Aula de Bioquímica I

Tema:

Exemplos de Mecanismos de Catálise Enzimática

Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM

Instituto de Química de São Carlos – IQSCUniversidade de São Paulo – USP

E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br

Enzimas Proteolíticas: Proteases Renovação de proteínas

- Reciclagem de Aminoácidos novas proteínas- Energia Livre a partir de aminoácidos

- Digestão

Regulação celular- Desenvolvimento - Coagulação sanguínea - Inflamação

Hidrólise de ligações peptídicas

- Adição de uma molécula de água

- t1/2 para hidrólise em pH neutro 10 a 1000 anos

Ressonância

Carbono da Carbonila é menos eletrófilo

Menor suscetibilidade a ataque nucleófilo

SERINA-PROTEASES Mecanismo envolve a participação de uma Ser particularmente reativa

- Funciona como um poderoso nucleófilo para atacar o C da Carbonila da ligação peptídica- Catálise covalente formação de um intermediário ligado à Enzima

SERINA-PROTEASES

Quimotripsina- Cliva ligações Peptídicas do lado carboxílico de aminoácidos hidrófobos volumosos

Nomenclatura de especificidade para interações Proteases-substrato

Pn= posição dos radicais Amino-cidívelPn’= posição dos radicais Carboxi-cidível

Sn= Local na enzima para o radical AminoSn’= Local na enzima para o radical Carboxi

Sequência substrato da Quimotripsina

Marcação covalente com DIFP

(diisopropylphosphofluoridate)

Apenas a Ser reativa ligou ao DIFP

- 1 de 20 Ser na Quimotripsina

Estudos de Cinética enzimática

Uso de substrato cromogênico: Clivagem de uma ligação Éster libera produto amarelo

SERINA-PROTEASESIdentificação do sítio ativo

SERINA-PROTEASESIdentificação do sítio ativo

Estudos de Cinética enzimática

Stopeed-flow (fluxo interropido)

Reação em 2 fases

SERINA-PROTEASESIdentificação do sítio ativo

Reação em 2 fases

Reação em duas etapas

1º) Acilação Formação de Acil-Enzima

2º) Desacilação Saída do grupo abandonador

SERINA-PROTEASESQuimotripsina

Quimotripsinogênio produzido no pâncreas e ativado no estômago Ativação proteolítica

SERINA-PROTEASES Sítio ativo é formado pela Tríade catalítica

- Asp, His e Ser forma rede de H-bound que reduz pKa da Ser catalítica

Hiper-polarização da OH da Ser

- Formação de um íon alcóxido

reativo poderoso nucleófilo

SERINA-PROTEASESQuimotripsina Estrutura protéica

SERINA-PROTEASESQuimotripsina Estrutura protéica

Mecanismo envolve:- Catálise ácido-base- Catálise nucleofílica

+

SERINA-PROTEASES

SERINA-PROTEASES

Sistema de revezamento de cargas

SERINA-PROTEASES Mecanismo envolve:- Catálise eletrostática

- Catálise por tensionamento ajuda a formar a estrutura tetraédrica- Intermediário tetraédrico é estabilizado pelo “Buraco Oxi-ânion”

1

Subtilisina

Carboxipeptidase II

SERINA-PROTEASES Tríade catalítica

- Importância foi estudada por mutagênese sítio específica- Atividade analisada por Cinética Enzimática

Subtilisina

Mutantes S221A, H64A e D32A e Triplo Mutante Menor atividade catalítica em 106 x Mantém KM constante Afinidade E + S inalterada

Triplo mutante é ainda 103 vezes mais ativo do que TampãoExplicação O mecanismo de catálise por tensionamento é mantida.

SERINA-PROTEASESQuimotripsina, Tripsina, Elastase e TEV Evolução Divergente

Apresentam ~ 40% de identidade na seqüência Estrutura terciária similar

Mecanismo de catálise similar Diferem na especificidade por substratos

Superposição da Quimotripsina e Tripsina

Alta similaridade estrutural

SERINA-PROTEASESQuimotripsina, Tripsina e Elastase Evolução Divergente

Bolsão S1Principal fator de

especificidade destas enzimas

SERINA-PROTEASESTripsina Bovina- Tríade catalítica

- Substrato Arg no bolsão- Asp enterrado no cerne da Estrutura

- 5 Pontes dissulfeto

SERINA-PROTEASES

- Quimotripsina – Subtilisina – CarboxipeptidaseII e ClpP protease

Sem correlação na estrutura primária e terciária

Evolução convergente

A Natureza parece ter descoberto de maneira independente o mesmo mecanismo catalítico pelo

menos Quatro vezes

Outras PROTEASES1- Ativação do nucleófilo 2- Polarização da lig. Peptídica

3- estabilização do intermediário tetraédrico

Cisteino-proteasesSerino-proteases

Metalo-proteasesAspartato-proteases

INIBIDORES DE PROTEASES Muitos medicamentos são inibidores de proteases

Ex: Captopril: Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina: antihipertensivos

INIBIDORES DE PROTEASES Muitos medicamentos são inibidores de proteases

Aspartato proteases

INIBIDORES DE PROTEASES Muitos medicamentos são inibidores de proteases

Inibidores da aspartil protease do HIV

ANIDRASE CARBÔNICA“Tornando mais rápida uma reação rápida”

Não-catalisada V = 1,3 x 10-1 (s-1)

Catalisada V = 1,0 x 10+6 (s-1)

Catálise depende da

presença de 1 íon Zn2+,

coordenado por 3 His,

localizado no fundo do

Sítio Ativo à 15 Angstrons

da superfície da enzima

ANIDRASE CARBÔNICACatálise por Zn2+ ocasiona a ativação de uma molécula de H2O

Dependência da V em função do pH- Catálise Básica

Zn2+ reduz o pKa da H2O de 15,7 para 7,0

- Aumento da [HO—] local mesmo em pH = 7,0

- Íon HO— é um nucleófilo mais poderoso do que a H2O

15,7Efeito do pH na Atividade da

Anidrase carbônica

ANIDRASE CARBÔNICACatálise ocorre em 4 etapas

- Catálise por Orientação - Catálise base geral

Próton liberado é captado pela His64

ANIDRASE CARBÔNICA Mecanismo de Catálise apoiado pelo Análogo sintético de coordenação do Zn2+

- Em pH 9,2, o complexo sintético mostra V hidratação do CO2 100 x maior

O Análogo sintético reduz o pKa da H2O = 8,7

ANIDRASE CARBÔNICA Regeneração da Enzima depende da liberação do próton passo limitante

V da hidratação do CO2

= 1,3 x 10+6 (s-1)

-1-1111

-1-1-11 sM10sM10 é H do difusão a Se +−

+ ≤→= k

)sM(1x10M)1x10(M1x10 1-1-117-1

7-

1

1 +

−

∗=∴== kkkK

?-14

1 s1x10≤k- A liberação do H+ é fator limitante para a Velocidade da Reação

O meio celular é tamponado!!!! buffer com pKa = 7.0- A Keq será = 1

ANIDRASE CARBÔNICAA Velocidade da reação depende da presença de um tampão para receber os prótons

liberados da H2O para formar o nucleófilo OH—

-1-1911 sM10 a' e' limita meio do difusãoA +−− kk

’.[B]kpor dada será prótons de retirada de A taxa 1

-163-1-191 s10)10(*)sM(10 ]'.[ +−+ == MBk

Concentração de Tampão da ordem de mM

(1.10-3 M) são suficientes para alcançar

Velocidades de 1.10+6 s-1

ANIDRASE CARBÔNICA O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima

Sem contato com o meio externo O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial

His64 “LANÇADEIRA DE PRÓTONS”na estrutura da proteína

ANIDRASE CARBÔNICA O Zn2+ está a 15 Å de profundidade da superfície da enzima

Sem contato com o meio externo O transporte de H+ do sítio ativo para o tampão depende de um mecanismo especial

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃOEnzimas de Restrição

Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias- Mecanismo de defesa contra infecção viral

Endonucleases de Restrição tipo IIClivam dentro da seqüência de

reconhecimento

Grande importância na Engenharia Genética, Biologia

Molecular e Biotecnologia Permitem a construção de moléculas de DNA específicas

- Clonagem de DNA

Emprego em testes de paternidade

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃOEspecificidade das Enzimas de Restrição: Altíssima

- Atuar somente na sequência de reconhecimento e NÃO devem degradar o DNA endógeno Reconhecem sequências específicas – Sítios de restrição

- Seqüência palindrômica = permite a mesma leitura em ambos os sentidos Reconhecem apenas o DNA Exógeno

Metilases Enzimas específicas que modificam o DNA endógeno no mesmo sítio de reconhecimento

Para cada Enzima de Restrição existe uma Metilase correspondente- Enzima de Restrição + Metilase: Sistema de restrição-modificação

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃOMecanismo da Hidrólise

Presença de Intermediários ligados à enzima?

Mecanismo 1 Catálise covalente

2 Passos sem inversão da configuração do P.

Mecanismo 2 Hidrólise direta

1 Passo Inversão da configuração do P.

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃOMecanismo da Hidrólise

1 Passo com inversão da configuração do P Sem intermediários reacionais

Sem catálise covalente Envolve hidrólise direta

Uso de fosfotiatos marcador de estereoisomeria

EcoRV Dependência de Magnésio – Co-fator

- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado1º DNA2º H20

Íon Magnésio (Co-fator) Coordenado por 6 ligantes

- 3 H2O

- 2 Asp

- 1 O do Pi

Ativa uma H2O para Ataque

Nucleofílico no grupo fosfato

Catálise por íon Metálico

- Posicionamento

- Catálise Eletrostática

- Catálise ácido-baseOrdem de ligação à EcoRV

1º: DNA2º: Co-fator Mg2+

3º: H20 reativa

EcoRV Interação EcoRV-DNA ocorre por simetria Bilateral

Sequência de reconhecimento é uma

sequência invertida

Enzima dimérica age nas duas fitas do DNA

Interação EcoRV-DNA

A Enzima envolve o DNA

Metilação no DNA endógeno

EcoRV Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar

- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico

EcoRV Afinidade EcoRV-DNA Inespecífico e específico é similar

- Distorção do DNA só ocorre com interações produtivas com DNA específico

Distorção do DNA tem um grande custo entrópico que é compensado pelas interações produtivas

com DNA específico

Catálise por tencionamento Distorção do DNA ajuda a posicionar o Pi

próximos aos grupos Asp reativos

EcoRV Complexo catalítico é montado somente após ser garantida a especificidade da interação Enzima-DNA Distorção do DNA

- Reação só progride se a especificidade for garantida- Mecanismo em Deslocamento Sequencial Ordenado

A Enzima usa a Energia livre de ligação

com o DNA para deformar o Substrato e

preparar o complexo catalítico para a

reação.

Mg2+ é coordenado pelo Pi a ser clivado e

Asp posicionados próximos na conformação

distorcida

DNA cognato = específico

DNA não-cognato = inespecífico

ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO TIPO IISem identidade Sequencial Com identidade Estrutural

São proteínas homólogas transferência gênica horizontalO gene foi disseminado por um plasmídio após a divergência evolutiva das bactérias