avaliação da atividade antifúngica de óleo essencial de orégano

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

CAROLINA MARIA BEDOYA SERNA

Avaliação da atividade antifúngica de óleo essencial de orégano

(Origanum vulgare) nanoemulsionado e estudo de caso em

queijo Minas Padrão

Pirassununga

2015

Carolina Maria Bedoya Serna

Avaliação da atividade antifúngica de óleo essencial de orégano

(Origanum vulgare) nanoemulsionado e estudo de caso em

queijo Minas Padrão

VERSÃO CORRIGIDA

Dissertação apresentada à Faculdade de

Zootecnia e Engenharia de Alimentos da

Universidade de São Paulo, como parte dos

requisitos para a obtenção do Título de Mestre

em Ciências.

Área de concentração: Ciências da Engenharia de Alimentos

Orientadora: Profª Dra Samantha Cristina de Pinho

Pirassununga

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Serviço de Biblioteca e Informação da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da

Universidade de São Paulo

Bedoya-Serna, Carolina Maria

B413a Avaliação da atividade antifúngica de óleo essencial

de orégano (Origanum vulgare) nanoemulsionado e estudo

de caso em queijo Minas Padrão / Carolina Maria Bedoya

Serna. –- Pirassununga, 2015.

106 f.

Dissertação (Mestrado) -- Faculdade de Zootecnia e

Engenharia de Alimentos – Universidade de São Paulo.

Departamento de Engenharia de Alimentos.

Área de Concentração: Ciências da Engenharia de

Alimentos.

Orientadora: Profa. Dra. Samantha Cristina de Pinho.

1. Nanoemulsões 2. Método PIT 3. Inibição fúngica

4. Orégano 5. Queijos. I. Título.

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, meu irmão, meu namorado e minha tia Liliana ...

sem vocês nada disso teria dado certo ...

Grata para sempre!!!

Cada dia vale a pena se tenho a Deus em meu coração, o amor da minha família, a companhia do

amor da minha vida, o carinho de meus amigos e a vontade de acordar cada dia com a esperança

de lutar por meus objetivos... então...

VALEU MESMO!!!

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por abençoar cada dia de minha vida e me permitir viver cada experiência

que me ajuda a ser uma pessoa melhor.

Agradeço a meus pais Ramón e Lucero pelo amor, apoio e paciência... não é fácil ficar

longe de vocês e, embora a saudade seja enorme, seu carinho e suas orações me dão a força para

continuar adiante na vida... Agradeço sempre a Deus por me dar os melhores pais do mundo, vocês

são únicos e por isso todo meu amor é para vocês.

Agradeço a meu irmão David por ser minha companhia e a força para ser melhor cada dia...

Espero estar fazendo as coisas bem e ser teu melhor exemplo... Te amo!!!... Meu cuidado e

dedicação serão para você.

Agradeço a minha tia Liliana por ser o impulso em minha vida como estudante e

profissional, se não fosse por você, não estivesse aqui abrindo minha mente ao mundo e

aumentando meu conhecimento... Espero te devolver da melhor forma todo aquilo que você me

tem dado... Deus te abençoe sempre!!!

Agradeço a meu namorado Julian por seu amor, sua companhia, seu apoio incondicional e

quer viver junto comigo esta aventura a qual está virando a melhor de todas... Te Amo meu amor!!

Agradeço a meus avós, minhas tias, meus tios, minhas primas e meus primos por suas

orações, seu carinho e seu ânimo para eu continuar trilhando meu caminho.

Agradeço a minha amiga Laura por seu carinho, sua paciência e por sua amizade

incondicional... Obrigada por tudo amiga!!!... Tomara que a gente possa se encontrar de novo na

Colômbia... Te adoro!!!

Agradeço à professora Samantha por arriscar em receber uma colombiana cheia de sonhos

e expectativas na sua equipe de trabalho, muito obrigada pela confiança, pelo apoio e por acreditar

em mim... pode contar comigo sempre e lembre que desde agora tem uma amiga colombiana...

Deus abençoe sempre!!!

Agradeço à professora Andrezza Fernandes por me receber no seu laboratório, me dar um

espaço no seu grupo de trabalho, me ajudar no processo do Mestrado e por seus ensinamentos... a

gente se vê no Doutorado...

Agradeço a Marilia Moraes pela ajuda e por tirar de seu tempo para me ensinar coisas

maravilhosas. Agradeço sua dedicação e paciência ... e Parabéns mamãe!!!

Agradeço ao pessoal do Laboratório de Coloides e Funcionalidade de Macromoléculas por

me receber tão bem e fazer que me sentisse em família ... Obrigada pelos momentos

compartilhados, suas risadas, sua alegria e pela comida gostosa rsrsrs ... nunca esquecerei!!! ... e

lembrem que cada vez que estejam com vontade de mousse de maracujá é só avisar.

Agradeço a Silvia Seraphin por sua paciência e dedicação e por seu esforço para que eu

aprendesse direitinho... Muito Obrigada por tudo!!!

Agradeço ao pessoal do Laboratório de Saúde Animal por sua amabilidade e me receber e permitir

que me sentisse em casa... Muito Obrigada!!!

Agradeço ao Laticínio Imperial Jureia (Monte Belo, MG), na pessoa do proprietário, Sr.

Roberto Costa, e da Enga de Alimentos Thalita Costa Liano, por seu apoio e disponibilizar do seu

tempo e as instalações do laticínio para levar a cabo nosso projeto.

Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

bolsa concedida, a qual me permitiu desenvolver este projeto de Mestrado.

Agradeço a Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos e a todos os professores

pelos ensinamentos obtidos durante a realização do curso.

Agradeço aos meus amigos por cada momento juntos por cada festinha, reunião, almoço,

janta, etc. vocês são parte de minha vida agora e sei que algum dia temos que ir embora, mas nunca

vou esquecer de vocês. Obrigada mesmo!!!

RESUMO

BEDOYA-SERNA, C.M. Avaliação da atividade antifúngica de óleo essencial de orégano

(Origanum vulgare) nanoemulsionado e estudo de caso em queijo Minas Padrão. 2015.

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São

Paulo, Pirassununga, 2015.

Este trabalho de Mestrado teve por objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro e em

queijo Minas Padrão de duas formulações (A e B) de nanoemulsões encapsulando óleo essencial

de orégano (Origanum vulgare) produzidas pelo método da temperatura de inversão de fases

(método PIT). Cladosporium sp., Fusarium sp. e Penicillium sp. foram os fungos identificados nas

amostras de queijo Minas Padrão deteriorados. Tais cepas foram utilizadas na avaliação da

atividade antifúngica in vitro e em queijo Minas Padrão do óleo de orégano nanoemulsionado. Nos

testes in vitro foram determinadas as concentrações mínimas inibitórias (CMI) do óleo essencial

de orégano puro e nanoemulsionado sobre o Cladosporium sp., Fusarium sp. e Penicillium sp.

Foram utilizadas fatias de queijo Minas Padrão para avaliar o efeito inibitório das nanoemulsões

contendo óleo essencial de orégano. Por último foi avaliado o efeito inibitório das nanoemulsões

durante o processo de maturação de queijos Minas Padrão. Determinaram-se valores de CMI para

óleo essencial puro de 0,2; 0,3 g/ml para Fusarium sp. e Penicillium sp., respectivamente.

Enquanto para as duas formulações de nanoemulsão; os valores de CMI dependeram da quantidade

de óleo essencial de orégano que estava contido nelas, obtendo-se valores de 0,26; 0,11 e 1,62

μg/ml para a formulação A de óleo de orégano nanoemulsionado sobre Cladosporium sp.,

Fusarium sp. e Penicillium sp., respectivamente, e CMIs de 0,32; 0,1 e 0,8 g/ml para a formulação

B de nanoemulsão sobre os mesmos gêneros de fungos. Os ensaios nas fatias de queijo

evidenciaram que o efeito das CMIs, quando aplicadas na matriz alimentícia, foi nulo, permitindo

o desenvolvimento normal dos fungos avaliados, da mesma forma se determinou a importância da

atividade de água no crescimento fúngico. Já nos queijos em ambiente de maturação o efeito

inibitório do óleo de orégano foi pouco satisfatório, o que indicou a importância do controle dos

demais parâmetros ambientais no ambiente de maturação. Pode-se concluir que o óleo essencial de

orégano nanoemulsionado apresentou efeito inibitório contra os gêneros de fungos avaliados.

Quando controlados parâmetros ambientais como temperatura de armazenamento e atividade de

água, seu efeito inibitório pode ser amplamente melhorado, apresentando-o como potencial

alternativa na conservação dos alimentos.

Palavras-chave: nanoemulsões; método PIT; inibição fúngica; orégano; queijos.

ABSTRACT

BEDOYA-SERNA, C.M. Evaluation of antifungal activity of nanoemulsions encapsulating

oregano essential oil and case study in Minas Padrão cheese. 2015. Master Thesis - Faculdade

de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2015.

This Master Thesis aimed to evaluate the in vitro antifungal activity and in Minas Padrão cheese

of two formulations (A and B) of nanoemulsions encapsulating essential oil of oregano (Origanum

vulgare) produced by the method of phase inversion temperature (PIT method). Cladosporium sp.,

Fusarium sp. and Penicillium sp. fungi were identified in deteriorated cheese samples. These

strains were used in the evaluation of antifungal activity of oregano essential oil nanoemulsions,

both in vitro and in cheese. Minimum inhibitory concentrations (MIC) of essential oil of pure

oregano oil and nanoemulsions were determined. Cheese slices were used to evaluate the inhibitory

effect of nanoemulsions containing essential oil of oregano. Finally the inhibitory effect of

encapsulated oregano oil was tested during cheese ripening. MIC values determined for pure

essential oil were 0.20 and 0.3 g/ml for Fusarium sp. and Penicillium sp., respectively. As for the

two nanoemulsion formulations, MIC values depended on the amount of essential oil of oregano

which was contained therein, and the values for formulation A were 0.26, 0.11 and 1.62 g / ml

for Cladosporium sp., Fusarium sp. and Penicillium sp, respectively. For formulation B, the values

of MIC were 0.32, 0.10 and 0.80 g/ml. The tests on the cheese slices showed that the effect of

MIC when applied in the food matrix was null, as the fungi growth was not avoided. As for the

tests during cheese ripening, the inhibitory effect of oregano oil in nanoemulsions was

unsatisfactory, which indicated the importance of controlling other environmental parameters in

the maturation chamber. It can be concluded that the nanoemulsions of essential oil presented

inhibitory effect against the genera of fungi evaluated. Controlled environmental parameters such

as storage temperature and water activity, its inhibitory effect can be highly improved, and the

nanoemulsions of oregano oil can be seen as a potential system for food preservation.

Keywords: nanoemulsions; phase inversion temperature; oregano essential oil; fungal growth inhibition;

cheese.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Aparência de queijo Minas Frescal ............................................................................... 25

Figura 2. Aparência de queijos tipo Minas curado ....................................................................... 26

Figura 3. Aparência de queijos Minas Padrão .............................................................................. 27

Figura 4. Estrutura química do carvacrol e o timol principais princípios ativos do óleo essencial

de orégano (O. vulgare) ................................................................................................................. 33

Figura 5. Representação esquemática da dependência da curvatura das camadas de tensoativo

polietoxilado com a temperatura, e sua influência na característica das emulsões ...................... 39

Figura 6. Esquema do mecanismo de geração de nanoemulsões pelo método da temperatura de

inversão de fases (método PIT): (a) a temperatura do sistema está abaixo da temperatura PIT; (b)

sistema durante o aumento da temperatura, em que os tensoativos gradualmente se transformam

em lipofílicos; (c) sistema na temperatura PIT; (d) a temperatura é levada acima do PIT, a emulsão

é invertida e a água é dispersa na mistura óleo + tensoativo lipofílico. O sistema é então

rapidamente resfriado, usando água diluída, tornando subitamente o tensoativo hidrofílico e

induzindo a espontaneidade e a rápida migração para a fase aquosa ........................................... 40

Figura 7. Aspecto visual das dispersões de nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano

....................................................................................................................................................... 48

Figura 8. Amostras comerciais de queijos deteriorados utilizados na identificação dos fungos . 49

Figura 9. Vista do Laticínio Imperial Jureia, localizado na cidade de Monte Belo, MG. ............ 51

Figura 10. Fluxograma de processo do queijo Minas Padrão fabricado no Laticínio Imperial Jureia

....................................................................................................................................................... 52

Figura 11. Porcentagem de crescimento dos diferentes tipos de fungos encontrados na superfície

e no interior das amostras de queijo Minas Padrão analisadas ...................................................... 62

Figura 12. Visualização da concentração mínima inibitória do óleo de orégano (Origanum

vulgare) puro para Fusarium sp. ................................................................................................... 64

Figura 13. Visualização da concentração mínima inibitória do óleo de orégano (Origanum

vulgare) em sua forma livre para Penicillium sp. .......................................................................... 64

Figura 14. Visualização da concentração mínima inibitória da formulação A de nanoemulsão

contendo óleo de orégano nanoencapsulado para Cladosporium sp. ............................................ 65


contendo óleo de orégano nanoencapsulado para Fusarium sp. ................................................... 66


contendo óleo de orégano nanoencapsulado para Penicillium sp.................................................. 66

Figura 17. Visualização da concentração mínima inibitória da formulação B de nanoemulsão

contendo óleo de orégano nanoencapsulado para Cladosporium sp. ............................................ 67


contendo óleo de orégano nanoencapsulado para Fusarium sp. ................................................... 68


contendo óleo de orégano nanoencapsulado para Penicillium sp.................................................. 69

Figura 20. Efeito do tempo de imersão no crescimento fúngico em fatias de queijo Minas Padrão,

utilizando-se formulação A da nanoemulsão pura encapsulando óleo essencial de orégano (fungo

testado: Fusarium sp.; Controle: sem óleo de orégano nanoemulsionado). .................................. 72


utilizando-se formulação A da nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano em

concentração de 11,7 g/ml de óleo essencial (fungo testado: Fusarium sp.; Controle: sem óleo de

orégano nanoemulsionado). ........................................................................................................... 73


utilizando-se formulação B da nanoemulsão pura encapsulando óleo essencial de orégano (fungo

testado: Fusarium sp.; Controle: sem óleo de orégano nanoemulsionado) ................................... 74


utilizando-se formulação B da nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano em

concentração de 18 g/ml de óleo essencial (fungo testado: Fusarium sp.; Controle: sem óleo de

orégano nanoemulsionado). ........................................................................................................... 75

Figura 24. Ação antifúngica sobre Cladosporium sp. para o dia trinta de incubação, para os

diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da

formulação A de nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada

imediata após imersão na nanoemulsão; (T30) imersão por 30 minutos na nanoemulsão. ............ 77

Figura 25. Ação antifúngica sobre Cladosporium sp. para o dia trinta de incubação, para os

diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da

formulação B de nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada


Figura 26. Ação antifúngica sobre Fusarium sp. para o dia trinta de incubação, para os diferentes

tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da formulação A

de nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada imediata após

imersão na nanoemulsão; (T30) imersão por 30 minutos na nanoemulsão. ................................... 79


tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da formulação B



Figura 28. Ação antifúngica sobre Penicillium sp. para o dia trinta de incubação, para os diferentes

tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da formulação A




tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da formulação B



Figura 30. Ação antifúngica sobre Cladosporium sp. para o dia trinta de incubação sob

refrigeração, para os diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as formulações

A e B de nanoemulsão pura encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada


Figura 31. Ação antifúngica sobre Fusarium sp. para o dia trinta de incubação sob refrigeração,

para os diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as formulações A e B de

nanoemulsão pura encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada imediata

após imersão na nanoemulsão; (T30) imersão por 30 minutos na nanoemulsão. ........................... 84

Figura 32. Ação antifúngica sobre Penicillium sp. para o dia trinta de incubação sob refrigeração,

para os diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as formulações A e B de

nanoemulsão pura encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada imediata

após imersão na nanoemulsão; (T30) imersão por 30 minutos na nanoemulsão. ........................... 85

Figura 33. Forma de imersão dos queijos Minas Padrão em nanoemulsão encapsulando óleo

essencial de orégano. ..................................................................................................................... 86

Figura 34. Aparência dos queijos tipo Minas Padrão imediatamente após a imersão nas

formulações A e B de óleo de orégano nanoemulsionado, na câmara de maturação. ................... 87

Figura 35. Aparência dos queijos tipo Minas Padrão imersos nas formulações A e B de óleo de

orégano nanoemulsionado, na câmara de maturação, após 30 dias............................................... 87

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação de queijo de acordo ao teor de gordura. .................................................. 24

Tabela 2. Classificação de queijo de acordo ao teor de umidade. ................................................. 25

Tabela 3. Gêneros e espécies de fungos filamentosos comumente presentes como agentes

contaminantes em queijos maturados ............................................................................................. 29

Tabela 4. Compostos ativos do óleo de orégano. .......................................................................... 32

Tabela 5. Estudos recentes sobre nanoencapsulação de óleos essenciais ...................................... 41

Tabela 6. Dados dos tensoativos empregados nos experimentos realizados. ................................ 46

Tabela 7. Formulações utilizadas para produção das nanoemulsões encapsulando óleo essencial de

orégano. .......................................................................................................................................... 47

Tabela 8. Tratamentos utilizados na etapa de avaliação da ação antifúngica das nanoemulsões em

queijos Minas Padrão. .................................................................................................................... 53

Tabela 9. Valores das contagens de fungos na superfície e no interior das amostras dos queijos

Minas Padrão .................................................................................................................................. 56

Tabela 10. Imagens macroscópicas e microscópicas dos fungos encontrados na superfície de

diferentes amostras de queijo Minas Padrão contaminados. .......................................................... 58

Tabela 11. Imagens macroscópicas e microscópicas dos fungos encontrados no interior das

amostras de queijo Minas Padrão contaminados. ........................................................................... 59

Tabela 12. Exemplos de placas ilustrando os gêneros escolhidos para ser utilizados nos ensaios de

atividade antifúngica do óleo de orégano nanoemulsionado in vitro. ............................................ 63

Tabela 13. Valores de concentração mínima inibitória para os fungos testados, para o óleo de

orégano puro e nanoemulsionado. .................................................................................................. 69

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

PIT Do inglês Phase Inversion Temperature – Temperatura de Inversão de Fases

TPIT Temperatura em que ocorre a inversão de fases

CMI Concentração Mínima Inibitória

MG Minas Gerais (Estado)

A/O Água/Óleo

O/A Óleo/Água

CFM Concentração Fungicida Mínima

HLB Balanço Hidrofílico-Lipofílico

DRBC Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol

PDA Ágar Batata Dextrose

OG Óleo de Girassol

OO Óleo Essencial de Orégano

UFC/g Unidade Formadora de Colônia por grama

PDA+C Ágar Batata Dextrose adicionado de Cloranfenicol

EST Valor Estimado

sp. Espécie

T0 Tempo zero

T30 Tempo 30 minutos

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

FETAEMG Federação de Trabalhadores na Agricultura do Estado de Minas Gerais

LISTA DE SÍMBOLOS

nm Nanômetros

l Microlitros

% Porcentagem

ºC Graus Celsius

ml Mililitro

rpm Revoluções por minuto

g Gramas

g Microgramas

≤ Menor ou igual que

> Maior que

< Menor que

kg Quilogramas

+ Mais

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 20

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 23

2.1. HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA DA PRODUÇÃO DE QUEIJOS NO BRASIL ........ 23

2.2. QUEIJO MINAS ............................................................................................................. 25

2.2.1. Queijo Minas Padrão ............................................................................................... 26

2.2.1.1. Contaminação fúngica em queijos maturados .................................................. 28

2.3. ÓLEOS ESSENCIAIS COMO AGENTES DE CONSERVAÇÃO .............................. 31

2.4. NANOEMULSÕES: PRODUÇÃO POR MÉTODOS DE BAIXA ENERGIA E

APLICAÇÕES EM ALIMENTOS ............................................................................................ 37

2.4.1. Produção de nanoemulsões pelo método da temperatura de inversão de fases ....... 38

3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 44

3.1. OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 44

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 44

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 45

4.1. MATERIAIS ................................................................................................................... 45

4.1.1. Amostras de queijo Minas Padrão ........................................................................... 45

4.1.2. Produção das nanoemulsões .................................................................................... 45

4.1.3. Análises microbiológicas ......................................................................................... 46

4.2. MÉTODOS ..................................................................................................................... 47

4.2.1. Produção das nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano pelo método

de inversão de fases (método PIT) ......................................................................................... 47

4.2.2. Identificação dos fungos encontrados nas amostras de queijos Minas Padrão ................ 48

4.1.3. Ensaios in vitro para avaliação da ação antifúngica das nanoemulsões .................. 50

4.1.3.1. Preparo da suspensão de esporos de fungos ..................................................... 50

4.1.3.2. Avaliação da inibição do crescimento dos fungos deteriorantes ...................... 50

4.1.4. Produção e caracterização do queijo tipo Minas Padrão ......................................... 51

4.1.5. Avaliação da ação antifúngica das nanoemulsões em queijos Minas Padrão ......... 52

4.1.6. Avaliação da contaminação fúngica do queijo Minas Padrão adicionado com

nanoemulsões contendo óleo de orégano ............................................................................... 53

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 55

5.1. IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS MAIS COMUMENTE ENCONTRADOS NAS

AMOSTRAS COMERCIAIS DE QUEIJO MINAS PADRÃO ............................................... 55

5.2. ENSAIOS IN VITRO PARA AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIFÚNGICA DAS

NANOEMULSÕES ................................................................................................................... 63

5.3. AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIFÚNGICA DAS NANOEMULSÕES EM QUEIJOS

MINAS PADRÃO ..................................................................................................................... 71

5.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE

ORÉGANO NANOEMULSIONADO EM QUEIJOS MINAS PADRÃO NO AMBIENTE DE

MATURAÇÃO .......................................................................................................................... 85

6. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 89

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .............................................................. 90

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 91

ANEXOS .................................................................................................................................... 106

20

1. INTRODUÇÃO

Atualmente, o Brasil é o sexto produtor mundial de queijo, com mais de 1 milhão de toneladas

produzidas em 2014. O estado de Minas Gerais apresenta-se como grande destaque na produção

de queijos de relevante importância tanto econômica quanto social, sendo que os principais queijos

artesanais produzidos no Estado estão concentrados nas regiões da Serra da Canastra, Serro, Araxá,

Alto Paranaíba e Campos das Vertentes. Entre os queijos considerados genuinamente brasileiros,

por terem sido desenvolvidos localmente, encontram-se o queijo Prato, Minas Frescal, Minas

Padrão, Minas Meia-Cura, queijo do Reino, Requeijão e Queijo de Coalho, sendo o queijo Minas

o mais produzido no estado de Minas Gerais, além de poder ser encontrado em praticamente todo

o país, ocupa o terceiro lugar na produção nacional de queijos.

O queijo Minas Padrão, é um queijo prensado, semicurado, de umidade alta e semigordo. É

produzido a partir de leite pasteurizado e apresenta cor, odor e sabor diferenciado. É um produto

que precisa refrigeração durante o armazenamento e comercialização, já que elevadas temperaturas

causam diminuição na sua qualidade. Embora seja um queijo muito fabricado e bastante consumido

no país, ainda não se tem descrito um regulamento técnico que vigie sua identidade, qualidade e

padronização.

O queijo Minas Padrão por ser classificado como queijo de alta umidade, pode ser atingido por

um sem número de microrganismos patogênicos como por exemplo Staphylococcus aureus,

Salmonella e Listeria monocytogenes, no entanto, por se tratar de um produto maturado, não é só

susceptível a ser contaminado por este tipo de bactérias patógenas durante o processo de produção,

mas também por fungos patogênicos no processo de maturação, devido a ficar exposto ao ambiente

por longos períodos de tempo. A grande preocupação é que a legislação vigente não estabelece

limites para contaminação por fungos e leveduras, pois além de causar problemas na qualidade e

vida de prateleira do queijo, podem causar doenças transmitidas por alimentos.

Por outro lado, devido ao crescente interesse da indústria por substituir agentes conservadores

sintéticos por conservadores naturais, surge a possibilidade de usar os óleos essenciais como

mecanismos de conservação dos alimentos. Os óleos essenciais são substâncias complexas

formadas por dezenas de compostos diferentes, oriundas de diferentes partes das plantas como

raízes, folhas, sementes e cascas. A qualidade do óleo essencial de orégano está representada pela

mistura dos seus principais compostos ativos como o carvacrol, o timol, o cimeno, o terpineno. O

21

crescente interesse no uso do óleo essencial de orégano na preservação de alimentos se deve ao

fato de possuir um amplo espectro de atividade antimicrobiana e antifúngica. O timol e o carvacrol

principais princípios ativos do óleo de orégano apresentam conhecida atividade inibitória contra

uma ampla gama de bactérias, diversas leveduras e fungos filamentosos. Como exemplo cabe

destacar a eficácia do timol contra bactérias como E. coli, Listeria monocytogenes e

Staphylococcus aureus, Salmonella thyphymorium e leveduras como Saccharomyces cereviseae;

por sua vez, o carvacrol é eficaz contra fungos, como Aspergillus, e bactérias patogênicas como

Salmonella, E. coli, S. thyphimorium, Listeria monocytogenes e Bacillus cereus.

Em alimentos, altas concentrações de óleos essenciais são necessárias para conseguir o mesmo

efeito antimicrobiano exercido por conservadores sinteticos, tais concentrações podem, muitas

vezes, causar efeitos sensoriais desagradáveis para os consumidores, desencadeando rejeição do

consumidor ao produto alimentício.

Do ponto de vista tecnológico o emprego de óleos essenciais na conservação de alimentos,

entretanto, enfrenta alguns desafios, como baixa estabilidade durante a armazenagem devido à sua

alta volatilidade e a dificuldade de incorporação em formulações aquosas, já que se trata de

substâncias hidrofóbicas. Com a finalidade de contornar tais desvantagens, a nanoencapsulação

tem sido proposta como alternativa, visando, além de aumentar a solubilidade dos óleos essenciais

em formulações aquosas, o aumento da sua estabilidade química durante o tempo de armazenagem

e, em alguns casos, até mesmo a melhora da sua ação antimicrobiana. Devido ao seu tamanho

nanométrico, estes sistemas podem interagir de modo mais eficiente com a matriz alimentícia a ser

conservada, possibilitando o controle da liberação dos compostos ativos do óleo essencial. Dentre

os diferentes nanossistemas que podem ser empregados com este objetivo são as nanoemulsões.

Tratam-se de sistemas emulsionados que possuem gotas com tamanho médio entre 20 e 200 nm;

são sistemas translúcidos a olho nu e possuem baixa estabilidade termodinâmica, mas, exibem alta

estabilidade cinética, o que os pode tornar estáveis por um longo tempo de armazenagem; a baixa

viscosidade e transparência óptica os fazem extremamente atraentes para utilização na área

farmacêutica e de alimentos.

Há duas abordagens para a produção de nanoemulsões, a primeira categoria envolve a adição

de grande quantidade de energia no sistema (processos de alta energia), e a segunda categoria

envolve adição de baixa quantidade de energia (processos de baixa energia). Mas, os processos de

22

alta energia muitas vezes são extremamente dispendiosos para aplicações industriais,

especialmente quando se deseja um tamanho médio de partícula muito pequeno.

A produção de nanoemulsões por métodos de baixa energia pode ser classificada em auto-

emulsificação, onde o fenômeno ocorre devido a fatores como mudança de composição do sistema,

variação de condições ambientais e condições de mistura; e métodos de transição de fase fazem

uso da energia química liberada durante a transição de fases que ocorre durante o processo de

emulsificação.

Dentre as metodologias de transição de fase está o método PIT (do inglês, phase inversion

temperature), baseado na mudança de solubilidade de tensoativos polietoxilados não-iônicos com

a temperatura, resultando, na inversão de emulsões O/A em emulsões A/O, tal método de

emulsificação leva à formação de nanoemulsões extremamente estáveis quando o sistema for

inicialmente emulsificado perto da temperatura PIT (TPIT) e a seguir resfriado rapidamente.

Dentro deste contexto, este trabalho de Mestrado teve como objetivos avaliar a atividade

antifúngica in vitro do óleo essencial de orégano nanoemulsionado e sua eficácia como agente

antifúngico em queijo Minas Padrão.

23

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA DA PRODUÇÃO DE QUEIJOS NO BRASIL

Atualmente, a indústria de queijos ocupa lugar de destaque na economia global, sendo os

Estados Unidos o maior produtor, e responsável por 26% da produção mundial, enquanto o Brasil

ocupa a sexta posição, com 1,1 milhão toneladas produzidas em 2014 (NUNES-FILHO, 2012;

SCARCELLI, 2015). O Brasil, com uma produção de 24,7 bilhões de litros de leite em 2014,

apresenta a quinta posição entre os maiores produtores mundiais deste produto (EMBRAPA, 2012;

IBGE, 2015), sendo 11 bilhões de litros deste montante destinado à fabricação de queijo,

demonstrando a importância social e econômica de tal produto no país (SCARCELLI, 2015). No

Brasil, o estado de Minas Gerais apresenta-se tradicionalmente com grande destaque na produção

de leite e produtos lácteos, sendo a produção de queijos de relevante importância tanto econômica

quanto socialmente (DE ALMEIDA et al., 2011). O estado de Minas Gerais é o maior produtor de

queijos e o responsável pela metade do consumo nacional, sendo gerador de empregos para

aproximadamente 30 mil famílias. Os principais queijos artesanais produzidos no estado de Minas

Gerais estão concentrados nas regiões da Serra da Canastra, Serro, Araxá, Alto Paranaíba e Campos

das Vertentes (SILVA, 2007; DE ALMEIDA et al., 2011).

O primeiro evento de importância para o desenvolvimento da indústria queijeira no Brasil

ocorreu em 1880, quando o português Carlos Perreira de Sá Fortes trouxe dois mestres queijeiros

da Holanda, que introduziram na Zona da Mata mineira (atualmente na região da cidade de Santos

Dumont, localizada na Serra da Mantiqueira) uma adaptação do queijo edam. Em 1920, o

dinamarquês Thovard Nielsen escolheu a região do Alto Rio Grande, no sul de Minas Gerais, para

produzir o queijo de massa semicozida, inspirado nos tradicionais tybo e danbo, e que foi

denominado queijo tipo prato. Os dinamarqueses fundaram as mais tradicionais indústrias de queijo

do país, e deram início à produção de diversas variedades europeias (gorgonzola, gruyère, gouda,

port-salut e camembert). A disseminação destas variedades de queijos pelo país foi bem lenta,

porque exigiam condições de produção e maturação especiais, ficando, por isso, conhecidos como

queijos finos. O contrário ocorreu com o queijo prato, que era de mais fácil produção, e exigia

menos conhecimento das técnicas de queijaria (CHALITA et al. 2009).

O consumo de queijos no Brasil gira em torno de 5 kg per capita, considerado baixo em

comparação a outros países como Argentina e França, em que o consumo é de 11 e 23 kg per capita,

24

respectivamente. As tendências, entretanto, apontam que tem havido um crescimento do consumo.

Quase 50% do consumo ainda é de mussarela e prato para uso culinário, porém, o consumo de

queijos finos vem aumentando significativamente (CHALITA et al., 2009; ABIQ, 2011;

SCARCELLI, 2015).

Tecnicamente, entende-se por queijo o produto fresco ou maturado que se obtém por separação

parcial do soro do leite ou leite reconstituído (integral, parcial ou totalmente desnatado) ou de soros

lácticos, coagulados pela ação física do coalho, enzimas específicas de bactérias específicas, de

ácidos orgânicos, isolados ou combinados, todos de qualidade apta para uso alimentar, com ou sem

agregação de substâncias alimentícias e/ou especiarias e/ou condimentos, aditivos especificamente

indicados, substancias aromatizantes e matérias corantes (BRASIL, 1952).

A legislação vigente (BRASIL, 1996), classifica os queijos de acordo com o conteúdo de

gordura e de umidade, conforme explicitado nas Tabelas 1 e 2. Entre queijos considerados

genuinamente brasileiros, por terem sido desenvolvidos localmente, encontram-se o queijo Prato,

Minas Frescal, Minas Padrão, Minas Meia-Cura, Reino, Requeijão e Queijo de Coalho, os quais se

caracterizam por estar dentro destas classificações.

Tabela 1. Classificação de queijo de acordo ao teor de gordura (fonte: BRASIL, 1996; Borges do Carmo,

2013).

Classificação % gordura

Extra gordo ou duplo creme ≥ 60 %

Gordos 45 – 59,9 %

Semigordo 25 – 44,9 %

Magros 10 – 24,9 %

Desnatados <10%

25

Tabela 2. Classificação de queijo de acordo ao teor de umidade (fonte: BRASIL, 1996; Borges do Carmo,

2013).

Classificação % umidade

Baixa umidade (massa dura) ≤ 35,9 %

Media umidade (massa semidura) 36 – 45,9 %

Alta umidade (massa branda ou “macios) 46 – 54,9 %

Muito alta umidade (massa branda ou “moles”) >55%

2.2. QUEIJO MINAS

Segundo Santos et al. (1997), o queijo Minas é um dos produtos lácteos brasileiros mais

importantes, podendo ser encontrado em praticamente todo o país, e ocupando o terceiro lugar na

produção nacional de queijos. Esta tendência é justificada pela simplicidade de sua tecnologia de

fabricação, pelo alto rendimento e pelo baixo investimento em sistemas de estocagem e

conservação (ZARBIELLI et al. 2004).

O queijo tipo Minas é produzido por coagulação enzimática, e possui massa crua, forma

cilíndrica, diâmetro cerca de duas vezes a altura e pode pesar entre 0,3 e 5 kg, sendo normalmente

classificado em Minas Frescal, Minas Padrão ou Meia-Cura, e Minas Artesanal ou curado

(OLIVEIRA, 1986).

O queijo Minas Frescal (ilustrado na Figura 1) é produzido com leite de vaca pasteurizado, tem

baixa acidez e sua vida de prateleira é bem curta (em torno de 9-10 dias sob refrigeração). É

classificado como um queijo macio, semi-gordo, de alta umidade, tem cor esbranquiçada e odor

suave (PERRY, 2004).

Figura 1. Aparência de queijo Minas Frescal (fonte: Charcutaria.org)

26

Por sua vez, o queijo Minas curado é feito com leite não-pasteurizado e deve ser conservado à

temperatura ambiente, tem sabor relativamente forte, consistência bastante dura, baixa umidade, e

só pode ser comercializado depois do processo de maturação de 60 dias (ilustrado na Figura 2)

(OLIVEIRA, 1986; PERRY, 2004).

Figura 2. Aparência de queijos tipo Minas curado (fonte: FETAEMG)

2.2.1. Queijo Minas Padrão

Dentre os queijos mais antigos e originalmente brasileiros, está o queijo Minas Padrão, cuja

origem remonta ao século 19, sobretudo em Minas Gerais. Esta variedade de queijo, ilustrada na

Figura 3, originou-se de variedades distintas que foram aperfeiçoando ao longo da história,

resultando em queijos com identidades próprias, dependendo da região o queijo Minas Padrão

também é denominado Minas Meia-Cura, Minas curado ou, ainda, Minas prensado (FURTADO;

LOURENÇO NETO, 1994; LONDOÑO; FURTADO; ABREU, 1999).

27

Figura 3. Aparência de queijos Minas Padrão (fonte: Queijos do Brasil)

O RIISPOA (REGULAMENTO DA INSPEÇÃO INDUSTRIAL E SANITÁRIA DE

PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL) define o queijo Minas Padrão como um produto obtido de

leite integral ou padronizado, pasteurizado, de massa crua, prensado mecanicamente e devidamente

maturado durante vinte (20) dias. Além disso, deve apresentar formato cilíndrico, massa entre 1 e

1,2 kg, crosta fina amarelada, consistência semidura tendendo a macia, eventualmente com

pequenos buracos devido ao prensado mecânico; cor homogênea branco-creme; odor característico

e sabor ácido agradável (BRASIL, 1952). Para o queijo Minas Padrão tradicional, em termos de

composição, espera-se teores de umidade entre 46%-49%, gordura de 23%-25% e cloreto de sódio

entre 1,4%-1,6%; o pH deve-se situar entre 5,0 e 5,2 (FURTADO; LOURENÇO NETO, 1994).

Por suas características, este tipo de queijo precisa de refrigeração durante todo o período de

armazenamento e comercialização, pois temperaturas elevadas causam excesso de acidificação e

proteólise, originando sabores fortes, e tendência da diminuição da consistência (OLIVEIRA,

1986).

Embora seja um queijo muito fabricado e, consequentemente, bastante consumido, não só no

estado de Minas Gerais mas em grande parte do Brasil, ainda não se tem descrito o Regulamento

Técnico de Identidade e Qualidade desse produto, o que prejudica em muito sua padronização. O

28

queijo Minas Padrão é classificado como queijo de alta úmidade. Para este tipo de produtos a

legislação estabelece limites de contaminação para coliformes a 30 e 45°C, Staphylococcus

coagulase positiva, Salmonella sp. e Listeria monocytogenes (BRASIL, 1996; BRASIL, 2001).

O queijo Minas Padrão, por se tratar de um produto maturado, não é só susceptível a ser

contaminado por bactérias patógenas durante o processo de produção mas também por fungos

patogênicos no processo de maturação, onde fica exposto ao ambiente por longos períodos de

tempo, o que pode gerar grande preocupação pois a legislação vigente não estabelece limites para

contaminação por este tipo de microrganismos, os quais têm igual relevância na questão de

conservação dos queijos quanto as bactérias (coliformes, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. e

Listeria monocytogenes), pois também podem causar doenças transmitidas por alimentos.

2.2.1.1. Contaminação fúngica em queijos maturados

As diferenças entre o queijo Minas Padrão e o queijo Minas frescal além do teor de umidade e

a quantidade de sal, durante o processo de produção, é o processo de maturação; esta etapa é

resultante do conjunto de ações de ordem bioquímica e bacteriológica simultâneas ou sucessivas,

que permitem transformar a coalhada fresca em queijo. No curso da maturação, os componentes

da coalhada fresca se transformam em diferentes produtos mais solúveis, é a natureza destes novos

produtos o que faz com que cada queijo tenha suas características típicas e o faça diferente das

demais variedades (BONASSI, 1985; AMIOT, 1991). No processo de maturação ocorrem três

principais fenômenos, proteólise; lipólise e fermentações, os quais são responsáveis pelas

características organolépticas dos queijos submetidos a maturação (BOURGEOIS, 1995;

ROBINSON, 1987).

A maturação é umas das etapas mais exigentes com relação à qualidade final e ao risco

econômico na fabricação do queijo (OLIVEIRA, 1986). Além dos controles das condições

ambientais dentro das câmaras (temperatura entre 12-14 ºC e umidade relativa 85%), o principal

cuidado é em relação às transformações indesejáveis produzidas geralmente por microrganismos

contaminantes que podem estar presentes no leite ou atingirem os queijos durante a fabricação,

ainda, durante a cura, causando grandes danos (OLIVEIRA, 1986).

O crescimento de fungos pode causar modificações nas características físico-químicas,

microbiológicas e sensoriais que podem comprometer a qualidade dos mesmos ao causar alteração

de sabor, descoloração, apodrecimento, formação de esporos patogênicos e alergênicos, e até

29

produção de micotoxinas (FILTENBORG et al., 1996; PERRY, 2004). As contaminações por

fungos normalmente ocorrem após o processamento, e reduzem o tempo de vida de prateleira

desses alimentos (PITT; HOCKING, 2009).

Diversos estudos demostram que fungos filamentosos estão envolvidos na deterioração dos

queijos, sobretudo em queijos submetidos a processos de maturação. A Tabela 3 relata alguns

estudos de gêneros isolados de diferentes tipos de queijos que promovem a sua deterioração:

Tabela 3. Gêneros e espécies de fungos filamentosos comumente presentes como agentes contaminantes

em queijos maturados

Tipo de queijo Gênero ou espécie de

fungo Referência

Queijo suave e semiduro

Penicillium commune

Lund et al., 1995 Penicillium palitans

Penicillium nalgiovense

Penicillium verrucosum

Queijo Espanhol

Penicillium sp.

Barrios et al., 1998 Mucor sp.

Geotrichum candidum

Queijo de cabra e ovelha Penicillium sp. Montagna et al., 2004

Queijo Cabrales

Penicillium sp.

Flórez et al., 2007 Penicillium roqueforti

Geotrichum candidum

Acremonium charticola

Queijo Camembert e Brie

Cladosporium

cladosporiodes

Arteau e Labrie, 2010

Geotrichum candidum

Mucor racemosus

Penicillium camemberti

Penicillium caseicola

Penicillium chysogenum

Penicillium commune

30

Penicillium roqueforti

Queijo Fossa Penicillium sp.

De Santi et al., 2010 Aspergillus sp.

Queijo de cabra Penicillium sp. Båth et al., 2012

Queijo Teleggio Penicillium commune

Panelli et al., 2012 Cladosporium sp.

Queijo Romy ou Ras

Geotrichum candidum

El-Fadaly et al., 2015

Aspergillus ochraceus

Aspergillus alliaceus

Aspergillus oryzae

Aspergillus niger

Aspergillus nidalus

Emericella nidularis

Aspergillus flavus

Aspergillus glaucus

Aspergillus flavipes

Penicillium sp.

Mucor sp.

Rhizopus stolonifer

No caso dos queijos duros e semiduros como o Minas Padrão, o crescimento de fungos é evitado

através de revestimentos convencionais ou de trabalhosos processos de limpeza das câmaras de

maturação e dos queijos em maturação, recorrendo a várias técnicas existentes (HOOFT;

DIETRICH, 2014).

Existem dois processos convencionais para a maturação e proteção de queijos duros e

semiduros; o primeiro deles é conhecido como “maturação natural” o qual envolve secar o queijo

ao ar e aplicar um revestimento contendo inibidores e/ou banhos de natamicina (fungicida ativo)

para protegê-lo contra o crescimento de fungos. Na maturação natural, como alternativa ao

revestimento, durante e após a maturação, a superfície pode ser lavada com diferentes agentes de

limpeza, posteriormente, ainda pode ser necessário limpá-los cortando as partes mofadas causadas

por bolores penetrantes. Além destes métodos, a indústria tenta controlar a qualidade do ar das

31

câmaras de maturação (HOOFT; DIETRICH, 2014). Este processo representa um alto custo para

o produtor seja pela mão de obra ou pelas perdas causadas na limpeza dos queijos.

O segundo processo envolve, logo após da salmoura, embalá-los em uma película plástica tipo

cryovac com selagem a vácuo e termo encolhível (OLIVEIRA, 1986). Este tipo de armazenamento

resulta em um produto macio, sem casca e com sabor típico de queijo novo, pois, o processo de

maturação não ocorre efetivamente como também não ocorre perda de umidade o desenvolvimento

das características próprias de um queijo maturado como o sabor e aroma (HOOFT; DIETRICH,

2014).

As maiores desvantagens que apresentam estes processos de conservação são a excessiva mão

de obra nos métodos de limpeza seja pela lavagem gerando possíveis sabores indesejáveis ou pela

retirada das partes mofadas resultando em perda direta do queijo e a mão de obra na manutenção

das câmaras de maturação; e dependendo do uso final do queijo o revestimento plástico poderia ser

ou não retirado resultando em mão de obra e descartes adicionais.

2.3. ÓLEOS ESSENCIAIS COMO AGENTES DE CONSERVAÇÃO

Os óleos essenciais são compostos aromáticos obtidos de matérias-primas vegetais (flores,

folhas, raízes, cascas), sendo caracterizados por alta volatilidade e por composição complexa

(BURT, 2004). São formados por metabólitos secundários de plantas aromáticas. Atualmente, são

conhecidos aproximadamente 3000 óleos essenciais, dos quais 300 são comercializados

especialmente para as indústrias farmacêutica, de alimentos, agronômica, cosmética e de

perfumaria (BURT, 2004; BAKKALI et al., 2008), devido ao fato de possuírem conhecida ação

antimicrobiana, ação antifúngica, além, obviamente, de seu caráter aromático.

Embora a ação antimicrobiana dos óleos essenciais seja amplamente conhecida e comprovada,

o seu mecanismo de ação ainda não foi completamente explicado em detalhes (LAMBERT et al.,

2001). Devido ao grande número de compostos químicos presentes nos óleos essenciais, o mais

provável é que sua atividade antibacteriana não seja atribuível a um mecanismo específico

(CARSON et al., 2002). Os mecanismos mais comumente aceitos como responsáveis pela ação

antimicrobiana são: degradação da parede celular; dano à membrana citoplasmática; danos às

proteínas da membrana; perda dos componentes celulares; coagulação do citoplasma e diminuição

do fluxo de prótons através da membrana celular (BURT, 2004). Em relação à atividade

antifúngica, diversos estudos também têm demonstrado o potencial dos óleos essenciais em evitar

32

a proliferação de espécies como Aspergillus, Microsporum, Mucor, Penicillium, Eurotium,

Debaryomyces, Pichia, Zygosaccharomyces e Candida em alimentos (THOMPSON et al., 1989;

CONSENTINO et al., 2003; HOLLEY; PATEL, 2005; SACCHETTI et al., 2005; CARSON;

HAMMER, 2011).

Dentre os óleos essenciais mais estudados devido às boas propriedades antifúngicas, se destaca

o óleo essencial de orégano (Origanum vulgare). O orégano é uma erva rizomatosa, baixa e

rastreira; seus ramos são longos, pardo-esverdeados que se enraízam em contato com o solo; as

folhas são pequenas, ovaladas, de cor verde e pubescentes (CASTRO; RAMOS, 2003). Trata-se

de uma planta de espécie condimentar, perene, pertencente à família das Lamiaceae, muito

utilizada na culinária, panificação e flavorizante de alimentos. A espécie é originaria da região

mediterrânea da Europa, Norte da África e Oriente Médio. A espécie foi aclimatada na América do

Norte e nas regiões áridas da América do Sul.

O óleo essencial de orégano representa uma porcentagem de 0,15 – 0,40% na planta verde,

possui sabor levemente picante, sendo o mesmo de cor amarelo-limão e de aroma intenso

(CASTRO; RAMOS, 2003). A qualidade do óleo essencial é representada pela mistura dos seus

compostos ativos como o carvacrol, o timol, o cimeno, o terpineno, entre outros (LAMBERT et

al., 2001; RHAYOUR et al., 2003). A Tabela 4 mostra os principais compostos ativos do óleo

essencial de orégano:

Tabela 4. Compostos ativos do óleo de orégano (fonte: Burt, 2004).

Componentes % Composição

Carvacrol Vestígios a 80%

Timol Vestígios a 64%

-Terpineno 2 – 52%

p-Cimeno Vestígios a 52%

O crescente interesse no uso deste óleo essencial na preservação de alimentos se deve ao

fato de possuir um amplo espectro de atividade antimicrobiana (SOUZA et al., 2009). O timol e o

carvacrol principais princípios ativos do óleo de orégano (Figura 4), são substâncias incoloras,

isômeras que pertencem ao grupo dos terpenos; têm conhecida atividade antibacteriana,

33

antifúngica, analgésica e antioxidante por isso são amplamente utilizados na indústria cosmética,

de higiene e de alimentos.

Figura 4. Estrutura química do carvacrol e o timol principais princípios ativos do óleo essencial de orégano

(O. vulgare) (fonte: Burt, 2004).

O timol apresenta uma conhecida atividade inibitória contra uma ampla gama de bactérias,

incluindo E. coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella thyphymorium e

diversas leveduras, como Saccharomyces cereviseae; por sua vez, o carvacrol é eficaz contra

fungos, como Aspergillus, e bactérias patogênicas como Salmonella, E. coli, S. thyphimorium,

Listeria monocytogenes e Bacillus cereus (GAYSINSKY, 2007; CARMO et al., 2008). Todos estes

microrganismos são conhecidos por causar diversas doenças relacionadas com a ingestão de

alimentos.

A literatura científica relata um grande número de pesquisas em que se estuda o efeito inibidor

do óleo essencial de orégano contra o crescimento bacteriano e fúngico, no entanto, são poucas as

pesquisas relatadas no uso deste óleo essencial como preservativo natural e agente antimicrobiano

em alimentos. As pesquisas aqui citadas são dos últimos cinco anos.

Almeida et al. (2010) avaliaram a eficácia e os possíveis mecanismos envolvidos no

estabelecimento da atividade antifúngica dos óleos essenciais de O. vulgare L. e O. majorana L.

na inibição do crescimento e sobrevivência de fungos patogênicos, e observaram que o óleo

essencial de O. vulgare apresentou menor concentração inibitória mínima que O. majorana. A

linhagem C. krusei foi única resistente a todas as concentrações de ambos os óleos essenciais.

Ambos os óleos essenciais proporcionaram um efeito bactericida in vitro frente a C. albicans, O.

vulgare apresentou inibição total do crescimento micelial radial frente ao T. rubrum. O. vulgare

reduziu a conidação, produziu vazamentos do citoplasma, perda de pigmentação e perturbações à

estrutura molecular no A. flavus. Os autores concluíram que os óleos essenciais de Origanum

Carvacrol Timol

34

podem ser considerados como compostos antifúngicos potenciais para controlar o crescimento de

fungos patogênicos e a aparição de micose.

Por sua vez, Cueto-Wong et al. (2010) determinaram a atividade antifúngica do orégano

mexicano sobre o crescimento micelial do fungo Fusarium oxysporum em sementes de tomate.

Encontraram que a produção de biomassa foi totalmente inibida. A concentração de 0.5% do óleo

essencial inibiu completamente a colonização que havia nas sementes sem afetar sua capacidade

de germinação. Desta forma, concluíram que os resultados obtidos apresentam o potencial do

orégano mexicano como importante inibidor, assim como agente fungicida de F. oxysporum em

sementes de tomate.

Por sua vez, os estudos desenvolvidos por Gumus et al. (2010) analisaram as propriedades

inibitórias de diferentes concentrações de óleos essenciais (cítricos, laurel, murta, orégano y

segurelha) obtidos por destilação de vapor, sobre o Aspergillus fumigatus e o Paecilomyces variotii,

isolados da margarina. Encontraram que o poder inibitório seguiu a seqüência: cítricos, orégano,

segurelha, laurel y murta, da mesma forma encontraram que o P. variotii foi mais resistente aos

óleos essenciais que o A. fumigatus. Concluíram que os resultados mostram a possibilidade de usar

estes compostos como conservantes naturais em alimentos.

Já Mitchell et al. (2010) avaliaram o efeito inibitório in vitro de diferentes concentrações de

óleo essencial de Origanum vulgare L. sobre o crescimento de Aspergillus flavus, Aspergillus

parasiticus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus e Aspergillus ochraceus. Observaram que

o óleo essencial apresentou um efeito inibitório significativo sobre todos os fungos analisados,

afetando o crescimento micelial radial, a massa micelial, a viabilidade e a germinação de esporas

e provocando alterações morfológicas. Concluíram que estes resultados mostraram que o óleo

essencial de O. vulgare exerce um efeito fungitóxico significativo, suportando seu uso como agente

antifúngico na conservação de alimentos.

Martín-Sánchez et al. (2011) avaliaram a atividade antifúngica superficial do óleo essencial de

orégano em salsichões espanhóis fermentados e curados e seu efeito sobre a lipólise, proteólise e

características sensoriais. Encontraram que a aplicação do óleo de orégano diminuiu a

contaminação fúngica na superfície sem afetar o processo de secagem. A adição do óleo essencial

de orégano aumentou os ácidos graxos insaturados, mas a lipólise não foi grandemente afetada. As

mudanças proteolíticas se mostraram similares aos padrões em todas as salsichas. O óleo de

orégano não afetou as características sensoriais, mas aumentou a dureza, melhorando a textura.

35

Concluíram que o uso de óleo essencial de orégano é uma alternativa como antifúngico natural

para aplicação de produtos cárneos curados.

Por sua vez, Kocić-Tanackov et al. (2012) avaliaram o efeito antifúngico de extrato de orégano

sobre três espécies de Aspergillus (A. niger, A. carbonarius, A. wentii). Encontraram que a baixas

concentrações (0,025ml/ml) o extrato de orégano inibiu completamente o crescimento de

Aspergillus wentii enquanto o crescimento de Aspergillus carbonarius e Aspergillus niger foi

inibido em 96% e em 46% respectivamente. Concluíram que o extrato pode ser usado como um

preservativo para prevenir infecções fúngicas de origem alimentar e produção de micotoxinas.

Por sua vez, Timóteo dos Santos et al. (2012) avaliaram a eficácia da aplicação de quitosana

combinada com óleo essencial de orégano na inibição in vitro e em uva (Vitis labrusca L.) de

Rhizopus stolonifer e Aspergillus niger. Encontraram que a CMI para quitosana e óleo de orégano

foi de 10 mg/ml e 10 l/ml respectivamente para ambas espécies de fungos. Enquanto à

combinação, o R. stolonifer foi inibido numa concentração de 5 mg/ml quitosana+5 l/ml óleo de

orégano e o A. niger foi inibido apenas como uma concentração de 5 mg/ml quitosana+2,5 l/ml

óleo de orégano. Além disso a aplicação do revestimento composto de quitosana e óleo essencial

de orégano preservou a qualidade física, físico-química e sensorial das uvas ao longo do

armazenamento. Concluíram que os resultados obtidos demonstraram o potencial da combinação

para o controle pós-colheita de fungos patogênicos em frutas.

Em outro estudo Lima de Sousa et al. (2013) avaliaram a eficácia da aplicação de óleos

essenciais de orégano e alecrim de forma separada e combinada sobre o crescimento in vitro e em

uva (Vitis lebrusca L.) de Aspergillus flavus e Aspergillus niger. Encontraram que a CMI para óleo

de orégano e óleo de alecrim foi de 0,25 e 1 l/ml respectivamente em ambas espécies de fungos.

Enquanto à mistura dos óleos essenciais, o crescimento das duas espécies de fungos foi inibido em

concentrações muito menores (¼ da CMI de cada óleo essencial). Em uva, o óleo de orégano inibiu

completamente o crescimento das duas espécies de fungos na concentração inibitória mínima. Para

A. niger a combinação de óleos essenciais na concentração de ¼ da CMI de cada óleo essencial

apresentou maior efeito inibidor, enquanto para o A. flavus o maior efeito da mesma combinação

se apresentou na concentração de ½ da CMI de cada óleo essencial. Concluíram que a aplicação

dos óleos preservou a qualidade das uvas e a combinação deles mostrou ter potencial no controle

pós-colheita de fungos patogênicos em frutas.

36

Santin et al. (2014) avaliaram a atividade antifúngica do óleo essencial de orégano frente a

isolados clínicos de Malassezia pachydermatis, levedura causante de otites e dermatites em

pequenos animais. Encontraram que para os 42 isolados de M. pachydermatis as CMI e CFM

variaram entre 0,87 – 7 mg/ml, permitindo determinar que este microrganismo é sensível ao efeito

do óleo essencial de orégano. Concluíram que o óleo essencial de orégano se apresenta como

promissor na bioprospecção de novos fármacos para o tratamento de otites e dermatites na clínica

de pequenos animais.

Stević et al. (2014) avaliaram as propriedades antifúngicas de 16 óleos essenciais sobre o

crescimento de vinte um (21) espécies diferentes de fungos. Encontraram que os óleos de sagurelha,

orégano, tomilho e rosa foram apresentaram o melhor efeito inibitório sobre todas as espécies de

fungos avaliadas. Concluíram que os óleos de sagurelha, orégano, tomilho e rosa representam uma

boa base para a formulação de produtos com potencial eficácia no controle de fungos, além disso,

numa possível aplicação em larga escala, usando pequenas concentrações dos óleos podem trazer

efeitos econômicos positivos.

Stupar et al. (2014) avaliaram efeito inibitório dos óleos essenciais de orégano, alecrim e

lavanda e um efetivo biocida (cloreto de benzalcônio) sobre o crescimento de A. niger, A.

ochraceus, B. spicifera, Penicillium sp. e T. viride. Encontraram que óleo essencial de orégano

apresentou o maior efeito inibitório sobre as espécies de fungos avaliadas, seguido pelo óleo de

lavanda e por último pelo óleo de alecrim. Concluíram que os resultados confirmaram o bem

conhecido efeito inibitório do Cloreto de Benzalcónio e sugeriram o uso potencial dos óleos

essenciais como novos agentes biocidas na conservação do patrimônio cultural. Além disto

sugeriram que os óleos essenciais podem ser uma boa alternativa para os biocidas existentes devido

à sua baixa toxicidade aos mamíferos, susceptibilidade à degradação e sua alta atividade inibitória.

Já Zabka et al. (2014) avaliaram a atividade antifúngica de vinte (20) óleos essenciais diferentes

sobre o crescimento deAlternaria alternata, Stochybotrys chartarum, Cladosporium

cladosporoides e Aspergillus niger. Os autores observaram que o óleo essencial de orégano teve a

maior eficácia de inibição do crescimento sobre as espécies de fungos avaliadas, e concluíram que,

devido a sua segurança ambiental e ser de origem natural, os óleos essenciais oferecem um

potencial para tornar-se uma alternativa quando o uso de fungicidas sintéticos não podem ser

usados por diferentes razões.

37

No entanto, normalmente altas concentrações de óleos essenciais são necessárias para

conseguir o mesmo efeito antimicrobiano em alimentos exercido por os agentes conservadores

sintéticos. Tais concentrações necessárias para inibir o crescimento de patógenos em alimentos

podem, muitas vezes, causar efeitos sensoriais desagradáveis para os consumidores. A adição de

pequenas quantidades de outros conservantes naturais em conjunto com o óleo essencial pode ser

uma forma de proporcionar o equilíbrio entre a aceitabilidade sensorial e eficácia antimicrobiana

(GUTIERREZ et al., 2008; NAVEENA et al., 2006).

Do ponto de vista tecnológico de aplicação dos óleos essenciais como conservantes

alimentícios, entretanto, uma grande desvantagem é sua limitada solubilidade em meio aquoso.

Com a finalidade de contornar tal desvantagem, a microencapsulação tem sido proposta como

alternativa, visando, além de aumentar a solubilidade dos óleos essenciais em formulações aquosas,

o aumento da sua estabilidade química durante o tempo de armazenagem e, em alguns casos, até

mesmo a melhora da sua ação antimicrobiana (NAMUR et al., 2006).

2.4. NANOEMULSÕES: PRODUÇÃO POR MÉTODOS DE BAIXA ENERGIA E

APLICAÇÕES EM ALIMENTOS

A nanotecnologia tem potencial para revolucionar o sistema alimentar mundial, pois através

dela se podem desenvolver, por exemplo: novos sistemas de segurança agrícola e alimentar;

métodos para liberação controlada de determinadas moléculas, como substâncias bioativas

(ingredientes funcionais); nanosensores para detecção de patógenos e contaminantes;

nanodispositivos para detecção e registro das condições ambientais às quais os alimentos são

submetidos durante seu transporte, dentre outras aplicações (MORARU et al., 2003).

Particularmente, os sistemas de segurança alimentar são um campo de investigação altamente

promissor na área de alimentos em associação à nanotecnologia, especialmente na substituição de

aditivos (conservantes, por exemplo) artificiais por naturais. Os sistemas coloidais, como as

nanoemulsões, são alternativas promissoras para se alcançar os objetivos já citados (MORARU et

al., 2003).

Define-se como nanoemulsões os sistemas emulsionados que possuem gotas com tamanho

médio na faixa de 20 a 200 nm, e, devido a esta característica, são sistemas translúcidos a olho nu

e possuem baixa estabilidade termodinâmica, mas, por outro lado, exibem alta estabilidade cinética,

o que os pode tornar estáveis por um longo tempo de armazenagem (SOLANS et al., 2005;

38

MASON et al., 2006; SAGALOWICZ; LESER, 2010). A baixa viscosidade e transparência óptica

os fazem extremamente atraentes para utilização na área farmacêutica e de alimentos. Por se tratar

de sistemas em não-equilíbrio termodinâmico, as nanoemulsões não são sistemas formados

espontaneamente. Há duas abordagens para a produção de nanoemulsões, sendo que a primeira

categoria envolve a adição de grande quantidade de energia no sistema (processos de alta energia),

e a segunda categoria envolve adição de baixa quantidade de energia (processos de baixa energia).

No primeiro caso, a energia mecânica é inserida nos sistemas por equipamentos como

homogeneizadores a alta pressão, microfluidizadores ou pela aplicação de altos níveis de energia

ultrassônica (SPERNATH; MAGDASSI, 2007; ANTON et al., 2007; ANTON et al., 2008).

Entretanto, tais métodos muitas vezes são extremamente dispendiosos para aplicações industriais,

especialmente quando se deseja um tamanho médio de partícula muito pequeno.

2.4.1. Produção de nanoemulsões pelo método da temperatura de inversão de fases

A produção de nanoemulsões por métodos de baixa energia pode ser realizada por

metodologias classificadas em dois tipos: auto-emulsificação e métodos de transição de fase. De

modo geral, na auto-emulsificação o fenômeno ocorre devido a diversos fatores: mudança de

composição do sistema; variação de condições ambientais (pH, força iônica, temperatura);

condições de mistura (intensidade de agitação, taxa de adição dos componentes, ordem de adição

dos componentes) (MCCLEMENTS; RAO, 2011).

Por outro lado, os métodos de transição de fase fazem uso da energia química liberada durante

a transição de fases que ocorre durante o processo de emulsificação. Dentre tais metodologias está

o método PIT (do inglês, phase inversion temperature), baseado na mudança de solubilidade de

tensoativos polietoxilados não-iônicos com a temperatura (SOLANS et al., 2010; SHINODA,

1969), resultando, na inversão de emulsões O/A em emulsões A/O. Uma representação

esquemática da emulsificação pelo método PIT pode ser visualizada na Figura 5:

39

Figura 5. Representação esquemática da dependência da curvatura das camadas de tensoativo polietoxilado

com a temperatura, e sua influência na característica das emulsões (fonte: McClements e Rao, 2011).

Tal método de emulsificação foi inicialmente desenvolvido por Shinoda (1969) e Satio (1968),

e leva à formação de nanoemulsões extremamente estáveis, se o sistema for inicialmente

emulsificado perto da temperatura PIT (TPIT) e a serguir resfriado rapidamente (SCHALBART et

al., 2010). A Figura 6 mostra que no método PIT, a partir de certa temperatura, ocorre uma mudança

na curvatura do tensoativo, o que altera sua afinidade (na verdade, altera seu valor de HLB, ou

balanço hidrofílico-lipofílico) permitindo a migração para a outra fase e desta forma a transição de

uma emulsão O/A para uma emulsão A/O (FERNANDEZ et al., 2004; McCLEMENTS; RAO,

2011; SOLANS; SOLÈ, 2012). Na temperatura PIT, a curvatura do tensoativo é próxima a zero e

há a formação de estruturas bicontínuas ou lamelares (ANTON; VANDAMME, 2009;

IZQUIERDO et al., 2004). No ponto em que a curvatura do tensoativo é próxima a zero, as barreiras

que se opõem ao processo de coalescência são baixas e assim, a taxa de coalescência é

extremamente alta, e é por essa razão, que a temperatura do sistema deve ser diminuída

rapidamente, para que sejam produzidas nanogotas cineticamente estáveis ao longo do tempo

(SOLANS; SOLÈ, 2012).

Curvatura

O/A Emulsão

O/A Nanoemulsão

A/O Emulsão

Temperatura

Microemulsão

Bicontínua

Aquecimento Esfriamento

Após

inversão Antes

inversão

40

O tipo de tensoativo é muito importante no método PIT, só podendo ocorrer a transição de fases

por temperatura quando se utilizam tensoativos sensíveis a alteração de temperatura, como os

tensoativos não-iônicos polietoxilados, nos quais as mudanças de temperatura induzem uma

mudança na hidratação das cadeias de polioxietileno, o que permite a alteração de sua curvatura

(SAJJADI et al. 2004; SALAGER et al., 2004; ANTON; VANDAMME, 2009). De maneira

simplificada pode-se dizer que em baixas temperaturas, a cabeça de tais tensoativos é hidratada,

permitindo que eles sejam solúveis em água, enquanto que em temperaturas mais baixas as cabeças

polares se desidratam e assim, tal tensoativo se torna insolúvel em meio aquoso. A partir de uma

dada temperatura, denominada temperatura PIT, a afinidade do tensoativo com a fase oleosa e

aquosa é equilibrada e a tensão interfacial é, portanto, muito baixa, sendo a curvatura espontânea

do tensoativo igual a zero (MORALES et al. 2006; McCLEMENTS; RAO, 2011). Se o sistema for

rapidamente resfriado após a inversão de fases, ocorre a nanoemulsificação da fase oleosa.

Figura 6. Esquema do mecanismo de geração de nanoemulsões pelo método da temperatura de inversão de

fases (método PIT): (a) a temperatura do sistema está abaixo da temperatura PIT; (b) sistema durante o

aumento da temperatura, em que os tensoativos gradualmente se transformam em lipofílicos; (c) sistema na

temperatura PIT; (d) a temperatura é levada acima do PIT, a emulsão é invertida e a água é dispersa na

mistura óleo + tensoativo lipofílico. O sistema é então rapidamente resfriado, usando água diluída, tornando

subitamente o tensoativo hidrofílico e induzindo a espontaneidade e a rápida migração para a fase aquosa

(adaptado de Anton; Vandamme, 2009).

Tensoativo

fase oleosa

41

Por outro lado, devido ao fato da nanoencapsulação ser uma tecnologia emergente e haver

crescente interesse no uso dos óleos essenciais como agentes antimicrobianos (principalmente

como substitutos de aditivos artificiais), a literatura científica relata diversas pesquisas que estudam

a nanoencapsulação de óleos essenciais e seu método de produção. A Tabela 5, lista exemplos de

pesquisas realizadas com este enfoque nos últimos 4 anos:

Tabela 5. Estudos recentes sobre nanoencapsulação de óleos essenciais (publicados desde 2012)

Óleo essencial Tipo de

encapsulação

Método de

encapsulação Referências

Óleo essencial de orégano

Encapsulação em

esferas de amido

de arroz e capsulas

de inulina e

gelatina/sacarose

Spray drying Beirão da Costa et

al. (2012)

Óleo essencial de sálvia

Microencapsulação

em matriz de

proteína de soro

concentrado-

polissacarídeos

Spray drying Rodea-González

et al. (2012)


Encapsulação em

micropartículas de

amido

Impregnação por

fluido supercrítico

Almeida et al.

(2013)


Encapsulação em

nanopartículas de

quitosano

Gelificação iônica

Fakhreddin-

Hosseini et al.

(2013)

Óleo essencial de eucalipto

Nanoencapsulação

com quitosano e

Tween 80

Agitação

mecânica

Ribeiro et al

(2014)

Óleo essencial de

mandarina

Nanoemulsão com

óleo de girassol,

Homogeneização

por alta pressão

Severino et al.

(2014)

42

mono-oleato de

glicerol e Tween

20


Nanoemulsão O/A

com óleo essencial

e Tween 80

Ultrassonicação Bhargava et al.

(2015)

Óleo essencial de hortelã-

pimenta

Nanopartículas de

zeína,

propilenoligol e

goma arábica

Dispersão líquido-

líquido

Chen e Zhong

(2015)

Óleo essencial de eucalipto

Nanoencapsulação

em goma do

cajueiro

Spray dryer Herculano et al.

(2015)

Óleo essencial de Zataria

multiflora

Encapsulação em

nanopartículas de

quitosana

Gelificação iônica Mohammadi et al.

(2015)

Óleos essenciais de capim-

limão, cravo, árvore do

chá, tomilho, gerânio,

manjerona, palmarosa,

pau-rosado, sálvia e hortelã

Nanoemulsões

produzidas com

Tween 80 e

alginato de sódio

Microfluidização Salvia-Trujillo et

al. (2015)

Óleo essencial de tomilho

Nanogel de

quitosano e ácido

benzoico

Ultrassonicação Tahereh-Khalili et

al. (2015)

Óleo essencial de cominho

Nanogel de

quitosano e ácido

caféico

Ultrassonicação Zhaveh et al.

(2015)

Desta forma, é possível perceber que há um grande interesse no potencial do uso de

nanoemulsões encapsulando óleos essenciais na indústria de alimentos; no entanto, ainda é

necessário superar algumas barreiras tecnológicas. As principais desvantagens dos óleos essenciais

43

são apresentar curta vida de prateleira e dificuldade de dispersão em meios predominantemente

hidrofílicos, as quais são possíveis de serem minimizadas em grande parte pela utilização de

sistemas nanoemulsionados.

Por outro lado, a crescente demanda por produtos de origem natural pelos consumidores e a

necessidade de substituir conservadores sintéticos por naturais da indústria é, com certeza, uma

grande possibilidade para a utilização de óleos essenciais na conservação de alimentos, sobretudo

no caso de alimentos que são facilmente atingidos por microrganismos patogênicos assim como os

queijos curados ou semicurados.

44

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral deste trabalho de Mestrado foi avaliar a ação antifúngica do óleo essencial de

orégano (Origanum vulgare) nanoencapsulado em emulsões produzidas pelo método da

temperatura de inversão de fases (método PIT), fazendo um estudo de caso em queijo tipo Minas

Padrão.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Para alcançar o objetivo geral especificado, os seguintes objetivos específicos foram

delineados:

Determinar quais tipos de fungos são mais comuns em amostras comerciais de queijo minas

padrão disponíveis no mercado;

Avaliar quantitativamente a ação antifúngica das nanoemulsões encapsulando óleo

essencial de orégano por meio de ensaios in vitro, através da determinação da concentração

mínima necessária para que a ação antifúngica possa ocorrer.

Avaliar a ação antifúngica das nanoemulsões em queijos tipo minas padrão, determinando

as condições mínimas necessárias para que a ação antifúngica possa ocorrer.

Avaliar a contaminação fúngica dos queijos tipo Minas Padrão incorporados com as

nanoemulsões e compará-la a contaminação de queijos sem aplicação das nanoemulsões.

45

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. MATERIAIS

4.1.1. Amostras de queijo Minas Padrão

Foram obtidas 18 amostras de queijo Minas Padrão, sob inspeção, do Mercado Municipal da

cidade de Poços de Caldas (MG), bem como amostras sabidamente deterioradas, doadas pelo

Laticínio Imperial Jureia (Monte Belo, MG).

No momento da compra, as amostras estavam à temperatura ambiente. As amostras foram

levadas para o Laboratório de Coloides e Funcionalidade de Macromoléculas, localizado na

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP, onde foram armazenadas sob

refrigeração (4ºC +/- 1ºC) até o momento da amostragem.

4.1.2. Produção das nanoemulsões

Na fase lipídica das nanoemulsões foi utilizado óleo essencial de orégano (Origanum vulgare)

(Anexo 1) fornecido pela FERQUIMA (Vargem Grande Paulista, SP) e óleo de girassol comercial

(Liza, Cargill, Mairinque, SP).

Os tensoativos utilizados foram Kolliphor RH 40 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA),

Brij 30 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) e Span 80 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO,

EUA).

A representação das moléculas dos tensoativos utilizados são mostradas na Tabela 6:

46

Tabela 6. Dados dos tensoativos empregados nos experimentos realizados. (fonte: Sigma-Aldrich;

Resikem)

Tensoativo HLB Molécula

Cremophor RH40 15

(L+M+N+X+Y+Z = 40)

Span 80 4,3

Brij 30 9,7

4.1.3. Análises microbiológicas

Para identificação dos fungos nas amostras comerciais de queijo Minas Padrão foi utilizado

ágar dicloran rosa de bengala cloranfenicol (DRBC – Acumedia - Neogen, São Paulo, SP). Nas

diluições foi empregada água destilada estéril (autoclavada a 120 ºC por 15 minutos). Para

isolamento dos fungos e etapas subsequentes foi utilizado ágar batata dextrose (Acumedia -

Neogen, São Paulo, SP), adicionado de cloranfenicol 50 mg. Os fungos foram visualizados e

identificados microscopicamente por microscópio (Leica – Leica Microsystems, Alemanha). No

preparo da suspensão de esporos se utilizou água ultrapura (Synergy® - Millipore Corporation –

MilliUNI, França) autoclavada a 120 ºC por 15 minutos e filtrada com filtro para seringa de 0,45

m de poro (Kasvi - Curitiba, PR). Para garantir um adequado tratamento das amostras de queijo

da fase inicial e as fatias de queijo Minas Padrão e evitar contaminações das placas de DRBC e

PDA, foi utilizada uma cabine de segurança biológica classe II B2 (Filterflux – Piracicaba, SP).

Para todas as análises microbiológicas foram utilizadas placas de Petri descartáveis de poliestireno

47

esterilizadas com oxido de etileno (J. Prolab, São José dos Pinhais, PR). Para incubação dos fungos

em todos os ensaios foi utilizada uma incubadora BOD microprocessada (Marqlabor – São José de

Rio Preto, SP).

4.2. MÉTODOS

4.2.1. Produção das nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano pelo método

de inversão de fases (método PIT)

O método empregado na produção das nanoemulsões foi o método da temperatura de inversão

de fases (ou método PIT, do inglês, phase inversion temperature). Foram adicionados em um

béquer os tensoativos, o óleo essencial de orégano, o óleo de girassol e água deionizada, de acordo

com as formulações descritas na Tabela 7. Em seguida, os componentes da mistura foram

submetidos à agitação magnética (MA085, Marconi) na velocidade de 1350 rpm, utilizando-se

aquecimento até uma temperatura de aproximadamente 65º C.

Tabela 7. Formulações utilizadas para produção das nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano.

Formulações Tensoativos Fase lipídica* Fase contínua

(aquosa)

A

13%

- Cremophor RH 40 (9,75%)

- Brij 30 (3,25%)

6,5%

- OG (3,25%)

- OO (3,25%)

80,5%

- Água ultrapura

B

20%

- Cremophor RH 40 (12%)

- Span 80 (8%)

10%

- OG (5%)

- OO (5%)

70%

- Água ultrapura

*OG = óleo de girassol; OO = óleo de orégano

Após o aquecimento, as formulações de nanoemulsões foram resfriadas em um béquer

encamisado, acoplado em um banho ultratermostatizado (MA184, Marconi), com água de

resfriamento a 0º C, até a temperatura alcançar aproximadamente 20º C, sob agitação magnética

48

com velocidade de 585 rpm. As dispersões de nanoemulsões foram submetidas a dois ciclos de

aquecimento e resfriamento.

A Figura 7 mostra o aspecto visual das dispersões de nanoemulsões obtidas após o segundo

ciclo de resfriamento.

Figura 7. Aspecto visual das dispersões de nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano,

formulações A e B.

4.2.2. Identificação dos fungos encontrados nas amostras de queijos Minas Padrão

As amostras de queijo Minas Padrão (representadas na Figura 8) foram analisadas no

Laboratório Multiusuário de Microbiologia, localizado no Departamento de Medicina Veterinária

da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP.

49

Figura 8. Amostras comerciais de queijos deteriorados utilizados na identificação dos fungos.

Os fungos foram isolados tanto da superfície (retirando-se uma amostra da camada mais externa

do queijo, entre 0,3 e 0,5 cm de profundidade) quanto do interior (retirando-se cubos do centro dos

queijos). Dez gramas de cada amostra (tanto da superfície quanto do interior), previamente

homogeneizadas, foram diluídas em 90 ml de água destilada estéril (diluição até 10-1). A partir

desta diluição foram realizadas diluições sucessivas até 10-4, com a inoculação de 0,1 ml em meio

de cultivo dicloran rosa de bengala cloranfenicol – DRBC. As placas foram incubadas a

temperatura de 25 °C por sete dias. Após este período foi efetuada a contagem de colônias e seu

respectivo cálculo em unidades formadoras de colônia por grama de amostra (UFC/g). As colônias

de diferentes tipos morfológicos foram isoladas em ágar batata dextrose + cloranfenicol (PDA+C)

e posteriormente foram identificadas pela técnica de microcultivo. Os fungos foram classificados

até o gênero (PITT; HOCKINS, 2009); desta forma, foram determinados quais os fungos mais

abundantes nas amostras de queijo tipo minas padrão disponíveis no mercado. Dentre os fungos

identificados, os três com maior ocorrência nas amostras de queijos foram empregados para os

passos experimentais subsequentes.

50

4.1.3. Ensaios in vitro para avaliação da ação antifúngica das nanoemulsões

4.1.3.1. Preparo da suspensão de esporos de fungos

Cepas dos gêneros Cladosporium sp., Fusarium sp. e Penicillium sp., fungos escolhidos na

etapa 4.2.2 foram cultivadas em ágar batata dextrose + cloranfenicol (PDA+C) a 25ºC por sete dias

para permitir esporulação significativa. Após a incubação, uma alça de semeadura estéril foi

utilizada para remover os conídios do ágar. Os conídios foram ressuspendidos em água ultrapura e

ajustados com o uso de uma câmara de Neubauer para ajuste a uma concentração final de 104 a 105

esporos/ml (GARCÍA et al., 2011).

4.1.3.2. Avaliação da inibição do crescimento dos fungos deteriorantes

Para a atividade inibitória in vitro foi utilizado óleo essencial de orégano (Origanum

vulgare) e nanoemulsão de óleo de orégano produzida pelo método PIT (conforme descrito no item

4.2.1), a avaliação se fez por método quantitativo. Foram utilizadas concentrações de 0,1; 0,2; 0,3;

0,4; 0,5 g/ml de óleo essencial de orégano puro para os fungos Fusarium sp. e Penicillium sp. e

concentrações de 0,05; 0,075; 0,1; 0,2; 0,3 g/ml para o Cladosporium sp., gêneros de fungos que

apresentaram maior ocorrência de crescimento. Para as formulações A e B, as concentrações de

nanoemulsão utilizadas dependeram do tipo de fungo a ser inoculado. Os valores das concentrações

para os três gêneros de fungos estão dados em função do óleo essencial de orégano

nanoencapsulado. Para Cladosporium sp. se usaram concentrações na faixa de 0,16 a 0,5 g/ml.

Por sua vez, para Fusarium sp. se utilizaram concentrações na faixa de 0,03 a 0,5 g/ml, e,

finalmente, para Penicillium sp. foram utilizadas concentrações na faixa de 0,16 a 2,5 g/ml. Tanto

o óleo essencial de orégano puro quanto as duas formulações (A e B) de nanoemulsão encapsulando

óleo essencial de orégano foram diluídos em ágar batata dextrose + cloranfenicol (PDA+C), para

obter as concentrações desejadas.

Espalhou-se 0,1 ml de cada suspensão contendo entre 104 e 105 esporos de fungos/ml em

PDA+C contendo cada uma das concentrações de óleo e de nanoemulsão. As placas inoculadas

foram incubadas a 25 ºC por sete dias (ADIGUZEL et al., 2009). A atividade inibitória foi

determinada pela presença ou ausência do crescimento fúngico. A concentração mínima inibitória

(CMI) foi determinada como a menor concentração de óleo e nanoemulsão na qual houve inibição

do crescimento fúngico (ADIGUZEL et al., 2009). Todos os ensaios foram realizados em duplicata.

51

4.1.4. Produção e caracterização do queijo tipo Minas Padrão

Os queijos tipo Minas Padrão utilizados nas etapas seguintes foram produzidos no Laticínio

Imperial Jureia (localizado na cidade de Monte Belo, MG) (Figura 7). Todos os queijos utilizados

foram produzidos sob as normas de Boas Práticas de Fabricação (BRASIL, 1997; BRASIL, 2001)

e caracterizados físico-quimicamente de acordo com os testes realizados pelo referido laticínio.

Figura 9. Vista do Laticínio Imperial Jureia, localizado na cidade de Monte Belo, MG.

A Figura 8 mostra o fluxograma do processo de produção dos queijos Minas Padrão no

Laticínio Imperial Jureia, utilizados na execução do presente trabalho de Mestrado:

52

Figura 10. Fluxograma de processo do queijo Minas Padrão fabricado no Laticínio Imperial Jureia.

4.1.5. Avaliação da ação antifúngica das nanoemulsões em queijos Minas Padrão

Fatias de queijo de 2 mm de espessura e 50 mm de diâmetro foram cortadas e, colocadas em

bandejas de aço inoxidável previamente esterilizadas, sendo a seguir expostas à radiação

ultravioleta por 2 horas (uma hora para cada superfície), em cabine de fluxo laminar (metodologia

adaptada de TAMIWAKI et al., 2001). A seguir, as fatias foram colocadas em placas de Petri. Os

tratamentos utilizados se mostram na Tabela 8.

Seleção de Matéria Prima

Pasteurização

Adição de Cloreto de Cálcio,

Coalho e Fermento Láctico

Formação da Coalhada

Maturação

Salga

Enformagem do Queijo

53

Tabela 8. Tratamentos utilizados na etapa de avaliação da ação antifúngica das nanoemulsões em queijos

Minas Padrão.

Tratamentos

Gênero de fungo

Cladosporium sp.

Fusarium sp.

Penicillium sp.

Concentração da emulsão*

Sem emulsão

Emulsão pura

Concentração mínima inibitória

A: 3,25 g/ml; B: 5 g/ml

A: 6,5 g/ml; B: 10 g/ml

A: 11,7 g/ml; B: 18 g/ml

Tempo de imersão das

fatias de queijo na

nanoemulsão

Retirada imediata

30 minutos

Tipo de armazenamento Temperatura ambiente (25º C)

Refrigeração (4-5º C)

*Concentração da emulsão: quantidade de óleo essencial de orégano nanoemulsionado no líquido de imersão para as

fatias de queijo (g óleo de orégano/ml liquido de imersão).

As fatias de queijo foram imersas nas dispersões de nanoemulsões, e a seguir colocadas em

placas de Petri para posterior inoculação fúngica com suspensão contendo entre 104 e 105 esporos

de fungos/ml. Cada fatia foi inoculada no seu centro com um gênero de fungo escolhido de acordo

com a Tabela 8. O efeito dos diferentes tratamentos foi avaliado visualmente pelo crescimento

fúngico. Todos os ensaios foram realizados em duplicata.

4.1.6. Avaliação da contaminação fúngica do queijo Minas Padrão adicionado com

nanoemulsões contendo óleo de orégano

A avaliação da contaminação fúngica do queijo Minas Padrão foi realizada no Laticínio

Imperial Jureia (Monte Belo, MG). Queijos Minas Padrão de 500 gramas devidamente salgados,

foram imersos nas duas formulações de nanoemulsão contendo óleo essencial de orégano (A e B)

54

e retirados na hora, após, foram dispostos em prateleiras plásticas dentro de uma câmara de

resfriamento a uma temperatura de aproximadamente 10 ºC por um tempo de 30 (trinta) dias para

que seu processo de maturação pudesse ocorrer. Foram utilizados cinco (5) queijos por cada

tratamento: Controle (sem emulsão); A (formulação A da nanoemulsão contendo óleo essencial de

orégano); B (formulação B da nanoemulsão contendo óleo de orégano). A contaminação fúngica

foi avaliada visualmente pelo crescimento de colônias na superfície dos queijos durante o tempo

de maturação.

55

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS MAIS COMUMENTE ENCONTRADOS NAS

AMOSTRAS COMERCIAIS DE QUEIJO MINAS PADRÃO

A Tabela 9 mostra a comparação das médias do crescimento de fungos em todas as amostras,

tanto na superfície quanto no interior dos queijos. As amostras 1 a 5 foram obtidas do Mercado

Municipal de Poços de Caldas (MG). As amostras 6 a 18 foram doadas pelo Laticínio Imperial

Jureia. Destas ultimas, as amostras 6, 7, 8 e 10 se encontravam sem embalagem e altamente

deterioradas na sua superfície. Enquanto, a amostra 9 e as amostras 11 a 18 se encontravam com a

embalagem original, mas, com evidentes sinais de deterioro.

56

Tabela 9. Valores das contagens de fungos na superfície e no interior das amostras dos queijos Minas

Padrão

Amostra Superfície

UFC/g

Interior

UFC/g

1 1,9x103 3,2x106

2 2,2x103 3,1x103

3 2,9x103 4,8x103

4 2,2x103 1,5x103

5 2,8x104 4,5x103 est.*

6 1,1x106 1,5x102 est.

7 8,5x103 est. 2x102 est.

8 9,5x103 3,1x106

9 < 1x102 est. 7,3x106

10 1x104 6,5x104

11 < 1x102 est. < 1x102 est.

12 < 1x102 est. < 1x102 est.

13 < 1x102 est. < 1x102 est.

14 < 1x102 est. < 1x102 est.

15 < 1x102 est. < 1x102 est.

16 < 1x102 est. <1x102 est.

17 < 1x102 est. < 1x102 est.

18 < 1x102 est. < 1x102 est.

*est = valor estimado de unidades formadoras de colônias por grama de amostra de queijo.

UFC/g = unidades formadoras de colônias por grama de amostra de queijo.

Para as 18 amostras de queijos, a contagem de unidades formadoras de colônias por grama

de amostra esteve na faixa entre 101 e 106 UFC/g tanto para a superfície quanto para o interior. As

amostras 5, 6 e 10 apresentaram os maiores valores para a superfície (2,8x104, 1,1x106 e 1x104

UFC/g respectivamente), enquanto as amostras que apresentaram maiores níveis na contagem de

colônias no interior foram 1, 8, 9 e 10 com valores de 3,2x106, 3,1x106, 7,3x106 e 6,5x104 UFC/g

respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho relativamente altos, mas similares aos

encontrados por Rocha (2004), que avaliou o crescimento fúngico durante a maturação de queijo

57

Minas Padrão encontrando um crescimento dentre 104 e 108 UFC/g de amostra para os 21 dias de

maturação e os encontrados por Idênio-Schmitt et. al. (2011), que encontraram contagens entre

2,2x104 e 1,3x109 UFC/g em 30 amostras de queijo colonial (um outro tipo de queijo curado)

comercializado no estado de Rio Grande do Sul. Araújo et. al. (2001) avaliaram seis amostras de

queijo Minas Padrão e 24 de Minas frescal, e observaram que, das seis amostras, uma teve

contagem de 103 UFC/g enquanto as outras cinco amostras se encontraram com níveis de 102,

entretanto, das 24 amostras de queijo Minas frescal, 18 apresentaram níveis de contaminação

iguais ou maiores de 102. Por sua vez, De Morais (2005) estudou a microbiota fúngica em queijos

manteiga (tipo de queijo curado) comercializados na cidade de João Pessoa (PB), e encontrou uma

contagem de 4,7x103 UFC/g. Pode-se afirmar, portanto, que os queijos avaliados apresentaram

níveis de contaminação fúngica típicos de queijos maturados presentes no mercado. .

Os resultados obtidos podem indicar que houve falhas no processo de fabricação ou na

higiene das instalações, ou mesmo dos manipuladores, bem como na comercialização e disposição

ao consumidor (Boas Práticas de Fabricação). Atualmente, a legislação vigente (BRASIL, 1996;

BRASIL, 2001) não estabelece limites máximos para contagem de bolores e leveduras para queijos

com baixa ou média umidade. Devido ao processo de maturação que têm estes tipos de produtos,

podem ser atingidos facilmente por diferentes microrganismos, especialmente fungos, o que pode

representar diminuição na qualidade físico-química e sensorial do produto, afetando sua vida de

prateleira e a final rejeição do consumidor.

Para dar continuidade à identificação dos fungos encontrados nas amostras de queijo foram

isoladas de todas as placas as colônias de fungos que apresentaram diferentes condições

morfológicas, e que permitissem ser identificadas pelo método de microcultivo, e posterior

visualização por microscópio.

Na Tabela 10 pode-se visualizar exemplos de diferentes gêneros de bolores encontrados na

superfície em cada uma das amostras analisadas, sendo que nelas se mostram as imagens

macroscópicas (anverso e reverso) e microscópicas de cada bolor.

58

Tabela 10. Imagens macroscópicas e microscópicas dos fungos encontrados na superfície de diferentes

amostras de queijo Minas Padrão contaminados.

Identificação de bolores por amostra

Amostra de

queijo

contaminado

Gênero

MACROSCÓPICA

MICROSCÓPICA Anverso Reverso

1 Cladosporium

sp.

4 Alternaria sp.

4 Cladosporium

sp.

5 Cladosporium

sp.

6 Penicillium sp.

8 Penicillium sp.

59

8 Scopulariopsis

sp.

8 Cladosporium

sp.

10 Penicillium sp.

10 Cladosporium

sp.

Por sua vez, a Tabela 11 mostra as imagens de alguns exemplos de bolores encontrados no

interior das amostras de queijo padrão analisadas:

Tabela 11. Imagens macroscópicas e microscópicas dos fungos encontrados no interior das amostras de

queijo Minas Padrão contaminados.

Identificação de bolores por amostra

Amostra de

queijo

contaminado

Gênero

MACROSCÓPICA


2 Cladosporium

sp.

60

3 Cladosporium

sp.

4 Fusarium sp.

5 Cladosporium

sp.

6 Penicillium

sp.

7 Penicillium

sp.

7 Cladosporium

sp.

8 Scopulariopsis

sp.

61

Segundo Filtenborg et. al., (2000), os fungos são os mais importantes deteriorantes dos

queijos duros e semiduros, pois tais alimentos são submetidos a longos períodos de maturação, o

que permite que fiquem mais expostos ao ataque destes microrganismos (SCHOLTE et. al., 2000).

Kure e Skaal (2000) e Kure et. al., (2001) isolaram de queijos noruegueses semiduros 13

espécies de Penicillium, Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Epicocum, Geotrichum,

Mucor, Phoma, Trichoderma e Ulocladium. Da mesma forma, De Morais (2005) isolou os gêneros

Penicillium, Aspergillus niger, Rhizopus, Aspergillus ocharaceus e Mucor de queijo manteiga.

Por outro lado, o tipo de leite, o tipo de queijo, a salmoura, as superfícies, a composição da

atmosfera de armazenamento e maturação, o tipo de embalagem, a temperatura de armazenamento,

localização das instalações, entre outros, são fatores que influenciam no potencial de

desenvolvimento de fungos deteriorantes nos queijos (FILTENBORG et. al., 1996; KURE;

SKAAR, 2000; KURE et. al., 2001; KURE et. al., 2004; STETZENBACH, 1998; TANIWAKI et.

al., 2001). Segundo Larone (1996), dentre os gêneros de fungos considerados como contaminantes

ambientais se encontram Penicillium, Aspergillus e Fusarium.

De acordo com os resultados obtidos da identificação dos fungos que cresceram nas

amostras, se determinou que o crescimento fúngico se deu em maior parte na superfície do produto

com uma porcentagem de 56%, resultado esperado devido a que o queijo Minas Padrão fica exposto

no ambiente quando é submetido ao processo de maturação, enquanto ao interior a porcentagem

de crescimento foi de 43%. Os gêneros de fungos que apresentaram maior ocorrência na superfície

foram o Penicillium sp. seguido por Cladosporium sp. e Scopulariopsis sp., com porcentagens de

67, 18 e 5 %, respectivamente. No entanto, no interior o crescimento ocorreu em maior

porcentagem para o Cladosporium sp. com 33%, seguido por Fusarium sp. e Scopulariopsis sp.

ambos com 14% e por último por Penicillium sp. com 12%. A Figura 11 sintetiza tais informações.

62

Figura 11. Porcentagem de crescimento dos diferentes tipos de fungos encontrados na superfície e no

interior das amostras de queijo Minas Padrão analisadas.

Portanto, levando-se em consideração os dados mostrados na Figura 11, os fungos

escolhidos para a continuação deste trabalho de Mestrado, com os ensaios de atividade antifúngica

in vitro, foram os bolores dos gêneros Cladosporium sp., Fusarium sp., e Penicillium sp., ilustrados

na Tabela 12.

1,5

17,9

0

67,2

4,59,0

56,8

3,9

33,3

13,7 11,8 13,7

23,5

43,2

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

Alternaria sp. Cladosporium

sp.

Fusarium sp. Penicillium sp. Scopulariopsis

sp.

Outros Total

% d

e C

resc

imen

to

Gênero de Fungo

Superfície Interior

63

Tabela 12. Exemplos de placas ilustrando os gêneros escolhidos para serem utilizados nos ensaios de

atividade antifúngica do óleo de orégano nanoemulsionado in vitro.

Fungos escolhidos para ensaios de atividade antifúngica in vitro

Gênero MACROSCÓPICA


Cladosporium sp.

Fusarium sp.

Penicillium sp.

5.2. ENSAIOS IN VITRO PARA AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIFÚNGICA DAS

NANOEMULSÕES

A ação antifúngica do óleo de orégano nanoemulsionado foi avaliada pelo crescimento

fúngico durante 7 dias de incubação dos bolores, permitindo evidenciar o efeito das diferentes

concentrações tanto do óleo essencial de orégano quanto das duas formulações de nanoemulsão

contendo óleo de orégano encapsulado. A concentração inibitória mínima foi determinada para o

óleo de orégano puro e para as duas formulações de nanoemulsão, separadamente.

Determinaram-se as concentrações inibitórias mínimas de óleo de orégano para Fusarium

sp. e Penicillium sp. as quais foram, 0,2 g/ml e 0,3 g/ml respectivamente. As Figuras 12 e 13

mostram tais informações.

64

Figura 12. Visualização da concentração mínima inibitória do óleo de orégano (Origanum vulgare) puro

para Fusarium sp.

Figura 13. Visualização da concentração mínima inibitória do óleo de orégano (Origanum vulgare) em sua

forma livre para Penicillium sp.

0,1 g/ml 0,1 g/ml

0,2 g/ml 0,2 g/ml

0,2 g/ml 0,2 g/ml

0,3 g/ml 0,3 g/ml

65

As concentrações de óleo essencial puro (0,05 – 0,3 g/ml) utilizadas para determinar a

atividade antifúngica sobre Cladosporium sp. não permitiram o crescimento do fungo durante o

tempo de incubação do mesmo, não permitindo a determinação da concentração mínima inibitória

para Cladosporium sp. Isto pode indicar que este gênero de fungo foi muito susceptível ao efeito

inibitório do óleo de orégano em sua forma livre quando comparado com o efeito inibitório do óleo

essencial de orégano sobre Fusarium sp. e Penicillium sp. O anteriormente dito pode ser

confirmado por Zabta et al. (2014) que obtiveram CMI de 0,062 g/ml para Cladosporium

cladosporoides quando foi aplicado de óleo essencial de orégano.

Por sua vez, as Figuras 14, 15 e 16 mostram a CMI da formulação A de nanoemulsão

contendo óleo de orégano nanoencapsulado para os fungos Cladosporium sp., Fusarium sp. e

Penicillium sp. respectivamente. As concentrações obtidas estão dadas em função da concentração

de óleo de orégano as quais foram 0,26 g/ml para Cladosporium sp., 0,113 g/ml para Fusarium

sp. e 1,62 g/ml para Penicillium sp.

Figura 14. Visualização da concentração mínima inibitória da formulação A de nanoemulsão contendo óleo

de orégano nanoencapsulado para Cladosporium sp.

0,26 g/ml

A

0,26 g/ml

A

0,24 g/ml A

0,24 g/ml A

66


de orégano nanoencapsulado para Fusarium sp.


de orégano nanoencapsulado para Penicillium sp.

0,11 g/ml A

0,11 g/ml A

0,097 g/ml A

0,097 g/ml A

1,62 g/ml A

1,62 g/ml A

1,56 g/ml

A 1,56 g/ml

A

67

A concentração mínima onde houve inibição no crescimento do Cladosporium sp.,

Fusarium sp. e Penicillium sp. para a formulação B da nanoemulsão encapsulando óleo de orégano

se mostra nas Figuras 17, 18 e 19. As CMIs para Cladosporium sp., Fusarium sp. e Penicillium sp.

foram 0,32 g/ml, 0,1 g/ml e 0,8 g/ml respectivamente, concentrações igualmente dadas em

função do óleo de orégano contido nas nanoemulsões.

Figura 17. Visualização da concentração mínima inibitória da formulação B de nanoemulsão contendo óleo

de orégano nanoencapsulado para Cladosporium sp.

0,32 g/ml

B

0,32 g/ml

B

0,3 g/ml

B

0,3 g/ml

B

68


de orégano nanoencapsulado para Fusarium sp.

0,1 g/ml

B

0,1 g/ml

B

0,075 g/ml

B

0,075 g/ml

B

69


de orégano nanoencapsulado para Penicillium sp.

A Tabela 13 sintetiza os resultados obtidos para as CMIs para o óleo essencial de orégano

puro e nanoemulsionado sobre os três gêneros de fungos avaliados.

Tabela 13. Valores de concentração mínima inibitória para os fungos testados, para o óleo de orégano puro

e nanoemulsionado.

Gênero de Fungo

Concentração mínima inibitória (μg óleo essencial/ml)

Óleo de orégano

puro

Óleo de orégano

nanoemulsionado

(formulação A)

Óleo de orégano

nanoemulsionado

(formulação B)

Cladosporium sp. -- 0,26 0,32

Fusarium sp. 0,20 0,11 0,10

Penicillium sp. 0,30 1,62 0,80

0,8 g/ml

B

0,8 g/ml

B

0,7 g/ml

B

0,7 g/ml

B

70

Os resultados obtidos mostram que as CMIs encontradas para a formulação A da

nanoemulsão foram maiores do que as CMIs para a formulação B sobre os três fungos avaliados

(Cladosporium sp. Fusarium sp. e Penicillium sp.), o que muito provavelmente se deve ao conteúdo

maior de óleo de orégano na formulação B (5%) comparado com a formulação A (3,25%). No

entanto, as concentrações para ambas formulações (A e B), foram maiores do que as CMIs

encontradas para o óleo essencial de orégano puro. Tal fato pode indicar que os componentes das

formulações das nanoemulsões interferem na atividade antifúngica do óleo essencial de orégano,

provavelmente pela aplicação da nanoencapsulação, ou pela temperatura ao momento de produzir

as nanoemulsões ou a agitação aplicada.

Entretanto, os valores de CMI in vitro obtidos tanto para o óleo essencial livre quanto as duas

formulações de nanoemulsão foram menores que os valores obtidos por Daferera et al. (2000), que

encontraram valores de inibição de 250 g/ml de óleo de orégano sobre o Penicillium digitatum.

Daferera et al. (2003) encontraram valores de inibição de 150 g/ml de óleo de orégano no gênero

Fusarium sp. Stević et al., (2014), por sua vez, encontraram concentrações mínimas de óleo de

orégano para 8 espécies diferentes de Fusarium que variaram entre 70 e 1160 g/ml, e para

Penicillium sp., que foi de 280 g/ml.

Ao contrário dos autores anteriores, Mitchell et al. (2010) encontraram valores de CMI de

0,564 g/ml de óleo de orégano em diferentes espécies de Aspergillus, no entanto, continuam sendo

concentrações maiores do que as obtidas no presente trabalho de Mestrado. Isto pode indicar que

os gêneros avaliados neste trabalho foram mais susceptíveis ao efeito do óleo de orégano

encapsulado na nanoemulsão.

Entretanto, as concentrações mínimas inibitórias de óleo essencial de orégano obtidas por

Stupar et al. (2014), as quais foram 0,18 g/ml para as espécies de Aspergillus ochraceus e

Bipolaris spicifera e para o gênero Penicillium sp.; 0,23 g/ml para Aspergillus niger e 0,47 g/ml

para Trichoderma viride; foram relativamente menores quando comparados com os dados obtidos

para as duas formulações de nanoemulsões contendo óleo de orégano. No entanto, foram maiores

quando comparadas com as concentrações obtidas neste trabalho pelo óleo essencial em forma

livre.

Zabta et al. (2014) obtiveram concentrações mínimas de óleo essencial de orégano muito

menores quando comparadas com as concentrações mínimas obtidas neste trabalho; as quais foram

71

0,0103, 0,062, 0,067 e 0,086 g/ml para Stochybotrys chartarum, Cladosporium cladosporoides,

Aspergillus niger e Alternaria alternata, respectivamente.

De acordo com os resultados obtidos, foi possível constatar que o óleo de orégano

nanoemulsionado, obtido pelo método PIT, mostrou atividade antifúngica considerável, o que

permitiu o prosseguimento dos estudos para verificação da atividade antifúngica em queijo Minas

Padrão.

5.3. AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIFÚNGICA DAS NANOEMULSÕES EM QUEIJOS

MINAS PADRÃO

Para levar a cabo os ensaios de atividade antifúngica em queijos, foi necessário estabelecer

primeiramente dois parâmetros importantes para os testes. O primeiro deles foi o volume de

nanoemulsão a ser utilizado, que foi estabelecido como o volume suficiente para se proceder à

imersão da fatia do queijo no líquido, em uma placa de Petri de 8 cm de diâmetro (9 ml). O segundo

parâmetro foi o tempo de contato das fatias de queijo com as nanoemulsões (denominado neste

trabalho de tempo de imersão). Foram testados os tempos de imersão de 0, 15, 30, 45 e 60 minutos.

Os resultados obtidos nos testes de tempo de imersão estão mostrados nas Figuras 20 a 23:

72


utilizando-se formulação A da nanoemulsão pura encapsulando óleo essencial de orégano (fungo testado:

Fusarium sp.; Controle: sem óleo de orégano nanoemulsionado).

Controle

Retirada

Imediata

30 min 15 min

45 min 60 min

73


utilizando-se formulação A da nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano em concentração de

11,7 g/ml de óleo essencial (fungo testado: Fusarium sp.; Controle: sem óleo de orégano

nanoemulsionado).

Controle Retirada

Imediata

30 min 15 min

45 min 60 min

74


utilizando-se formulação B da nanoemulsão pura encapsulando óleo essencial de orégano (fungo testado:

Fusarium sp.; Controle: sem óleo de orégano nanoemulsionado)

Controle

Retirada

Imediata

30 min 15 min

45 min 60 min

75


utilizando-se formulação B da nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano em concentração de

18 g/ml de óleo essencial (fungo testado: Fusarium sp.; Controle: sem óleo de orégano nanoemulsionado).

Os resultados obtidos evidenciaram que à medida em que se aumentou o tempo de imersão

das fatias de queijo nas nanoemulsões, em concentração de 11,7 e 18 g/ml (em função de óleo

essencial de orégano), o crescimento fúngico também aumentou, durante os sete dias de incubação.

Controle

Retirada

Imediata

30 min 15 min

45 min 60 min

76

Nas fatias imersas nas nanoemulsões puras (sem diluição) ocorreu o mesmo efeito, no entanto, o

crescimento fúngico se deu em tempos maiores de incubação (15 dias). Tal fato provavelmente

ocorreu porque quando se aumentou o tempo de imersão das fatias também se aumentou a atividade

de água das mesmas, ao final do tempo de imersão, originando um ambiente ideal para o

crescimento destes tipos de microrganismos.

Na matriz dos alimentos, os fungos podem se desenvolver em pHs menores que 2 e maiores

que 9, sendo que a maioria dos bolores cresce em temperaturas entre 5 e 35º C, e em atividade de

água de 0,85 ou menor (MISLIVEC et al., 1992). Esta última variável é que determina se haverá

crescimento fúngico, já que indica quanta água disponível tem o alimento. Jay (1973) destaca que

outros parâmetros que influenciam no crescimento dos fungos são a variação da temperatura ou a

quantidade de elementos nutritivos da matriz alimentícia.

Devido aos resultados obtidos no teste anterior, foram aplicados tempos de imersão de 0

(zero, representando a retirada imediata das fatias após a imersão) e 30 minutos para avaliar a

atividade antifúngica do óleo de orégano nanoemulsionado nos diferentes tratamentos nos ensaios

subsequentes.

A Figura 24 mostra a ação antifúngica da formulação A de nanoemulsão contendo óleo de

orégano para o gênero Cladosporium sp. para o dia trinta (30) nos diferentes tratamentos usados

incluindo o tratamento controle (sem imersão em nanoemulsão) e nos diferentes tempos de imersão

(retirada imediata e 30 minutos) das fatias de queijo.

77

Cladosporium sp.

Emulsão A

(g/ml)

Retirada

imediata 30 minutos

Controle - +

CMI - +

3,25 - +

6,5 - +

11,7 - +

42, 1 - -

Figura 24. Ação antifúngica sobre Cladosporium sp. para o dia trinta de incubação, para os diferentes

tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da formulação A de

nanoemulsão encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada imediata após imersão na

nanoemulsão; (T30) imersão por 30 minutos na nanoemulsão.

Os resultados obtidos não permitiram determinar diferença no crescimento de

Cladosporium sp. nas fatias de queijo quando foram imersas por 30 minutos nas diferentes

concentrações de nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano, evidenciando-se igual

crescimento ao longo do armazenamento. Quando comparadas as fatias imersas por trinta minutos

em nanoemulsão diluída (diferentes concentrações) com as fatias imersas no mesmo tempo em

nanoemulsão pura, verificou-se que não houve crescimento do fungo avaliado nas fatias com

nanoemulsão pura durante os 30 dias de armazenamento, o que permite evidenciar o efeito

antifúngico do óleo essencial de orégano nanoemulsionado para o referido fungo.

Por sua vez, a Figura 25 mostra a ação antifúngica da formulação B de nanoemulsão

contendo óleo de orégano para o gênero Cladosporium sp. para o e trinta (30) nos diferentes

tratamentos usados incluindo o tratamento controle (sem imersão em nanoemulsão) e nos diferentes

tempos de imersão (retirada imediata e 30 minutos) das fatias de queijo.

(T30

) (T0)

(Dia 30)

(T30

) (T0)

(Dia 30)

78

Cladosporium sp.

Emulsão B

(g/ml)

Retirada

imediata 30 minutos

Controle - +

CMI - +

5 - +

10 - +

18 - +

64,8 - -

Figura 25. Ação antifúngica sobre Cladosporium sp. para o dia trinta de incubação, para os diferentes

tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as diferentes concentrações da formulação B de



Ao contrário das fatias de queijo imersas por 30 minutos na formulação A de nanoemulsão,

as fatias de queijo imersas no mesmo tempo na formulação B, apresentaram diferença no

crescimento de Cladosporium sp. nas diferentes concentrações de nanoemulsão avaliadas,

evidenciando um menor crescimento do fungo na medida em que aumentava a concentração de

nanoemulsão contendo óleo essencial de orégano. Tal diferença entre as duas formulações (A e B)

pode dever-se a que a formulação B tem maior quantidade de óleo essencial de orégano (5%) que

a formulação A (3,25%). Para as fatias imersas por 30 minutos, tanto na formulação A de

nanoemulsão quanto na formulação B, não houve crescimento do fungo avaliado ao longo do

armazenamento quando estas foram imersas na nanoemulsão pura.


orégano para o gênero Fusarium sp. para o dia trinta (30) nos diferentes tratamentos usados



(T30

) (T0)

(Dia 30)

(T30

) (T0)

(Dia 30)

79

Fusarium sp.

Emulsão A

(g/ml)

Retirada

imediata 30 minutos

Controle - +

CMI - +

3,25 - +

6,5 - +

11,7 - +

42,1 - -





A Figura 27 mostra a ação antifúngica da formulação B de nanoemulsão contendo óleo de

orégano para o gênero Fusarium sp. para o dia trinta (30) nos diferentes tratamentos usados



(T30

) (T0)

(Dia 30)

(T30

) (T0)

(Dia 30)

80

Fusarium sp.

Emulsão B

(g/ml)

Retirada

imediata 30 minutos

Controle - +

CMI - +

5 - +

10 - +

18 - +

64,8 - -





Da mesma forma que para as fatias imersas por 30 minutos em formulação A de

nanoemulsão contendo óleo essencial de orégano e inoculadas com Cladosporium sp., para as fatias

de queijo imersas no mesmo tempo em formulação A e B de nanoemulsão contendo óleo de

orégano e inoculadas com Fusarium sp., não houve diferença no crescimento do fungo quando

comparadas as diferentes concentrações de nanoemulsão, devido a que se apresentou crescimento

do fungo nas quatro concentrações durante o tempo de armazenamento. Nas fatias imersas na

nanoemulsão pura, em ambas as formulações, não houve crescimento do Fusarium sp. ao longo do

armazenamento, permitindo determinar o efeito positivo do óleo essencial de orégano

nanoemulsionado na inibição do crescimento do fungo avaliado.


orégano para o gênero Penicillium sp. para o dia trinta (30) nos diferentes tratamentos usados



(T30

) (T0)

(Dia 30)

(T30

) (T0)

(Dia 30)

81

Penicillium sp.

Emulsão A

(g/ml)

Retirada

imediata 30 minutos

Controle - +

CMI - +

3,25 - +

6,5 - +

11,7 - +

42,1 - +





A Figura 29 mostra a ação antifúngica da formulação B de nanoemulsão contendo óleo de

orégano para o gênero Penicillium sp. para o dia trinta (30) nos diferentes tratamentos usados



(T30

) (T0)

(Dia 30)

(T30

) (T0)

(Dia 30)

82

Penicillium sp.

Emulsão B

(g/ml)

Retirada

imediata 30 minutos

Controle - +

CMI - +

5 - +

10 - +

18 - +

64,8 - +





Nas fatias de queijo imersas por 30 minutos nas formulações A e B de nanoemulsão

contendo óleo essencial de orégano e inoculadas com Penicillium sp., encontrou-se que para todas

as concentrações de nanoemulsão avaliadas - incluindo a nanoemulsão pura - houve crescimento

do fungo ao longo do tempo de armazenamento, no entanto, pode-se evidenciar que houve

diferença entre as fatias de queijo imersas em nanoemulsão nas concentrações de 11,7 e 18 g/ml

e as fatias imersas em nanoemulsão pura para ambas formulações, devido à diminuição aparente

no crescimento do fungo na medida em que aumentou a concentração da nanoemulsão. Entretanto,

quando comparadas as fatias imersas por trinta minutos, em formulação A com formulação B de

nanoemulsão contendo óleo essencial de orégano, determinou-se que a formulação B de

nanoemulsão apresentou maior atividade antifúngica sobre o Penicillium sp. que a formulação A,

provavelmente devido a que em sua concentração a formulação B tem maior porcentagem de óleo

essencial de orégano.

Por outro lado, quando comparando o comportamento geral de ambas formulações de

nanoemulsão (A e B) sobre o crescimento dos três gêneros de fungos avaliados pode-se dizer que

estas apresentaram efeito positivo na inibição do crescimento dos fungos avaliados, no entanto, o

(T30

) (T0)

(Dia 30)

(T30

) (T0)

(Dia 30)

83

Penicillium sp. foi o gênero que teve menor susceptibilidade ao efeito antifúngico do óleo essencial

de orégano nanoemulsionado, que os gêneros Cladosporium sp. e Fusarium sp., devido a que ao

final do armazenamento se apresentou início do crescimento de Penicillium sp. o que pode indicar

que este gênero de fungo tem alta capacidade de acoplamento a ambientes extremos, contrário ao

Cladosporium sp. e Fusarium sp. que não apresentaram crescimento algum durante o tempo de

armazenamento para ambos tempo de imersão.

Os resultados obtidos nestes testes confirmaram que o tempo de imersão das fatias de queijo

nas nanoemulsões afetou consideravelmente o crescimento dos gêneros de fungos avaliados,

permitindo observar que nas fatias que foram retiradas imediatamente (tempo de imersão zero) e

depois inoculadas dos fungos, não se apresentou crescimento dos mesmos durante os 30 dias de

armazenamento, destacando com isso a importância da atividade de água para o crescimento deste

tipo de microrganismos.

Ao respeito da atividade antifúngica das duas formulações de nanoemulsão contendo óleo

essencial de orégano na concentração inibitória mínima, não se apresentou o mesmo efeito quando

estas foram aplicadas nas fatias de queijo (tempo de imersão 30 minutos), porque permitiram o

desenvolvimento dos gêneros de fungos avaliados em sete dias de incubação, tempo em que

normalmente demoram em crescer e esporular os gêneros avaliados neste trabalho.

Por outro lado, as fatias que foram armazenadas sob refrigeração não apresentaram

crescimento fúngico (Cladosporium sp., Fusarium sp. e Penicillium sp.) para as diferentes

concentrações de óleo essencial de orégano nanoemulsionado e para os dois tempos de imersão

avaliados, tais informações se mostram nas Figuras 30, 31 e 32.

84

Figura 30. Ação antifúngica sobre Cladosporium sp. para o dia trinta de incubação sob refrigeração, para

os diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as formulações A e B de nanoemulsão pura

encapsulando óleo essencial de orégano. Tratamentos: (T0) retirada imediata após imersão na nanoemulsão;

(T30) imersão por 30 minutos na nanoemulsão.

Figura 31. Ação antifúngica sobre Fusarium sp. para o dia trinta de incubação sob refrigeração, para os

diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as formulações A e B de nanoemulsão pura



(T0)

A

(T0)

A

(T30

)

A

(T30

)

A

(Dia 30)

(T0)

B

(T0)

B

(T30

)

B (T

30)

B

(Dia 30)

(T0)

A

(T0)

A

(T30

)

A (T

30)

A

(Dia 30)

(T0)

B

(T0)

B

(T30

)

B

(T30

)

B

(Dia 30)

85

Figura 32. Ação antifúngica sobre Penicillium sp. para o dia trinta de incubação sob refrigeração, para os

diferentes tratamentos, em fatias de queijo Minas Padrão com as formulações A e B de nanoemulsão pura



Os resultados obtidos não permitiram determinar o efeito inibitório real das nanoemulsões

sobre os gêneros de fungos estudados, devido à forte influência que teve a temperatura de

armazenamento no crescimento fúngico. No entanto, segundo Mislivec et al., (1992), numa matriz

alimentícia, os fungos se podem desenvolver em pH muito ácido ou muito básico, em temperaturas

entre 5 e 35º C, e em atividade de água de 0,85 ou menor, o que pode indicar que o óleo essencial

de orégano nanoemulsionado teve melhor atividade antifúngica quando combinado com

temperaturas de refrigeração, o que faz que a atividade de água tenha menor importância neste caso

quando comparado com o armazenamento a temperatura ambiente.

5.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE

ORÉGANO NANOEMULSIONADO EM QUEIJOS MINAS PADRÃO NO

AMBIENTE DE MATURAÇÃO

Os queijos testados foram imersos nas duas formulações (A e B) de nanoemulsões

encapsulando óleo essencial de orégano e retirados imediatamente, de acordo com os ensaios

(T0)

A

(T0)

A

(T30

)

A

(T30

)

A

(Dia 30)

(T0)

B

(T0)

B

(T30

)

B (T

30)

B

(Dia 30)

86

realizados previamente nas fatias de queijo. A Figura 33 mostram este processo realizado dentro

instalações do Laticínio Imperial Jureia:

Figura 33. Forma de imersão dos queijos Minas Padrão em nanoemulsão encapsulando óleo essencial de

orégano.

Para avaliação da atividade antifúngica das duas formulações de nanoemulsão encapsulando

óleo essencial de orégano sobre os queijos Minas Padrão, estes foram armazenados durante 30 dias,

tempo no qual ocorre o processo de maturação, em uma câmara de refrigeração a 10◦ C,

aproximadamente. As Figuras 34 e 35 mostram a atividade antifúngica do óleo essencial de

orégano nanoemulsionado em queijos Minas Padrão.

87

Figura 34. Aparência dos queijos tipo Minas Padrão imediatamente após a imersão nas formulações A e B

de óleo de orégano nanoemulsionado, na câmara de maturação.

Figura 35. Aparência dos queijos tipo Minas Padrão imersos nas formulações A e B de óleo de orégano

nanoemulsionado, na câmara de maturação, após 30 dias.

Controle

A

B

A B

Controle

88

Os resultados obtidos mostram que o óleo de orégano nanoemulsionado não teve efeito

inibitório quando comparado com os resultados obtidos nas fatias de queijo no mesmo período de

armazenamento, permitindo o crescimento de fungos na superfície dos queijos. Este efeito

provavelmente se deve ao fato que as fatias de queijo no ensaio em laboratório permaneceram em

ambiente controlado (dentro das placas de Petri), livres de qualquer contaminação externa (foram

inoculadas apenas uma vez), enquanto os queijos Minas Padrão na câmara de maturação estavam

expostos a uma grande quantidade de microrganismos continuamente. Tal problemática poderia

ser diminuída ou eliminada caso houvesse a possiblidade de reaplicação das nanoemulsões

periodicamente na superfície dos queijos.

Por último, foi realizada a identificação dos bolores que cresceram na superfície dos queijos

Minas Padrão aplicados com as nanoemulsões (formulações A e B), encontrando maior

crescimento de Cladosporium sp., isto pode indicar que o ambiente onde foram dispostos os queijos

para seu processo de maturação é propício para o desenvolvimento deste tipo de fungo. Para este

caso, são necessárias estratégias de controle na área de maturação para garantir um adequado

processo dos queijos e evitar perdas do produto.

89

6. CONCLUSÕES

A partir da análise dos dados obtidos neste trabalho de Mestrado, pode-se concluir que:

- Foi possível identificar os gêneros de fungos mais comumente encontrados em queijos tipo

Minas Padrão deteriorados, e foram eles Fusarium sp., Cladosporium sp. e Penicillium sp.,

nas amostras analisadas;

- O óleo essencial de orégano nanoemulsionado pelo método da temperatura de inversão de

fases produzido possui ação antifúngica, em ambas as formulações utilizadas, em

concentrações dentro de intervalos de concentração de óleo essencial compatíveis com a

literatura;

- As nanoemulsões de óleo essencial de orégano foram efetivas contra o crescimento fúngico

de Fusarium sp., Cladosporium sp. e Penicillium sp em fatias de queijo Minas Padrão. Tal

efetividade foi dependente do tempo de imersão das fatias na nanoemulsão e também da

temperatura na qual o queijo foi armazenado. Em condições de temperatura ambiente,

somente as fatias imersas e imediatamente retiradas foram protegidas contra o crescimento

fúngico; já no caso das fatias armazenadas sob refrigeração, o tempo de imersão não foi fator

determinante, mas sim a temperatura.

- No ambiente de laticínio (câmara de maturação), as nanoemulsões não foram efetivas para

evitar o crescimento fúngico, provavelmente devido ao contato contínuo do ambiente

contaminado com a superfície dos queijos.

90

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

De acordo com os dados obtidos neste trabalho de Mestrado, as seguintes sugestões são

feitas para trabalhos futuros no mesmo tema:

- Avaliação de outras formulações de nanoemulsões contendo óleo de orégano;

- Determinação da influência das formulações de nanoemulsões no crescimento in vitro dos

fungos, em termos quantitativos;

- Determinação da influência das nanoemulsões na produção de toxinas fúngicas;

- Reaplicação periódica das nanoemulsões na superfície dos queijos no ambiente de

maturação, com acompanhamento periódico da presença de fungos na superfície, bem como do seu

crescimento.

91

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABIQ - Associação Brasileira das Indústrias de Queijos. MG estima crescimento de 3% na

produção de laticínios em 2012. Disponível em:

<http://www.abiq.com.br/noticias_ler.asp?codigo=1286&codigo_categoria=6&codigo_subcatego

ria=6>. Acesso em: Julho/2014.

ADIGUZEL, A; OZER, M; SOKMEN, M; GULLUCE, M; SOKMEN, A; KILIC, H; SAHIN, F;

BARIS, O. Antimicrobial and Antioxidant Activity of the Essential Oil and Methanol Extract of

Nepeta cataria. Polish Journal of Microbiology, v. 58, p. 69 – 76, 2009.

ALMEIDA, N.; SOUZA, B.; LIMA, E.; NUNES GUEDES, D.; PEREIRA, F.; LEITE DE

SOUZA, E.; BARBOSA DE SOUSA, F. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 46,

p. 499 – 508, 2010.

ALMEIDA, A.P., RODRÍGUEZ-ROJO, S., SERRA, A.T., VILA-REAL, H., SIMPLICIO, A.L.,

DELGADILHO, I., BEIRÃO-DA-COSTA, S., BEIRÃO-DA-COSTA, L., NOGUEIRA, I.D.,

DUARTE, C.M.M. Microencapsulation of oregano essential oil starch-based materials using

supercritical fluid technology. Innovative Food Science and Emerging Technologies, v. 20, p.

140 – 145, 2013.

AMIOT, J. Ciencia y tecnología de la leche: Principios y aplicaciones. Ed. Acribia, Zaragoza -

España, 1991.

ANTON, N., AND T.F. VANDAMME. The universality of low-energy nanoemulsification.

International Journal of Pharmaceutics, v. 377, n. 1–2, p. 142 – 147, 2009.

ANTON, N., BENOIT, J.P., SAULNIER, P. Design and production of nanoparticles formulated

from nano-emulsion templates—A review. Journal Controlled Release, v. 128, n. 3, p. 185 – 199,

2008.

92

ANTON, N., GAYET, P., BENOIT, J.P., SAULNIER, P. Nano-emulsions and nanocapsules by

the PIT method: An investigation on the role of the temperature cycling on the emulsion phase

inversion. International Journal of Pharmaceutics, v. 344, n. 1 – 2, p. 44 – 52, 2007.

ARAJO, W. N., SILVA, M. H., MARTINEZ, T.C.N., BANAS, S.L.B., SILVEIRA, V. F.

Determinação do número de bolores e leveduras no queijo Minas comercializado na região

metropolitana de Salvador – Bahia. Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v. 2, n. 1,

p. 10 – 14, 2001.

ARTEAU M, LABRIE S. Terminal-restriction fragment length polymorphism and automated

ribosomal intergenic spacer analysis profiling of fungal communities in Camembert cheese.

International Dairy Journal, v. 20, p. 545 – 54, 2010.

BAKKALI, F., AVERBECK, S., WAOMAR, M. Biological effects of essential oil – a review.

Food and Chemical Toxicology, v. 46, p. 446 – 475. 2008.

BARRIOS M, MEDINA L, LOPEZ M. Fungal biota isolated from Spanish cheeses. Journal Food

Safety, v. 18, p. 151 – 157, 1998.

BÅTH K., PERSSON K.N., SCHN¨URER, J., LEONG, S.I.L. Microbiota of an unpasteurized

cellar-stored goat cheese from northern Sweden. Agriculture Food Science, v. 21, p. 197 – 203,

2012.

BEIRÃO-DA-COSTA, S., DARTE, C., BOURBON, A.I., PINHEIRO, A.C., JANUÁRIO, M.I.N,

VICENTE, A.A., BEIRÃO-DA-COSTA, M.L., DELGADILLO, I. Inulin potential for

encapsulation and controlled delivery of Oregano essential oil. Food Hydrocolloids, v. 33, p. 199

– 206, 2013.

BHARGAVA, K., CONTI, D.S., DA ROCHA, S.R.P, ZHANG, Y. Application of na oregano oil

nanoemulsion to the control foodborne bactéria on fresh lettuce. Food Microbiology, v. 47, p. 69

– 73, 2015.

93

BONASSI, I.A. Liberação de ácidos graxos livres voláteis em queijo minas padronizado. Revista

do Instituto de Laticinios Cândido Tostes, Juiz de Fora, MG. v. 40, n. 240, p. 37 – 48. 1985.

BORGES DO CARMO, A.A.L. Avaliação da qualidade higiênica e sanitária de queijos tipo Minas

Padrão de fabricação industrial, artesanal e informal. (TCC), Faculdade de Agronomia e

Medicina Veterinária da Universidade de Brasília, 2013.

BOURGEOIS, C.M., LARPENT, J.P. Microbiología Alimentária – Fermentaciones Alimentárias.

Ed. Acribia, Zaragoza – España, 1995.

BRASIL. Decreto 30691 de 29/03/1952. Regulamento da inspeção industrial e sanitária de

produtos de origem animal (RIISPOA). Ministério da Aricultura, do Abastecimento Departamento

de Inspeção de Produtos de Origem Animal - DIPOA Divisão de Normas Técnicas.

BRASIL. Portaria no. 146, de 7 de março de 1996. Regulamentos técnicos de identidade e

qualidade dos produtos lácteos. Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária

- Gabinete Do Ministro.

BRASIL. Portaria SVS/MS no 326, de 30/07/1997. Regulamento Técnico sobre as condições

higiênico-sanitárias e de boas práticas de fabricação para estabelecimentos

produtores/industrializadores de alimentos. Diário Oficial da União, Brasília, 01 de agosto de 1997.

BRASIL. Resoluçao RDC nº 12, de 02 de Janeiro de 2001. Regulamento Técnico sobre padrões

microbiológicos para alimentos. Diário Oficial da União; Poder Executivo, de 10 de janeiro de

2001.

BURT, S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods – a review.

International Journal of Food Microbiology, v. 94 p. 223 – 253, 2004.

94

CARMO, E.S., LIMA, E.D., SOUZA, E.L. The potential of Origanum vulgare L. (Lamiaceae)

essential oil in inhibiting the growth of some food-related Aspergillus species. Brazilian Journal

of Microbiology, v. 39, p. 362 – 367, 2008.

CARSON, C.F., MEE, B.J., RILEY, T.V. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree)

oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage and salt tolerance assays and

eléctron microscopy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 46, n. 6, p. 1914 – 1920.

2002.

CARSON, C.F.; HAMMER, K.A. (2011). Chemistry and bioactivity of essential oils. Lipids and

essential oils as antimicrobial agents. Ed. Thormar, H, p. 203 – 237, 2011.

CASTRO, L.O., RAMOS, R.L.D. Descroção botânica, cultivo e uso de Origanum majorana L.,

manjerona e de Origanum vulgare L., oregano (LAMIACEAE). FEPAGRO, Circular Técnica,

v. 22, p. 15, 2003.

CHALITA, M.A.N., PITHAN-SILVA, R.O., PETTI, R.H.V., LEITE DA SILVA, C.R. Algumas

considerações sobre a fragilidade das concepções de qualidade no mercado de queijos no brasil.

Informações Econômicas, v. 39, n. 6, 2009.

CHARCUTARIA.ORG. Queijo Minas Frescal. Disponivel em:

<http://charcutaria.org/diversos/queijo-minas-frescal/>. Ingresso em: Março/2015.

CHEN, H., ZHONG, Q. A novel method of preparing stable zein nanoparticle dispersions for

encapsulation of peppermint oil. Food Hydrocolloids, v. 43, p. 593 – 602, 2015.

COSENTINO, S., BARRA, A. PISANO, B., CABIZZA, M. PIRISI, F., PALMAS, F. Composition

and antimicrobial properties of Sardinian juniperus essential oils against foodborne pathogens and

spoilage microorganisms. Journal Food Protection, v. 66, p. 1288 – 1291, 2003.

95

CUETO-WONG, M. C.; RIVAS-MORALES, C.; ALANÍS-GUZMÁN, M. G.; ORANDAY-

CÁRDENAS, A.; AMAYA-GUERRA, C. A.; NÚÑEZ-GONZÁLEZ, A. Antifungal properties of

essential oil of mexican oregano (Lippia berlandieri) against Fusarium oxysporum f. sp.

lycopersici. Revista Mexicana de Micologia, v. 31, p. 29 – 25, 2010.

DAFERERA, D.J., ZIOGAS, B.N., POLISSIOU, M.G. GC-MS Analysis of essential oils from

some greek aromatic plants and their fungitoxicity on Penicillium digitatum. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, v. 48, p. 2576 – 2581, 2000.

DAFERERA, D.J., ZIOGAS, B.N., POLISSIOU, M.G. The effectiveness of plant essential oils on

the growth of Botrytis cinerea, Fusarium sp. and Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis.

Crop Protection, v. 22, p. 39 – 44, 2003.

DE ALMEIDA, K.M., DA PAIXÃO, R.F., DE OLIVEIRA, A.D.M., GAUDERETO, B.S.,

LOPES, M.M., MARTINS, J.M. Características físico-químicas e sensoriais de queijo minas

padrão probiótico Revista do Instituto de Laticínios “Cândido Tostes”, v. 378, n. 66, p. 17 – 25,

2011.

DE MORAIS, V.M.F. Identificação de fungos leveduriformes e filamentosos em queijos de

manteiga. Dissertação-Mestrado. Departamento de Tecnologia Química e de Alimentos,

Universidade Federal Da Paraíba, 2005.

DE SANTI M, SISTI M, BARBIERI E, PICCOLI G, BRANDI G, STOCCHI V. A combined

morphologic and molecular approach for characterizing fungal microflora from a traditional Italian

cheese (Fossa cheese). International Dairy Journal, v. 20, p. 465 – 71, 2010.

EL-FADALY, H.M., EL-KADI, S.M., HAMAD, M.N., HABIB, A.A. Isolation and identification

of egyptian ras cheese (Romy) contaminating fungi durng ripening period. Journal of

Microbiology Research, v. 5, n. 1, p. 1 – 10, 2015.

96

EMBRAPA. Principais países produtores de leite no mundo – 2010. Embrapa Gado de Leite.

Disponível em:

http://www.cnpgl.embrapa.br/nova/informacoes/estatisticas/producao/tabela0212.php.

Ingresso em: fevereiro/2012.

FAKHREDDIN-HOSSEINI, S., ZANDI, M., REZAEI, M., FARAHMANDGHAVI, F. Two-step

method for encapsulation of orégano essential oil in chitosan nanopaticles: Preparation,

characterization and in vitro release study. Carbohydrate Polymers, v. 95, p. 50 – 56, 2013.

FERNANDEZ, P., ANDRE, V., RIEGER, J., AND KUHNLE, A. Nanoemulsion formation by

emulsion phase inversion. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects,

v. 251, n. 1–3, p. 53 – 58, 2004.

FETAEMG. Queijo minas artisanal já pode ser comercializado em outros estados e for a do país.

Noticias – Federação dos Trabalhadores na Agricultura do Estado de Minas Gerais. Disponivel em:

<http://www.fetaemg.org.br/noticias/queijo-minas-artesanal-ja-pode-ser-comercializado-em-

outros-estados-e-fora-do-pais/>. Ingresso em: Março/2015.

FILTENBORG, O., FRISVAD, J.C., THRANE, U. Moulds in food spoilage. International

Journal of Food Microbiology, v. 33, p. 85 – 102. 1996.

FILTENBORG, O., FRISVAD, J.C., SAMSON, R.A. Specific association of fungi to foods and

influence of physical environmental factors. In: SAMSON, R.A., HOEKSTRA, E.S., FRISVAD,

J.C., FILTENBORG, O. Introduction to food and airborne fungi. 6th.ed. Utrecht: Centraal

Bureau Voor Schimmelcultures, p. 321 – 330, 2000.

FLÓREZ, A.B., ÁLVAREZ-MARTÍN, P., LÓPEZ-DÍAZ, T., MAYO, B. Morphotypic and

molecular identification of filamentous fungi from spanish blue-veined cabrales cheese, and typing

of Penicillium roqueforti and Geotrichum candidum isolates. International Dairy Journal, v. 17,

p. 350 – 357, 2007.

97

FURTADO, M.M.; LOURENÇO NETO, J.P.M. Tecnologia de queijos: manual técnico para a

produção industrial de queijos. São Paulo: Dipemar, p. 118, 1994.

GARCIA, D., GARCIA-CELA, E., RAMOS, A.J., SANCHIS, V., MARÍN, S. Mould growth and

mycotoxin production as affected by Equisetum arvense and Stevia rebaudiana extracts Food

Control, v. 22, p. 1378 – 1384, 2011.

GAYSINSKY, S. Emulsions and microemulsions as antimicrobial delivery systems. Tese

(Doutorado) – Departament of Food Science, University of Massachussets at Amherst, 2007.

GUMUS, T.; SUKRU-DEMIRCI, A.; SAGDIC, O.; ARICI, M. Inhibition of heat resistant molds:

Aspergillus fumigatus and Paecilomyces variotti by some plant essential oils. Food Science and

Biotechnology, v. 19, n. 5, p. 1241 – 1244, 2010.

GUTIERREZ, J.; BARRY-RYAN, C.; BOURKE, R. The antimicrobial efficacy of plant essential

oil combinations and interactions with food ingredients. International Journal of Food

Microbiology, v. 124, n. 1, p. 91 – 97, 2008.

HERCULANO, E.D., DE PAULA, H.C.B., DE FIGUEIREDO, E.A.T., DIAS, F.G.B., PEREIRA,

V.A. Physicochemical and antimicrobial properties of nanoencapsulated Eucalyptus staigeriana

essential oil. LWT – Food Science and Technology, v. 61, p. 484 – 491, 2015.

HOLLEY, R.A., PATEL, D. Improvement in shelf-life and safety of perishable foods by plant

essential oils and smoke antimicrobials. Food Microbiology, v. 22, p. 273 – 292, 2005.

HOOFT, C., DIETRICH, J. A revolução do Pack-Age®. Revista Leite e Derivados, v. 151, p. 19

– 20, 2014.

IBGE. Estatística da produção pecuária. Indicadores IBGE, Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatística, Março 2015.

98

IDÊNIO-SCHMITT, C., DEBONI-CERESER, N., SILVA-BOHRZ, D.A., NOSKOSKI, L.

Contaminação do queijo colonial de produção artesanal comercializado em mercados varejistas do

rio grande do sul. Veterinária Noticias, v. 17, n. 2, p. 111 - 116, 2011.

IZQUIERDO, P., ESQUENA, J., TADROS, T.F., DEDEREN, J.C., FENG, J., GARCIA-CELMA,

M.J., AZEMAR, N., SOLANS, C. Phase behavior and nano-emulsion formation by the phase

inversion temperature method. Langmuir, v. 20, p. 6594 – 6598, 2004

JAY, J.M. Microbiología moderna de los alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza – España, 1973.

KOCIĆ-TANACKOV, S., DIMIĆ, G., TANACKOV, I., PEJIN, D., MOJOVIĆ, L., PEJIN, J. The

inhibitory effect of oregano extract on the growth of Aspegillus spp. and on sterigmatocystin

biosyntesis. LWT – Food Science and Technology, v. 49, p. 14 – 20, 2012.

KURE, C.F., SKAAR, I. Moulds growth on the Norwegian semi-hard cheese Norvegia and

Jarlsber. International Journal Food Microbiology, v. 62, p. 133 – 137, 2000.

KURE, C.F., WASTESON, Y., BRENDEHAUG, J., SKAAR, I. Moulds contaminants on Jarlsber

and Norvegia cheese blocks from four factories. International Journal Food Microbiology, v.

70, p. 21 – 27, 2001.

KURE, C.F., SKAAR, I., BRENDEHAUG, J. Mould contamination in production of semi-hard

cheese. International Journal Food Microbiology, v. 93, p. 41 – 49, 2004.

MARTÍN-SÁNCHEZ, A.M., CHAVEZ-LÓPEZ, C., SENDRA, E., SAYAS, E., FERNÁNDEZ-

LÓPEZ, J., PÉREZ-ÁLVAREZ, J.A. Lipolysis, proteolysis and sensory characteristics of a

Spanish fermented dry-cured meat product (salchichón) with oregano essential oil used as surfasse

mold inhibitor. Meat Science, v. 89, p. 35 – 44, 2011.

MASON, T.G.; WILKING, J.N.; MELESON, K.; CHANG, C.B.; GRAVES, S.M. Journal

Physics Condensed Matter, v. 18, p. 635 – 666, 2006.

99

MCCLEMENTS, D.J.; RAO, J. Food-Grade Nanoemulsions: Formulation, Fabrication, Properties,

Performance, Biological Fate, and Potential Toxicity. Critical Reviews in Food Science and

Nutrition, v. 51, p. 285 – 330, 2011.

MITCHELL, T. C.; MONTENEGRO, T. L.; LEITE DE SOUZA, E.; LIMA, E.; CARMO, E.

Origanum vulgare L. essential oil as inhibitor of potentially toxigenic Aspergilli. Ciência e

Tecnologia de Alimentos, v. 30, p. 755 – 760, 2010.

MISLIVEC, P.B., BEUCHAT, L.R., CUSIN, M.A. Yeast and molds. In: VANDERZART, C.,

SPLITTSTOESSER, D. F. Compendium of methods for the microbiological examination of

foods. 3rd. ed. Washington, DC: APHA, p. 239 – 49, 1992.

MOHAMMADI, A., HSHEMI, M., HOSSEINI, S.M. Nanoencapsulation of Zataria multiflora

essential oil preparation and characterization with enhanced antifungal activity for controlling

Botrytis cinerea, the causal agent of gray mould disease. Innovative Food Science and Emerging

Technologies, v. 28, p. 73 – 80, 2015.

MONTAGNA MT, SANTACROCE MP, SPILOTROS G, NAPOLI C, MINERVINI F, PAPA A,

DRAGONI I. Investigation of fungal contamination in sheep and goat cheeses in southern Italy.

Mycopathologia, v. 158, p. 245 – 9, 2004.

MORALES, D., GUTIERREZ, J.M., GARCIA-CELMA, M.J., SOLANS, C. A estudy of the

relation between bicontinuous microemulsion and oil/water nanoemulsion formation. Langmuir,

v. 19, p. 7196 – 7200, 2003.

MORARU, C.I.; PANCHAPAKESAN, C.P.; HUANG, Q.; TAKHISTOV, P.; LIU, S.; KOKINI,

J.L. Nanotechnology: A new frontier in food science. Food Technology, v. 7, n. 12, p. 24 – 29,

2003.

100

LAMBERT, R.J., SKANDAMIS, P.N., COOTE, P.J., NYCHAS, G.J.E. A study of the minimum

inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal

of Applied Microbiology, v. 91, n. 3, p. 453 – 462, 2001.

LARONE, D.H. Medically important fungi: A guide to identification. 3rd ed. Washington, DC:

ASM Press, p. 274, 1996.

LIMA DE SOUSA, L., ALBUQUERQUE DE ANDRADE, S.C., ALVES-AGUIAR, A.A.J.,

VASCONCELOS DE OLIVEIRA, C.E., VERÍSSIMO DE SALES, C., MADRUGA, M.S., LEITE

DE SOUZA, E. Efficacy of Origanum vulgare L. and Rosmarinus officialis L. essencial oils in

combination to control posthavest pathogenic Aspergilli and autochthonous mycoflora in Vitis

labrusca L. (table grapes). International Journal of Food Microbiology, v. 165, p. 312 – 318.

2013.

LODOÑO, M.M.D.; FURTADO, M.M.; ABREU, L.R. Comparação dos processos de fabricação,

composição centesimal e sensorial do queijo Minas meia cura com os queijos Minas padrão e prato.

Revista do Instituto de Laticínios Cândido Toestes, Juiz de Fora, v.54, n.306, p.20-22, jan./fev.

1999.

LUND, F., FILTENBORG, O., FRISVAD, J.C. Associated mycoflora of cheese. Food

Microbiology, v. 12, p. 173 – 180, 1995.

NAMUR, J.A.D., CABRAL-ALBUQUERQUE, E.C.D., QUINTILIO, W., SANTANA, M.H.A.,

POLITI, M.J., DE ARAUJO, P.S. LOPES, A.C., DA COSTA, M.H.B. Poly-lactide-co-glycolide

microparticle sizes: a rational factorial design and surface response analysis. Journal of

Nanosciense and Nanotechnology, v. 6, n. 8 p. 2403 – 2407, 2006.

NAVEENA, B.M.; MUTHUKUMAR, M.; SEN, A.R.; BABJI, Y.; MURTHY, T.R.K.

Improvement of shelf-life of buffalo meat using lactic acid, clove oil and vitamin C during retail

display. Meat Science, v. 74, n. 2, p. 409 – 415, 2006.

101

NUNES-FILHO, R. O maravilhoso mundo dos queijos especiais. Superhiper. Promoção II, p. 60

– 64, 2012.

OLIVEIRA, J. S. Queijo: Fundamentos Tecnológicos. 2a ed., Ed. Icone, Campinas, 1986.

PANELLI S, BUFFONI JN, BONACINA C, FELLIGINI M. Identification or moulds from the

taleggio cheese environment by the use of barcodes. Food Control, v. 28, p. 285 – 391, 2012.

PERRY, K.S.P. Queijos: aspectos químicos, bioquímicos e microbiológicos. Química Nova, v.

27, n. 2, p. 293 – 300, 2004.

PITT, J.I.; HOCKING, A.D. Fungi and Food Spoilage. Springer, 3a ed., 2009.

QUEIJOS DO BRASIL. Receita queijo minas padrão. Disponível em:

<http://www.queijosnobrasil.com.br/receita-queijo-minas-padrao.html>. Ingresso em:

Março/2015.

RESIKEM S.A. Distribuición de productos químicos y materias primas para la industria.

Disponível em: <http://www.resikem.com.ar/>. Ingresso em: Fevreiro/2015.

RIBEIRO, J.C., RIBEIRO, W.L.C., CAMURCA-VASCONCELOS, A.L.F., MACEDO, I.T.F.,

SANTOS, J.M.L., PAULA, H.C.B., ARAÚJO FILHO, J.V., MAGALHÃES, R.D., BEVILAQUA,

C.M.L. Efficacy of free and nanoencapsuated Eucalyptus citriodora essential oils on sheep

gastrointestinal nematodes and toxicity for mice. Veterinaty Parasitology, v. 204, p. 243 – 248,

2014.

RHAYOUR, K., BOUCHIKHI, T., TANTAOUI-ELARAKI, A., SENDIDE, K., REMMAL, A.

The mechanism of bactericidal action of Oregano and clove essential oils and their phenolic major

componts on Escherichia coli and Bacillus subtilis. Journal of Essential Oil Research, v. 15, p.

286 – 292, 2003.

102

ROBINSON, R.K. Microbiologia lactológica – microbiologia de los productos lácteos. Ed.

Acrobia, Zaragoza - España, 1987.

ROCHA, A. M. P. Controle de Fungos Durante a Maturação do Queijo Minas Padrão. Dissertação

de Mestrado – Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2004

RODEA-GONZÁLEZ, D.A., CRUZ-OLIVARES, J., RÓMAN-GUERRERO, A., RODRÍGUEZ-

HUEZO, M.E., VERNON-CARTER, E.J., PÉREZ-ALONSO, C. Spray-dried encapsulation of

chia essential oil (Salvia hispánica L.) in whey protein concentrate-polysaccharide matirces.

Journal of Food Engineering, v. 111, p. 102 – 109, 2012.

SACCHETTI, G.; MAIETTI, S.; MUZZOLI, M., SCAGLIANTI, M., MANFREDINI, S.,

RADICE, M., BRUNI, R. Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as

functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods. Food Chemistry, v. 91, n. 4 p.

621 – 632, 2005.

SAGALOWICZ, L., LESER, M.E. Delivery systems for liquid food products. Current Opinion

in Colloid and Interface Science, v. 15, p. 61 – 72, 2010.

SAJJADI, S., JAHANZAD, F., YIANNESKIS, M., BROOKS, B.W. Phase inversion in abnormal

O/W/O emulsions: effect of surfactant hydrophilic-lipophilic balance. Industry and Engineering

Chemical Research, v. 42, p. 3571 – 3577, 2004.

SALAGER, J.L., FORGIARINI, A., MARQUEZ, L., PENA, A., PIZZINO, A., RODRIGUEZ,

M.P., RONDO-GONZALEZ, M. Using emulsion inversion in industrial processes. Advances in

Colloid and Interface Science, v. 108, p. 259 – 272, 2004.

SALVIA-TRUJILLO, L., ROJAS-GRAÜ, A., SOLIVA-FORTUNY, R., MATÍN-BELLOSO, O.

Physicochemical characterization and antimicrobial activity of food-grade emulsion and

nanoemulsion incorporating essential oils. Food Hydrocolloids, v. 47, p. 547 – 556, 2015.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814604005096

103

SIGMA-ALDRISH BRASIL. Produces and sells a broad range of biochemicals, organic and

inorganic chemicals and related products. Dispinivel em:

<http://www.sigmaaldrich.com/brazil.html>. Ingresso em: Fevereiro/2015.

SILVA, J. G. Características físicas, físico-químicas e sensoriais do queijo Minas artesanal da

Canastra. Lavras: UFLA, p. 198, 2007.

SANTIN, R., GIORDANI, C., MADRIS, I.M., MATOS, C.B., FREITAG, R.A., MEIRELES,

M.C.A., CLEFF, M.B., MELLO, J.R.B. Atividade antifúngica do óleo essencial de Origanum

vulgare frente a Malassezia pachydermatis. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e

Zootecnica, v. 66, n. 2, p. 367 – 373, 2014.

SANTOS, D.M., GALVÃO, L.C.A., MENEZES, H.C. Tecnologia de queijos. I - Testes de coalhos

com queijos prato e minas frescal. Col. Inst. Tecnol. Alim, v.8, p.95, 1997.

SCARCELLI, F. A evolução do mercado de queijos em 2014 e suas perspectivas. Revista Leite e

Derivados, v. 152, p. 21 – 22, 2015.

SCHOLTE, R.P.M., SAMSON, R.A., DIJKSTERHUIS, J. Spoilage fungi in the industrial

processing of food. In: SAMSON, R.A.; HOEKSTRA, E.S.; FRISVAD; J.C.; FILTENBORG, O.

Introduction to food and airborne fungi. 6th. ed. Utrecht: Centraal Bureau Voor

Schimmelcultures, p. 339-356, 2000.

SEVERINO, R., DANG-VU, K., DONSÌ, F., SALMIERI, S., FERRARI, G., LACROIX, M.

Antibacterial and physical effects of modified chitosan-coating containing nanoemulsion of

mandarin essential oil and three non-thermal treatments against Listeria innocua in green beans.

International Journal of Food Microbiology, v. 191, p. 82 – 88, 2014.

SHINODA, K. Proceedings of the 5th International Congress of Surface Activity, Barcelona,

Spain, v. 2, p. 275 – 283, 1969.

104

SOLANS, C.; IZQUIERDO, P.; NOLLA, J.; AZEMAR, N.; GARCIA-CELMA, M.J. Nano-

emulsions. Current Opinion in Colloid and Interface Science, v. 10, n. 3 – 4, p. 102 – 110, 2005.

SOUZA, E.L., BARROS, J.C., OLIVEIRA, C.E.V., CONCEIÇÃO, M.L. Influence of Origanum

vulgare L. essential oil on enterotoxin production, membrane permeability and surface

characteristics of Staphylococcus aureus. International Journal of Food Microbiology, v. 137,

n. 2 – 3, p. 308 – 311, 2009.

SPERNATH, L.; MAGDASSI, S. A new method for preparation of poly-lauryl acrylate

nanoparticles from nanoemulsions obtained by the phase inversion temperature process. Polymers

for Advanced Technologies, v. 18, n. 9, p. 705 – 711, 2007.

STETZENBACH, L.D. Microorganisms and indoor air quality. Clinical Microbiology

Newsletter, v. 20, p. 34 – 45, 1998

STEVIĆ, T., BERIĆ, T., SAVIKIN, K., SOKOVIĆ, M., GODEVAC, D., DIMKIĆ, I.,

STANKOVIĆ, S. Antifungal activity of selected essential oils against fungi isolated from

medicinal plant. Industrial Crops and Products, v. 55, p. 116 – 122, 2014.

STUPAR, M., GRBIĆ, L.J., DZAMIĆ, A., UNKOVIĆ, N., RISTIĆ, M., JELIKIĆ, A.,

VUKOJEVIĆ, J. Antifungal activity of selected essencial oils and biocide benzalkonium chloride

against the fungi iolated from cultural heritage objects. South African Journal of Botany, v. 93,

p. 118 – 124, 2014.

TAHEREH-KHALILI, S., MOHSENIFAR, A., BEYKI, M., ZHAVEH, S., RAHMANI-

CHERATI, T., ABDOLLAHI, A., BAYAT, M., TABATABAEI, M. Encapsulation of Thyme

essential oils in chitosan-benzoic acid nanogel with enhanced antimicrobial activity against

Aspergillus flavus. LWT – Food Science and Technology, v. 60, p. 502 – 508, 2015.

105

TANIWAKI, M.H.; HOCKING, A.D.; PITT, J.I.; FLEET, G.H. Growth of fungi and mycotoxin

production on cheese under modified atmospheres. International Journal of Food Microbiology,

68, p. 125 – 133, 2001.

TIMÓTEO DOS SANTOS, N.S., ALVES-ATHAYDE, A.A.J., VASCONCELOS DE

OLIVEIRA, C.E., VERÍSSIMO DE SALES, C., MELO DE SILVA, S., SOUSA DA SILVA, R.,

MONTENEGRO-STAMFORD, T.C., LEITE DE SOUZA, E. Efficacy of the application of a

coating composted of chitosan and Origanum vulgare L. essential oil to control Rhizopus stolonifer

and Aspregillus niger in grapes (Vitis labrusca L.). Food Microbiology, v. 32, p. 345 – 353. 2012.

THOMPSON, D. P. Fungitoxic activity of essential oil components on food storage fungi.

Mycologian v. 81, p. 151-153, 1989.

ZABKA, M., PAVELA, R., PROKINOVA, E. Antifungal activity and chemical composition of

twenty essencial oils against significant indoor and autdoor toxigenic an aeroallergenic fungi.

Chemosphere, v. 112, p. 443 – 448, 2014.

ZARBIELLI, M; SANTIN, M; JACQUES, R; STUART, G; VALDUGA, E. Formulação e

caracterização físico-química e sensorial de queijo Minas light enriquecido com fonte de ferro.

Alimentos e Nutrição, v. 15, p. 251 – 257, 2004.

ZHAVEH, S., MOHSENIFAR, A., BEIKI, M., TAHEREH-KHALILI, S., ABDOLLAHI, A.,

RAHMANI-CHERATI, T., TABATABAEI, M. Encapsulation of Cuminum cyminum essential oils

in chitosan-caffeic acid nanogel with enhanced antimicrobial activity against Aspergillus flavus.

Industrial Crops and Products, v. 69, p. 251 – 256, 2015.

106

ANEXOS

Anexo 1. Especificações técnicas do óleo essencial de orégano (Origanum vulgare). (Fonte:

www.ferquima.com.br)

avaliação da atividade antifúngica de óleo essencial de orégano

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