Sinalização Celular

núcleo

receptor

ligante

Receptores são proteínas que interagem com seus ligantes,

ativando vias de sinalização intracelulares, gerando efeitos biológicos.

vias de sinalização

efeitos biológicos

meioextra-celular

receptor

domínio externo

meiointra-celular

domínio transmembrânico

domínio interno

• alteração no potencial de membrana• dilatação/contração celular• estimulação/inibição de expressão gênica• etc....

Efeitos Biológicos:correspondentes ao tipo celular e à natureza do ligante

extracelular

intracelular

ligante

receptor

vias de sinalização

efeito biológico

Vias de Sinalização são reações em cascata no meio intracelular,

que traduzem os sinais extracelulares,via ativação de segundos mensageiros.

extracelular

intracelular

ligante

receptor

vias de sinalização

efeito biológico

Ativação de segundos mensageiros

extracelular

intracelular

ligante

receptor

vias de sinalização

efeito biológico

Peptídeos, neurotransmissores, aminoácidos, hormônios, drogas, etc..

Ligantes são substâncias capazes de ativar receptores

e desencadear efeitos biológicos

CRESCIMENTO SOBREVIVÊNCIA PROLIFERAÇÃO

Molécula sinalizadora

TRANSDUÇÃO DE SINAIS

DIFERENCIAÇÃO

MIGRAÇÃO

(1) Síntese da molécula sinalizadora por uma célula

(2) Liberação da molécula pela célula sinalizadora

(3) Transporte da molécula sinalizadora para a célula alvo

(4) Interação da molecúla sinalizadora com um receptor celular na célula alvo

(5) Desencadeamento da sinalização intracelular

(6) Alteração do metabolismo, função, expressão gênica ou desenvolvimento da célula alvo

(7) Remoção do sinal e consequente

término da resposta celular

Passos envolvidos na comunicação

célula-célula

Sinalização endócrina

Vaso sanguíneo

Secreção do hormôniopela glândula endócrina no vaso sanguíneo

Células alvo distantes

Sinalização parácrina

Célula secretora Célula alvo adjacente

Sinalização célula-célula

Célula sinalizadora Célula alvo adjacente

Moléculas sinalizadoras podem atuar localmente ou a distância

Sinalização autócrina

Sítios alvos sobre a mesma célula

Sinal extracelular

Receptor

Agentes sinalizadores

1. Peptídeos e proteínas (insulina e PDGF)

2. Esteróides (estradiol, testosterona)3. Gases solúveis (NO, CO)4. Nucleotídeos, retinóides, derivados

de ácidos graxos5. Luz

Receptores Celulares

Existem 4 modelos estruturais propostos de proteínas receptoras:

1– Receptores Intracelulares

2 – Receptores acoplados à Proteína G

3 – Receptores com e sem Atividade Enzimática

4 – Receptores do tipo Canal Iônico

Natureza das moléculas sinalizadoras

Hidrofílicas

Hidrofóbicas

Receptores de superfície

Receptores intracelulares

Molécula hidrofílica

receptorm. plasmática

Molécula hidrofóbica

carreador

núcleoReceptor intracelular

Hormônios esteróides e seus receptores intracelulares

inibidorDT DLDT DL

Núcleo

citoplasma

DNA

RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G (GPCR)

1. Odor e paladar2. Percepção da luz3. Neurotransmissores4. Funções endócrinas5. Quimiotaxia6. Exocitose7. Controle da pressão arterial8. Embriogênese9. Crescimento e diferenciação celulares10. Oncogênese

Funções Biológicas dos GPCRs

• Metade de todas as drogas conhecidas utilizam como alvo os GPCRs

• O projeto genoma revelou um vasto número de novos GPCRs (receptores orfãos - possíveis alvos para novas drogas)

Domínios de interação com a proteína G

extracelular

intracelular

Receptores acoplado a proteína G (GPCR)

• A classe mais numerosa de receptores superfície (fungos - mamíferos)

• Mamíferos: células olfatórias usam de 500 a 1000 diferentes GPCrse outras células usam outros 500 diferentes tipos de GPCRs para responder a diversos estímulos

PorcentagemEstimadaNo genôma

Proteína G trimérica

Diferentes tipos de subunidades Ga

M. Plasmática Proteína G

GPCR Molécula

Sinalizadora

Espaço extracelular

citosol

Proteína G ativada

Subunidade a ativada

Mecanismo de ativação dos GPCRs

Subunidade a ativada

Proteína alvo

Ativação da proteína alvoPela subunidade a

inativação

Reconstituição da proteína G trimérica

Proteína alvo inativa

subunidades Ga apresenta atividade GTPásica = são capazes de hidrolizar GTP em GDP

Subunidade a ativada

Enzima ativada

Síntese de moléculas mensageiras que atuam em proteínas alvo intracelulares

Substrato

Enzima

substratos

Segundos mensageiros

Proteína Gbg pode ativar ativa canais iônicos

Canal de K+

Substratos alvos ativados pelos GPCRs

• Os maiores segundo mensageiros produzidos a partir da ativação dos GPCRs:

– cAMP

– Inositol trifosfato (IP3)

– Diacilglicerol (DAG)

Canal de K+Adenilato

ciclase

cAMP

PKA

PLC-b

IP3 DAG

Ca2+ PKC

Mecanismo de ativação da Adenilato-ciclase por GPCRs

Molécula sinalizadora

Adenilato-ciclase ativada

receptor

Subunidade a ativada

AMP cíclico

Proteína quinase A (PKA) inativa

Proteína quinase A (PKA) ativa

Proteína quinase A (PKA) ativa Poro nuclear

Fosforila e ativa o fator de transcrição CREB que regula a expresão gênica

CREB inativo

Gene alvo ativado

Transcrição

Tradução

Nova protéina

Mecanismo de ativação da Adenilato-ciclase

AMP cíclico-PKA estimula a quebra de glicogêniomas inibe a sua síntese

Aumento do AMPcEstimulação da quebra de glicogênio

Inibição da síntese de glicogênio

Enzimas fosfodiesterase catalizam: AMPc + H2O AMP

A fosfodiesterase que cliva o AMPc é ativada pela PKAAssim, o AMPc estimula a sua própria degradação levando a uma rápida dimuição do sinal gerado pelo AMPc

N

N N

N

NH2

O

OHO

HH

H

H2C

HO

PO

O-

1'

3'

5' 4'

2'

cAMP

GPCR

Gas

Adenilato-ciclase

AMPc

PKAGPK GP Glucose 1- fosfato

GS

CREB

Transcrição gênica

Quebra do glicogênio

Inibição da síntese de glicogênio

PKA = proteína quinase AGPK = quinase glicogênio fosforilaseGP = glicogênio fosforilaseGS = glicogênio sintase

= ativação

= inibição da ativação

P P

P

P

Fosfodiesterase de

AMPc

Núcleo

citoplasma

adrenalina

Algumas Respostas celulares mediadas pelo AMP cíclico

Molécula sinalizadora Tecido-alvo Resposta principalAdrenalina cardíaco Aumento da taxa e força

de contração cardíaca

Adrenalina muscular Degradação de glicogênio

ACTH e glucagon adiposo Degradação de gordura

Receptor b-adrenérgico

Receptor a-adrenérgico

Complexo G estimulatório

Complexo G inibitório

Controle da ativação da Adenilato-ciclasedepende da classe de proteína G trimérica ativada

Hormônio estimulatório

Hormônios inibitórios

Adenilatociclase

Efeito de exotoxinas bacterianas sobre a ativação dos GPCRs

Interage com resíduos de arginina de Gase inibe a sua atividade GTPásica “trancando”Gas no seu estado ativo

Interage com resíduos de cisteína de Gaiimpedindo a sua interação com GPCRpermanecendo no estado inativo

Toxina do cólera Toxina pertussis

Mecanismo de ativação da Fosfolipase C através da ativação do GPCR

Molécula sinalizadora GPCR Fosfolipase C-b

fosfatidil inositolbi-fosfato (PIP2)

diacilglicerol

subunidade Gaativada

inositol tri-fosfato

proteína quinase C

(PKC) Canal de Ca+2

Lúmem do reticuloendoplasmático

Mecanismo de ativação da fosfolipase C

calmodulina

Ca/calmodulina Quinase

Inativa

ativa

ativa

Inativa

Domínio catalítico

Ca+2/calmodulina

Ativa Ativaçãototal

Auto-fosforilação

calmodulina

Proteína fosfataseDomínio inibitório

Mecanismo de ativação da Calmodulina quinase (CaM-quinase)

GPCR

Fosfolipase C

DAGIP3

Ca+2PKC

Calmodulina

CalmodulinaQuinase

CaM-quinase abundante nas sinapsesImportantes para a memória

Proliferação celular

Sinalização induzida pela luz em células Fotorreceptoras bastonadas da retina

Bastonete da retina

Luzcitosol

lúmem

Disco

Fosfodiesterase inativa Fosfodiesterase

ativa Membrana plasmática dos bastonetes

Fechamento do canal iônico

abertura do canal iônico

Diminui a conc. De GMPc

aumenta a conc. de GMPc

Adaptada ao escuro

rodopsina

Classe da proteína G

Efetor alvo 2° mensageiro Ex. de receptores

Gas Adenilato-ciclase AMPc (aumento) Receptor b-adrenérgico,Receptor para glucagon, serotonina, vasopressina

Gai Gbg

Adenilato-ciclase

Canal de K+

AMPc (diminuição) Receptor a-adrenérgico, receptor acetilcolina

Gaolf Adenilato-ciclase AMPc (aumento) Receptores de olfato

Gaq Fosfolipase C IP3 e DAG (aumento)

Receptores a2-adrenérgico

Gat GMPc fosfodiesterase

GMPc (diminuição) Rodopsina (receptores de luz)

Principais classes de proteína G trimérica e seus efetores

NO signalingThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1998

"for their discoveries concerning nitric oxide as a signallingmolecule in the cardiovascular system"

Robert F.Furchgott

Louis J .Ignarro

Ferid Murad

USA USA USA

SUNY Health Science Center Brooklyn, NY, USA

UCLA School of Medicine Los Angeles, CA, USA

University of Texas, Health Science Center Dallas, TX, USA

1916 - 1941 - 1936 -

• Óxido nítrico (NO)- Diversas atividades biológicas (funciona como segundo mensageiro)

NOS 1 ou NOS neuronalNOS 2 ou NOS endotelialNOS 3 ou NOS induzida

Arginina+O2

Citrulina

NOS (nNOS, eNOS, iNOS)

NO

NO sintases (NOS) Ca+2

acetilcolina

GPCR Fosfolipase C

Relaxamento da musculatura lisa

Células da musculatura lisa

Células endoteliais

Lúmem do vasosanguíneo

Estimulação sexual

Guanilato ciclase

fosfodiesterase

Relaxamento da

musculatura lisa

Ereção

NO

GMP cíclicoGMP

PKG

Relaxamento da musculatura lisa

Guanilato ciclase

GMPcFosfodiesterase

1 - Receptores com atividade quinase intrínsica

• Receptores tirosina quinase (RTK)(Receptores de fatores de crescimento)

• Receptores serina/treonina quinase (Receptores da família TGF-b)

2- Receptores sem atividade enzimática(Receptores de citocinas)

Evolução e diversidade dos RTK

• RTK são encontrados em organismos tão primitivos como poríferos (Geodia cydonium) e cnidários (Hydra vulgaris)

Hydra vulgarisGeodia cydonium

Poríferos Cnidários

Parazoa700 milhões

eumetazoa

Receptores tirosina quinase

Mecanismo de ativação dos Receptores Tirosina Quinase

Monômeros inativos

trans-fosforilaçãoDimerização

pY pY

pY pY

pY pY

Domínio catalítico

Conformação do loop de ativação dos RTKe mecanismo de autofosforilação

Hubbard, Stevan R.  1997

Ligante estabiliza a formação de dímeros ativos

-P-P-P

P-P-P-

-P-P-P

P-P-P-

-P-P-P

P-P-P-

Transdução do sinal

Ligante estabiliza a formação de dímeros ativos

-P-P-P

P-P-P-

COMO O SINAL É TRANSDUZIDO APÓS A FOSFORILAÇÃO DO RECEPTOR?

?

P-

P-

-P

-P

P- -P P

Amplificação do sinal

COMO ESSAS PROTEÍNAS INTERAGEM COMO RECEPTOR ATIVADO?

-P

-P

P-

P-

SH2

Ty

TyTy

Ty

Quinase Src Vírus do sarcoma aviário

• Domínios SH2 são módulos compactos (~100 a.a)

• Reconhecem resíduos de tirosina fosforilada

SH2

• Quinases

• Proteínas adaptadoras

• Proteínas do citoesqueleto

• Fatores de transcrição

Domínios SH2 são encontrados em um grandenúmero de proteínas envolvidas em sinalização

ESPECIFICIDADE

SH2

• Cada domínio SH2 reconhece fosfotirosinas no contexto dos a.a que ladeiam o resíduo fosforilado(1-6 a.a C-terminal)

SH2

NH2 -pTy-X-X-Z-B-S-T- COOH

SH3

-P-X-X-P-X-

14-3-3

-R-S-X-pS-X-P-

. . .

Domínios proteicos em transdução de sinais

SH2

NH2-pTy-X-X-Z-B-S-T-COOH FosfolipídeoPIP3

PH1-6 aa

Reconhecem proteínas ricasno aa prolina

Serina fosforilada

enzimas

adaptadores

Proteinas plataforma

Fatores detranscriçãoProteínas docitoesqueleto

Sinalização Ras-ERK/MAPK

• Proteínas Ras são membros de uma superfamília de proteinas G de baixo peso molecular

• Estão ancoradas na membrana plasmática através de âncoras lipídicas

• São reguladas por fatores de troca de guanina (FTGs) e por proteínas ativadoras de GTPases (PAGs)

Ras

Ras

GDP

GTP

FTG promove a dissociação de GDP

GTP se liga espontânemamente

PAG acelera a atividade basal

GTPsede Ras

Pi

H2O

RasGDP

GTP

Raf

MEK -P

ERK -P

ELK1P-

ProliferaçãoSobrevivênciaDiferenciação

GDP

GAP

GRB2 SOS

-P-P-P

P-P-P-

PI3K

-P-P-P

P-P-P-

PIP2

PDK1 AKT

PIP3PIP3

P

BAD IKK FRKH

Controlam a sobrevivência celular

PI3K-P-P-P

P-P-P-

PIP2PIP3PIP3

PTEN

PIP2 PIP2

Receptores serina/treonina quinase• Receptores de TGF-b

• Crescimento

• Diferenciação

• Sobrevivência

• Desenvolvimento

Mecanismo de ativação do receptor TGFb

Receptor do tipo IReceptor do tipo II

quin

ase

FKBP12

quin

ase

FKBP12

quin

ase

Smad-R-P

P P P

Smad-4Smad-R Smad-4

Receptores que não apresentamatividade quinase intrínsica

Olli Silvennoinen, 2004

JAK JAK

JAK JAKJA

K

JAK

-PP- StatStat -PP-PP

StatP

StatP

Stat

PStat

PStatP

PStat

P

Mecanismos de inibição da ativação

SPITZ

ARGOS

P- -PP- -P

1- Ligação de antagonistas

EGFR

Se liga ao receptor mas não induz a sua ativação

P- -PP- -P(Fosfatases )

3- Desfosforilação

Proteínas fosfatases desfosforilam o Receptor inibindo a transdução do sinal

PPP

PP

PP

P

4- Inibição por endocitose

Após a sua ativação, receptores podemser endocitados e degradados nos

lisossomos

P- -PP- -P

-UB

Proteosoma

5- Degradação por ubiquitinação

Receptor TGF-b

quin

ase

quin

ase

Smad-R

-P

Smad-4

APOPTOSE

Hepatócitos

quin

ase

quin

ase

Smad-R

-P

Smad-4

PI3K

-P-P-P

P-P-P-

PIP2

PDK1 AKT

PIP3PIP3

P

Inibição da apoptose

Receptor TGF-b Receptor de insulina

Hepatócitos

Receptores

Mecanismos de ativaçãoe inibição

Domínios de reconhecimentoTransdução do sinal

Como as células usam esse repertório de vias de sinalização conhecidas para transduzir respostas

biológicas específicas

1. Receptores tirosina quinase2. Receptor serina/treonina quinase3. Receptores sem atividade quinase intrínsica

ESTUDO DIRIGIDO SINALIAÇÃO CELULAR – BIOCEL 2015

1- O que são vias de sinalização celular? 2- A sinalização celular pode ser classificada em autócrina, parácrina, endócrina e célula-célula. Descreva a diferença entre esses diferentes tipos de sinalização. 3- O que determina o mecanismo de ativação dos receptores? 4- Cite os diferentes tipos de receptores. Como se caracterizam a estrutura destas moléculas? 5- Ligantes podem atravessar a membrana citoplasmática? Explique.6- A insulina pode ativar receptores? Qual a sua função na sinalização para captação de glicose pelas células? 7- Explique a ação nuclear decorrente da ativação de receptores hormonais. 8- Em receptores acoplados à proteína G (GPCR), o que faz com que a subunidade α ative a unidade efetora (enzima)? 9- Como ocorre a ativação de PKA pelo AMP cíclico? 10- A toxina do cólera, produzido pela bactéria Vibrio Cholera, causa diarreia nos indivíduos infectados. Qual a base molecular para esse efeito causado por essa toxina? 11- O inositol 3 fosfato (IP3) e o diacilglicerol (DAG) atuam como segundos mensageiros. Descreva como o IP3 regula a liberação de cálcio do retículo endoplasmático. Qual a enzima responsável pela formação do IP3 e DAG ? 12- Descreva o mecanismo de ação do viagra no relaxamento da musculatura lisa dos corpos cavernosos. 13- O que é a rodopsina? Como ela é ativada? Qual a consequência da ativação da rodopsina para os bastonetes da retina. 14- O que são quinases e qual a sua relação com o ATP? 15- Após a ativação de um receptor tirosina quinase, como ocorre a transdução do sinal intracelular desencadeado pela sua ativação? 16- Descreva os diferentes mecanismos possíveis de inibição de uma via de sinalização. 17- Por que a transfosforilação é importante para a auto-fosforilação de tirosinas do receptor tirosina quinase? 18- O que são domínios SH2? Qual a sua importância na transdução de sinais?

19- Considere as vias de sinalização abaixo. Descreva a seqüência de ativação da via 1 e 2. Quem é 1? Por que somente depois da ativação de M, 1 é capaz de inibir AA. Como vc acha que ocorre a inibição de AA por 1.

X Y Z M

1

K W 7

10

23

AA

T

Via 1 Via 2

X = receptor tirosina quinase 7 = receptor GPCRY, Z, M, 1 = quinases K = fator de transcriçãoW = proteína 10 = Proteína G-as23 = Enzima AA = PKAT = Fator de transcrição

= ativação

= inibição da ativação