1 atividade antioxidante in vitro e antifúngica do noni ( morinda citrifolia l.)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUI CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE NUTRIÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO

ADRIANA BARBOSA COSTA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE in vitro E ANTIFÚNGICA DO NONI ( Morinda citrifolia L.)

Teresina 2011



TERESINA 2011

Dissertação para obtenção do grau de Mestre,

pelo curso de Pós-Graduação em Alimentos e

Nutrição, setor do Centro de Ciências da Saúde

da Universidade Federal do Piauí.

Orientador: Profº Dr. Alessandro de Lima



Comissão julgadora da dissertação para obtenção do grau de Mestre:

________________________________________________ Prof. Alessandro de Lima

Orientador/Presidente

________________________________________________ Elma Regina Silva de Andrade-Wartha

2° examinador

________________________________________________ Reginaldo Almeida da Trindade

3° examinador

Teresina, 12 de Abril de 2011.

Aos meus pais, Alaíde e José, que mesmo com toda dificuldade, sempre estiveram dispostos a ajudar os filhos nos ensinando a sermos humildes e solidários mesmo com as adversidades que a vida nos impõe.

O que dignifica a vida de um homem não são as derrotas

impostas aos seus opositores, mas as vitórias silenciosas,

sem manchetes, conseguidas sobre si mesmo, e que

ninguém pode avaliar quanto de renúncias e penosos

sacrifícios cada uma delas lhe custou.

João José Torres

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me confortar e abençoar toda a minha família.

À minha mãe, Alaíde, pela ajuda infinita, por ser minha mola mestra, pelas

preocupações, por estar sempre disponível aos filhos, em todos os momentos;

Ao meu orientador, Prof. Dr°.Alessandro de Lima, pelo voto de confiança, por

ter me aceitado como sua orientanda com tanto carinho, pelo exemplo notório de

professor e que em tão pouco tempo, me repassou conhecimentos valiosos dentro

da ciência dos alimentos e principalmente, pela forma humilde e respeitosa com que

trata seus orientandos e por me inspirar no campo da pesquisa. Espero não ter lhe

decepcionado!

A UFPI, por ter sido o berço da minha formação acadêmica e ao Programa de

Pós- Graduação em Alimentos e Nutrição da UFPI, na pessoa da professora Pós.

Doc. Regilda Saraiva do Reis Moreira Araújo, pela iniciativa de fundar o primeiro

mestrado em Nutrição da UFPI dando oportunidade para muitos alunos de fazer um

mestrado em uma instituição que tanto nos engrandece;

Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí (IFPI), por

ter me disponibilizado o laboratório para realização das minhas análises;

Ao meu grande amor, amigo e companheiro, Thiago Luiz, pelo amor que nos

une e por tudo que representa em minha vida, por ser um exemplo de determinação

e de esforço e por me apoiar em todos os momentos;

À minha grande amiga, Nonata, pela espiritualidade que fortalece a todos,

pelas orações e pela amizade verdadeira, suas palavras sempre ficarão no meu

coração;

Aos amigos sempre dispostos a ajudar: Adenilma, Juliana e Leidiane, pela

força e amizade;

À minha tão exemplar ajudante de laboratório e estagiária do IFPI, Denise

Vilela;

A Ana Mara, por ter me ajudado a engrandecer esse trabalho nas análises de

β-caroteno-ácido linoléico;

Ao NUEPPA, pela disponibilização do laboratório de microbiologia e ao

doutorando Chico, pela disponibilidade e ajuda nas análises antifúngicas;

Ao Manoel, técnico do IFPI, por ter contribuído para o enriquecimento do

trabalho;

Aos colegas pós-graduandos, com os quais compartilhei muitos momentos de

alegria e de preocupações e com os quais sempre vou ter especial carinho: Juliana,

Leidiane, Marina, Ana Lina, Rosana, Adolfo, Theídes, Vanessa e Celsa;

E muito obrigada a todos aqueles que torcem por mim e me abraçam em

todos os momentos!

E a todos aqueles não citados aqui, mas que de uma forma ou de outra

cooperaram comigo.

RESUMO

Na busca pela identificação de novas fontes de antioxidantes naturais e de esclarecer lacunas, na literatura científica, a cerca das reais propriedades benéficas atribuídas ao Noni (Morinda citrifolia Linn), o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização química e avaliar a atividade antioxidante e antifúngica da polpa, casca e semente do noni. Foi determinada a composição centesimal (umidade, cinzas, proteínas, carboidratos e lipídios); os compostos bioativos (fenólicos totais, carotenóides totais e vitamina C); a atividade in vitro; nos extratos aquoso, etanólico e acetônico, utlizando os métodos de captura de radicais DPPH, ABTS e de co-

oxidação do -caroteno/ácido linoléico, já a atividade antifúngica foi realizada pela inibição dos fitopatógenos Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum. Os resultados demonstraram que, em relação a outros frutos, as distintas partes do noni possuem quantidades significativas de carboidratos, (27,21±0,82; 9,70±0,55 e 8,37±0,43) para semente, casca e polpa, respectivamente e de proteínas (2,64 ± 0,03; 2,23 ± 0,4; e 2,24 ± 0,04) semente, casca e polpa, respectivamente. A polpa apresentou maior teor de vitamina C (23,1±0,1 mg/100g) e de carotenóides totais (3,90 ±0,05 mg/100g). No extrato acetônico da polpa foi quantificado 109,81 ± 2,02 mg/100g de fenólicos totais, seguido pelos extratos acetônicos da casca (76,01±6,36 mg/100g), da semente (28,75±1,07 mg/100g) e do extrato etanólico da polpa (20,33 ± 1,37 mg/100g). Todos os extratos avaliados apresentaram atividade antioxidante in vitro, entre estes, o acetônico e etanólico da casca e semente do noni, possuiram maior atividade pelo método β-caroteno/ ácido linoléico, o extrato etanólico da polpa teve uma maior atividade antioxidante pelo ensaio DPPH e ABTS e o extrato acetônico da polpa pelo método ABTS. Quanto à atividade antifúngica, o extrato aquoso da polpa, casca e semente apresentaram melhor atividade inibitória para o fungo Aspergillus japonicus, demonstrando que o noni é fonte de compostos bioativos que possuem atividade antioxidante e antifúngica relevantes.

Palavras-chave: noni, compostos bioativos, atividade antioxidante, atividade

antifúngica.

ABSTRACT

In the quest for identifying new sources of natural antioxidants and to clarify gaps in scientific literature, about the real beneficial properties attributed to Noni (Morinda citrifolia Linn), the purpose of this study was to do the chemical characterization and evaluate antioxidant and antifungal activity of the pulp, skin and seeds of the noni. It was determined the proximate composition (moisture, ash, protein, carbohydrates and lipids), the bioactive compounds (total phenolics, total carotenoids and vitamin C), the in vitro activity, in aqueous, ethanolic and acetone extracts, using capture methods of DPPH radical, ABTS and co-oxidation of -carotene / linoleic acid. The

antifungal activity was carried out by the inhibition of plant pathogens Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus and Penicillium citrinum. The results showed that compared to others fruits, the different parts of the noni have significant amounts of carbohydrates (27.21 ± 0.82, 9.70 ± 0.55 and 8.37 ± 0.43) for seed, rind and pulp, respectively, and protein (2.64 ± 0.03, 2.23 ± 0.4, and 2.24 ± 0.04) seeds, bark and pulp, respectively. The pulp had a higher content of vitamin C (23.1 ± 0.1 mg/100 g) and carotenoids (3.90 ± 0.05 mg/100g). In the acetone extract of the pulp was measured 109.81 ± 2.02 mg/100g of total phenolics, followed by acetonic extracts of skin (76.01 ± 6.36 mg/100g), seed (28.75 ± 1.07 mg/100g) and the ethanolic extract of the pulp (20.33 ± 1.37 mg/100g). 1.37 mg/100g). All extracts evaluated showed in vitro antioxidant activity. Acetone and ethanolic extracts of peel and seeds of the noni, possessed greater activity by the method β-carotene / linoleic acid. The ethanolic pulp extract had a higher antioxidant activity by DPPH and ABTS assay and acetone extract of pulp by the ABTS method. As for the antifungal activity, the aqueous extract of the pulp, peel and seeds showed better inhibitory activity for the fungus Aspergillus japonicus, showing that noni is a source of bioactive compounds that have antioxidant activity and antifungal relevant.

Keywords: noni, bioactive compounds, antioxidant activity, antifungal activity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Estrutura química dos principais tipos de flavonóides ........................ 28

Figura 02 Estrutura química dos principais ácidos fenólicos............................... 29

Figura 03 Estabilização do radical ABTS ·+ por um antioxidante e sua formação

pelo perssulfato de potássio.................................................................

31

Figura 04 Estabilização do radical livre DPPH..................................................... 32

Figura 05 Árvore adulta do noni (fonte:

www.sucononi.com)..............................................................................

36

Figura 06 (A) Fruto verde; (B) “de vez”, ponto de colheita; (C) maduro, ponto

ideal para retirada das sementes. (Fonte: EMBRAPA,

2010).....................................................................................................

36

Figura 07 Fluxograma de preparo e obtenção dos extratos da polpa, casca e

semente do noni, por extração seqüencial...........................................

42

Figura 08 Curva de calibração de ácido gálico (mg/L)......................................... 43

Figura 09 Curva de calibração-resposta da porcentagem de inibição de trolox

em etanol (0 a 20 μg/mL) frente ao radical ABTS•+ ........................

46

Figura 10 Curva cinética do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanólico

e acetônico da polpa do noni................................................................

57


e acetônico da casca do noni...............................................................

57


e acetônico da semente do noni...........................................................

58

Figura 13 Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato aquoso da

polpa do noni .......................................................................................

60


semente do noni...................................................................................

61


casca do noni........................................................................................

61

Figura 16 Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato etanólico da

polpa do noni........................................................................................

62


semente do noni...................................................................................

62

http://www.sucononi.com)/


casca do noni.......................................................................................

63

Figura 19 Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato acetônico da

polpa do noni........................................................................................

61


semente do noni...................................................................................

62


casca do noni........................................................................................

62

Figura 22 Curva cinética da atividade antioxidante de extratos alcoólicos da

polpa, casca e semente do noni...........................................................

65

Figura 23 Curva cinética da atividade antioxidante de extratos aquosos da


65

Figura 24 Curva cinética da atividade antioxidante de extratos acetônicos da


66

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Principais agentes de defesa antioxidante ........................................ 20

Tabela 02 Fontes alimentares de antioxidantes dietéticos................................. 23

Tabela 03 Composição centesimal da polpa, semente e casca do noni

(Morinda citrifolia Linn.) ....................................................................

49

Tabela 04 Teor de vitamina C e carotenóides da polpa, casca e semente do

noni (Morinda citrifolia Linn.) em mg/ 100g de

amostra..............................................................................................

50

Tabela 05 Teores de fenólicos totais (expresso em equivalente de ácido

gálico) presente no extrato aquoso, etanólico e acetônico da polpa,

casca e semente do noni (Morinda citrifolia Linn.).............................

52

Tabela 06 Atividade antioxidante dos extratos aquoso, etanólico e acetônico

da polpa, casca e semente de noni (Morinda citrifolia Linn.), pelo

método β-caroteno/ ácido linoléico

............................................................................................................

55

Tabela 07 Capacidade antioxidante (EC50 em ppm) dos extratos da polpa,

semente e casca do noni, utilizando o método β-caroteno/ ácido

linoléico..............................................................................................

55

Tabela 08 Coeficiente de correlação linear (r2) obtido dos extratos alcoólicos,

aquosos e acetônico da polpa, semente e casca do noni (Morinda

citrifolia Linn) na avaliação da atividade antioxidante pelo método

do β-caroteno/ ácido linoléico...........................................................

56

Tabela 09 Coeficiente de correlação linear (r2) obtido dos extratos alcoólicos,

aquosos e acetônico da polpa, semente e casca do noni (Morinda

citrifolia Linn). na avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio

do radical DPPH•...............................................................................

59

Tabela 10 Capacidade antioxidante, expressos em EC50 (μg/mL) dos extratos

da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn)

utilizando o radical livre DPPH...........................................................

60

Tabela 11 Capacidade Antioxidante Total (TEAC) dos extratos aquoso,

alcoólico e acetônico da polpa, casca e semente do noni (Morinda

citrifolia Linn) pelo método ABTS•+ expressos em mM de trolox/ g

de amostra fresca.............................................................................. 65

Tabela 12 Taxa de inibição do crescimento micelial de Aspergillus terreus

sobre ação do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni.

em diferentes concentrações............................................................

69

Tabela 13 Taxa de inibição do crescimento micelial de Penicillium citrinum


em diferentes concentrações............................................................

69

Tabela 14 Taxa de inibição do crescimento micelial de Aspergillus japonicus


em diferentes concentrações.............................................................

70

LISTA DE ABREVIATURAS

ABTS: 2,2´- azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico

BHA: butilhidroxianisol

BHT: butilhidroxidotolueno

DCFI: diclorobenzenoindofenol

DPPH: radical [2,2 difenil-1-pricril-hidrazil (DPPH)]

ERNs: espécies reativas de nitrogênio

EROs: espécies reativas de oxigênio

H2O2: peróxido de hidrogênio

HClO: ácido hipocloroso

HO• : hidroxila

NO-: ânion nitroxila

NO+: cátion nitrosonium

O2 •−: superóxido

ONOO- : peroxinitrito

PG: propilgalato LDL

RO• : alcoxila

ROO• : peroxila

TBHQ: terciobutilhidroxinona

TEAC: atividade antioxidante total equivalente ao trolox

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15

2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 17

2.1 OS RADICAIS LIVRES .................................................................................... 17

2.2 ESTRESSE OXIDATIVO.................................................................................. 18

2.3 COMPOSTOS ANTIOXIDANTES ................................................................... 19

2.3.1 Mecanismos de ação dos antioxidantes ............................................ 21

2.3.2 Antioxidantes dietéticos ou naturais ................................................. 22

2.3.2.1 Vitamina C (ácido ascórbico) ................................................... 24

2.3.2.2 Vitamina E ................................................................................ 25

2.3.2.3 Carotenóides ............................................................................ 26

2.4 COMPOSTOS FENÓLICOS ............................................................................. 27

2.4.1 Flavonóides e Ácidos fenólicos ........................................................ 29

2.4.2 Métodos utilizados na avaliação da capacidade antioxidante ....... 30

2.5 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE PLANTAS ...................................................... 33

2.6 O NONI ............................................................................................................ 35

2.6.1 Características da planta .................................................................... 36

2.6.2 Constituição química ........................................................................... 38

2.6.3 Atividade biológica .............................................................................. 36

3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 38

3.1OBJETIVOS GERAL ........................................................................................ 38

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 38

4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 39

4.1 OBTENÇÃO E PREPARO DAS AMOSTRAS ............................................................. 39

4.2 MÉTODOS .............................................................................................................................. 39

4.2.1 Análise da composição centesimal .............................................................. 39

4.2.2 Obtenção dos extratos aquoso, alcoólico e acetônico, e

quantificação de sólidos totais (peso seco) ........................................................ 40

4.2.3 Compostos fenólicos totais, segundo SWAIN, 1959, adaptada por

LIMA, 2008 ........................................................................................................................... 41

4.2.4 Conteúdo de carotenóides totais segundo AOAC (1998) ................... 42

4.2.5 Conteúdo de vitamina C pelo método de TILLMANS modificado por

Benassi e Antunes-1988 ............................................................................................... 43

4.2.6 Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos da

polpa, semente e casca do noni ................................................................................ 44

4.2.6.1 Método DPPH ......................................................................................... 44

4.2.6.2 Método ABTS ........................................................................................... 44

4.2.6.3 Método de co-oxidação do -caroteno/ácido linoléico ................ 45

4.2.7 Determinação da atividade antifúngica ....................................................... 47

4.4 TRATAMENTO ESTATÍSTICO ....................................................................................... 47

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 48

5.1 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL ......................................................................................... 48

5.2 VITAMINA C E CAROTENÓIDES ................................................................................... 49

5.3 FENÓLICOS TOTAIS.......................................................................................................... 50

5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO ............................ 51

5.4.1 Método β-caroteno/ ácido linoléico ............................................................... 52

5.4.2 Atividade antioxidante utilizando o radical DPPH· .................................. 57

5.4.3 Atividade antioxidante pelo método ABTS·+ .............................................. 64

5.4.4 Atividade antifúngica ........................................................................................... 67

6. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 72

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................... 73

15 INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

Durante séculos, as diferentes culturas do mundo têm utilizado produtos naturais

e herbáceos como parte do acervo da medicina tradicional. Frente a isso, o uso de

plantas medicinais e seus extratos vêm crescendo na assistência à saúde

(VARANDA, 2006) em função de sua fácil aceitabilidade, disponibilidade e baixo

custo. Em todo o mundo, a medicina popular é utilizada para cuidados primários em

relação à saúde, sendo que a maior parte dessa terapia tradicional envolve o uso de

extratos de plantas ou seus princípios ativos. Dessa forma, cientistas e profissionais

da saúde têm aumentado o interesse neste campo de pesquisa reconhecendo os

reais benefícios que os produtos naturais podem proporcionar à saúde (VARANDA,

2006; BALUNAS et al., 2006).

Os compostos bioativos mais comumente encontrados em vegetais, frutas e

hortaliças são as substâncias fenólicas, que são formadas no metabolismo

secundário dos vegetais, podendo ser encontradas na forma livre ou ligadas a

açúcares e proteínas, possuindo várias funções como: crescimento da planta,

propriedades sensoriais, processos germinativos da semente, defesa contra pragas

e danos oxidativos. Em animais e humanos, os estudos têm apontado que os

compostos fenólicos são capazes de bloquear as estruturas radicalares, devendo-se

isto à estrutura química, formada por pelo menos um anel aromático com

grupamentos hidroxila (BRAVO, 1998; LIU, 2007).

O excesso de radicais livres no organismo, leva ao estresse oxidativo (conjunto

de condições intra e extracelulares que leva à geração exacerbada de radicais livres,

causando desequilíbrio na homeostase). Esta condição tem sido associada como

um possível agente causador de uma série de doenças crônicas não transmissíveis,

como aterosclerose, infarto do miocárdio, artrite reumatóide, catarata, mal de

Parkinson, envelhecimento precoce, câncer, dentre outras. (MANACH e DONOVAN,

2004; KIM et al., 2008).

Os Estudos em todo o mundo têm caracterizado vários produtos naturais com o

intuito de identificar e quantificar os componentes bioativos destes vegetais a fim de

utilizá-lo na alimentação da população e com isso reduzir o risco de surgimento de

doenças. Nesse contexto, as frutas exóticas, como o Noni (Morinda citrifolia Linn),

16 INTRODUÇÃO

tem ganhado cada vez mais espaço, tanto pela busca de benefícios que estas

possam oferecer, como pela procura por diferentes tipos de fontes alimentares.

Pesquisas estão sendo feitos com a planta Morinda citrifolia, popularmente

conhecida por noni. O emprego tradicional do noni, usado há mais de 2000 anos

pelos polinésios, está atribuído aos efeitos relacionados com atividade

antibacteriana, antioxidante, antiviral, antifúngica, antitumoral, anti-helmíntica,

analgésica, antiinflamatória, hipotensora e imunoestimulante (WANG et al., 2002).

Esse vegetal tem suas folhas e especialmente seu fruto consumidos sob

diferentes formas por várias comunidades do mundo (CHANBLANCO et al., 2006).

No Brasil o seu consumo como alimento ou como medicamento tem aumentado de

forma significativa nos últimos anos.

Com isso, há um grande marketing comercial do noni no Brasil, tal fato se dá por

essa planta possuir um papel relevante na economia dos países da qual é originada.

Atualmente o nosso país é o quinto maior mercado de produtos à base de noni e

existem cadastrados, mais de 18.000 distribuidores que comercializam o suco de

Noni, cápsulas de extrato seco e do pó da planta, todos esses produtos estão à

venda nas farmácias de manipulação (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE EMPRESAS

DE VENDAS DIRETAS, 2006).

Diante da relevância que tem alcançado os estudos sobre as propriedades

medicinais da Morinda citrifolia Linn, é de fundamental importância pesquisas que

avaliem os reais benefícios que esta planta pode trazer à saúde. Diante do exposto,

este trabalho teve como objetivo caracterizar nutricionalmente o Noni, bem como

avaliar sua atividade antioxidante e antinfúngica, nas distintas partes que compõem

o fruto (casca, semente e polpa).

17 REVISÃO DE LITERATURA

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 OS RADICAIS LIVRES

O termo radical livre pode ser definido como um conjunto de moléculas

orgânicas e inorgânicas que contêm em sua estrutura um ou mais elétrons não

pareados, independentes na sua existência (HALLIWELL, 1994). Ou seja, são

átomos ou moléculas altamente reativos, que contém número ímpar de elétrons em

sua camada eletrônica e este não emparelhamento de elétrons da ultima camada

confere alta reatividade a esses átomos ou moléculas (HALLIWELL, 1992;

HALLIWELL, 1990).

Tal configuração eletrônica faz dos radicais livres moléculas muito instáveis, com

meia-vida muito reduzida e muito reativas quimicamente. A presença desses radicais

no organismo humano torna crítica a manutenção de muitas funções fisiológicas

normais (POMPELLA, 1997).

Esses radicais livres, cujo elétron desemparelhado encontra-se centrado nos

átomos de oxigênio ou nitrogênio, são classificados como espécies reativas de

oxigênio (EROs) ou espécies reativas de nitrogênio (ERNs). As principais EROs

distribuem-se em dois grupos, os radicalares: hidroxila (HO•), superóxido (O2 •−),

peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•); e os não radicalares: oxigênio, peróxido de

hidrogênio (H2O2) e ácido hipocloroso (HClO). Como ERNs podemos citar o cátion

nitrosonium (NO+), o ânion nitroxila (NO-) e o peroxinitrito (ONOO-) (DROGE, 2002,

BARREIROS, et al.,2006).

Portanto, como a exemplo do H2O2, apesar de não ser considerado um radical

livre, é capaz de atravessar a membrana nuclear e induzir danos à molécula de DNA

por meio de reações enzimáticas. Algumas ERO e ERN podem ser altamente

reativas no organismo causando danos aos lipídeos, proteínas e DNA, outros são

reativas apenas com os lipídeos, além disso, existem aqueles que são poucos

reativos, mas que apesar disso podem gerar espécies danosas (ANDERSON, 1996).

A geração dos radicais livres, nas células, ocorre tanto no meio citoplasmático,

como nas mitocôndrias e estão envolvidos em funções fisiológicas básicas, como na

produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização

intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes. Porém, sua produção


em excesso apresenta efeitos prejudiciais como a peroxidação dos lipídeos de

membrana e agressão às proteínas dos tecidos e das membranas, enzimas,

carboidratos e DNA (HUSAIN, 1987; ANDERSON, 1996; YU e ANDERSON, 1997).

A produção de radicais livres também ocorre nos fagócitos quando infectados

por bactérias ou vírus, produzindo oxidantes como o óxido nítrico, ânion superóxido,

peróxido de hidrogênio, entre outros, fazendo com que os radicais livres façam parte

da defesa imune do organismo (VALKO et al., 2006)

Os radicais livres se formam em um gama de reações de óxido – redução, no

entanto, podem ceder o elétron solitário, oxidando-se, ou podem receber outro

elétron, reduzindo-se, como o que ocorre com o radical superóxido (O2).que

apresenta um baixa capacidade de oxidação. Portanto, os radicais livres podem

provocar ou serem resultados dessas reações de óxido redução. O radical OH·

apresenta uma alta capacidade de difusão e por isso, é o mais reativo na indução de

lesões nas moléculas celulares (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).

As causas exógenas que levam à formação dos radicais livres são diversas,

como radiações gama, poluentes, praguicidas entre outros. O fumo é uma

importante fonte exógena desses radicais, pois a combustão do cigarro produz

óxidos de nitrogênio levando à oxidação das moléculas biológicas (ELSAYED,

2001).

2.2 ESTRESSE OXIDATIVO

A formação de radicais livres ocorre pela ação catalítica de enzimas in vivo,

durante os processos de transferência de elétrons que ocorrem no metabolismo

celular e pela exposição a fatores exógenos. A concentração desses radicais pode

se elevar devido à maior geração intracelular ou pela deficiência dos mecanismos

antioxidantes, esse desequilíbrio desfavorável que ocorre entre as moléculas

oxidantes e antioxidantes, caracteriza o estresse oxidativo (CERUTTI, 1991;

CERUTTI, 1994; SIES, 1993).

Segundo Dröge (2002), esse desbalanço entre a produção de EROS/ ERNs e

remoção pelos sistemas de defesa antioxidante caracteriza o estresse oxidativo,

sendo este uma condição celular ou fisiológica de EROS/ ERNs que causa danos


moleculares às estruturas celulares tendo como conseqüência alteração funcional e

prejuízo das funções vitais em diversos tecidos e órgãos.

A ocorrência de um estresse oxidativo moderado é frequentemente

acompanhada de um aumento nas defesas antioxidantes enzimática, porém, a

produção de uma quantidade elevada de radicais livres pode causar danos e morte

celular (ANDERSON, 1996). Niess et al.,(1999) afirma que o efeito deletério desse

estresse oxidativo variar consideralmente de um ser vivo para outro, dependendo de

fatores como a idade, estado fisiológico e da dieta.

Os danos oxidativos induzidos nas células e tecidos têm estreita relação com a

etiologia de diversas doenças, principalmente, as crônicas não transmissíveis como

as cardiopatias, aterosclerose e problemas pulmonares, sendo que os danos

oxidativos no DNA também influenciam de forma significativa nos processo de

mutagênese e carcinogênese (POULSEN et al.,1998; AMES, et al.,1993; WITSUN,

1994).

Diante dos danos causados pelos mecanismos radicalares, as proteções

conhecidas do organismo contra as ROS e RNS abrangem a proteção enzimática,

sendo constituído pelas enzimas antioxidantes catalase, superoxido dismutase,

glutationa redutase e glutationa peroxidase; por micromoléculas que podem ter

origem no próprio organismo, como a glutationa, ácido úrico, bilirrubina, albumina e

melationeína; ou são adquiridas através da dieta, como a vitamina C, vitamina E,

carotenóides e os compostos fenólicos presentes principalmente nos alimentos de

origem vegetal (BARREIROS et al.,2006).

2.3 COMPOSTOS ANTIOXIDANTES

A produção contínua e em excesso de radicais livres durante os processos

metabólicos levou ao desenvolvimento de defesas pelo organismo, como o

mecanismo de defesa antioxidante, com o intuito de limitar os níveis intracelulares e

impedir a indução de danos (SIES, 1993). Os compostos antioxidantes são os

agentes responsáveis pela inibição e redução das lesões causadas pelos radicais

livres nas células. Halliwell (2000) define antioxidante como sendo uma substância

que presente em baixas concentrações em relação ao substrato oxidável, regenera

ou previne de maneira eficaz a oxidação desse substrato.


A definição de um bom antioxidante se dá pelas suas características

químicas, como a presença de doadores de elétrons ou de hidrogênio; capacidade

de deslocamento do radical formado em sua estrutura; potencial de quelar metais de

transição envolvidos no processo oxidativo e facilidade de acesso ao local de ação

(MANACH e DONOVAN, 2004).

Quanto à classificação, esses agentes protetores das células contra os

radicais livres, podem ser classificados em antioxidantes enzimáticos e não

enzimáticos (tabela 1), os quais são produzidos pelo organismo, ou antioxidantes

dietéticos, isto é, que são obtidos pela dieta (SIES, 1993).

A exemplo dos antioxidantes que agem enzimaticamente tem-se as enzimas

superóxido dismutase, catalase, NADPH-quinona oxidoredutase, glutationa

peroxidase e enzimas de reparo. Entre os antioxidantes não enzimáticos tem-se as

proteínas do plasma, a glutationa, clorofilina, L-cisteína e os provenientes da dieta

como o α-tocoferol (vitamina E), β-caroteno (pro-vitamina A), ácido ascórbico

(vitamina C) e os compostos fenólicos em que se destacam os flavonóides e os

ácidos fenólicos (PIETTA, 2000; HALLIWELL, 1995).

Tabela 01: Principais agentes de defesa antioxidante

Não-enzimático Enzimático

α-tocoferol (vitamina E) Superóxido dismutase Β-caroteno Catalase

Ácido ascórbico (vitamina C) NADPH-quinona oxidoredutase Flavanóides Glutationa peroxidase

Proteínas do plasma Enzimas de reparo Selênio

Glutationa Clorofilina L-cisteína Curcumina

FONTE: (Adaptado de BIANCH E ANTUNES, 2003)

Outra classificação segundo Bravo (1998), coloca os antioxidantes como

primários ou secundários, sendo que os antioxidantes primários agem como

doadores de prótons e estão nesta classe os compostos fenólicos, tocoferol,

aminoácidos, carotenóides e os antioxidantes sintéticos. Os antioxidantes

secundários têm sua ação no bloqueio da decomposição dos peróxidos e


hidroperóxidos, inativando-os. Nesta classe estão os antioxidantes sintéticos,

compostos fenólicos e as vitaminas A, C e E (DONNELI e ROBINSON, 1995).

Os antioxidantes sintéticos, como o butilhidroxitolueno (BHT), o

butilhidroxianisol (BHA), o propilgalato (PG) e o terciobutilhidroxinona (TBHQ), são

frequentemente usados na indústria de alimentos com o intuito de aumentar a vida

de prateleira dos alimentos que contenham lipídeos em sua composição, entretanto

muitos estudos têm sugerido que o uso de altas doses desses constituintes levam

ao desenvolvimento de processos carcinogênicos, nesse sentido, tem sido

substituídos, ainda que parcialmente, por antioxidantes naturais (BARREIROS e

DAVID, 2006).

Apesar da proteção celular conferida pelos antioxidantes endógenos, os

componentes celulares não são totalmente protegidos e constantemente há

formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio que interagem em diferentes

níveis com o ambiente celular antes de serem eliminadas. No entanto, é de fato

estabelecido que além dos antioxidantes endógenos, é necessária a participação

dos antioxidantes dietéticos, pois são indispensáveis para a defesa apropriada

contra a oxidação e, por isso, têm importante papel na manutenção da saúde. Os

benefícios provenientes de frutas, hortaliças e demais vegetais deve-se em grande

parte à presença de antioxidantes nestes alimentos (LAMPE, 1999).

2.3.1 Mecanismos de ação dos antioxidantes

Os antioxidantes podem atuar sobre diferentes níveis na proteção dos

organismos. Podem agir como captadores de radicais e supressores de estados

excitados, como sistemas catalíticos que neutralizam ou eliminam ROS/ RNS ou

fazendo a ligação de íons metálicos à proteínas, tornando-os indisponíveis para a

produção de espécies oxidantes (HALLIWELl e GUTTERIDGE, 1999).

O primeiro mecanismo de proteção contra os radicais livres é impedir sua

formação, inibindo principalmente reações em cadeia com o ferro e o cobre. Outro

mecanismo importante de defesa é o fato dos antioxidantes serem capazes de

interceptar os radicais gerados pelo metabolismo das células ou por fontes

exógenas, evitando o prejuízo aos lipídeos, aos aminoácidos, às duplas ligações dos

ácidos graxos poliinsaturados e às bases de DNA, impedindo a lesão e perda de


integridade celular. Vale ressaltar que, os antioxidantes da dieta, tais como a

vitamina E, C, A, os flavonóides e carotenóides exercem papel essencial nessa

intercepção de radicais livres. (BIANCHI e ANTUNES, 1999).

Os antioxidantes também atuam no reparo das lesões causadas pelos

radicais, processo este relacionado com a remoção dos danos da molécula de DNA

e com a reconstituição das membranas celulares danificadas. Em alguns casos,

pode ocorrer uma adaptação do organismo em resposta a geração desses radicais

resultando em um aumento da síntese de enzimas antioxidantes (BIANCHI e

ANTUNES, 1999).

As pesquisas em relação aos antioxidantes têm focado principalmente, o uso

de nutrientes isolados no tratamento e prevenção de doenças, além do que, nos

alimentos são encontrados uma variedade de substâncias que podem atuar em

sinergismo na proteção das celulas e tecidos (JACOB, 1995; NIKI et al.,

HERCBERG et al., 1998).

Quanto ao desempenho dos antioxidantes in vivo, este depende de fatores

como: tipo de radical formado, local e como são gerados, análise e métodos para a

identificação dos danos e as doses ideais para obter proteção. Nesse sentido, é

possível que um determinado antioxidante atue como protetor em determinado

sistema mas falhe na proteção ou então, aumente as lesões induzida em outros

sistemas ou tecidos (HALLIWELL et al., 1995).

2.3.2 Antioxidantes dietéticos ou naturais

O sistema de defesa humano contra os radicais livres não seria completo sem

os antioxidantes provenientes da dieta, o que confirma a importância da ingestão

diária desses compostos, proporcionando vários benefícios como melhoria na

qualidade de vida da população (RATMAN et al., 2006).

Os componentes da dieta podem, no entanto, alterar o balanço antioxidante

do organismo, seja pelo aumento no consumo de alimentos ricos em substâncias

antioxidantes. No entanto, há várias lacunas no que se refere aos antioxidantes em

geral, como por exemplo, a inexistência de uma recomendação específica para cada

antioxidante, a falta de padronização dos valores antioxidantes dos alimentos e os


efeitos tóxicos que venham a existir pela administração de dose excessivas de

antioxidantes (LIMA, 2008).

Os compostos antioxidantes da dieta, dependendo do tipo, podem ou não

produzir efeitos sinérgicos de difícil avaliação. A complexidade da dieta deve ser

avaliada e considerada, pois as interações entre seus constituintes podem ocasionar

efeitos que não representam diretamente as propriedades dos seus constituintes

individuais (RICE-EVANS, 1999).

Portanto, a ingestão de antioxidantes dietéticos é a principal forma de

obtenção pelo organismo de antioxidantes e os principais nutrientes são as

vitaminas (C e E), carotenóides (β-caroteno e licopeno) e entre os não nutrientes

incluem-se os compostos fenólicos (flavanóides e ácidos fenólicos). As vitaminas C,

E e o β-caroteno são consideradas excelentes antioxidantes pois são capazes de

seqüestrar os radicais livres com grande eficiência, porém, o uso de medicamentos,

álcool, a poluição atmosférica e muitos outros fatores interferem negativamente nos

níveis de antioxidantes celulares, porém, o organismo pode ter suas defesas

restabelecidas tendo como fonte de antioxidantes, dietas apropriadas e suplementos

a base de vitaminas com expressiva atividade antioxidante. (ROE, 1992; CARAGAY,

1992; ANDERSON, 1996). Os compostos antioxidantes exógenos ou dietéticos são

encontrados em diversos alimentos, na Tabela 02, são elencados alguns alimentos e

seus respectivos compostos antioxidantes.

Tabela 02: Fontes alimentares de antioxidantes dietéticos.

ALIMENTO ANTIOXIDANTE ALIMENTO ANTIOXIDANTE

Mamão β-caroteno Uva Ácido elágico

Brócolis Flavonóides Salsa Flavonóides

Laranja Vitamina C Morango Vitamina C

Chá Catequinas Curry Curcumina

Vinho Quercetina Noz Polifenóis

Cenoura β-caroteno Espinafre Clorofilina

Tomate Carotenóides Repolho Taninos

FONTE: BIANCHI e ANTUNES, 1999.


2.3.2.1 Vitamina C (ácido ascórbico)

Composto natural com expressiva atividade antioxidante e baixa toxicidade, a

vitamina C, por ser um nutriente hidrossolúvel, e está envolvido em múltiplas

funções biológicas, atuando como cofator de diversas enzimas envolvidas na

hidroxilação pós-tradução do colágeno, na biossíntese de cartinina, na conversão de

neurotransmissores, na amidação peptídica e no metabolismo da tirosina. (WEBER

et al., 1996).

Contudo, a vitamina C também tem importante papel na absorção do ferro

dietético pois apresenta a capacidade de reduzir a forma férrica (Fe3+) a ferrosa

(Fe2+), facilitando assim, a absorção do ferro não-heme no trato gastrointestinal

(LOUREIRO , 2002; HALLIWELL, 2001).

Geralmente, o ácido ascórbico é consumido em grandes quantidades pelos

seres humanos, adicionadas a produtos alimentares, com o objetivo de inibir a

formação de metabólitos nitrosos carcinogênicos. Sendo assim, essa vitamina é

rapidamente absorvida e de forma eficiente, por um processo dependente de

energia, entretanto o consumo em doses excessivas pode ocasionar ao aumento da

sua concentração nos tecidos e no plasma sanguíneo (BIANCHI e ANTUNES,

2003).

Além das suas várias funções, a vitamina C é um potente agente redutor

capaz de reduzir grande parte das ROS/ RNS de importância fisiológica, sendo que

em meio fisiológico, encontra-se predominantemente na forma de monoânion

ascorbato (Food and Nutrition Board, 2000). Outra função importante do ácido

ascórbico é referente à sua capacidade de regenerar o α-tocoferol e, por

conseguinte, atuar no mecanismo protetor contra a lipoperoxidação sendo que uma

vez depletada, outros compostos antioxidantes podem, de forma menos eficiente,

reduzir o radical α-tocoferila (AMES, 2001).

2.3.2.2 Vitamina E

A vitamina E é um componente dos óleos vegetais encontrada na natureza

em quatro formas diferentes α, β, δ e α-tocoferol, sendo o α-tocoferol a forma

antioxidante amplamente distribuída nos tecidos e no plasma. A vitamina E


encontra-se em grande quantidade nos lipídeos, e evidências recentes sugerem que

essa vitamina impede ou minimiza os danos provocados pelos radicais livres

associados com doenças específicas, incluindo o câncer, artrite, catarata e o

envelhecimento (Morrissey et al., 1994; Heinonen et al., 1998).

Estudo in vitro comprova a capacidade do α-tocoferol em prevenir a

peroxidação lipídica de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), as quais atuam no

transporte de ácidos graxos e colesterol do fígado para os tecidos periféricos

(THOMAS, 2000). Sua função antioxidante se deve à sua capacidade em inibir a

peroxidação lipídica, combatendo os radicais peroxila e convertendo-se em um

radical tocoferol regenerando o α-tocoferol ao reagir com a vitamina C

(SERRACARBASSA, 2006).

No entanto, tendo em vista os benefícios antioxidantes do α-tocoferol in vitro e

que sua quantidade presente em LDL é rapidamente alterada em resposta ao

consumo dietético, estudos em seres humanos são realizados com o intuito de

verificar a eficácia da suplementação oral deste nutriente tanto no retardo como na

prevenção de doenças que envolvam a lipoperoxidação (JESSUP et al., 2004).

2.3.2.3 Carotenóides

Assim como as vitaminas, os carotenóides são as substâncias mais

investigadas como agentes quimiopreventivos devido a sua funcionalidade como

antioxidantes em sistemas biológicos (POOL-ZOBEL, 1997). São corantes naturais

cuja estrutura química é composta por ligações duplas conjugadas responsáveis

pela cor e função antioxidante desses compostos (RAO e RAO, 2007).

Os carotenóides são isoprenóides, constituídos na sua maioria por 8 unidades

de isoprenos, formando uma longa cadeia de polieno que pode conter de 2 a 15

duplas ligações conjugadas, sendo que isto permite várias configurações cis e trans.

Segundo Olson (1999), os carotenóides desempenham diversas funções no

organismo humano, pois atuam seqüestrando o oxigênio singlete, removendo os

radicais peróxidos, modulando o metabolismo carcinogênico, como também inibindo

a proliferação celular, estimulam a comunicação entre células (junções gap), e

elevam a resposta imune. A quantidade de ligações duplas conjugadas, presentes

nas moléculas dos carotenóides, interfere na ação seqüestrante de radicais.


A proteção dos sistemas biológicos pelos carotenóides do ataque dos radicais

depende de um mecanismo pelo qual há transferência de energia do oxigênio

excitado para a molécula do carotenóide, em que a energia é dissipada por meio de

rotações e vibrações do carotenóide no meio solvente (STAHL e SIES, 1999).

Os carotenóides reagem com os radicais livres, principalmente com os

radicais peróxidos e com o oxigênio molecular, sendo a base de sua ação

antioxidante. Certos carotenóides como a luteína, β-caroteno, zeaxantina e licopeno,

exercem suas funções antioxidantes em fases lipídicas, impedindo que os radicais

livres danifiquem as membranas lipoprotéicas (SIES e STAHL, 1995).

Dessa forma, por serem potentes antioxidantes certos carotenóides atuam

como precursores da vitamina A na dieta, sendo o β-caroteno o mais importante

precursor dessa vitamina, sendo encontrado amplamente distribuído nos alimentos.

Além disso, há também certos carotenóides que não atuam como precursores da

vitamina A como é o caso do licopeno e luteína (HANDELMAN, 2001).

O licopeno está entre os 600 pigmentos carotenóides encontrados na

natureza e entre os 25 que estão presentes no plasma e tecidos. A sua distribuição

no organismo humano é ampla, sendo o fígado o órgão onde há maior acumulo

desse carotenóide (SHAMI e MOREIRA, 2004). É lipossolúvel, composto por onze

ligações conjugadas e duas ligações duplas não conjugadas (RAO e SHEN, 2002).

Também é tido como o carotenóide que possui a maior capacidade seqüestrante do

oxigênio singlete, característica essa atribuída possivelmente à presença na sua

estrutura das duas ligações duplas não conjugadas, o que lhe oferece maior

reatividade (KRINSKY, 2001; DI MASCIO, KAISER e SIES, 1989).

As fontes de carotenóides são várias, como por exemplo, as cenouras e

abóboras (α e β-caroteno), tomates e seus produtos derivados, como extrato de

tomate, polpa e molhos, ricos em licopeno e como fonte de luteína o espinafre

(SILVA e NAVES 2001; BIANCHI e ANTUNES, 1999).

2.4 COMPOSTOS FENÓLICOS

Os compostos fenólicos são encontrados na parede celular dos vegetais livres ou

ligados a açucares (glicosídeos) e proteínas e englobam uma grande variedade

compostos, desde moléculas simples até moléculas com alto grau de polimerização


possuindo em comum um anel aromático, ao qual está unida uma ou mais hidroxilas

(CROF, 1998; BRAVO, 1998; KARAKAYA, 2004). Atuam na adaptação da planta a

condições de estresse ambiental, como na defesa contra radiações ultravioleta ou

agressão por patógenos. Além disso, contribuem para características da planta ou

fruto, como adstringência, cor, flavor e estabilidade oxidativa (NACZK e SHAHIDI,

2004; FARAH e DONANGELO, 2006).

Os compostos fenólicos estão classificados, segundo Ribéreau-Gayon (1968)

como compostos: pouco distribuídos na natureza, polímeros e os largamente

distribuídos na natureza. Na família dos compostos pouco distribuídos na natureza

estão os fenóis simples, o pirocatecol, a hidroquinona e o resorcinol. Também

pertencem a essa família os aldeídos derivados dos ácidos benzóicos, que são os

constituintes dos óleos essenciais como a vanilina (SOARES, 2002).

Os compostos fenólicos presentes na forma de polímeros são aqueles que não

se apresentam na forma livre nos tecidos vegetais. Dentre eles, estão os taninos e

as ligninas. Os taninos são polímeros de alto peso molecular, responsáveis por

conferir sabor adstringente ao alimento e estão classificados em dois grupos: os

taninos hidrolisáveis e os condensados. Já as ligninas, são polímeros complexos, de

grande rigidez e resistência mecânica. Ao sofrerem hidrólise alcalina, liberam

grandes variedades de derivados dos ácidos benzóico e cinâmico (KING e YOUNG,

1999).

Na família dos compostos largamente distribuídos na natureza estão os

fenólicos, podendo ser encontrados em todo reino vegetal ou em apenas uma

planta. Os fenólicos podem ser divididos em dois grandes grupos: os flavanóides e

derivados e os ácidos fenólicos (ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados) e as

cumarinas (SOARES, 2002).

Os compostos fenólicos atuam como seqüestradores de radicais e como

quelantes de metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação, como na de

propagação do processo oxidativo. Isto leva a produção de produtos intermediários,

relativamente estáveis devido à ressonância do anel aromático apresentada por

estas substâncias (NAWAR, 1985; SHAHIDI et al., 1992). O grau de hidroxilação e a

posição dos grupos hidroxila na molécula dos compostos fenólicos são os mais

importantes fatores que determinam a atividade antioxidante nesses compostos. O

tipo de estrutura pode afetar na solubilidade e nos efeitos estéricos de cada


molécula, como ocorre nos derivados glicosilados, que podem aumentar ou diminuir

a atividade antioxidante (RICE-EVANS et al., 1996).

Os compostos fenólicos podem estar presentes entre as distintas partes das

plantas, porém a maior concentração desses compostos está nas frutas, hortaliças e

seus derivados como azeite virgem de oliva, vinho tinto etc. Também pode haver

consideráveis quantidades desses compostos em cereais e leguminosas (SOARES,

2002; LIU, 2005).

2.4.1 Flavonóides e Ácidos fenólicos

Dentre os compostos fenólicos de origem natural destacam-se os flavonóides

e os ácidos fenólicos, cuja classificação ocorre de acordo com as suas estruturas

químicas. A estrutura química dos flavonóides é formada por dois anéis aromáticos

unidos por um heterociclo oxigenado, dependendo do grau de hidrogenação e da

substituição do heterociclo, se classifica, em diferentes grupos: flavonas, flavanóis,

flavonóis, flavononas, antocianinas e isoflavanóides. Estes compostos estão

geralmente ligados a açucares, formando glicosídeos. (KARAKAYA, 2004). A

estrutura dos principais grupos flavonóides pode ser observada na Figura 01:

Figura 01: Estrutura química dos principais tipos de flavonóides.


Quanto aos ácidos fenólicos, também chamados de compostos benzóicos e

cinâmicos, estes possuem estrutura mais simples dentre os compostos fenólicos, na

qual compreende um anel aromático com grupos ligados à sua estrutura, dentre os

quais o mais comum é a hidroxila. Outros grupos funcionais com os quais eles

podem se ligar são os aldeídos, alcoóis ou ácidos, podendo formar ésteres com os

ácidos orgânicos ou unir-se a açucares. Além desses compostos, outros também de

natureza fenólica são os estilbenos, lignanos e, de forma polimeralizada, os taninos

e as ligninas (MANACH e DONOVAN, 2004). Na figura 02, consta a estrutura

química dos principais ácidos fenólicos.

Figura 02: Estrutura química dos principais ácidos fenólicos.

2.4 .2 Métodos utilizados na avaliação da capacidade antioxidante

Um grande número de métodos tem sido desenvolvidos com o intuito de

determinar a capacidade antioxidante dos alimentos. Estes métodos podem ser

baseados na captura do radical peroxila (ORAC, TRAP), poder de redução do metal


(FRAP; CUPRAC), captura do radical hidroxila (método de desoxirribose), captura do

radical orgânico (ABTS, DPPH), quantificação de produtos formados durante a

peroxidação de lipídios (TBARS, oxidação do LDL, co-oxidação do -caroteno)

(FRANKEL e MEYER, 2000; SÁNCHEZ-MORENO, 2002; ARUOMA, 2003), etc.

Dentre estes métodos, ABTS, FRAP, DPPH e ORAC são alguns dos mais usados

atualmente (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA CALIXTO, 2006).

A importância da determinação da atividade antioxidante nos alimentos se dá

principalmente pelo fato de que o conhecimento do potencial antioxidante de cada

alimento, antes de ser ingerido, irá permitir a mensuração da quantidade de cada

alimento necessária para se ter uma resposta antioxidante eficiente. Para isso, é

importante que a determinação da capacidade antioxidante seja avaliada utilizando-

se mais de um método.

Esses métodos são necessários, pois existe uma grande dificuldade em medir

cada composto que tenha ação antioxidante, separadamente, além das interações

existentes entre os diferentes antioxidantes do sistema. Todos os métodos utilizados

na mensuração da capacidade antioxidante têm em comum a presença de um

agente antioxidante e um substrato específico. Esses métodos possuem duas

classificações: os que agem na captura de radicais livres e os que atuam na

determinação de uma molécula alvo (LIMA, 2008).

Dentre as várias metodologias utilizadas para a avaliação da atividade

antioxidante de alimentos vegetais, o método β-caroteno/ ácido linoléico tem sido

bastante utilizado. Este método colorimétrico se baseia na técnica de co-oxidação de

substratos em meio emulsionado, isto é, determina a atividade de uma amostra ou

composto de proteger um substrato lipídico da oxidação. Foi desenvolvido por Marco

(1968) e Miller (1971), no qual utiliza o ácido linoléico, monopalmitato de

polioxietileno sorbitan (Tween 40) e o β-caroteno. É um método colorimétrico que

utiliza comprimento de onda de 470nm sendo que a leitura das absorbâncias se

refere à descoloração da solução (β-caroteno e ácido linoléico) em meio aquoso. O

ácido linoléico, ao ser submetido à oxidação, forma estruturas radicalares, que

atacam as duplas ligações do β-caroteno, que ao perder seu cromóforo provoca a

descoloração da solução. A presença de antioxidantes no sistema protege o ácido

linoléico, prolongando o período de formação dos radicais na reação. Para a

comparação dos resultados obtidos por esse método, utiliza-se o antioxidante

sintético butilhidroxidotolueno (BHT) como padrão positivo para comparação dos


resultados. A eficiência desse método tem sido analisada em várias matrizes

alimentares, principalmente frutos e sementes ricas em lipídeos (Lima, 2008).

Outra metodologia que tem sido bastante aplicada pelos pesquisadores é o

método utilizando o radical ABTS, que apresenta com principais vantagens em

relação aos demais, ser utilizado tanto para extratos hidrofílicos como lipofílicos e a

forma de expressão dos resultados como valor TEAC (atividade antioxidante total

equivalente ao trolox), facilitando assim comparações entre diversos alimentos. O

radical ABTS·, (2,2´- azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) pode ser

gerado por meio de uma reação química, eletroquímica ou enzimática, normalmente

se utiliza o persulfato de potássio (Figura 03). O radical formado é um cromóforo

estável quimicamente e com elevada solubilidade em água e um máximo de

absorbância de 414 nm com medidas secundárias de absorbâncias de 645, 734 e

815 nm (MILLER et al., 1993, Re et al., 1999).

Figura 03: Estabilização do radical ABTS ·+ por um antioxidante e sua formação pelo perssulfato de potássio.

O método DPPH tem sido muito utilizado pela facilidade de execução e baixo

custo, além de obtenção de resultados confiáveis. Foi proposto por Brand-Williams

et al. (1995) e se baseia na captura do radical DPPH (2,2-difenil-1- picril-hidrazil) por

antioxidantes, produzindo um decréscimo da absorbância a 515 nm,. Esse método

foi modificado por SÁNCHEZ-MORENO et al., (1998) para medir os parâmetros

cinéticos. O DPPH é um radical livre que pode ser obtido diretamente por dissolução

do reagente em meio orgânico (Figura 05). A vantagem desse método se dá pela

disponibilidade em se obter comercialmente o radical DPPH, o que evita sua

geração por formas distintas, facilitando seu uso, porém, por ser um método que

utiliza metanol para gerar a reação, seu uso se torna inapropriado para amostras


biológicas, devido à ocorrência de precipitação das proteínas em meio alcoólico

(BRAND-WILLIAMS et al., 1995).

Figura 04: Estabilização do radical livre DPPH.

2.5 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE PLANTAS

Fungos filamentosos, também conhecidos como bolores ou mofos, são

microrganismos eucariotos, heterotróficos e multicelulares. São organismos

fundamentais para o equilíbrio da natureza, além da importância ambiental, eles

também possuem valor econômico e aplicações na produção de alimentos e

medicamentos (AZEVEDO, 2004).

Estes microrganismos estão presentes em todos os ambientes e são

economicamente importantes no campo da medicina, da fitopatologia e da indústria,

além de serem ecologicamente importantes como decompositores. No entanto,

também podem contaminar os alimentos, causando sua deterioração, reduzindo seu

valor nutricional, alterando suas qualidades organolépticas e tornando-se, em alguns

casos, um problema de saúde pública (RAVEN et al., 1992).

Alguns fungos dos gêneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium podem causar

problemas no consumo de grãos, devido à produção de micotoxinas, compostos

capazes de causar doenças em animais e em seres humanos (COELHO NETO e

DHINGRA, 1998). As micotoxinas produzidas por esses fungos são metabólitos

tóxicos naturais e freqüentemente encontradas em alimentos .

Aproximadamente duzentas espécies de fungos são consideradas

toxinogênicas, sendo que o tipo de substrato e as condições do ambiente são

fatores determinantes para a produção de micotoxinas (BOURGEOIS, 1994). Entre


os tóxicos contaminantes de alimentos podemos destacar as aflatoxinas produzidas

por espécies do gênero Aspergillus, as quais são altamente tóxicas e

carcinogenéticas para homens e animais, tornando-se assim, um fator preocupante

para a indústria alimentícia (AMADO, 2004; GRANADA. 2003).

As fumonisinas são toxinas produzidas principalmente pelo fungo Fusarium

moniliforme (SANTURIO, 2000), detectadas naturalmente em diversos alimentos,

principalmente no milho e seus derivados, causam edema pulmonar e hidrotórax em

suínos, leucoencefalo-malácia em eqüinos, e provável câncer de esôfago em

humanos. Além desta toxina, o Fusarium também pode produzir as micotoxinas

zearalenona e tricotecenos (POZZI, 2002; PUTZKE, 2004).

A micotoxina patulina pode ser produzida por várias espécies do gênero

Penicillium e Aspergillus, sendo freqüentemente encontrada em frutas, verduras e

cereais. Em animais, esta toxina causa várias complicações como distúrbios

gastrointestinais, efeitos neurotóxicos e imunológicos. A verruculogeno também é

uma importante toxina produzida por Penicillium e Aspergillus causando fortes

tremores em animais afetados (KAWASHIMA et al., 2002).

A busca por novos agentes antimicrobianos, a partir de plantas, é intensa

devido ao aumento da resistência dos microorganismos patogênicos frente aos

produtos sintéticos. Além disso, o uso destes pesticidas a longo prazo causa

impactos negativos o meio ambiente e para a sociedade, devido à poluição causada

pelos resíduos químicos. Frente a este problema, a agricultura vem criando

estratégias para resolver essas questões, buscando métodos alternativos para o

controle de doenças e pestes, que visem causar menos danos ao ambiente e a

saúde humana. Contudo, muitos trabalhos são desenvolvidos com extratos brutos

ou óleos essenciais, obtidos a partir de plantas medicinais o que têm indicado o

potencial das mesmas no controle de fitopatógenos (BAUTISTA-BAÑOS et al., 2003;

CUNICO et al., 2003; MYTLE et al., 2004; MOREIRA et al., 2004).

No campo, a produtividade das frutas está relacionada à aplicação de

fungicidas, o que pode acarretar no aumento dos níveis de contaminantes químicos

indesejáveis no produto final, somando-se o efeito deletério já proporcionado pelas

toxinas fúngicas naturais. Com isso, os métodos de controle biológico constituem

alternativas viáveis em relação ao químico tradicional, principalmente por não

deixarem resíduos tóxicos nas frutas tratadas (WILSON e WISNIEWSKI, 1997).


Sendo assim, os fungos atuam como os principais agentes causadores de

doenças em plantas. Existem mais de 5.000 espécies de fungos que atacam

culturas de alto valor econômico, bem como plantas ornamentais e outras não

cultivadas (RAVEN et al., 1992). Entre as doenças de importância econômica

causadas por fungos podem ser citadas as murchas do feijoeiro, do tomateiro e da

bananeira, além de atacarem outras culturas como o mamão, melão, melancia,

ervilha, entre outras.

Contudo, no intuito de reduzir os efeitos negativos do uso de agrotóxicos

acarretando assim no aumento da produção de alimentos de melhor qualidade, têm-

se buscado novas medidas de proteção das plantas contra as doenças. Neste

sentido, vários estudos estão sendo realizados na busca pela descoberta de

pesticidas naturais, sendo que os extratos vegetais aparecem como fontes

potenciais para o desenvolvimento desses novos produtos. A utilização de produtos

naturais no controle de doenças de plantas representa um meio eficiente para a

redução do uso de defensivos agrícolas (KIMATI et al., 1997).

2.6 O NONI

A planta Morinda citrifolia Linn, conhecida popularmente como noni, é originária

do Sudeste da Ásia e Austrália e, subsequentemente, foi distribuída em toda a

região do Pacífico, principalmente nas ilhas da Polinésia Francesa, onde se situa o

Taiti. Era uma das plantas que os colonizadores polinésios do Havaí mais

valorizavam e a utilizavam como medicamento e como corante (NELSON, 2006).

Assim, é uma planta tipicamente encontrada nas ilhas do Havaí e Taiti (WANG et al.,

1999; WANG e SU, 2001).

É conhecida, entre outros nomes vulgares, como: Ba Ji Tian, Nonu, Indian

Mulberry, Canary wood e Cheese fruit. Os cultivos comerciais de noni podem ser

encontrados no Taiti, Havaí e outros países da Polinésia, onde se fabricam a maioria

dos sucos comercializados no mundo. Como não há cultivares selecionados, a

exploração comercial de noni dá-se a partir de plantas originadas de sementes. Os

produtos derivados dessa fruta são comercializados nos Estados Unidos da América

(EUA) desde os anos 90 e são distribuídos cada vez mais pelo mundo inteiro

(VEIGA, 2005; SCOT, 2006).


O noni é um fruto rico em vitaminas, proteínas, minerais e no alcalóide

proxeronina. Estudos comprovam as mais de 53 propriedades da M. citrifolia dentre

os quais estas propriedades, podem-se destacar: regenerador celular, antisséptico

natural, analgésico, antiinflamatório, antiparasitário, regulador matabólico,

regenerador de células danificadas e como antioxidante (WANG et al., 2002).

As partes da planta do noni são praticamente todas aproveitadas e a cada uma

delas são atribuídas propriedades medicinais diferentes. A casca, cuja propriedade é

adstringência, é utilizada no tratamento da malária; as folhas são usadas como

analgésico e para inflamações externas; as flores são empregadas no tratamento de

inflamações oculares; o extrato das raízes no tratamento da hipertenão e as

sementes são utilizadas como laxante (RODRIGUEZ e PINEDO, 2004).

A parte da planta de mais ampla utilização é o fruto, com várias aplicações:

antibactericida, analgésica, anticongestiva, antioxidante, expectorante,

antiinflamatória, adstringente, emoliente, emenagoga, laxativa, analgésica,

hipotensora, purificadora do sangue, imunoestimulante e tônica (ELKINS, 1997).

Também é atribuída ao fruto, ação anticancerígena (RODRIGUEZ e PINEDO, 2004).

2.6.1 Características da planta

A Morinda citrifolia é perene, de clima tropical e temperado,freqüentemente

cresce em áreas florestais e em regiões costeiras, com cerca de 400 metros acima

do nível do mar (LUBECK e HANNES, 2001; McCLATHEY, 2002; WANG et al.,

2002).


Figura 05: Árvore adulta do noni (FONTE:www.sucononi.com)

Figura 06: (A) Fruto verde; (B) “de vez”, ponto de colheita; (C) maduro, ponto ideal para

retirada das sementes. (Fonte: EMBRAPA, 2010)


2.6.2 Constituição química

Segundo pesquisas realizadas por Chan-Blanco et al., (2006), o fruto do noni

contém cerca de 90% de água sendo que os principais componentes da matéria

seca são sólidos solúveis, fibras alimentares e proteínas. Em quantidade

consideráveis estão os hidratos de carbono, incluindo quantidades variáveis de

sacarose, frutose e glicose (JENSEN et al., 2005). A partir do suco do noni, o teor de

proteína encontrado foi em torno de 11,3% da matéria seca e os principais

aminoácidos encontrados foram o ácido aspártico, ácido glutâmico e isoleucina

(CHUNHIENG, 2003). O teor de minerais está em torno de 8,4% da matéria seca,

sendo os principais: potássio, enxofre, cálcio e fosfóro. O ácido ascórbico e a

provitamina A são as principais vitaminas encontradas na polpa.

Com relação aos compostos fitoquímicos presentes na polpa do noni, já foram

identificados 160 compostos sendo a maioria dos nutrientes, compostos fenólicos,

ácidos orgânicos e alcalóides. Os compostos fenólicos foram descritos como o maior

grupo dentro dos micronutrientes funcionais, sendo as antraquinonas, rutinam

asperulosido e escopoletina as mais relatadas. Porém, existem diferenças na

composição química para cada parte analisada, além do que, a composição

fitoquímica completa do fruto, incluindo outras partes além da polpa, como a casca e

a semente, ainda não foi descrita pela literatura atual (CHAN-BLANCO et al., 2006).

No fruto maduro foram identificados em torno de 51 compostos voláteis

incluindo ácidos orgânicos, alcoóis, ésteres, cetonas e lactonas (CHAN-BLANCO et

al., 2006).

2.6.3 Atividade biológica

Vários estudos relacionados aos benefícios que o noni pode oferecer ao

organismo estão direcionados para a comprovação do que a medicina popular

advinda dos Polinésios defende: a prevenção e cura de diversas enfermidades

através da ingestão do fruto, principalmente da polpa do noni.

Um dos efeitos mais estudados no noni é relativo à sua atividade antioxidante,

porém com o uso de metodologias pouco aplicáveis no Brasil. Zin, Abdul-Hamid e

Osman (2002) analisaram a atividade antioxidante de extratos polares e não polares


das raízes, folhas e frutos da M. citrifolia. De acordo com a pesquisa, os extratos não

polares das três partes da planta demonstraram possuir alta atividade antioxidante

quando comparados com os antioxidantes clássicos como o α-tocoferol e di-terc-

butilmetil-fenol (BHT).

Estudos relataram que o noni exibe uma atividade relevante na inibição do

crescimento de certas bactérias in vitro, como Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Proteus morgaii, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Helicobacter pylori, Salmonella e Shigella. Este efeito antibacteriano pode estar

relacionado à presença de compostos fenólicos presentes na planta, como alizarina,

escopoletina e outras antraquinonas (ATKINSON, 1956). Já Furuzawa et al., (2003)

estudando o potencial profilático e terapêutico contra Sarcoma 180, utilizaram uma

substância rica em polissacarideos chamada Noni-ppt extraída da Morinda citrifolia.

Os resultados mostraram que a atividade antitumoral de Noni-ppt produziu a cura

em 25% a 45% dos camundongos alogênicos

A atividade antiinflamatória do noni foi estudada por Li et al. (2003), em que

foram investigadas in vitro, a ação antiinflamatória de 24 espécies de plantas

australianas e chinesas e observaram que a M. citrifolia em pó possui atividade

inibitória da enzima cicloxigenase (COX-1). Uma pesquisa feita por Younos et al.,

(1990), utilizando o extrato aquoso liofilizado das raízes da M.citrifolia, investigou a

atividade analgésica do noni em camundongos. O extrato da raiz do noni (1,6 mg/kg)

mostrou uma significante atividade analgésica semelhante ao efeito da morfina em

camundongos.

Entretanto alguns estudos encontraram resultados controversos quanto às

reais propriedades benéficas do consumo de noni. Alguns estudos sugerem que o

uso indiscriminado e em altas doses do noni poderá ter efeitos deletérios à saúde.

Nesse sentido é importante cautela no uso desses produtos e mais estudos com

vistas a esclarecer as lacunas ainda existentes quanto as propriedade medicinais e

antioxidantes do noni.

39 OBJETIVOS

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAL

Avaliar a atividade antioxidante in vitro e a atividade antifúngica da

casca, semente e polpa do Noni (Morinda citrifolia Linn.).

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar a composição centesimal das distintas partes (cascas,

sementes e polpa) do noni;

Quantificar os teores de compostos bioativos (vitamina C, carotenóides e

fenólicos totais) presentes na casca, semente e polpa do Noni;

Avaliar a atividade antioxidante in vitro de extratos de noni, pelos método

de varredura dos radicais DPPH, ABTS e de co-oxidação do β-caroteno/

ácido linoléico.

Analisar a atividade antifúngica no extrato aquoso do noni

40 MATERIAL E MÉTODOS

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 OBTENÇÃO E PREPARO DAS AMOSTRAS

As amostras de Noni (Morinda citrifolia Linn.) foram adquiridas no município

de Altos, estado do Piauí-Brasil a 31 ºC 12” 21’ de latitude e a 400m de altitude,

provenientes de hortas domiciliares. O solo local é Podzólico Vermelho Amarelo

Distrófico com baixa fertilidade natural (P 5 mg/dm³, K14 mg/dm³, Al 6 mmol/dm³, e

Ca+Mg 8 mmol/dm³) e alta acidez (pH-5,3). A precipitação média anual do município

é em torno de 1.297 mm, sendo que cerca de 90% das chuvas se concentram no

período de novembro a maio. A temperatura média anual está em torno de 25°C e

umidade relativa de 67% situado a 42 km ao nordeste de Teresina.Os frutos foram

coletados no período de Agosto a Novembro de 2010.

Os frutos foram coletados maduros e lavados cuidadosamente com água

destilada antes da separação das partes. O fruto foi subdivido em três partes: casca,

semente e polpa. Após a separação das partes, as amostras foram trituradas em

moinho analítico, acondicionadas em sacos plásticos envolvidos por papel alumínio

e armazenados sob congelamento a -18°C, por um período máximo de 30 dias.

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Análise da composição centesimal

A composição centesimal foi realizada pela metodologia do Instituto Adolfo

Lutz (2005). A determinação da umidade foi feita por gravimetria, com secagem em

estufa a 105°C até peso constante. O resíduo mineral fixo (cinzas) foi determinado a

partir da incineração em mufla a 550°C até peso constante. As proteínas foram

determinadas pelo método de Kjeldahl (micro) (IAL, 2005) utilizando fator de

conversão nitrogênio proteína de 6,25. Os lipídeos totais foram obtidos a partir da

fração etérea por fluxo intermitente de Soxhlet, utilizando-se hexano P.A como


solvente. Os carboidratos foram obtidos por diferença, subtraindo de 100% do valor

das proteínas, lipídeos, cinzas e umidade.

4.2.2 Obtenção dos extratos aquoso, alcoólico e acetônico, e quantificação de

sólidos totais (peso seco)

Os extratos alcoólicos, acetônicos e aquosos foram obtidos de forma

seqüencial, a partir de 20 g de cada amostra (polpa, semente e casca do noni)

previamente trituradas, segundo metodologia de Jardini e Mancini-Filho (2007).

Para a obtenção dos extratos alcoólicos, foram pesados 20 gramas de

amostra na qual foi adicionada 100 mL de álcool etílico e submetidos à agitação por

uma hora para posterior filtração à vácuo. O resíduo foi recuperado para obtenção

do extrato acetônico e aquoso, seguindo o mesmo procedimento utilizado para

obtenção do extrato alcoólico, utilizando-se acetona e água, respectivamente, como

diluente. O preparo e obtenção dos extratos seguiram o fluxograma abaixo (Figura

07).

Para determinação do peso seco, colocou-se 1mL em triplicata, de cada

extrato obtido, em cápsulas de porcelana, previamente taradas, e em seguida o

material foi levado à estufa a 105° C por 1 hora. Após secagem as amostras foram

resfriadas em dessecador por 30 min, pesadas e anotado o resultado.


20g da amostra

+ 100mL de álcool etílico

1 hora de agitação Filtração à vácuo

(usando filtro Whatman n° 4)

Sobrenadante resíduo (extrato alcoólico)

+ 100mL de acetona 1 hora de agitação

Filtração à vácuo (usando filtro Whatman n° 4)

Sobrenadante (extrato acetônico) resíduo

+ 100mL de água

1 hora de agitação + Centrifugação (4.000 rpm)

Sobrenadante resíduo (extrato aquoso) Figura 07: Fluxograma de preparo e obtenção dos extratos da polpa, casca e semente do noni, por extração seqüencial.

4.2.3 Compostos fenólicos totais, segundo SWAIN, 1959, adaptada por LIMA,

2008

Foi adicionado em um balão volumétrico de 10 mL, 0,5 mL de amostra, em

triplicata, do extrato alcoólico, aquoso e acetônico, a 8 mL de água destilada e

0,5mL do reagente de Follin Denis. Em seguida, a solução foi homogeneizada e

deixou-se em repouso por 3 min. Decorrido esse tempo, acrescentou-se 1mL de

solução saturada de carbonato de sódio anidro. A solução ficou em repouso por 1

hora e logo após foram realizadas as leituras de absorbâncias em espectrofotômetro

a 720 nm. A leitura do branco foi realizada contendo os mesmos reagentes menos a

amostra.


Utilizou-se como padrão a solução de ácido gálico, em concentrações

variando de 0 a 100 mg/mL. A partir da reta obtida, realizou-se o cálculo do teor de

fenólicos totais, expresso em mg de ácido gálico/g de amostra.

Figura 08. Curva de calibração de ácido gálico (mg/L)

4.2.4 Conteúdo de carotenóides totais segundo AOAC (1998)

A determinação dos carotenóides foi realizada segundo AOAC (1998).

Preparou-se um extrato com 10 gramas de cada amostra (casca, semente e polpa),

30 ml de álcool isopropílico e 10 ml de hexano. A mistura foi homogeneizada, em

seguida, adicionou-se 85 ml de água e transferida para o funil de separação. Após

30 minutos de repouso, adicionou-se 10 ml de água destilada. Em seguida, filtrou-se

a mistura. O filtrado foi recolhido em recipiente contendo 5 mL de acetona, o qual foi

completado com hexano até completar 50 mL. Procedeu-se a leitura, em triplicata,

destes extratos em espectrofotômetro (Coleman 33 D) a 450 nm.

Carotenóides (mg/100g) = Absorbância lida x 100

250 x L x W

L- largura da cubeta

W- quociente original entre a amostra inicial e o volume final da diluição

y = 0,0078x - 0,0185R² = 0,9964

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ab

so

rbân

cia

concentração (mg/L)

CURVA PADRÃO DE ÁCIDO GÁLICO


4.2.5 Conteúdo de vitamina C pelo método de TILLMANS modificado por

Benassi e Antunes-1988

Utilizou-se ácido oxálico em substituição ao ácido metafosfósforico. Pesou-se

10 gramas da amostra e diluiu-se em 100 mL de água destilada. Após filtração,

trasnferiu-se 10 mL do filtrado para erlenmeyer de 250 mL. Adicionou-se 10 mL de

ácido oxálico e titulou-se com DCFI até a coloração rósea persistente .

Calculou-se o valor de ácido ascórbico pela expressão:

mg/100g = (V1 x F x100) ____________________ V2

v1= volume de DCFI usado para titular a amostra

v2= volume da amostra

F= fator do DCFI

4.2.6 Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos da polpa,

semente e casca do noni

4.2.6.1 Método DPPH

O ensaio de captura de radicais DPPH, desenvolvido por Blois (1958) e

adaptado por Brand-Willians (1995), tem por base a redução do radical [2,2 difenil-1-

pricril-hidrazil (DPPH)], que ao fixar um H• (removido do antioxidante em estudo),

propicia uma diminuição e absorbância, permitindo calcular, após o estabelecimento

do equilíbrio da reação, a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50 % do

radical DPPH•.

Para a avaliação da atividade antioxidante da polpa, semente e casca do

noni, foi adicionado a 1,5 mL de solução metanólica de DPPH• (6X10-5M) uma

alíquota de 0,5 mL de cada extrato contendo diferentes concentrações de cada


extrato. A leitura de absorbância foi realizada em espectrofotômetro (coleman 33D) a

517 nm nos tempos de 2, 5, 10, 20 e 30 minutos após o início da reação. Todas as

leituras foram feitas em triplicata e acompanhadas de um controle (sem o

antioxidante). A porcentagem de descoloração do radical DPPH foi calculada de

acordo com a fórmula:

% de proteção = (Abs controle - Absamostra) / Abscontrole

Foi também calculado o valor EC50, isto é, a concentração da amostra

necessária para inibir 50% do radical.

4.2.6.2 Método ABTS

Consiste em verificar como os antioxidantes são capazes de degradar os

radicais livres presentes no meio. Por esse método, inicialmente, gera-se o radical

colorido; em seguida, adiciona-se o antioxidante para posteriormente, medir o

decréscimo de absorbância produzido. Sendo que, quanto maior a atividade

antioxidante do composto testado, maior será o decréscimo na absorbância.

Utilizou-se a metodologia descrita por Re et al., (1999) para a formação do

radical ABTS•+ a partir da reação de 7mM de ABTS com 2,45 mM de persulfato de

potássio para concentração final, incubada à temperatura ambiente e na ausência

de luz, por um período de 12 horas. Após esse tempo, a solução foi diluída em

etanol até obter-se 20-80% de inibição do radical comparando-se com a absorção do

branco.

Foram adicionados 40 µL de cada amostra diluída a 1960 µL da solução

contendo o radical. A absorbância foi determinada em espectrofotômetro, a 734 nm,

após 2, 5, 10, 20, 30 minutos de reação. A solução padrão utilizada foi o antioxidante

sintético trolox nas concentrações de 20 a 50 µM em etanol (Figura 10). Todas as

leituras foram realizadas em triplicata e os resultados expressos em μM de trolox por

grama de amostra.


Figura 09. Curva de calibração-resposta da porcentagem de inibição de trolox em etanol (0 a

20 μg/mL) frente ao radical ABTS•+

4.2.6.3 Método de co-oxidação do -caroteno/ácido linoléico

Os procedimentos de análise foram realizados de acordo com o método

descrito por MILLER (1971), que se baseia na oxidação (descoloração) do β-

caroteno em uma determinada emulsão. A descoloração é observada diretamente

em colorímetro. Para formar a emulsão, foram adicionados 20 μL de solução de β-

caroteno dissolvido em clorofórmio (20 mg/mL), 40 μL de ácido linoléico, 530 mg de

emulsificante Tween 40 e 1 mL de clorofórmio (para completar emulsificação). A

emulsão foi evaporada com nitrogênio gasoso. Foram acrescidos posteriormente,

100 mL de água destilada previamente oxigenada (por trinta minutos). A solução

emulsionada foi diluída até atingir a faixa de densidade ótica, entre 0,6 – 0,7 nm.

Em tubos calibrados para leitura no espectrofotômetro, foram tomados 5 mL

da solução emulsionada e adicionados a diferentes volumes de extratos, além do

BHT isolado, nas concentrações de 25, 50, 100, 200 e 400 ppm. Todas as

determinações foram realizadas em triplicata e acompanhadas de um controle, sem

antioxidante.

Imediatamente após a adição da solução emulsionada às substâncias

antioxidantes naturais e ao BHT, ou seja, no tempo zero (A0), foram realizadas as

leituras de cada tubo em espectrofotômetro, a 470 nm. A seguir, os tubos foram

y = 0,038x - 0,0052R² = 0,999

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20

Vari

ação

de A

bso

rbân

cia

Concentração (ug/mL)


colocados em banho-maria a 50º C e, após um período de duas horas (Af), foram

realizadas as leituras das absorbâncias.

Os resultados foram expressos em porcentagem de inibição de oxidação,

conforme o cálculo expresso na fórmula a seguir:

% de Oxidação = X da Abs. amostra1 x 100

X da Abs. controle2

% de Proteção = 100 - % de Oxidação

1X da diferença das absorbâncias de cada amostra (Abs. ami – Abs.

amf)

2X da diferença das absorbâncias de cada controle (Abs. ci – Abs. cf)

O decaimento da densidade ótica do controle (Ac0 – Acf) foi considerado como

100% de oxidação. A partir dessa relação, o decréscimo na leitura da absorbância

das amostras foi correlacionado com o controle, desse modo estabelecendo o

percentual de inibição da oxidação das amostras antioxidantes.

Foi calculado o valor do EC50, isto é, a concentração da amostra necessária

para inibir 50% do radical.

4.2.7 Determinação da atividade antifúngica

A atividade antifúngica dos extratos aquosos da casca, semente e polpa de

noni foi avaliada a partir do desenvolvimento de três importantes fitopatógenos:

Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum Todas as linhagens

foram cedidas pelo Laboratório de microbiologia do Núcleo de Estudos, Pesquisa e

Processamento de Alimentos (NUEPPA), do Centro de Ciências Agrárias da

Universidade Federal do Piauí. O meio de cultura utilizado no experimento foi o Ágar

Batata Dextrose (BDA), da marca comercial Himedia®, sendo preparado conforme

instruções do fabricante.

A atividade antifúngica foi avaliada por meio da inibição do crescimento

micelial dos fitopatógenos de acordo com a metodologia proposta por Franzener et


al., (2007). Os extratos aquosos foram incorporados ao meio de cultura BDA ainda

fundente (com temperatura aproximada de 100ºC) de modo a obter-se quatro

diferentes concentrações: 1, 2, 4 e 8 mg de extrato por mL de meio de cultura . Após

a solidificação do meio, um disco de micélio de 6 mm de diâmetro foi transferido de

uma cultura pura de sete dias para o centro da placa. A avaliação foi realizada por

meio de duas medições diametralmente opostas das colônias quando o controle

(BDA sem adição do extrato) atingiu o máximo de crescimento. O experimento foi

conduzido em triplicata de forma inteiramente casualizada.

4.4 TRATAMENTO ESTATÍSTICO

Neste trabalho os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão.

Para comparação das médias aritméticas, empregaram-se a análise de variância

(ANOVA) e o teste Tukey, usando o software Prisma 4.0 (GraphPad). Adotou-se o

nível de significância de 5% de probabilidade (p<0,05).

49 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 COMPOSIÇÃO CENTESIMAL

Os resultados da composição centesimal da polpa, semente e casca do noni

encontram-se dispostos na tabela 03, na qual se pode observar segundo os valores

para umidade, que a água é componente majoritário no noni, em todas as partes

estudadas. O valor da umidade no presente estudo foi de 88,36% ± 0,22; 68,65%

±1,03 e 86,49% ± 0,36 para polpa, semente e casca respectivamente. Resultados

semelhantes, para a polpa do noni, foram encontrados por Chan-Blanco et. al.,

(2006) e Corrêia (2010) que quantificaram 90% e 89,44%, respectivamente. O

conteúdo de cinzas variou 0,93% para a polpa e semente a 1,05% para a casca.

Tabela 03: Composição centesimal da polpa, semente e casca do noni (Morinda

citrifolia Linn.)

Constituintes Polpa (%) Semente (%) Casca (%)

Umidade 88,36 ± 0,22a 68,65 ± 1,03c 86,49 ± 0,36b

Cinzas 0,93 ± 0,03b 0,93 ± 0,26b 1,05 ± 0,13a

Proteína 2,24 ± 0,04a 2,64 ± 0,03a 2,23 ± 0,4a

Lipídeos 0,37 ± 0,01a 0,57 ± 0,01a 0,52± 0,07a

Carboidratos 8,37±0,43c 27,21±0,82a 9,70±0,55b

VET 45,77 124,53 52,40

Valores expressos em média ± desvio padrão, n=3 a,b,c

Médias seguidas da mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nivel de 5%. VET:Valor energético total

Os resultados também demonstram que não houve diferenças significativas

nos valores de proteínas e lipídeos referentes às três partes do fruto analisadas. O

teor médio de proteína encontrado para a polpa do noni foi de 2,24% ± 0,04, valor

superior aos encontrados por Shovic e Whistler (2001) e Corrêia (2010), 0,4% e


0,68%, respectivamente. Porém, semelhante ao encontrado por Chunhieng (2003),

2,5%. O teor de proteínas das distintas partes do noni está próximo aos de outras

frutas tripicais como tangerina (2,49%) e banana (2,69%), e superiores aos de

abacaxi (1,45%) e maracujá (0,67%) (GONDIM et al., 2005).

Marques et. al., (2008), estudando a composição centesimal da polpa e casca

da manga, encontraram para tal fruta valores inferiores de proteínas e lipídeos aos

encontrados para o noni, sendo que para polpa, os valores de proteínas foi de

0,44% e para casca de 1,24%, já o conteúdo de lipídeos para polpa e casca foi de

0,18% para polpa e 0,44% para casca.

Quanto ao teor de proteínas e lipídeos presentes na semente do noni, os

resultados encontrados foram inferiores aos da semente do maracujá, 12,57% de

proteínas e 28,12% de lipídeos, de acordo com Jorge et al.,(2009).

Ainda na tabela 01, observa-se que o valor energético total, equivalente a 100

g de amostra, para a polpa e casca forneceram cerca de 45,77 e 52,40 kcal,

respectivamente, valores inferiores aos encontrados para semente (124,53 kcal),

portanto a polpa do noni é considerado de baixo valor calórico.

5.2 VITAMINA C E CAROTENÓIDES

A tabela 04 apresenta os valores obtidos para vitamina C e carotenóides

totais das partes do noni (polpa, semente e casca). De acordo com essa tabela, os

teores de vitamina C da polpa (23,1mg/100g) foram significativamente (p<0,05)

maiores que o encontrado para as outras partes do noni, a semente apresentou o

menor conteúdo de vitamina C, com 1,36mg/100g.

Tabela 04: Teor de vitamina C e carotenóides da polpa, casca e semente do noni

(Morinda citrifolia Linn.) em mg/ 100g de amostra.

CONSTITUINTES POLPA CASCA SEMENTE

VITAMINA C

CAROTENÓIDES

23,1±0,1a

3,90 ±0,05a

10,55±0,34b

3,60±0,10b

1,36±0,14c

1,06±0,10c

Valores expressos em média ± desvio padrão, n=3 a,b,c

Médias seguidas da mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nivel de 5%.


Diferentemente do valor de vitamina C determinado neste trabalho, Barros et

al., (2008) e Canuto et al., (2010), verificaram teores para a polpa do noni 105,3 e

51,2 mg/100g, valores. Tais discrepâncias nos teores de vitamina C encontrados nos

frutos podem estar relacionadas com o grau de maturação dos frutos analisados,

além da metodologia utilizada para quantificação. (Silva et al., 2009)

O teor de vitamina C da polpa e casca do noni é superior aos de frutas como:

açaí (10,1mg/100g), bacuri (0,2mg/100g), cajá (0,3mg/100g), cupuaçu (3,3mg/100g),

murici (0,3) e tamarindo (0,1mg/100g) (CANUTO et al., 2010).

Quanto ao conteúdo de carotenóides, não houve diferença estatística entre os

valores obtidos para a polpa (3,9 mg/100g) e casca (3,60mg/100g) do noni, porém,

ambos foram superiores ao teor de carotenóides obtidos na semente, que foi de

1,06mg/100g, valor este condizente com os obtidos de amêndoas e sementes

típicas do serrado brasileiro (CREPALDI et al., 2001).

Melo e Andrade (2010) avaliando os carotenóides totais do umbu maduro e

semi maduro, encontraram valores de 3,02 e 1,70 mg/100g respectivamente. Lima

(2008), encontrou para a polpa do pequi 7,25mg/100g enquanto para a semente um

valor de 0,295mg/100g.

5.3 FENÓLICOS TOTAIS

Os compostos fenólicos têm participação no sabor, na coloracão, na vida de

prateleira e na ação do produto como alimento funcional, notadamente

correlacionado com a capacidade antioxidante (CHITARRA; CHITARRA, 2005).

Na Tabela 05 estão ilustrados o conteúdo de fenólicos totais para os extratos

do noni, na qual pode-se averiguar que os extratos acetônicos da polpa, casca e

semente foram os que obtiveram melhores resultados na extração de fenólicos.

Dentre os resultados dispostos na tabela 04, constata-se que o extrato acetônico da

polpa foi o que teve um maior teor de fenólicos, 109,81mg/ 100g, diferente

estatisticamente (p<0,05) dos demais extratos. Chan-Blanco et al.,(2007) encontrou

no extrato aquoso da polpa de noni 51,1 mg/100g, nesse mesmo estudo foram ainda

identificados os compostos fenólicos rutina e a escopoletina como componentes

majoritários. Já Barros et al. (2008), encontraram valores superiores

(160,84mg/100g) ao deste estudo, para o extrato aquoso da polpa do noni.


Tabela 05: Teores de fenólicos totais (expresso em equivalente de ácido gálico)

presente no extrato aquoso, etanólico e acetônico da polpa, casca e semente do

noni (Morinda citrifolia Linn.)

Extratos *Teores de fenólicos totais (mg/100g de amostra)

polpa casca semente

Aquoso 12,75 ± 0,26c 8,23±0,13c 2,91±0,47c

Etanólico 20,33 ± 1,37b 18,82±1,26b 11,22±1,63b

Acetônico 109,81±2,02a 76,01±6,36a 28,75±1,07a

* valores correspondem à média ± desvio padrão, n=3 a,b,c

Médias seguidas da mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey ao nivel de 5%.

ROESLER et al. (2007), analisando frutos do cerrado quanto ao conteúdo de

fenólicos presente em extrato etanólico e aquoso de cada fruta, obteve para os

extratos aquosos da polpa da banha de galinha (1,59mg/100g) valor inferior do

extrato aquoso do noni (Tabela 05) e para o araticum, 16,91mg/100g. Para o extrato

aquoso da semente da banha galinha, o teor de fenólicos foi um pouco superior ao

do extrato aquoso da semente do noni (2,91mg/ 100g).

Ainda de acordo com ROESLER et al. (2007), para o extrato etanólico da

banha galinha, foi encontrado para a polpa (4,68mg/ 100g), araticum

(20,31mg/100g) e para cagaita, valor de 18,31mg/100g, tanto para o extrato

etanólico da polpa como da casca. Pode-se inferir de acordo com esses resultados

que o extrato etanólico do noni possui teor considerável de fenólicos totais quando

comparados a frutos do cerrado.

5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO

Neste estudo, foi determinada a atividade antioxidante in vitro utilizando-se

três métodos distintos. Os extratos utilizados foram os aquosos, etanólicos e

acetônicos para as três partes do fruto do noni: polpa, semente e casca.


5.4.1 Método β-caroteno/ ácido linoléico

Para a avaliação da atividade antioxidante dos extratos da polpa, semente e

casca do noni pelo método β-caroteno/ ácido linoléico, foram utilizados cinco tipos

de concentrações diferentes (25, 50, 100, 200, 400 ppm), de tal forma que a reação

dos antioxidantes das amostras e do BHT (padrão) reagissem com o sistema

emulsionado com conseqüente descréscimo na densidade óptica em intervalos de

tempo, durante 120 minutos.

A capacidade antioxidante dos extratos aquosos, etanólicos e acetônicos

estão demonstrados na Tabela 06. Pode-se aferir que os três extratos,

principalmente nas concentrações de 100, 200 e 400ppm, apresentaram boa

atividade em combater os peróxidos formados, comparados com o padrão BHT.

Observando a tabela 06, pode-se constatar que, relacionando as partes

(polpa, semente e casca) do noni, com seus respectivos percentuais de proteção, a

menor atividade foi conferida pela polpa, sendo a semente e casca as partes que

apresentaram melhores percentuais de proteção da oxidação.

Ainda na tabela 06, na concentração de 400ppm, o extrato aquoso da polpa

obteve 7,16% de proteção, 31,69% para o extrato alcoólico e 26,17% para o

acetônico, valores esses inferiores aos encontrados para a casca, que na mesma

concentração, obteve 17,80%, 54,36% e 58,36% para o extrato aquoso, etanólico e

acetônico, respectivamente. Esses valores não diferiram estatisticamente aos

obtidos para a semente, sendo 54,59% para o extrato alcoólico, 32,19% para o

aquoso e 50% para o acetônico.

Contudo, pode-se concluir que nas concentrações de 200 e 400 ppm, a

porcentagem de proteção foi estatisticamente maior para os extratos acetônicos e

etanólicos para todas as partes do noni, ficando a menor atividade antioxidante para

o extrato aquoso. Essas diferenças podem estar relacionadas com o fato de que os

teores de fenólicos nos extratos etanólicos e acetônicos foram estatisticamente

superiores aos encontrados para o extrato aquoso.

Lima (2008), avaliando a capacidade de proteção da polpa do pequi,

encontrou para o extrato alcoólico, na concentração de 200ppm, 18,3% de proteção,

valor este semelhante ao encontrado para o extrato alcoólico da polpa do noni

(17,74%).


Em uma pesquisa sobre o potencial antioxidante em vinhos de jabuticaba e

uva, pelo sistema β-caroteno/ ácido linoléico, Barros et al.(2010), encontraram

expressiva atividade antioxidante em todas as concentrações utilizadas, sendo seu

valor máximo de proteção na concentração de 200ppm. O vinho tinto de jabuticaba

obteve 57,7% de proteção e o vinho branco apresentou 65,9%, valores próximos ao

do padrão BHT(87,14%).

Jardini (2007), avaliando a atividade antioxidante em diferentes extratos da

polpa e sementes da romã, pelo teste de co-oxidação com β-caroteno/ ácido

linoléico, verificou para concentração de 200ppm, proteção de 6,18% para extrato

alcoólico da polpa e 14,46% para o da semente, valores significativamente menores

aos encontrados para o noni neste estudo (Tabela 06) para o extrato alcoólico da

polpa e semente.

Pelo mesmo método, Giada (2006) observou que, na concentração de 200

ppm, os extratos aquoso e alcoólico da semente de girassol apresentaram uma

proteção de 35,1 e 4,2%, respectivamente, após duas horas de ensaio.

A porcentagem de proteção conferida pelos extratos foi menor que o padrão

BHT (p< 0,05), porém os extratos etanólicos e acetônicos da casca e semente

superaram valores de proteção acima de 50%, o que confere a esses extratos

relativa atividade em inibir a oxidação.


Tabela 06: Atividade antioxidante dos extratos aquoso, etanólico e acetônico da polpa,

casca e semente de noni (Morinda citrifolia Linn.), pelo método β-caroteno/ ácido linoléico.

Extratos

% inibição da oxidação

Concentração (ppm)

25 50 100 200 400

Aquoso

Polpa 5,45±0,98aB 6,13±0,99aC 6,65±1,62aB 6,70±1,19bB 7,16±0,40bB

Casca 8,71±0,30aB 11,23±1,10aB 13,36±1,39aA 17,56±17,56bA 17,80±0,68bA

Semente 15,10±0,71aA 29,46±0,39aA 30,52±0,69aA 30,48±1,28bA 32,19±1,38bA

Etanólico

Polpa 3,37±1,32aB 4,04±1,32bC 6,59±1,21abB 17,74±0,55aB 31,69±1,08aB

Casca 5,94±1,10aB 8,27±0,81bB 19,63±0,70abA 31,57±1,15aA 54,36±1,24aA

Semente 12,17±1,72aA 16,58±1,22bA 23,17±1,96abA 35,96±1,03aA 54,59±0,54aA

Acetônico

Polpa 1,46±0,29bB 2,03±0,55bC 4,05±0,77bB 13,12±1,14aB 26,17±1,53aB

Casca 3,16±0,33bB 7,75±0,79bB 16,59±0,91bA 35,51±1,05aA 58,36±0,69aA

Semente 5,35±1,51bA 8,38±0,78bA 10,88±1,45bA 28,07±1,45aA 50,00±1,85aA

BHT

43,13c 60,51c 75,53c 81,86c 87,56c

a,b,A,B,CMédias seguidas de mesma letra, nas colunas, não apresentam diferença estatística entre si pelo

teste de Tukey a 5%; letras minúsculas, entre extratos; letras maiúsculas, entre partes.

De acordo com a Tabela 07, os extratos do noni apresentaram valores

variados de EC50, isto é, quantidade de antioxidante capaz de reduzir pela metade os

radicais livres presentes na solução, sendo que quanto menor o EC50 maior será a

atividade antioxidante do extrato.

Pode-se observar na Tabela 07 que o extrato acetônico da casca (EC50 =

329,35 ppm), seguido pelo extrato etanólico da semente e casca apresentaram

melhor atividade antioxidante corroborando com o percentual de inibição observado

anteriormente (Tabela 06).

Tabela 07: Capacidade antioxidante (EC50 em ppm) dos extratos da polpa, semente

e casca do noni, utilizando o método β-caroteno/ ácido linoléico.

Extratos

EC50 em ppm

Polpa Semente Casca

Aquoso 11.148 677,44 1.814

Etanólico 633,58 329,35 329,35

Acetônico 751,97 399,71 329,35


O coeficiente de correlação linear (r2) obtido para cada extrato, no intervalo de

concentração de 25-400 ppm, encontram-se dispostos na Tabela 08, observa-se que

houve correlação linear positiva para todos os extratos, apenas os extratos aquosos

obtiveram valores de r2 menores que 0,90.

Tabela 08: Coeficiente de correlação linear (r2) obtido dos extratos alcoólicos,

aquosos e acetônico da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn) na

avaliação da atividade antioxidante pelo método do β-caroteno/ ácido linoléico.

Extrato

Concentração (ppm)

25-400

r2 obtido

Alcoólico polpa 0,987

Alcoólico semente 0,990

Alcoólico casca 0,988

Aquoso polpa 0,858

Aquoso semente 0,862

Aquoso casca 0,726

Acetônico polpa 0,992

Acetônico semente 0,990

Acetônico casca 0,985

A partir dos resultados obtidos, nas distintas concentrações testadas, pelo

ensaio β-caroteno/ ácido linoléico, pôde-se traçar a curva cinética de degradação do

β-caroteno e avaliar, a partir disso, a eficácia do antioxidante utilizado para a análise

em intervalos de tempo variáveis. As curvas cinéticas dos extratos aquosos,

etanólicos e acetônicos da polpa, casca e semente do noni estão dispostas nas

Figuras 10 a 12, demonstrando a crescente taxa de proteção acompanhada pelo

aumento das concentrações.


Figura 10: Curva cinética do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanólico e acetônico da polpa

do noni.

Figura 11: Curva cinética do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanólico e acetônico da casca do noni.

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

25 50 100 200 400

Ext. acetônico

Ext. Etanólico

Ext. Aquoso

BHT

%d

ep

rote

ção

Concentração (μg/mL)

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

25 50 100 200 400

Ext. acetônico

Ext. Etanólico

Ext. Aquoso

BHT

Concentração (μg/mL)

% d

e p

rote

ção


Figura 12: Curva cinética do potencial antioxidante do extrato aquoso, etanólico e acetônico da semente do noni.

5.4.2 Atividade antioxidante utilizando o radical DPPH·

Na avaliação da atividade antioxidante por este método, as substâncias

antioxidantes presentes nos extratos reagem com o DPPH, que é um radical estável,

convertendo-o na sua forma reduzida 2,2-difenil-1-picril hidrazina. O grau de

descoloração vai indicar o potencial antioxidante de cada extrato, a habilidade do

antioxidante em seqüestrar radicais livres será inversamente proporcional ao valor

do EC50, que é a quantidade de antioxidante capaz de seqüestrar metade dos

radicais livres DPPH presentes em solução. Quanto menor o valor de EC50 , maior a

atividade do antioxidante, menor quantidade de extrato será necessária para reduzir

em 50% do radical livre DPPH.

Neste estudo, a capacidade em seqüestrar os radicais DPPH foi avaliada

utilizando concentrações distintas para cada extrato, variando de acordo com a

resposta antioxidante de cada um. Uma curva linear foi obtida entre a concentração

do antioxidante e o seqüestro do radical, calculando-se a partir disso, o EC50 de cada

extrato.

Na Tabela 09 encontra-se, para cada intervalo de concentração, o coeficiente

de correlação linear (r2) obtido para cada extrato, demonstrando uma boa linearidade

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

25 50 100 200 400

% d

e p

rote

ção

acetonico

etanolico

aquoso

BHT


na maioria dos extratos, com valores superiores a 0,90, com exceção dos extratos

acetônicos da semente e da casca, que apresentaram r2 um pouco inferior a 0,90.

Tabela 09: Coeficiente de correlação linear (r2) obtido dos extratos alcoólicos,

aquosos e acetônico da polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn). na

avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio do radical DPPH• .

Extrato Concentração (μg/mL) r2 obtido

Alcoólico polpa 6,25-75 0,967

Alcoólico semente 100-800 0,986

Alcoólico casca 25-400 0,827

Aquoso polpa 600-1400 0,988

Aquoso semente 50-600 0,902

Aquoso casca 100-1200 0,900

Acetônico polpa 200-1200 0,961

Acetônico semente 50-600 0,766

Acetônico casca 50-400 0,788

Conforme disposto na Tabela 10, todos os extratos exibiram capacidade de

de seqüestro do radical DPPH, o extrato etanólico da polpa de noni foi o que

apresentou melhor atividade antioxidante, por varrer o radical com menor quantidade

de extrato, seguido pelo o extrato etanólico da casca, acetônico da casca e

acetônico da semente.

Lima (2008), avaliando a capacidade antioxidante do extrato etanólico da

polpa e amêndoa do pequi, pelo método DPPH, determinou valor de EC50 para a

polpa (820,37) menor que o encontrado para a o noni neste trabalho, 0,967. Roesler

et al.,(2007), avaliando a capacidade antioxidante de frutas do cerrado brasileiro,

encontrou valores de EC50 , para os extratos aquosos e etanólicos da polpa,

respectivamente, de 879,93ppm e 387,47ppm para cagaita, 1.321,93ppm e

148,82ppm para o araticum e 1328,98ppm e 182,16ppm para lobeira. Jorge et

al.,(2009), analisando o extrato etanólico da semente do maracujá, obtiveram EC50

de 113,41ppm.


Tabela 10: Capacidade antioxidante, expresso em EC50 (μg/mL) dos extratos da

polpa, semente e casca do noni (Morinda citrifolia Linn) utilizando o radical livre

DPPH.

Extratos

EC50 em μg/mL

Polpa Semente Casca

Aquoso 1.401 739,67 598,9

Etanólico 40,98 498,77 103,02

Acetônico 507,50 108,19 105,79

Nas Figuras 13 a 21 pode-se visualizar a atividade antioxidante dos

extratos da polpa, casca e semente do noni, em distintas concentrações, nos tempos

de 2, 5, 10, 20 e 30 minutos. Percebe-se que os extratos possuem comportamento

diferenciado de acordo com a concentração usada nos testes, mas de uma forma

geral, o decaimento na absorbância é mais evidente nos primeiros cinco minutos de

reação, demonstrando que os extratos de noni possuem compostos antioxidantes de

ação rápida, característica importante para um bom extrato antioxidante.

Figura 13: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato aquoso da polpa do noni.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35

Ab

so

rbân

cia

Tempo (minutos)

Controle

600 µg/mL

800 µg/mL

1000 µg/mL

1200µg/mL

1400 µg/mL


Figura 14: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato aquoso da semente do noni.

Figura 15: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato aquoso da casca do noni.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35

Ab

so

rbân

cia

tempo (minutos)

Controle

50 µg/Ml

100 µg/mL

200 µg/mL

400µg/mL

600 µg/mL

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35

ab

so

rbân

cia

tempo (minutos)

Controle

100 µg/mL

200 µg/mL

400 µg/mL

800µg/mL

1200µg/m


Figura 16: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato etanólico da polpa do noni.

Figura 17: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato etanólico da semente do noni.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35

Ab

so

rbân

cia

Tempo (minutos)

Controle

6,25 µg/mL

12,5 µg/mL

25 µg/mL

50µg/mL

75 µg/mL

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10 15 20 25 30 35

Ab

so

rbâ

nc

ia

tempo (minutos)

Controle

50 µg/mL

100 µg/mL

200 µg/mL

400µg/mL

600 µg/mL


Figura 18: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato etanólico da casca do noni.

Figura 19: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato acetônico da polpa do noni.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30

Ab

so

rbân

cia

Tempo (minutos)

Controle

25 µg/Ml

50 µg/mL

75 µg/mL

100µg/mL

200 µg/mL

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35

Ab

so

rbân

cia

tempo (minutos)

Controle

200 µg/Ml

400 µg/mL

800 µg/mL

1000µg/mL

1200 µg/mL


Figura 20: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato acetônico da semente do noni.

Figura 21: Atividade antioxidante, pelo método DPPH, do extrato acetônico da casca do noni.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30 35

Ab

so

rbân

cia

tempo (minutos)

Controle

50

100

200

400

600

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25 30

Ab

so

rbân

cia

tempo (minutos)

Controle

50

75

100

200

400


5.4.3 Atividade antioxidante pelo método ABTS·+

O resultado da avaliação da atividade antioxidante pelo método ABTS

geralmente é expressa como valor TEAC (Atividade Antioxidante Total Equivalente

ao Trolox), o qual é definido como a concentração de Trolox que apresenta o mesmo

percentual de inibição que uma concentração de 1mM do composto de referência.

Muitos trabalhos divergem quanto aos tempos usados para medir a reação. Tempos

mais longos são mais utilizados do que os tempos mais curtos, isso porque os

antioxidantes alimentares não reagem tão rapidamente com o radical, a medida em

um tempo muito curto poderia subestimar o valor de TEAC. Van Den Berg et

al.,(1999) explicam que o uso de tempos mais longos se justifica pelo fato de que

certos antioxidantes seguem uma reação bifásica frente ao radical ABTS, com uma

fase inicial rápida e outra fase considerada lenta.

Tabela 11: Capacidade Antioxidante Total (TEAC) dos extratos aquoso, alcoólico e

acetônico da polpa, casca e semente do noni (Morinda citrifolia Linn) pelo método

ABTS•+ expressos em mM de trolox/ g de amostra fresca,

Extratos

Valor de TEAC (mM trolox/g amostra fresca)

2 5 10 15 20 30

Alcoólico

Polpa 1,02±0,04b 1,07±0,04

b 1,12±0,04

b 1,13±0,57b 1,15±0,57b 1,17±0,00b

Semente 0,42±0,03de 0,46±0,06

c 0,52±0,04

e 0,55±0,05e 0,57±0,04e 0,60±0,05e

Casca 0,93±0,03c 0,96±0,04

b 1,00±0,04c 1,03±0,02c 1,05±0,02c 1,09±0,01c

Aquoso

Polpa 0,10±0,20g 0,17±0,01

d 0,22±0,00g 0,25±0,01f 0,27±0,01fg 0,29±0,01fg

Semente 0,17±0,00f 0,23±0,01

d 0,28±0,01f 0,31±0,01f 0,34±0,01f 0,37±0,01f

Casca 0,13±0,02fg 0,18±0,02d 0,23±0,03fg 0,25±0,02f 0,24±0,01g 0,27±0,01g

Acetônico

Polpa 1,33±0,03ª 1,44±0,03a 1,51±0,02ª 1,55±0,03ª 1,60±0,02ª 1,67±0,02ª

Semente 0,47±0,03d 0,54±0,06

c 0,62±0,05d 0,70±0,02d 0,74±0,02d 0,79±0,02d

Casca 0,51±0,04d 0,57±0,05

c 0,63±0,04d 0,67±0,06d 0,70±0,05d 0,74±0,05d

abc

Médias seguidas de mesma letra, nas colunas, não apresentam diferença estatística entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Na Tabela 11 estão expressos os valores TEAC dos extratos de noni. O

extrato acetônico da polpa apresentou maior atividade antioxidante (p<0,05) em


todos os tempos, com TEAC variando de 1,33mM ± 0,03 no tempo 2 minutos a

1,67nM ± 0,03 no tempo de 60 minutos. Ao contrário de Jáurequi et al., (2007) que

quantificaram um TEAC de 3,48μmol/g de amostra.

Na Tabela 11, também pode ser visto que o extrato alcoólico da polpa e da

casca no tempo de 30 minutos apresentaram atividade antioxidante. Valores

próximos aos de frutos como pequi TEAC = 0,95mM/ g, (Lima, 2008) e superiores

aos de frutos como bacuri e cupuaçu, TEAC =0,6 (Canuto et al. 2010). Villaño et al.,

(2006) encontraram valores de TEAC de 1,98 mM/g para o ácido gálico; 1,01 mM/g

para o ácido caféico; 0,99 mM/g para a epicatequina; e 1,83 mM/g para a

procianidina B2. Demonstrando que os extratos alcoólicos da polpa e casca

apresentam atividade antioxidante comparável a padrões de ácidos fenólicos puros.

O extrato aquoso da casca polpa e semente apresentaram os menores

valores de TEAC e inferiores (p<0,05) em relação aos extratos alcoólicos e

acetônicos. Provavelmente os compostos antioxidantes presentes nesses extratos

possuam baixa reatividade com o radical ABTS. Por isso a importância da realização

da atividade antioxidante de matrizes alimentares por distintas metodologias. Villaño

et al., (2006), descrevem que mesmo padrões de ácidos fenólicos puros como os

ácidos siríngico, vanílico, p-cumárico e a procianidina B3 não possuem atividade

antioxidante com o radical ABTS.

Nas Figuras 23, 24 e 25 são visualizadas as curvas cinéticas da atividade

antioxidante dos extratos de noni de acordo com o tempo de reação. Percebe-se

que o padrão trolox reage rapidamente com os radicais livres e aos dois minutos já

estabiliza, enquanto os extratos mesmo reagindo com os radicais nos primeiros dois

minutos continuam a degradar após esse tempo até os 30 minutos de reação.


Figura 22: Curva cinética da atividade antioxidante de extratos alcoólicos da polpa,

casca e semente do noni.

Figura 23: Curva cinética da atividade antioxidante de extratos aquosos da polpa,


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25 30 35

CONT

Al. POL

AL.CAS

AL.SEM

TROLOX

Ab

so

rbâ

nc

ia

Tempo (min)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25 30 35

CONT

AQ.POL

AQ.CAS

AQ.SEM

TROLOX

Ab

so

rbân

cia

Tempo (min)


Figura 24: Curva cinética da atividade antioxidante de extratos acetônicos da polpa,


5.4.4 Atividade antifúngica

Para realização da atividade antifúngica, apenas o extrato aquoso foi utilizado

devido ao provável efeito inibidor que o extrato acetônico e etanólico poderiam

exercer sobre as cepas utilizadas. Os resultados dos testes de suceptibilidade dos

fitopatógenos Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium citrinum ao

extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni estão esquematizados nas

Tabela 10, 11 e 12. Nelas pode-se observar a porcentagem de inibição de cada

patógeno para o extrato aquoso de cada parte do noni.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25 30 35

CONT

AC.POL

AC.CAS

AC.SEM

TROLOXAb

so

rbâ

nc

ia

Tempo (min)


Tabela 12: Taxa de inibição do crescimento micelial de Aspergillus terreus sobre

ação do extrato aquoso da polpa, casca e semente do noni. em diferentes

concentrações.

Aspergillus terreus

Concentração (mg de extrato/ mL

de meio)

Média de crescimento micelial (cm)

Taxa de inibição (%)

POLPA

0,0 3,7 - 1,0 4,0 Sem atividade 2,0 3,7 Sem atividade 4,0 3,0 18,91

CASCA

0,0 3,7 - 1,0 3,65 1,35

2,0 3,45 6,75 4,0 2,6 29,72

SEMENTE

0,0 3,7 - 1,0 3,7 Sem atividade 2,0 3,6 2,70 4,0 3,2 13,5

De acordo com a Tabela 12, na concentração de 4 mg de extrato/ mL de

meio, o extrato aquoso da casca foi o que obteve maior taxa de inibição para

Aspergillus terreus, praticamente 30,00%, seguido pela polpa e semente. Em

concentrações menores, não houve inibição significativa do fitopatógeno.

Tabela 13: Taxa de inibição do crescimento micelial de Penicillium citrinum sobre


concentrações.

Penicillium citrinum

Concentração (mg de extrato/ mL

de meio)



POLPA

0,0 2,3 - 2,0 2,0 Sem crescimento 4,0 2,0 13,04

8,0 1,8 21,73

CASCA

0,0 2,3 - 2,0 2,1 8,6 4,0 2,0 13,04

8,0 1,9 17,39

SEMENTE

0,0 2,3 - 2,0 2,1 4,34 4,0 2,2 8,6

8,0 2,0 13,04

Na Tabela 13, pode-se constatar que na concentração de 8mg/mL, os

extratos aquosos da polpa foram os que demonstraram maior taxa de inibição para

Penicillium citrinum, valor aproximado ao obtido pelo extrato aquoso da casca


(17,39%). A semente apresentou a menor taxa de inibição dentre os extratos

testados.

Tabela 14: Taxa de inibição do crescimento micelial de Aspergillus japonicus sobre


concentrações.

Aspergillus japonicus Concentração (mg de extrato/ mL

de meio)



POLPA

0,0 8,5 -

2,0 6,2 27,05

4,0 6,1 28,23

8,0 5,5 35,29

CASCA

0,0 8,5 -

2,0 6,7 22,35

4,0 6,5 23,47

8,0 6,4 24,70

SEMENTE

0,0 8,5 -

2,0 7,0 17,64

4,0 6,8 19,62

8,0 5,7 32,94

A espécie Aspergillus japonicus foi a que apresentou maior sensibilidade aos

extratos aquosos do noni. A maior taxa de inibição foi para os extratos aquosos da

polpa e semente na concentração de 8mg/mL.

As taxas de inibição nas demais concentrações para Aspergillus terreus (1 e

2mg/L), Aspergillus japonicus (2 e 4mg/mL) e Penicillium citrinum (2 e 4mg/mL)

foram semelhantes para cada parte estudada, porém, relativamente inferiores à taxa

de inibição encontrada para as concentrações maiores, de 4mg/mL para Aspergillus

terreus e 8mg/mL para Penicillium citrinum e Aspergillus japonicus.

Martins et al. (2010), avaliando a capacidade antifúngica do extrato oleoso de

alho roxo (Allium sativum L.), observaram 100% de inibição dos fungos Aspergillus

níger e Penicillium spp. em concentrações de 0,07812% e 0,03906%,

respectivamente.

Chalfoun et al.(2004), mostram o efeito in vitro de óleos essenciais dos

condimentos alho, canela, cravo e tomilho testados em concentrações de 500, 1000,

1500 e 2000mg/mL e do óleo de cravo nas concentrações de 200, 400, 600 e

800mg/ml, sobre o desenvolvimento micelial dos fungos Penicillium spp., Aspergillus

níger, Eurotium repens, constataram uma inibição total do óleo de canela sobre os


fungos testados, os óleos de tomilho e alho tiveram o mesmo efeito nas

concentrações mais altas, o cravo inibiu o desenvolvimento dos fungos a partir da

concentração de 600mg/mL, exceto o fungo Penicillium spp. que foi verificado na

concentração de 800mg/mL.

O extrato aquoso da casca semente e polpa do noni mostraram relativa

atividade antifúngica para os fitopatógenos: Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus

e Penicillium citrinum, entretanto acredita-se que com uso de maiores concentrações

dos extratos serão obtidos maiores taxas de inibição desses fitopatógenos.

72 CONCLUSÕES

6. CONCLUSÕES

A polpa, casca e semente do noni possuem um alto teor de umidade, quantidade

significativas de carboidratos e proteínas e apenas quantidades traços de

lipídeos;

As distintas partes do noni apresentaram teores variáveis dos compostos

bioativos (vitamina C e carotenóides totais), a polpa se destacou como maior

fonte de vitamina C. Já com relação ao teor de carotenóides totais, tanto a polpa

como a casca se constituem em boas fontes desse nutriente;

Os teores de fenólicos totais presentes no noni, no extrato acetônico, foram

superiores aos encontrados nos outros extratos aquoso e etanólico, porém,

ambos obtiveram teores de fenólicos totais superiores aos encontrados para

muitas frutas típicas do serrado brasileiro;

Na avaliação da atividade antioxidante in vitro, todos os extratos apresentaram

expressiva atividade antioxidante, variando-se de acordo com a parte do noni e ou

extrato testado. Não houve uma relação direta entre a atividade antioxidante pelos

três métodos utilizados. No método do β-caroteno/ ácido linoléico a melhor

atividade antioxidante foram obtidos pelos extratos etanólicos e acetônicos da

casca e semente do noni, O extrato alcoólico da polpa teve uma maior atividade

antioxidante pelos ensaios DPPH e ABTS, neste ultimo método se destacou

também o extrato acetônico da polpa; Demonstrando que a polpa do Noni possui

elevada capacidade em combater os radicais livres de DPPH e ABTS.

A casca, polpa e semente do noni possuem capacidade antifúngica frente aos

fitopatógenos estudados (Aspergillus terreus, Aspergillus japonicus e Penicillium

citrinum), com melhor atividade inibitória para o fungo Aspergillus japonicus,

demonstrando que o extrato aquoso do noni pode ser uma alternativa para o

combate de pragas em plantas através da inibição dos referidos fitopatógenos e

uma substituição ao uso de pesticidas químicos.

73 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1 atividade antioxidante in vitro e antifúngica do noni ( morinda citrifolia l.)

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