avaliaÇÃo da repopularizaÇÃo celular de … · dedicatÓria aos meus pais josé bernardo e...
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LEANDRO JOSÉ RECKERS
AVALIAÇÃO DA REPOPULARIZAÇÃO CELULAR DE ENXERTOS
HOMÓLOGOS DE MENISCOS ULTRACONGELADOS DE COELHOS,
SUBMETIDOS A QUATRO TÉCNICAS DE FIXAÇÃO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
SÃO PAULO 2006
LEANDRO JOSÉ RECKERS
AVALIAÇÃO DA REPOPULARIZAÇÃO CELULAR DE ENXERTOS
HOMÓLOGOS DE MENISCOS ULTRACONGELADOS DE COELHOS,
SUBMETIDOS A QUATRO TÉCNICAS DE FIXAÇÃO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Djalma José Fagundes
SÃO PAULO 2006
Reckers, Leandro José Avaliação da repopularização celular de enxertos homólogos de
meniscos ultracongelados de coelhos, submetidos a quatro técnicas de fixação/Leandro José Reckers – São Paulo, 2006
xxiv, 110f Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação. Evaluation of cell repopulation of homologous frozen menisci grafts of
rabbits submitted to four fixation techniques . 1. Meniscos mediais. 2. Adesivo de fibrina. 3. Transplante. 4. Coehos.
ESCO’LA PAULISTA DE MEDICINA UNIFESP-EPM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA E EXPERIMENTAÇÃO
COORDENADOR: Prof. Dr. José Luiz Martins
TESE DE DOUTORADO
AUTOR: Leandro José Reckers ORIENTADOR: Prof. Dr. Djalma José Fagundes TÍTULO: Avaliação da repopularização celular de enxertos homólogos de meniscos ultracongelados de coelhos, submetidos a quatro técnicas de fixação. BANCA EXAMINADORA: 1- Presidente: Prof. Dr. Djalma José Fagundes Professor Adjunto do Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP-EPM. MEMBROS EFETIVOS: 2 – Prof. Dr. Moisés Cohen Professor Livre-Docente e Chefe do Centro de Traumatologia do Esporte do Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Universidade Federal de São Paulo. UNIFESP-EPM. 3 – Prof. Dr. Gilberto Luis Camanho Professor Livre-Docente e Adjunto da Disciplina de Ortopedia e Traumatologia da Universidade de São Paulo - USP. 4 – Prof. Dr. Nilson Roberto Severino Professor Doutor do Departamento de Ortopedia e Traumatologia da Faculdade de Medicina da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. 5 – Prof. Dr. Edgar dos Santos Pereira Professor Titular da Faculdade de Medicina de Santo Amaro-UNISA. Presidente da Sociedade Brasileira de Artroscopia. MEMBROS SUPLENTES 1- Prof. Dr. Hélio Plapler Professor Adjunto da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de São Paulo-Escola Paulista de Medicina. 2 - Prof. Dr. José Luiz Pozo Raymundo Professor Adjunto e Regente da Disciplina de Ortopedia e Traumatologia da Universidade Católica de Pelotas. Pelotas-RS.
ii
Não importam quais sejam os obstáculos e as dificuldades. Se estamos possuídos de uma inabalável determinação, conseguiremos superá-los.
Tenzin Gyatso, o Dalai Lama(Líder espiritual Tibetano; Prêmio Nobel da Paz)
iii
DEDICATÓRIA
Aos meus pais José Bernardo e Elory, pelo exemplo de luta, perseverança, humildade
e respeito ao próximo. Agradeço a Deus por ter me dado vocês como o bem mais valioso que
a vida poderia me proporcionar. Ofereço este trabalho a vocês, fruto de muito esforço e
dedicação. Obrigado por tudo.
À Josiene, mesmo distante por mais de dois anos, não saberia falar neste momento a
grande admiração que sinto por ti. A tua presença sempre esteve comigo. Tento imaginar
quantos anos demorarei para agradecer tudo o que tu fizeste por mim.
iv
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. Djalma José Fagundes, Professor Adjunto do Departamento de
Cirurgia e Orientador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da
Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, orientador deste trabalho,
por me incentivar a vencer os grandes desafios da vida. Muito obrigado pela confiança
depositada em mim. Não tenho palavras para agradecer tanta credibilidade, mas sei que lhe
serei eternamente grato.
v
AGRADECIMENTOS
À UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO – ESCOLA PAULISTA DE
MEDICINA – UNIFESP-EPM, por ter me recebido como aluno do Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia e Experimentação, possibilitando minha titulação.
Ao Prof. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo, Livre-Docente, Titular da Disciplina
de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pela acolhida na
Disciplina.
Ao Prof. Dr. José Luiz Martins, Professor Adjunto, Livre-Docente da Disciplina de
Cirurgia Pediátrica e Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e
Experimentação da UNIFESP-EPM, pelos valiosos ensinamentos e orientação.
À Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero, Professora Afiliada ao Departamento
de Cirurgia da UNIFESP-EPM, pela contribuição e delineamento desta tese e pela experiência
pessoal, tão proveitosamente transmitida.
Ao Prof. Dr. Henri Chaplin Rivoire, Professor Assistente e Chefe do Departamento de
Cirurgia da Fundação Universidade Federal do Rio Grande-RS, pela sua grande persistência e
espírito de grupo transmitida ao longo destes anos. Seu conhecimento metodológico foi
importante para a formatação desta pesquisa. Muito obrigado pela ajuda.
Ao Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes, Professor Adjunto da Disciplina de Técnica
Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pelas informações e conhecimentos
de grande valia.
Ao Prof. Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo, Professor Adjunto da
Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, pelos
ensinamentos dirigidos principalmente à língua portuguesa e à metodologia científica.
vi
Ao Prof. Dr. Murched Omar Taha, Professor Afiliado ao Departamento de Cirurgia
da UNIFESP-EPM, pelos ensinamentos transmitidos.
À médica veterinária e amiga Vanessa Carla Paiva, Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP-EPM. Como no mestrado, sua
amizade e alegria transmitidas no decorrer deste longo trabalho foram um estimulante para
chegarmos ao final desta tarefa. Sua competência em Medicina Veterinária foi muito
importante na execução desta pesquisa. Muito obrigado por tudo. Este trabalho também lhe
pertence.
À médica veterinária e amiga Márcia Bento Moreira, Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP-EPM. Como no mestrado, sua
competência em medicina veterinária foi em grande parte responsável pela execução desta
pesquisa. Muito obrigado pela compressão de sua família. Este trabalho também lhe pertence.
À Simone, pela compreensão nestes meses de convivência no final desta jornada de
muito trabalho e pesquisa. Seu companheirismo me trouxe a tranqüilidade necessária para a
complementação desta etapa tão importante em minha formação.
Ao meu amigo e ortopedista Hilário Boatto, Doutor em Medicina pelo Departamento
de Ortopedia e Traumatologia da UNIFESP-EPM, pela grande amizade em momentos bons e
difíceis. Muito obrigado.
À amiga e funcionária da UNIFESP-EPM Elaine Maria Alves Bazzi Dantas, pela
amizade e pelo apoio nestes anos de muito trabalho. Obrigado pela colaboração nesta
pesquisa.
À estatística Sandra Malagutti, pelo talentoso desempenho estatístico na realização
deste trabalho.
À acadêmica de medicina da Universidade Católica de Pelotas-UCPEL Alessandra
Formigheri pela grande amizade, apoio e colaboração nos momentos de muito trabalho.
vii
À Adriana Sayury Takamory, acadêmica de Medicina Veterinária da UNIBAN e
PIBIC-Programa de Iniciação Científica da UNIFESP, pela colaboração preciosa no cuidado
com os animais em seu pré-operatório.
Ao funcionário João Custódio de Brito (Fernando), pela sua amizade, colaboração e
paciência, principalmente nos vários finais de semanas em que passamos envolvidos com esta
pesquisa.
À Valdelice Justiniano Soares, secretária do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia
e Experimentação da UNIFESP, pela sua amizade, ajuda e disponibilidade na execução deste
trabalho.
À Benedita Salete Costa Lima Valverde e Rita de Cássia Almeida Bonfim
funcionárias da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP, pela
colaboração durante a realização do presente trabalho.
Aos colegas do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da
UNIFESP, pela convivência, amizade e ajuda na formação do espírito crítico.
À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-USP – Departamento de Patologia –
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e Laboratório de Oncologia Experimental,
pela confecção das lâminas.
viii
LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Biotério da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia
Experimental. Animais alojados em gaiolas individuais.................
5
Figura 2 - Esquema de distribuição dos animais nos diversos grupos de
estudo...............................................................................................
8
Figura 3 - Radiografia na incidência ântero-posterior do joelho direito
mostrando o ângulo frontal..............................................................
9
Figura 4 - Foto representativa da meniscectomia medial (M=menisco)............ 10
Figura 5 - Foto representativa da medição do menisco medial no seu eixo
maior com o uso de paquímetro digital...........................................
11
Figura 6 - Foto representativa da técnica de sutura após fixação do menisco.
(A) Fixação do corno posterior junto ao ligamento cruzado
anterior. (B) Fixação do corno anterior junto à cápsula anterior.....
12
Figura 7 - Foto representativa da técnica de sutura após fixação do menisco.
(A) Fixação do corpo do menisco no ligamento colateral tibial.
(B) Menisco transplantado (imagem em perfil)..............................
12
Figura 8 - Foto representativa do momento da passagem da broca para a
realização do túnel posterior............................................................
13
Figura 9 - (A) Foto representativa do momento da passagem da broca para a
realização do primeiro túnel anterior. (B) Foto representativa do
momento da passagem da broca para realização do segundo túnel
anterior, encontrando o primeiro túnel anterior...............................
14
Figura 10 - (A) Foto representativa do momento da passagem do fio no túnel
posterior. (B) Foto mostrando a realização do ponto em “U” no
corno posterior do menisco medial..................................................
14
Figura 11 - (A) Foto representativa do momento da passagem da agulha no
túnel anterior. (B) Foto representativa do momento da realização
do ponto em “U” no corno anterior do menisco medial..................
14
ix
Figura 12 - Foto representativa da técnica de túneis tibiais após fixação do
menisco............................................................................................
15
Figura 13 - Foto mostrando os quatro fios na região anterior da tíbia (setas
amarelas) e a passagem do fio de poliamida no ligamento
colateral tibial (seta branca).............................................................
15
Figura 14 - (A) Foto representativa do momento da aplicação de 0,4mL de
cola de fibrina antes da fixação final. (B) Foto representativa do
momento da manutenção do menisco no platô tibial após a
introdução da cola de fibrina...........................................................
16
Figura 15 - (A) Foto da pistola, do frasco e da ponteira onde é adicionada a
cola de fibrina. (B) Foto representativa dos frascos e ponteiras da
cola de fibrina: (1) Ponteiras já utilizadas com a cola de fibrina.
(2) Ponteiras que serão utilizadas no procedimento operatório. (3)
Frascos de cola de fibrina.(C) Foto representativa do momento da
aplicação da cola de fibrina. (D) Foto representativa do momento
da manutenção do menisco no platô tibial após a introdução da
cola de fibrina..................................................................................
17
Figura 16 - Foto de um quadrante sendo quantificado pelo programa Image-
Pro-Plus (setas: células repopularizadas)........................................
19
Figura 17 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de sutura, com duas semanas de
observação.......................................................................................
30
Figura 18 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com duas
semanas de observação. Verificar à direita o corno posterior do
menisco descolado do platô tibial (seta amarela)............................
30
x
Figura 19 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de fibrina,
com duas semanas de observação. Verificar à direita a presença
de cor amarronzada do menisco transplantado................................
31
Figura 20 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com duas semanas
de observação. Verificar à direita a presença da membrana
sinovial adjacente ao menisco transplantado (setas horizontais)
(seta amarela mostrando fio de sutura)............................................
31
Figura 21 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de sutura, com duas semanas
de observação. Verificar a quantidade significativa de células
invadindo a matriz amorfa (colágeno) desde a periferia do
enxerto (seta longa) até o seu terço proximal (seta curta) (HE-
10X).................................................................................................
34
Figura 22 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com duas
semanas de observação. Verificar a escassa quantidade de células
restrita à periferia do enxerto (seta) (HE-10X)................................
34
Figura 23 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de
fibrina, com duas semanas de observação. Verificar escassa
quantidade de células invadindo a matriz amorfa (colágeno)
restrita à periferia do enxerto (seta) (HE-10X)................................
35
Figura 24 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com duas
semanas de observação. Verificar três a quatro camadas de
células invadindo a matriz amorfa (colágeno) a partir da periferia
do enxerto (setas) (HE-10X)............................................................
35
xi
Figura 25 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de sutura, com quatro semanas de
observação.......................................................................................
46
Figura 26 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com quatro
semanas de observação. Verificar à direita o corno posterior do
menisco medial descolado do platô tibial........................................
46
Figura 27 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de fibrina,
com quatro semanas de observação. Verificar a membrana
sinovial sobre o corno anterior e corpo do menisco (setas
horizontais)......................................................................................
47
Figura 28 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com quatro
semanas de observação. Verificar a ausência do corno anterior e
do corpo do menisco (setas horizontais)..........................................
47
Figura 29 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de sutura, com quatro
semanas de observação. Verificar a quantidade significativa de
células invadindo a matriz amorfa (colágeno) desde a periferia do
enxerto até o seu terço proximal (setas) (HE-10X).........................
50
Figura 30 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com
quatro semanas de observação. Verificar a escassa quantidade de
células invadindo a matriz amorfa (colágeno) restrita à periferia
do enxerto (setas) (HE-10X)............................................................
50
xii
Figura 31 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória túneis tibiais e cola de
fibrina, com quatro semanas de observação. Verificar a
quantidade pequena de células invadindo a matriz amorfa
(colágeno) restrita à periferia do enxerto (setas) (HE-10X)............
51
Figura 32 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com quatro
semanas de observação. Verificar a quantidade significativa de
células invadindo a matriz amorfa (colágeno) em direção à parte
central do enxerto (setas) (HE-4X)..................................................
51
Figura 33- (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de sutura, com oito semanas de
observação (seta amarela mostrando fio de sutura).........................
63
Figura 34 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com oito
semanas de observação....................................................................
63
Figura 35 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de fibrina,
com oito semanas de observação. Verificar a soltura do corpo e
corno posterior do menisco transplantado.......................................
64
Figura 36 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle
à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita,
fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com oito semanas
de observação. Verificar à direita a presença da membrana
sinovial adjacente ao menisco transplantado (setas horizontais).....
64
xiii
Figura 37 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de sutura, com oito semanas
de observação. Verificar a grande quantidade de células
invadindo a matriz amorfa (colágeno) desde a periferia até a
região central do enxerto (HE-4X)..................................................
67
Figura 38 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com oito
semanas de observação. Verificar a pequena quantidade de
células apenas na periferia do enxerto (seta) (HE-4X)....................
67
Figura 39 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de
fibrina, com oito semanas de observação. Verificar a pequena
quantidade de células apenas na periferia do enxerto (setas) (HE-
4X)...................................................................................................
68
Figura 40 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no
grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com oito
semanas de observação. Verificar a pequena quantidade de
células apenas na periferia (seta curta) do enxerto migrando em
direção central (seta longa) (HE-10X).............................................
68
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo da evolução ponderal
(gramas) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de
fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de duas
semanas de observação.........................................................................
24
Tabela 2 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo do tamanho do
menisco (centímetros) entre os grupos com as diferentes técnicas
operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de
duas semanas de observação................................................................
26
Tabela 3 - Distribuição do número e porcentagem de fixação parcial ou total
dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias,
ao final de duas semanas de observação...............................................
28
Tabela 4 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo das porcentagens de
células que repopularizaram o menisco transplantado, com duas
semanas de observação.........................................................................
32
Tabela 5 - Distribuição da presença ou ausência de infiltrado inflamatório nos
animais dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do
menisco transplantado, com duas semanas de observação...................
36
Tabela 6 - Distribuição da presença ou ausência de edema nos animais dos
grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco
transplantado, com duas semanas de observação.................................
37
Tabela 7 - Distribuição da presença ou ausência de complicações nos animais
dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco
transplantado, com duas semanas de observação.................................
38
xv
Tabela 8 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo da evolução ponderal
(gramas) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de
fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de
quatro semanas de observação..............................................................
40
Tabela 9 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo do tamanho do
menisco (centímetros) entre os grupos com as diferentes técnicas
operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de
quatro semanas de observação..............................................................
42
Tabela 10 - Distribuição do número e porcentagem de fixação parcial ou total
dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias,
ao final de quatro semanas de observação............................................
44
Tabela 11 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo das porcentagens de
células que repopularizaram o menisco transplantado, com quatro
semanas de observação.........................................................................
48
Tabela 12 - Distribuição da presença ou ausência de infiltrado inflamatório nos
animais dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do
menisco transplantado, com quatro semanas de observação................
52
Tabela 13 - Distribuição da presença ou ausência de edema nos animais dos
grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco
transplantado, com quatro semanas de observação..............................
54
Tabela 14 - Distribuição da presença ou ausência de complicações nos animais
dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco
transplantado, com quatro semanas de observação..............................
55
Tabela 15 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo da evolução ponderal
(gramas) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de
fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de oito
semanas de observação.........................................................................
57
xvi
Tabela 16 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
médias, mediana e valores máximo e mínimo do tamanho do
menisco (centímetros) entre os grupos com as diferentes técnicas
operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de
oito semanas de observação..................................................................
59
Tabela 17 - Distribuição do número e porcentagem de fixação parcial ou total
dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias,
ao final de oito semanas de observação................................................
61
Tabela 18 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da
repopularização celular do menisco entre as diferentes técnicas
operatórias de fixação, ao final de oito semanas de observação..........
65
Tabela 19 - Distribuição da presença ou ausência de infiltrado inflamatório nos
animais dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do
menisco transplantado, com oito semanas de observação....................
69
Tabela 20 - Distribuição da presença ou ausência de edema nos animais dos
grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco
transplantado, com oito semanas de observação..................................
70
Tabela 21 - Distribuição da presença ou ausência de complicações nos animais
dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco
transplantado, com oito semanas de observação..................................
71
Tabela 22 - Distribuição das médias, da variabilidade (desvio padrão), mediana,
mínimo e máximo dos ângulos dos joelhos medidos a partir das
radiografias, para critérios de exclusão de ângulos anômalos..............
72
xvii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da
evolução ponderal (gramas) entre os grupos com as diferentes
técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais
no início e ao final de duas semanas de observação.......................
25
Gráfico 2 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) do
tamanho do menisco (centímetros) entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao
tamanho no início e ao final de duas semanas de observação........
27
Gráfico 3 - Distribuição da porcentagem de fixação parcial ou total dos
meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias,
ao final de duas semanas de observação.........................................
29
Gráfico 4 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
porcentagens de células que repopularizaram o menisco
transplantado com duas semanas de observação............................
33
Gráfico 5 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da
evolução ponderal (gramas) entre os grupos com as diferentes
técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais
no início e ao final de quatro semanas de observação....................
41
Gráfico 6 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) do
tamanho do menisco (centímetros) entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao
tamanho no início e ao final de quatro semanas de observação.....
43
Gráfico 7 - Distribuição da porcentagem de fixação parcial ou total dos
meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias,
ao final de quatro semanas de observação......................................
45
Gráfico 8 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das
porcentagens de células que repopularizaram o menisco
transplantado, com quatro semanas de observação........................
49
xviii
Gráfico 9 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da
evolução ponderal (gramas) entre os grupos com as diferentes
técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais
no início e ao final de oito semanas de observação........................
58
Gráfico 10 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) do
tamanho do menisco (centímetros) entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao
tamanho no início e ao final de oito semanas de observação.........
60
Gráfico 11 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) entre
os diferentes métodos de fixação em relação à fixação do
menisco, ao final de oito semanas de observação..........................
62
Gráfico 12 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da
repopularização celular do menisco entre as diferentes técnicas
operatórias, ao final de oito semanas de observação......................
66
Gráfico 13 - Apresentação gráfica comparativa das técnicas operatórias
usadas em relação à fixação parcial do menisco transplantado,
nos três tempos de observação.......................................................
73
Gráfico 14 - Apresentação gráfica comparativa das técnicas operatórias
usadas em relação à fixação total do menisco transplantado, nos
três tempos de observação..............................................................
74
Gráfico 15 - Apresentação gráfica comparativa das técnicas operatórias
usadas em relação à repopularização celular do menisco
transplantado, nos três tempos de observação................................
75
xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
∆: variação
AF: Ângulo Frontal
AFT: Ângulo Fêmoro-Tibial
C: Celsius
cm: centímetros
Co: condrócitos
CPU: central processing unit / unidade central de processamento
dp: desvio padrão
Fb: fibroblastos
Fc: fibrocondrócitos (fibrócitos)
g: gramas
GI: grupo I
GII: grupo II
GIII: grupo III
GIV: grupo IV
HE: hematoxilina-eosina
IM: intramuscular
Kg: quilograma
Kv: quilovolt
L: litro
LCF: ligamento colateral fibular
LCT: Ligamento colateral tibial
LP: ligamento da patela
mAs: miliamperes/segundo
ML: menisco lateral
mL: mililitro
MM: menisco medial
mm: milímetro
mseg: milisegundo
PLL: patela luxada lateral
RAM: random access memory / memória de acesso aleatório
xx
TT: túneis tibiais
UI/Kg: unidades internacionais por quilo de peso
UNIFESP-EPM: Universidade Federal de São Paulo-Escola Paulista de Medicina
USP: Universidade de São Paulo
µm: micrômetro
xxi
RESUMO Objetivo: avaliação morfológica da repopularização celular de meniscos ultracongelados,
fixados por quatro diferentes técnicas operatórias. Métodos: retirou-se assepticamente o
menisco medial do joelho direito de 72 coelhos (Nova Zelândia), machos, idade entre 6/8
meses, peso médio de 3.250g. Os meniscos foram congelados a 73°Celsius negativos por um
período de 30 dias. Após este período os meniscos foram transplantados em outros coelhos e
fixados com quatro técnicas operatórias diferentes: sutura, túneis tibiais, túneis tibiais com
cola de fibrina e cola de fibrina. Analisou-se a repopularização celular no menisco
transplantado, duas, quatro e oito semanas após o transplante. Resultados: após duas semanas
de transplante, foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os quatro grupos
(p=0,001); o grupo sutura apresentou a maior porcentagem média de repopularização
(30,9%). Após quatro semanas de transplante, foi encontrada diferença estatisticamente
significante entre os quatro grupos (p=0,003), sendo que os grupos sutura e túneis tibiais
apresentaram as maiores porcentagens médias de repopularização e semelhantes entre si
(44,9% e 35,2%). Após oito semanas o grupo sutura apresentou a maior porcentagem média
de repopularização (76,9%), e se diferenciou significantemente dos grupos túneis tibiais
(40,02%), túneis tibiais com cola de fibrina (35,5%) e cola de fibrina (27,2%). Conclusão: a
repopularização por células do receptor no menisco ultracongelado e transplantado, ocorreu
em todos os grupos após duas, quatro e oito semanas de transplante, sendo mais evidente na
oitava semana com a técnica sutura que proporcionou a fixação mais estável dos enxertos.
xxii
ABSTRACT Objectives: Morphological evaluation of cell repopulation of ultrafrozen menisci fixed by
four different surgical techniques. Methods: Medial right knee menisci were aseptically
removed from 72 male rabbits (New Zealand), aged 6 to 8 months, mean weight of 3,250 g.
Menisci were frozen at minus 73o Celsius for thirty days. Then, menisci were transplanted in
different rabbits and were fixed by four different surgical procedures: suture, tibial tunnels,
tibial tunnels with fibrin glue, and fibrin glue. Transplanted menisci cell repopulation was
evaluated two, four and eight weeks after transplantation. Results: There have been
statistically significant differences among the four groups two weeks after transplantation
(p=0.001): the suture group presented the highest mean repopulation percentage (30.9%).
There have been statistically significant differences among the four groups four weeks after
transplantation (p=0.003): suture and tibial tunnels groups presented the highest mean
repopulation percentages without statistical differences between groups (44.9% and 35.2%).
The suture group presented the highest mean repopulation percentage eight weeks after
transplantation (76.9%) and was significantly different from tibial tunnels (40.02%), tibial
tunnels with fibrin glue (35.5%) and fibrin glue (27.2%) groups. Conclusion: Cell
repopulation, by receptor cells, of ultrafrozen and transplanted menisci was observed in all
groups two, four and eight weeks after transplantation, being more evident and significant in
the eighth week with the suture technique, which provided more stable graft fixation.
xxiii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS....................................................................................................... 4
3. MÉTODOS......................................................................................................... 5
4. RESULTADOS.................................................................................................. 23
5. DISCUSSÃO...................................................................................................... 76
6. CONCLUSÕES.................................................................................................. 86
7. REFERÊNCIAS................................................................................................. 87
8. NORMAS ADOTADAS.................................................................................... 94
APÊNDICE......................................................................................................... 95
xxiv
1. INTRODUÇÃO
A importância que os meniscos possuem para o funcionamento do joelho foi
adequadamente avaliada somente nos últimos 30 anos. Anteriormente presumia-se que os
meniscos fossem supérfluos e desprovidos de função. Seriam resquícios da evolução da
musculatura da perna e poderiam ser removidos sem provocar disfunção para o joelho.
Atualmente se sabe que os meniscos são estruturas fibrocartilaginosas semilunares localizadas
no platô tibial, com papel importante na função do joelho, distribuindo o estresse do peso,
auxiliando na lubrificação da articulação e na nutrição da cartilagem articular. A lesão ou a
retirada dos meniscos compromete a transmissão estática do peso através do joelho,
desencadeando a formação e progressão da artrose1-11.
A degeneração cartilaginosa progressiva após meniscectomia continua a ser um grande
desafio desde que King (1936)12 e Fairbank (1948)13 enfocaram este processo. Estudos têm
mostrado que a perda da função total ou parcial dos meniscos acarreta o aparecimento de
evidências radiográficas e artroscópicas de degeneração da cartilagem articular em joelhos.
Estas evidências, quando diagnosticadas, exigem uma conduta eficaz que evite a sua
progressão11-14. A partir destas observações sobreveio um imenso esforço para definir os
modos de preservação ou substituição dos meniscos lesados.
São escassas as estratégias viáveis no intuito de corrigir a perda meniscal e evitar a
artrose precoce. Milachowski et al (1989)15 relataram o primeiro estudo de reposição de um
menisco humano utilizando enxerto retirado de cadáver. Desde então, o número de
transplantes meniscais tem aumentado paulatinamente, com grande expressividade no campo
experimental, permitindo um novo enfoque na conduta terapêutica7,8,15-20.
Passados vinte e dois anos do primeiro procedimento operatório de menisco
transplantado, determinadas dúvidas ainda persistem. Uma delas diz respeito à escolha da
forma mais adequada de preservação do enxerto, o que afetaria as questões sobre o momento
e a velocidade com que ocorre a ocupação do menisco pelas células do receptor, ou seja, a
repopularização celular. A migração de células do receptor no tecido doador seria um fator
positivo para a melhor integração do menisco transplantado, uma vez que as propriedades
anatômicas e funcionais deste enxerto dependeriam de uma adequada atividade celular
mantendo suas características as mais fisiológicas possíveis6,7,8,9,15,21.
2
Autores partidários do transplante meniscal utilizando o enxerto fresco argumentam que
a existência de células vivas do doador manteria a integridade do menisco e facilitaria a
ocupação celular gradativa pelas células do receptor. Entretanto, autores partidários do
congelamento profundo do menisco, processo que acarretaria a escassez de células vivas,
argumentam que esta maneira de preservar o enxerto minimizaria qualquer possibilidade de
reações imunológicas7,8,10,19,21. Por sua vez, Reckers et al22 verificaram que os meniscos de
coelhos congelados em temperaturas diferentes, mesmo no ultracongelamento, permanecem
com cerca de 30% de células viáveis ao final de trinta dias de estocagem.
A repopularização celular que ocorre no menisco transplantado persiste como fator
pouco relatado na literatura especializada. Arnoczky et al (1992)19 estudaram e identificaram
os estágios de repopularização celular. Na primeira semana após o transplante, nenhuma
célula foi observada no menisco. Em torno da segunda semana, notou-se a presença de células
na superfície tibial e femoral do menisco. No primeiro mês, as células foram observadas por
toda a superfície tibial e femoral, enquanto que no terceiro mês, já havia uma distribuição
mais homogênea, permanecendo acelular apenas o centro do menisco. Após este estudo
pioneiro, não foram identificados outros trabalhos que enfoquem este tipo de avaliação,
analisando o momento e a porcentagem com que as células do receptor preenchem o menisco
transplantado19.
Portanto o conhecimento do processo de integração do menisco transplantado,
principalmente nos aspectos de ocupação celular do enxerto por células do receptor, é um
campo de pesquisa em aberto e cujo equacionamento poderá trazer uma contribuição
relevante no encaminhamento da escolha de um substituto para as situações que exijam a
meniscectomia total23.
Paralelamente a isto, outra dúvida diz respeito ao modo de fixação do menisco
transplantado. A técnica operatória utilizada e o tipo de material usado para manter o enxerto
têm obviamente interferência na capacidade de integração do tecido ao doador. Materiais
inertes e técnicas menos invasivas podem ser decisivas neste aspecto.
Autores têm realizado estudos experimentais, na busca de uma técnica operatória que
permita resultados com êxito e que levem a uma melhor repopularização celular do menisco
transplantado7,9,16,17,19,20,24. Diversas técnicas de fixação já foram testadas e até o momento
não está claro qual a melhor forma de se manter o menisco em uma posição mais adequada
3
anatomicamente, que evite todo e qualquer dano à cartilagem articular, permitindo uma
migração mais favorável de células do receptor para o enxerto1,4,7,9,15,18,20,24-28.
Na tentativa de manter o menisco transplantado em sua posição mais próxima da
anatomia normal, permitindo sua melhor repopularização, surge como opção a cola de fibrina,
que é um produto complexo derivado de plasma, e que vem sendo utilizada em escala cada
vez maior como um adesivo tecidual biodegradável. Sua aplicação em diversas situações
cirúrgicas busca diminuir ou impedir os sangramentos em estruturas parenquimatosas29-32 ou
proporcionar a aproximação continente de estruturas tubulares. O mecanismo de ação deste
adesivo é explicado por uma reação cruzada com o fator XIII da coagulação, tendo o cálcio
como catalisador, o que faz com que a trombina converta o fibrinogênio em uma rede firme
de fibrina que é mecanicamente estável e com acentuadas propriedades adesivas30,33,34.
O Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação desenvolve uma linha de
pesquisa em Integração Orgânica de Materiais de Sutura, Enxertos e Transplantes, e diante
dos evidentes questionamentos que envolvem os transplantes meniscais, no que tange a forma
mais adequada de preservação e de fixação dos enxertos para se obter sua satisfatória
integração ao receptor, propõe-se a avaliar a repopularização celular ao longo do tempo (duas,
quatro e oito semanas), após transplante de menisco, utilizando quatro diferentes técnicas de
fixação.
Optou-se por um modelo animal em coelhos, usando enxertos ultracongelados retirados
de um animal doador e transplantados para outro animal receptor, criando-se assim uma
situação similar àquela que seria no futuro a encontrada, quando utilizada em humanos.
2. OBJETIVOS
2.1Geral:
Estudo do transplante meniscal para enxerto homólogo.
2.2 Específico:
Estudo morfológico da repopularização celular no transplante homólogo de menisco medial
em coelhos, utilizando-se quatro diferentes técnicas de fixação: sutura, cola de fibrina, túneis
tibiais e túneis tibiais com cola de fibrina.
3. MÉTODOS
O experimento foi submetido à apreciação e aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo-UNIFESP-EPM, protocolo nº1238/03.
3.1 Amostra
Foram utilizados setenta e dois coelhos, Oryctolagus cuniculus, da linhagem Nova
Zelândia, albinos, machos, com idade entre seis e oito meses e peso médio de 3.250 gramas.
Os coelhos permaneceram por um período adaptativo pré-operatório de sete dias no
Biotério da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM,
responsável pelo experimento, alojados em gaiolas individuais, em condições de temperatura
controlada por sistema de ar condicionado, ciclo de luz-escuridão de doze horas e alimentação
com ração própria para a espécie e com água à vontade (Figura 1).
O estudo foi dividido em três etapas, realizadas durante um período de 12 meses.
Devido ao tamanho da amostra sempre trabalhou-se com vinte e quatro animais no biotério. A
distribuição da amostra está esquematizada na figura 2.
Figura 1 - Biotério da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM. Animais alojados em gaiolas individuais.
6
3.2 Avaliação Radiográfica
Previamente à realização dos procedimentos operatórios, os animais sob anestesia,
foram submetidos à radiografias com o intuito de analisar o ângulo frontal do membro inferior
direito.
Para a realização dos exames, utilizou-se um aparelho Orion 500 mAs de ânodo
giratório com 125Kv, com distância focal de um metro, centrado nos joelhos, foco fino de
3.2mAs, 45Kv e 40mseg. Na distância focal de um metro, as dimensões não sofrem distorções
e correspondem à real mensuração. Para a mensuração, utilizou-se um objeto padrão
radiopaco de 10cm na calibragem das medidas radiográficas35. Analisou-se como parâmetro
radiográfico o seguinte ângulo:
• Ângulo frontal: determinado no quadrante superior e lateral, pela união
entre uma reta traçada pelo eixo longitudinal do fêmur e outra tangente à
superfície articular dos côndilos femorais, na incidência ântero-posterior
(Figura 3).
Utilizou-se como critério de exclusão os animais que apresentaram diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos, quanto à média dos ângulos encontrados.
3.3 Procedimento Anestésico
Os animais foram privados de ração por seis horas antes do ato operatório e pesados
em balança de precisão, imediatamente antes da medicação pré-anestésica. Previamente à anestesia, foi realizada antibioticoprofilaxia com penicilina procainada
(Ariston®) na dose 40.000UI/Kg dia, mantido por mais dois dias após o procedimento.
Na sala operatória, os coelhos receberam como medicação 2,4mg.Kg-1 de
acepromazina (Acepran®) a 1% e 4mg.Kg-1 de cloridrato de xilazina (Anasedan®) adicionados
na mesma seringa e administrados pela via intramuscular (região posterior da coxa-ventre dos
músculos semitendíneo e semimembranáceo).
Viabilizou-se um acesso venoso por meio da punção da veia auricular marginal, para
infusão de solução salina de cloreto de sódio a 0,9% e das drogas necessárias para a indução
anestésica, como cloridrato de cetamina (Ketamin®) e cloridrato de xilazina, na proporção de
1:1, administrando-se 0,5 mL desta solução.
7
Na sala cirúrgica, os animais foram mantidos em decúbito dorsal na calha operatória e
intubados com sonda orotraqueal 2,5 sem balão. A manutenção anestésica se fez com
isofluorano a 1,5%, em fluxo constante de 2L por minuto e com uma freqüência respiratória
de dez movimentos respiratórios por minuto, ciclados pelo aparelho Takaoka® (modelo KT12
Sansei).
8
Figura 2 – Esquema de distribuição dos animais nos diversos grupos de estudo.
Grupo I Sutura
(n=18 meniscos)
Grupo II Túneis Tibiais (TT)
(n=18 meniscos)
Grupo III TT + cola de fibrina
(n=18 meniscos)
Grupo IV Cola de fibrina (n=18 meniscos)
Eutanásia 14 dias (n=6 meniscos)
Eutanásia 14 dias(n=6 meniscos)
Eutanásia 14 dias(n=6 meniscos)
Eutanásia 14 dias(n=6 meniscos)
Eutanásia 30 dias (n=6 meniscos)
Eutanásia 30 dias(n=6 meniscos)
Eutanásia 30 dias(n=6 meniscos)
Eutanásia 30 dias(n=6 meniscos)
Eutanásia 60 dias (n=6 meniscos)
Eutanásia 60 dias(n=6 meniscos)
Eutanásia 60 dias (n=6 meniscos)
Eutanásia 60 dias(n=6 meniscos)
72 coelhos (n=72meniscos)
9
Figura 3 – Radiografia na incidência ântero-posterior do joelho direito mostrando o ângulo frontal.
3.4 Procedimento operatório no doador
O animal foi posicionado em decúbito dorsal, em calha própria para operações em
coelhos. Com o animal anestesiado foi realizada a tricotomia de todo o membro posterior
direito, desde a raiz da coxa até a pata do animal, sem incluí-la. Posteriormente foi feita a
anti-sepsia com solução de polivinilpirrolidona (Povidine®) e a colocação de panos
esterilizados, delimitando o campo operatório. O procedimento operatório iniciou-se com uma
incisão longitudinal parapatelar medial medindo em torno de cinco centímetros. Foi
divulsionada a tela subcutânea, identificando-se o ligamento da patela, até a exposição da
cápsula articular medial. Um esforço em valgo, flexão do joelho e luxação lateral da patela
foram o suficiente para acessar o menisco medial. A meniscectomia total foi realizada com
um bisturi lâmina número 11 e uma tesoura reta de dez centímetros (Figura 4). Após sua
retirada, os meniscos foram medidos em seu eixo maior (Figura 5) e colocados em pequenos
sacos de plástico estéreis com dimensões de seis por quatro centímetros, lacrados com
esparadrapo, também estéril. Cada conjunto foi novamente armazenado em um novo
10
invólucro de plástico duro-rígido, circular, com sete centímetros de comprimento, esterilizado
em óxido de etileno. Após identificação com número, o menisco foi levado para o congelador
e mantido a uma temperatura de 73°Celsius negativos.
Procedeu-se a redução da luxação da patela, seguindo-se o fechamento da cápsula
articular e pele com fio de poliamida (Mononylon®-Ethicon 5.0). Terminado o ato operatório
o animal foi levado para a sala de recuperação e observado por um período pós-anestésico até
a recuperação total da consciência e deambulação espontânea, sendo posteriormente
devolvido à sua gaiola. Os animais foram mantidos em temperatura ambiente e alimentados
com ração e água. Não foi necessária a realização de curativo. Os pontos foram expulsos
espontaneamente, em média com 16 dias de pós-operatório.
Figura 4 - Foto representativa da meniscectomia medial (M=menisco).
M
11
Figura 5 - Foto representativa da medição do menisco medial no seu eixo maior com o uso de paquímetro digital.
3.5 Procedimento operatório no receptor
Após 30 dias do primeiro procedimento, foi realizada a segunda etapa do experimento.
Os meniscos foram retirados do congelador e dos invólucros a que se mantinham
armazenados, e colocados em um recipiente com solução salina de cloreto de sódio a 0,9%
em temperatura ambiente, ocorrendo o descongelamento dos mesmos por um período de 15
minutos, em média.
Repetiram-se as etapas do primeiro procedimento operatório quanto a jejum,
anestesia, antibioticoprofilaxia, assepsia e anti-sepsia. Realizou-se uma incisão longitudinal
parapatelar medial, medindo em torno de cinco centímetros. Foi dissecado o tecido celular
subcutâneo até a exposição da cápsula articular medial. A patela foi luxada lateralmente e o
joelho flexionado.
Em seguida, foram reimplantados em coelhos diferentes, sendo o menisco do coelho
número um colocado no coelho número dois, e vice-versa. Previamente à realização dos
transplantes, ocorreu a randomização dos períodos de observação e para a definição de uma
das quatro técnicas operatórias propostas:
12
3.5.1 Sutura: a técnica de sutura dos meniscos foi realizada com fio de poliamida 5.0 preto.
Foram realizados três pontos de fixação, sendo o primeiro na região do corno posterior junto à
inserção do ligamento cruzado anterior (Figura 6A), o segundo ponto de fixação foi realizado
na região do corno anterior junto à cápsula anterior20 (Figura 6B) e o terceiro ponto de fixação
foi realizado no corpo do menisco onde foi realizado um ponto em “U”, junto ao ligamento
colateral tibial (Figura 7).
Figura 6 – Foto representativa da técnica de sutura após fixação do menisco. (A) Fixação do corno posterior junto ao ligamento cruzado anterior. (B) Fixação do corno anterior junto à cápsula anterior.
Figura 7 – Foto representativa da técnica de sutura após fixação do menisco. (A) Fixação do corpo do menisco no ligamento colateral tibial. (B) Menisco transplantado (imagem em perfil).
A
B
A
B
13
3.5.2 Túneis tibiais: sendo o coelho um animal de pequeno porte, a técnica de túneis tibiais
foi realizada sem a presença do bloco ósseo. Primeiramente, com uma broca de um milímetro
de diâmetro, realizou-se o túnel posterior, iniciando na região ântero-medial da tíbia, em
direção posterior, com finalização na inserção do corno posterior do menisco medial (Figura
8). O túnel anterior também foi realizado com uma broca de um milímetro, iniciando-se na
região do platô tibial, mais precisamente na inserção do corno anterior do menisco medial,
estando a broca paralela à diáfise da tíbia (Figura 9A). Um segundo túnel anterior foi
realizado iniciando na região ântero-medial da tíbia, lateral ao túnel posterior, com o objetivo
de encontrar o primeiro túnel anterior (Figura 9B). Em seguida introduziu-se um fio de
poliamida 5.0 preto através do túnel posterior, que na seqüência foi passado através do corno
posterior do menisco em forma de “U” (Figura 10 A e B). Este fio retornou pelo mesmo túnel
até a região anterior da tíbia. Um segundo fio de poliamida 5.0 preto foi introduzido pelo
túnel anterior (Figura 11A), sendo realizado um ponto em “U” no corno anterior do menisco
(Figura 11B). Este fio retornou pelo mesmo túnel até a região anterior da tíbia, onde foi
realizado o ponto final (nó) (Figura 12). O corpo do menisco foi fixado junto ao ligamento
colateral tibial em forma de “U” (Figura 13).
Figura 8 – Foto representativa do momento da passagem da broca para a realização do túnel posterior.
14
Figura 10 – (A) Foto representativa do momento da passagem do fio no túnel posterior. (B) Foto mostrando a realização do ponto em “U” no corno posterior do menisco medial.
Figura 11 - (A) Foto representativa do momento da passagem da agulha no túnel anterior. (B) Foto representativa do momento da realização do ponto em “U” no corno anterior do menisco medial.
A B
A B
AB
Figura 9 - (A) Foto representativa do momento da passagem da broca para a realização do primeiro túnel anterior. (B) Foto representativa do momento da passagem da broca para realização do segundo túnel anterior, encontrando o primeiro túnel anterior.
B
15
Figura 12 - Foto representativa da técnica de túneis tibiais após fixação do menisco.
Figura 13 - Foto mostrando os quatro fios na região anterior da tíbia (setas amarelas) e a
passagem do fio de poliamida no ligamento colateral tibial (seta branca).
MENISCO TRANSPLANTADO
NÓ NA REGIÃO ANTERIOR DA TÍBIA
PATELA LUXADA LATERAL
16
3.5.3 Túneis tibiais com cola de fibrina: Primeiramente, com uma broca de um milímetro
de diâmetro, realizou-se o túnel posterior, iniciando na região ântero-medial da tíbia, em
direção posterior, com finalização na inserção do corno posterior do menisco medial (Figura
8). O túnel anterior também foi realizado com uma broca de um milímetro, iniciando-se na
região do platô tibial, mais precisamente na inserção do corno anterior do menisco medial,
estando a broca paralela à diáfise da tíbia (Figura 9A). Um segundo túnel anterior foi
realizado iniciando na região ântero-medial da tíbia, lateral ao túnel posterior, com o objetivo
de encontrar o primeiro túnel anterior (Figura 9B). Em seguida introduziu-se um fio de
poliamida 5.0 preto através do túnel posterior, que na seqüência foi passado através do corno
posterior do menisco em forma de “U” (Figura 10B). Este fio retornou pelo mesmo túnel até a
região anterior da tíbia. Um segundo fio de poliamida 5.0 preto foi introduzido pelo túnel
anterior, sendo realizado um ponto em “U” no corno anterior do menisco (Figura 11B). Este
fio retornou pelo mesmo túnel até a região anterior da tíbia. Um terceiro fio de poliamida 5.0
preto foi passado no corpo do menisco e no ligamento colateral tibial (Figura 13). Antes do
nó final na região anterior da tíbia e no ligamento colateral tibial, adicionou-se 0,4mL de cola
de fibrina na região tibial do menisco (Figura 14A), mantendo-se este pressionado por dois
minutos (Figura 14B). Após este período realizou-se a fixação dos fios cruzados na região
anterior da tíbia e a fixação do corpo do menisco junto ao ligamento colateral tibial.
Figura 14 – (A) Foto representativa no momento da aplicação de 0,4mL de cola de fibrina antes da fixação
final. (B) Foto representativa do momento da manutenção do menisco no platô tibial após a introdução da cola de fibrina.
A B
17
3.5.4 Cola de fibrina: foi realizada a fixação do menisco com a aplicação de 0,4mL de cola
de fibrina na porção tibial do menisco medial. Realizou-se compressão manual sobre o
menisco na região do platô tibial durante um período de dois minutos (Figura 15).
Figura 15 – (A) Foto da pistola, do frasco e da ponteira onde é adicionada a cola de fibrina. (B) Foto representativa dos frascos e ponteiras da cola de fibrina: (1) Ponteiras já utilizadas com a cola de fibrina. (2) Ponteiras que serão utilizadas no procedimento operatório. (3) Frascos de cola de fibrina.(C) Foto representativa do momento da aplicação da cola de fibrina no menisco medial. (D) Foto representativa do momento da manutenção do menisco no platô tibial após a introdução da cola de fibrina.
A
C D
B
11 22
33
18
3.6 Procedimento operatório de coleta dos meniscos transplantados
Após duas, quatro e oito semanas da segunda etapa, os coelhos foram sacrificados com
acepromazina (Acepran®) na dose de 1mg/Kg IM, como medicação pré-anestésica, e após dez
minutos procedeu-se a injeção intravenosa da associação (T-61) de Embutramida, Mebezônio
e Tetracaína, procedendo-se assim a eutanásia.
Para a coleta dos meniscos transplantados realizou-se a tricotomia de todo o membro
posterior direito, desde a raiz da coxa até a pata do animal, porém sem incluí-la. A anti-sepsia
da área tricotomizada foi realizada com polivinilpirrolidona (Povidine®) e isolada com panos
esterilizados, delimitando o campo para o ato operatório. Iniciou-se com uma incisão
longitudinal parapatelar medial medindo em torno de oito centímetros. Foi divulsionada a tela
subcutânea, identificando-se o ligamento da patela até a exposição da cápsula articular
medial. Um esforço em valgo, flexão do joelho e luxação lateral da patela foram o suficiente
para acessar o menisco medial. A meniscectomia total foi realizada com um bisturi lâmina
número 11 e uma tesoura reta de dez centímetros. Após sua retirada os meniscos foram
medidos em seu eixo maior (Figura 5) e encaminhados para processamento histológico. Para a
coleta do menisco medial do joelho controle (joelho contralateral) realizou-se o mesmo
procedimento operatório efetuado no joelho transplantado.
3.7 Critérios de avaliação macroscópica
Os meniscos foram submetidos à análise macroscópica, sendo classificados como
normal, quando apresentavam forma e tamanho comparáveis ao grupo controle (joelho
contralateral), e alterados, quando possuíam tamanho menor e/ou forma distinta. Foi avaliada
também a presença ou não de cicatrização do menisco com a membrana sinovial,
classificando-a como total, quando todo o menisco estava fixo à sinovial, e parcial, quando
pelo menos um dos terços do menisco não estava aderido. Esta avaliação foi realizada por um
ortopedista independente, que desconhecia as técnicas de fixação que estavam sendo
avaliadas e seus respectivos grupos.
19
3.8 Processamento histológico e critérios de avaliação
O procedimento histológico incluiu três cortes verticais em relação ao eixo maior do
menisco (10mm), delimitando o menisco em: corno anterior (0,33mm), corpo (0,33mm) e
corno posterior (0,33mm). Estes cortes foram emblocados em parafina e seccionados com
micrótomo rotativo, ajustado para 5µm de espessura, seguindo-se a preparação das lâminas e
coloração pelo método de hematoxilina-eosina (HE).
Para cada corte foram estudadas duas lâminas, e identificados e contados os diferentes
tipos celulares (fibroblastos, fibrocondrócitos e condrócitos) determinados em 250 quadrantes
tomados aleatoriamente. A contagem celular por unidade de lâmina estudada foi realizada
utilizando uma escala de milímetros quadrados em relação ao corte delimitado (Figura 17).
Figura 16 – Foto de um quadrante sendo quantificado pelo programa Image-Pro-Plus (setas:
células repopularizadas).
20
As lâminas foram avaliadas pelo sistema computadorizado de análise de imagens, que
consistiu de uma vídeo-câmera Nikon® FDX-35, acoplada a um microscópico óptico Nikon
(Eclipse 800), com objetivas pancromáticas, que transmitiram as imagens a um
microcomputador Pentium IV, com 502 megabytes de memória RAM, trabalhando em
ambiente Windows XP Professional® e equipado com placa digitalizadora e o software
Imagem Pro-Plus® (versão 4.5). O mesmo procedimento foi realizado para os meniscos
controle respectivamente.
3.9 Critérios de classificação do Edema entre fibras colágenas
Nos cortes corados em HE foram analisados vinte campos por lâmina, localizados na
periferia e centro do menisco transplantado, e adotados os seguintes critérios para classificar o
edema:
- edema ausente: quando não ocorreu afastamento entre as fibras de colágeno da
matriz transplantada;
- edema leve: quando o afastamento entre as fibras colágenas (espaço entre duas fibras
contíguas) foi correspondente à largura de uma fibra colágena;
- edema moderado: quando o afastamento entre as fibras (espaço entre duas fibras
contíguas) foi correspondente à largura de duas fibras colágenas;
- edema intenso: quando o afastamento entre as fibras (espaço entre duas fibras
contíguas) foi correspondente à largura de três ou mais fibras colágenas.
3.10 Critérios de classificação da reação imunológica
Nos cortes corados em HE foram analisados vinte campos por lâmina, localizados na
periferia e centro do menisco transplantado, e adotados os seguintes critérios para classificar a
reação imunológica:
- reação ausente: quando identificada a presença de até cinco linfócitos entre as células
componentes da repopularização do menisco transplantado;
- reação leve: quando identificada a presença de 5 a 10 linfócitos entre as células
componentes da repopularização do menisco transplantado;
21
- reação moderada: quando identificada a presença de 11 a 20 linfócitos entre as
células componentes da repopularização do menisco transplantado;
- reação intensa: quando identificada a presença de mais de 21 linfócitos entre as
células componentes da repopularização do menisco transplantado.
3.11 Critérios de classificação da reação inflamatória
Nos cortes corados em HE foram analisados vinte campos por lâmina, localizados na
periferia e centro do menisco transplantado, e adotados os seguintes critérios para classificar a
reação inflamatória:
- reação ausente: quando identificada presença de até cinco células inflamatórias
(neutrófilos polimorfonucleados) entre as células componentes da repopularização do menisco
transplantado;
- reação leve: quando identificada a presença de 5 a 10 células inflamatórias
(neutrófilos polimorfonucleados) entre as células componentes da repopularização do menisco
transplantado;
- reação moderada: quando identificada a presença de 11 a 20 células inflamatórias
(neutrófilos polimorfonucleados) entre as células componentes da repopularização do menisco
transplantado;
- reação intensa: quando identificada a presença de mais de 21 células inflamatórias
(neutrófilos polimorfonucleados) entre as células componentes da repopularização do menisco
transplantado.
3.12 Critérios de classificação das complicações macroscópicas
No momento de abertura da cápsula articular e exposição do menisco transplantado
antes e após sua retirada, foram anotadas as eventuais alterações que pudessem ser
consideradas como fatores intervenientes no processo de integração. Assim, foram
considerados fatores de complicação a presença de secreção serosa, secreção caseosa,
secreção purulenta, hematoma ou qualquer coleção sanguinolenta. Adotou-se o critério de
anotar a ausência ou presença da complicação e a sua descrição qualitativa.
22
3.13 Estudo Estatístico
Utilizou-se no estudo estatístico software SPSS 10®. As variáveis foram representadas
por média e desvio padrão (dp). Adotou-se o nível de significância de 0,05 (α≤5%) e níveis
descritivos (p) inferiores a esse valor foram considerados significantes e representados por um
asterisco.
As variáveis quantitativas foram representadas por média, desvio padrão (dp),
mediana, valores mínimo e máximo, e as qualitativas por freqüência absoluta (n) e relativa
(%).
Os grupos de diferentes métodos de fixação foram comparados dentro de cada
experimento, definidos pelo tempo de eutanásia, duas, quatro e oito semanas de observação.
Foram aplicados os testes estatísticos:
• Prova de Kruskal-Wallis para comparar os quatro métodos de fixação quanto à
distribuição das variáveis quantitativas: peso inicial, peso final, tamanho do menisco
pré-transplante, tamanho do menisco na eutanásia e porcentagem de células
repopularizadas no menisco transplantado;
• Teste de Comparações Múltiplas de Dunn para localizar as diferenças entre os
métodos de fixação quando o resultado da Prova de Kruskal-Wallis foi significante;
• Teste Exato de Fisher para comparar os métodos de fixação, dois a dois, quanto à
distribuição das variáveis qualitativas: fixação do menisco, infiltrado inflamatório,
edema e complicações.
Foi aplicada a correção de Bonferroni ao nível de significância quando um teste foi
utilizado várias vezes de forma a garantir em cada comparação de grupos um nível de
significância global de 5%.
4. RESULTADOS
4.1 Observação de duas semanas.
4.1.1 Avaliação da variação ponderal (gramas) com duas semanas de observação.
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final
de duas semanas de observação (p=0,896 no início e p=0,563 no final) [Tabela 1 e Gráfico1].
4.1.2 Avaliação da variação do tamanho do menisco (cm) com duas semanas de
observação.
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho do menisco pré-transplante
e com duas semanas de observação (p=0,546 no pré-transplante e p=0,454 na eutanásia)
(Tabela 2 e Gráfico 2).
4.1.3 Avaliação da fixação do menisco com duas semanas de observação.
Na comparação entre as diferentes técnicas operatórias em relação à capacidade de
fixação do menisco, foram encontrados os seguintes resultados:
•
•
Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos sutura (Figura 17) e cola
de fibrina (Figura 18) (p=0,015), onde no grupo sutura 80% dos meniscos apresentou
fixação total, enquanto que no grupo cola de fibrina a proporção foi significantemente
menor com fixação de 0% dos meniscos (Tabela 3; Gráfico 3).
Não houve diferença estatisticamente significante entre os demais grupos (p>0,05 em
todas as comparações).
A correção de Bonferroni para as comparações múltiplas (somente valores de p
menores do que 0,008 que seriam estatisticamente significantes) não foi efetuada, pois a
comparação entre os grupos mostrou diferença significante (p>0,008).
24
Tabela 1 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo da evolução ponderal (gramas) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de duas semanas de observação.
Peso (g)
Inicial Final
Técnica de fixação –
observação com duas semanas Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Sutura
(n = 5)
3108,0 ± 480,7
2800
2740 / 3750
3428,0 ± 481,6
3440
2900 / 4000
Cola de fibrina
(n = 6)
2873,3 ± 185,9
2855
2630 / 3200
3118,3 ± 285,9
3095
2750 / 3520
Túneis tibiais
(n = 6)
2941,7 ± 430,0
2795
2500 / 3650
3085,0 ± 411,2
2955
2770 / 3890
Túneis e cola
(n = 6)
2906,7 ± 196,7
2880
2700 / 3240
3069,5 ± 226,0
2978
2900 / 3500
Prova de
Mann-Whitney
p = 0,896 p = 0,563
25
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Inicial Final
Méd
ia d
e pe
so d
os a
nim
ais
(g)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
observação em 2 semanas
Gráfico 1 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da evolução ponderal (gramas) entre os
grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de duas semanas de observação.
26
Tabela 2 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo do tamanho do menisco (centímetros) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de duas semanas de observação.
Tamanho do menisco (cm)
Pré-transplante Duas semanas Técnica de fixação observação
em duas semanas Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Sutura
(n = 5)
1,14 ± 0,11
1,10
1,00 / 1,30
1,00 ± 0,06
1,00
0,90 / 1,08
Cola de fibrina
(n = 6)
1,08 ± 0,08
1,10
1,00 / 1,20
0,97 ± 0,05
1,00
0,90 / 1,00
Túneis tibiais
(n = 6)
1,07 ± 0,12
1,00
1,00 / 1,30
0,98 ± 0,08
1,00
0,90 / 1,10
Túneis e cola
(n = 6)
1,08 ± 0,12
1,05
1,00 / 1,30
0,92 ± 0,10
0,95
0,80 / 1,00
Prova de
Mann-Whitney p = 0,546 p = 0,454
27
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Inicial FinalMéd
ia d
e ta
man
ho d
o m
esni
co d
os a
nim
ais
(cm
)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
observação em 2 semanas
Gráfico 2 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) do tamanho do menisco (centímetros)
entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de duas semanas de observação.
28
Tabela 3 - Distribuição do número e porcentagem de fixação parcial ou total dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias, ao final de duas semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com duas semanas Fixação do
menisco Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
Parcial
1 ( 20,0)
6 (100,0)
4 ( 66,7)
4 ( 66,7)
Total
4 ( 80,0)
0 ( 0,0)
2 ( 33,3)
2 ( 33,3)
Soma
5 (100,0)
6 (100,0)
6 (100,0)
6 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 0,015*
sutura x túneis tibiais
p = 0,242
sutura x túneis e cola de fibrina
p = 0,242
cola de fibrina x túneis tibiais
p = 0,455
cola de fibrina x túneis e cola
p = 0,455
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola de fibrina
p = 1,000
29
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porc
enta
gem
de
anim
ais
(%)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
Observação em 2 semanas
Fixação Parcial Fixação Totala
Gr
*p<0,05, Sutura x Cola de fibrin
áfico 3 - Distribuição da porcentagem de fixação parcial ou total dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias, ao final de duas semanas de observação.
30
B
A Figura 17 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal dogrupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de sutura, com duas semanas de observação.
B
A
Figura 18 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animaldo grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com duas semanas de observação. Verificar à direita o corno posterior do menisco descolado do platô tibial (seta amarela).
31
B F
F
A
igura 19 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de fibrina, com duas semanas de observação. Verificar à direita a presença de cor amarronzada do menisco transplantado.
B
Aigura 20 – (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com duas semanas de observação. Verificar à direita a presença da membrana sinovial adjacente ao menisco transplantado (setas horizontais) (seta amarela mostrando fio de sutura).
32
4.1.4 Avaliação da repopularização celular do menisco transplantado com duas semanas
de observação.
Na avaliação da repopularização celular, foi encontrada diferença estatisticamente
significante entre as técnicas operatórias de fixação (p=0,001). Os testes de comparações
múltiplas de Dunn com correção de Bonferroni mostraram que o grupo sutura (Figura 21)
[Tabela 4; Gráfico 4], com as maiores porcentagens de repopularização, se diferenciou
significantemente dos grupos cola de fibrina (Figura 22) [Tabela 4; Gráfico 4] e túneis tibiais
com cola de fibrina (Figura 23) [Tabela 4; Gráfico 4] que apresentaram as menores
porcentagens. O grupo túneis tibiais (Figura 24) [Tabela 4; Gráfico 4] com valores
intermediários de porcentagem de repopularização não se diferenciou significantemente dos
demais grupos.
Tabela 4 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo das porcentagens de células que repopularizaram o menisco transplantado, com duas semanas de observação.
Repopularização celular (%)
Técnica de fixação –
observação duas semanas média
dp
mediana
mínimo
Máximo
Sutura (n = 5)
30,9 8,8 31,0 22 42
Cola de fibrina (n = 6)
Túneis tibiais (n=6)
14,4
23,2
5,0
3,7
22,2
14,3
16
10
31
20
Túneis e cola (n = 6)
13,8
5,5
14,2
5
21
Prova de Kruskal-Wallis: p=0,001 *
33
Observação em 2 semanas
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
Méd
ia (+
/- 1
dp) d
a re
popu
lariz
ação
cel
ular
(%)
* p < 0,05 quando comparadoao grupo Sutura
Gráfico 4 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das porcentagens de células que
repopularizaram o menisco transplantado com duas semanas de observação.
34
Figura 21 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de sutura, com duas semanas de observação. Verificar a quantidade significativa de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) desde a periferia do enxerto (seta longa) até o seu terço proximal (seta curta) (HE-10X).
Figura 22 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com duas semanas de observação. Verificar a escassa quantidade de células restrita à periferia do enxerto (seta) (HE-10X).
35
Figura 23 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de fibrina, com duas semanas de observação. Verificar escassa quantidade de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) restrita à periferia do enxerto (seta) (HE-10X).
Figura 24 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com duas semanas de observação. Verificar três a quatro camadas de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) a partir da periferia do enxerto (setas) (HE-10X).
36
4.1.5 Reação imunológica Nenhum dos quatro grupos de métodos de fixação apresentou reação imunológica.
4.1.6 Infiltrado inflamatório
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
infiltrado inflamatório, não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os
grupos (p>0,05 em todas as comparações).
Tabela 5 - Distribuição da presença ou ausência de infiltrado inflamatório nos animais dos
grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com duas semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com duas semanas
Infiltrado inflamatório Sutura
Cola de fibrina
Túneis Tibiais
Túneis e
Cola
Não 5 (100,0) 3 ( 50,0) 4 ( 66,7) 4 ( 66,7)
Sim 0 ( 0,0) 3 ( 50,0) 2 ( 33,3) 2 ( 33,3)
Total 5 (100,0) 6 (100,0) 6 (100,0) 6 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 0,182
sutura x túneis tibiais
p = 0,455
sutura x túneis e cola
p = 1,000
cola de fibrina x túneis tibiais
p = 1,000
cola de fibrina x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis tibiais x túneis e cola
p = 1,000
37
4.1.7 Edema
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
edema, não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05 em
todas as comparações).
Tabela 6 - Distribuição da presença ou ausência de edema nos animais dos grupos submetidos
a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com duas semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com duas semanas
Edema Sutura
Cola de fibrina
Túneis
Túneis e Cola
Não 4 ( 80,0) 2 ( 33,3) 2 ( 33,3) 2 ( 33,3)
Sim 1 ( 20,0) 4 ( 66,7) 4 ( 66,7) 4 ( 66,7)
Total 5 (100,0) 6 (100,0) 6 (100,0) 6 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 0,242
sutura x túneis tibiais
p = 0,242
sutura x túneis e cola
p = 0,242
cola de fibrina x túneis tibiais
p = 1,000
cola de fibrina x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis tibiais x túneis e cola
p = 1,000
38
4.1.8 Complicações
Em relação à presença de complicações, não foi encontrada diferença estatisticamente
significante entre os grupos (p>0,05 em todas as comparações).
No grupo sutura foi encontrado um caso de secreção serosa e no grupo cola de fibrina
um caso de hematoma e outro de necrose do menisco.
Tabela 7 - Distribuição da presença ou ausência de complicações nos animais dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com duas semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com duas semanas
Complicações Sutura
Cola de fibrina
Túneis
Túneis e Cola
Não 4 ( 80,0) 4 ( 66,7) 6 (100,0) 6 (100,0)
Sim 1 ( 20,0) 2 ( 33,3) 0 ( 0,0) 0 ( 0,0)
Total 5 (100,0) 6 (100,0) 6 (100,0) 6 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 1,000
sutura x túneis tibiais
p = 0,455
sutura x túneis e cola
p = 0,455
cola de fibrina x túneis tibiais
p = 0,455
cola de fibrina x túneis e cola
p = 0,455
Teste exato de Fisher
túneis tibiais x túneis e cola
p = 1,000
39
4.2 Observação de quatro semanas
4.2.1 Avaliação da variação ponderal (gramas) com quatro semanas de observação.
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação à média de peso dos animais no início e
ao final de quatro semanas de observação (p=0,865 no início e p=0,845 no final). [Tabela 8 e
Gráfico5].
4.2.2 Avaliação da variação do tamanho do menisco (cm) com quatros semanas de
observação.
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho do menisco pré-transplante
e com quatro semanas de observação (p=0,542 no pré-transplante e p=0,762 na eutanásia)
[Tabela 9 e Gráfico 6].
4.2.3 Avaliação da fixação do menisco com quatro semanas de observação.
Na comparação entre as diferentes técnicas operatórias em relação à capacidade de
fixação do menisco, foram encontrados os seguintes resultados:
• Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos sutura (Figura 25) e cola
de fibrina (p=0,015) (Figura 26), onde no grupo sutura 16,7% dos meniscos apresentou
fixação parcial e no grupo cola de fibrina essa proporção foi significantemente maior, com
100% dos casos (Tabela 10; Gráfico 7);
• Não houve diferença estatisticamente significante entre os demais grupos (p>0,05 em
todas as comparações).
A correção de Bonferroni para as comparações múltiplas (somente valores de p
menores do que 0,008 que seriam estatisticamente significantes) não foi efetuada, pois a
comparação entre os grupos mostrou diferença significante (p>0,008).
40
Tabela 8 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo da evolução ponderal (gramas) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de quatro semanas de observação.
Peso (g)
Inicial Final Técnica de fixação –
observação com quatro
semanas Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Sutura
(n = 6)
2836,7 ± 299,9
2770
2570 / 3330
3142,5 ± 496,7
3100
2585 / 3990
Cola de fibrina
(n = 5)
2924,0 ± 465,8
2770
2560 / 3700
3067,0 ± 567,6
2995
2580 / 4000
Túneis tibiais
(n = 5)
3044,0 ± 351,0
2960
2560 / 3440
3288,0 ± 486,9
3110
2760 / 3940
Túneis e cola
(n = 6)
2966,7 ± 389,0
2920
2560 / 3640
3078,3 ± 443,9
2960
2670 / 3930
Prova de
Mann-Whitney p = 0,865 p = 0,845
41
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Inicial Final
Méd
ia d
e pe
so d
os a
nim
ais
(g)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
observação em 4 semanas
Gráfico 5 – Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da evolução ponderal (gramas) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de quatro semanas de observação.
42
Tabela 9 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo do tamanho do menisco (centímetros) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de quatro semanas de observação.
Tamanho do menisco (cm)
Pré-transplante Quatro Semanas Técnica de fixação
observação com quatro
semanas Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Sutura
(n = 6)
1,02 ± 0,04
1,00
1,00 / 1,10
0,95 ± 0,05
0,95
0,90 / 1,00
Cola de fibrina
(n = 5)
1,06 ± 0,15
1,00
0,90 / 1,30
0,96 ± 0,11
1,00
0,80 / 1,10
Túneis
(n = 5)
1,00 ± 0,00
1,00
1,00 / 1,00
0,94 ± 0,09
1,00
0,80 / 1,00
Túneis e cola
(n = 6)
0,98 ± 0,04
1,00
0,90 / 1,00
0,98 ± 0,04
1,00
0,90 / 1,00
Prova de
Mann-Whitney p = 0,542 p = 0,762
43
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Inicial FinalMéd
ia d
e ta
man
ho d
o m
esni
co d
os a
nim
ais
(cm
)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
observação em 4 semanas
Gráfico 6 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) do tamanho do menisco (centímetros)
entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de quatro semanas de observação.
44
Tabela 10 - Distribuição do número e porcentagem de fixação parcial ou total dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias, ao final de quatro semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com quatro semanas
Fixação do
menisco Sutura
Cola biológica Túneis Túneis e Cola
Parcial
1 ( 16,7) 5 (100,0) 3 ( 60,0) 5 ( 83,3)
Total
5 ( 83,3) 0 ( 0,0) 2 ( 40,0) 1 ( 16,7)
Soma
6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0) 6 (100,0)
sutura x cola biológica
p = 0,015
sutura x túneis
p = 0,242
sutura x túneis e cola
p = 0,081
cola biológica x túneis
p = 0,444
cola biológica x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 0,546
45
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Porc
enta
gem
de
anim
ais
(%)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
Observação em 4 semanas
Fixação Parcial Fixação Total a Gr
* p < 0,05, sutura x cola de fibrin
áfico 7 - Distribuição da porcentagem de fixação parcial ou total dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias, ao final de quatro semanas de observação.
46
B
F
A
Figura 25 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de umanimal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de sutura, com quatro semanas de observação.
B
Aigura 26 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com quatro semanas de observação. Verificar à direita o corno posterior do menisco medial descolado do platô tibial.
47
A
Figura 27 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) danimal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de túneis tibiais de fibrina, com quatro semanas de observação. Verificar a membrana sinovial sobre o anterior e corpo do menisco (setas horizontais).
Figura 28 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, cquatro semanas de observação. Verificar a ausência do corno anterior e do corpo do meni(setas horizontais).
B
e ume cola corno
B A um om sco
48
4.2.4 Avaliação da repopularização celular do menisco transplantado com quatro semanas de observação.
Na avaliação da repopularização celular, foi encontrada diferença estatisticamente
significante entre as técnicas operatórias de fixação (p=0,003). Os testes de comparações
múltiplas de Dunn com correção de Bonferroni mostraram que os grupos sutura (Figura: 29) e
túneis tibiais (Figura: 32), com as maiores porcentagens de repopularização e semelhantes entre
si, se diferenciaram significantemente dos grupos cola de fibrina (Figura: 30) e túneis tibiais
com cola de fibrina (Figura: 31) que apresentaram as menores porcentagens e foram
semelhantes (Tabela 11; Gráfico 8).
Tabela 11 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo das porcentagens de células que repopularizaram o menisco transplantado, com quatro semanas de observação.
Repopularização celular (%)
Técnica de fixação – observação quatro
semanas Média
Dp
Mediana
Mínimo
Máximo
Sutura (n = 6)
44,9 8,3 44,9 33 56
Túneis (n=5)
35,2 6,4 21,8 11 28
Túneis e cola (n=6)
23,0 9,0 33,9 26 47
Cola de fibrina (n = 5)
20,2 4,3 22,3 19 28
Prova de Kruskal-Wallis: p = 0,003 *
49
Observação em 4 semanas
0
10
20
30
40
50
60
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e ColaMéd
ia (+
/- 1
dp) d
a re
popu
lariz
ação
cel
ular
(%)
* p < 0,05 quando comparadoaos grupos Sutura e Túneis
Gráfico 8 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das porcentagens de células que
repopularizaram o menisco transplantado, com quatro semanas de observação.
50
Figura 29 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de sutura, com quatro semanas de observação. Verificar a quantidade significativa de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) desde a periferia do enxerto até o seu terço proximal (setas) (HE-10X).
Figura 30 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com quatro semanas de observação. Verificar a escassa quantidade de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) restrita à periferia do enxerto (setas) (HE-10X).
51
Figura 31 Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória túneis tibiais e cola de fibrina, com quatro semanas de observação. Verificar a quantidade pequena de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) restrita à periferia do enxerto (setas) (HE-10X).
Figura 32 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com quatro semanas de observação. Verificar a quantidade significativa de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) em direção à parte central do enxerto (setas) (HE-4X).
52
4.2.5 Reação imunológica
Nenhum dos quatro grupos de método de fixação apresentou reação imunológica.
4.2.6 Infiltrado inflamatório
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
infiltrado inflamatório, não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os
grupos (p>0,05 em todas as comparações).
Tabela 12 - Distribuição da presença ou ausência de infiltrado inflamatório nos animais dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com quatro semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com quatro semanas
Infiltrado inflamatório
Sutura Cola de fibrina Túneis Túneis e Cola
Não
6 (100,0) 3 ( 60,0) 4 ( 80,0) 3 ( 50,0)
Sim
0 ( 0,0) 2 ( 40,0) 1 ( 20,0) 3 ( 50,0)
Total
6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0) 6 (100,0)
sutura x de fibrina
p = 0,182
sutura x túneis
p = 0,455
sutura x túneis e cola
p = 0,182
cola de fibrina x túneis
p = 1,000
cola de fibrina x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 0,546
53
4.2.7 Edema
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
edema, foram encontrados os seguintes resultados:
foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos sutura e cola de
fibrina (p=0,015), onde no grupo sutura 16,7% dos meniscos apresentaram edema e no
grupo cola biológica essa proporção foi significantemente maior, com 100% dos casos
(Tabela 13);
•
•
•
foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos sutura e túneis e
cola (p=0,015), onde no grupo sutura 16,7% dos meniscos apresentaram edema e no
grupo túneis e cola essa proporção foi significantemente maior, com 100% dos casos
(Tabela 13);
não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os demais grupos
(p>0,05 em todas as comparações).
Fazendo a correção de Bonferroni para as comparações múltiplas, somente valores de
p menores do que 0,008 seriam estatisticamente significantes, e dessa forma nenhuma
comparação entre os grupos mostrou diferença significante (p>0,008).
54
Tabela 13 - Distribuição da presença ou ausência de edema nos animais dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com quatro semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com quatro semanas
Edema
Sutura
Cola biológica Túneis Túneis e Cola
Não
5 ( 83,3) 0 ( 0,0) 1 ( 20,0) 0 ( 0,0)
Sim
1 ( 16,7) 5 (100,0) 4 ( 80,0) 6 (100,0)
Total
6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0) 6 (100,0)
sutura x cola biológica
p = 0,015
sutura x túneis
p = 0,080
sutura x túneis e cola
p = 0,015
cola biológica x túneis
p = 1,000
cola biológica x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 0,455
55
4.2.8 Complicações
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
complicações, não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos
(p>0,05 em todas as comparações).
No grupo túneis tibiais e cola de fibrina foi encontrado um caso de secreção caseosa.
Tabela 14 - Distribuição da presença ou ausência de complicações nos animais dos grupos
submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com quatro semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com quatro semanas Complicações
Sutura
Cola de fibrina
Túneis Túneis e Cola
Não
6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0) 5 ( 83,3)
Sim
0 ( 0,0) 0 ( 0,0) 0 ( 0,0) 1 ( 16,7)
Total
6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0) 6 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 1,000
sutura x túneis
p = 1,000
sutura x túneis e cola
p = 1,000
cola de fibrina x túneis
p = 1,000
cola de fibrina x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 1,000
56
4.3 Observação de oito semanas
4.3.1 Avaliação da variação ponderal (gramas) com oito semanas de observação.
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final
de oito semanas de observação (p=0,239 no início e p=0,758 no final) [Tabela 15 e Gráfico
9].
4.3.2 Avaliação da variação do tamanho do menisco (cm) com oito semanas de
observação.
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos com as
diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho do menisco pré-transplante
e com oito semanas de observação (p=0,106 no pré-transplante e p=0,733 na eutanásia).
[Tabela 16 e Gráfico 10].
4.3.3 Avaliação da fixação do menisco com oito semanas de observação.
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à fixação do
menisco, foram encontrados os seguintes resultados:
Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos sutura (Figura 33) e cola
de fibrina (p=0,015) (Figura 34), onde no grupo sutura 20,0% dos meniscos
apresentaram fixação parcial e no grupo cola de fibrina essa proporção foi
significantemente maior, com 100% dos casos (Tabela 17;Gráfico 11);
•
•
•
Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos sutura e túneis tibiais e
cola de fibrina (Figura 35) (p=0,048), onde no grupo sutura 20,0% dos meniscos
apresentaram fixação parcial enquanto que no grupo túneis tibiais e cola de fibrina
essa proporção foi significantemente maior, com 100% dos casos com fixação parcial
(Tabela 17;Gráfico 11);
Não houve diferença estatisticamente significante entre os demais grupos (p>0,05 em
todas as comparações).
A correção de Bonferroni para as comparações múltiplas (somente valores de p
menores do que 0,008 que seriam estatisticamente significantes) não foi efetuada, pois a
comparação entre os grupos mostrou diferença significante (p>0,008).
57
Tabela 15 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo da evolução ponderal (gramas) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de oito semanas de observação.
Peso (g)
Inicial Final Técnica de fixação –
observação com oito
semanas Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Sutura
(n = 5)
2869,0 ± 189,1
2850
2610 / 3125
3599,0 ± 262,0
3600
3300 / 4000
Cola de fibrina
(n = 6)
2992,0 ± 307,9
2925
2650 / 3452
3457,5 ± 294,8
3495
3110 / 3750
Túneis tibiais
(n = 5)
2707,0 ± 162,0
2740
2551 / 2940
3404,6 ± 216,0
3450
3123 / 3650
Túneis e cola
(n = 5)
2760,0 ± 276,7
2640
2500 / 3110
3518,8 ± 268,4
3450
3220 / 3840
Prova de
Mann-Whitney p = 0,239 p = 0,758
58
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Inicial Final
Méd
ia d
e pe
so d
os a
nim
ais
(g)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
observação em 8 semanas
Gráfico 9 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da evolução ponderal (gramas)
entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao peso dos animais no início e ao final de oito semanas de observação.
59
Tabela 16 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) das médias, mediana e valores máximo e mínimo do tamanho do menisco (centímetros) entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de oito semanas de observação.
Tamanho do menisco (cm)
Pré-transplante Eutanásia Técnica de fixação
observação em oito semanas Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Média ± d.p.
Mediana
Min./ Máx.
Sutura
(n = 5)
1,06 ± 0,09
1,00
1,00 / 1,20
1,00 ± 0,00
1,00
1,00 / 1,00
Cola de fibrina
(n = 6)
1,08 ± 0,08
1,10
1,00 / 1,20
1,00 ± 0,00
1,00
1,00 / 1,00
Túneis
(n = 5)
0,98 ± 0,04
1,00
0,90 / 1,00
0,96 ± 0,09
1,00
0,80 / 1,00
Túneis e cola
(n = 5)
1,12 ± 0,13
1,10
1,00 / 1,30
0,98 ± 0,08
1,00
0,90 / 1,10
Prova de Mann-Whitney
p = 0,106 p = 0,733
60
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Inicial FinalMéd
ia d
e ta
man
ho d
o m
esni
co d
os a
nim
ais
(cm
)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
observação em 8 semanas
Gráfico 10 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) do tamanho do menisco (centímetros)
entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias de fixação, em relação ao tamanho no início e ao final de oito semanas de observação.
61
Tabela 17 - Distribuição do número e porcentagem de fixação parcial ou total dos meniscos entre os grupos com as diferentes técnicas operatórias, ao final de oito semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com oito semanas
Fixação do
Menisco Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais
Túneis e Cola
Parcial
1 ( 20,0) 6 (100,0) 2 ( 40,0) 5 (100,0)
Total
4 ( 80,0) 0 ( 0,0) 3 ( 60,0) 0 ( 0,0)
Soma
5 (100,0) 6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 0,015
sutura x túneis tibiais
p = 1,000
sutura x túneis e cola
p = 0,048
cola de fibrina x túneis tibiais
p = 0,061
cola de fibrina x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 0,167
62
0102030405060708090
100
Porc
enta
gem
de
anim
ais
(%)
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
Observação em 8 semanas
Fixação Parcial Fixação Total
* p < 0,05, quando comparado ao grupo Sutura
Gráfico 11 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) entre os diferentes métodos de
fixação em relação à fixação do menisco, ao final de oito semanas de observação.
63
Figura 33 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de sutura, com oito semanas de observação (seta amarela mostrando fio de sutura).
A B
A
Figura 34 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com oito semanas de observação.
B
64
B A
Figura 35 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de túneis tibiais e cola de fibrina, com oito semanas de observação. Verificar a soltura do corpo e corno posterior do menisco transplantado.
A B
Figura 36 - (A) Foto representativa do joelho de um animal do grupo controle à esquerda e (B) de um animal do grupo transplantado à direita, fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com oito semanas de observação. Verificar à direita a presença da membrana sinovial adjacente ao menisco transplantado (setas horizontais).
65
4.3.4 Avaliação da repopularização celular do menisco transplantado com oito
semanas de observação.
Na avaliação da repopularização celular, foi encontrada diferença estatisticamente
significante entre os grupos (p=0,001). Os testes de comparações múltiplas de Dunn com
correção de Bonferroni mostraram que o grupo sutura (Figura 37), com as maiores
porcentagens de repopularização, se diferenciou significantemente dos grupos cola de fibrina
(Figura 38), túneis tibiais (Figura 40) e túneis tibiais com cola de fibrina (Figura 39), que
apresentaram as menores porcentagens e foram semelhantes entre si (Tabela 18; Gráfico 12).
Tabela 18 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da repopularização
celular do menisco entre as diferentes técnicas operatórias de fixação, ao final de oito semanas de observação.
Repopularização celular (%)
Técnica de fixação – observação oito semanas
Média
Dp
Mediana
Mínimo
Máximo
Sutura (n = 5)
76,9 6,6 75,3 70 86
Túneis (n = 5)
40,2 5,0 28,3 18 32
Túneis e cola (n = 5)
35,5 6,1 38,9 34 50
Cola de fibrina (n = 6)
27,2 3,6 35,9 31 40
Prova de Kruskal-Wallis: p = 0,001 *
66
Observação em 8 semanas
0102030405060708090
100
Sutura Cola de fibrina Túneis tibiais Túneis e Cola
Méd
ia (+
/- 1
dp) d
a re
popu
lariz
ação
cel
ular
(%)
* p < 0,05 quando comparadoao grupo Sutura
Gráfico 12 - Distribuição das médias e da variabilidade (desvio padrão) da repopularização celular do
menisco entre as diferentes técnicas operatórias, ao final de oito semanas de observação.
67
Figura 37 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de sutura, com oito semanas de observação. Verificar a grande quantidade de células invadindo a matriz amorfa (colágeno) desde a periferia até a região central do enxerto (HE-4X).
Figura 38 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de cola de fibrina, com oito semanas de observação. Verificar a pequena quantidade de células apenas na periferia do enxerto (seta) (HE-4X).
68
Figura 39 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela
técnica operatória de túneis tibiais e cola de fibrina, com oito semanas de observação. Verificar a pequena quantidade de células apenas na periferia do enxerto (setas) (HE-4X).
Figura 40 - Fotomicrografia representativa da repopularização celular no grupo fixado pela técnica operatória de túneis tibiais, com oito semanas de observação. Verificar a pequena quantidade de células apenas na periferia (seta curta) do enxerto migrando em direção central (seta longa) (HE-10X).
69
4.3.5 Reação imunológica
Nenhum dos quatro grupos de método de fixação apresentou reação imunológica.
4.3.6 Infiltrado inflamatório
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
infiltrado inflamatório, não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os
grupos (p>0,05 em todas as comparações).
Tabela 19 - Distribuição da presença ou ausência de infiltrado inflamatório nos animais dos
grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com oito semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com oito semanas
Infiltrado
inflamatório
Sutura
Cola biológica Túneis Túneis e Cola
Não
5 (100,0) 4 ( 66,7) 4 ( 80,0) 3 ( 60,0)
Sim
0 ( 0,0) 2 ( 33,3) 1 ( 20,0) 2 ( 40,0)
Total
5 (100,0) 6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 0,455
sutura x túneis
p = 1,000
sutura x túneis e cola
p = 0,444
cola de fibrina x túneis
p = 1,000
cola de fibrina x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 1,000
70
4.3.7 Edema
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
edema, não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos (p>0,05 em
todas as comparações).
Tabela 20 - Distribuição da presença ou ausência de edema nos animais dos grupos
submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com oito semanas de observação.
Técnica de fixação – Observação com oito semanas Edema
Sutura
Cola biológica Túneis Túneis e Cola
Não
3 ( 60,0) 0 ( 0,0) 0 ( 0,0) 2 ( 40,0)
Sim
2 ( 40,0) 6 (100,0) 5 (100,0) 3 ( 60,0)
Total
5 (100,0) 6 (100,0) 6 (100,0) 5 (100,0)
sutura x cola biológica
p = 0,061
sutura x túneis
p = 0,167
sutura x túneis e cola
p = 1,000
cola de fibrina x túneis
p = 1,000
cola de fibrina x túneis e cola
p = 0,182
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 0,444
71
4.3.8 Complicações
Nas comparações entre os diferentes métodos de fixação em relação à presença de
complicações não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos (p >
0,05 em todas as comparações).
Tabela 21 - Distribuição da presença ou ausência de complicações nos animais dos grupos submetidos a diferentes técnicas de fixação do menisco transplantado, com oito semanas de observação.
Método de fixação – observação em oito semanas
Complicações
Sutura
Cola de fibrina Túneis Túneis e Cola
Não
5 (100,0) 6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0)
Sim
0 ( 0,0) 0 ( 0,0) 0 ( 0,0) 0 ( 0,0)
Total
5 (100,0) 6 (100,0) 5 (100,0) 5 (100,0)
sutura x cola de fibrina
p = 1,000
sutura x túneis
p = 1,000
sutura x túneis e cola
p = 1,000
cola de fibrina x túneis
p = 1,000
cola de fibrina x túneis e cola
p = 1,000
Teste exato de Fisher
túneis x túneis e cola
p = 1,000
72
4.3.9 Radiografias
4.3.9.1 Medida de exclusão
Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos A, B e C
quanto à média dos ângulos (p=0,746). Desta forma, todos os animais selecionados para a
pesquisa foram aproveitados.
Tabela 22 - Distribuição das médias, da variabilidade (desvio padrão), mediana, mínimo e máximo dos ângulos dos joelhos medidos a partir das radiografias, para critérios de exclusão de ângulos anômalos.
Grupo
n
Média
dp
Mediana
Mínimo
Máximo
A
24 4,47 0,38 4,45 3,8 5,0
B
24 4,38 0,45 4,25 3,8 5,1
C
24 4,44 0,41 4,45 3,8 5,1
73
4.4 Resultados comparativos
Para obter-se uma visão de conjunto dos resultados referentes à fixação (Gráficos 13 e
14) e repopularização celular (Gráfico 15), os dados foram agrupados em gráficos únicos.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Porc
enta
gem
da
Fixa
ção
Parc
ial (
%)
Sutura Cola de Fibrina Túneis Tibiais Túneis e Cola
Fixação Parcial do Transplante de Menisco
2 Semanas4 Semanas8 Semanas
Gráfico 13 – Apresentação gráfica comparativa das técnicas operatórias usadas em relação à fixação parcial
do menisco transplantado, nos três tempos de observação.
74
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Por
cent
agem
da
Fixa
ção
Tota
l (%
)
Sutura Cola de Fibrina Túneis Tibiais Túneis e Cola
Fixação Total do Transplante de Menisco
2 Semanas4 Semanas8 Semanas
Gráfico 14 - Apresentação gráfica comparativa das técnicas operatórias usadas em relação à fixação total do
menisco transplantado, nos três tempos de observação.
75
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Por
cent
agem
da
Rep
opul
ariz
ação
(%)
Sutura Cola de Fibrina Túneis Tibiais Túneis e Cola
Repopularização Celular do Menisco Transplantado
2 Semanas4 Semanas8 Semanas
Gráfico 15 - Apresentação gráfica comparativa das técnicas operatórias usadas em relação à repopularização
celular do menisco transplantado, nos três tempos de observação.
5. DISCUSSÃO
Durante anos, pouca ou nenhuma importância foi dada aos meniscos. Atualmente os
meniscos são reconhecidos como estruturas de fundamental importância para a função normal
da articulação do joelho. Colaboram decisivamente na estabilidade, na absorção de impactos,
na manutenção e lubrificação da superfície articular36-53.
Independente de sua origem, de seu mecanismo de produção e de sua extensão, as
lesões de meniscos são tratadas preferencialmente procurando-se restabelecer a sua
integridade anatômica e funcional. A sua retirada parcial ou total, nos casos em que se torna
inviável a sua restauração, está associada a processos degenerativos da articulação, que
fatalmente resultarão em graus variáveis de comprometimento articular. Desta forma, a
procura de um substituto para este tecido fibrocartilaginoso permanece como um desafio para
a cirurgia ortopédica15,16,17,38,54-57.
A literatura biomédica refere mais comumente, três tipos de substitutos para os
meniscos: enxertos autólogos, homólogos e artificiais7,25.
Os enxertos autólogos, provenientes do próprio indivíduo, possuem um apelo
importante a favor de sua utilização, que seria a ausência do risco de transmissão de
doenças7,8. É relatada na literatura pertinente, a utilização de segmento de tecidos obtidos da
gordura pré-patelar, do ligamento da patela, do tendão do músculo quadríceps da coxa, entre
outros. Os resultados devido à variedade de situações empregadas, não são uniformes e por
vezes são conflitantes. A necessidade de intervenções associadas para obtenção do tecido
doador e a dificuldade em obter-se tecido suficiente e resistente para uma substituição
adequada são fatores limitantes para o uso corrente destes substitutos autólogos58-63.
Uma opção oferecida pela tecnologia seria a utilização de materiais sintéticos para a
substituição do menisco lesado6. Dentre os materiais sintéticos, as próteses de dacron e de
teflon são as mais comumente citadas na literatura6,64,65. Os resultados a médio e longo prazo
não se mostram favoráveis, e o fenômeno de osteoartrose acompanha com freqüência estas
substituições protéticas6,64-67.
Frente aos estudos realizados e resultados obtidos com os enxertos autólogos e as
próteses de menisco, o grande alvo das pesquisas tem sido os enxertos homólogos. Estas
opções biológicas apresentam remodelação, tanto nos estudos experimentais como nos
77
achados clínicos e mantêm as propriedades biomecânicas do menisco original7,8,24,68,69. A
substituição por tecido homólogo, no caso a fibrocartilagem de menisco obtido de doador
morto (no beating donor) ou de doador múltiplo não morto (beating donor), apresenta como
vantagem a possibilidade de utilizar um tecido semelhante em sua morfologia ao tecido que
está sendo substituído. As desvantagens estão na possibilidade do enxerto ser transmissor de
doenças infecto-contagiosas e nos eventuais processos de imuno-rejeição tecidual3,5,8,70.
O papel da resposta imune ao enxerto homólogo não está esclarecido, mas no geral,
não há evidências de rejeição67-69. A experiência clínica mostra que a rejeição é realmente um
fato extremamente raro, ocorrendo somente um relato na literatura21. A baixa taxa de rejeição
estudada em animais de experimentação, é atribuída à matriz densa na qual estão envolvidas
as células do menisco, não permitindo o acesso de células imunorreativas7,15,17,19,71-74. Porém
estes resultados estão diretamente ligados à maneira na qual os meniscos, após serem
retirados de seu doador, são armazenados8.
A liofilização e a criopreservação foram processos de armazenamento idealizados na
tentativa de contornar os óbices da transmissão de doenças.
A liofilização ou congelamento a seco implica em um processo padronizado, no qual o
congelamento ocorre em uma câmara de vácuo com retirada de até 95% do conteúdo de água
do tecido7,8. Embora permita a estocagem por um período de três a cinco anos e a
rehidratação possa ser conseguida em trinta minutos antes do uso, ocorrem alterações de cor,
aparência, assim como de estrutura, propriedade e integridade do colágeno, resultando num
enfraquecimento do enxerto. Há referência de que ocorre um encurtamento de até 2/3 na
extensão do menisco após o transplante5. A estas alterações acrescente-se o fato que ocorre a
completa inviabilidade celular no enxerto. Embora consiga obter uma matriz
fibrocartilaginosa praticamente isenta de microrganismos patogênicos, o processo de
liofilização acaba por alterar a constituição físico-química do futuro enxerto, que ressecado e
retraído não cumpre satisfatoriamente as funções de um substituto adequado1,3,5,7.
Criopreservação é um processo de congelamento controlado com extração da água
celular pelo dimetilsulfóxido e glicerol. É um processo trabalhoso e de custo muito elevado, e
não há evidências de superioridade em relação a outros métodos de preservação. A vantagem
teórica da criopreservação é a manutenção da integridade e viabilidade da membrana celular,
estimando que permaneçam entre 30 a 40% de células viáveis7,8,22,75-84.
78
O ideal seria utilizar um tecido que mantivesse suas características físico-químicas e
fosse isento de agentes patogênicos. Concomitantemente, seria necessário que este material
pudesse ser preparado e estocado por um tempo razoável até o momento de sua aplicação. O
banco de meniscos já é uma realidade79. No entanto, ainda não há na literatura biomédica um
embasamento suficiente para se estabelecer qual o método de preservação mais adequado
para um enxerto homólogo de menisco. Os trabalhos que tratam do transplante de meniscos
fazem referências pouco aprofundadas aos processos de preservação1,7,8,16,22,23,25,27,38,72,73.
Baseados em modelos de preservação de outros tecidos osteomusculares ou
osteocartilaginosos, são referidos que os meniscos podem ser preservados em temperaturas
ditas de congelamento1,7,8,15,16,80-84.
O congelamento profundo, também referido como de ultracongelamento, implica em
armazenamento e congelamento do tecido em temperaturas negativas a partir de 70ºCelsius. É
um método simples e o mais amplamente utilizado para a preservação de meniscos. As
vantagens incluem um processo menos custoso e, apesar da conjectura teórica a respeito da
extensa ou quase total morte celular, tem mostrado resultado clínico adequado. Há autores
que afirmam que todas as células são destruídas na matriz conjuntiva, mas que não são
notados efeitos clínicos deletérios causados pela relativa acelularidade do tecido meniscal. O
tempo médio de estocagem é referido como sendo entre quatro e oito semanas7,8,16,20.
A escolha do tipo de congelamento é fundamental no que tange à necessidade de que o
processo seja de baixo custo e disponível em situações que não exijam recursos tecnológicos
sofisticados. Dentro da linha de pesquisa, Reckers et al22 demonstraram que a celularidade de
meniscos de coelhos preservados por congelamento nas temperaturas -7,2ºC, -21,4ºC e -73ºC,
apresentam ao final de 30 dias de congelamento 30% de células viáveis. Assim, na
continuidade do estudo optou-se pela escolha do ultracongelamento que tem resultados
semelhantes às outras duas temperaturas pesquisadas e também tem o respaldo de ser a mais
comumente citada na literatura.
Outro aspecto referido na literatura diz respeito à repopularização celular do menisco
transplantado. Uma vez que as células do doador são poucas ou ausentes, a integridade do
enxerto dependeria da infiltração celular na matriz por células do hospedeiro, que de certa
forma permitiria uma segurança maior na reabilitação deste menisco em seu receptor. Há
referências que de um a seis meses após a enxertia, ocorre a repopularização do menisco por
células do hospedeiro7,19 . Após o estudo de Arnoczky (1992) não se encontrou outro trabalho
79
sistematizado estudando a quantificação das células que preenchem o menisco do receptor,
em períodos diferentes de observação19.
Considerando que a conservação da estrutura matricial do menisco está relacionada
com o processo de preservação, e este também está relacionado com a quantidade de células
viáveis remanescentes nesta matriz, o estudo destas relações é relevante para tentar-se
padronizar métodos confiáveis de preservação de meniscos para transplantes. Nos trabalhos
ditos clínicos, utilizando seres humanos, as variáveis são de difícil controle para
homogeneização da amostra, assim os trabalhos com animal de experimentação ganham
importância para esta linha de pesquisa.
Por outro lado, o procedimento operatório de fixação de meniscos transplantados
também é um ponto de controvérsia. Uma variedade de técnicas operatórias para a fixação
deste menisco tem sido descritas2-5,7,8,15,16,20,24,25.
A fixação do menisco pela sutura, ao longo de sua extensão, ao platô tibial e ao tecido
conectivo adjacente7,15,20,38, assim como a técnica de fixação com a realização de túneis
tibiais, com e sem associação de blocos ósseos, são técnicas operatórias de citação freqüente
na literatura pertinente75,85-88.
Milachowski et al (1989) publicaram a primeira série de transplantes de meniscos
realizados em 22 pacientes15. Os autores utilizaram como método de fixação a sutura simples
em intervalos de cinco milímetros em toda extensão do menisco. Com seguimento médio de
13 meses, apenas dois pacientes apresentavam insatisfação com o resultado cirúrgico, um
devido à infecção pós-operatória e outro devido à instabilidade residual do ligamento cruzado
anterior.
Shelton et al (1994) descreveram uma nova técnica operatória para transplante de
menisco, que difere das demais pela utilização do enxerto não isoladamente, mas
conjuntamente com blocos ósseos88. Segundo os autores, a fixação precária ou inadequada do
transplante é fato determinante para a não integração do enxerto. Yoldas et al (2003)
relataram os resultados de 34 transplantes de meniscos em 31 pacientes com seguimento
médio de três anos, utilizando-se blocos ósseos75. No seguimento final dos resultados, 96%
dos pacientes apresentavam satisfação com o resultado. Entretanto, os autores ressaltam o
pequeno tempo de acompanhamento. Graf Jr et al (2004) relataram os resultados de oito
pacientes submetidos ao transplante meniscal com fixação na tíbia utilizando-se blocos ósseos
81. Ao final do acompanhamento de oito anos, 87% dos pacientes retornaram as suas
80
atividades esportivas recreacionais. Verdonk et al (2006) publicaram sua série de 42 casos de
transplante de menisco com um seguimento longo de 14 anos, com a técnica operatória de
sutura simples em intervalos de cinco milímetros em toda extensão do menisco, sem
utilização de blocos ósseos38. Ao final do seguimento, 90% dos pacientes relataram satisfação
com o resultado, afirmando que se necessário, submeter-se-iam novamente ao procedimento.
Já a utilização de adesivos cirúrgicos para a fixação do menisco a ser transplantado é
pouco citada na literatura24,33. Nabeshima et al (1995) realizaram transplante de menisco
profundamente congelado em cães, por meio do procedimento de sutura ou com o uso de cola
de fibrina. Não foi encontrada nenhuma célula no menisco transplantado após a primeira
semana. Na segunda semana, notou-se a presença de células na superfície tibial e femoral do
menisco. No primeiro mês, as células foram observadas por toda a periferia tibial e femoral,
enquanto que no terceiro mês, já havia uma distribuição mais homogênea, permanecendo
acelular apenas o centro do menisco. Concluíram não haver diferenças estatisticamente
significantes entre os dois grupos, após doze semanas de transplante33. Reckers et al (2006)
realizaram transplante autólogo e homólogo de menisco ultracongelado em coelhos,
utilizando adesivo sintético como método de fixação24. Os autores concluíram que os
adesivos cirúrgicos sintéticos, derivados do ácido cianoacrilato, provocaram necrose desde a
cortical até a medular óssea para ambos os grupos, não apresentando fixação do menisco
transplantado.
Deste modo, também em relação ao procedimento operatório de fixação do menisco
transplantado, não há um consenso ou padronização na literatura. Aqui também se procura
estabelecer a relação entre a técnica empregada e a repopularização celular do enxerto,
relacionando-a com o sucesso do transplante. Novamente os ensaios em animal de
experimentação podem ser relevantes no encaminhamento da resolução deste problema, pela
possibilidade de usar uma amostra homogênea e comparativa entre os procedimentos.
No tocante à escolha do animal, seguiu-se a tendência da literatura, na qual o coelho é
tido como adequado. Apresenta um padrão histológico de menisco muito semelhante ao
encontrado em seres humanos, caracterizado por um tecido fibrocartilaginoso composto por
um entrelaçado de fibras colágenas interpostas por fibrocondrócitos6,7,20,22-25,35,36,89-91.
Ressalte-se que os coelhos são animais de fácil obtenção, baixo custo de manutenção e por
serem de médio porte, facilitam o alojamento. Entretanto, alguns autores que estudaram os
81
transplantes de menisco, optaram por espécimes de porte maior, como cães17,19,58,92,
ovelhas28,59,93 ou cabras8,72.
Se por um lado o coelho traz as facilidades mencionadas, por outro, o fato de ter que
reimplantar um menisco com comprimento médio de um centímetro por meio centímetro de
largura, em uma superfície de proporções semelhantes, implica em maiores dificuldades
técnicas, tornando o procedimento mais prolongado e exigindo delicadeza no manuseio,
porém sem inviabilizá-lo. Entretanto, diante da dificuldade em se conseguir animais de maior
porte, e o número reduzido de alojamentos disponíveis para esses animais de grande porte em
nosso biotério, optou-se pela utilização do coelho.
Na pesquisa realizada, em virtude do tamanho da amostra, trabalhou-se sempre com
vinte e quatro animais no biotério. A randomização da técnica operatória e do período de
observação ocorreu imediatamente após a medicação pré-anestésica. Os procedimentos
anestésicos foram aqueles já padronizados no Laboratório Experimental do Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia e Experimentação, e como todos os demais procedimentos
experimentais, foram avaliados e aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa da
UNIFESP-EPM.
Escolheu-se a retirada do menisco medial do joelho direito dos coelhos na primeira
fase, mantendo-se a temperatura de 73ºCelsius negativos por 30 dias. Após esse período, com
as feridas cirúrgicas completamente cicatrizadas, os meniscos foram reimplantados em
animais diferentes (segunda fase). Dessa maneira procurou-se reproduzir e simular as
condições em que o enxerto homólogo é realizado em seres humanos.
Um dos pontos importantes na técnica operatória realizada em seres humanos para o
sucesso do procedimento, é a fixação estável dos enxertos. Os meniscos podem vir
acompanhados de pequenos fragmentos ósseos, que são encaixados nos túneis tibiais,
conferindo uma fixação osso-osso, e uma boa estabilidade ao enxerto. Quando os meniscos
são retirados sem esses fragmentos, suturas podem ser realizadas na periferia do menisco
através de toda sua extensão, por onde é feita a fixação94-97.
Na pesquisa em foco, os meniscos foram fixados através de quatro técnicas
operatórias, tentando-se desta forma, estabelecer uma adequada fixação e conseqüentemente
uma melhor repopularização celular no seu receptor.
A primeira série de resultados publicados na literatura mundial sobre transplante de
menisco foi realizada com a técnica sutura15. Devido ao seu pioneirismo, a sua fácil
82
aplicabilidade e ao relato da literatura de resultados satisfatórios, foi uma opção a ser
pesquisada.
Mesmo diante da maior dificuldade operatória, a técnica túneis tibiais com fragmento
ósseo é amplamente utilizada75,85-88. No entanto, pelo fato de o coelho ser um animal de
pequeno porte, a técnica de túneis tibiais foi realizada sem o uso de fragmentos ósseos.
A cola de fibrina é amplamente utilizada em vários procedimentos operatórios em
diversas situações29-34. Pela sua disponibilidade, facilidade de aplicação, ausência de rejeição
ou reações imunológicas e a capacidade em potencial de manter uma estrutura como o
menisco em posição estável, foi escolhida como uma opção de fixação, usando de forma
isolada ou como adjuvante em associação com a técnica de túneis tibiais.
A avaliação da eficácia das técnicas quanto à capacidade de manter o menisco em
posição e integrado ao seu sítio, foi estabelecida para ser observada com duas, quatro e oito
semanas, tempos considerados básicos para acompanhar o processo de cicatrização e
regressão do processo inflamatório após o transplante.
Com duas semanas de transplante, foi encontrada uma diferença estatisticamente
significante entre os grupos sutura (Figura 17) e cola de fibrina (p=0,015) (Figura 18),
mostrando que no grupo sutura somente 20% dos meniscos estavam fixados parcialmente,
enquanto que no grupo cola de fibrina essa proporção foi significante maior, com 100% dos
meniscos fixados apenas parcialmente. Não foi encontrada diferença estatisticamente
significante entre os demais grupos, ou seja, túneis tibiais e túneis tibiais com cola de fibrina
(p>0,05) (Figuras 20 e 19). Estes resultados coincidem com os trabalhos da literatura, que
também mostram um alto índice de integração do menisco transplantado, apesar de uma
porcentagem elevada de não fixação do corno posterior8,16,18,20. Em relação à técnica que
utilizou cola de fibrina, os resultados observados no presente estudo foram conflitantes
quando comparados com os resultados de Nabeshima, que não encontrou diferenças entre as
técnicas sutura e cola de fibrina, analisando por um período de 12 semanas após o
transplante33. O autor analisou a influência do coágulo de fibrina sobre o processo de
reparação na junção menisco sinovial de meniscos transplantados em cães, utilizando a
técnica operatória sutura e cola de fibrina, ressaltando que o uso de cola de fibrina pode ser
útil com o intuito de reduzir a imobilização pós-operatória e facilitar o processo de
reabilitação em pacientes transplantados. Apesar dos resultados satisfatórios apresentados
pelos autores, não há relatos da continuidade desta linha de pesquisa.
83
O grupo sutura apresentou maiores porcentagens de repopularização com duas
semanas (30,9%) (Figura 21) e se diferenciou significantemente dos grupos cola de fibrina
(14,4%) (Figura 22) e túneis tibiais com cola de fibrina (13,8%) (Figura 23) que apresentaram
porcentagens menores e semelhantes entre si. O grupo túneis tibiais com valores
intermediários de porcentagem de repopularização, não se diferenciou de forma significante
dos demais grupos (23,2%) (Figura 24). Os resultados encontrados de repopularização celular
com a técnica sutura após duas semanas de transplante, foram semelhantes aos achados
descritos por Arnoczky et al (1992)19 com quatro semanas de transplante, que relataram 25%
de repopularização celular. A quase totalidade das células que infiltraram a matriz se limitou
à periferia do menisco com duas semanas de transplantes. Aos trinta dias, Arnoczky et al 19
relataram achados semelhantes.
Os resultados encontrados com duas semanas de transplante em relação à fixação do
menisco, seja parcial ou total, com as técnicas sutura, túneis tibias, túneis tibias com cola de
fibrina e cola de fibrina, estiveram diretamente relacionados com a porcentagem de
repopularização celular no enxerto. A fixação estável proporcionada pela técnica sutura
esteve relacionada com uma porcentagem maior de fixação total do menisco e com uma
porcentagem mais elevada de repopularização celular comparado com os outros grupos. Já os
resultados com as demais técnicas mostraram que uma menor taxa de fixação do menisco
estava associada a uma porcentagem inferior de repopularização celular, estabelecendo uma
relação direta entre a fixação do menisco e a infiltração celular do enxerto.
Com quatro semanas de transplante, houve diferença estatisticamente significante
entre os grupos sutura (Figura 25) e cola de fibrina (p=0,015) (Figura 26), onde no grupo
sutura 16,7% dos meniscos apresentou fixação parcial e no grupo cola de fibrina a ocorrência
foi de 100%. Não houve diferença estatisticamente significante entre os demais grupos
(p>0,05 em todas as comparações).
No tocante à avaliação histológica com quatro semanas de transplante, os resultados
verificados neste estudo se assemelham também aos achados de Arnoczky et al (1992)19, com
três meses de transplante. Foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os
grupos (p=0,003). Os grupos sutura (44,9%) (Figura 29) e túneis tibiais (35,2%) (Figura 32),
com as maiores porcentagens de repopularização e semelhantes entre si, se diferenciaram
significantemente dos grupos cola de fibrina (20,2%) (Figura 30) e túneis com cola de fibrina
(23%) (Figura 31) que apresentaram as menores porcentagens. Os resultados encontrados
84
com quatro semanas de transplante em relação à fixação do menisco, seja parcial ou total,
com as técnicas sutura, túneis tibias, túneis tibias com cola de fibrina e cola de fibrina,
novamente estiveram diretamente relacionados com a porcentagem de repopularização celular
no enxerto. As técnicas sutura e túneis tibias, com suas fixações estáveis de seus enxertos,
demonstraram uma maior porcentagem de repopularização celular, quando comparadas com
as técnicas que utilizaram adesivos cirúrgicos. Esses resultados encontrados em relação à
porcentagem da repopularização celular com quatro semanas de transplante de menisco
ultracongelado de coelhos, ressalta a importância da fixação estável do enxerto no futuro
receptor.
Na avaliação da fixação do menisco com oito semanas de transplante foi encontrada
diferença estatisticamente significante entre os grupos sutura (Figura 33) e cola de fibrina
(p=0,015) (Figura 34), onde no grupo sutura 20,0% dos meniscos apresentou fixação parcial e
no grupo cola de fibrina a proporção foi de 100%. Foi encontrada uma diferença
estatisticamente significante entre os grupos sutura, túneis tibiais e cola de fibrina (p=0,048)
(Figura 35), sendo que no grupo sutura 20,0% dos meniscos apresentou fixação parcial e no
grupo túneis tibiais e cola de fibrina essa proporção foi de100%.
No tocante à repopularização celular com oito semanas de transplante, nossos achados
foram também semelhantes aos encontrados por Arnoscky et al (1992), com seis meses de
transplante (75%). Foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos
(p=0,001). O grupo sutura (76,9%) (Figura 37), com as maiores porcentagens de
repopularização, se diferenciou significantemente dos grupos cola de fibrina (27,2%) (Figura
38), túneis tibiais (40,2%) (Figura 40) e túneis com cola de fibrina (35,5%) (Figura 39) que
apresentaram as menores porcentagens e foram semelhantes entre si. Os resultados
encontrados com oito semanas de transplante em relação à fixação do menisco, seja parcial ou
total, com as técnicas sutura, túneis tibias, túneis tibias com cola de fibrina e cola de fibrina,
mostraram novamente uma relação direta da fixação estável do menisco com a
repopularização celular do menisco transplantado. A técnica sutura, com oito semanas de
transplante, apresentou uma melhor fixação do menisco transplantado, quando comparada
com os demais grupos, ressaltando mais uma vez, que a fixação estável e confiável do
menisco no receptor, está associada à uma quantidade maior de células invadindo o enxerto
transplantado.
85
Estes achados de repopularização celular, com duas, quatro e oito semanas de
transplante, sugerem que a repopularização da matriz transplantada ocorre por infiltração
celular da periferia para o centro do enxerto, o que dá indícios que essas células devem ser
provenientes do receptor. Deste modo fica à esclarecer qual seria o papel das células
sobreviventes do doador nesta matriz transplantada. Abre-se a perspectiva de tentar descobrir,
por processo de identificação do DNA, o destino das células sobreviventes do doador.
Também fica em aberto para discussão, se outros métodos de preservação de meniscos
terão alguma influência na taxa de repopularização celular em condições comparativas com as
técnicas de fixação usadas nesta pesquisa, ou com outras que possam ser aventadas em outros
estudos. Ficou clara a associação de que a técnica operatória que produz uma maior fixação
do enxerto está associada a uma maior infiltração celular da matriz por prováveis células do
receptor.
No entanto, este estudo limitou-se a avaliar a repopularização celular que ocorre no
menisco transplantado, utilizando a coloração pela hematoxilina e eosina. O material já
coletado poderá ser processado e avaliado por outros métodos de coloração como Picrosirius
red ou microscopia de polarização para identificação do colágeno, além do que, métodos
imunohistoquímicos poderão ser utilizados para identificação e quantificação de elementos
constituintes da matriz inorgânica.
Uma perspectiva muito atraente também seria o estudo destes meniscos
repopularizados, na investigação das qualidades macroscópicas e fisicoquímicas, para
averiguar a sua resistência à tração, deformação e ruptura, em relação ao período e
porcentagem de células repopularizadas.
Os meniscos são estruturas de grande importância para a função normal da articulação
do joelho. A sua substituição e completa integração é certamente, uma das tarefas mais
complexas da ortopedia atual. Os achados encontrados nesta pesquisa acrescentam subsídios
para que o transplante meniscal e sua respectiva repopularização celular demonstrem as
excelentes perspectivas de recuperação para os casos de lesão do menisco humano. No
modelo experimental testado, a ocupação celular por prováveis células do receptor no
menisco transplantado já no 14º dia, abre perspectivas de um resultado promissor também em
seres humanos, assegurando maior resistência ao enxerto, e conseqüentemente permitindo
uma melhoria na qualidade de vida destes pacientes.
6. CONCLUSÕES 1.
2.
3.
O transplante homólogo do menisco de coelho preservado a 73°Celsius negativos durante
30 dias, levou à ocupação da matriz por células do receptor de modo progressivo na
segunda, quarta e oitava semanas de observação.
O transplante homólogo do menisco de coelho preservado a 73°Celsius negativos durante
30 dias, sofreu diferentes graus de integração ao platô tibial, de acordo com a técnica de
fixação, sendo mais eficaz com as técnicas operatórias de sutura, túneis tibiais, túneis
tibiais com cola de fibrina e cola de fibrina, respectivamente.
O transplante homólogo do menisco de coelho preservado a 73°Celsius negativos durante
30 dias, apresentou uma correlação direta entre o tipo de técnica de fixação e a
porcentagem de repopularização celular, sendo que a eficácia de ocupação foi
respectivamente progressiva com as técnicas operatórias de sutura, túneis tibiais, túneis
tibiais com cola de fibrina e cola de fibrina.
7. REFERÊNCIAS 1. Wirth CJ, Peters G, Milachowski KA, Weismeier KG, Kohn D. Long term results of
meniscal allograft transplantation. J Sports Med [Am]. 2002; 30(2):174-81.
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DeCS – Descritores em Ciências de Saúde. 3ª. ed. São Paulo. Bireme; 1992.
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Anatômica, [Tradução para o Português por CTA-SBA]. São Paulo, Manole, 2001, 248.
INTERNATIONAL COMMITTEE ON VETERINARY ANATOMICAL
NOMENCLATURE. NOMINA ANATOMICA VETERINÁRIA. 4 ed, ver. Zurich, 1994
(Together with Nomina Histológica, 2 ed. And Nomina embriológica veterinária).
APÊNDICE
96
PROTOCOLO DE ACOMPANHAMENTO RADIOGRÁFICO IDENTIFICAÇÃO = ANIMAL Nº GRUPO ANIMAL: Oryctolagus cuniculus SEXO: masculino
DATA DA RADIOGRAFIA:__/__/__
PRÉ-ANESTÉSICO:_________________________________ DOSE:___________________ - VIA:______ - HORA:_______ ANESTÉSICO: ___________________________________ DOSE:___________________ - VIA:______ - HORA:_______ PLANO ANESTÉSICO: HORA:_________________ DURAÇÃO DA ANESTESIA:__________________ REFORÇO:__________________________________ ANALGÉSICO:______________________________________ DOSE:__________________- VIA:_______- HORA:_________ INTERCORRÊNCIAS:___________________________________________________
97
EQUIPE RESPONSÁVEL PELO ACOMPANHAMENTO DO
EXAME RADIOGRÁFICO:
1- PESQUISADOR PRINCIPAL
2- ANESTESISTA VETERINÁRIA
3- MÉDICA VETERINÁRIA
4- ACADÊMICA DE VETERINÁRIA
5- TÉCNICOS DE RADIOLOGIA (2)
6- FUNCIONÁRIOS DA DISCIPLINA DE TÉCNICA OPERATÓRIA (2)
RADIOGRAFIA:
ACOMPANHAMENTO ANESTÉSICO PÓS-RADIGRAFIA
___________________________________________________________________________
98
Distribuição dos ângulos dos joelhos medidos a partir das radiografias, para critérios de exclusão de ângulos anômalos.
GRUPOS: A B C
4,7 4,9 4,2 4,2 5 4,3 5 4 4
3,8 4,3 4,7 4,6 5,1 4,3 4,6 4,2 4,5 4,9 4,1 4,9 4,2 4,4 4 4 4,9 4,2 4 4,8 5
4,3 4,2 3,9 4,4 4,7 3,8 4,2 4,5 4,7 4,4 4,6 4,1 4,8 3,8 4,7 4,7 3,9 3,9 4,9 3,9 5 5 4 5,1 5 5 4,8
3,9 5,1 4,9 4 3,8 3,9
4,5 3,8 4,7 4,4 4 4,5 4,9 4,2 4,4
99
Distribuição dos ângulos dos joelhos medidos a partir das radiografias, para critérios de exclusão de ângulos anômalos.
GRUPO A Ângulo Frontal
Coelho N° Varo Valgo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
4,7 4,2 5
3,8 4,6 4,6 4,9 4,2 4 4
4,3 4,4 4,2 4,4 4,8 4,7 4,9 5 5
3,9 4
4,5 4,4 4,9
100
Distribuição dos ângulos dos joelhos medidos a partir das radiografias, para critérios de exclusão de ângulos anômalos.
GRUPO B
Ângulo Frontal Coelho
N° Varo Valgo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
4,9 5 4
4,3 5,1 4,2 4,1 4,4 4,9 4,8 4,2 4,7 4,5 4,6 3,8 3,9 3,9 4 5
5,1 3,8 3,8 4
4,2
101
Distribuição dos ângulos dos joelhos medidos a partir das radiografias, para critérios de exclusão de ângulos anômalos.
GRUPO C
Ângulo Frontal Coelho
N° Varo Valgo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
4,2 4,3 4
4,7 4,3 4,5 4,9 4
4,2 5
3,9 3,8 4,7 4,1 4,7 3,9 5
5,1 4,8 4,9 3,9 4,7 4,5 4,4
PROTOCOLO DE ACOMPANHAMENTO DO ANIMAL
102
IDENTIFICAÇÃO = ANIMAL Nº GRUPO ANIMAL: Oryctolagus cuniculus SEXO: masculino
LINHAGEM: Nova Zelândia PESO:__________g
DATA DO 1º PROCEDIMENTO:__/__/__
ANESTESIA:
_____________________________________________________________________
ANTI-SEPSIA:
_____________________________________________________________________
INCISÃO:
_____________________________________________________________________
MENISCECTOMIA TOTAL
_____________________________________________________________________
DURAÇÃO DO ATO OPERATÓRIO:
_____________________________________________________________________
TAMANHO DO MENISCO:
_____________________________________________________________________
ARMAZENAMENTO:
_____________________________________________________________________
103
DATA DO 2º PROCEDIMENTO:__/__/__
ANESTESIA:
_____________________________________________________________________
ANTI-SEPSIA:
_____________________________________________________________________
RANDOMIZAÇÃO DA TÉCNICA OPERATÓRIA:
_____________________________________________________________________
RANDOMIZAÇÃO DA EUTANÁSIA:
_____________________________________________________________________
INCISÃO:
_____________________________________________________________________
DURAÇÃO DO ATO OPERATÓRIO:
_____________________________________________________________________
104
DATA DA EUTANÁSIA:__/__/__( SEMANAS)
PESO:
_____________________________________________________________________
ANESTESIA:
_____________________________________________________________________
ANTI-SEPSIA:
_____________________________________________________________________
INCISÃO:
_____________________________________________________________________
ANÁLISE MACROSCÓPICA:
_____________________________________________________________________
ANÁLISE MICROSCÓPICA:
_____________________________________________________________________
105
PROTOCOLO DA ANESTESIA (D)
IDENTIFICAÇÃO= ANIMAL Nº GRUPO
DATA:__/__/____ - PESO:________________
PRÉ-ANESTÉSICO:_________________________________ DOSE:___________________ - VIA:______ - HORA:_______ ANESTÉSICO:______________________________________ DOSE:___________________ - VIA:______ - HORA:_______ PLANO ANESTÉSICO: HORA:_________________ DURAÇÃO DA ANESTESIA:__________________ REFORÇO:__________________________________ ANTIBIOTICOPROFILAXIA:__________________________ DOSE:__________________- VIA:_______- HORA:_________ ANALGÉSICO:______________________________________ DOSE:__________________- VIA:_______- HORA:_________ INTERCORRÊNCIAS:____________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________
106
PROTOCOLO DA EUTANÁSIA (E)
IDENTIFICAÇÃO = ANIMAL Nº GRUPO
DATA:___/___/____ PRÉ-ANESTÉSICO:_________________________________ DOSE:______________VIA:________HORA:_____________ FÁRMACO PARA EUTANÁSIA: __________________________________________________ DOSE:______________VIA:________HORA:_____________
107
PROTOCOLO DA MACROSCOPIA E MICROSCOPIA
MENISCO MEDIAL TRANSPLANTADO
NÚMERO: MENISCO MEDIAL CONTROLE MACROSCOPIA: TAMANHO (cm): FORMA: FIXAÇÃO PARCIAL (SIM OU NÃO): FIXAÇÃO TOTAL (SIM OU NÃO): COMPLICAÇÕES (SIM OU NÃO): MICROSCOPIA: TAMANHO: CORNO ANTERIOR (cm): CORPO (cm): CORNO POSTERIOR (cm): EDEMA ENTRE FIBRAS COLÁGENAS: REAÇÃO IMUNOLÓGICA: REAÇÃO INFLAMATÓRIA: