irmãos, que me apoiaram em absolutamente todos os momentos.
Obrigada a todos. Sem vocês, nada disso seria possível.
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RESUMO
Trypanosoma vivax (Ziemann, 1905) é o protozoário responsável por causar a tripanossomíase em bovinos, doença que atualmente expressa caráter epidêmico no Brasil e, no estado de Goiás, foi identificada pela primeira vez em 2015. Por ocasionar aborto, letalidade e grande queda de produção de leite, a tripanossomíase pode gerar grandes prejuízos ao produtor, principalmente os que trabalham com bovinocultura de leite. Apesar disto, ainda não há muitas informações disponíveis sobre este protozoário no Brasil. Considerando a necessidade de conhecer mais as características dos isolados presentes no país a fim de avaliar sua prevalência real, impacto na economia e, principalmente, desenvolvimento de programas de controle, este trabalho se propôs avaliar a morfometria do parasito em microscopia eletrônica de varredura e a eficácia de diferentes desinfetantes na sua eliminação. A microscopia eletrônica de varredura é uma técnica de alta resolução empregada para analisar a estrutura externa do parasito, que apresenta diferenças morfométricas entre os isolados na América Latina e no Brasil. Neste trabalho, ficou evidenciado que não há diferença de tamanho entre os isolados encontrados no Brasil e em Goiás. Os resultados da avaliação da eficácia dos desinfetantes em eliminar o agente demonstram que diversos desinfetantes comumente encontrados no mercado podem ser empregados. Estas informações podem ser aplicadas diretamente em propriedades para auxiliar no controle de surtos e contribuir na redução dos impactos causados nos rebanhos bovinos de leite brasileiros.
Palavras-chave: Desinfecção, microscopia eletrônica, tripanossomíase
ix
ABSTRACT
Trypanosoma vivax (Ziemann, 1905) is a protozoon responsible for causing trypanosomiasis in bovines, a disease currently increasing in Brazil and, in the state of Goiás, it was first identified in 2015. As it causes abortion, lethality and greatly diminishes milk production, trypanosomiasis may cause significant losses to farmers, especially those working with milk production. However, there is not much information about this protozoon in Brazil. As it is necessary to gather more knowledge about isolates in the country to evaluate the disease real prevalence, impact in economy and, more importantly, develop control programs, this work proposed evaluate the morphometry of this parasite in scanning electron microscopy and the efficacy of different disinfectants in its elimination. Scanning electron microscopy is a high-resolution technique used to analyze the external structures of the parasite, which shows morphometric differences between Latin America and Brazilian isolates. In this work, it was shown that there is no size difference among isolates found in Brazil and Goiás. The results of disinfectants efficacy evaluation to eliminate this agent have shown that many disinfectants commonly found in the market may be used. This information may be applied directly in farms to help control infection focus and contribute in reducing the disease impact in Brazilian milk production.
Key words: Disinfection, electron microscopy, trypanosomiasis
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xi
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................... 3
2.1 Impacto econômico de tripanossomíase bovina ................................................................... 3
2.2 Tripanossomíase bovina por T. vivax no Brasil .................................................................. 5
2.3 Trypanosoma vivax em bovinos ........................................................................................... 6
2.3.1 Morfologia ......................................................................................................................... 7
2.3.2 Ciclo de vida ..................................................................................................................... 9
2.3.3 Sinais clínicos .................................................................................................................. 11
2.3.4 Diagnóstico ..................................................................................................................... 13
2.3.5 Microscopia eletrônica de varredura ............................................................................... 14
2.3.6 Tratamento e controle ...................................................................................................... 15
3 OBJETIVOS ......................................................................................................................... 17
3.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 17
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 17
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 18
4.1 Local de experimento ......................................................................................................... 18
4.2 Determinação de animais com tripanossomíase ................................................................. 18
4.3 Colheita de sangue ............................................................................................................. 18
4.4 Morfometria do parasita por Microscopia Eletrônica por Varredura ................................. 18
4.5 Teste de eficácia de desinfetantes para Trypanosoma vivax .............................................. 19
4.6 Análise estatística ............................................................................................................... 20
5 RESULTADOS ..................................................................................................................... 22
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 27
7 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 31
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 32
xii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Distribuição de Trypanosoma vivax nas Américas e na África, adaptado28.........3
FIGURA 2 – Divisão de genótipos de Trypanosoma vivax por sequência de gene 18s rRNA,
adaptado18............................................................................................................7
FIGURA 3 – Ciclo de vida do Trypanosoma vivax, (a) e (c) são formas tripomastigotas
presentes no sangue bovino; (b) é a forma de divisão no sangue; (d) é a forma
final no sangue de camundongos; (e) e (f) são tripomastigotas em região de
probóscide de uma tsé-tsé; (g) é a forma epimastigota se dividindo na
probóscide; (h) e (i) são formas aderidas à probóscide; (j) e (k) são formas
metacíclicas na hipofaringe de uma tsé-tsé, adaptado20....................................10
FIGURA 4 – Esquema de teste para eficácia de desinfetantes.................................................20
FIGURA 5 – Microscopia eletrônica de varredura de isolado de Trypanosoma vivax
encontrado no estado de Goiás com núcleo visível e presença de granulosidade
no corpo.............................................................................................................22
FIGURA 6 – Microscopia eletrônica de varredura de isolado de Trypanosoma vivax
apresentando posterior arredondado (A) e fino (B)...........................................23
FIGURA 7 – Microscopia eletrônica de varredura apresentando formas mais compactas com
núcleo não distinguível em isolado de Trypanosoma vivax encontrado em
Goiás................................................................................................................. 23
FIGURA 8 – Microscopia eletrônica de estágio final de fissão binária em tripomastigota de
isolado de Trypanosoma vivax encontrado em Goiás.......................................24
FIGURA 9 – Quantidade de Trypanosoma vivax vivos encontrados em lâmina após
tratamento com desinfetantes testados..............................................................25
FIGURA 10 – Quantidade de Trypanosoma vivax vivos encontrados em lâmina em controle e
após tratamento com solução de álcool 10%, iodo 0,1%, CB-30 e sabão.........26
xiii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – Média de quantidade de parasitos vivos e móveis após tratamento com oito
soluções de desinfetantes ao longo de um período de contato de 30 minutos.....24
1 INTRODUÇÃO
Trypanosoma é um protozoário flagelado que pode ser encontrado em vários
tecidos de seu hospedeiro, dentre eles o sangue, e é responsável por ocasionar a doença
chamada tripanossomíase. Uma espécie de Trypanosoma patogênico pertencente ao sub-
gênero Duttonella1, Trypanosoma vivax (Ziemann, 1905), vem se destacando por seu
crescente impacto econômico em bovinos no Brasil2. O agente tem sido responsável por
perdas econômicas devido à alta taxa de letalidade, diminuição de taxa de fertilidade,
aumento do número de abortos, e elevação de custos com tratamento3.
A bovinocultura é uma atividade de grande destaque em Goiás; em 2015 o
estado era o quarto maior produtor de leite, totalizando 3,518 bilhões de litros naquele ano, e
possuía o segundo maior rebanho de bovinos de leite do país4. A produção de leite e de
carne vem aumentando no estado e no país, sendo que só no quarto semestre de 2016 o país
teve faturamento de mais de um milhão de dólares com exportação de carne bovina in
natura5.
No Brasil, a tripanossomíase foi registrado pela primeira vez em 1972, ao ser
identificado em surto no Pará6, e desde então a doença já se disseminou para outros 12
estados7-18 sendo Goiás o mais recentemente afetado, com casos diagnosticados em 201518.
Estima-se que um rebanho doente, quando tratado, tenha seu valor reduzido em 4%,
enquanto um rebanho não tratado possa sofrer perdas de até 17% em seu valor total3. Além
disto, pode ocorrer queda de até 47% na produção diária de leite, gerando mais prejuízos2.
Como estratégia de tratamento para controlar a doença, o diaceturato de
diminazene19 e o cloridrato cloruro de isometamidium20 são empregados como forma
terapêutica ou mesmo preventiva1,21. Contudo, casos de resistência do agente a ambas as
drogas já foram relatados em algumas regiões1,22. Outras medidas de manejo podem ser
tomadas, como o controle de tabanídeos, vetores da doença10, e minimização de formas
iatrogênicas de transmissão, como por exemplo a reutilização de agulhas em mais de um
animal14. Entretanto, mesmo sendo informados sobre as formas de transmissão da doença,
por vezes os produtores não modificam sua forma de manejo, ou modificam de forma
ineficiente, mantendo a disseminação do parasito no rebanho.
Destaca-se que análises morfométricas dos parasitos revelaram polimorfismo
nas amostras avaliadas em diferentes países16,23,24. Geralmente, os espécimes apresentam
aproximadamente 16 a 26,5µm1, no entanto já foram detectados em diversas regiões T. vivax
com menor comprimento quando comparado às cepas africanas. A caracterização
2
morfométrica de diferentes isolados pode ajudar a compreender melhor a sua epizootiologia
e patogenicidade25 sendo portanto uma ferramenta de auxílio na implantação de programas
de controle para a doença. A microscopia eletrônica utiliza-se de técnicas versáteis que
permitem a análise em alta resolução de microestruturas em diversas amostras26, inclusive
biológicas27,28.Deste modo, esta técnica permite adquirir maior conhecimento sobre a
organização estrutural de parasitos27.
Por se tratar de uma doença emergente em Goiás, ainda não se conhece a
ultraestrutura dos parasitos desta região. Por isso, pretendeu-se com este trabalho realizar
investigação dos aspectos morfométricos de T. vivax parasitando bovinos e proceder sua
comparação com características do agente já descritas em outras regiões, visando identificar
possíveis diferenças.
Considerando ainda que os estudos realizados no estado apontaram fômites, em
especial agulhas reutilizadas, como principal forma de transmissão do agente, foi proposto
também avaliar a sensibilidade do protozoário frente a diferentes desinfetantes comumente
utilizados. Com isso, espera-se reduzir os riscos de disseminação da enfermidade e
minimizar seus impactos sanitários e econômicos, o que se reveste de importância ao se
considerar a participação da pecuária na economia estadual.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Impacto econômico de tripanossomíase bovina
Trypanosoma vivax é um dos tripanosomas patogênicos com maior importância
econômica28 e maior extensão geográfica29, afetando principalmente bovinoculturas na
África e na América do Sul28. Conhecida como nagana ou souma na África e secadeira na
América do Sul20, este agente é o principal responsável por mortalidade e morbidade de
tripanossomíases em bovinos, causando prejuízos à saúde animal e a produtividade da
pecuária20.
Na América Latina, a doença já foi identificada em 15 países e dois
departamentos ultramarinos franceses, inicialmente na Guiana Francesa em 1919 e depois,
seja por diagnóstico parasitológico direto ou pesquisa de anticorpos, também foi encontrada
no Brasil31, Bolívia32, Cuba1, Colômbia33, Costa Rica34, El Salvador35, Equador1,
Guadalupe35, Guiana1, Guiana Francesa1, Martinica35, Panamá1, Paraguai35, Peru36,
Suriname1 e Venezuela37 (Figura 1).
FIGURA 1 – Distribuição de Trypanosoma vivax nas Américas e na África, adaptado38.
É considerada a terceira principal doença a afetar bovinos na Colômbia, ficando
atrás apenas de outras hemoparasitoses e fasciolose1. Os impactos da doença são mais
evidentes em propriedades com manejo inadequado de animais, que reaproveitam agulhas,
realizam tratamento inadequado e não possuem bom manejo nutricional, mas também
afetam a produção de propriedades bem manejadas. Neste país, foi relatado uma diminuição
4
de ganho de peso diário de bezerros Holstein e mestiço Holstein de 390 a 200 gramas por
dia. Venezuela é outro país também bastante afetado e na Bolívia, houve letalidade de 34%
durante um surto1.
Apesar de estudos sobre os impactos econômicos ocasionados pela doença
serem realizados desde sua citação na América Latina39, ainda são poucos29. Estima-se que o
prejuízo por animal seja de US$72 e perdas em rebanhos possam somar até
US$1000.000,0040. Além disso, há dificuldade em calcular com precisão as perdas
econômicas pois a enfermidade pode ocorrer concomitantemente com outras
hemoparasitoeses. Ademais, para analisar o impacto da doença em um rebanho, é necessário
analisar todos os animais infectados, não somente os aparentemente sintomáticos1 pois
bovinos infectados e assintomáticos podem diminuir a produção de leite em 20 a 25%41.
Com prevalência de infecção variando de 20 a 60%, a tripanossomíase em
bovinos causa consideráveis impactos na economia da América Latina. Áreas enzoóticas
para a doença podem apresentar variações de impacto clínico e baixa letalidade, o que pode
não demonstrar os prejuízos ocasionados pela doença1.
No Brasil foi realizado um estudo sobre o impacto econômico de
tripanossomíase no Pantanal do Mato Grosso e Mato Grosso do Sul, e estima-se que os
custos gerados foram de US$15 por animais, ou 4% o valor total de cada cabeça. Sem
tratamento, entretanto, o custo aumentou para US$64 por animal ou 17% do valor total do
rebanho42. O custo de tratamento em 2008 com cloruro de isometamidium, uma das drogas
recomendadas para tripanossomíase, foi estimado em US$37,80 por animal/ano para
prevenção em áreas de risco na região do pantanal43. Em um surto em São Paulo, em seis
meses a doença causou a morte de 31 animais e aproximadamente 56,84% de todo o
rebanho de 1080 animais foi afetado14, demonstrando a capacidade da doença em prejudicar
a produção de rebanhos bovinos brasileiros.
Estima-se que as tripanossomíases serão provavelmente permanentes na
América do Sul e continuarão a ter um impacto econômico persistente, mas variável. Tal
cenário ocorrerá mesmo em zonas enzoóticas pois o parasito tem grande capacidade de
infectar vários biungulados domésticos e silvestres20,35,43 e os surtos epizoóticos continuarão
se disseminando geograficamente e colonizando novas áreas ou afetando novamente áreas
previamente infectadas.
5
2.2 Tripanossomíase bovina por T. vivax no Brasil
Estima-se que a tripanossomíase tenha surgido na América do Sul por volta de
1830, através de importação de bovinos africanos infectados, possivelmente do Senegal,
oeste da África. Ela foi reconhecida pela primeira vez em 1919 na Guiana Francesa20.
Apesar de o vetor original não existir naturalmente nas Américas, a transmissão mecânica
por mucideos como Stomoxys calcitrans34 ou outras moscas hematófagas foi possível e a
doença se estabeleceu no continente8,35,43,44.
O primeiro caso de tripanossomíase bovina por Trypanosoma vivax foi relatado
em búfalos no estado de Pará, em 1972. O parasito aparentemente ficou restrito à região
norte durante aproximadamente duas décadas, ocorrendo também no estado do Amapá1,45.
Outros surtos foram posteriormente confirmados nos estados de Goiás, em 201546,47,
Maranhão11, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul8,42, Minas Gerais48,49, São Paulo14, Paraíba 50, Pará 51, Pernambuco 52, Rio de Janeiro53, Rio Grande do Sul54 e Tocantins12. No Brasil, o
parasito afeta tanto bovinos taurinos quanto zebus, com animais sintomáticos e
assintomáticos50.
Inicialmente, pensava-se que T. vivax ficaria restrito à áreas alagadiças e mais
propícias a disseminação de moscas55, mas ocorreram surtos em outras áreas e nem sempre
relacionados à forte presença de moscas12,45,46. Como a infecção pode produzir portadores
que apresentam recidivas sob condições de estresse, a doença pode se difundir para áreas
consideradas livres. Desequilíbrios ambientais e aumento de população de moscas
hematófagas, que realizaram potencialmente transmissão mecânica, também podem
contribuir para a disseminação do parasito55.
Alguns autores consideram que a presença do parasito nas Américas é um
exemplo de disseminação de um patógeno através da intervenção humana35, principalmente
devido a introdução de animais doentes em áreas previamente livres da doença e com
presença de vetores48. Em um estudo de 2016, foram analisadas diversas propriedades de
bovinos de leite em Minas Gerais através de soroprevalência por imunofluorescência
indireta (IF). Aproximadamente 49% das propriedades analisadas (40 no total) eram
positivas para a doença e nestas propriedades, cerca de 9,9% dos animais estavam
infectados. Uma característica é que tanto grandes quanto pequenas propriedades
apresentaram a doença, apesar de que as propriedades maiores, talvez devido ao alto nível
tecnológico empregado e manejo sanitário constante, tinham menor probabilidade de
estarem infectadas45.
6
2.3 Trypanosoma vivax em bovinos
O gênero Trypanosoma pertencente a família Trypanosomatidae, ordem
Kinetoplastida56,57 e é responsável por diversas doenças negligenciadas tanto em animais
quanto em humanos. Estes protozoários flagelados infectam principalmente vertebrados e
são encontrados em fluidos corporais como sangue, linfa ou líquido cerebroespinal e vários
outros tecidos1,56, afetando várias espécies de importância veterinária e até humanos57.
Grande parte do conhecimento sobre tripanossomas decorre de estudos com Trypanosoma
brucei por ter a capacidade de infectar humanos. Entretanto, em termos veterinários, T.
brucei é menos importante que outros patógenos transmitidos por moscas tsé-tsé (Glossina
spp.) como T. congolense e T. vivax29.
O Trypanosoma vivax descrito pela primeira vez na África em 1905. Em 1919
foi descoberto um tripanosoma patogênico para gado na Guiana Francesa, causando sinais
parecidos com o do africano. Tentaram nomeá-lo Trypanosoma guyanense, mas este nome
já existia para outra espécie e a morfologia e características biológicas eram muito
semelhantes ao T. vivax já descrito1.
A diversidade de tripanosomas africanos é maior que anteriormente pensada:
centenas de novas espécies foram descobertas, entretanto, nem todas são patogênicas.
Considera-se improvável que alguma espécie patogenicamente importante não tenha sido
detectada até hoje. Estas novas espécies são identificadas em moscas tsét-tsé, bovinos,
pequenos ruminantes, suínos e animais silvestres28.
Trypanosoma vivax pertence ao subgênero Duttonela, grupo Salivaria1, ,
diferenciando-se dos outros por se desenvolver exclusivamente na probóscide e bomba
cibarial da mosca tsé-tsé, vetor da doença 28,58. Tripanosomas salivários, aqueles excretados
pela saliva do vetor, são os que evoluem mais rapidamente dentre as espécies de
tripanosomatídeos e, dentre os salivários, o T. vivax é o que mais apresenta este
comportamento59.
Devido à diferença de tamanho das amostras encontradas nas Américas e ao
modo de transmissão distinto por não depender do vetor mosca tsé-tsé, já foi sugerido que o
T. vivax americano fosse reclassificado como uma nova subespécie, Trypanosoma vivax
viennei. Entretanto, esta sugestão não foi amplamente aceita e continuou-se a denominar os
patógenos encontrados na América de T. vivax39,59. Um dos fatores que desestimula esta
reclassificação é a semelhança genética entre isolados americanos e do oeste africano, cuja
divergência é em torno de 0,7%28,44,59. Há uma grande diferença, entretanto, entre isolados
africanos das regiões do Oeste e do Leste, tanto a nível genético quanto morfológico: os
7
isolados americanos são aproximadamente 3,2% divergentes dos do leste da África.
Atualmente, T. vivax está dividido entre genótipos A, B, C e Moçambique, diferenciados
principalmente por sequências de gene 18s rRNA28 (Figura 2). Entretanto, devido a estas
diferenças, alguns autores sugerem a reclassificação de T. vivax do leste da África em outra
espécie ou uma subespécie do subgênero T. (Duttonella)59.
FIGURA 2 - Divisão de genótipos de Trypanosoma vivax
por sequência de gene 18s rRNA, adaptado28.
Apesar dos isolados americanos e do oeste africanos serem geneticamente
próximos, em análises imunológicas observou-se que o sistema imune dos animais pode
desenvolver proteção total entre cepas colombianas, mas apenas proteção parcial para cepas
oeste africanas. De mesma forma, proteção parcial também foi observada entre isolados da
Guiana Francesa e Venezuela1,43. Além disto, divergências entre mapas proteicos 2.D,
patogenicidade, capacidade de infecção natural em camundongos e evolução geográfica
distintas implicam em questionamentos sobre a uniformidade de T. vivax como uma única
espécie29. Quanto mais conhecimento se obtiver da diversidade de tripanosomídeos, seus
hospedeiros mamíferos e patogenicidade, aumenta-se a chance de desenvolvimento de
medidas efetivas de controle para a doença28.
2.3.1 Morfologia
Trypanosoma vivax possui duas formas extracelulares: tripomastigota e
epimastigota. Na forma sanguínea, tripomastigota, o tamanho médio varia de 18 a 31µm de
comprimento, média 22µm e largura 1,5 à 3µm. Comparando com as cepas africanas, a sul
8
americana é ligeiramente menor (16 à 26,5µm). Possui flagelo livre (7µm) com final
posterior em formato de bastão20, membrana ondulante média e o cinetoplasto (1µm) é
distinto por ficar em posição terminal1,20,43. Semelhante ao T. brucei, pode ser também
diferenciado por seus movimentos rápidos vibracionais e translacionais no sangue20.
Na África, em seus hospedeiros principais e em camundongos, T. vivax
apresenta dimorfismo43: formas mais esguias e alongadas (slender) são observadas em
momentos de alta parasitemia, com o cinetoplasto localizado mais anteriormente29, e formas
menores e mais robustas predominantes em fase descendente de parasitemia43, apresentando
também antígenos de superfície diferentes1. Formas intermediárias já foram vistas em
animais inoculados43.
As formas esguias do T. vivax se assemelham a outras espécies de tripanosomas
por se encontrarem em fase estacionária na síntese de DNA. Estas formas apresentam
aparência granular quando coradas com Giemsa e também podem apresentar vacúolos. Por
ter cessado a síntese de DNA, esta forma tem densidade diferente, tendência a aderir o
flagelo à partículas ou materiais celulares e possui baixa habilidade de realizar infecções
clonais. Estas características sugerem que este formato de T. vivax seja uma um tipo de
adaptação ao ciclo de vida no vetor tsé-tsé20. Assim como as formas alternativas de T.
brucei, estima-se que estas formas alongadas possam ser importantes na indução de
respostas por anticorpos em infeções pelo parasito29. Presume-se também que parasitos que
tenham tido contato com tratamento como diminazene tenham alterações morfológicas e
pleomórficos, apresentando frequentemente vacuolizações14.
Na América, T. vivax é mecanicamente transmitido e não apresenta forma
polimórfica, somente as formas mais esguias do parasito1. Entretanto, a morfologia é
relativamente variável e geralmente são menores e mais finos que as formas típicas
africanas60. Já foi sugerido que o tamanho dos tripomastigotas seja influenciado pelo
hospedeiro ou pela patogenicidade do isolado48. Na Colômbia, constatou-se que algumas
formas apresentavam posterior afunilado, embora não chegasse a ser pontiagudo, e os
cinetoplastos eram subterminais e laterais61. Em Minas Gerais, por exemplo o tamanho
médio de T. vivax encontrado foi de 19,89µm48, mas outras preparações de lâminas podem
apresentar tamanhos menores, 15 a 16µm1 ou até mesmo 11µm62. Foi sugerido que para os
parasitos americanos, aplique-se o termo pleomorfismo, pois as variações não aparentam
ocorrer por algum motivo especial. Já foi sugerido que estas mudanças possam ser
ocasionadas pela replicação rápida do parasito, preservação no nitrogênio e/ou resposta
9
imune do hospedeiro1. De forma geral, ainda há pouca informação disponível sobre a
patogeniciade, epizoologia e morfologia de T. vivax em animais domésticos nas Américas62.
2.3.2 Ciclo de vida
O ciclo de vida do T. vivax difere em regiões com ou sem a presença de seu
vetor natural. Na África, ele é classificado como um parasito heteróxeno presente
principalmente em regiões onde há populações de moscas tsé-tsé. Ao ingerir sangue
infectado com o protozoário, os tripanosomas se aderem à parede da probóscide do vetor e a
infecção ocorre quando alguns tripanosomas conseguem aderir ao terço proximal do labro.
Os tripanosomas se diferenciam para formas epimastigotas do segundo dia em diante,
migrando o cinetoplasto para uma posição anterior. As formas epimastigotas se dividem e,
ainda aderidas à parede labral, colonizam aos poucos o labro20.
Dentro de cinco a 13 dias, as formas epimastigotas se desenvolvem para
tripomastigotas metacíclicos (Figura 3), única forma capaz de infectar vertebrados por
picada de mosca20,43. O ciclo de desenvolvimento é considerado simples e resulta em altas
taxas de infecção no vetor20. A mosca tsé-tsé é o único vetor em que o T. vivax pode se
multiplicar e continuar na fase infectante durante toda a vida do inseto e infectar
hospedeiros, que depois servirão de fonte de infecção para outras moscas. O parasito
também é carregado mecanicamente por outras moscas hematófagas nas quais a transmissão
é não cíclica. Nestes casos moscas como mosca-dos-estábulos (Stomoxys calcitrans) e
tabanídeos permanecem infectantes por um curto período de tempo29,43.
Embora todo grupo de tripanosomas Salivaria seja transmitido através da saliva
do vetor, o ciclo de vida do T. vivax se difere, pois ele não se desenvolve nos intestinos da
mosca, e sim em sua probóscide29,60. Além disto, aparentemente T. vivax é mais adaptado ao
desenvolvimento na tsé-tsé que outros tripanosomas, pois apresenta em geral maiores taxas
de infecção na mosca. Entretanto, no momento de repasto da mosca em hospedeiros, apenas
uma pequena quantidade dos protozoários é transmitida (aproximadamente cinco a 20)29.
Essa espécie apresenta menor amplitude de hospedeiros quando comparada a
outros tripanosomas60, infectando predominantemente biungulados como bovinos,
bubalinos20 ovinos, caprinos, camelídeos, algumas espécies de antílopes e equinos29,63.
Experimentalmente, infecta alpacas (Lama pacos) e lhamas (Lama glama) 1, não havendo
muita informação acerca de animais silvestres64. Há o risco que outros animais domésticos
como ovinos1 ou silvestres biungulados possam ser importante fonte de infecção para
bovinos32, quando estes convivam nas mesmas áreas.
10
FIGURA 3 - Ciclo de vida do Trypanosoma vivax, (a) e (c) são formas
tripomastigotas presentes no sangue bovino; (b) é a forma de divisão no
sangue; (d) é a forma final no sangue de camundongos; (e) e (f) são
tripomastigotas em região de probóscide de uma tsé-tsé; (g) é a forma
epimastigota se dividindo na probóscide; (h) e (i) são formas aderidas à
probóscide; (j) e (k) são formas metacíclicas na hipofaringe de uma tsé-
tsé, adaptado20.
Na América Latina, o protozoário é transmitido principalmente por tabanídeos e
Stomoxys1. Como é possível que outros insetos hematófagos sejam vetores mecânicos,
acredita-se que moscas do gênero Haematobia (mosca-dos-chifres), mosquitos Culicidae
(Culex, Mansonia, Aedes) 1 possam fazer parte do ciclo de transmissão, pois o parasito já foi
encontrado em aparelho bucal destas moscas20. Outra suposição é que os isolados da
América do Sul perderam a habilidade de infectarem moscas tsét-sé, embora os mecanismos
responsáveis por esta perda de infectividade sejam desconhecidos44.
No Brasil, associa-se maior incidência da doença à estação quente e chuvosa
devido ao aumento da população de moscas neste período. Nestes casos, a propagação da
doença é facilitada devido ao manejo de bovinos de leite em que os animais são agrupados
em baias48. Entretanto, já ocorreram surtos durante estação seca e fria, no período de junho a
dezembro em São Paulo, indicando que a presença de tabanídeos não seja um fator
11
determinante. Porém, neste caso, foi observado presença de Haematobia irritans e Stomoxys
calcitrans, o que sugere que talvez estas moscas tenham papel importante na transmissão do
hemoprotozoário14.
Outras formas de transmissão incluem a transmissão congênita, o que pode levar
ao nascimento de bezerros subclínicos carreadores da doença e fonte de infecção para o resto
do rebanho1,20, e a iatrogênica, principalmente com o compartilhamento de fômites
contaminados, como agulhas14. Atenção especial deve ser dada em momentos de vacinação
do rebanho, pois já foi observado que ocorreu um surto de T. vivax uma semana após o gado
ter sido vacinado contra febre aftosa na Colômbia1,20. A epidemiologia da doença pode
mudar de acordo com alterações antropogênicas no ambiente, portanto, o impacto da
tripanossomíase bovina não é constante, mas pode mudar ao longo do tempo como
resultados de mudanças de manejo ou de ambiente65.
2.3.3 Sinais clínicos
A doença pode acometer animais de qualquer idade54. O período pré-patente em
bovinos varia de nove a 14 dias para isolados virulentos e nova a 59 dias para menos
virulentos58.Quando sintomáticos, os principais sinais apresentados em infecções por T.
vivax são aborto, anemia, anorexia, apatia, febre intermitente, hipertermia, perda de peso,
redução na produção de leite e morte8,34,43,65. Devido a estes sinais inespecíficos, é
necessária a diferenciação com outras hemoparasitoses ou com infecções mistas com
tripanossomíase por T. evansi, anaplasmose, erliquiose ou babesiose ou helmitoses que
causem anemia1,9,34,39. É possível que ocorram outros sinais em menor escala, como
desidratação, diarreia, icterícia, secreção nasal e vaginal, entre outros 14,54.
Quadros mais graves podem apresentar sinais de acometimento do sistema
nervoso, como incoordenação motora, tremores musculares, opstótono, cegueira e
estrabismo. Foi notado que geralmente quando os animais apresentam sinais nervosos, o
quadro clínico evolui para morte50,56. Ademais, quando a redução nas plaquetas é alta, pode
ocorrer casos de coagulação intravascular disseminada29. Nos casos de quadro nervoso, deve
ser feita a diferenciação de raiva e intoxicação por plantas1,61.
A letalidade e severidade dos sinais clínicos é variável43,67. Quando a doença
ocorre em área anteriormente livre, a letalidade pode ser alta, de 50% a 100%, como foi em
um caso de bovinos zebu na Nigéria58,e deixar vários animais sobreviventes enfraquecidos.
Porém, depois de estabelecida, a doença pode apresentar patogenicidade limitada1. Em
alguns casos, há recuperação espontânea, em outros, a morte pode ocorrer dentro de oito a
12
10 dias de contaminação com o agente. Exames laboratoriais como hematócrito podem
apresentar valores baixos como 10 a 26% Os animais que apresentam doença crônica
podem perder cerca de 23% do peso vivo50.
Outra possibilidade é que ocorram animais assintomáticos carreadores, que são
especialmente preocupantes pois podem prejudicar programas de controle que dependem da
identificação da doença através de sua manifestação clínica56. Além disto, alguns animais
assintomáticos ou com doença subclínica apresentam exames parasitológicos negativos, pois
em fases assintomáticas, os tripanosomas podem não estar presentes no sangue e se
encontrarem em regiões extravasculares como linfonodos58. Nesses casos, a pesquisa de
anticorpos anti-T. vivax poderia auxiliar na identificação destes hospedeiros48.
Há diferença entre patogenicidade de cepas do leste e do oeste da África, pois as
cepas do leste tendem a causar infecções mais brandas em bovinos com boas condições de
saúde29 e, em contraste, as cepas do oeste tendem a ser mais virulentas28 ocasionando uma
doença com quadro mais agudo que, se não tratado, leva à morte29. Já a virulência de cepas
americanas é menor que as transmitidas ciclicamente na África1. Estima-se que o melhor
manejo dos animais e a ausência do vetor contribuam para um equilíbrio mais rápido da
doença, ausência de doença clínica ou até eliminação do parasito50.
Outro fator que influencia na diferença de apresentação dos sinais clínicos é o
próprio hospedeiro. Bovinos afetados por um mesmo isolado de T. vivax podem demonstrar
sinais clínicos diferentes ou serem totalmente assintomáticos59. Historicamente, raças
taurinas do Oeste da África vivem em áreas infestadas por moscas tsé-tsé há milhares de
anos. O gado zebu foi introduzido nestas regiões principalmente em 700 DC56,68. A pressão
seletiva para as raças taurinas foi bem maior e elas se adaptaram para não apresentarem os
efeitos mais patogênicos de infecções por tripanosomas56.
Por consequência, algumas raças bovinas apresentam tripanotolerância,
característica reconhecida há mais de um século. Esta característica foi observada em
bovinos do oeste africano e definida como habilidade de algumas raças bovinas de
sobreviveram, reproduzirem e produzirem em áreas com tsé-tsé infestadas por tripanosomas,
onde outras raças não conseguem sem o recurso de utilizar medicamentos. Portanto,
tripanotolerância é a habilidade do hospedeiro de sofrer pouco ou nada diante de uma
infecção. Exemplos bem conhecidos incluem taurinos como N’Dama, Baoulé e Lagune,
enquanto raças zebu e taurinas exóticas são susceptíveis às tripanossomíases56,69. Esta
habilidade varia entre indivíduos dentro de uma mesma raça e seus mecanismos ainda não
são muito bem compreendidos56.
13
2.3.4 Diagnóstico
A ausência de sinais clínicos patognomônicos requer a utilização de outras
técnicas de diagnóstico para tripanossomíase causada por T. vivax. Entretanto, ainda não há
um protocolo padrão a ser utilizado para detectar a doença crônica48,66.
O exame parasitológico por microscopia direta tem as vantagens de ser de baixo
custo e ter alta especificidade para o gênero Trypanosoma. Porém, deve se tomar cuidado no
diagnóstico diferencial morfológico entre as espécies do parasito encontradas em ruminantes
(T. vivax, Trypanosoma evansi e Trypanosoma theileri) ou em casos de infecções mistas54,
pois por vezes as espécies são indistinguíveis somente por esta técnica28.Para diferenciação
morfológica é preferível identificar as espécies em distensões finas (esfregaço sanguíneo) do
que observar tripanosomas vivos28.
A microscopia direta pode ser feita com sangue fresco ou fixado e corado por
Giemsa1,70. O teste de Woo, ou técnica de centrifugação de microhematócrito apresenta
sensibilidade maior que 60%71 e é a técnica por microscopia direta mais recomendada72,
pois técnicas de microscopia óptica como lâminas coradas tem sensibilidade menor, em
torno de 10%14,36. Uma variação de Woo é o método de camada espessa, buffy coat method,
(BCM), que consiste em cortar o tubo capilar e colocar a junção de plasma e células brancas
em uma lâmina e lamínula1, contudo, esta é uma técnica que requer experiência do
microscopista e tempo para ser realizada. Todas as técnicas de microscopia direta estão
sujeitas, entretanto, a menor sensibilidade quando aplicadas a portadores crônicos da
doença, sendo possível que estes exames não detectem o parasito48,55. Além disto, mesmo
durante a infecção aguda, há flutuação nos níveis de parasitemia, podendo haver intervalos
com ausência de parasitos1,44,73,74.
O comportamento biológico do T. vivax, diferente de outras espécies, não
permite que ele infecte facilmente camundongos e ratos inoculados com o parasito, mas a
inoculação em ovinos e bovinos resultam em parasitemia38,44,75. Diferente de cepas da
América Latina, inoculação de T. vivax em roedores só foi possível com alguns isolados do
oeste da África43.
Anteriormente, as técnicas de detecção de antígenos não eram muito indicadas
por possuírem baixa sensibilidade e não serem espécie específicas 1,29,44, o que poderia
dificultar estudos epidemiológicos onde múltiplas infecções pudessem ocorrer. A sorologia
para anticorpos, tanto ELISA indireto quanto imunofluorescência indireta (IFI)20, é
recomendada principalmente como teste de triagem para áreas não enzoóticas para
14
tripanossomíase1 e para detectar animais cronicamente infectados. Tal recomendação baseia-
se principalmente por ser um teste fácil, barato, rápido de ser realizado14, e com
sensibilidade maior que o parasitológico direto48. Por ser um teste sorológico, entretanto,
não diferencia casos atuais de infecções passadas44,48 e tampouco detecta todos os animais
doentes, talvez porque no início da infecção os hospedeiros não apresentem quantidade
suficiente de anticorpos74.
Ainda é possível aplicar técnicas de diagnóstico molecular como a reação de
cadeira em polimerase (PCR), mas seu uso geralmente é limitado por requerer laboratório
onde as amostras possam ser processadas44,74. A PCR já é utilizada há mais de duas décadas
para detecção de tripanosomas20, mas pesquisas esbarraram em dificuldades como obtenção
de amostra de DNA puro, especificidade28 e sensibilidade do teste44. Ademais, as diferenças
entre tripanosomas do oeste e do leste africano sugerem que talvez também seja necessário
diagnóstico diferencial entre essas cepas de T. vivax29,76. Em alguns casos, PCR e métodos
parasitológicos apresentaram resultados semelhantes48; em outros, a PCR se destacou e se
mostrou mais sensível que exames parasitológicos diretos14,57, enquanto em casos sem
parasitemia, a PCR mostrou-se inferior ao ELISA74. Assim, estas pesquisas sugerem que a
eficácia da PCR ainda seja limitada, especialmente em situações sem o parasito circulante
no sangue, e que seu uso possa levar a diagnóstico equivocado74. Mais recentemente
desenvolveu-se uma técnica de amplificação isotérmica do DNA (LAMP) que mostrou-se
promissora, por ser uma técnica rápida, simples e menos suscetível a erros ocasionados por
inibidores que a PCR, com sensibilidade de aproximadamente 93% mesmo em casos sem
parasitemia74.
2.3.5 Microscopia eletrônica de varredura
A microscopia eletrônica é uma técnica versátil para analisar as microestruturas
de objetos sólidos orgânicos ou inorgânicos. A área a ser examinada é irradiada com um raio
de elétrons de foco fino, que pode ser estático ou movimentar-se pela superfície a ser
analisada. Os sinais obtidos pela interação com os elétrons liberados variam de acordo com a
topografia da superfície da amostra, sendo possível obter imagens de alta resolução, de por
exemplo um nanometro, e, diferente da microscopia óptica, ter noções da profundidade do
objeto analisado77.
Apesar da técnica já ser conhecida há muitas décadas77, a microscopia
eletrônica, de forma geral, voltou a despertar interesse em pesquisas, principalmente por
seus avanços e novas possibilidades como a microscopia eletrônica de volume, que cria
15
imagens em 3D78. A técnica é utilizada em tripanosomas principalmente para observar
alterações que estes parasitos podem causar às células do hospedeiro e esclarecer
mecanismos patogênicos79. Em Trypanosoma vivax ainda foi pouco empregada, destacando-
se uma pesquisa conduzida na Venezuela que focou-se em estudar características
morfométricas dos isolados encontrados no país80 e uma análise de interação do parasito
com hematócitos81.
As informações obtidas a partir desta microscopia permitem estabelecer
características específicas dos isolados estudados para que possam ser utilizados como
marcadores de identificação, virulência ou patogenicidade e identificar os diferentes isolados
existentes em uma região80.
2.3.6 Tratamento e controle
Duas são as principais drogas utilizadas para tratamento de tripanossomíase no
Brasil: aceturato de diminazene e o cloruro de isometamidium. O diminazene é usado como
curativo, mas não tem efeito profilático e é recomendado para áreas com baixas cargas
parasitárias, para controlar surtos esporádicos1. Isometamidium é recomendado para
prevenção e tratamento, fornecendo proteção média de cinco meses, sendo geralmente a
terapia de escolha na maioria dos casos, recomendado para áreas enzoóticas ou para
períodos de alta carga parasitária. Outras drogas utilizadas são o sal de homidium e suramin,
mas para todas as terapias utilizadas no tratamento de tripanossomíase já foi registrada
resistência, talvez devido ao uso indiscriminado dos medicamentos, pois alguns também são
recomendados para controle de babesiose1,82..
Foi relatado no Brasil que o uso de diminazene ocasiona melhora aparente nos
animais infectados e não se detecta parasitemia por um período de 20 dias a dois meses.
Entretanto, já se observou que devido à resistência apresentada a esta droga, novos
tripomastigotas são observados posteriores a este período e os animais voltam a adoecerem,
sendo que alguns morrem12, 38.
Apesar do risco do risco de resistência, o uso de drogas continua a ser
importante no controle da doença, devido aos bons resultados a um custo relativamente
baixo43. Entretanto, o tratamento não assegura a eliminação do parasito: há relatos que as
infecções por tripanosoma possam ser reativadas por alguma situação de estresse como
transporte, infecção por outros hemoprotozoários ou outras doenças12. Ademais, animais
tratados continuam susceptíveis a novas infecções, pois os anticorpos para o parasito
desaparecem dentro de um período de até dois anos29,45.
16
O controle da doença, portanto, deve incluir várias medidas além do tratamento
de animais infectados43,56,82. Dentre as medidas de manejo possíveis, estão o controle de
possíveis vetores1,12,56 , manejo de animais, incluindo evitar rebanhos com alta densidade,
nutrição adequadas 12,43, evitar o uso compartilhado de agulhas1 e o controle dos animais que
se movem de áreas endêmicas para áreas não endêmicas da doença1,12,43. Na América do Sul,
não há grandes esforços para conter a disseminação do parasito no continente, pois não há
restrição de movimentação de animais de áreas infectadas e o controle continua muito
dependente do tratamento com drogas35. Atualmente, ainda não há a comercialização de
vacina efetiva contra a doença1.
Após mais de um século de intervenção contra a tripanossomíase animal, a
doença continua a causar impacto em diversas economias A erradicação iminente da doença
não parece possível, dadas as perspectivas atuais. Embora hoje se compreenda mais os
mecanismos da doença, as medidas de controle continuam não sendo suficientes83. Além das
medidas de controle já citadas, há casos de animais infectados que não adoecem ou morrem,
mesmo sem tratamento com drogas20. Na África, é conhecido também o fenômeno da
tripanotolerância, ou seja, a habilidade do animai em conviver com o parasito. A existência
destes animais é vista com dualidade. Por um lado, podem prejudicar programas de
eliminação, pois permitem que os parasitos sejam carreados por longos períodos de tempo e
possam ser transmitidos na presença de vetores56. Por outro, há a proposta de
desenvolvimento de programas que incentivem a criação de raças molecularmente
identificadas como tripanotolerantes, como forma de melhoramento genético. Esta proposta
é vista como uma opção sustentável a ser incluída em conjunto com outras intervenções83.
De forma geral, ainda são necessários estudos sobre a epidemiologia de T. vivax,
sua distribuição, prevalência e incidência em animais domésticos e silvestres na América do
Sul e seus vetores para avaliar seu impacto econômico na pecuária. A partir destas
informações, será possível fortalecer a proposta de um programa internacional ou nacional
para orientar criadores sobre boas práticas de manejo dos animais e o sistema de defesa
sanitária animal a aumentar o rigor na vigilância sanitária, impedindo a disseminação de
agentes patogênicos9,39.
17
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Realizar avaliações morfométricas de Trypanosoma vivax encontrado em
bovinos experimentalmente infectados no estado de Goiás utilizando microscopia de alta
resolução e avaliar eficácia de desinfetantes em amostras contendo sangue com parasito.
3.2 Objetivos específicos
- Realizar avaliações morfométricas de T. vivax encontrados em sangue de animais
parasitados com auxílio de microscopia eletrônica por varredura (MEV).
- Testar eficácia de álcool, hipoclorito de sódio, iodo, cloreto de alquil dimetil benzil
amônio(CB-30 T.A. Ourofino, Cravinhos São Paulo) e sabão antibacteriano em diferentes
concentrações para eliminação de parasitas após aplicação direta em solução contendo
parasitas.
18
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de experimento
Os animais experimentalmente infectados foram oriundos de um outro projeto
em andamento. Estes animais foram alojados em baias nas imediações do Hospital
Veterinário da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da Universidade Federal de Goiás
(UFG) sob adequado manejo até o final do experimento. O material colhido foi
imediatamente transportado ao Laboratório de Doenças Parasitárias da EVZ para o
processamento de amostras. A preparação das lâminas de microscopia ocorreu no
Laboratório Estudos Morfológicos do Instituto de Ciências Biológicas III da UFG e a
microscopia eletrônica no Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta
Resolução(LABMIC) no Instituto de Física da mesma Universidade.
4.2 Determinação de animais com tripanossomíase
Os animais foram experimentalmente infectados com Trypanosoma vivax
isolado no estado de Goiás. As amostras de sangue foram obtidas a partir de punção da veia
jugular com seringas de 3mL acopladas a agulhas de 25x0,8mm. Este material foi submetido
à técnica de Woo para diagnóstico parasitológico direto72.
4.3 Colheita de sangue
Para a microscopia eletrônica, o sangue foi colhido por punção de veia jugular
de todos os animais e acondicionado em tubos BD Vacutainer® contendo EDTA (BD, São
Paulo, SP). Adaptando o protocolo de D’Archivio84 e Cotta-Pereira et al.85, utilizaram-se
tubos de microhematócrito para acondicionar o sangue, os quais foram centrifugados a 1300
g durante dez minutos. Para interferir minimamente na camada de hemácias e obter a maior
concentração possível de tripanosomas, foram realizados cortes no tubo na região de união
do creme leucocitário com o plasma e as primeiras gotas desta região foram diretamente
repassadas a microtubos de 1,5mL (Eppendorf®, São Paulo, SP) e as amostras processadas
no mesmo dia para confecção de lâminas.
4.4 Morfometria do parasita por Microscopia Eletrônica por Varredura
A partir das amostras dos cinco animais foram confeccionadas lâminas para
visualização do parasita por microscopia eletrônica por varredura.
19
Baseando-se em um protocolo adaptado24,15,85 no Laboratório de Estudos
Morfológicos do ICB III, foi colocada uma gota da amostra contendo Trypanosoma vivax
em uma lâmina polarizada coberta com poli-l-lisina (Starfrost® Polycat, Knittel, Alemanha)
e cuidadosamente dispersada com auxílio de uma pipeta de pasteur. A amostra foi fixada
durante uma hora em câmara úmida, temperatura ambiente, utilizando fixador
2,5%glutaraldeído em tampão fosfato de sódio a 0,1M pH 7,2. As lâminas foram lavadas
três vezes durante cinco minutos utilizando o mesmo tampão e depois passaram por uma
série gradual de desidratação utilizando etanol 30% durante cinco minutos, etanol 50% por
cinco minutos, etanol 70% por cinco minutos, etanol 90% por cinco minutos e finalmente,
etanol 100% por cinco minutos.
Logo em seguida, foi utilizado HDMS para secagem durante cinco minutos.
Após secagem à temperatura ambiente, as lâminas foram levadas ao LAMBIC para
metalização com uma camada de 20nm de cromo e posterior análise ao MEV.
Para leitura do material confeccionado foi utilizado o Microscópio Eletrônico de
Varredura Jeol®, JSM – 6610, equipado com EDS da Thermo Scientific NSS Spectral
Imaging do LABMIC.
A partir das imagens geradas, foram realizadas, com base em Gomez et al.80
mensurações de 70 parasitos com as seguintes medidas: medidas de F= flagelo livre; L=
comprimento total, incluindo o flagelo10 e D=diâmetro do parasito.
4.5 Teste de eficácia de desinfetantes para Trypanosoma vivax
Como controle, foi utilizado sangue de bovino acrescido de soro fisiológico
comercial. Os desinfetantes comerciais testados foram:
1- álcool 10%
2- álcool 40%
3- álcool 70% com iodo 0,5%
4- hipoclorito de sódio diluído a 0,05% (500ppm)
5- iodo 0,1%
6- iodo 0,5%
7- sabão antibacteriano 1:1000
8- CB-30 (Ourofino Saúde Animal, São Paulo, Brasil) 1:2000
Para o preparo da amostra, foram utilizados aproximadamente 10mL do sangue
previamente coletado de animais infectados. Foi realizada a contagem estimada de parasitos
por mililitro, conforme Brener86. De forma geral, a contagem foi feita utilizando 5µL de
20
sangue com parasitos entre lâmina e lamínula 22x22 e conta-se a quantidade de campos
existentes em toda a lâmina (que em média são 2.401 campos). O fator de correção foi
encontrado ao dividir o número total de campos da lamínula por 50, que foi a quantidade de
campos que é realmente analisada. Assim, verificou-se o número de formas tripomastigotas
em 50 campos microscópicos e multiplicou-se pelo fator de correção, obtendo a estimativa
de 3,8 x106 tripanosomas por mililitro.
Em seguida, adaptando a metodologia de Wang et al.87, foi adicionado em
microtubos de 1,5mL a quantidade de sangue correspondente à concentração aproximada de
1x106 parasitos (260µL). Os microtubos foram completados então até o volume total de 1mL
pelos desinfetantes (Figura 4). A cada dez minutos a solução foi homogeneizada e uma
alíquota de 5µL foi preparada entre lâmina e lamínula para contagem de células parasitárias
móveis. Este procedimento foi realizado em triplicata até o tempo de 30 minutos. Como
controle, utilizou-se a mesma quantidade de sangue acrescido de soro fisiológico até
totalizar o volume de 1mL e esta solução passou pelos mesmos procedimentos que os testes.
É importante ressaltar que todos esses tratamentos foram diluídos quando
adicionados às amostras de sangue. Portanto, a concentração final para cada um dos
tratamentos foi, respectivamente, álcool 7,3%; álcool 29,2%; álcool 51,1%; hipoclorito de
sódio0,0365%; iodo 0,073%; iodo 0,365%; sabão antibacteriano 0,00073% e CB-30
0,00037.
FIGURA 4 – Esquema de teste para eficácia de desinfetantes.
4.6 Análise estatística
Para comparação morfometria dos parasitos encontrados com os dados de
outros autores, foi aplicado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para comparação de
médias, aplicando p<0,05. Para o teste de eficácia de desinfetantes, foi utilizado o teste de
21
Friedman, por ser uma alternativa não paramétrica para teste de experimentos em blocos
casualizados.
22
5 RESULTADOS
A microscopia eletrônica de varredura revelou heterogeneidade na morfometria
de T. vivax no estado de Goiás. O menor tamanho encontrado foi de 12,61µm, enquanto o
maior foi 24,55µm e a média foi 20,144 ± 3,109. As mensurações de flagelo livre variaram
de 4,87µm à 9,635µm , sendo a média 7,084 ± 1,469 e o menor e maior diâmetro do parasito
foram 0,91µm e 2,37µm, média de 1,471 ± 0,36. Em algumas imagens foi possível observar
e distinguir outras estruturas como o núcleo, membrana ondulante e local de inserção do
flagelo no bolso flagelar (Figura 5). A superfície do corpo e, principalmente, da membrana
se apresentaram ligeiramente rugosas e muitas vezes com presença de formações granulosas.
Estas granulosidades não foram observadas na região do flagelo, livre ou aderido.
FIGURA 5 – Microscopia eletrônica de varredura de isolado de Trypanosoma vivax encontrado no estado de Goiás com núcleo visível e presença de granulosidade no corpo.
Foram encontrados parasitos tanto com a extremidade posterior abaulada quanto
mais pontiaguda (Figura 6), mas a extremidade anterior apresentou consistentemente
afinamento até o início do flagelo livre. A membrana ondulante estava presente em todas as
amostras, como característica da espécie, mas não era muito desenvolvida, o que levou o
flagelo a parecer aderido ao corpo em algumas imagens.
23
FIGURA 6 – Microscopia eletrônica de varredura de isolado de Trypanosoma vivax apresentando posterior arredondado (A) e fino (B).
As formas alongadas e delgadas foram as mais visualizadas, entretanto também
estiveram presentes formas mais robustas e compactas. Neste caso, quase sempre era
impossível distinguir a localização do núcleo (Figura 7).
FIGURA 7 – Microscopia eletrônica de varredura apresentando formas mais compactas com núcleo não distinguível em isolado de Trypanosoma vivax encontrado em Goiás.
Também foi possível observar a fissão binária em algumas das lâminas
analisadas (Figura 8). Nas imagens desta reprodução, grande parte das formas observadas
nas lâminas eram finas e alongadas. Em nenhuma das lâminas foi encontrada a reprodução
em estágio inicial com a fissão dos flagelos, ou seja, todas já estavam em estágio mais
avançado com os indivíduos quase se separando.
24
FIGURA 8 – Microscopia eletrônica de estágio final de fissão binária em tripomastigota de isolado de Trypanosoma vivax encontrado em Goiás.
No experimento com desinfetantes, houve diferença estatística entre os
tratamentos analisados (p<0,05) e alguns casos verificou-se a morte instantânea dos
tripanosomas. Os tratamentos com álcool 40%, álcool 70% + iodo, hipoclorito de sódio
0,05% e iodo 0,5% não apresentaram tripanosomas vivos em nenhum momento, mostrando-
se estatisticamente eficazes na eliminação do parasito nestas diluições. O tratamento com
álcool 10% conseguiu a eliminação total dos parasitos após 11 minutos de contato (Quadro
1) (p>0,597).
QUADRO 1 – Média de quantidade de parasitos vivos e móveis após tratamento com oito soluções de desinfetantes ao longo de um período de contato de 30 minutos. Tratamento 30s 11m 20m 30m Álcool 10% 51,33.105 0 0 0 Álcool 40% 0 0 0 0 Álcool 70% + iodo 0 0 0 0 Hipoclorito 0,05% 0 0 0 0 Iodo 0,1% 31.105 20,33. 105 8,33. 105 15,66. 105 Iodo 0,5% 0 0 0 0 CB-30 1:2000 49,66. 105 32,33. 105 33,00. 105 18,66. 105 Sabão 60,66. 105 35,33. 105 41,66. 105 52,33. 105 Controle 71,50. 105 65,50. 105 62,00. 105 55,00. 105
Os tratamentos com iodo 0,1% e CB-30 1:2000 mostraram redução gradual do
número de parasitos ao longo do tempo de contato, mas mesmo após 30 minutos, eles não
conseguiram eliminar todos os parasitos presentes na solução. Quando comparados ao
controle, esses tratamentos apresentaram, respectivamente, p=0,808 e p=0,941. O tratamento
com sabão antibacteriano diluído a 1:1000 mostrou pouca eficácia na eliminação dos
25
parasitos. e não houve diferença estatística quando comparado ao controle (p=1). O
tratamento controle, que consistia somente em sangue diluído com soro fisiológico, mostrou
uma queda gradual no número de tripanosomas vivos ao longo do período analisado, o que
era esperado pois os tripanosomas estavam sob estresse fora de seu hospedeiro.
A Figura 9 mostra a quantidade de parasitos vivos encontrados em cada
tratamento e o desvio padrão deles. Nesta figura, é possível notar que alguns tratamentos
como álcool 10%, CB-30 e iodo 0,1% não apresentaram diferença quando comparados ao
controle nos primeiros tempos analisados. Entretanto, logo no segundo tempo, o tratamento
com álcool 10% se mostra eficiente e tanto o iodo 0,1% quanto o CB-30 também foram
eficientes após 30 minutos de contato, o que fica ilustrado na Figura 10.
FIGURA 9 – Quantidade de Trypanosoma vivax vivos encontrados em lâmina após tratamento com diferentes desinfetantes testados.
26
FIGURA 10 – Quantidade de Trypanosoma vivax vivos encontrados em lâmina em controle e após tratamento com solução com álcool 10%, iodo 0,1%, CB-30, sabão.
27
6 DISCUSSÃO
A média de comprimento total deste isolado de Trypanosoma vivax obtido em
Goiás foi semelhante a de outros isolados encontrados no Brasil9-11,13,23,53. A média de
comprimento de flagelo, entretanto, foi maior que o encontrado em todas as outras regiões,
exceto em um isolado obtido no Rio de Janeiro53. O outro isolado de T. vivax obtido em
Goiás apresentou-se estatisticamente menor que os de outras regiões do Brasil90. Entretanto,
neste estudo, apesar de ser oriundo da mesma região do país, o parasito estudado não se
mostrou estatisticamente diferente quando comparando aos de outros trabalhos.
Quando comparado a outros isolados obtidos na América do Sul, constatou-se
que este isolado de T. vivax de Goiás foi maior que o encontrado na Bolívia e semelhante
aos encontrados na Venezuela, inclusive no tamanho do flagelo livre, embora com a largura
de corpo ligeiramente maior. Estas medidas morfométricas foram condizentes com as
descritas por Gardiner e Wilson29 e Hoare58 para T. vivax encontrados na América Latina.
Entretanto, assim como observado por estes autores, quando comparado ao comprimento
total dos isolados encontrados na África, este T. vivax, assim como os outros da América
Latina, se assemelhou mais às formas curtas africanas.
Diferente dos outros isolados descritos no Brasil, este isolado de T. vivax de
Goiás apresentou o formato predominantemente fino (slender) com a extremidade posterior
fina, compartilhando este aspecto com alguns dos isolados encontrados por Gomez et al.80
na Venezuela. Além disto, a superfície corporal e de membrana também se apresentou
ligeiramente rugosa. Não foi possível visualizar com distinção os sulcos presentes nas partes
posteriores, como descritos por Gomez et al.80, talvez devido ao recobrimento espesso das
lâminas gerado pelo protocolo utilizado.
A presença de parasitos tanto com extremidade posterior fina quanto
arredondada e formas esguias e mais robustas em uma mesma amostra sugere que, diferente
do pensado por Desquesnes1 e Hoare58, o T. vivax na América possa ser também pleomorfo.
Dávila et al.23 e Gomez et al.80 também notaram uma variabilidade nos valores
morfométricos de T. vivax americano. Diante destas considerações, Gomez et al.80 destacou
que, assim como ocorreu com T. evansi, o T. vivax americano não seja mais considerado
monomórfico e que possa apresentar polimorfismo entre e intra isolados.
Alguns autores23,80, repararam que formas curtas de T. vivax estejam
relacionadas ao período de fase aguda da doença. No presente estudo, os parasitos foram
28
obtidos durante o primeiro pico agudo da doença, o que sugere que talvez a média de
comprimento possa ser maior em infecções crônicas.
Ademais, em muitos parasitos, foi observado a presença de formações
granulosas ao longo do corpo dos tripanosomas14, ao observar estruturas semelhantes a
vacúolos nos parasitos, cogitou a possibilidade delas terem sido causadas pelo contato com o
tratamento de diminazene. Entretanto, nesta pesquisa, as amostras foram oriundas de
bovinos que nunca entraram em contato com esta droga, o que não condizente com tal
afirmação.
Gardiner e Wilson29 descreveram a presença de algumas formas mais granulares
e alongadas de Trypanosoma vivax em laminas coradas por Giemsa. Aparentemente, estas
formas só seriam encontrados em T. vivax em bovinos e seriam uma forma de pré-adaptação
à continuação do ciclo de vida no vetor tsé-tsé, sendo encontradas somente no continente
africano. Outra hipótese do autor é que o T. vivax possa mudar de forma, alternando entre
formas pequenas e divisíveis e formas maiores não replicantes. Esta última suposição é
reforçada pelo fato que o T. brucei também se apresenta em formas alternativas com fase
estacionária em síntese de DNA. Neste trabalho, foram observadas tanto formas alongadas
quanto formas menores em amostras de um mesmo animal, condizendo com a hipótese que
T. vivax possa apresentar mais de uma forma.
Apesar do protozoário já ter sido observado com essa presença aparentemente
natural de granulações, como revelado por Gardiner e Wilson29, é possível que, neste
experimento, os grânulos foram oriundos de reações à alguma das substâncias utilizadas
durante a técnica de confecção de lâmina para microscopia eletrônica. Embora o protocolo
tenha sido baseado em outros já realizados e tenha se utilizado produtos conhecidos, pode
ter ocorrido alguma reação não esperada do parasito frente às substâncias empregadas. Outro
dado que reforça esta condição é que em outros isolados encontrados e corados em Goiás,
não foi encontrada nenhuma vacuolização88.
Em nota adicional, foram necessárias diversas adaptações ao protocolo de
processamento de amostras para microscopia eletrônica. O protocolo final apresentado neste
trabalho foi satisfatório, mas laborioso. Acredita-se que ele ainda possa ser aprimorado,
principalmente para obtenção qualidade mais homogênea de imagens. Esta foi a primeira
microscopia eletrônica de transmissão realizada em T. vivax no Brasil.
Quanto à avaliação de sensibilidade do agente a diferentes desinfetantes, sua
realização foi decorrente da demanda observada a campo. Em casos de surtos da
tripanossomíase, mesmo após estudo do caso e esclarecimento aos proprietários de como a
29
doença se disseminou em sua propriedade e as medidas mais recomendadas de controle, foi
observado uma grande resistência em adequar as práticas de manejo das propriedades88.
Alguns autores observaram que um dos fatores mais ligados à disseminação da
tripanossomíase bovina no Brasil é a introdução de animais infectados para áreas
consideradas livres da doença 12,14,88. No entanto, diferente do relatado em outras regiões
brasileiras14, os surtos de tripanossomíase em Goiás não aparentam estar relacionados com a
presença de possíveis vetores para a doença, como tabanídeos ou outras moscas
hematófagas, pois não foi relatada presença significativa destes vetores nas propriedades
afetadas. Em todos os surtos relatados até o momento, há a fortes indícios que a doença
tenha sido transmitida principalmente por formas iatrogênicas, em especial por
compartilhamento de agulhas88.
Tendo em vista que a principal forma de transmissão da doença no estado está
ligada a más práticas de manejo e falhas nos sistemas de biosseguridade utilizados nas
propriedades afetadas, os resultados da eficácia de desinfetantes contidos neste trabalho
podem auxiliar a adequação do manejo e evitar a disseminação da doença.
Diversos autores já relataram as dificuldades em comunicação entre
profissionais veterinários e responsáveis por propriedades de criação de bovinos de
leite89,90,91quando é necessário realizar alguma mudança no programa de biosseguridade. No
entanto, ressaltou92 que por vezes, falhas na biosseguridade não dependem somente de falta
de conhecimento, mas envolvem outros fatores mais complexos inerentes ao comportamento
humano. Para uma mudança de manejo eficiente, além de uma boa relação interpessoal entre
o veterinário e o proprietário89, fornecimento de informações padronizadas90e conhecimento
sobre a severidade das doenças e o risco de disseminação no local59,60, é necessário
estabelecer estratégias em conjunto com o proprietário91. Ou seja, por mais que o padrão
para controle de doença disseminada por forma iatrogênica seja recomendar a não
reutilização de seringas e agulhas entre os animais, esta medida não está sendo empregada88,
sendo necessário implementar adequações ao manejo.
A reutilização de agulhas, seja por diminuir custos de aquisição de
equipamentos93,94 ou por praticidade95, ocorre de forma constante em propriedades. Portanto,
este trabalho propõe o uso de desinfetantes comerciais, fáceis de serem adquiridos e de
baixo custo, para realização de desinfeção das agulhas dentro das propriedades que fazem o
uso da ocitocina injetável uma prática comum. Tendo em vista que já foi relatado caso de
surto de tripanossomíase logo após campanha de vacinação bovina1,12 talvez essas
informações também possam ser extrapoladas para prevenir futuros surtos ocasionados pelo
30
compartilhamento de agulhas. A desinfecção química de agulhas e seringas, se realizada
adequadamente com as concentrações e tempo de ação dos produtos respeitados96, pode ser
eficaz na eliminação dos parasitos, como demonstrado com algumas das substâncias
testadas. Desta forma, destaca-se a necessidade de novos estudos sobre como esta prática
poderia ser introduzida nas propriedades.
31
7 CONCLUSÃO
Há diferenças de dimensões entre os isolados de Trypanosoma vivax
encontrados em Goiás e os descritos nas outras regiões do Brasil.
Diversos desinfetantes apresentam-se eficazes para eliminação do parasito,
sendo os mais eficientes álcool 40%, álcool 70%, iodo 0,5% e hipoclorito de sódio 500ppm.
32
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