UFMSLABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

AULA PRÁRICAREAÇÕES QUALITATIVAS PARA AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS

Profa. Dra. Giovana Cristina GiannesiObjetivo: Identificar e caracterizar diferentes aminoácidos e proteínas através de reações específicas.

1 – REAÇÃO COM BIURETOFundamento teórico: O Biureto é um reagente analítico, composto de Hidróxido de Sódio (NaOH 2,5N) e sulfato de cobre 1% (CuSO4).

A reação do Biureto é detectar a presença de ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação é também positiva para substâncias que contêm 2 carbonilas (-CONH2) ligadas diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio.

Os compostos com duas ou mais ligações peptídicas atingem uma coloração violeta quando submetidos a uma solução diluída de sulfato de cobre em meio alcalino. A intensidade da cor varia com a concentração de proteínas.  Nesse exercício, o tubo de ensaio com água destilada foi utilizado como tubo controle, uma vez que a água não contém proteínas.

Uma ligação peptídica ocorre entre duas moléculas quando o grupo carboxilo de uma molécula reage com o grupo amina de outra molécula, liberando uma molécula de água ( H2O ). Isto é uma reação de síntese por desidratação que ocorre entre moléculas de aminoácidos.

Dependendo da complexidade da proteína ou do peptídeo em questão, a cor do produto de reação a presença do Biureto varia substancialmente: proteínas dão coloração violeta, peptídeos dão coloração rosa.

Para que a reação ao Biureto seja positiva há necessidade da presença de pelo menos duas ligações peptídicas na molécula, portanto, aminoácidos e dipeptídeos não apresentam reação positiva ao Biureto.

O tubo contendo água destilada no qual não ocorreu reação (resultado negativo), serve de referência para os tubos restantes, concluindo-se que os tubos cuja reação foi semelhante à do biureto com a água destilada, e teve resultado final negativo.

Por outro lado, nos tubos que ocorreram reações diferentes à da água destilada quando se adicionou biureto, ou seja, apresentara uma coloração violeta ou bem mais escura que o azul pálido apresentado na reação com a água destilada, considerou-se resultado final positivo.

Objetivo : Esta prática teve como objetivos detectar a presença de ligações peptídicas.

Reativos: Foram utilizados:- Biureto (1mL de NaOH 2,5 + 1mL de Sulfato de Cobre);- água destilada;- leite;- clara de ovo;- glicina ;- triptofano e- albumina.

Técnica : (5 tubos)

Tubo 1: 1mL de água destilada; Tubo 2: 1mL de glicína 1%; Tubo 3: 1mL de leite; Tubo 4: 1mL de clara de ovo; Tubo 5: 1mL de albumina 1%.

Foi adicionado em cada tubo, aproximadamente 1mL do reagente de biureto, agitando-se continuamente.

Resultados: Tubo 1: Resultado NEGATIVO Coloração azul muito pálida. A água não tem componentes de proteínas em sua composição.

Tubo 2: Resultado NEGATIVO Coloração azul um pouco mais escura que no tubo 1 Glicina é um aminoácido portanto, sem ligações peptídicas.

Tubo 3: Resultado POSITIVO Coloração púrpura. O leite apresenta várias proteínas em sua composição.

Tubo 4: Resultado POSITIVO Coloração púrpura A Clara de ovo contém proteínas (albumina, inclusive) que apresentam ligações peptídicas.

Tubo 5: Resultado POSITIVO Coloração púrpura A albumina é uma proteína cujos aminoácidos formam uma cadeia por ligações peptídicas.

2 – REAÇÃO DE NINHIDRINAFundamento teórico: A ninhidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) é um poderoso agente oxidante que reage com grupo de amino livres de aminoácidos, peptídeos e proteínas desde que o pH da solução esteja entre 4 e 8. A reação dos aminoácidos com a ninhidrina origina um composto de cor púrpura de Ruherman no geral, e amarelo para a prolina, não apresentando sempre a mesma intensidade de coloração.

A ninhidrina é comumente usada para detectar impressões digitais, já que, graças a sua reação com os aminogrupos terminais das moléculas de lisina incorporadas nas proteínas ou peptídeos, é suficientemente sensível para revelar resíduos de pele.

Objetivo : Esta prática teve como objetivos caracterizar a presença de aminas livres.

Reativos: Foram utilizados:- Ninhidrina;- leite;- clara de ovo diluída;- albumina 1%;- prolina 1%;- glicina 1%;- fenilanina 1%.

Técnica : (6 tubos) Em cada tubo de ensaio foi pipetado 1mL da solução de ninhidrina e adicionado 1mL de cada um dos reagentes descritos abaixo:

Tubo 1: 1mL de água destilada; Tubo 2: 1mL de leite; Tubo 3: 1mL de clara de ovo diluída; Tubo 4: 1mL de prolina 1%; Tubo 5: 1mL de glicina 1%; Tubo 6: 1mL de albumina 1%.

Foi adicionado em cada tubo, aproximadamente 1mL do reagente de nihidrina, agitando-se continuamente e fervendo em seguida por alguns minutos em banho-maria, até o aparecimento da cor.

Resultados: Tubo 1: Resultado NEGATIVO A água não apresenta aminoácidos em sua composição.

Tubo 2: Resultado POSITIVO Coloração roxo O leite apresenta aminas livres em sua composição proteica. Aquecendo-se uma proteína e depois adicionando-se a nihidrina forma-se uma coloração azul por causa da reação desse reagente com os aminoácidos presentes na proteína.

Tubo 3: Resultado POSITIVO Coloração liláz. Como o leite, a clara de ovo apresenta várias proteínas em sua composição, inclusive albumina.

Tubo 4: Resultado POSITIVO Coloração amarela A prolina é um dos aminoácidos codificados pelo código genético, sendo portanto um dos componentes das proteínas dos seres vivos. Diferencia-se dos demais aminoácidos devido ao fato de possuir uma estrutura quimicamente coesa e rígida, sendo mesmo o aminoácido mais rígido dos vinte que são codificados geneticamente. A sua estrutura anelar confere-lhe ainda a classificação de iminoácido, já que a sua estrutura resulta da ligação do terminal alfa-amina (NH2) à cadeia variável alifática e forma um produto amarelo na reação com a ninhidrina.

Tubo 5: Resultado POSITIVO Coloração púrpura A Glicina é um aminoácido portanto apresenta aminas livres.

Tubo 6: Resultado POSITIVO Coloração amarelo escuro No caso da albumina, que é uma proteína hidrossolúvel do tipo globular cuja função é armazenar nutrientes, não reagiu instantaneamente com a ninhidrina. Sendo a albumina uma proteína, os aminoácidos que a constituem estão unidos por ligações peptídicas e não no estado livre motivo pelo qual não reagiu imediatamente com a ninhidrina, que esta apenas detecta os aminoácidos livres. No entanto, depois de aquecida, a albumina reagiu com a ninhidrina porque suas ligações peptídicas foram quebradas, devido ao aumento da vibração das partículas em consequência do aumento da temperatura, alterando assim a conformação desta proteína, expondo os aminoácidos livres de sua composição à ninhidrina.

3 – REAÇÃO XANTOPROTEICA

Fundamento teórico: As proteínas que possuem grupamento fenil (-C6H5); reagem com HNO3 formando compostos fortemente coloridos.

Objetivo : Esta prática teve como objetivos identificar aminoácidos com grupo aromático (cadeias laterai).

Bibliografia:- http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-

46702002000200006&script=sci_abstract&tlng=pt

- http://www.nupel.uem.br/pasteurizacao.pdf