aula hplc

Cromatografia lquida

de alta eficincia

O que cromatografia lquida?

A cromatografia fundamenta-se na migrao

diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido

a diferentes interaes entre duas fases imiscveis, sendo uma

fase fixa que tem uma grande rea superficial chamada fase

estacionria, e a outra um fluido que se move atravs da fase

estacionria sendo chamada de fase mvel. Na cromatografia

lquida a fase mvel lquida! (LANAS, 1993; DEGANI; CASS;

VIEIRA, 1998).

Principio da cromatografia lquida

Tempo

AMOSTRA

Coluna

contendo fase

estacionria.

SOLVENTE

Ao da

gravidade!

CROMATOGRAFIA LQUIDA

PLANAR

CCD CP CONVENCIONAL

COLUNA

HPLC

ADOSRO PARTIO INICA EXCLUSO

Tipos de cromatografia lquida:

Primeiro, o que HPLC?

HPLC uma abreviao do nome em ingls : High Performance (Pressure) Liquid Cromatography.

Historia da HPLC:

- Dcada de 60 : O comeo da HPLC como High pressure LC!

- Dcada de 70 : Com a melhora do material da coluna e da

instrumentao, HPLC passa a ser High Performance LC!

- Dcada de 80: A partir dessa dcada houve um boom do HPLC

- 2006- Evoluo da tcnica: UPLC, RRLC, UFLC...

Vantagens da HPLC

FE utilizada inmeras vezes.

Versatilidade: nico requisito a solubilidade na FM.

Tempo reduzido de anlise.

Alta resoluo.

Anlise qualitativa: tR , espectro de absoro no UV (DAD), MS.

Anlise quantitativa: desvios menores do que 5%.

Boa detectabilidade:

Absoro de UV-Vis de comprimento de onda varivel 10-10 g;

Fluorescncia: 10-12 g;

Automatizao

Limitaes da HPLC

Alto custo do instrumento

Alto custo de manuteno

Alto custo de operao

Falta de detector universal sensvel

ndice de refrao: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estvel.

Espectrmetro de massas: ~US$ 150.000,00

Necessidade de experincia no seu manuseio

Como um HPLC comercial?

Reservatrios dos

solventes e

sistema de

degaseificao.

Bomba.

Injetor.

Coluna.

Detector.

Instrumentao para HPLC

Reservatrio para a fase mvel

Filtro do reservatrio : Captar a fase mvel e evitar que partculas suspensas na FM obstruam

os capilares ou contaminem a bomba.

Filtros de 10 a 40 um

Limpeza peridica!!

Caractersticas da fase mvel

Ser de alto grau de pureza ou fcil purificao

Dissolver a amostra sem decompor seus componentes

No decompor ou dissolver a fase estacionria

Ter baixa viscosidade

Compatvel com o tipo de detector

Polaridade adequada para permitir a separao dos componentes da amostra.

Degaseificao da FM:

Garanti a reprodutibilidade da vazo

Estabilidade da linha base.

Mtodos de degaseificao

Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o pior mtodo quando usado sozinho

Vcuo + ultrassom: Rpido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.

Purga com Hlio: Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a

aumento de vazamentos, maior custo operacional.

Degaseificador on-line: Contnuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial (melhor opo a longo prazo)

Sistema de bombeamento

Tm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutvel de FM para o

sistema cromatogrfico

REQUISITOS:

Ser de material inerte

Presses de at 6000 psi (~400 atm)

Vazo contnua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

Vazes de 0,1 a 10 ml/min (aplicaes analticas)

Controle de vazo e reprodutibilidade melhor que 1 %


Tipos de bombas:

Pneumtica

Deslocamento

Recproca

Bomba pneumtica

Vantagens:

Baixo custo

Livre de pulsaes

Desvantagens:

Baixa presso (at 2000 psi)

Baixo volume

No permite gradiente

Vazo depende da presso de retorno e viscosidade da fase mvel

Bomba de deslocamento

Vantagens:

Vazo independe da presso de retorno e viscosidade da fase mvel

Livre de pulsaes

Desvantagens:

Baixo volume

No permite gradiente

Bomba recproca

Vantagens:

Presso elevada (at 10 000 psi)

Pequeno volume interno (35 a 400 L)

Permite gradiente

Desvantagem:

Fluxo pulsado

Alto custo


Isocrtico :

+ A composio da fase mvel permanece constante ao longo da

anlise.

+ Capaz de separa um nmero limitado de analitos.

Gradiente

+ A composio da fase mvel varia durante a anlise.

+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes

na amostra , muito diferente.

+ Separao de amostras complexas.

Separao isocrtica e por gradiente

A eluio isocrtica feita com um nico solvente (ou mistura de

solventes). Se um solvente no propiciar uma eluio suficientemente

rpida de todos os componentes, ento pode ser utilizada uma eluio

por gradiente.

Com base nas eluies isocrticas foi elaborado o gradiente a seguir.

INJEO MANUAL

- As amostras so introduzidas com seringas.

- Aps virar a ala, a amostra carregada pela fase mvel at o incio

da coluna.

AMOSTRADOR AUTOMTICO

- As amostras so postas em um frasco localizado

dentro do amostrador.

- O amostrador automtico :

1- Mede o volume correto para injeo.

2- Injeta a amostra.

3 Prepara o injetor para uma prxima amostra

Sistema de Injeo

Sistema de Injeo Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo

Bomba

Coluna

Bomba

Coluna

LO

AD

Sobrecarga de Volume da amostra

Para aproveitar de todos os pratos que uma

colina possui, no se deve injetar um volume

maior que 1% do volume da coluna vazia.

(L)=(raio)2(comprimento)(0,01)

Coluna Geralmente em ao inox ( mais popular, maior presso)

+ Coluna de vidro reforado (at 600 psi, utilizada para biomoleculas)

+ PEEK polmero ( biocompatvel e quimicamente inerte com a maioria

dos solventes)

+ Preo: > US$ 200.00

Tipos de colunas

+ Analticas : dimetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250

mm.

+ Preparativas: i.d 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.

A escolha de uma coluna apropriada o ponto crtico para o sucesso

da anlise.

Pr-coluna

Localizada entre o injetor e a coluna

Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.

Mesma FE da coluna de separao.

Protege a coluna

Custo reduzido

Pr-coluna!

Fase estacionria.

+ As colunas so recheadas com partculas porosas com dimetro de 1,8 5 m.

+ Estas partculas porosas na coluna tm geralmente uma fase ligada

quimicamente sobre a sua superfcie, que interage com os componentes da

amostra para separ-los um do outro.

Coluna

Condicionamento da Coluna

Necessrio para que haja um perfeito equilbrio

da FM e da FE.

Coluna nova: 4- 8 horas

Coluna parada h alguns dias: 2 horas

Coluna de uso dirio: 15 minutos.

Lembre-se: a coluna deve ser

guardada em solvente orgnico.

LC com fase quimicamente ligada

Sntese da FE.

Modos de HPLC

HPLC

Partio Inica Excluso Adsoro


Adsoro: O mecanismo de separao: competio entre molculas da

amostra e da fase mvel em ocupar os stios ativos da fase estacionria,

slido. (Slica)

Fase estacionria (polar) afetada com frequncia pela

reteno de molculas de alta polaridade como lcoois, gua.

Partio: (CLL ou CFL) CLL: O mecanismo de separao: baseia-se nas diferentes

solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase

mvel e na fase estacionria.(slica purificada)

O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase

estacionria na fase mvel.

CFL: A fase estacionria est imobilizada por meio de ligaes

qumicas. (Normal ou Reversa)

Fase normal x Fase reversa

Fase normal:

fase estacionria polar;

fase mvel apolar (n-alcanos, clorofrmio, acetato de etila);

solutos neutros;

polaridade soluto t. reteno;

mecanismo reteno: adsoro

Fase reversa:

fase estacionria apolar;

fase mvel polar (tampes, gua, metanol, acetonitrila, THF);

solutos apolares, no-inicos;

polaridade f. mvel t. reteno;

mecanismo reteno: interaes apolares com radicais da coluna.

Fase Normal

Si

OH

silanol livre

Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

Ciano (-C2H4CN)

Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)

Amina (C3H6NH2)

R =

CROMATOGRAFIA DE FASE

NORMAL Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como

gua e trietilenoglicol

adsorvidos sobre slica ou

alumina e solventes apolares,

como hexano ou ter

isoproplico, eram usados como

fase mvel; por razes histricas,

este tipo de cromatografia

chamado de fase normal

Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando a polaridade da fase mvel tem

o efeito de diminuir o tempo de eluio

Polaridade do soluto: a > b > c

c b a tempo

c b a tempo

Po

lari

dad

e d

a f

ase m

vel

Fase reversa

CROMATOGRAFIA DE FASE

REVERSA

Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionria apolar, um

hidrocarboneto por exemplo (C18), e a

fase mvel relativamente polar

(gua, metanol, acetonitrila, etc)

Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da fase mvel aumenta-se

o tempo de eluio

Polaridade do soluto: a > b > c

a b c

tempo

a b c

tempo

Po

lari

dad

e d

a f

ase m

vel

Efeito do comprimento da cadeia na

reteno.


Inica: A fase estacionria , normalmente, uma resina de poliestireno e

divinilbenzeno, a qual so ligados grupos inicos, como por exemplo,

-SO-3 trocadores fortes de ction

-CO-2 trocadores fracos de ction

-NR+3 trocadores fortes de nions

-NH2R+ trocadores fracos de nions

Os grupos inicos tm um contra-on (com carga oposta) que pode

ser deslocado pelos ons da fase mvel de carga similar a ele.

Excluso: A separao efetuada de acordo com o tamanho efetivo das

molculas.

A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho

controlado. Onde, as molculas menores penetram a maioria dos poros.

Caractersticas de um detector

Sensibilidade e seletividade adequada

Ampla faixa linear

Baixo volume interno

Resposta Rpida

Boa estabilidade e reprodutibilidade

No destruir a amostra

Baixo volume interno

O volume do detector a regio do fluxo cromatogrfico ao qual o detector responde.

Grande volume alargamento dos picos registrados.


Resposta Rpida

O sistema de deteco deve idealmente apresentar um sinal que represente um exato instante de uma poro do caminho (volume do detector).

Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.


Boa estabilidade e reprodutibilidade

Alta confiabilidade e facilidade de uso

No destruir a amostra para:

Permite coletar o eluato

Utilizar um segundo tipo de detector

Um feixe de luz ultravioleta dirigido atravs de uma clula de fluxo e um sensor

mede a luz que passa atravs da clula.

Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrer uma

alterao na quantidade de energia que incide sobre o sensor.

Essa alterao da quantidade de energia amplificada e dirigida para um

sistema de registro de dados.

Como resposta, um espectro de UV obtido, o que pode ajudar na identificao

de alguns compostos.

Detector por espectrofotometria UV-

visvel


visvel

Detector por espectrofotometria

UV-visvel

Detector por arranjo de diodos


visvel

Princpio de operao Absorvncia de luz na faixa UV-visvel

tipo Seletivo, depende de propriedades do

composto

Min. quanti. detectvel

(g/mL)

10-9

Sensib. a temperatura Baixa

Sensib. a vazo da f. mvel No

til com gradientes Sim

Aplicabilidade Compostos que absorvem no selecionado

Detector por fluorescncia

Em comparao com detectores de UV-Vis, os detectores de

fluorescncia oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que

permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes

complexas em nveis extremamente baixos.

Os detectores de fluorescncia detectam apenas substncias que

apresentam fluorescncia.


Princpio de operao Excitao com luz produz emisso

fluorescente

tipo Altamente seletivo

Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-9 (excitao a laser: 10-12)

Sensib. a temperatura Baixa


til com gradientes Sim

Aplicabilidade Compostos ou derivados que fluorescem

Detector por ndice de refrao

A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma

maneira de detect-lo.

O IR uma medida da capacidade de uma molcula em desviar a luz em

uma fase lquida.

A quantidade de deflexo proporcional concentrao.

O detector IR considerado universal porm, pouco sensvel e sofre com a

variao da temperatura.


Princpio de operao Mudana no ndice de refrao da fase mvel

tipo Universal, depende de propriedade da f.

mvel

Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-7

Sensib. a temperatura alta


til com gradientes No

Aplicabilidade Geral

Detector eletroqumico

Princpio de operao Oxidao ou reduo em potencial fixo


composto


Sensib. a temperatura Mdia

Sensib. a vazo da f. mvel Sim


Aplicabilidade Espcies que oxidam ou reduzem

Detector por condutividade eltrica

Detector por condutividade eltrica

Princpio de operao Condutividade eltrica devida a presena de

ons


composto


Sensib. a temperatura Mdia

Sensib. a vazo da f. mvel Sim


Aplicabilidade Solues aquosas com compostos inicos

E aqui termina a aula,

!!!!!

Referncias bibliogrficas

http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html

SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.

Princpios de anlise instrumental. 5. Ed., 2002.

COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.

Introduo a mtodos cromatogrficos.

WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles

and practice. 1997.

ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LQUIDO

Figura 28-1 Skoog p642 vp

espcies MM>104: cromatografia por excluso

espcies inicas de baixa MM: cromatografia por troca inica

espcies pequenas e polares, mas no-inicas: mtodos de

partio (srie homloga)

espcies no-polares: cromatografia por adsoro

(ismeros estruturais,

hidrocarbonetos alifticos)

TROCA INICA

PARTIO ADSORO

fase normal

fase reversa

EXCLUSO

filtrao em gel

permeao em gel

insolvel em gua solvel em gua

no-polar inico

polar no-inico

POLARIDADE DO SOLUTO

102

103

104

105

106

mas

sa m

olecu

lar

aplicaes

HPLC x GC

Fator GC HPLC

Requisito p/ amostra voltil e termicamente

estvel solvel na fase mvel

Tipos de amostra gases, lquido e slidos lquidos e slidos

Quantidade mnima

detectvel 10-12 g (ECD) 10-9 g (UV)

Tempo de anlise minutos at poucas

horas

minutos at muitas

horas

Pratos tericos por

coluna 2.000-300.000 500-25.000

Capacidade analtica at 200 componentes at 50 componentes

Tempo de treinamento

do operador cerca de 3 meses pelo menos 6 meses

Comparao entre as caractersticas de GC e HPLC

(a) (b)

(d) (c)

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