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CÁSSIA DE LOURDES CAMPANHOL
AVALIAÇÃO DA PREVALÊNCIA DE POLIMORFISMOS CROMOSSÔMICOS EM FETOS, NEONATOS MALFORMADOS
E CASAIS COM FENÓTIPO DE SUBFERTILIDADE
Dissertação de Mestrado
ORIENTADOR: Prof. Dr. RICARDO BARINI
Unicamp 2009
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CÁSSIA DE LOURDES CAMPANHOL
AVALIAÇÃO DA PREVALÊNCIA DE POLIMORFISMOS CROMOSSÔMICOS EM FETOS, NEONATOS MALFORMADOS
E CASAIS COM FENÓTIPO DE SUBFERTILIDADE
Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do Título de Mestre em Tocoginecologia, área de Ciências Biomédicas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. RICARDO BARINI
Unicamp 2009
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS UNICAMP
Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044 Título em inglês : Prevalence evaluation of chromosomic polymorphisms in fetuses and neonates with congenital defects and couples with the subfertility phenotype Keywords: • Polymorphism
• Human chromosomes, anomalies • Prenatal diagnosis
Titulação: Mestre em Tocoginecologia Área de concentração: Ciências Biomédicas Banca examinadora:
Prof. Dr. Ricardo Barini Prof. Dr. Renato Passini Júnior Profa. Dra. Ana Elizabete da Silva
Data da defesa: 25-08-2009 Diagramação e arte-final: Assessoria Técnica do CAISM (ASTEC)
Campanhol, Cássia de Lourdes C151a Avaliação da prevalência de polimorfismos
cromossômicos em fetos, neonatos malformados e casais com fenótipo de subfertilidade / Cássia de Lourdes Campanhol. Campinas, SP: [s.n.], 2009.
Orientador: Ricardo Barini Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual de
Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. 1. Polimorfismo. 2. Cromossomos humanos – anomalias.
3. Diagnóstico pré-natal. I. Barini, Ricardo. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
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Orientador: Prof. Dr. RICARDO BARINI.";~I~~_N"""'" ,,- .! ~[l!i'f~.4 r!:;: -,-
Curso de Pós-Graduação em Tocoginecologia da Faculdadede Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
iv
Dedico este trabalho...
A Marciano Paulo Lemes
Por entender minhas ausências, minhas angústias,
pois, estando mais perto, é onde batem primeiro minha raiva e alegrias,
por tornar meus dias muito mais felizes...
v
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Ricardo Barini, a quem eu admiro e estimo, por acreditar no meu
trabalho.
A Profa. Dra. Juliana Heinrich pela amizade, por me ajudar a moldar o meu caminho,
por nunca me deixar desistir, a me fazer sempre ver o lado bom do problema. Pela
dedicação em seu tempo tão apertado, pelas “broncas” e conselhos nos momento certos.
Ao Prof. Dr. Renato Passini Junior, pelo aceite como aluna sem ao mesmo me conhecer,
pelo sorriso nos corredores do CAISM, minha eterna gratidão e admiração.
Aos professores Dr. Cleisson Fábio Peralta e Dr. Renato Passini Junior, por aceitarem
participar do meu exame de qualificação, pelos comentários que com certeza
enriqueceram meu trabalho.
Aos professores Dr. Renato Passini Junior e Dra. Ana Elizabete Silva, por participarem
da banca examinadora da tese, pelo rico debate proporcionado.
À Lucia Fagian, pela dedicação com que preparou as lâminas para que eu pudesse ler.
Sem suas “mãos de ouro” tudo seria mais difícil.
Ao Prof. Dr. Fernando Guimarães, por se dispor a me orientar na técnica de citometria,
mesmo não tendo realizado, sempre disposto a ajudar no que quer que fosse.
vi
Ao pessoal do laboratório de Clínicos Especializados do CAISM – Mara, Vitória, Lucilene,
Fernanda, Priscila, Silvia, Alex, Sr Amilton, Alexandre, Dra. Tereza e Renata, pela
convivência do dia a dia e por estarem sempre dispostos a ajudar.
A estagiária Thatiane Moura, por ajudar a buscar tantas pastas sem reclamar!
A Profa. Dra. Denise Cavalcante e Dr. Mauricio Sakata, que me incentivaram e
esclareceram minhas dúvidas sobre essa imensidão da genética.
A Dra. Isabela Machado pelo companheirismo, risadas, ajuda e tantos incentivos!
A Dra. Carolina Moreno, Dra. Fabíola Vicente, Dra. Fabíola Monteiro e Dra. Joana
Prota, por me receberem sempre de portas abertas.
As secretárias Andreia, Marlene e Leonice por estarem sempre prontas a me ajudar no
meio de tantas pastas!
A secretária da Pós-Graduação do Departamento de Tocoginecologia FCM/UNICAMP,
Margarete, pela competência com que realiza seu trabalho, pelo carinho e ajuda
mesmo estando de férias!
A minha amiga Raquel Mary Rodrigues, pelo sorriso farto, pela convivência tranquila
do dia a dia, por estar sempre pronta a me ajudar, mesmo com tantos afazeres.
As minhas amigas Mariana Ávila e Fernanda Possan, pela amizade de tantos anos, por
aguentar minhas incertezas, e apoio diário.
Aos amigos Wilton Forti e Cristiane Forti, a quem eu admiro e estimo, que não
contribuíram diretamente para a realização deste projeto, mas que me ajudaram a
“ir mais longe”, minha eterna gratidão.
Aos meus amigos não menos importantes que viveram as “emoções” do meu dia a dia:
Rafael, Andressa, Ligia, Laudice, Priscila, Vanessa, Daniela, Gisele e Ana Laura.
Essas pessoas são presentes de Deus na minha vida.
vii
Aos meus pais José e Amélia, pessoas batalhadoras, que sempre deram o seu melhor,
fizeram tudo o que podiam para que chegasse onde cheguei. Por sempre rezarem
por mim...
Aos meus irmãos Marcos e Eduardo, faltam palavras para expressar toda minha
admiração, gratidão e amor...
A minha sobrinha Maria Eduarda, criança muito esperada e amada, não há o que
pague vê-la crescer e descobrir o mundo, sentir seu abraço e seu carinho, e rir
das suas “descobertas”.
As minhas cunhadas Ivone, Ariane e Mariana¸ mulheres lutadoras, brilhantes, por
entenderem minha ausência e pelo sorriso sempre acolhedor.
A meus tios João e Terezinha pelo amor de pais que sempre tiveram por mim, por me
acudirem em tantos momentos...
A meus tios Toninho e Lurdinha que sempre estiveram muito presentes na minha vida,
pela compreensão da minha ausência...
A meus primos Antonio Carlos, Mariana, Ivan e Daniel que compartilharam comigo
toda essa etapa, nem que fosse para tirar minhas dores literalmente!
E, acima de tudo, a Deus, que cuida de mim, que fez e faz maravilhas em minha vida...
As inquietações nos fazem caminhar, buscar algo a mais...
viii
Sumário
Símbolos, Siglas e Abreviaturas .................................................................................................... ix
Resumo .......................................................................................................................................... x
Summary ....................................................................................................................................... xii
1. Introdução ............................................................................................................................... 14
1.1. Polimorfismos Cromossômicos ....................................................................................... 14
1.2. Cromossomopatias e Subfertilidade ............................................................................... 19
1.3. Cromossomopatias e Malformações Congênitas ........................................................... 22
2. Objetivos ................................................................................................................................. 26
2.1. Objetivo geral .................................................................................................................. 26
2.2. Objetivos específicos....................................................................................................... 26
3. Materiais e Métodos ................................................................................................................ 27
3.1. Desenho do estudo ......................................................................................................... 27
3.2. Tamanho amostral........................................................................................................... 27
3.3. Seleção dos Sujeitos ....................................................................................................... 28
3.3.1. Casais com fenótipo de subfertilidade ............................................................... 28
3.3.2. Fetos e neonatos malformados .......................................................................... 28
3.4. Técnicas .......................................................................................................................... 29
3.5. Coleta de Dados .............................................................................................................. 30
3.6. Controle de qualidade ..................................................................................................... 31
3.7. Processamento e análise dos dados .............................................................................. 32
4. Publicação ............................................................................................................................... 33
4.1. ARTIGO 1 ........................................................................................................................ 34
4.2. ARTIGO 2 ........................................................................................................................ 51
5. Discussão ................................................................................................................................ 65
6. Conclusões.............................................................................................................................. 70
7. Referências Bibliográficas ....................................................................................................... 71
8. Anexos .................................................................................................................................... 78
8.1. Anexo 1 – Carta de aprovação do projeto no Comitê de Ética em Pesquisa - FCM/Unicamp e Carta de aprovação no Comitê de Pesquisa do Departamento de Tocoginecologia – FCM/Unicamp ........................................................................................... 78
Símbolos, Siglas e Abreviaturas ix
Símbolos, Siglas e Abreviaturas
CAISM – Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher
ECA – European Cytogeneticists Associaton
FCM – Faculdade de Ciências Médicas
ISCN – International System for Human Cytogenetic Nomenclature
inv – Inversão
qh – Heterocromatina do braço q de um determinado cromossomo
qh+ – Aumento da heterocromatina do braço q de um determinado cromossomo
ps+ – Aumento do satélite de um determinado cromossomo
PS – Privative service
RL – Reproductive loss
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
UWH – University Women´s Hospital
Resumo x
Resumo
Introdução: Embora até o momento um efeito fenotípico específico não esteja
associado a variantes polimórficas, observa-se uma prevalência mais elevada
destas variações entre os indivíduos que apresentam um fenótipo de abortamento
recorrente. Por outro lado, pouco se sabe sobre a participação destas variantes
entre fetos e neonatos com defeitos congênitos. Materiais e métodos: Foram
incluídos neste estudo 2060 resultados de cariótipos, de duas populações de estudo
diferentes: 1236 indivíduos provenientes de dois diferentes centros (público e
privado) e que haviam sido submetidos ao teste de cariótipo como parte da
investigação para a subfertilidade, e 824 fetos e neonatos com defeitos congênitos.
Resultados: Para os indivíduos com fenótipo de subfertilidade, nos dois
centros, a predominância de variações polimórficas foi de 8,9% e 3,8%. Entre os
fetos e neonatos, 37 (4,5%) indivíduos apresentaram variantes polimórficas.
Dentre esses pacientes, o achado clínico mais prevalente foi história prévia de
perda reprodutiva, apresentada nos progenitores em aproximadamente 54% dos
casos. Os defeitos craniofaciais e cardíacos foram descritos em aproximadamente
29% dos casos que apresentaram polimorfismos, seguidos pelos defeitos do
sistema nervoso central (21,6%), anomalias ósseas (16,2%), defeitos da parede
Resumo xi
abdominal (13,5%) e alterações renais (10,8%). Conclusões: Os resultados
deste trabalho reforçam a necessidade da adequada divulgação da informação
citogenética completa nos resultados de cariótipo, com atenção específica em
relação às variantes polimórficas. Assim, prevê-se contribuir para uma melhor
compreensão da participação desses polimorfismos em conjuntos de fenótipos
específicos. Também reforçam a importância de investigação do cariótipo para
uma melhor caracterização do fenótipo de subfertilidade, mesmo na ausência
de perda fetal recorrente.
Summary xii
Summary
Introduction: Although up to now a specific phenotypic effect has not been
associated to chromosome polymorphic variants such as inversions and variation in
length of heterochromatin segments, it has been widely noticed higher frequencies of
these variants among individuals who present a subfertility phenotype. On the
other hand little is known about the prevalence of these variants among fetuses
and neonates with congenital defects. Materials and methods: A total of 2060
karyotype results were included in this study from 1236 individuals of two different
centers who had been submitted to karyotyping as part of the investigation for
subfertility and 824 fetuses and neonates with congenital defects. Results: Among
individuals with the subfertility phenotype, in the two centers, the prevalence of
polymorphic variants was 8.9% and 3.8%. There was no significant difference
between the prevalence of polymorphic variants and other abnormalities in
individuals with or without previous history of reproductive loss. As for the fetuses
and neonates, thirty seven individuals (4.5%) presented polymorphic variants.
Among these patients, the most prevalent clinical finding was previous parental
history of reproductive loss in around 54% of the cases. Craniofacial and cardiac
defects were present in about 29% of them, followed by central nervous system
Summary xiii
defects (21.6%), bone alterations (16.2%), abdominal wall defects (13.5%) and
kidney alterations (10.8%). Conclusions: Our findings reinforce the need to
disclose complete information on polymorphic variants in karyotype reports and
contribute to a better understanding of the genetic mechanisms that characterize
some prevalent congenital defects. Also indicate the usefulness of karyotype
results to better characterize the subfertility phenotype even in the absence of
recurrent fetal loss.
Introdução 14
1. Introdução
1.1. Polimorfismos Cromossômicos
Os rearranjos cromossômicos têm importância particular no contexto da
saúde reprodutiva, uma vez que podem estar envolvidos na expressão de uma
série de fenótipos, incluindo as malformações fetais e as perdas gestacionais
sucessivas (1). Os gametas que apresentam alterações estruturais originam-se,
na maioria das vezes, de translocações cromossômicas equilibradas presentes
em um ou em ambos os genitores. É mais comum encontrar translocações
balanceadas em casais que já tiveram dois ou mais abortos espontâneos e em
homens inférteis do que na população em geral (2,3). Estima-se uma incidência
de translocações Robertsonianas de aproximadamente 0,1% na população
em geral e, em casais com abortamento de repetição, a prevalência é de
aproximadamente 8% (1,4).
Tanto as translocações recíprocas como as Robertsonianas são rearranjos
balanceados. Os indivíduos portadores não apresentam alterações fenotípicas
decorrentes das anomalias, exceção feita para os casos com microdeleções, ou
Introdução 15
pequenas deleções envolvendo os pontos de quebra cromossômica nos quais
ocorreu a translocação, ou mesmo pela ruptura de genes localizados nestas
regiões (5,6). Os riscos existentes restringem-se à sua prole, pois, dependendo da
segregação ocorrida durante a gametogênese, pode haver a formação de fetos
cromossomicamente não-balanceados e, consequentemente não viáveis (3,5,7).
Algumas regiões cromossômicas, ou mesmo cromossomos inteiros, são
ricas em conteúdo gênico, enquanto outras não o são. As consequências
clínicas das anomalias estruturais do genoma refletem a natureza específica dos
genes e das sequências envolvidas. Assim, as anomalias dos cromossomos ricos
em genes ou regiões codificantes tendem a ser muito mais graves clinicamente
do que os defeitos similares envolvendo partes do genoma não codificantes (2).
Com relação à organização da cromatina no núcleo, esta se condensa e
descondensa-se durante o ciclo celular. Pode-se dividir em eucromatina,
que compõe as regiões não condensadas e geneticamente ativas, e em
heterocromatina. As regiões de heterocromatina constitutiva estão presentes nos
centrômeros e telômeros ou, ainda, intercaladas com regiões de eucromatina
nos braços cromossômicos. A heterocromatina pode ainda ser classificada em
constitutiva, quando permanentemente condensada e inativa em todos os tipos
de células, e facultativa, quando condensada somente em certos tipos de
células ou em estágios especiais do desenvolvimento (2).
Embora a maioria dos 50.000 genes estimados no genoma esteja
representada com DNA de cópia única, ou seja, DNA cuja sequência de
Introdução 16
nucleotídeos é representada apenas uma vez, ou no máximo algumas vezes,
as sequências na fração de DNA repetitivo contribuem para manter a estrutura
cromossômica (2). A grande maioria dos genes está localizada a uma distância
significativa da região de heterocromatina presente nos centrômeros e nos
telômeros (8). No entanto, há uma zona de transição entre as regiões gênicas e
de heterocromatina que é denominada de região pericentromérica (9). Essas
regiões são pobres em sequências codificantes e possuem uma organização
complexa (10,11).
A integridade genética de uma célula depende da estabilidade de seus
cromossomos. Nesse sentido, os centrômeros desempenham um papel
importante na divisão celular (12). Através de técnicas moleculares, foi possível
verificar que a região de heterocromatina é composta de diferentes frações de
sequências repetitivas de DNA satélite. A região de heterocromatina do
cromossomo 9 é composta de sequências repetitivas de α satélite, β satélite e
satélite III (12, 13,14).
Na população geral são identificadas variantes dessas regiões constituindo
os polimorfismos cromossômicos. Esses polimorfismos são variantes estruturais da
normalidade, presentes nos cromossomos e que ocorrem com certa frequência nas
populações (15, 16, 17). Vale ressaltar, aqui, que um polimorfismo é uma
variação de DNA comum na população. Neste caso, nenhum alelo ou condição
específica é tido como a sequência ou condição-padrão. Ao invés disso, há duas ou
mais alternativas que são igualmente aceitáveis para uma determinada característica.
Existe um cut-off de 1%, arbitrário, para diferenciar um polimorfismo de uma
Introdução 17
mutação. Ou seja, para que uma condição seja classificada como polimórfica, o
alelo menos frequente tem que estar presente em uma frequência, no mínimo,
de 1% na população em geral. Se essa frequência for menor que 1%, a
condição é tida como mutação e não polimorfismo (18).
Com aplicação de técnicas de bandamento e, mais recentemente, com
técnicas moleculares, é agora conhecido que os polimorfismos representam
heterocromatina constitutiva, principalmente da região centromérica dos
cromossomos, podendo os segmentos polimórficos variar em tamanho e
posição (19). Assim sendo, os polimorfismos cromossômicos estão, basicamente,
relacionados ao aumento de tamanho de regiões heterocromáticas ou, ainda, à
inversão de sequência.
As inversões ocorrem quando um único cromossomo sofre duas quebras
e é reconstituído com o segmento entre as quebras, mas em sentido invertido
(Figura 1). As inversões são de dois tipos. As paracêntricas, que não incluem o
centrômero e nas quais ambas as quebras ocorrem em um só braço, sendo
menos frequentes na população em geral (0,009% a 0,049%). As pericêntricas
incluem o centrômero e são as que apresentam uma quebra em cada braço (2).
A inversão pericêntrica é um achado comum em um laboratório de rotina
citogenética, refletindo sua prevalência na população em geral. Estima-se que
inversões pericentroméricas ocorram com uma frequência de aproximadamente
2% na população (16). Apesar de um efeito fenotípico específico não ter sido,
até o momento, associado às inversões consideradas polimórficas, a
recombinação da região invertida durante a meiose pode resultar na produção
Introdução 18
de gametas desbalanceados com segmentos cromossômicos deletados ou
duplicados, gerando descendentes cromossomicamente anormais, abortos ou,
ainda, à ocorrência do efeito intercromossômico (6,15,20, 21, 22).
Figura 1: Fotomicrografia de cromossomos humanos mostrando um par do cromossomo 9, heterozigoto
para a inversão pericentromérica e a representação gráfica do bandamento cromossômico normal.
O segundo tipo de polimorfismo mais frequente envolve os cromossomos
1, 9, 16 e Y e estão relacionados à variação de tamanho de regiões
heterocromáticas, ou seja, as regiões de constricção secundária dos cromossomos
1, 9 e 16 e a região distal do braço longo do cromossomo Y (19) (Figura 2).
Figura 2: Fotomicrografia de cromossomos humanos mostrando aumento de heterocromatina
nos cromossomos 1, 9 e 16 e a representação gráfica do bandamento cromossômico normal.
Introdução 19
Os polimorfismos cromossômicos são alterações citogenéticas estruturais
tidas como “silenciosas”. Os dados da literatura chegam a apontar uma frequência
de até 8% de polimorfismos na população. Durante muito tempo considerou-se
que estas variantes polimórficas não tinham qualquer efeito fenotípico (19). No
entanto, mais atualmente, uma nova linha de investigação, sustentada por vários
autores, como Ait-Allah et al (23), Screbniak et al (24), Minocherhomji (25) e
Collodel et al (17), tem apontado que essas variantes polimórficas podem estar
associadas ao fenótipo de subfertilidade. Essa variação de heterocromatina
pode estar associada a um aumento de instabilidade cromossômica, anomalias
congênitas e, até mesmo, predisposição ao câncer (13, 14, 26).
1.2. Cromossomopatias e Subfertilidade
Nos últimos 20 anos, o paradigma do comportamento reprodutivo das
mulheres sofreu grandes modificações, aumentando em 50% o número de
mulheres que optam por engravidar após os 35 anos. Apesar de não haver uma
conclusão que aponte uma relação de causa e efeito definitiva, verifica-se que
as taxas de abortamento também se elevaram, confirmando o achado de que a
idade materna avançada é um fator de risco independente para o abortamento,
principalmente devido ao aumento do risco de concepção de fetos com
cromossomopatias (5). A respeito dessa mudança de paradigma, vários autores
têm considerado como abortamento recorrente a observação de duas perdas
fetais, incluindo as não consecutivas (7, 27), contrapondo-se à definição
tradicional que se dava à observação de três ou mais eventos consecutivos,
Introdução 20
antes de antingir-se a 20ª semana de gestação (28, 29). Em novembro de
2008, publicou-se uma recomendação da Sociedade Americana de Medicina
Reprodutiva definindo o conceito de perda recorrente a partir da segunda perda
reprodutiva, consecutiva ou não (30).
Com relação ao conceito de subfertilidade, este passou a ser utilizado de
forma não específica, para definir a falta de concepção, não desejada, incluindo
indivíduos com perda reprodutiva recorrente e indivíduos que apresentam
ausência de concepção (31).
A etiologia da perda fetal recorrente é multifatorial e, na maioria dos
casos, não é completamente esclarecida (28, 29). A perda fetal recorrente, de
forma isolada, não classifica um casal como infértil, incapaz de conceber, mas
caracteriza o fenótipo de subfertilidade, em que os indivíduos podem apresentar
fertilidade reduzida, com dificuldades para a concepção (31).
Além das causas genéticas, que explicam grande parte das perdas fetais
recorrentes, principalmente aquelas em idade materna avançada, outras causas
podem estar associadas à etiologia do abortamento recorrente como as
características intrínsecas de cada indivíduo, caracterizadas por deformidades
anatômicas, alterações endócrinas, imunológicas e hematológicas do casal (28,
29). Dentre todos os eventos passíveis de ocorrência em uma gestação, o
abortamento é a complicação mais comumente observada. Em geral, o
abortamento espontâneo atinge em torno de 10% a 20% dos casais em idade
reprodutiva, inserindo no contexto familiar angústia e sofrimento devido à
interrupção de uma gravidez (5, 6).
Introdução 21
Os fatores genéticos são considerados como os mais relevantes na
natureza da perda fetal espontânea. Estudos revelam que aproximadamente
50% a 60% dos conceptos de primeiro trimestre, abortados naturalmente,
apresentam alterações cromossômicas (3). Cerca de 5% a 10% dos casais com
fracassos reprodutivos apresentam, em pelo menos um cônjuge, translocações
equilibradas e/ou inversões (24, 28, 29, 32).
O mosaicismo cromossômico, situação em que os indivíduos são
portadores de mais de uma linhagem de células, envolve principalmente os
cromossomos sexuais e tem sido descrito com uma média de frequência de
aproximadamente 12% na população (6). Muitas das aneuploidias surgem de
erros da primeira divisão meiótica nos oócitos, que é iniciada uma vez, durante
a vida fetal, em um número limitado de células e não se completa até a
ovulação. Um aumento na taxa de anormalidades cromossômicas no esperma
também foi relatado em casais com abortamento recorrente, sendo que 7% das
trissomias fetais demonstraram vir de erros na disjunção meiótica paterna (5).
Mulheres apresentando mosaicismo para uma linhagem celular 45,X, têm
uma incidência de aborto recorrente e natimortos entre 25% e 30% e entre 6%
e 8%, respectivamente (6, 33). Apesar de a maioria das mulheres 47,XXX
apresentarem um desempenho reprodutivo satisfatório, para algumas a
presença de células 47,XXX talvez possa ser um fator adverso para a qualidade
dos seus oócitos (33).
A incidência de subfertilidade parece estar elevada entre pacientes
adultos com inversão do cromossomo 9 comparado com a população em geral
(23,34). Segundo Colls et al. (15), alguns estudos associam a inversão do
Introdução 22
cromossomo 9 com infertilidade e abortamento recorrente, resultado da
disjunção anormal durante a meiose, enquanto outros observaram um aumento
na frequência dessa inversão em familiares de portadores de síndrome de
Down, quando comparados com a população em geral.
A inversão pericentromérica do cromossomo 2 também é considerada
um polimorfismo frequente na população em geral. Esta anomalia não está
associada com uma síndrome ou anormalidade fenotípica específica, gerando
debates sobre as consequências clínicas dessa inversão (21, 24). Alguns
autores também associam esse tipo de inversão a anormalidades congênitas e
abortamento recorrente (16, 24).
1.3. Cromossomopatias e Malformações Congênitas
Das anomalias cromossômicas fetais, as aberrações numéricas são as
mais frequentes. Dentre estas, prevalecem as trissomias, seguidas de
poliploidias e monossomias do cromossomo X (1).
O mecanismo cromossômico mais comum nas aneuploidias é a não-
disjunção meiótica. Isto se refere à falha de um par de cromossomos em se
separar corretamente durante uma das duas divisões meióticas – meiose I e
meiose II – sendo diferentes para cada cromossomo. Todas as trissomias do
cromossomo 16 resultam da não-disjunção na primeira divisão meiótica
materna. A trissomia do cromossomo 13 ocorre devido a não-disjunção na
meiose I ou II, a trissomia do cromossomo 18 é quase inteiramente devido a
não-disjunção na meiose II e a trissomia do cromossomo 21 ocorre
Introdução 23
principalmente devido a não-disjunção associada com recombinação anormal
na meiose I e também na meiose II (1, 2).
Além da não-disjunção clássica, na qual a segregação imprópria dos
cromossomos resulta de uma falha no pareamento ou na recombinação apropriada
dos cromossomos, ou ambos, outros mecanismos envolvem a separação
prematura das cromátides irmãs na meiose I, ao invés de na meiose II. Caso
isto ocorra, as cromátides separadas podem, por acaso, segregar-se para o
ovócito ou para o glóbulo polar, levando a um gameta não-balanceado (2).
Além das alterações numéricas, ocorrem ainda as alterações estruturais
balanceadas e não-balanceadas. Dentre estas, as mais frequentes são as
translocações – equilibradas ou não – as inversões, o aumento de heterocromatina,
as deleções e inserções. Tanto as alterações numéricas quanto as estruturais
podem ocorrer na forma de linhagem pura ou de mosaico (2, 29, 32).
Os rearranjos cromossômicos têm importância particular, uma vez que
podem levar a malformações fetais. Os gametas que apresentam alterações
estruturais originam-se, na maioria das vezes, de translocações cromossômicas
equilibradas presentes em um dos genitores (2, 3).
Os rearranjos balanceados raramente são identificados em termos clínicos, a
menos que a pessoa portadora do rearranjo tenha um filho com um complemento
cromossômico não-balanceado e sejam realizados estudos familiares. Os rearranjos
não-balanceados provavelmente chamam a atenção em termos clínicos, em função
dos dismorfismos e do retardo no desenvolvimento físico e mental da pessoa
cromossomicamente anormal (2).
Introdução 24
Durante muito tempo os polimorfismos cromossômicos foram considerados
variantes normais na população, mesmo no contexto da Medicina Fetal. No
entanto, mais recentemente, alguns autores começaram a relatar frequências
aumentadas de inversão do cromossomo 9 em fetos que apresentaram algum
tipo de alteração ao exame ultrassonográfico pré-natal. As alterações relatadas
incluem polidrâmnio, oligodrâmnio, aâmnio, hidronefrose, hidroureter, encefalocele e
síndrome de Prune Belly (35). Outros sugerem uma associação da inversão do
cromossomo 9 com alguns distúrbios psiquiátricos e atraso de desenvolvimento
neuro-psico-motor (35, 36).
Um dos primeiros trabalhos a evidenciar essas alterações em associação
à inversão do cromossomo 9 foi relatado por Uehara et al. (37). Estes autores
descreveram que, em fetos fenotipicamente normais, era frequente o achado de
oligodrâmnio ou polidrâmnio ao ultrassom no período pré-natal.
A indicação do estudo citogenético em casais com história de abortamentos
recorrentes é importante para se esclarecer a etiologia da perda fetal e prevenir
a malformação congênita. Em seus estudos, Celep et al.(3), Yuce et al. (27) e
Sugiura-Ogasawara et al. (38) enfatizam a importância de se investigar as
causas genéticas em casais com abortamento recorrente e/ou óbito fetal, pois
muitos casais, apesar de terem sofrido dois ou mais abortamentos recorrentes,
ainda tentam novas possibilidades de reprodução, mesmo sem ter conhecimento da
etiologia do abortamento.
O estudo do cariótipo convencional do sangue periférico é indicado para
casais que apresentam fenótipo de subfertilidade, fazendo parte dos protocolos
de rotina de muitos centros, inclusive no CAISM. Um cariótipo alterado, de um
Introdução 25
dos indivíduos do casal, pode significar desde a total impossibilidade até chances
reduzidas de concepção, devido à repercussão desse fenômeno na formação
dos gametas e/ou na viabilidade do embrião e feto. Em se tratando de uma anomalia
sem chances de correção para gestações futuras, o aconselhamento genético
torna-se vital como parte da assistência ao casal, para que estes possam decidir
como conduzir o processo, diante dos riscos reprodutivos futuros, inclusive
considerando a possibilidade de utilização de técnicas de reprodução assistida.
O polimorfismo é um achado frequente na prática de um laboratório de
citogenética; entretanto, relatar esse achado no laudo final é facultativo.
Acredita-se que as prevalências dos polimorfimos possam estar subestimadas.
Assim, frente à importância do tema e à quase inexistência de estudos
consolidados no Brasil, decidiu-se pela condução do presente estudo.
Objetivos 26
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Avaliar a prevalência de alterações citogenéticas e polimorfismos
cromossômicos no contexto da saúde reprodutiva.
2.2. Objetivos específicos
Determinar a prevalência de polimorfismos cromossômicos em casais com
fenótipo de subfertilidade atendidos no CAISM e em uma clínica privada;
Determinar a prevalência de polimorfismos cromossômicos em fetos e
neonatos com malformações congênitas avaliados no CAISM;
Verificar, dentre os resultados de cariótipos alterados, qual a anomalia
mais prevalente nos três grupos de pacientes analisados;
Descrever os achados clínicos mais prevalentes, dentre as malformações
congênitas, em fetos e neonatos com polimorfismos cromossômicos.
Materiais e Métodos 27
3. Materiais e Métodos
3.1. Desenho do estudo
Descritivo com componente retrospectivo e prospectivo
3.2. Tamanho amostral
Foram incluídos no estudo resultados de cariótipos, processados no
laboratório de Citogenética do CAISM/Unicamp, de casais com fenótipo de
subfertilidade atendidos no Ambulatório de Perdas Gestacionais no período de
janeiro de 2003 a março de 2009. Também se incluíram os resultados de
cariótipos de casais com fenótipo de subfertilidade, atendidos em um serviço
privado, no período de janeiro de 2000 a dezembro de 2008.
Também fizeram parte do estudo os resultados de cariótipos de fetos ou
neonatos malformados, atendidos pelo Ambulatório de Pré-Natal Especializado –
Medicina Fetal, cujos cariótipos foram investigados no Laboratório de Citogenética do
CAISM/Unicamp, no período de janeiro de 2003 a abril de 2009.
Materiais e Métodos 28
O período para os casais com fenótipo de subfertilidade, fetos e
neonatos malformados atendidos no CAISM foi estipulado pelo fato de ter sido
o mesmo analisador e o mesmo revisor em todos os casos.
3.3. Seleção dos Sujeitos
3.3.1. Casais com fenótipo de subfertilidade
Este estudo incluiu 202 indivíduos com resultados de cariótipos (101
casais) com fenótipo de subfertilidade, atendidos no Ambulatório de Perdas
Gestacionais e no Laboratório de Citogenética do CAISM/Unicamp, no período de
janeiro de 2003 a março de 2009. Também incluiu 1034 resultados de cariótipos de
casais (517 mulheres e 517 homens) com fenótipo de subfertilidade, atendidos
em um serviço privado, no período de janeiro de 2000 a dezembro de 2008.
3.3.2. Fetos e neonatos malformados
A amostra foi composta de 824 fetos ou neonatos, atendidos pelo
Ambulatório de Pré-Natal Especializado – Medicina Fetal, cujos cariótipos foram
investigados no Laboratório de Citogenética do CAISM/Unicamp, no período de
janeiro de 2003 a abril de 2009. O cariótipo foi obtido a partir de sangue do
cordão umbilical, líquido amniótico, sangue de punção cardíaca, sangue
periférico ou vilosidades coriônicas.
Materiais e Métodos 29
Critérios de Inclusão
– Casais com história de dois abortamentos espontâneos, podendo ser
consecutivos ou não.
– Fetos ou neonatos malformados analisados através do ultrassom pré-
natal ou de exame clínico.
Critérios de Exclusão
– Já ter sido submetido(a) à radioterapia ou quimioterapia;
3.4. Técnicas
Para os casais com fenótipo de subfertilidade atendidos no serviço
privado foi realizada a consulta aos prontuários como forma de acesso aos
laudos e resultados de cariótipo, provenientes de diversos laboratórios externos
de citogenética.
Para os casais, fetos e neonatos atendidos no CAISM, utilizou-se a
técnica de cariótipo convencional com bandamento G, para todos os casos, e
com bandamento C em casos selecionados. Os protocolos utilizados foram
aqueles descritos no Manual de Processos dos Laboratórios Clínicos
Especializados. Resumidamente, após a coleta de sangue em tubo
heparinizado, procedeu-se ao cultivo celular de 500 µl de sangue total em meio
completo [meio de cultura HAM F-10 a 10% de soro fetal bovino e 100µl de
fitohemaglutinina 10µg/ml (Gibco)], em duplicatas, à 37ºC, por 68 a 72 horas.
Materiais e Métodos 30
Posteriormente, o material foi processado com hipotonia em solução de cloreto
de potássio (KCl 0,075M) por 10 minutos e fixação em Carnoy (metanol:ácido
acético 3:1) até que o pellet estivesse límpido. A suspensão celular foi aplicada
em lâmina de vidro e corada com corante Giemsa Wright. As culturas de líquido
amniótico e vilosidades coriônicas foram cultivadas em Meio Modificado Mem
Alpha, 15% de soro fetal bovino e 15% de suplemento AmnioMax (Gibco).
Foram analisadas 20 metáfases por caso. Em caso de suspeita de mosaicismo
este número foi expandido para 100.
Na presença de alguma variante polimórfica, aplicou-se a técnica de
Bandamento C, para confirmação das alterações nos segmentos de
heterocromatina. Nesta técnica, a lâmina foi incubada em ácido acético 45%, a
60oC durante 15 minutos, em seguida lavada com água gelada e água corrente.
Depois foi incubada em solução de hidróxido de bário 0,35M, durante 5 minutos
em temperatura ambiente, sendo enxaguada em água acidificada com HCl e
depois em água corrente. Em seguida foi incubada em tampão 2XSSC a 60oC
durante 30 minutos. No dia seguinte a lâmina foi corada com Giemsa a 10%.
3.5. Coleta de Dados
Os dados dos resultados dos cariótipos foram obtidos através de análise
de prontuário para os casais do serviço privado. Para os casais e fetos ou
neonatos malformados atendidos no CAISM, foi feito um levantamento no
banco de dados do laboratório de citogenética e, posteriormente, análise do
Materiais e Métodos 31
prontuário. A coleta do sangue periférico dos casais acompanhados no CAISM
foi realizada pela equipe de enfermagem do Ambulatório de Perdas Gestacionais. A
coleta de sangue periférico dos casais acompanhados nas clínicas particulares
foi realizada em local indicado pelo médico responsável. O material coletado
dos fetos e neonatos foi realizado pela equipe médica do CAISM.
3.6. Controle de qualidade
O laboratório de citogenética do CAISM/Unicamp possui um controle e
registros de todos os equipamentos (manutenção e temperatura) e meios
utilizados (registros referentes ao lote, data de fabricação, validade, fabricante,
teste de esterilidade). O referido laboratório está em acordo com as normas
internacionais de Boas Práticas de Laboratório, NR 32, Normas para Trabalho
em Contenção com Material Biológico, VISA e ANVISA.
Como as culturas de sangue periférico, líquido amniótico, vilosidades
coriônicas e sangue fetal para o cariótipo convencional já estão bem implementadas,
não foi necessário passar por um processo de validação da técnica.
Os resultados das análises de todas as técnicas utilizadas foram
conferidos por um segundo analisador, seguindo critérios internacionais de
assertividade, rastreamento e controle de qualidade.
Materiais e Métodos 32
3.7. Processamento e análise dos dados
Para todos os casos, pelo menos 5 imagens foram capturadas em um
sistema informatizado e analisadas através do software BandView (Applied
Spectral Imaging), montado em um microscópio Zeiss Axiophot. A descrição
dos cariótipos foi realizada com base no International System for Human
Cytogenetic Nomenclature 2005 (ISCN) [39].
Quanto às características clínicas dos casais, foram preenchidas fichas
de dados referentes à idade dos indivíduos no momento da primeira avaliação,
bem como o número de abortamentos, filhos vivos, crianças polimalformadas e
natimortos, apresentados por cada casal. Em relação às características clínicas dos
fetos ou neonatos com malformação congênita, foram coletados dados referentes
às alterações verificadas no ultrassom pré-natal ou através do exame clínico.
Os resultados de citogenética e os dados clínicos foram planilhados
utilizando-se o software Excel, onde também foram realizados os cálculos de
porcentagens. Estatisticamente, quando aplicável, utilizou-se o teste exato de
Fisher para o cálculo do valor “p”. Também se aplicou o cálculo de odds ratio.
Publicação 33
4. Publicação
Artigo 1 - Chromosome polymorphism association with the subfertility
phenotype revisited
Artigo 2 - Chromosomal Polymorphic Variants: A Relevant Finding During
Cytogenetic Investigation for Prenatal Congenital Defects?
Publicação 34
4.1. ARTIGO 1
Publicação 35
Chromosome polymorphism association with the subfertility phenotype
revisited
Campanhol, CL1, Couto, EC 2, Heinrich, JK1, Barini, R. 2,3
1Cytogenetics Laboratory at the Women´s Hospital (CAISM), State University of
Campinas, UNICAMP, Campinas, SP, Brazil, 2Recurrent Loss Outpatient Clinics,
Obstetrics Area at the Women´s Hospital (CAISM), State University of Campinas,
UNICAMP, Campinas, SP, Brazil, 3Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty
of Medical Sciences, State University of Campinas, UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
3Correspondence address. Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of
Medical Sciences, State University of Campinas, UNICAMP, Campinas, SP, Brazil. Tel:
+55-19-3521-9356; E-mail: [email protected]
Publicação 36
ABSTRACT
BACKGROUND: Although a specific phenotypic effect has not been associated
to chromosome polymorphic variants such as inversions and variation in length
of heterochromatin segments so far, it has been widely noticed higher
frequencies of these variants among individuals who present a subfertility
phenotype. METHODS: A total of 1236 individuals from two different centers
who had been submitted to karyotyping as part of the investigation for subfertility
were reviewed and included in the study. RESULTS: Approximately 25% of the
cases presented abnormal karyotype results, including numerical and structural
abnormalities and also the polymorphic variants. In the two centers, the
prevalence of polymorphic variants was 8.9% and 3.8%. CONCLUSIONS: There
was no significant difference between the prevalence of polymorphic variants
and other abnormalities in individuals with or without previous history of
reproductive loss. Our results reinforce the need of a better standardization for
reporting polymorphic variants and also indicate the usefulness of karyotype
results to better characterize the subfertility phenotype even in the absence of
recurrent fetal loss.
Publicação 37
Introduction
In the past, recurrent spontaneous abortion was defined as three or more
consecutive pregnancy losses and estimated to occur in 5% of all couples. More
recently, as reproductive paradigms have been reviewed, a broad subfertility
denomination has been assigned to couples with reproductive failure, either
through the occurrence of spontaneous miscarriage or through the occurrence
of difficulties to conceive. Nowadays, couples presenting two pregnancy losses,
including those which are not consecutive, have also been referred to
reproductive investigation [1,2,3,4]. The isolated recurrent fetal loss does not
classify a couple as infertile or incapable to conceive, but may characterize a
more contemporary understanding of the subfertility phenotype, a condition in
which the individuals present a reduced fertility, with difficulties to accomplish
conception and a viable offspring [5]. Several factors are associated with the
etiology of the subfertility phenotype such as anatomic, hormonal, immunological,
hematological and genetic alterations as well as infectious agents and unknown
causes [3,6,7].
Chromosomal abnormalities are considered to be responsible for 50% of
spontaneous abortions in the first trimester, including numerical alterations, structural
chromosome rearrangements (translocations, inversions, deletions and duplications)
and mosaicism. About 5 to 10% of couples with reproductive failures present
balanced translocations and/or inversions, in at least one partner [6,8].
Sex chromosomes are the most commonly involved in human
chromosomal aberrations and may disturb reproduction [9,10]. The chromosome
changes in autosomes, especially reciprocal translocation involving acrocentrics,
Publicação 38
such as Robertsonian translocations, can disturb sperm density by some central
effect during spermatogenesis. The presence of a small extra marker
chromosome in the karyotype is also a condition associated with the disruption
of the human spermatogenic sequence [10, 11]
Balanced translocations have no phenotypic effect. However, unbalanced
translocations are likely to have an effect on the phenotype and at the viability of
pregnancy [12].
An unbalanced structural abnormality ascertained after miscarriage could
have been caused it, and may result from chromosomal segregation errors during
gametogenesis, in one of the parents with a balanced rearrangement. When
products of conception contain an unbalanced structural rearrangement, it is
advisable to examine the parental chromosomes and determine whether a parent
carries a balanced rearrangement which may put them at risk of having a further
conceptus with additional and/or missing chromosome material [2, 10, 13, 14].
The pericentric inversion is a common finding in a cytogenetic laboratory
routine, despite the 2% frequency in the general population for this condition [15].
Although a specific phenotypic effect have not been associated to these
polymorphic inversions so far, the recombination of the inverted region during
meiosis can result in the production of gametes with deficient or duplicated
chromosome segments, generating abnormal descending or abortions [16, 17, 18].
Several authors have reported that heterochromatin polymorphisms are
present in 1 to 8% of specific groups in the population. Increase of
heterochromatic regions of chromosomes 1, 9, 16 and Y as well as increase of
satellite in acrocentric chromosomes is often found. However, in the past, they
Publicação 39
were not reported to be associated with any phenotypic repercussion. More
recently, these heterochromatin variations were reported to be associated with
the increase of chromosomic instability, congenital anomalies and even with
cancer predisposition [19, 20, 21]. When a structural rearrangement such as an
inversion, occurs in a chromosome, the segregation of the other chromosomes
may be affected, a phenomenon called interchromosomal effect [22].
In order to better understand the role of chromosome polymorphisms in a
specific population of individuals with the broad definition of the subfertility
phenotype and considering that many authors have been observing increased
rates of polymorphic variants in couples with recurrent reproductive losses, we
aimed on determining the prevalence of polymorphic variants in individuals with
the subfertility phenotype and on reviewing previous findings of other groups
and policies on how to report polymorphic variants.
Materials and Methods
Individuals assigned for this study were already included in clinical investigation
for reproductive failure in a private service and in the Recurrent Loss Outpatient
Clinics of the Women´s University Hospital, considered as a state reference
center. To be included in the study, couples had to present the phenotype of
subfertility. Individuals were classified under this term as they presented both
unwilled difficulties to conceive after one year of unprotected intercourse and/or
two reproductive losses (spontaneous loss during the fetal or neonatal period,
consecutively or not). The sample size comprised 1236 karyotype reports.
Cytogenetic results of 202 patients were assessed from the Cytogenetic Laboratory
Publicação 40
of the Women´s Hospital at the State University of Campinas Brazil (UWH) and
1034 reports were assessed at a private service (PS), located in the same city,
in the period between January 2003 to March 2009 (UWH) and January 2000 to
December 2008 (PS). Chromosome analysis was part of the clinical
investigation in both cases. In the PS, only the cytogenetic reports information
was collected in order to access the frequencies for the polymorphic variants and
other abnormalities. For the cases from the University Hospital, all karyotypes
were analyzed by the same technician and clinical records were reviewed. In
this case, chromosome preparations were obtained from 68-72 hours
lymphocyte cultures and analyzed with conventional G and C-banding as in
conventional routine protocols. At least 20 metaphases were analyzed for each
case. When mosaicism was suspected, 100 metaphases were analyzed.
Karyotypes were classified according to the International System for Human
Cytogenetic Nomenclature 2005 [23]. Image was acquired and analyzed through
the BandView Software (Applied Spectral Imaging) mounted in a Zeiss Axiophot
microscope. As the assignement of chromosome polymorphisms rely on
subjective interpretation, all karyotypes were reviewed by two independent and
blind readers. Inversions were assigned by the observation of the specific
banding pattern and length variation of heterochomatic segments was assigned
in the presence of segments which had double or half the size of the counter
region in the unaffected homolog. The study was approved by the institutional
Ethics Committee. Fisher´s exact test was applied to evaluate statistical
significance when appropriate.
Publicação 41
Results
The mean age of the women who had undergone investigation was 29 (19-42)
in the UWH and 33 (25-47) in the PS. Among men, the average age was 31 (16-
46) and 36 (26-55) respectively. Summarized results are presented in tables 1,
2 and 3. The frequencies of abnormal karyotype results were 18.3% for the
UWH and 6.7% for the PS, including numerical and structural abnormalities and
also the polymorphic variants. The frequency of individuals affected by a
polymorphic variant was 8.9% in the UWH and 3.8% in the PS.
As clinical records were checked in the UWH, individuals were separated
into two groups, one with clinical history of reproductive loss and other group
with no positive history of reproductive loss. Two episodes of spontaneous
abortion or perinatal loss would include an individual in the group with history of
reproductive loss. By the other hand, individuals with no positive history were
those with no report on reproductive loss but still under investigation as they
presented difficulties to achieve reproductive success through means of a viable
offspring.
Discussion
A wide variation in the frequencies of chromosome abnormalities was observed
in our sample ranging from 6.7% in the private service to 18.3% in the University
Women´s Hospital. It is interesting to consider that in the UWH, a higher
frequency of numerical abnormalities was detected probably due to the
standardization of a number of 100 metaphases that are analyzed in each case.
Kiss et al [24] has recently proposed that a higher number of metaphases
Publicação 42
should be analyzed in couples with recurrent fetal loss under cytogenetic
investigation to exclude low mosaicisms. We account that the differences
regarding the frequency of polymorphisms in the two different groups of patients,
which is higher among the patients from the UWH, are due to the
standardization to disclose every polymorphic variants in the final cytogenetic
report. As the cytogenetic reports from the PS would come from many different
and private cytogenetic laboratories, it would be difficult to reach the same level
of standardization. In Brazil, as well as in other countries, there´s no current
statement on how to report these chromosome polymorphisms and the
information decision lays on the cytogeneticist experience and will to report them
[25, 26]. In a survey conducted by the American College of Pathologists among
cytogeneticists, in 2006, it was reported that 97% of them would consider 1,9,16
or Yqh+ or qh- as a heteromorphism but only 24% of them would register them
in the final report. By the other hand, 86% would consider inv(9) as a
heteromorphism and 75% would report it. Regarding prominent acrocentric
satellites, 95% would consider it but only 26% would report it [26]. Disclosing all
polymorphic variants in the final cytogenetic report would allow other
researchers to access real frequencies for the polymorphisms, especially in
groups with specific phenotype profiles. To avoid unnecessary misinterpretation
of the reports by the clinician and the patient, it would be strongly recommended to
add an interpretative comment clearly indicating the significance of the findings.
Another issue to be considered is the fact that we have found similar
frequencies for polymorphic variants in couples with and without reproductive
losses (RL). If considered together, structural and numerical abnormalities, we
Publicação 43
could also observe the lack of a significant difference between the two groups
(9.1% for the group with RL and 10% for the group without RL). This finding
would suggest the importance to access the karyotype of every individual who
presents the phenotype of subfertility which would name any form or grade of
reduced fertility in couples trying to conceive [5]. It would represent a shift in the
current models for cytogenetic investigation referral, as supported by other
authors, but could also represent a better management of the subfertility
phenotype, avoiding both over and under treatment. At all times, genetic
counseling should be offered to couples who are under investigation and it is
suggested to declare that, although the chromosome polymorphisms represent
an expected population variability, several and recent studies have displayed
higher frequencies of these variants within individuals who present subfertile
phenotype. In the future, other molecular studies will allow the investigation of
the chromosome regions involved in these polymorphisms, specifically in the
transitions between euchromatin and heterochromatin aiming a full understanding
of the relationship between chromosome structure and function within coding
and non-coding sequences of the genome.
Publicação 44
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Publicação 48
Table 1 – Distribution of cytogenetic results in the Women´s Hospital and
the Private Service
UWH Private Service TOTAL
N % N % N %
Normal 165 81.6% 964 93.2% 1129 91.3%
Numerical 12 5.9% 17 1.6% 29 2.3%
Structural 7 3.4% 13 1.2% 20 1.6%
Polymorphic 18 8.9% 40 3.8% 58 4.6%
TOTAL 202 1034 1236
Publicação 49
Table 2: Distribution of observed cytogenetic classification according to
clinical history of reproductive loss (RL)
NORMAL POLYMORPHISM STRUCTURAL NUMERICAL ANY TOTAL
with 110 10 2 10 22 132
RL 83.3% 7.6% 1.5% 7.6% 16.7% 100.0%
without 55 8 5 2 15 70
RL 78.6% 11.4% 7.1% 2.9% 21.4% 100.0%
Odds Ratio - 1,60 5,00 0,40 1,36
(IC 95%) (0.6 (0.94 (0.08 (0.66
4.2) 26.6) 1.89) 2.8)
TOTAL 165 18 7 12 202
Fisher´s Exact Test: 0.0805
Publicação 50
Table 3: Description of abnormal karyotype results at the UWH and at the PS
ANEUPLOID STRUCTURAL POLYMORPHIC
Mosaic with 45,X 7 46,XY,der(8)(10pter→10p13::8p23→8qter) 1 9qh+ 2
Mosaic with 45,X and 47,XXX 3 46,XX,t(4;9)(p16;p23) 2 16qh+ 3
Mosaic with 47,XXX 1 Robertsonian 4 Yqh+ 1
Mosaic with mar 1 21,22ps+ 4
14pstk+ 1
inv(9)qh 6
inv(1)qh 1
TOTAL 12 TOTAL 7 TOTAL 18
Mosaic with 45,X 7 46,XY,der(6)(6qter-6p25::19p13.1-pter) 1 1qh+ 1
Mosaic with 45,X and 47,XXX 3 46,XY,t(3;5)(q12;q12) 1 9qh+ 11
Mosaic with 47,XXX 5 46,XX,t(6;10)(q21;p13) 1 Yqh+ 3
Mosaic with mar 2 46,XX,t(2;9)(q32;q22) 1 13,14,15,21,22ps+ 7
46,XX,t(9;16)(q34;q12) 1 13,14,15pstk+ 4
46,XX,ins(9;4)(q31;q22q33) 1 15cenh 2
46,XX,t(8;19)(q24.3;p13.1),9qh+ 1 inv(9)qh 10
46,XY,t(5;13)(q13;q22) 1 inv(8)qh 1
46,XX,t(2;5)(q31~33 - qter) 1 inv(1)qh 1
Robertsonian 4
TOTAL 17 TOTAL 13 TOTAL 40
Publicação 51
4.2. ARTIGO 2
Publicação 52
Chromosomal Polymorphic Variants: A Relevant Finding During
Cytogenetic Investigation for Prenatal Congenital Defects?
Campanhol, CLa, Andrade, KCb,d, Heinrich, JKa,d, Barini, Rc,d
aCytogenetics Laboratory at the Women´s Hospital (CAISM), State University of
Campinas, UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
bUltrasound Unit at the Women´s Hospital (CAISM), State University of Campinas,
UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
cDepartment of Gynecology and Obstetrics, Faculty of Medical Sciences, State
University of Campinas, UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
dFetal Medicine Unit at the Women´s Hospital (CAISM), State University of Campinas,
UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
3Correspondence address. Department of Gynecology and Obstetrics, Faculty of
Medical Sciences, State University of Campinas, UNICAMP, Campinas, SP, Brazil. Tel:
+55-19-3521-9356; E-mail: [email protected]
Publicação 53
ABSTRACT
Objectives: To investigate the prevalence of chromosome polymorphisms in
fetuses and neonates with congenital defects. Methods: Perinatal karyotype
analysis and clinical findings of 824 individuals. Results: Polymorphic variants
were observed in 4,5% of the individuals. The most prevalent congenital defects
observed were craniofacial and cardiac defects. Conclusion: Our findings
reinforce the need to disclose complete information of polymorphic variants in
karyotype reports and contribute to a better understanding of the genetic issues
that characterize some prevalent congenital defects.
Publicação 54
INTRODUCTION
Human chromosomes present polymorphic variants in the general population
with regard to chromosomal structure, shape and size. This variation is
considered to be a polymorphism as it affects a considerable percentage of
individuals. The most frequent polymorphic variants reported are chromosomal
inversions, specially affecting chromosomes 2 and 9 and length variation of
heterochromatic segments within the satellites of the acrocentrics and
centromeric regions of several chromosomes such as 1, 9, 16 and Y [1, 2]. The
frequency of these polymorphisms ranges widely, considering different
populations, risks and also ethnicity. In general, the percentages range from 1 to
10%, depending on the population studied. In the African-American population
(3.57%), slightly above average in Hispanics (3.42%), and relatively low in
Caucasians (0.73%) and Asians (0.26%) [3]. In Brazil, it has been accepted
frequencies ranging up to 1.5% approximately.
It is widely known that the most relevant and prevalent cytogenetic
abnormality found in the prenatal and perinatal period is aneuploidy, specifically
of the chromosomes 13, 18, 21, X and Y. Although the polymorphic variants
have turned to be a frequent finding in cytogenetic reports of subfertile couples,
there is still a lack of evidence for a link between these variants and congenital
defects which are not fully explained by typical and expected other genetic
abnormalities [1, 4, 5].
Although polymorphic variants usually occur within non-coding sequences of
the genome, it is important to note that other physical mechanisms are involved.
It is mandatory to have breakage and reunion of chromosomal segments with
Publicação 55
possible disruption of important genes in the neighbouring coding area. By the
other hand, variation in length of chromosome segments may involve duplication
or disruption of gene regions. It is not fully understood what lies beneath the
transition areas of euchromatin and heterochromatin and the analysis of
chromosome polymorphisms prevalences might help to better elucidate the role
of these abnormalities in the genome.
In order to better understand the role of chromosome polymorphisms in a
specific population of fetuses and neonates with congenital defects and
considering that many authors and our group have been observing increased
rates of polymorphic variants in the clinical practice, we aimed on determining
the prevalence of polymorphic variants in our state reference center and on
reviewing previous findings of other groups and policies on how to report
polymorphic variants considering that all karyotypes were analyzed under the
same laboratory and analyzer quality controls.
MATERIALS AND METHODS
Eight hundred and twenty and four cases of fetuses or neonates were
referred to cytogenetic investigation due to the observation of dysmorphologic
features through prenatal ultrasound examination or clinical neonatal
examination at the Women´s Hospital (CAISM) of the State University of
Campinas, from January 2003 to April 2009. This period of time comprised the
same standardization for polymorphism evaluation in our center, with the same
senior cytogeneticist who assigned the first or the second reading and slide
conference and assured a a strict quality control. Patients´ clinical records were
Publicação 56
assessed to ascertain information on clinical history. The record revealed that
informed consent was obtained prior to each invasive procedure. Either amniotic
fluid, blood or chorionic villi were collected to obtain fetal karyotype. All the
cases included in the study were referred to clinical investigation and none were
included only for research purposes.
Using routine protocols, cell culture was performed to obtain chromosomal
preparations which were submitted to conventional G and C-banding respectively.
A case was considered to carry a polymorphic variant if the following
abnormalities were observed: paracentric inversion of chromosomes 2, pericentric
inversion of chromosome 9, variation in heterochromatin length of chromosomes 1,
9, 16 or Y, and variation in satellite length of chromosomes 13, 14, 15, 21 and 22.
RESULTS
All patients were referred to cytogenetic investigation due to abnormal
ultrasound in the prenatal period or due to abnormalities found through clinical
exam soon after birth. The karyotype results are summarized on tables 1 and 2.
Around 74% of the cases presented a normal karyotype, followed by 19.5% of
aneuploidies, 1.8% of structural abnormalities and 4.5% of cases with
polymorphic variants. Trisomy 21 was the most prevalent aneuploid, followed by
trisomy 18, monosomy X and trisomy 13. Fifteen patients displayed structural
abnormalities and 37 present polymorphic variants. The most prevalent variant
was inv(9) with 10 affected subjects. By the other hand, if taken together,
variation in length of heterochromatic segments was the most prevalent finding
with 26 cases. As for the congenital defects detect through clinical or
Publicação 57
ultrasonographic examination, approximately 60% of the cases presented
multiple malformations. The most prevalent clinical finding regarded previous
history of fetal loss. More than half of our cases (54%) were parented by
individuals who had already presented at least one episode of reproductive loss.
The most prevalent malformations, with the same percentage of cases (29.7%),
was craniofacial defects and cardiopathy, followed by central nervous system
defects (21.6%), bone alterations (16.2%), abdominal wall defects (13.5%) and
kidney alterations (10.8%). Clinical findings are summarized on tables 3 and 4.
DISCUSSION
The observed prevalence for polymorphisms was considered high (4.5%)
if compared to the average frequency described in the literature for chromosome
polymorphisms in general. Around 1-2% in the general population and around 3-
4% in sub-fertile couples cohorts [1, 3, 4]. As far as we know, our study
constitutes the first large database analyzed for chromosomal polymorphisms
during the prenatal and neonatal periods, with a description of the relevant
clinical findings of congenital defects.
Our results corroborate with the literature to observe that aneuploidy is
still the most prevalent cytogenetic finding within fetuses and neonates who
presented at least one malformation through ultrasound examination.
For many years in the past, cytogenetic reports undisclosed polymorphic
variants findings as there was no clear recommendation on how to report them
nor strong clinical evidence of a link between the occurrence of a polymorphic
variant and an affected phenotype [1, 6, 7].
Publicação 58
More recently, many studies have reported on the results of the practical
observation in clinics which is that the prevalence of polymorphic variants is
higher not only in sub-fertile couples when compared with fertile couples, but
also that these variants are frequently observed with higher frequencies in
fetuses and/or neonates with congenital defects and who are referred to
chromosomal investigation [1, 4, 7, 8] observed that fetuses who presented
polymorphisms frequently presented polyhydramnios or oligohydramnios. More
recently some authors have published their cytogenetics casuistics and
commented on the observation that polymorphic variants are frequently
observed in patients with mental retardation [9, 10].
It is important to note that even specific characteristics that would not
naturally refer a patient to karyotype investigation were present in our sample.
For a better understanding of the mechanisms underlying the role of the
polymorphic variants, especially in fetuses and neonates with dysmorphologic
features, it would be important to investigate the karyotype, prenatally or after
birth of all these individuals, taking into account the risks for an invasive
procedure and other complications. Also, our large database revealed that the
occurrence of polymorphic variants is even more frequent than structural
abnormalities during the prenatal and neonatal periods and indicates the
importance to disclose the complete data about these polymorphic variants
specifically within the final cytogenetic report which, in the future, might help to
better elucidate all the genomic implications involved in this situation.
Publicação 59
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Publicação 61
Table 1: Distribution of the cytogenetic classification according to the type
of sample analyzed
Fetal Blood Am.Fluid Heart P. P.Blood CV TOTAL
N % N % N % N % N % N %
NL 242 78.5% 134 70.5% 37 84% 178 71.2% 20 62.5% 611 74.1%
Num 49 15.9% 42 22.1% 5 11.3% 54 21.6% 11 34.3% 161 19.5%
St 5 1.6% 5 2.6% 0 0,00% 4 1.6% 1 3.1% 15 1.8%
P 12 3.9% 9 4.7% 2 4.5% 14 5.6% 0 0.0% 37 4.4%
308 37.3% 190 23% 44 5.3% 250 30.3% 32 3.8% 824
Legends
Am.Fluid: Amniotic Fluid / Heart P.: Heart Punction / P.Blood: Peripheral Blood / CV:
chorionic villi / NL: Normal results / Num: Numerical abnormalities / St: Structural
abnormalities / P: Polymorphisms
Publicação 62
Table 2: Description of abnormal karyotype results for fetuses and
neonates
ANEUPLOID STRUCTURAL POLYMORPHIC
X monosomy 18 46,XX,del11(q14→qter)[4]/ 46,XX[46] 1 1qh+ 6
Trisomy 13 16 46,XX,del(8)(q24→qter) 1 9qh+ 5
Trisomy 18 34 46,XX,del(9)(p22→pter) 1 16qh+ 7
Trisomy 21 63 46,XY,del(Y)(pter→q11.2) 1 14,15,21,22ps+ 7
47,XXX 1 46,XY,t(1;8)(q41;p23) 1 9qh+,16qh+ 1
Triploidy 8 46,XX,der(5),t(5;6)(p15.2;p21.3)mat 1 inv(9)qh 10
48,XXX,+18 1 46,XX,der(4)t(4;9)(p16;p23) 1 inv(1)qh 1
47,XX,+mar 1 46,XX,add(4)(q28) 1 TOTAL 37
Robertsonian + Trisomy 9 46,XY,add(8p) 1
Mosaic with 45,X 2 46,XY,add(9p) 1
Mosaic with trisomy 8 2 46,XX,r(13) 1
Mosaic with trisomy 13 1 Robertsonian 4
Mosaic with trisomy 21 3
Mosaic with mar 2 TOTAL 15
TOTAL 161
Publicação 63
Table 3: General description of clinical findings for the individuals carrying
a polymorphic variant.
CASE FINDING CLINICAL FINDINGS Others
1 inv(1) Onfalocele
2
1qh+
Rabdomioma Rabdomioma
3 Silver Russel Syndrome
4 Craniofacial anomalies Trisomy 21
5 Craniofacial anomalies, hand anomalies, Dandy-Walker, cardiopathy
6 Previous history of chromosome 18 deletion Trisomy 13
7 Holoprosencephaly Holoprosencephaly
8
9qh+
Craniofacial anomalies
9 Onfalocele
10 Cardiopathy
11 Anencephaly
12 Fetal ascitis Fetal ascitis
13
16qh+
Craniofacial anomalies, ventriculomegaly
14 Cardiopathy
15 Altered Nuchal Translucency Altered Nuchal Translucency
16 Neural tube defect, bone anomalies, multicystic kidney
17 Hydropsy Hydropsy
18 Cardiopathy, craniofacial anomalies, bone anomalies Trisomy 18
19 Bone anomalies 20
ps+
Diaphragmatic hernia, craniofacial anomalies Diaphragmatic hernia
21 Encephalocele Hepatomegaly
22 Kidney agenesy, criptorquidy Criptorquidy
23 Splenomegaly and hepatomegaly Splenomegaly and hepatomegaly
24 Onfalocele
25 Gastroschisis
26 Ventriculomegaly
27
inv(9)qh
Bone anomalies, cardiopathy
28 Craniofacial anomalies, hand anomalies
29 MACP III Pulmonar defects
30 Acrany and cardiopathy
31 Craniofacial anomalies, bone anomalies, imperfurated anus, kidney agenesy
32 Hipospady, kidney agenesy, IUGR, craniofacial anomalies, ventriculomegaly Hipospady
33 Coroid plex cyst
34 Cardiopathy
35 Craniofacial anomalies, cardiopathy
36 Dandy Walker
37 9qh+,16qh+ Isolated hipospady Hipospady
Publicação 64
Table 4: Distribution cases and prevalence of the clinical findings
according to the polymorphic karyotype results.
Poli/oligo Multiple
Malformations
Previous Fetal Loss
Craniofacial
Cardiopathy
Abd Wall CNS Kidney Bone TOTAL
inv1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 2
1qh+ 1 5 4 3 3 1 1 0 0 18
9qh+ 3 1 4 1 1 1 1 0 0 12
16qh+ 0 4 3 2 2 0 2 1 3 17
ps+ 1 5 4 1 1 2 1 1 0 16
inv9qh 4 7 4 4 4 0 3 2 3 31
Total 9 22 20 11 11 5 8 4 6 96
% 24.3% 59.4% 54% 29.7% 29.7% 13.51% 21.6% 10.8% 16.2%
IC (95%)
10.3%- 43.4%- 37.8%- 14.8%- 14.8%- 2.3%- 8.2%- 0.7%- 4.2%-
38.3% 75.5% 70.3% 44.7% 44.7% 24.7% 35.1% 21% 28.3%
Legends: poli/oligo: presence of polyhydramnio or oligohydramnio. Abd Wall: presence
of abdominal wall defects. CNS: presence of central nervous system defects.
Discussão 65
5. Discussão
A possibilidade de verificar a existência de variantes polimórficas em um
cariótipo remonta, praticamente, ao advento da própria citogenética
convencional. Com o passar do tempo não foram desenvolvidas novas técnicas,
com exceção do bandamento C, relatado pela primeira vez em 1972, para
marcação de heterocromatina constitutiva, com diferentes protocolos (47). No
entanto, a interpretação da repercussão fenotípica desses achados polimórficos
ainda constitui-se em um dos maiores desafios da área da citogenética.
No contexto da saúde reprodutiva, questiona-se a repercussão dos
achados, principalmente em casais que apresentam abortamento recorrente,
sendo esta a área que agrega, sem sombra de dúvida, o maior número de
publicações que apontam uma frequência aumentada de variantes polimórficas
do que na população em geral. Apesar de existir consenso com relação ao
aumento da frequência, ressalta-se que sua quantificação é bastante variável.
Em um trabalho de revisão sobre a frequência de anormalidades
cromossômicas em casais com perdas gestacionais recorrentes, Kiss e
Discussão 66
colaboradores relatam frequências que variam de 0,6% a 2,8% para anomalias
de todos os tipos, sendo, dentro dessas, de 3% a 30% aquelas consideradas
como polimórficas, mais especificamente as inversões pericentroméricas (6).
Embora as variantes polimórficas sejam consideradas anomalias
silenciosas presentes na análise do cariótipo, este estudo revelou elevadas
taxas dessas variantes tanto em pacientes do serviço privado como do hospital
universitário, bem como entre os fetos e neonatos malformados. Esse valor
aumentado pode refletir o fato deste trabalho ter incluído amostras de pacientes
acompanhadas em um serviço de referência terciário e em um serviço privado
especializado em pacientes que apresentam insucesso reprodutivo.
Por outro lado, é interessante notar que indicar a presença de um
polimorfismo, no laudo que seguirá para o médico solicitante e paciente, é
facultativo. Em normatizações europeias indica-se, inclusive, que a variação da
normalidade (variação polimórfica) não deve ser indicada no laudo final, ficando
apenas registrada nas anotações internas do laboratório, para que não haja
uma interpretação controversa por parte do profissional não-citogeneticista (46).
Nos Estados Unidos, o grupo de Citogenética do Colégio Americano de
Patologistas, que normatiza a prática da citogenética naquele país, declara que
não há um padrão estabelecido para o registro dos heteromorfismos no laudo
citogenético, ficando a critério do citogeneticista responsável pelo exame a
decisão de reportá-los ou não (45). No Brasil, não existe uma normatização
com relação à informação em laudo das variantes da normalidade, existindo
uma sugestão da Sociedade Brasileira de Genética de que variantes
Discussão 67
cromossômicas normais, como tamanho de heterocromatina e satélite, exceto
aquelas envolvendo quebra e reunião de cromossomos, não necessitam ser
incluídas na descrição dos resultados. Aponta-se, entretanto, que se forem
mencionadas, o seu significado deve estar claramente descrito nos comentários
dos laudos (48).
No Laboratório de Citogenética do CAISM, local onde foi realizado o
presente estudo, optou-se desde 2002 pelo registro dos polimorfismos em
laudo, em todos os casos. Assim sendo, é possível que os dados apresentados
na literatura possam estar subestimados devido à falta de normatização com
relação à descrição dos polimorfismos em laudo, viés este não encontrado na
prática do laboratório do CAISM.
É ainda importante ressaltar que muitos autores indicam a possibilidade
de reportarem-se os polimorfismos relacionados às inversões, pois estas
apresentam duas quebras de DNA na estrutura do cromossomo, deixando-se
em um segundo plano a possibilidade de informação dos aumentos de tamanho
de heterocromatina (45). No presente estudo, em que não houve seleção dos
polimorfismos a serem reportados, verificou-se que as frequências para
aumento de tamanho de heterocromatina são tão ou mais prevalentes do que
as inversões, tanto nos casos dos casais com fenótipo de subfertilidade, como
nos casos de fetos e neonatos acompanhados para defeitos congênitos. Dessa
forma, é possível que vários trabalhos que publicaram que as inversões são
mais prevalentes do que os aumentos de tamanho de heterocromatina possam
ter apresentado dados subestimados. Em um trabalho apresentado por um
Discussão 68
consórcio de profissionais do Colégio Americano de Patologistas em 2006,
reportou-se que aproximadamente 90% dos profissionais optam por reportar as
inversões. No entanto, aproximadamente apenas 25% dos profissionais reportam
os aumentos de heterocromatina nos laudos (45). Especificamente para os
casos de fetos ou neonatos portadores de malformações incluídos neste estudo,
observou-se que o aumento de heterocromatina dos cromossomos 1, 9 ou 16 e
aumento de satélite dos acrocêntricos, se somados, são 100% mais prevalentes
do que os casos com inversão do cromossomo 9. O mesmo é observado nos
casos incluídos de casais com fenótipo de subfertilidade.
Com relação às outras alterações encontradas nos dois trabalhos,
verificou-se que os polimorfismos são mais prevalentes que as anomalias
estruturais. Em fetos e neonatos, o achado mais prevalente continua sendo o
das aneuploidias, seguido pelos polimorfismos e, posteriormente, as anomalias
estruturais. Para os casais com fenótipo de subfertilidade, a prevalência de
polimorfismos chega a ultrapassar o das aneuploidias, sendo o segundo maior
achado, depois do cariótipo normal.
Como este trabalho envolveu a maior casuística de pacientes brasileiros
e, até onde conhecemos, é o terceiro trabalho internacional a envolver mais do
que mil indivíduos com cariótipos analisados e o primeiro trabalho estruturado
para avaliar polimorfismos em fetos ou neonatos com malformações, os
resultados deste estudo validam a importância do registro em laudo das
variantes da normalidade, como os polimorfismos; sejam eles constituídos por
inversões ou aumento de tamanho de regiões heterocromáticas, com o
Discussão 69
subsequente comentário interpretativo do achado em questão, para que não
haja um entendimento controverso por parte do profissional não-citogeneticista.
A nomenclatura citogenética descrita na ISCN de 1995 e 2005 (39, 40), apesar
de internacional e padronizada, apresenta peculiaridades e é de difícil
compreensão para um profissional não especialista em citogenética.
Apesar de ainda não haver consenso científico, o aumento da frequência
de polimorfismos é um achado frequente em um Laboratório de Citogenética,
no contexto da saúde materno-fetal. É possível que, no futuro, e com a
contribuição das sequências mapeadas do genoma humano, seja possível
identificar regiões específicas, por array CGH, que estejam envolvidas em
alterações de número de cópia. Essas variações parecem agrupar-se perto de
sítios conhecidos de microdeleções ou outros genes relacionados a patologias.
Assim sendo, a visualização dos heteromorfismos, por citogenética
convencional, pode constituir-se em um marcador para a triagem de casos para
investigação molecular. Por outro lado, investigações complementares com
técnicas de biologia molecular poderão indicar pequenos ganhos ou perdas
genômicas associadas à ocorrência dos heteromorfismos e, assim, levar à
descoberta de novas sequências envolvidas na etiologia de malformações fetais
específicas ou ao fenótipo estendido de subfertiilidade em casais, mesmo na
ausência de abortamento recorrente.
Conclusões 70
6. Conclusões
– A prevalência de polimorfismos cromossômicos em casais com fenótipos de
subfertilidade e em fetos e neonatos malformados observados no presente
estudo indica que estas alterações podem estar relacionadas com o efeito
fenotípico em seus portadores.
– As variantes polimórficas constituem as anomalias cromossômicas mais
prevalentes nos casais com fenótipo de subfertilidade com cariótipos alterados,
independentemente do atendimento em serviço público ou privado, enquanto
que no grupo de fetos e neonatos malformados são as aberrações
numéricas.
– Fetos e neonatos malformados com variantes polimórficas apresentaram
como achados clínicos mais prevalentes: história familiar prévia de perda
fetal, defeitos craniofaciais, cardiopatias, defeitos do sistema nervoso central,
anomalias esqueléticas, defeitos de parede abdominal e anomalias renais.
Referências Bibliográficas 71
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Anexos 78
8. Anexos
8.1. Anexo 1 – Carta de aprovação do projeto no Comitê de Ética em Pesquisa - FCM/Unicamp e Carta de aprovação no Comitê de Pesquisa do Departamento de Tocoginecologia – FCM/Unicamp
Anexos 79
Anexos 80
Anexos 81
Anexos 82