atividade tripanocida e anti-inflamatória de compostos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – CBIOL

Laboratório de Imunobiologia da Inflamação – LABIIN

Atividade tripanocida e anti-inflamatória de compostos derivados de

1,8-dioxo-octa-hidroxantenos.

ANA PAULA DE JESUS MENEZES

OURO PRETO- MG

2019

II

ANA PAULA DE JESUS MENEZES

Atividade tripanocida e anti-inflamatória de compostos

derivados de 1,8-dioxo-octa-hidroxantenos

Orientador: Prof. André Talvani

Co-orientador: Guilherme de Paula Costa

OURO PRETO

ABRIL DE 2019

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação

em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas

em Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Ouro Preto, como parte integrante dos

requisitos para obtenção do grau de Doutora em

Ciências Biológicas.

Área de concentração: Imunobiologia de

Protozoários

V

AGRADECIMENTOS

Ao professor André Talvani pela orientação e amizade;

Ao agora professor Guilherme de Paula Costa, pela co-orientação;

Ao professor Dr. Robson Teixeira da Universidade Federal de Viçosa e a sua aluna Milene

Lopes, que gentilmente cederam as Xantenodionas sempre foram solícitos e dispostos a

contribuir de maneira efetiva para a realização deste trabalho;

Ao professor Dr. Rick Tarleton (UGA) e toda sua equipe pela orientação no Programa de

Doutorado Sanduíche e pelo auxílio não só pela construção do conhecimento científico e

tórico, mas também pelo crescimento pessoal;

Á Ludmila Walter dos Reis e Luíza Perucci por compartilharem toda experiência acadêmica

e pela incansável determinação em nos ajudar na rotina do LABIIN;

À todos os integrates do Laboratório de Imunobiologia da Inflamação pela ajuda na execução

deste trabalho, pela convivência diária e por serem a família que eu escolhi na UFOP;

À Universidade Federal de Ouro Preto pelo ensino público e gratuito de qualidade;

Aos órgãos de fomento, Capes, Fapemig e CNPQ.

Um agradecimento especial a Glenda, Paula e Priscila, amigas presentes desde o início desta

jornada. A República Mistura Perfeita pela amizade e por me permitir viver tudo que Ouro

Preto tem de melhor;

Aos amigos de Athens por estarem ao meu lado todos os dias e por me ajudarem em todas

as situações! Vocês sabem o quão são importantes para mim!

Á minha mãe Vitoria, por ser exemplo de determinação e coragem e por me incentivar a

sempre ir além! Ao meu irmão Daniel e a Ludmila pelo companheirismo! À minha avó

Mundica, zelosa pela minha educação desde criança e certamente estará torcendo por mim

no plano espiritual. Obrigada por serem a melhor família, por me permitirem embarcar em

busca dos meus sonhos, me distanciando de vocês que mais amo. Hoje, percebo que não

estou livre do medo e de tantas outras fraquezas, mas chegar até aqui me deixa livre do medo

de nunca ter tentado!

VI

RESUMO

A infecção pelo Trypanosoma cruzi acomete milhares de pessoas pelo mundo e a eficácia dos

fármacos disponíveis para eliminar este parasito é limitada à fase aguda da doença. A busca por

moléculas mais efetivas contra o T. cruzi e de menor toxicidade para o hospedeiro é, portanto, uma

prioridade para a saúde pública mundial. Neste contexto surgem as 1,8-dioxo-octahidroxanthenos ou

xanthenodionas, compostos sintéticos derivados das xantonas que possuem inúmeras aplicações

terapêuticas descritas, dentre elas atividades anti-inflamatória, tripanocida e cardioprotetora. Assim,

o objetivo deste trabalho foi avaliar a ação tripanocida, in vitro, de compostos derivados das 1,8-

dioxo-octahydroxantenos e sua influência, in vivo, na parasitemia e na alteração dos parâmetros

inflamatórios durante a infecção murina. Para avaliar a toxicidade dos compostos in vitro utilizou-se

testes colorimétricos (MTT) em formas tripomastigotas (cepa Y) e em macrófagos J774A.1, além de

ensaios fluorimétricos (AlamarBlue) em células Vero com parasitos da cepa CL expressando uma

proteína vermelho fluorescente (CLtdTomato) para determinação da CC50, IC50 e IS. Nesta etapa,

doze compostos foram avaliados (MI17, MI18, MI24, MI25, MI39, MI45, MI68, MI73, MI78, MI79,

MI80 e MI81) foram avaliados nesta etapa. O compostos MI80 (IC50=30.65) destacou-se por

apresentar atividade anti-T. cruzi, com o melhor IS (170). Para avaliar in vivo o desempenho

tripanocida e imunológico do composto MI80, camundongos Swiss foram infectados com as cepas

Y (n = 10) e CL (n = 10) de T. cruzi utilizando um protocolo de tratamento por 10 dias com 50mg /

kg de MI80. O MI80 reduziu 40% do pico de parasitemia em animais infectados com a cepa Y,

enquanto reduziu, em ambas as cepas, o infiltrado inflamatório cardíaco. RankL, CCL2 e IFN-g

foram mensurados no tecido cardíaco, mas o MI80 não foi capaz de modificar seu padrão em animais

infectados com a cepa Y. No entanto, o MI80 aumentou o RankL e IL-10 em camundongos

infectados com CL. Não foi observada toxicidade hepática e renal nos animais advindas do

tratamento com o composto MI80. . Nossos achados mostraram que o 1,8-dioxo-octa-hidroxanteno

tem um efeito anti-parasitário limitado e foi capaz de melhorar os parâmetros inflamatórios cardíacos

relacionados à infecção por T. cruzi.

VII

ABSTRAT

Trypanosoma cruzi infection affects thousands of people worldwide and the efficacy of drugs

available to eliminate this parasite is limited. The1,8-dioxo-octahydroxanthenos or xanthenediones

are derivatives synthetic compounds from xanthones presenting considerable biological applications.

The aim of this study was to assess the trypanocidal and inflammatory activities of 1,8-dioxo-

octahydroxanthenes derivatives using the CL strain of T. cruzi expressing the tandem red fluorescent

protein (tdTomato) to test in vitro 12 xanthenediones derivatives (MI17- 18, 24, 25, 39, 45, 68, 73,

78, 79, 80, 81). The killing assay showed that three compounds were able to eliminate this parasite:

MI24 (Ic50=26.43µM), MI25 (Ic50= 14.11µM) and MI80 (Ic50=30.65). However, only MI80 was

not toxic for Vero cells after the viability assay. To evaluate in vivo the tripanocidal and the

immunological performance of the MI80, Swiss mice were infected with the Y (n=10) and CL (n=10)

strains of T. cruzi using a treatment protocol for 10 days with 50mg/kg of MI80. MI80 reduced 40%

of the parasitemia peak in animals infected with Y strain while reduced, in both strains, the cardiac

inflammatory infiltration. RankL, CCL2 and IFN-g were measured in cardiac tissue, but the MI80

was not able to modify their pattern in Y-strain infected animals. However, MI80 increased the

RankL and IL-10 in CL-infected mice. No hepatic and renal toxicity was observed with the MI80.

Our findings showed that 1,8-dioxooctahydroxanthene has a limited anti-parasitic effect and it was

capable to ameliorate the cardiac inflammatory parameters related to T. cruzi infection.

VIII

LISTA DE ABREVIATUTAS

ABTS – Ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolina-6-sulfonico)

AMPc – Monofosfato cíclico de adenosina

Bz – Benznidazol

CC50 - Concentração citotóxica para 50% das células

CCA – Centro de ciência animal

CCL2 - Quimiocina ligante de monocito

CEUA – Comissão de experimentação em uso animal

COX – Ciclo-oxigenase

DMSO - Dimetilsulfóxido

DMXAA - Ácido dimetilxantenona-4-acético

DNA – Ácido dexiribonucleico

DPI – Dias após a infecção

GAL - D-galactosidase

IC50 – Concentração inibitória para 50% dos parasitos

IFN - Interferon

IL-10 - Interleucina 10

IL4 – Interleucina 4

IL6 – Interleucina 6

iNOS – Enzima óxido-nitrico sintase

IS - Índice de seletividade

LDNT – Triptose neutralizada e digerida de fígado

MTT – 3-(4,5-di-metilazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium brometo tetrazol

NFAT – Fator nuclear de células T ativadas

NF-kb – Fator nuclear kappa-Β

NI - Grupo de animais não infectados

NIT - Grupo de animais não infectados e tratados com 50mg/kg da XtdMI80

NO – Óxido nítrico

Nxt – Nifurtimox

PBS – Tampão fosfato salino

PCR – Reação em cadeia da polimerase

PGE – Prostaglandina E

IX

RANK – Ligante ativador do receptor do fator nuclear kappa-Β

RNA – Ácido ribonucleico

ROS – Espécies reativas de oxigênio

rRNA – Ácido ribonucleico ribossomal

SE – Erro padrão

SFB – Soro fetal bovino

AST/TGO – Transaminase oxalacética

ALT / TGP– Transaminase pirúvica

Th1 – Células T auxiliares com perfil do tipo 1

TNF - Fator de necrose tumoral

Treg – Células T reguladoras

Xtd - Xantenodiona

MI80 - Derivado de xantenodiona MI80

X

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 12

1.1 Xantenodionas: histórico e relevância ............................................................................... 12

1.2 Potencial anti-inflamatório ................................................................................................ 16

1.3 Ação cardioprotetora das xantonas.................................................................................... 19

1.4 - Atividade antiparasitária das xantonas ............................................................................ 20

1.5 O T.cruzi como um indutor do processo inflamatório ...................................................... 22

1.6 Estratégias terapêuticas na doença de Chagas ................................................................... 23

2. OBJETIVOS............................................................................................................ 25

2.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 25

2.2 Objetivos específicos......................................................................................................... 25

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 26

a. Representação esquemática do delineamento experimental ............................................ 26

3.1 Compostos ......................................................................................................................... 26

3.2 Parasito .............................................................................................................................. 28

3.3 Culturas Celulares ............................................................................................................. 29

3.4 Obtenção das formas tripomastigotas de cultura celular ................................................... 29

3.5 Modelo animal .................................................................................................................. 30

3.6 Experimentos In vitro ........................................................................................................ 30

3.6.1 Verificação da atividade tripanocida - Ensaio de citotoxidade em formas tripomastigotas

derivadas de cultura celular ..................................................................................................... 30

3.6.2 Avaliação do efeito tripanocida em formas amastigotas ................................................ 31

3.6.2.1 Geração de parasitos modificados – T. cruzi fluorescentes (tdTomato)...................... 31

3.6.2.2 Avaliação do potencial tripanocida em amastigotas ................................................... 33

3.6.3 Ensaios de citotoxidade em culturas de células – determinação da CC50....................... 33

3.6.3.1 Macrófagos murinos-MTT® ....................................................................................... 34

3.6.3.2 Células Vero- AlamarBlue® ....................................................................................... 34

3.7 Experimentos In vivo ......................................................................................................... 36

3.7.1 Padronização – Experimento de dose-resposta .............................................................. 36

XI

3.7.2 Infecção e esquema de tratamento ................................................................................. 36

3.7.3 Exame de sangue a fresco - parasitemia ......................................................................... 36

3.7.4 Mortalidade .................................................................................................................... 37

3.7.5 Histopatologia do coração .............................................................................................. 37

3.7.6 Estereologia do coração ................................................................................................. 38

3.7.7 Produção de citocinas ..................................................................................................... 38

3.7.8.1 Transaminase oxalacética (AST/TGO) ....................................................................... 39

3.7.8.2 Transaminsae pirúvica (ALT/TGP) ............................................................................ 40

3.7.8.3 Creatinina .................................................................................................................... 41

3.7.8.4 Ureia enzimática .......................................................................................................... 41

3.8 Análise estatística .............................................................................................................. 42

4. RESULTADOS ....................................................................................................... 43

4.1 - Resultados in vitro .......................................................................................................... 43

4.1.1 Avaliação da toxicidade em formas tripomastigotas do T.cruzi e determinação do IC50

................................................................................................................................................. 43

4.1.2 Efeito dos compostos na viabilidade celular demacrófagos murinos J774A.1)avaliados

por ensaios colorimétricos ....................................................................................................... 45

4.1.3 Atividade tripanocida em formas amastigotas do T.cruzi (cepa CLtdTomato) .............. 47

4.1.4 Efeito sobre a viabilidade celular em células Vero por ensaios fluorimétricos e seu

respectivo índice de seletividade ............................................................................................. 50

4.2 Resultados In vivo ............................................................................................................. 55

4.2.1 Padronização da dose e via de tratamento ...................................................................... 55

4.3 Avaliação do tratamento com o composto MI80 na dose de 50mg/kg por via oral .......... 57

4.3.1 Parasitemia e mortalidade .............................................................................................. 57

4.3.2 Massa corporal e massa relativa do coração, baço e fígado ........................................... 59

4.3.4 Efeito do tratamento com MI80 nos parâmetros inflamatórios na infecção experimental

pelo T.cruzi .............................................................................................................................. 60

4.3.4.1 Histopatologia e estereologia do miocárdio ................................................................ 60

4.3.4.2 Mediadores inflamatórios ............................................................................................ 64

4.3.6 Tratamento com a xantenodiona MI80 e avaliação da toxicidade renal e hepática ....... 65

XII

5. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 67

6. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 76

7. REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 77

XIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Representação molecular dos compostos. Em (A) Xanteno (9H-Xanthene ou

Dibenzo pirano) e em (B) Xantona (9H-xanten-9-ona). ............................................................. 13

Figura 2 – Estrutura do núcleo das xantenodionas e seu padrão de distribuição ................ 15

Figura 3 – Representação esquemática dos métodos realizados para estudo da atividade das

xanthenodionas. (A) Experimentos in vitro. (B) Ensaios in vivo de padronização da dose e via

de tratamento(n=5). (C) Avaliação do tratamento com a MI80 na redução da parasitemia e do

potencial anti-inflamatório (n=10). CC50, concentração citotóxica de 50%; IC50, concentração

inibitória de 50%, DPI, dias após a infecção. .............................................................................. 26

Figura 4 - Formula estrutural do núcleo xantenodiona. Esqueleto utilizado para construção das

respectivas séries químicas.......................................................................................................... 27

Figura 5 - Plasmídeo utilizados na geração de T. cruzi fluorescente. Representação

esquemática do plasmídeo pTrex-Neo-tdTomato. ...................................................................... 32

Figura 6 - Avaliação da fluorescência do T. cruzi (cepa CL) tdtomato. (A) Imagem

microscópica dos parasitas expressando tdTomato em todas as fases evolutivas. (B) Intensidade

de fluorescência em epimastigotas em citômetro de fluxo CyAn (DakoCytomation) e analisada

com o software FlowJo (Tree Star). A fluorescência de fundo dos parasitas selvagens (verde)

também pode ser observada. Fonte: Canavaci et al, 2010 ........................................................... 32

Figura 7 – Análise do efeito citotóxico em formas tripomastigotas T. cruzi (cepaY), pelo

método do MTT. 1x106 foram adicionados por poço, em placa de 96 poços e os compostos

MI17, MI24, MI25, MI79, MI80 ou MI81 foram nas concentrações de 5 a 300µM/mL e incubados

por 24h. Os resultados foram expressos como valores em porcentagem do número de parasitos

viáveis após 24 horas de incubação com os derivados de xantenodionas. Análise de variância

(ANOVA) e pos-teste de Tukey foram aplicadas para determinar a diferença estatística entre os

tratamentos em relação ao controle DMSO. (*) representa diferença estatística determinada por

p<0,05. ........................................................................................................................................ 44

Figura 8 – Análise de viabilidade celular de culturas de macrófagos murinos J774A.1

avaliadas pelo método do MTT frente aos derivados de xantenodionas. 1x105 celulas foram

adicionada aos poços em placa de 96 poços.Após a formação da monocamada os compostos

MI17, MI24, MI25, MI79, MI80 ou MI81 foram adicionados em concentrações decrescentes de

5 a 300µM/mL e as placas incubadas por 48h em estufa 37ºC 5% CO2.Após 48h foi realizado o

ensaio de MTT e os resultados foram expressos em porcentagem do número de células viáveis

após 48 horas de incubação com os derivados de xantenodionas . ............................................. 46

Figura 9 - Atividade das xantenodionas MI24, MI25 e MI80 sobre a infecção de células Vero

pela cepaCLtdtomato do T. cruzi. 2,5x104 células foram infectadas pela cepa CLtdtomato e,

posteriormente, incubadas na presença ou ausência de concentrações decrescentes de

XIV

xantenodionas MI24, MI25 e MI80, por 72 horas. Cada ponto das curvas de dose-resposta

corresponde à média de 2 experimentos independentes, em triplicata. O cálculo de IC50 foi

realizado utilizando-se o software GraphPadPrism6. .................................................................. 48

Figura 10 - Fotomicrografias representativas dos efeitos anti-T.cruzi dos compostos MI24,

MI25 e MI80. Estão representadas fotomicrografias de células Vero infectadas com cepa

CLtdTomato sem tratamento e tratadas com as xantenodiona MI24, MI25 e MI80 ou com o

fármaco benznidazol (Bz) ao terceiro dia após a infecção in vitro. ............................................ 49

Figura 11 – Análise da viabilidade celular em culturas de células Vero pelo método do

AlamarBlue. 2,5x104 foram plaqueadas e incubadas em estufa 37ºC, 5%CO2 por 72h com os

derivados de xantenodionas MI79, MI80, MI81, MI73 e MI39 em concentrações decrescentes de

100 a 0,39µM/mL. As barras representam os valores em porcentagem do número de células

viáveis de três experimentos independentes em triplicata e erro padrão (SE). ........................... 51

Figura 12 - Viabilidade celular em culturas de células Vero pelo método do AlamarBlue,

determinado após 72 horas de incubação com os derivados de xantenodionas MI17, MI24, MI25,

MI45 e MI49 em diferentes concentrações. As barras representam os valores em porcentagem do

número de células viáveis de três experimentos independentes em triplicata e erro padrão (SE).

..................................................................................................................................................... 52


determinado após 72 horas de incubação com os derivados de xantenodionas MI18, MI68 e MI78

em diferentes concentrações. As barras representam os valores em porcentagem do número de

células viáveis de três experimentos independentes em triplicata e erro padrão (SE). ............... 53

Figura 14 - Curva de parasitemia. Camundongos Swiss foram infectados com 5.000 formas

tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do T. cruzi (n=5) e tratados ou não com a xantenodiona

MI80 ou Benznidazol (Bz). Os dados em cada ponto da curva equivalem à média da

parasitemia/dia referente a cada grupo. O símbolo (*) indica p<0,05 em relação ao grupo controle

infectado e não tratado.O gráfico superior indica a parasitemia durante o tratamento por via oral

e o gráfico inferior por via intraperitoneal. ................................................................................. 56

Figura 15 - Curvas de letalidade dos animais infectados e tratados com a MI80 por via oral

ou intraperitoneal. Animais Swiss fêmeas foram infectados com a cepa Y do T. cruzi, tratados

ou não com MI80 em doses decrescentes de 800 a 50mg/kg ou BZ (100mg/kg) (n=5). Curvas

referentes ao período compreendido entre o 1º e o 15 º dia de infecção. O gráfico a direita

representa a taxa de mortalidade dos animais tratados por via oral e o gráfico da esquerda a

mortalidade dos camundongos tratados intraperitonealmente. ................................................... 57

Figura 16 - Curva de parasitemia em camundongos Swiss infectados pelo T. cruzi. Os animais

foram infectados com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y (A) ou CL (B) do T.

cruzi (n=10), tratados ou não com a xantenodiona MI80 ou Bz. Os dados em cada ponto da curva

XV

equivalem à média da parasitemia/dia referente a cada grupo. (*) representa p<0,05 em relação

ao grupo infectado e tratado com Bz. .......................................................................................... 58

Figura 17 - Curvas de letalidade de camundongos Swiss infectados com 5x103 formas

tripomastigotas sanguíneas da cepa Y ou CL do T. cruzi, tratados ou não com a MI80 ou

Bz. Animais Swiss fêmeas foram infectados com a cepa Y ou CL do T. cruzi, tratados ou não

com MI80(50mg/kg) ou BZ (100mg/kg) (n=10). Curvas referentes ao período compreendido

entre o 1º e o 15 º dia de infecção para cepa Y e 1º ao 18º para a cepa CL. O gráfico a direita

representa a taxa de mortalidade dos animais tratados para cepa CL o gráfico da esquerda a

mortalidade dos camundongos infectados coma cepa Y.Os resultados representam porcentagem

de animais vivos. ......................................................................................................................... 59

Figura 18 - Massa corporal e massa relativa do coração, baço e fígado. Camundongos Swiss

infectados e não infectados com a cepa Y ou CL do T. cruzi, tratados ou não com a MI80 ou Bz.

A massa corporal (A) dos animais foi avaliada após a eutanásia e, em seguida, o peso relativo do

coração (B), baço (C) e fígado (D), obtido a partir relação entre a massa do órgão dividido pela

massa corporal do animal. As caixas representam a mediana, máximo e mínimo. (*) representa

p<0,05 em relação aos controles NI e NIT. (#) mostra também diferença estatística em relação ao

grupo infectado e tratado com Bz. (Xtd) Xantenodiona MI80, (Bz) Benznidazol, (NI) Não

infectado e (NIT) Não infectado tratado com a MI80. ................................................................ 60

Figura 19 - Quantificação do processo inflamatório no músculo cardíaco. Camundongos

Swiss infectados com 5.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y ou CL do T. cruzi foram

tratados ou não com MI80 ou Benznidazol (Bz) na fase aguda. Análise do infiltrado inflamatório

contendo células mononucleares (A) e polimorfonucleares (B) no miocárdio dos animais. (C)

Diagrama de campo octogonal organizado em domínios que representa a celularidade tecidual da

seguinte forma: (-) celularidade mínima / (+ ) leve, (+ +) moderada ou (+ + +) intensa / infiltrado

inflamatório. * p< 0,05 comparado com o grupo controle infectado e não tratado; # p<0,05 em

relação ao grupo tratado com Bz e & p<0,05 comparado ao grupo tratado com MI80. (NI) Não

infectado e (NIT) Não infectado tratado com a MI80. ................................................................ 61

Figura 20 - Fotomicrografia de cortes histológicos do tecido muscular cardíaco.

Camundongos Swiss foram infectados com 5.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y

ou CL e tratados ou não com MI80 ou Bz, na fase aguda. As figuras superiores representam os

animais infectados pela cepa Y, além do controle não infectado. As imagens inferiores mostram

os animais infectados pela cepa CL e o controle não infectado e tratado com a MI80.Nos animais

infectados e não tratados (Y) ou (CL), o infiltrado inflamatório apresentou-se de maneira

moderada e foi possível identificar ninhos de amastigotas. Para o grupo de animais infectados e

tratados (Y+MI80) e (CL+MI80) verificou-se processo inflamatório discreto e focal. Nos animais

infectados e tratados com as doses 100 mg/Kg de Bz não houve detecção de infiltrado. Os

controles NI e NI+MI80 apresentaram aspecto histológico cardíaco normal. Barra 60μm2. (MI80)

XVI

Xantenodiona MI80, (Bz) Benznidazol, (NI) Não infectado e (NIT) Não infectado tratado com a

MI80. ........................................................................................................................................... 62

Figura 21 – Aspectos estereológicos do miocárdio. Camundongos Swiss foram infectados com

5.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y ou CL e tratados ou não com MI80 ou Bz, na

fase aguda. Confirmada a infecção, os animais foram tratados por 10 dias e o coração foi removido

e fixado em formol tamponado (10%). (A) Densidade volumétrica do caridiomiócito. (B)

Densidade volumétrica do tecido conjuntivo. (C) Densidade volumétrica dos vasos sanguíneos.

(D)Vascularização do miocárdio. (E) Compartimentos estruturais e funcionais. * p< 0,05

comparado com o grupo controle infectado e não tratado; # p<0,05 em relação ao grupo tratado

com Bz e & p<0,05 comparado ao grupo tratado com MI80. (NI) Não infectado e (NIT) Não

infectado tratado com a MI80. (Vv[cmy]) = volume total dos cardiomiócitos, (Vv [cnt])= volume

intersticial e (Vv [bvs])= volume de vasos sanguíneos. .............................................................. 63

Figura 22 - Perfil de marcadores inflamatórios no sobrenadante do macerado de miocárdio

de camundongos infectados ou não com a cepa Y ou CL do T.cruzi e tratados com a MI80

ou Bz. (A) Concentração de RankL. (B) níveis de CCL2, (C) IFN-gama no miocárdio e (D) IL-

10. O símbolo (#) representa p<0,05 em relação ao grupo infectado e tratado com Bz e (*) em

relação aos grupos NI e NIT. Os resultados estão expressos em caixas contendo a mediana,

máximo e mínimo. (Xtd) Xantenodiona MI80, (Bz) Benznidazol, (NI) Não infectado e (NIT) Não

infectado tratado com a MI80. .................................................................................................... 65

Figura 23 - Concentrações plasmáticas de TGO (A), TGP (B), ureia (C) e creatinina (D) de

camundongos infectados com as cepas Y e CL do T. cruzi, tratados com 50mg/kg durante

10 dias por via oral. O símbolo (*) representa diferença estatística (p<0,05) em relação aos

controles NI e NIT (#) representa p<0.05 em relação ao grupo infectado e tratado com Bz e (&)

indica diferença entre o grupo infectado e não tratado e o grupo tratado com a MI80. (, (Bz)

Benznidazol, (NI) não infectado e (NIT) não infectado tratado com a MI80 ............................. 66

XVII

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Atividade anti-inflamatória in vivo de xantonas e seus derivados ............................ 18

Tabela 2 - Estrutura molecular representativa das xantenodionas. Fórmula estrutural evidenciando

radicais e suas posições no núcleo das xantenodionas avaliadas neste estudo. ........................... 28

Tabela 3 – Citotoxidade em macrófagos murinos, atividade tripanocida em tripomastigotas e

índice de seletividade de compostos derivados de xantenodionas .............................................. 47

Tabela 4 - Citotoxidade em células Vero, atividade tripanocida em formas amastigotas do T. cruzi

e o índice de seletividade de compostos derivados de xantenodionas ........................................ 54

12

1. INTRODUÇÃO

1.1 Xantenodionas: histórico e relevância

Na química orgânica, os compostos heterocíclicos constituídos principalmente por

oxigênio e nitrogênio possuem grande relevância por apresentarem, dentre outras

vantagens, propriedades biológicas (Dua et al., 2009; Quin, 2010). Dessa forma, os

xantenos (Fig.1A) e seus derivados têm despertado interesse científico por suas atividades

antivirais, antibacterianas, anti-inflamatórias e antiparasitárias (Poupelin, 1978;

Vennerstrom et al., 1995; Reddi Mohan Naidu et al., 2012; Kaya et al., 2013). Além do

uso como precursor sintético para muitos compostos orgânicos (Shchekotikhin, 2002) e

corantes (Hilderbrand e Weissleder, 2007), os xantenos também foram investigados em

aplicações com tecnologias de laser (Pohlers et al., 1997; Hilderbrand e Weissleder,

2007) e com materiais fluorescentes para visualização de biomoléculas (Knight Cg,

1989).

Os xantenos isolados a partir de fontes naturais são denominados xantonas (9H-

xanten-9-ona) (Fig.1B). Esta classe de moléculas apresenta em sua estrutura dois anéis

aromáticos fundidos com uma y-piranona. Podem ser subdivididas, dependendo da

natureza dos substituintes na estrutura do dibenzo-γ-pirano, em xantonas oxigenadas

simples, xantonas glicosiladas, xantonas preniladas e seus derivados, dímeros de

xantonas, xantonolignóides e xantonas miscelâneas (Pinto et al., 2005). Em contrapartida,

as xantonas de origem sintética podem ter grupos simples, como hidroxila, metoxila,

metila, carboxila, bem como substituintes mais complexos, como epóxido, azol,

metilidenobutirolactona, aminoálcool, sulfamoil, ácido metiltiocarboxílico e

diidropiridina (Vieira e Kijjoa, 2005; Yang Chun-Hui, 2012).

13

Figura 1 – Representação molecular dos compostos. Em (A) Xanteno (9H-Xanthene ou

Dibenzo pirano) e em (B) Xantona (9H-xanten-9-ona).

Historicamente, a primeira xantona foi isolada em 1855 pelo químico alemão Dr.

W. Schmid que a extraiu a partir da casca de mangostão (Garcinia mangostana), a

primeira xantona natural denominada α-mangostina (Kuan, 2012). Devido a cor amarela

brilhante da α-mangostina, Schmid nomeou a nova classe química como xantona, termo

baseado na palavra grega xantos (amarelo) (Hostettman, 1989). Entretanto, as primeiras

investigações do potencial farmacológico destes compostos datam de cem anos após a

sua descoberta. Em 1968, o grupo de Bhattacharya isolou e caracterizou a mangiferina,

uma xantona da raíz das Malpighiacea com propriedades diuréticas e cardiotônicas

(Finnegan, 1968). Mais tarde, Da Re P (1970) foi o pioneiro a descrever as atividades

estimulantes e analépticas centrais de derivados sintéticos de aminoalquilxantonas. Uma

análise profunda desta atividade levou ao relato de um notável efeito estimulante sobre o

sistema nervoso central (SNC) e a inibição da enzima monoamina oxidase (MAO), uma

das mais importantes e açoes descritas destas classe de compostos. (Bhattacharya et al.,

1972; Suzuki et al., 1981; Deeb et al., 2007; Zuo et al., 2014). Outros estudos foram

descritos em 1972 evidenciando as xantonas como agentes bloqueadores β-adrenérgicos

(Dare, 1972), com atividade antitumoral in vivo (Schneider et al., 1972) e com

propriedades anti-alérgicas (Pfister et al., 1972). Ao final da década de 70, muito foi

alcançado para o reconhecimento das atividades biológicas destes compostos, com

estudos farmacológicos sendo realizados para as xantonas naturais e sintéticas.

Com o avanço da ciência e a melhoria das técnicas empregadas para extração de

produtos naturais e, também o aprimoramento da síntese de novos compostos, as

pesquisas envolvendo as atividades biológicas das xantonas expandiram (Pinto et al.,

2005). Em meados da primeira década do século XXI, o ácido dimetilxantenona-4-acético

ou DMXAA, análogo de xantona, foi testado clinicamente como agente antitumoral,

(A) (B)

14

apresentando-se como um potente indutor de interferon-β (IFN-β) (Roberts et al., 2007).

A atividade antitumoral de DMXAA foi associada à sua capacidade de induzir uma

variedade de mediadores inflamatórios, incluindo o fator de necrose tumoral (TNF), a IL-

10, a IL-6 e CCL5 (Jassar et al., 2005; Head, 2011). Apesar da promessa clínica, o

composto falhou nos testes em seres humanos, uma vez que o composto atuava

diretamente na via de sinalização celular STING (Baguley e Siemann, 2010; Prantner D,

2012). Após estes estudos, foi descoberto que esta via é diferente em humanos e

camundongos, não havendo correlação entre os resultados encontrados em modelo animal

e os testes clinicos em humanos. Entretanto a molécula é amplamente utilizada para

experimentação em modelo murino, uma vez que se conhece seu mecanismo de atuação

e (Daei Farshchi Adli et al., 2018; Conlon J e Monks B, 2103).

Comercialmente dois produtos contendo majoritariamente xantonas em sua

composição ganham destaque, o Vimang® e o Xango® (Garrido et al., 2001; Pardo-

Andreu et al., 2006). O Vimag®, extrato aquoso do caule de Mangifera indica L., planta

popularmente conhecida como mangueira, é constituído de mangiferina, polifenóis,

triterpenos, fitoesteróis, ácidos graxos e outros microelementos (Nunez A, 2002; Rivera

et al., 2011). Em Cuba, a suplementação com Vimang® é indicada para a redução do

stress oxidativo e melhoria da qualidade de vida dos pacientes (Pardo-Andreu et al.,

2006). Além do potencial antioxidante, o trabalho de Garrido et al. (2001), em modelo de

edema de pata em camundongos, demostrou que a injestão do Vimang® foi capaz de

reduzir a dor e a inflamação nestes animais, demostrando seu papel anti-inflamatório e

analgésico. O Xango® já é um produto que movimenta o mercado de bebidas funcionais

nos EUA e possui em sua composição a α-magostina. Contrariamente ao Vimag®,

estudos científicos não demonstraram sua eficacia em reduzir os parâmetros inflamatórios

em modelo animal e humano (Gutierrez-Orozco e Failla, 2013).

Os resultados emergentes da atividade farmacológica de compostos naturais

resultaram numa busca crescente pela otimização dos compostos líderes (Pinto et al.,

2005; Gong et al., 2017). Os métodos de extração tradicionais utilizados para obtenção

dos produtos naturais apresentam algumas desvantagens como o elevado tempo para a

extração com técnicas complexas e laboriosas, baixa seletividade e/ou baixos

rendimentos, além de empregar grandes quantidades de solventes tóxicos (Menendez et

al., 2017). Dessa forma, devido às importantes aplicações biológicas das xantonas, novas

estratégias sintéticas foram propostas e originaram distintos derivados com base nas

15

diferentes posições dos constituintes no esqueleto xantônico (Yang Chun-Hui, 2012;

Shagufta e Ahmad, 2016; Cidade et al., 2017). Isso permitiu aos pesquisadores

racionalizar e determinar as características estruturais essenciais para sua bioatividade

(Pedro et al., 2002; Shagufta e Ahmad, 2016). Shagufta e Ahmad (2016), em uma revisão

sobre as aplicações biológicas das xantonas sintéticas, enfatizaram que as modificações

moleculares como a inserção de grupos polares ou hidrofóbicos, além de outros

componentes, podem aumentar a eficiência dos compostos para suas atividades

antiproliferativas, antimicrobianas, antimaláricas, anti-HIV, anticonvulsivantes,

anticolinesterásicas, anti-oxidantes, anti-inflamatórias, além de aumenta a atividade

inibitória em diferentes enzimas.

Neste contexto surgem as xantenodionas, compostos heterocíclicos também

conhecidos como 1,8-dioxo-octa-hidroxantenos contendo um núcleo pirano fundido em

ambos os lados com anéis ciclohex-2-enona (Fig.2). A metodologia usada para gerar esta

molécula emprega técnicas caracterizadas como “green chemisty”, que permitem realizar

reações sob condições que não sejam prejudiciais ao ambiente, em um processo

ambientalmente aceitável (Sauer, 2000; Wender, 1997).

Além das vantagens de uma produção sustentável, as xantenodionas apresentam

distintas atividades biológicas descritas na literatura, que incluem propriedades

antibacterianas (Narasimha Murthy et al., 2014), antifungicas (Rahimifard et al., 2015),

leishmanicida (Muhammad Nisar, 2013), antimalárica (Winter et al., 1997), anti-

inflamatórias(Cidade et al., 2017) e antiproliferativa (Mulakayala et al., 2012). E, foi

pensando no viés inflamatório e em sua atividade em tripanosomatídeos (anti-

Leishmania), que elegemos as xantenodionas como a molécula alvo do nosso estudo.

Núcleo da Xantenodiona

Padrão de substituição comum

Figura 2 – Estrutura do núcleo das xantenodionas e seu padrão de distribuição

16

1.2 Potencial anti-inflamatório

O corpo humano é submetido a constantes danos que estimulam a resposta

inflamatória. Uma vez que a homeostase é perturbada, e em resposta a certos estímulos,

nosso corpo pode lançar um processo que define a inflamação, manifestada com sinais

macroscópicos cardinais (isto é, vermelhidão, inchaço, febre e dor) e sublinhado por eventos

microvasculares, celulares e moleculares que culminam no acúmulo de leucócitos (por

exemplo, granulócitos) nas áreas teciduais afetadas (Sugimoto et al., 2019)

O processo inflamatório é desencadeado através da ativação celular com consequente

liberação mediadores inflamatórios com efeitos autócrinos e parácrinos como o TNF, o IFN-

g, a IL-1b, IL-2, IL-6, dentre outros. Estes mediadores inflamatórios promovem a ativação

local de macrófagos, neutrófilos, células endoteliais e, com isso, aumentam a

permeabilidade vascular, facilitam a migração de células da resposta adaptativa para o local

do estímulo antigênico e possibilitam a ação resolutiva do processo inflamatório (Dinarello,

1996; 2007; Griffith et al., 2014). As quimiocinas são citocinas quimiotáticas que controlam

os padrões migratórios e o posicionamento das células imunes. A função da quimiocina é

fundamental para todo o movimento celular imunológico, desde a migração necessária para

o desenvolvimento e homeostase da célula imune, até a geração das respostas imunes celular

e humoral(Allavena et al., 1999; Bonecchi et al., 1999; Murdoch e Finn, 2000).

Mecanismos que regulam a resposta inflamatória são de suma importância para o

retorno à homeostase (Netea et al., 2017). A resolução da inflamação não é simplesmente a

eliminação do agente patogênico ou estressor, mas sim um processo ativo e autorregulado

que envolve reprogramação funcional de células por meio da produção de mediadores ad

hoc (Ouyang et al., 2011; Headland e Norling, 2015). Vários mediadores são capazes de

inibir a inflamação, dentre eles a IL-10, que suprime a produção de mediadores pró-

inflamatórios e é derivada principalmente de células T reguladoras (Treg) (Libby, 2007;

Dinarello et al., 2016). Os mediadores inflamatórios também podem ser neutralizados pela

interação célula-célula, desensibilização de receptores GPCRs e/ou por vias de sinalização

intracelular que dirigem a inflamação para uma regulação negativa (Headland e Norling,

2015). O fator de transcrição nuclear κB (NF-κB) regula muitos processos celulares,

incluindo produção de mediadores inflamatórios, proliferação e sobrevivência celular,

diferenciação de células T efetoras e reguladoras e maturação de células dendríticas (Arthur

e Ley, 2013; Afonina et al., 2017; Zhang et al., 2017).

17

Xantonas naturais e sintéticas são amplamente descritas na literatura por

apresentarem atividade anti-inflamatória induzindo ou bloqueando a expressão/produção de

mediadores inflamatórios. Sua ação é descrita em distintos tipos celulares in vitro e in vivo,

por diferentes mecanismos de ação (Pinto et al., 2005; Vieira e Kijjoa, 2005; Cidade et al.,

2017). Além disso podem alterar vias de sinalização celular relacionadas a atividade

inflamatória, a exemplo da sinalização das vias cinases ativadas por mitógenos, MAPK,

JNK, ERK, p38 e NF-kB (Pal et al., 2013; Jeong et al., 2014; Saha et al., 2016)

Nos modelos in vitro de inflamação induzida por lipopolissacarídeos (LPS) xantonas

e seus derivados foram capazes de alterar a expressão e a produção de citocinas(Deshpande

et al., 1997; Jeong et al., 2009; Tewtrakul et al., 2009; Bumrungpert et al., 2010) . A

mangostina, em particular, já foi descrita por regular negativamente a expressão de TNF, IL-

6 e IL-4, em macrófagos e adipócitos humanos (Bumrungpert et al., 2010; Liu et al., 2012;

Ding et al., 2018), além de atuar nas vias de sinalização celular das MAPK, STAT1, c-Fos,

c-Jun, EIK-1 e NF-kb (Lopaczynski e Zeisel, 2001; Liu et al., 2012; Ding et al., 2018). As

xantonas também possuem atividades antioxidantes, pois são unidades importantes de

doação de elétrons (Boots et al., 2002). Esta ação antioxidante desempenha um papel

preventivo em algumas patologias por meio da remoção de espécies reativas de oxigênio

(ROS), responsável por danos irreversíveis aos componentes celulares (Nakatani et al.,

2002; Chen et al., 2008; Tewtrakul et al., 2009).

O ativador do receptor do ligante nuclear fator kappa (RANKL) é a principal citocina

para a formação e ativação de osteoclastos (Lacey et al., 1998). A interação entre RankL e

o seu receptor é responsável pela sinalização intracelular envolvendo proteínas distintas

como o NF-kB, as proteínas quinases ativadas por mitógeno AKT, o fator nuclear de células

T ativadas (NFAT) e a cinase dependente de calmodulina (Ang et al., 2011). Estudos

mecanísticos revelaram que a mangiferina inibe a ativação do NF-kB induzida por RankL,

concomitante com a inibição da degradação de IkB-a e a translocação nuclear de p65. Além

disso, a mangiferina também inibe a fosforilação de ERK e JNK (quinase N-terminal c-Jun),

p38 e fosforilação de Akt (Ma et al., 2015; Fu et al., 2018).

A tabela 1, sumariza os resultados da experimentação in vivo, onde reforçam a

atividade anti-inflamatória das xantonas em diferentes modelos animais (Imran et al., 2017).

18

Tabela 1 – Atividade anti-inflamatória in vivo de xantonas e seus derivados

Modelo

Resultados Referência

Edema de pata induzido por

carregenina

Redução do diâmetro do edema de pata

(Lin et al., 1996;

Librowski et al.,

2005)

Colite induzida por TNBS

(2,3,4-trinitrobenzeno

sulfônico)

Redução do infiltrado inflamatório e

aumento da expressão de IL-10 (Jeong et al., 2014)

Asma induzida por albumina

(de ovo)

Redução da inflamação nos vasos e

brônquios, inibição das citocinas com perfil

Th2 e proliferação de linfócitos

(Rivera et al., 2011)

Artrite induzida por

adjuvante

Redução da produção de TNF, IL1-b, IFN e

IL-10 (Pal et al., 2013)

Toxicidade hepática induzida

por D-galactosamina

Inibição de NfKb em macrófagos

Redução de TGO/AST e TGP/ALT (Dar et al., 2005)

Em seres humanos, Rassameemasmaung et al. (2008) mostraram que a aplicação

tópica de um gel contendo mangostina reduziu a inflamação periodontal enquanto Udani et

al. (2009) e Tang et al. (2009) demonstraram que a ingestão de suco de mangostão diminuiu

os níveis séricos da proteína C reativa e reduziu os marcadores inflamatórios (CXCL10 e

CCL4) em indivíduos obesos. As xantonas também são capazes de inibir a formação de

radicais livres e das citocinas envolvidas no processo inflamatório da acne juvenil

(Chomnawang et al., 2007). Além disso, vale ressaltar a importância do DMXAA, derivado

xantônico, já testado clinicamente, com potencial antiproliferativo para células tumorais

(Roberts et al., 2007; Head, 2011; Prantner D, 2012; Daei Farshchi Adli et al., 2018).

19

Apesar dos estudos relatados anteriormente, a aplicação das xantonas naturais ou

sintéticas em doenças com alto índice de morbidade e/mortalidade despertaria interesse das

indústrias farmacêuticas e dos órgãos gerenciadores de saúde pública. As doenças

cardiovasculares estariam na lista alvo para as xantonas uma vez que previamente foi

demonstrado o papel cardioprotetor advindo do efeito anti-inflamatório destes compostos

(Jiang, D.-J. et al., 2004). Neste contexto, o próximo tema desta revisão enfatizará o papel

cardioprotetor de xantonas naturais e sintéticas.

1.3 Ação cardioprotetora das xantonas

A resposta inflamatória apresenta papel crucial na formação e perpetuação das lesões

cardíacas de diferentes etiologias. Estas inflamações nas células cardíacas têm sido

associadas à ativação coordenada do sistema complemento, do aumento da expressão de

citocinas e moléculas de adesão, recrutamento de neutrófilos e consequentemente aumento

da permeabilidade vascular (Frangogiannis, 2014). O efeito protetor das xantonas no sistema

cardiovascular pode ser devido a uma combinação de fatores como atividades antioxidante,

anti-inflamatória, inibitória da agregação plaquetária, antitrombótica e / ou vasodilatadora

(Jiang, D.-J. et al., 2004).

Foi demonstrado que a norathyriol, uma xantona isolada de Tripterospermum

lanceolatum, atenua o dano ao miocárdio aumentando a permeabilidade das células

endoteliais cardíacas e a “explosão respiratória” em neutrófilos. Esse fenômeno é induzido

por agonistas inflamatórios que inibem a ativação da proteína quinase C e da fosfolipase C

(Hsu et al., 1997; Lee et al., 1998). Além disso, estes compostos possuem ação direta na

liberação de creatina kinase (CK) e na redução dos níveis de TNF no miocárdio, em modelos

in vitro e in vivo, sugerindo que os efeitos protetores estão relacionados a redução da

atividade anti-inflamatória (Madan et al., 2002; Dai et al., 2004).

Estes compostos são também capazes de inibir o influxo de Ca+ por intermédio dos

canais de Ca+ receptores-operativos e voltagem-dependentes, ou por aumento nos níveis de

monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). Além disso, as xantonas aminoalcanólicas ainda

demostraram atividade hipotensora por ação dependente de canal de cálcio e pelo bloqueio

dos receptores b-adrenérgicos (Rapacz et al., 2014). Estes efeitos das xantonas e de seus

derivados em receptores adrenérgicos podem prevenir arritmias de forma mais eficiente que

o medicamento de referência Urapidil® (Marona et al., 2008; Szkaradek et al., 2015).

20

A busca por xantenodionas que atuem com efeito cardioprotetor em função da

atividade anti-inflamatória despertou o interesse do nosso grupo de pesquisa. O T. cruzi,

causador da doença de Chagas, induz lesões no miocárdio, principalmente, pelo

desequilíbrio da resposta inflamatória do hospedeiro. A seguir compreenderemos os aspectos

inter-relacionados entre o efeito antiparasitário das xantonas, sua ação anti-inflamatória

conectada ao seu efeito cardioprotetor na infecção pelo T. cruzi.

1.4 - Atividade antiparasitária das xantonas

Infecções por protozoários são problemas emergentes de saúde pública mundial.

Suramina, pentamidina, melarsoprol, efloritina e benznidazol constituem drogas utilizadas

no tratamento contra alguns agentes infecciosos, principalmente em países de clima tropical

(Theel e Pritt, 2016). No entanto, a toxicidade e o potencial de desenvolvimento de

resistência a estes compostos enfatizam a necessidade de medicamentos mais eficazes e

seguros para a população (Dua et al., 2009; Scarim et al., 2018). Recentemente, estudos

destacaram as atividades antiparasitárias das xantonas naturais ou sintéticas, em protozoários

e helmintos, atuando como principal agente parasiticida ou em sinergia com outros

medicamentos já utilizados na clínica, a exemplo da malária (Mauss, 1948; Nabih, 1966;

Dua et al., 2009; Aberham et al., 2011; Keiser et al., 2012)

É notória a ação das xantonas contra parasitos do gênero Plasmodium sp, agente

etiológico da malária (Pontius et al., 2008; Al-Massarani et al., 2013). Os compostos ativos

são extraídos de diversas fonte naturais, como espécies de fungos (Pontius et al., 2008) e

vegetais (Al-Massarani et al., 2013) além de compostos sintéticos (Winter et al., 1997;

Ignatushchenko Mv, 2000; Xu Kelly et al., 2001; Kelly et al., 2002). Sua ação malaricida

deve-se, possivelmente, a ação antioxidante das xantonas que, ao reduzir a produção de

radicais livres inibe a polimerização do grupo heme, fundamental para a sobrevivência deste

parasito (Ignatushchenko Mv, 2000; Xu Kelly et al., 2001; Zarena e Sankar, 2009). Sugere-

se, ainda, que modificações no posicionamento de grupos aminas protonáveis das

hidroxixantonas são capazes de aumentar a afinidade para o grupo heme livre e melhorar,

assim, as propriedades antimaláricas do composto (Winter et al., 1997). Estes compostos

apresentam ação sinérgica em associação com a artemisina, fármaco de escolha no

tratamento da malária (Tjahjani, 2017).

21

Existem poucos relatos da ação de xantonas, xantenos e xantenodionas com

propriedades anti-tripanosomastídeos e, os disponíveis, advêm principalmente de modelos

in vitro. Em geral, essa moléculas apresentam razoável atividade citotóxica e podem ganhar

ou perder radicais afim de aumentar sua eficácia antiparasitária (Abe et al., 2003; Abe et al.,

2004; Dua et al., 2009). Esta estratégia foi usada por Nisar et al. (2013) mostrando que a

natureza não citotóxica de análogos de 1,8-dioxo-octa-hidroxanteno fornece uma rota mais

segura para estudos biológicos com atividade leishmanicida contra promastigotas de

Leishmania major. Xantonas naturais extraídas de Andrographis paniculata (Dua et al.,

2009) e G.mangostana também apresentaram ação anti-leishmania (Al-Massarani et al.,

2013).

Apenas xantonas oriundas de fontes naturais foram testadas contra o T. cruzi e a

maior parte dos compostos testados possuem baixos índices de seletividade (Al-Massarani

et al., 2013). Estes compostos apresentaram atividade contra epimastigotas axênicos,

tripomastigotas de cultura celular e formas amastigotas, intracelulares (Abe et al., 2003; Abe

et al., 2004; Pontius et al., 2008)

Os trabalhos descritos anteriormente relatam apenas a atividade dos compostos

contra o T.cruzi, sem revelar quais são os eventos responsáveis por esta atividade. Entretanto,

em 2013, um grupo de pesquisadores brasileiros demonstrou o potencial anti-T. cruzi da

1,3,7-tri-hidroxi-2-(3-metilbut-2-enil)-xantona, isolada da Kielmeyera coriácea, árvore

nativa do cerrado e popularmente conhecida como “pau santo”. Este composto foi capaz de

gerar alterações ultraestruturais e morfológicas no parasito, sendo a mitocôndria seu alvo

principal (De Oliveira Caleare et al., 2013).

As perspectivas sobre o conhecimento e a identificação de novas moléculas é uma

área que proporciona grande avanço econômico e farmacológico (Scarim et al., 2018;

Osorio-Méndez e Cevallos, 2019). O impacto causado por doenças infecciosas assume

relevância mundial porque atinge a população, provocando graves problemas à saúde

pública (Rodriques Coura e De Castro, 2002; Dias et al., 2009). Dessa forma, existe a

necessidade de novas alternativas terapêuticas para o tratamento, principalmente para

doenças que são poucos estudadas ou mesmo negligenciadas farmacologicamente, como é

caso da doença de Chagas, impulsionando a busca por novos compostos com atividade

biológica (Osorio-Méndez e Cevallos, 2019).

22

1.5 O T.cruzi como um indutor do processo inflamatório

A presença do T. cruzi no organismo de mamíferos induz a uma complexa interação

entre suas moléculas e células de defesa do hospedeiro e, desta interação, emerge uma

resposta inflamatória sistêmica e focal no intuito de contenção da replicação parasitária

(Rocha E Silva, 1978; Marin-Neto et al., 2007; Talvani e Teixeira, 2011). No entanto, a não

eliminação destes protozoários promove a cronificação e a persistência da resposta

inflamatória podendo gerar lesões teciduais, perdas funcionais de alguns órgãos e até a morte

do hospedeiro (Teixeira et al., 2002; Gazzinelli, 2004). A intensa replicação deste protozoário

durante a fase aguda da infecção ativa uma resposta inflamatória inicial coordenada por células do

sistema mononuclear fagocitário (ex. macrófagos) que respondem à presença de antígenos do T. cruzi

através de uma via dependente de receptores do tipo Toll (TLR)-Myd88 (Bafica et al., 2006). Estes

receptores, ao se ligarem a proteínas (glicosilfosfadilinositol) presentes na superfície do parasito,

formam âncoras, conhecidas por GPI-mucinas (Cardoso et al., 2015), conduzindo, principalmente, à

ativação de uma resposta imune do tipo TH1, secretando mediadores inflamatórios como citocinas

(IL-12, TNF, IFN- gama), quimiocinas (CCL2, CCL5), óxido nítrico (NO), dentre outros, que além

de eliminarem o agente agressor, e modularem o curso da doença, atuam como indicadores

quantitativos de processos biológicos ou patológicos empregados para fins de diagnóstico (Pinazo et

al., 2015; Guedes et al., 2016). A produção do IFN-gama, é realizada tanto por células da resposta

imune inata (ex. células NK, Natural killer cells) quanto por células T, que em conjunto com o TNF,

ativam células do sistema fagocitário mononuclear, a produzirem o óxido nítrico (NO), molécula

efetora, responsável por controlar a replicação intracelular desse protozoário (Gutierrez et al., 2009);

além de acionarem quimiocinas (CCL2-MCP1, CCL5-RANTES), que ativam e recrutam novas

células para o local da infecção (Teixeira et al., 2002). Uma vez que o excesso de células pró-

inflamatórias em determinado tecido por um tempo prolongado pode ser prejudicial ao hospedeiro,

torna-se essencial a participação de citocinas regulatórias, como a IL-10, responsáveis por inibir e

controlar a resposta imune mediante a infecção por esse protozoário (Dutra et al., 1997). A constância

desses eventos inflamatórios, ao longo do tempo, conduz à prevalência desse parasito em diferentes

tecidos do hospedeiro mamífero, especialmente em tecidos musculares. Em particular, o tecido

muscular cardíaco representa um dos sítios mais importantes desta interação parasito-hospedeiro.

Dito isso, a infiltração maciça de células inflamatórias, seja devido à permanência do estímulo ou à

ausência de mecanismos regulatórios, embora priorize a eliminação do protozoário, inevitavelmente,

conduz à destruição de células hospedeiras e de plexos simpáticos e parassimpáticos, essenciais para

o funcionamento autonômico cardíaco. Estas ações em conjunto, culminam em uma nova

reorganização estrutural do coração, afetando negativamente sua funcionalidade, e assim,

23

conduzindo cerca de 20- 30% dos pacientes sintomáticos nesta condição, a um quadro de cardiopatia

chagásica crônica (CCC)(Prata, 2001; Marin-Neto et al., 2007; Talvani e Teixeira, 2011; Malik et

al., 2015). Nestes indivíduos, já foi demonstrada maior produção/expressão de citocinas e

quimiocinas pró- inflamatórias como TNF e CCL2, e a presença dessas, estão correlacionadas com

o comprometimento do coração (Dutra et.al., 1997 Cunha-Neto et al., 2009). Por outro lado, em

indivíduos crônicos, com ausência de manifestações cardíacas e digestórias, já foi demonstrado uma

prevalência de citocinas regulatórias circulantes, como a IL-10, mostrando que, em parte, o perfil

dos mediadores inflamatórios parece definir o quadro clínico na fase crônica dos indivíduos

infectados pelo T. cruzi (Dutra et al., 2014). No entanto, a intensidade da resposta inflamatória

mediante a infecção pelo T. cruzi, pode decorrer de diferentes fatores como, por exemplo, a cepa do

parasito, a via de infecção, além da genética e da resposta imune do hospedeiro vertebrado, capaz de

direcionar o curso de evolução da doença (Machado, 2013; Magalhães et al., 2015). Dito isso, torna-

se importante o desenvolvimento/utilização de fármacos, visando não apenas a destruição do

parasito, mas também o equilíbrio entre a interação parasito/hospedeiro.

1.6 Estratégias terapêuticas na doença de Chagas

Atualmente há dois fármacos disponíveis para o tratamento da doença de Chagas: o

nitrofurano Nifurtimox (Nfx; Lampit®, Bayer) e o nitroimidazol Benznidazol (Bz;

Lafepe®). Esses fármacos são compostos nitroheterocíclicos, pontuados pela existência de

um grupo nitro unido a um anel aromático. São incluídos em grupo de nitrofuranos e

antibióticos nitroimidazólicos que apresentam eficiência frente a um grande número de

infecções bacterianas e parasitárias (Wilkinson et al., 2008; Romanha et al., 2010).

No Brasil, o fármaco utilizado para o tratamento desta doença parasitária é o Bz desde

1978. A atuação do Bz parece ocorrer por meio de um mecanismo envolvendo a modificação

covalente de macromoléculas do parasito (como por exemplo, DNA, RNA, citocromo P450

e outras proteínas) provocada por radicais aniônicos gerados por nitroredução (Urbina e

Docampo, 2003) e resultando na inibição da síntese proteica. Este fármaco possui ação em

formas circulantes (tripomastigotas) e teciduais (amastigotas) do T. cruzi. Entretanto,

ocasiona indesejáveis reações aos usuários como reações de hipersensibilidade, dermatites,

toxicidade hepática, intolerância digestiva, edemas e depressão da medula óssea que leva,

frequentemente, ao abandono do tratamento (Salomon, 2012)

24

A eficácia dos dois agentes quimioterápicos de uso atual (Nfx e Bz) para o tratamento

da doença de Chagas é altamente variável e muitas vezes limitada, especialmente durante a

fase crônica da infecção (Viotti et al., 1994; Tarleton, Rick L., 2003; Urbina, 2010). Ambas

requerem longos períodos de administração e têm efeitos colaterais significativos (Rodriques

Coura e De Castro, 2002). Além disso, cepas resistentes também são responsáveis pelas

falhas terapêuticas (Filardi e Brener, 1987; Chatelain, 2015) Recentemente, formas do

parasita resistentes ao tratamento farmacológico prolongado in vivo e in vitro foram

identificadas e permanecem capazes de restabelecer a infecção após um dia de exposição à

droga (Sanchez-Valdez et al., 2018). Assim, há uma necessidade urgente de

descobrir/desenvolver novos alvos terapêuticos bem como drogas mais seguras, eficazes e

de baixo custo (Lombardino e Lowe Iii, 2004; Chatelain e Konar, 2015).

Existe uma demanda contínua por novas terapias para doenças tropicais, incluindo a

doença de Chagas. A falta de consenso em relação aos protocolos de triagem in vitro e in

vivo tem dificultado a descoberta de novas drogas para o tratamento da doença de Chagas

(Romanha et al., 2010).

Apesar do potencial dos fármacos utilizados na rotina clínica contra o T. cruzi, o

desenvolvimento de novos compostos com atividade tripanocida ainda é incipiente.

Atualmente, o tratamento com Bz (LAFEPE®) possui eficácia questionável, além de ter

atividade mutagênica e carcinogênica(Caldas et al., 2008). Por este motivo, novos

compostos vêm sendo testadas para o tratamento da tripanossomíase americana. Dessa

forma, a identificação de um composto derivado de xantenodionas que elimine o parasito

circulante e atue modulando a resposta inflamatória no hospedeiro, forneceria uma estrutura

química com potencial capacidade de tornar-se um fármaco. Além disso, a geração de

produtos com subsídios para contribuir nas ações públicas voltadas para o tratamento e

profilaxia de doenças tropicais, traria enorme benefício para uma parte da população latino-

americana, ainda parcialmente negligenciada farmacologicamente. Por estas razões as

xantenodionas tornaram-se alvo de investigação nacional e internacional nas últimas

décadas, por suas propriedades-alvo microbiocidas e anti-inflamatórias. Dessa forma, o

objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito anti-inflamatório e anti-T.cruzi de derivados da


25

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar as atividades tripanocida e anti-inflamatória de compostos derivados dos


2.2 Objetivos específicos

In vitro

Avaliar a ação tripanocida das xantenodionas em formas triposmatigotas e

amastigotas;

Verificar a citotoxicidade dos compostos em macrófagos J774A.1 e células Vero;

Determinar o índice de seletividade;

Selecionar, dentre os 12 compostos avaliados, o mais promissor para prosseguir na

etapa in vivo.

In vivo

Padronizar a dose a ser administrada capaz de reduzir a parasitemia sem gerar a

mortalidade dos animais;

Avaliar a capacidade do composto em atuar na parasitemia em camundongos Swiss

infectados pela cepa Y e CL do T. cruzi;

Avaliar a influência do tratamento com o composto mencionado nos parâmetros

biológicos dos animais;

Quantificar a resposta inflamatória no tecido muscular cardíaco, renal e hepático dos

camundongos infectados pelo T. cruzi, após o tratamento com o composto.

Avaliar a produção de marcadores regulatórios e inflamatórios no miocárdio dos

animais;

Verificar a toxicidade hepática e renal nos animais tratados com a xantenodiona

selecionada .

26

3. MATERIAL E MÉTODOS

a. Representação esquemática do delineamento experimental

Figura 3 – Representação esquemática dos métodos realizados para estudo da atividade das

xanthenodionas. (A) Experimentos in vitro. (B) Ensaios in vivo de padronização da dose e via

de tratamento(n=5). (C) Avaliação do tratamento com a MI80 na redução da parasitemia e do

potencial anti-inflamatório (n=10). CC50, concentração citotóxica de 50%; IC50, concentração

inibitória de 50%, DPI, dias após a infecção.

3.1 Compostos

Os compostos utilizados neste trabalho foram cedidos pelo pesquisador Prof. Dr. Róbson

Ricardo Teixeira, do departamento de Química da Universidade Federal de Viçosa. A

estratégia geral de síntese para construção dessa biblioteca foi a derivação química das

xantonas, composto natural supracitados, utilizando-se o núcleo1,2,3-triazólico como

espaçador entre a molécula base e um grupamento aromático substituído, da qual deriva a

27

diversidade química da biblioteca de compostos da UFV. A estrutura do núcleo da

xantenodiona utilizado como grupo substituinte é mostrado na figura 4. A estrutura dos

compostos avaliadas neste estudo, está representada na tabela 2. Cada composto recebeu um

código aleatório, sendo eles: MI17, MI18, MI24, MI25, MI39, MI45, MI68, MI73, MI78,

MI79, MI80 e MI81.

Figura 4 - Formula estrutural do núcleo xantenodiona. Esqueleto utilizado para construção das

respectivas séries químicas

28

Tabela 2 - Estrutura molecular representativa das xantenodionas. Fórmula estrutural evidenciando

radicais e suas posições no núcleo das xantenodionas avaliadas neste estudo.

3.2 Parasito

Duas cepas do T. cruzi com perfis variáveis de susceptibilidade ao Bz foram

utilizadas neste estudo. A cepa Y classificada como Discrete Typing Units II (DTU II) sendo

parcialmente resistente ao fármaco e a cepa CL, DTU VI, susceptível ao Bz em modelo

murino (Zingales et al., 2009). A cepa CL foi escolhida nos experimento in vitro por permitir

a inserção de plasmídeos fluorescentes em seu material genético e ser descrita como

prioritária no protocolo de screnning de novos fármacos para a Doença de Chagas in vivo

29

(Xu et al., 2009; Canavaci et al., 2010; Chatelain e Konar, 2015). Já cepa Y foi selecionada

por apresentar características biológicas como a indução de alta parasitemia e 100% de

mortalidade na infecção murina, facilitando, neste caso, a avaliação da atividade tripanocida

com diferentes doses do composto (Filardi e Brener, 1987).

3.3 Culturas Celulares

Os macrófagos J774 foram cultivados em meio DMEM 1640 (GIBCO®)

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SBF), L-glutamina 2mM,

Penicilina/Streptomicina 100U, 1mM de Piruvato de sódio (Sigma), aminoácidos não

essenciais, pH7.2 e mantidos em estufa 5% CO2, a 37 °C. Os repiques foram realizados a

cada 72h, quando a cultura apresentava 80% de confluência. As células foram ressuspensas

por raspagem suave utilizando “cell scraper”. Em seguida, as células foram coletadas,

quantificadas e utilizadas para novos repiques e ensaios biológicos.

As células da linhagem Vero foram cultivadas em meio RPMI suplementado com

5% de SFB, 2mM de L-glutamina, 100U de Penicilina/Streptomicina, pH 7.2 e mantidas em

estufa 5% CO2 a 37ºC. Os repiques foram realizados a cada 72h, quando a cultura

apresentava 80% de confluência. As células foram ressuspensas por tripsinização e, em

seguida, coletadas, quantificadas e utilizadas para novos repiques e ensaios biológicos.

3.4 Obtenção das formas tripomastigotas de cultura celular

As formas tripomastigotas da cepa Y utilizadas para infectar células foram obtidas a

partir do sobrenadante de cultura de células infectadas. Para isso, células Vero foram

cultivadas em meio RPMI suplementado com 5% de SFB. Ao atingir cerca de 70% de

confluência, a cultura foi infectada, na proporção de 10 parasitos por célula, com

tripomastigotas sanguíneos oriundos do sangue de camundongos infectados pela cepa Y no

pico de parasitemia, que corresponde ao 8o dia de infecção. Após 24 horas de incubação a

37º C e 5% CO2, o meio de cultura foi removido e os parasitos não internalizados, bem como

detritos celulares, foram retirados através de sucessivas lavagens com meio. Às células, foi

adicionando meio RPMI suplementado com 1% de SFB e, novamente, incubadas a 37º C

por sete dias, quando o sobrenadante foi coletado e centrifugado, a 1100rpm, 24º C, por 10

minutos para remoção dos debris celulares. Posteriormente, o sobrenadante rico em parasitos

foi centrifugado a 3000 rpm a 4º C por10 minutos e o sedimento ressuspendido em meio de

cultura para posterior utilização nos experimentos. Apenas parasitos recém liberados das

30

células foram utilizados nos experimentos, uma vez que o sobrenadante era periodicamente

coletado e um novo meio de cultura adicionado.

3.5 Modelo animal

Os animais foram fornecidos e mantidos pelo Centro de Controle Animal (CCA) da

Universidade Federal de Ouro Preto. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso

em Experimentação Animal com o número 2016-34. Foram utilizados camundongos Swiss,

fêmeas, com idade variando entre 30 a 35 dias, pesando entre 25 e 30 g.

3.6 Experimentos In vitro

3.6.1 Verificação da atividade tripanocida - Ensaio de citotoxidade

em formas tripomastigotas derivadas de cultura celular

Para avaliar a citotoxidade dos compostos em formas tripomastigotas de cultura

celular do T. cruzi (cepa Y) foi adicionado uma suspensão 1x106 parasitos a cada poço (placa

de 96 poços) e incubados em oito concentrações diferentes (5, 10, 20, 50, 80, 100, 200 e 300

μM/mL) dos compostos MI17, MI24, MI25, MI79, MI80 e MI81 por 24 horas. Após este

período, foram adicionados aos poços 20 μL (2mg/mL) de MTT 3-(4,5-di-metilazol-2-il) -

2,5-difeniltetrazolium brometo tetrazol (Sigma-Aldrich) por 2 horas nas mesmas condições

de cultivo conforme descrito por Mosmann (1983). Após a reação, os parasitos foram

centrifugados a 1000 g, por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado sendo o sedimento

resuspenso em DMSO (Sigma-Aldrich) para completa dissolução dos cristais. Em seguida,

a absorbância foi determinada em 530 nm em leitor de placas VICTOR™ X3 (Perkin Elmer).

O percentual de parasitos viáveis foi calculado por meio da seguinte fórmula:

% Viabilidade = (Absorbância do tratado/Absorbância do controle) x 100

Os valores obtidos com esses cálculos foram plotados no programa GraphPadPrism

versão 6.0 para a determinação da IC50.

31

3.6.2 Avaliação do efeito tripanocida em formas amastigotas

3.6.2.1 Geração de parasitos modificados – T. cruzi fluorescentes

(tdTomato)

Os experimentos para geração de parasitos modificados, bem como os ensaios de

citotoxidade em células Vero foram realizados Na Universidade da Geórgia(EUA) sob

orientação do Dr.Rick L Tarleton durante o período de doutorado sanduiche. Para gerar

parasitas expressando em tandem uma proteína dimérica tomate vermelho fluorescente foi

construído um plasmídeo usando o vetor de expressão pTrex como suporte. O gene

tdTomato (1464 pb) foi gerado por amplificação via PCR usando o conjunto de primers 5’-

AGAATTCATGGCGCCTAGGGTGAGC-3’ (senso) e 5’-

TACGTCGACTTAGAGCTCGATATCGACG -3’ (anti-senso), e o vetor pCTR2t como

modelo. O primer senso possui um sitio EcoRI e o primer anti-senso um sitio SalI. O

fragmento de PCR foi digerido e clonado a jusante do promotor do gene rRNA e da fração

HX1 dentro dos locais de multi-clonagem do plasmídeo pTREX, gerando o plasmídeo

pTREX-tdTomato (Fig.5). Os parasitos transgênicos foram gerados por knockout como

descrito previamente por Xu et al. (2009) e Canavaci et al. (2010). Culturas de epimastigotas

da cepa CL na fase log de crescimento foram centrifugadas a 1,620 g por 15 min e suspensos

em 100 µl de solução de Nucleofector TM Solution de células T humanas (Lonza, Alemanha)

à temperatura ambiente. Os parasitos foram ressuspensos e, então, misturados com 10 µg de

DNA oriundos do produto da pcr descrita acima, em volume total de 10 µl e eletroporados

usando o programa "U33" no dispositivo Nucleofector AMAXA (Lonza, Alemanha). Os

parasitos eletroporados foram então cultivados em garrafas de cultura de 25 cm2 (Corning

Incorporated, Lowell, MA) com 10 ml de meio LDNT (Triptose neutralizada e digerida de

fígado) e adicionou-se 300 mg / ml de antibiótico G418 24 h após a transfecção. As culturas

de parasitos foram monitoradas por citometria de fluxo frequentemente para verificar a

intensidade de fluorescência. Quando necessário, as culturas eram “sorteadas” para remover

contaminantes não fluorescentes usando o citómetro MoFlo (DakoCytomation, Carpinteria,

CA) com um laser Enterprise 631 488 nm para excitação e um filtro de emissão com uma

banda de passagem 570/40 nm (Fig.6) Este protocolo garantiu a geração da cepa CL

tdTomato utilizada nos experimentos de “drug screnning”.

32

Figura 5 - Plasmídeo utilizados na geração de T. cruzi fluorescente. Representação

esquemática do plasmídeo pTrex-Neo-tdTomato.

Figura 6 - Avaliação da fluorescência do T. cruzi (cepa CL) tdtomato. (A) Imagem microscópica

dos parasitas expressando tdTomato em todas as fases evolutivas. (B) Intensidade de fluorescência

em epimastigotas em citômetro de fluxo CyAn (DakoCytomation) e analisada com o software

FlowJo (Tree Star). A fluorescência de fundo dos parasitas selvagens (verde) também pode ser

observada. Fonte: Canavaci et al, 2010

33

3.6.2.2 Avaliação do potencial tripanocida em amastigotas

Os parasitos fluorescentes descritos no item 3.6.2.1 foram utilizados neste

experimento para avaliar a capacidade das xantenodionas (MI17, MI18, MI24, MI25, MI39,

MI45, MI68, MI73, MI78, MI79, MI80 e MI81) em eliminar o T. cruzi. As células Vero

foram expostas a 2000 rad de radiação gama durante dez minutos (Yan e Moreno, 1998) e

2,5x104 células foram adicionadas em placas de 96 poços Black Greiner (Bio-One). Após a

confirmação da aderência e formação da monocamada, formas tripomastigotas da cepa

CLtdTomato do T. cruzi foram adicionas durante aproximadamente 5 h na proporção de 10

parasitos para 1 célula. Após a infecção, as culturas celulares foram lavadas para remover

parasitas não internalizados e meios frescos contendo os compostos ou Bz (como o fármaco

tripanocida de referência) em concentrações decrescentes (50 a 0,25µM/mL) foram

adicionados. A mudança na intensidade de fluorescência foi determinada como uma medida

de crescimento ao longo de 3 dias de cultura. Os valores de concentração inibitória de 50%

(IC50) foram determinados por análise de regressão linear no dia 3. Esse percentual de

inibição foi utilizado para a construção de curvas de dose-efeito e cálculo da IC50 com

auxílio dos software GraphPadPrism6. Todos os experimentos realizados com as formas

amastigotas foram feitos em duplicatas, em no mínimo 3 repetições,

3.6.3 Ensaios de citotoxidade em culturas de células – determinação

da CC50

Os compostos foram diluídos em dimetilsulfoxido (DMSO-Sigma-Aldrich) a 0,01%

e posteriormente preparada uma solução estoque a 1000µM/mL que, em seguida, foi

sonicada em Cuba Ultrassônica CD-4820 (Kondentech) por dois minutos. Logo após, a

solução foi adicionada ao meio de cultura utilizado para os experimentos in vitro.

Duas linhagens celulares foram testadas nesta etapa, os macrófagos J774A.1 e as

células Vero. Também foram testadas duas metodologias para verificação da viabilidade

celular, a do MTT® e a do AlamarBue®.

34

3.6.3.1 Macrófagos murinos-MTT®

O ensaio de MTT® foi utilizado nos experimentos com macrófagos J774A.1. As

células foram cultivadas em meio DMEM completo suplementado e ajustadas para um

volume de 1x105 células por poço em um volume final de 150µL. As placas foram incubadas

24h em estufa a 37°C e atmosfera de 5% de CO2. Após o período de incubação as células

foram observadas em microscópio invertido para verificação do aspecto e aderência celular.

Os poços foram lavados com meio para retiradas de células mortas e, posteriormente, os

compostos adicionados em oito concentrações 5, 10, 20, 50, 80, 100, 200 e 300 µM/mL. As

culturas permaneceram expostas aos compostos durante 48h horas, incubadas a 37ºC com

atmosfera de 5% de CO2.

Após os períodos de incubação, foram adicionados aos poços 20μL da solução MTT

a 20mg/mL (50μL/poço). As placas foram novamente incubadas por 2 horas a 37º C com

atmosfera de 5% de CO2. Após incubação, o sobrenadante foi removido e adicionou-se

150μL de DMSO para solubilizar os cristais de formazan formados. Posteriormente, as

placas foram submetidas à leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 490nm

em leitor de placas VICTOR™ X3 (Perkin Elmer). O valor final da densidade ótica de cada

poço foi subtraído do valor da densidade ótica de uma triplicata de poços contendo apenas

DMSO. Os resultados foram expressos em gráficos de porcentagem, sendo os valores do

eixo y relativos ao controle, considerado como apresentando 100% de viabilidade. A

viabilidade das linhagens celulares com diferentes concentrações dos compostos foi

conduzida de acordo com Mosmann (1983).

Com os resultados obtidos calculou-se a percentagem de inibição através da fórmula

citada no item 3.6.2 e os valores plotados no programa GraphPadPrism versão 6.0 para a

determinação da CC50 e posterior cálculo do índice de seletividade.

3.6.3.2 Células Vero- AlamarBlue®

Para excluir os efeitos tóxicos das xantenodionas sobre as células hospedeiras,

células Vero não infectadas por T. cruzi, foram tratadas com oito concentrações decrescentes

(100-0.39μM/μL) dos compostos. O experimento foi realizado utilizando o corante Alamar

Blue® (Bio-Rad), um indicador colorimétrico de proliferação celular. Esse método se baseia

35

na redução química do reagente devido à atividade metabólica celular. Através de reações

de oxirredução, o corante passa da cor azul (forma oxidada e não fluorescente) para rosa

(forma reduzida, fluorescente) e esta mudança de cor pode ser medida pela leitura

colorimétrica ou fluorimétrica (Rampersad, 2012)

As células Vero foram expostas a 2000 rad de radiação gama durante dez minutos

(Yan e Moreno, 1998) e posteriormente, cem microlitros destas células, na concentração de

2.5x104/poço, foram adicionadas às placas Black Greiner (Bio-One) e mantidas em estufa

CO2 a 37° C por pelo menos uma hora para completa adesão. Os compostos foram diluídos

em DMSO, a partir de uma solução estoque de 5mM/μL, em concentrações crescentes (8

diluições 1:2 iniciando em 100μM/μL). Ressalta-se que a concentração final de DMSO no

poço foi inferior a 0.01%. Após a adesão das células e formação da monocamada 100μL de

cada concentração foi adicionada aos poços em triplicata e a placa novamente incubada em

estufa CO2 a 37°C por 72h. Como controle de morte foi utilizado o fármaco

ANACOR14353® nas mesmas concentrações testadas para os compostos, sabidamente

tóxico para esta linhagem celular (dados não publicados). Cada placa continha controles

negativos (meio) e controles positivos (meio+célula). Após 72h de incubação, 50 μL do meio

de cultura foi removido para que 50 μL de Alamar Blue® 10% fosse adicionado. As placas

foram cobertas com papel alumínio e novamente incubadas em estufa CO2 a 37°C por 4h.

Após este período a fluorescência foi mensurada no leitor de placas SynergyH4 (BioTek) em

comprimento de 560nm e 590nm. A porcentagem de redução do corante induzida pelos

compostos foi calculada considerando o percentual de redução das células incubadas na

ausência de drogas, utilizando-se a fórmula abaixo:

% redução = [A560-(A590xR0) Tratado / A560-(A590xR0) Controle+]

Nessa fórmula, A560= fluorescência a 560nm, A590= fluorescência a 590nm.

Controle + é o poço contendo células, meio e Alamar Blue® na ausência do composto. R0

é o fator de correção, calculado a partir dos valores de emissão de fluorescência do controle

negativo (C-), ou seja, apenas meio de cultura e Alamar Blue® na ausência de células [Ro =

(A560 /A590)C-].

O composto mais eficiente (<toxicidade >atividade tripanocida) na fase in vitro foi

selecionado para os ensaios em modelo animal, conforme descritos nos itens metodológicos

a seguir.

36

3.7 Experimentos In vivo

3.7.1 Padronização – Experimento de dose-resposta

Para avaliar a via de tratamento e dosagem máxima do composto (mais eficiente nos

experimentos in vitro) e capaz de ser tolerado pelos animais e potencialmente reduzir ou

suprimir a parasitemia, foi realizado um experimento de dose-resposta. Os animais foram

inoculados intraperitonealmente com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y T.

cruzi e divididos em grupos de 5 animais (n=5).

Cada grupo recebeu o composto MI80, escolhido na triagem in vitro, em suspensão

numa solução de carboximetilcelulose (CMC) a 0,5% e Tween80 (0,5%)(Sigma®) . Foram

cinco dosagens testadas (1:2) de 800 a 50mg/kg por via oral (gavagem) e via intraperitoneal.

Os grupos controles utilizados para a comparação de eficácia do tratamento foram: grupo

não tratado (NI) e grupo não infectado e tratado (NIT). O tratamento foi iniciado

imediatamente após a detecção de parasitemia patente (4ºdia após a infecção) e administrado

por 10 dias consecutivos, uma vez ao dia, para os grupos contendo os animais infectados.

3.7.2 Infecção e esquema de tratamento

Realizada a padronização da dose e da via de tratamento foi realizado um

experimento para avaliar a eficácia do composto MI80 na redução da parasitemia e sua

capacidade em alterar parâmetros biológicos, imunológicos e bioquímicos nos animais

tratados. Dessa forma, camundongos Swiss fêmeas foram infectadas, intraperitonealmente,

com cinco mil formas tripomastigotas sanguíneas do T. cruzi. Nesta etapa, foram utilizadas

duas cepas, Y e Cl, sendo uma parcialmente resistente ao Bz e a outra susceptível ao mesmo

fármaco. Os animais foram divididos em grupos de dez animais (n=10) e, após confirmada

a parasitemia, foram tratados por via oral com 50mg/kg da xantenodiona MI80, uma vez ao

dia, por 10 dias. Após 15 dias de infecção para a cepa Y e 18 dias para a cepa Cl os animais

foram eutanasiados. Foram coletados o plasma, coração, fígado e rim para análises

histológicas, imunológicas e bioquímicas.

3.7.3 Exame de sangue a fresco - parasitemia

Para a realização deste procedimento, 5µL de sangue da artéria coccígea ventral foi

coletado de cada animal e depositdos sobre uma lâmina de microscópio coberta com uma

lamínula 22x22mm para determinação do número de parasitos em 50 campos microscópicos.

37

O número encontrado foi multiplicado pelo fator do microscópio, calculado para cada

objetiva, levando em consideração o número de campos microscópios (Brener, 1962).

3.7.4 Mortalidade

A taxa de mortalidade foi calculada pela observação diária dos animais durante o

tratamento até a necropsia. Os resultados foram expressos em porcentagens.

3.7.5 Histopatologia do coração

Após o término do tratamento, os animais foram eutanasiados e, por meio de incisão

torácica, o coraçãofoi removido, lavado em PBS, pesado e seccionados longitudinalmente

para análise histopatológica. Os tecidos foram imersos em formalina tamponada a 10% por

no mínimo 48 horas. As etapas seguites foram realizadas em colaboração com o professor

Rômulo Novaes da Universidade Federal de Lavras. As amostras foram embebidas em resina

histológica de metacrilato de glicol e cortadas em micrótomo rotativo em seções de 3-mm

de espessura utilizando lâminas de vidro (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha). Cinco

cortes histológicos foram coletados em semi-séries, utilizando uma de cada 50 seções, as

quais foram coradas com hematoxilina e eosina. A análise histopatológica foi realizada

avaliando-se a distribuição e organização do parênquima e do estroma conjuntivo, necrose

tecidual e infiltrado inflamatório, morfologia e distribuição de miócitos, vasos sanguíneos e

células intersticiais e presença de ninhos de amastigotas de T. cruzi (Novaes et al., 2016)

A intensidade da celularidade ou inflamação do coração foi avaliada comparando-se

a distribuição de células intersticiais no miocárdio de todos os grupos (Novaes et al., 2013).

Para isso, a celularidade tecidual, por área histológica, foi determinada como o número de

núcleos de células intersticiais em uma área de teste padronizada (At = 25×103μm2). Foram

avaliados a partir de 20 campos histológicos amostrados aleatoriamente de secções cardíacas

de cada animal usando um microscópio de campo claro com uma lente objetiva × 40

(ampliação de 400x; Axioscope A1, Carl Zeiss, Alemanha). Uma área total de tecido de

25,0×105 μm2 foi analisada para cada grupo. A celularidade intersticial total foi analisada

pelo software de análise de imagens Image-Pro Plus® (versão 4.5; Media Cybernetics Inc.,

Silver Spring, MA, EUA). Os resultados foram expressos como um diagrama de campo

octogonal organizado em domínios que representam a celularidade tecidual da seguinte

forma: (-) celularidade mínima / (+ -) leve, (+ +) moderada ou (+ + +) intensa/infiltrado

inflamatório (Felizardo et al., 2018).

38

3.7.6 Estereologia do coração

A amplitude da reorganização microestrutural cardíaca foi analisada a partir do método

estereológico (Novaes et al., 2013). A densidade volumétrica (Vv,%) do parênquima

cardíaco (cardiomiócitos [cmy]), estroma (tecido conjuntivo [cnt]) e vasos sanguíneos (bvs)

foi estimada como Vv = ΣPt / P; onde ΣPt é o número de pontos de teste que ativam a

estrutura de interesse e P é o número total de pontos no sistema de teste. Usamos um sistema

de teste com 72 pontos em uma área de teste padrão de (At = 25 × 103 μm2) ao nível do

tecido. A relação entre vasos sanguíneos e cardiomiócitos (Vv [bvs] / Vv [cmy]) foi utilizada

como índice morfológico de vascularização do miocárdio. A relação entre compartimentos

estruturais e funcionais do coração foi estimada como Vv [cnt] / Vv [cmy] (Novaes et al.,

2013). A densidade do volume foi estimada a partir de 20 campos histológicos amostrados

aleatoriamente de secções cardíacas de cada animal usando uma objetiva 40 × (ampliação

de 400x; Axioscope A1, Carl Zeiss, Alemanha). Uma área total de tecido de 25,0 × 105 μm2

foi analisada para cada grupo.

A densidade numérica de células intersticiais mononucleares (MN) e

polimorfonucleares (PMN) por área histológica foi estimada como QA = ΣQ / At; onde ΣQ

é o número de MN ou PMN no plano focal microscópico e At é a dimensão do teste (At =

8,56 × 103 μm2). A densidade do volume foi estimada a partir de 20 campos histológicos

amostrados aleatoriamente de secções cardíacas de cada animal usando uma objetiva × 100

(aumento de 1000x; Axioscope A1, Carl Zeiss, Alemanha) (Novaes et al., 2013). Uma área

total de tecido de 85,6 × 104 μm2 foi analisada para cada grupo. Todas as contagens foram

realizadas usando o software de análise de imagem AxionVision (Carl Zeiss, Alemanha).

3.7.7 Produção de citocinas

As citocinas IFN-γ, CCL2, IL-10 e RankL foram quantificadas no sobrenadante do

macerado do tecido cardíaco dos animais por meio de do teste imunoenzimatico ELISA

sanduíche (PeproTech, NJ, EUA) seguindo recomendaçoes do fabricante. Microplacas de

96 poços foram adsorvidas com anticorpo de captura monoclonal anti IFN-γ,CCL2, IL-10

ou RANKL na concentração adequada para cada citocina, em salina tamponadade fosfatos

(PBS), pH7,4 (100 µL/poço). As placas foram incubadas por 12h a temperatura ambiente .

Após a incubação as placas foram lavadas quatro vezes com PBS, contendo 0,05% de Tween-

20 (solução de lavagem) e posteriormente bloqueadas com 300 µL por poço com PBS

39

contendo 1% de SFB (solução de bloqueio) à temperatura ambiente por 1h. Em seguida as

placas foram lavadas quatro vezes com a solução de lavagem. Após lavagem, foram

adicionados a cada poço, 50µL do padrão de citocinas ou do sobrenadante do macerado do

tecido cardíaco. As placas foram incubadas a temperatura ambiente por 2h e lavadas quatro

vezes com a solução de lavagem. Em seguida foi adicionado 100µl por poço do anticorpo

de detecção (anticorpo anti-citocina de camundongo marcado com biotina) diluído na

concentração recomendada pelo fabricante em PBS. As placas foram incubadas à

temperatura ambiente por 12h e lavadas quatro vezes com a solução de lavagem, sendo então

adicionados 100µL/poço do conjugado avidina-HRP na diluição de 1:2000 em PBS

contendo 0.05% de Tween-20 e 0,1% de SFB (solução diluente). As placas foram incubadas

novamente em temperatura ambiente por 30 min. O cromógeno escolhido para revelação foi

o 2,2#-Azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico) (ABTS – Sigma Aldrich,

Missouri, USA) e 100µL/poço deste cromógeno adicionados por vinte minutos de

incubação, em ausência de luz e temperatura ambiente. Interrompida a reação, a leitura da

intensidade de coloração foi realizada em leitor de ELISA utilizando-se o comprimento de

onda de 405nm, com correção de 650nm. A quantificação da quimiocina e citocinas

presentes nas amostras foi determinada baseada na densidade óptica obtida com a curva

padrão de concentração conhecida destes mediadores, analisadas pelo software SOFTmax

PRO 4.0.

3.7.8 Testes bioquímicos

Os testes bioquímicos descritos abaixo foram adquiridos e seguiram as

recomendações do fabricante - Bioclin®

3.7.8.1 Transaminase oxalacética (AST/TGO)

Para a dosagem da enzima transaminase oxalacética (AST/TGO) utilizou-se o

método colorimétrico de Reitman S (1957) que se baseia na reação catalisada pela AST/TGO

do grupamento amino de um alfa-aminoácido para um alfa-cetoácido segundo a reação a

seguir:

L-Aspartato + Alfa-Cetoglutarato L-Glutamato + Oxalacetato

Junto à reação foi adicionado um composto com propriedades corantes

(dinitrofenilhidrazina) que reage com o oxaloacetato fomando hidrazina. A intensidade de

40

cor foi diretamente proporcional à produção de oxaloacetato, que por sua vez, representa a

atividade enzimática. Foram utilizadas três soluções neste protocolo, a primeira contendo

PBS, ácido L-aspártico, ácido alfa cetoglutárico e azida sódica. A segunda solução continha

o reagente corante possuindo dinitrofenilhidrazina e ácido clorídrico e a terceira solução de

hidróxido de sódio. Para inicialização do procedimento, 250µl da primeira solução foi

incubada a 37°C por 3 minutos, em seguida foi adicionado 100µl da amostra de plasma e

novamente incubado por mais 30 minutos a 37°C. Adicionou-se então 250µl da segunda

solução e o sistema foi deixado em repouso por 20 minutos e finalmente adicionado 2,5ml

do hidróxido de sódio. Após 5 minutos a 37°C o conteúdo foi transferido para uma cubeta

de quartzo e lido em espectrofotômetro com comprimento de onda 505nm. O cálculo final

foi conseguido a partir dos valores de diluição de uma curva padrão pré-determinada pelo

kit.

3.7.8.2 Transaminsae pirúvica (ALT/TGP)

O método colorimétrico para a dosagem a enzima transaminase pirúvica (ALT/TGP)

é semelhante ao descrito para a AST/TGO (Reitman S, 1957). Entretanto com a alteração do

L-aspartato pela L-alanina e do oxaloacetado pelo piruvato.

L-Alanina + Alfa-Cetoglutarato L-Glutamato + Piruvato

Junto à reação foi adicionado um composto com propriedades corantes

(dinitrofenilhidrazina) que reage com o piruvato fomando hidrazina. A intensidade de cor

foi diretamente proporcional à produção de piruvato, que por sua vez, representa a atividade

enzimática. Foram utilizadas três soluções neste protocolo, a primeira contendo PBS, ácido

L-alanina, ácido alfa cetoglutárico e azida sódica. A segunda solução continha o reagente

corante possuindo dinitrofenilhidrazina e ácido clorídrico e a terceira solução de hidróxido

de sódio. Para inicialização do procedimento, 250µl da primeira solução foi incubada a 37°C

por 3 minutos, em seguida foi adicionado 100µl da amostra de plasma e novamente incubado

por mais 30 minutos a 37°C. Adicionou-se então 250µl da segunda solução e o sistema foi

deixado em repouso por 20 minutos e finalmente adicionado 2,5ml do hidróxido de sódio.

Após 5 minutos a 37°C o conteúdo foi transferido para uma cubeta de quartzo e lido em

espectrofotômetro com comprimento de onda 505nm. O cálculo final foi conseguido a partir

dos valores de diluição de uma curva padrão pré-determinada pelo kit.

41

3.7.8.3 Creatinina

Para a detecção da creatinina em plasma dos animais foi utilizado o método de Jaffe

(1986) que consiste em um método colorimétrico onde a creatinina reage com o ácido pícrico

formando uma solução com coloração amarelada. Com a adição de um reagente ácido,

ocorre uma redução do pH e consequentemente da intensidade de cor devido a reversão da

reação que formou creatinina-picrato. Pela diferença das leituras obtidas, alcança-se o valor

da creatinina. Para realização do método, utilizou-se um reagente alcalino contendo

hidróxido de sódio, carbonato de sódio e surfactante, uma solução é de ácido pícrico e um

reagente ácido contendo ácido acético. Em um tubo foi adicionado 2,0mL do reagente

alcalino com 250µL da amostra de plasma e 500µL da solução de ácido pícrico. Após 10

minutos em banho-maria a 37°C, as absorbâncias foram lidas utilizando-se uma cubeta de

quartzo e espectrofotômetro em comprimento de onda de 510nm. Em seguida foi adicionado

100µl do reagente ácido e aguardou-se 5 minutos à temperatura ambiente para realização da

nova leitura em comprimento de onda de 510nm. Para se chegar ao valor final de creatinina

foi utilizado o seguinte cálculo:

Creatinina (mg/dL ) = Leitura 1- Leitura 2 x 3/absorbância do padrão

3.7.8.4 Ureia enzimática

Para determinação dos níveis de uréia no plasma dos animais foi utilizado um teste

enzimático colorimétrico onde a uréia foi hidrolisada a iôns amônio e CO2 baseando-se na

seguinte reação:

Uréia + 3 H2O 2NH4+ + CO2 + OH-

A reação continha uma solução enzimática contendo urease, PBS, nitroprussiato de

sódio, salicilato de sódio, estabilizantes, conservantes, além de hidróxido de sódio e

hipoclorito de sódio. Então 1mL da solução enzimática foi acrescentado a 10µl da amostra

e levado ao banho-maria a 37°C por 5 minutos. Em seguida foi adicionado 1ml da solução

oxidante e novamente incubado por 5 minutos a 37°C em banho-maria. A leitura então foi

aferida utilizando cubeta de quartzo e espectrofotômetro com o comprimento de onda de

600nm. Para se chegar ao valor final de uréia foi utilizado o seguinte cálculo:

urease

42

Uréia (mg/dL) =Absorbância da amostra / absorbância do padrão

3.8 Análise estatística

Todos os dados foram submetidos ao teste de normalidade Kolmogorov–Smirnov.

Parâmetros com distribuição normal foram analisados pelo teste de análise de variância

univariada (ANOVA-one way) e o teste de Bonferroni utilizado posteriormente para

determinar as diferenças entre os grupos. Para as variáveis que não apresentaram distribuição

normal, realizou-se o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn’s para

determinação das diferenças entre grupos. Os dados foram expressos como média ± erro

padrão e as diferenças consideradas significantes para p<0,05. Todas as análises foram

realizadas utilizando o software GraphPadPrism versão 6.0 para Windows (San Diego,

California, USA).

43

4. RESULTADOS

4.1 - Resultados in vitro

4.1.1 Avaliação da toxicidade em formas tripomastigotas do T.cruzi

e determinação do IC50

Com o objetivo de avaliar a toxicidade dos derivados de xantenodionas sob formas

tripomastigotas do T. cruzi, foi realizado um ensaio de MTT e o cálculo da curva de

concentração-resposta para determinação da IC50.

Todas as seis xantenodionas testadas em tripomastigotas apresentaram, em diferentes

níveis, atividade tripanocida de maneira dose-dependente. A viabilidade dos parasitos foi

reduzida significativamente (p<0,05) em relação ao controle não tratado, nas concentrações

maiores que 100µM/mL para os compostos MI80 e MI81. Para o composto MI17 essa

redução foi notada nas concentrações maiores que 50µM/mL enquanto para os compostos

MI79, MI24 e MI25 este padrão foi observado nas concentrações acima de 10µM/mL

(Fig.7). Os controles do ensaio consistiram em poços contendo parasitas não tratados com

as xantenodionas e poços contendo DMSO 0,01% (v/v) evidenciando a não toxicidade deste

diluente, além de poços contendo o Bz como controle de alta atividade tripanocida

Na determinação da IC50, destacaram-se os compostos MI17, MI80 e MI81 com

valores de IC50 de 69,21µM, 87,76µM e 137,8µM, respectivamente. Outros três derivados

de xantenodionas testados, MI24, MI25 e MI79 apresentaram concentração inibitória

parasitária, porém menos significativa que os compostos citados inicialmente (Tabela 3).

44

Figura 7 – Análise do efeito citotóxico em formas tripomastigotas T. cruzi (cepaY), pelo

método do MTT. 1x106 foram adicionados por poço, em placa de 96 poços e os compostos

MI17, MI24, MI25, MI79, MI80 ou MI81 foram nas concentrações de 5 a 300µM/mL e

incubados por 24h. Os resultados foram expressos como valores em porcentagem do número de

parasitos viáveis após 24 horas de incubação com os derivados de xantenodionas. Análise de

variância (ANOVA) e pos-teste de Tukey foram aplicadas para determinar a diferença estatística

entre os tratamentos em relação ao controle DMSO. (*) representa diferença estatística

determinada por p<0,05.

45

4.1.2 Efeito dos compostos na viabilidade celular demacrófagos

murinos J774A.1)avaliados por ensaios colorimétricos

Para avaliar a viabilidade celular em presença das seis xantenodionas (MI17, MI24,

MI25, MI79, MI80 e MI8), testamos sua toxicidade em macrófagos murinos. Após 48h de

exposição aos compostos, a molécula MI81 mesmo na concentração de 300µM/mL,

apresentou toxicidade negligenciável nesta linhagem celular, com 85,22% de células viáveis.

Estes resultados foram comparáveis ao composto MI17 que também manteve um padrão de

células viáveis superior a 70% na maior concentração. Entretanto seus análogos, MI79 e

MI80, na dosagem superior a 200µM/mL, reduziram a viabilidade celular em 30%. Também

os compostos MI24 e MI25 foram citotóxicos nas concentrações de 100µM/mL e 50µM/mL,

respectivamente. A viabilidade também foi avaliada na presença de DMSO 0,01% (v/v)

mostrando que o diluente, nesta concentração, não foi citotóxico às células (Fig.8). Os

valores de 50% da concentração citotóxica (CC50) estão expressos na tabela 3 e foram

utilizados para o cálculo do índice de seletividade.

46

Observou-se que o composto MI81 obteve o melhor índice de seletividade

Figura 8 – Análise de viabilidade celular de culturas de macrófagos murinos J774A.1

avaliadas pelo método do MTT frente aos derivados de xantenodionas. 1x105 celulas foram

adicionada aos poços em placa de 96 poços.Após a formação da monocamada os compostos

MI17, MI24, MI25, MI79, MI80 ou MI81 foram adicionados em concentrações decrescentes de

5 a 300µM/mL e as placas incubadas por 48h em estufa 37ºC 5% CO2.Após 48h foi realizado o

ensaio de MTT e os resultados foram expressos em porcentagem do número de células viáveis

após 48 horas de incubação com os derivados de xantenodionas .

47

(67,12µM), seguido pelo MI80 (5,37µM) e pelo MI17 (4,3µM). Apesar dos demais

compostos apresentarem ação tripanocida contra formas tripomastigotas, os índices de

seletividade, os quais expressam quantas vezes o composto é mais tóxico para o parasito em

relação as células de mamíferos, foram baixos, conforme evidenciados na Tabela 3.

Tabela 3 – Citotoxidade em macrófagos murinos J774, atividade tripanocida em formas

tripomastigotas do T.cruzi e índice de seletividade de compostos derivados de xantenodionas

Composto

Células J774A.1

CC50(µM)

Tripomastigotas(Y)

IC50(µM)

IS

MI17 303 69.25 4.3

MI24 79,82 199,6 ND

MI25 232.9 209,7 1.1

MI79 >300 >300 1

MI80 >300 87.70 5.37

MI81 >300 136.4 67.12

*Bz >300 22.69 15.51

CC50 = concentração citotóxica de 50% / IC50-concentração inibitória de 50% / IS- índice

de seletividade, razão entre CC50 e IC50 / Bz -Benznidazol (*Usado como fármaco controle)

4.1.3 Atividade tripanocida em formas amastigotas do T.cruzi (cepa

CLtdTomato)

Nesta etapa, utilizou-se um controle de células infectadas com o T. cruzi e não

tratadas e um controle de células infectadas e tratadas com Bz para comparação dos

resultados. Dos doze compostos testados, apenas três apresentaram ação sob as formas

amastigotas da cepa CLtdtomato do T. cruzi (Fig.9 e Fig.10), sendo eles o MI25 com IC50

de 14.11µM, seguido do MI24 (IC50=26.43) e do MI80 (IC50=30,65) (Tabela 4). Foi

calculado, mais uma vez, o IS dos compostos empregando o valor do CC50 das células vero

48

e o IC50 sob as formas amastigotas. O composto MI80, apesar de não ter o menor IC50

dentre as xantenodionas testadas, obteve o melhor IS, principalmente devido a sua

baixíssima ação sob a viabilidade celular (Fig.10). Por esta razão, o composto MI80 foi

selecionado para os ensaios in vivo que avaliarão sua potencial ação tripanocida em animais

infectados por cepas sensíveis e parcialmente resistentes ao Bz, além de sua ação anti-

inflamatória.

M I2 4

L o g C o n c .(M )

% o

f M

ax

ima

l G

row

th

1 0 0 .0 1 0 0 .5 1 0 1 .0 1 0 1 .5 1 0 2 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

M I2 5

L o g C o n c .(M )

% o

f M

ax

ima

l G

row

th

1 0 0 .0 1 0 0 .5 1 0 1 .0 1 0 1 .5 1 0 2 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

M I8 0

L o g C o n c .(M )

% o

f M

ax

ima

l G

row

th

1 0 0 .0 1 0 0 .5 1 0 1 .0 1 0 1 .5 1 0 2 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Figura 9 - Atividade das xantenodionas MI24, MI25 e MI80 sobre a infecção de células Vero

pela cepaCLtdtomato do T. cruzi. 2,5x104 células foram infectadas pela cepa CLtdtomato e,

posteriormente, incubadas na presença ou ausência de concentrações decrescentes de xantenodionas

MI24, MI25 e MI80, por 72 horas. Cada ponto das curvas de dose-resposta corresponde à média de

2 experimentos independentes, em triplicata. O cálculo de IC50 foi realizado utilizando-se o software

GraphPadPrism6.

49

Figura 10 - Fotomicrografias representativas dos efeitos anti-T.cruzi dos compostos MI24,

MI25 e MI80. Estão representadas fotomicrografias de células Vero infectadas com cepa

CLtdTomato sem tratamento e tratadas com as xantenodiona MI24, MI25 e MI80 ou com o

fármaco benznidazol (Bz) ao terceiro dia após a infecção in vitro.

Campo Claro Proteína Fluorescente

Vermelha Sobreposição

MI24

Bz

MI25

MI80

Não tratado

50

4.1.4 Efeito sobre a viabilidade celular em células Vero por ensaios

fluorimétricos e seu respectivo índice de seletividade

Foram avaliadas a toxicidade dos 12 compostos derivados de xantenodionas, onde

seis foram testados no experimento anterior (MI17, MI24, MI25, MI79, MI80 e MI81) e sete

ainda não haviam sido testados (MI18, MI39, MI45, MI49, MI68, MI73 e MI78). Realizou-

se o ensaio fluorimétrico AlamarBlue® e, as células Vero plaqueadas e incubadas com os

12 compostos, por 72h, em concentrações seriadas de 100 a 0,39µM/mL.

Dos doze compostos testados, cinco não foram tóxicos em nenhuma concentração,

sendo eles os análogos MI79, MI80 e MI81, além dos MI73 e MI39 (Fig.11). Já para os

compostos MI17, MI24, MI25, MI49 e MI45 a viabilidade celular foi reduzida em 30% ou

mais nas concentrações maiores que 50µM/mL, sendo considerados citotóxicos (Fig.12). Os

demais derivados de xantenodionas MI18, MI68 e MI78 foram tóxicos mesmo em baixas

concentrações, o que inviabilizou a utilização dessas moléculas nestes

experimentos(Fig.13).

51

Figura 11 – Análise da viabilidade celular em culturas de células Vero pelo método do

AlamarBlue. 2,5x104 foram plaqueadas e incubadas em estufa 37ºC, 5%CO2 por 72h com os

derivados de xantenodionas MI79, MI80, MI81, MI73 e MI39 em concentrações decrescentes de 100

a 0,39µM/mL. As barras representam os valores em porcentagem do número de células viáveis de

três experimentos independentes em triplicata e erro padrão (SE).

52


determinado após 72 horas de incubação com os derivados de xantenodionas MI17, MI24, MI25,

MI45 e MI49 em diferentes concentrações. As barras representam os valores em porcentagem do

número de células viáveis de três experimentos independentes em triplicata e erro padrão (SE).

53

M I1 8

C o n c e n t r a ç ã o (M )

% d

e c

élu

las

Ve

ro v

iáv

eis

Dm

so

0,3

9

0,7

8

1,5

6

3,1

2

6,2

5

12,5

025

50

100

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

M I6 8


% d

e c

élu

las

Ve

ro v

iáv

eis

Dm

so

0,3

9

0,7

8

1,5

6

3,1

2

6,2

5

12,5

025

50

100

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

M I7 8


% d

e c

élu

las

Ve

ro v

iáv

eis

Dm

so

0,3

9

0,7

8

1,5

6

3,1

2

6,2

5

12,5

025

50

100

0

5

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0


determinado após 72 horas de incubação com os derivados de xantenodionas MI18, MI68 e MI78

em diferentes concentrações. As barras representam os valores em porcentagem do número de células

viáveis de três experimentos independentes em triplicata e erro padrão (SE).

O composto MI80, apesar de não ter o menor IC50 dentre as xantenodionas testadas,

obteve o melhor IS, principalmente devido a sua baixa ação sob a viabilidade celular

(Fig.10). Por esta razão, o composto MI80 foi selecionado para os ensaios in vivo que

avaliaram sua potencial ação tripanocida em animais infectados por cepas sensíveis e

parcialmente resistentes ao Bz, além de sua potencial ação anti-inflamatória.

54

Tabela 4 - Citotoxidade em células Vero, atividade tripanocida em formas amastigotas do T.

cruzi (cepa CL) e o índice de seletividade de compostos derivados de xantenodionas

Composto

Células Vero

CC50(µM)

Amastigotas-CL

IC50(µM)

SI

MI17 >100 Inativo ND

MI18 27,8 Inativo ND

MI24 81,47 26,43 3,08

MI25 >100 14,11 7.29








MI80 >100 30,65 170


*Bz >100 3.4 103

CC50-concentração citotóxica de 50%. IC50-concentração inibitória de 50%. IS - índice de

seletividade, razão entre CC50 e IC50. Bz-Benznidazol (*Usado como fármaco controle)

55

4.2 Resultados In vivo

4.2.1 Padronização da dose e via de tratamento

Para dar início aos experimentos em modelo animal, foi realizado um experimento

de padronização das doses do composto MI80 e da respectiva via para sua administração..

O composto MI80, administrado a partir do quarto dia de infecção, mostrou efeito

tripanocida em todas as doses (800 a 50mg/kg) e rotas testadas (oral e intraperitoneal),

quando comparada ao controle infectado e ao não tratado (Fig.14). Por via oral observou-se

redução na parasitemia (p<0,05) para os grupos tratados com 400mg/kg e 800mg/kg em

relação ao grupo infectado e não tratado. Enquanto para a rota intraperitoneal, houve

diminuição da parasitemia apenas para a dose de 800mg/kg. Ainda verificou-se que o

tratamento com Bz foi capaz de suprimir a parasitemia durante todo o período de

experimentação.

56

V ia o ra l

D ia s a p ó s a in fe c ç ã o

Pa

ras

ito

s e

m 0

.1m

L d

e s

an

gu

ex

10

3

1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

15

16

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

5 0 m g /kg

1 0 0 m g /kg

2 0 0 m g /kg

4 0 0 m g /kg

8 0 0 m g /kg

C o n tro le N T

B z - 1 0 0 m g

*

V ia in tra p e rito n e a l


Pa

ras

ito

s e

m 0

.1m

L d

e s

an

gu

ex

10

3

1 2 3 4 5 6 7 8 910

11

12

13

14

15

16

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

*

*

Figura 14 - Curva de parasitemia. Camundongos Swiss foram infectados com 5.000 formas

tripomastigotas sanguíneas da cepa Y do T. cruzi (n=5) e tratados ou não com a xantenodiona

MI80 ou Benznidazol (Bz). Os dados em cada ponto da curva equivalem à média da

parasitemia/dia referente a cada grupo. O símbolo (*) indica p<0,05 em relação ao grupo controle

infectado e não tratado.O gráfico superior indica a parasitemia durante o tratamento por via oral

e o gráfico inferior por via intraperitoneal.

57

Apesar da redução da parasitemia nos animais que receberam a MI80 por via

peritonial, foi observada uma acentuada taxa de mortalidade, inviabilizando esta via em

experimentos futuros (Fig.15). Dessa forma, o tratamento por gavagem foi priorizado na

dose de 50mg/kg, uma vez que esta concentração foi capaz de reduzir em 60% o número de

parasitos no sangue periférico durante o pico de parasitemia e ainda manter 80% dos animais

vivos até o fim do experimento.

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Figura 15 - Curvas de letalidade dos animais infectados e tratados com a MI80 por via oral ou

intraperitoneal. Animais Swiss fêmeas foram infectados com a cepa Y do T. cruzi, tratados ou não

com MI80 em doses decrescentes de 800 a 50mg/kg ou BZ (100mg/kg) (n=5). Curvas referentes ao

período compreendido entre o 1º e o 15 º dia de infecção. O gráfico a direita representa a taxa de

mortalidade dos animais tratados por via oral e o gráfico da esquerda a mortalidade dos camundongos

tratados intraperitonealmente.

4.3 Avaliação do tratamento com o composto MI80 na dose de

50mg/kg por via oral

4.3.1 Parasitemia e mortalidade

Nos animais infectados com a cepa Y, o tratamento foi rapaz de reduzir em 40% a

quantidade de parasitos circulantes no sangue periférico no pico da infecção. Para os animais

infectados com a cepa CL do T. cruzi, não foi observada redução da parasitemia quando

comparada ao grupo dos animais infectado e não tratados. Diferenças estatísticas (p<0,05)

58

foram observadas, para as duas cepas, entre o grupo controle infectado e não tratado e o

grupo infectado e tratado com o Bz (Fig.16).

Figura 16 - Curva de parasitemia em camundongos Swiss infectados pelo T. cruzi. Os animais

foram infectados com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y (A) ou CL (B) do T. cruzi

(n=10), tratados ou não com a xantenodiona MI80 ou Bz. Os dados em cada ponto da curva

equivalem à média da parasitemia/dia referente a cada grupo. (*) representa p<0,05 em relação ao

grupo infectado e tratado com Bz.

A taxa de sobrevivencia foi determinada para os animais pertencentes aos grupo

infectados, submetidos ou não aos tratamentos com a MI80 ou com o Bz (Fig.17). Para a

cepa Y do T. cruzi, observou-se que a taxa de sobrevida foi de 100% nos animais dos grupos

infectados e tratados com o MI80 e com Bz. Já os animais infectados que não receberam

tratamento, houve aproximadamente 80% de sobrevivência até o 15º dia de infecção (dia da

necropsia). Para a cepa CL do parasito, a sobrevida dos animais infectados tratados ou não

com o Bz foi de 100% até o 17º dia após infecção, quando se findou o experimento. Por

outro lado, para os animais tratados com a MI80, a taxa de sobrevivência foi de 90%.

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Y

Y + M I8 0

Y + B z **

*

59

Figura 17 - Curvas de letalidade de camundongos Swiss infectados com 5x103 formas

tripomastigotas sanguíneas da cepa Y ou CL do T. cruzi, tratados ou não com a MI80 ou Bz.

Animais Swiss fêmeas foram infectados com a cepa Y ou CL do T. cruzi, tratados ou não com

MI80(50mg/kg) ou BZ (100mg/kg) (n=10). Curvas referentes ao período compreendido entre o 1º e

o 15 º dia de infecção para cepa Y e 1º ao 18º para a cepa CL. O gráfico a direita representa a taxa

de mortalidade dos animais tratados para cepa CL o gráfico da esquerda a mortalidade dos

camundongos infectados coma cepa Y.Os resultados representam porcentagem de animais vivos.

4.3.2 Massa corporal e massa relativa do coração, baço e fígado

Observou-se a massa corporal nos animais infectados pela cepa Y, não tratados e

tratados com o MI80, foram maiores em relação aos animais não infectados (NI) e não

infectados tratados com MI80 (NIT) (Fig.18A). Nos animais infectados com a cepa CL, não

houve diferença significativa na massa corporal entre os grupos. Observamos que os animais

infectados com a cepa CL do T. cruzi tratados com o MI80 tiveram a massa relativa do

coração maior em relação aos controles NI e NIT (Fig.18B). Verificamos, também, que o

baço encontrava-se aumentado em todos os grupos infectados com a cepa Y do T. cruzi e

nem o tratamento com o MI80 nem com o Bz foram capazes de reverter este quadro. Para a

cepa CL do parasito, o tratamento com o MI80 não foi capaz de reverter o aumento da massa

esplênica, porém o Bz exerceu um papel protetor e preveniu o aumento deste órgão nos

animais infectados (Fig.18C). Também referente ao aumento relativo da massa hepática, o

MI80 não foi capaz de reverter o aumento observado com a presença do T. cruzi, sendo esta

redução observada apenas nos animais tratados com o Bz (Fig.19D).


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e S

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Figura 18 - Massa corporal e massa relativa do coração, baço e fígado. Camundongos Swiss

infectados e não infectados com a cepa Y ou CL do T. cruzi, tratados ou não com a MI80 ou Bz. A

massa corporal (A) dos animais foi avaliada após a eutanásia e, em seguida, o peso relativo do

coração (B), baço (C) e fígado (D), obtido a partir relação entre a massa do órgão dividido pela massa

corporal do animal. As caixas representam a mediana, máximo e mínimo. (*) representa p<0,05 em

relação aos controles NI e NIT. (#) mostra também diferença estatística em relação ao grupo

infectado e tratado com Bz. (Xtd) Xantenodiona MI80, (Bz) Benznidazol, (NI) Não infectado e (NIT)

Não infectado tratado com a MI80.

4.3.4 Efeito do tratamento com MI80 nos parâmetros inflamatórios

na infecção experimental pelo T.cruzi

4.3.4.1 Histopatologia e estereologia do miocárdio

O efeito do tratamento com a MI80 alterou aspectos histopatológicos cardíacos durante a

fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi e os resultados quantitativos e qualitativos estão

apresentados nas figuras 19 e 20, respectivamente. Foram observados ninhos de amastigotas nos

animais infetados e não tratados para as duas cepas estudadas (Fig. 20Y e CL), além de infiltrado

inflamatório caracterizado como leve a moderado com predominância de células mononucleares

61

(Fig.19C). Verificamos que o tratamento com a MI80 foi capaz de reduzir o infiltrado

inflamatório quando comparado aos animais que não receberam o composto (Fig.19A). O mesmo

perfil não foi percebido quando avaliamos as células polimorfonucleares, no qual o tratamento

não foi eficiente em reduzir o número de células para cepa Y (Fig.19B). Entretanto, o grupo

infectado pela cepa CL e tratado com a MI80 apresentou celularidade estatisticamente igual aos

controles não infectados. Observou-se ainda, redução do processo inflamatório no miocárdio nos

animais tratados com o Bz tanto para o grupo infectado com a cepa Y quanto com a CL do T.

cruzi (Fig. 19 A e B)

Figura 19 - Quantificação do processo inflamatório no músculo cardíaco. Camundongos Swiss

infectados com 5.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y ou CL do T. cruzi foram

tratados ou não com MI80 ou Benznidazol (Bz) na fase aguda. Análise do infiltrado inflamatório

contendo células mononucleares (A) e polimorfonucleares (B) no miocárdio dos animais. (C)

Diagrama de campo octogonal organizado em domínios que representa a celularidade tecidual da

seguinte forma: (-) celularidade mínima / (+ ) leve, (+ +) moderada ou (+ + +) intensa / infiltrado

inflamatório. * p< 0,05 comparado com o grupo controle infectado e não tratado; # p<0,05 em

relação ao grupo tratado com Bz e & p<0,05 comparado ao grupo tratado com MI80. (NI) Não

infectado e (NIT) Não infectado tratado com a MI80.

62

Figura 20 - Fotomicrografia de cortes histológicos do tecido muscular cardíaco.

Camundongos Swiss foram infectados com 5.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y

ou CL e tratados ou não com MI80 ou Bz, na fase aguda. As figuras superiores representam os

animais infectados pela cepa Y, além do controle não infectado. As imagens inferiores mostram

os animais infectados pela cepa CL e o controle não infectado e tratado com a MI80.Nos animais

infectados e não tratados (Y) ou (CL), o infiltrado inflamatório apresentou-se de maneira

moderada e foi possível identificar ninhos de amastigotas. Para o grupo de animais infectados e

tratados (Y+MI80) e (CL+MI80) verificou-se processo inflamatório discreto e focal. Nos animais

infectados e tratados com as doses 100 mg/Kg de Bz não houve detecção de infiltrado. Os

controles NI e NI+MI80 apresentaram aspecto histológico cardíaco normal. Barra 60μm2. (MI80)

Xantenodiona MI80, (Bz) Benznidazol, (NI) Não infectado e (NIT) Não infectado tratado com a

MI80.

Os animais infectados não tratados apresentaram redução no volume total dos

cardiomiócitos (Vv[cmy]) para cepa Y e CL, quando comparados aos grupos controle não

infectados e infectados e tratados com a MI80 (Fig.21A). Verificou-se ainda um aumento de

volume intersticial (Vv [cnt]) e vasos sanguíneos (Vv [bvs]) nos grupos Y e CL em relação aos

grupos Y+MI80, CL+MI80, NI e NIT (Fig.21B e C). A relação entre (Vv [bvs])/ (Vv [cnt])

indicou redução da vascularização do miocárdio no grupo Y e CL e o tratamento com a MI80 foi

capaz de controlar este processo em relação aos grupos infectados e sem tratamento (Fig.21D).

Contudo, há um aumento dos compartimentos estruturais e funcionais, obtidos da razão entre (Vv

[cnt])/ (Vv[cmy]), para os grupos Y, Y+MI80, CL e CL+MI80 quando comparados ao grupo

Y+MI80

60 µm

Y

(

60 µm

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CL

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60 µm

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60 µm

Y+Bz

60 µm

63

controle NI e NIT. O tratamento com Bz foi capaz de reverter todos os danos causados pela

infecção do ponto de vista estereológico.

Y

Y+M

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E

Figura 21 – Aspectos estereológicos do miocárdio. Camundongos Swiss foram infectados com

5.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y ou CL e tratados ou não com MI80 ou Bz, na

fase aguda. Confirmada a infecção, os animais foram tratados por 10 dias e o coração foi removido

e fixado em formol tamponado (10%). (A) Densidade volumétrica do caridiomiócito. (B)

Densidade volumétrica do tecido conjuntivo. (C) Densidade volumétrica dos vasos sanguíneos.

(D)Vascularização do miocárdio. (E) Compartimentos estruturais e funcionais. * p< 0,05

comparado com o grupo controle infectado e não tratado; # p<0,05 em relação ao grupo tratado

com Bz e & p<0,05 comparado ao grupo tratado com MI80. (NI) Não infectado e (NIT) Não

infectado tratado com a MI80. (Vv[cmy]) = volume total dos cardiomiócitos, (Vv [cnt])= volume

intersticial e (Vv [bvs])= volume de vasos sanguíneos.

64

4.3.4.2 Mediadores inflamatórios

A resposta imune após o tratamento com a xantenodiona MI80 foi também avaliada

neste estudo para citocinas inflamatórias e regulatórias. A proteína ligante de RankL não

sofreu alterações em nenhum dos grupos infectados pela cepa Y do T. cruzi. Já para a cepa

CL houve aumento na concentração desta proteína (p=0,009) no grupo infectado e tratado

com a MI80 em comparação aos grupos controle NI, NIT (Fig.22A). Observamos um

aumento de IFN e CCL2 para os animais infectados pela cepa CL com e sem tratamento com

a MI80, em relação aos grupos controle. Este perfil não foi observado nos animais infectados

pela cepa Y, que tiveram aumento na concentração de CCL2 no tecido cardíaco (Fig.22B).

Para as duas cepas do parasito, o tratamento com o Bz foi capaz de manter os níveis de IFN-

γ e CCL2 próximos aos dos grupos controles, sem diferença significativa (Fig.22B e C).

Embora o MI80 não tenha afetado os níveis de IL-10 no contexto da infecção com a cepa Y,

verificou-se aumento da produção desta citocina para os animais infectados pela cepa CL e

tratado com a MI80 em relação aos animais infectados e tratados com Bz (Fig.22D).

Ainda, avaliando em conjunto os 4 marcadores inflamatórios, o tratamento com a

dose 50mg/kg (NIT), durante 10 dias nos animais sem infecção, não apresentou redução ou

aumento da concentração destas proteínas quando comparado ao grupo não infectado sem

tratamento (Fig. 22).

65

Y

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Y

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0m

g)

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A

A

C

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Figura 22 - Perfil de marcadores inflamatórios no sobrenadante do macerado de miocárdio

de camundongos infectados ou não com a cepa Y ou CL do T.cruzi e tratados com a MI80

ou Bz. (A) Concentração de RankL. (B) níveis de CCL2, (C) IFN-gama no miocárdio e (D) IL-

10. O símbolo (#) representa p<0,05 em relação ao grupo infectado e tratado com Bz e (*) em

relação aos grupos NI e NIT. Os resultados estão expressos em caixas contendo a mediana,

máximo e mínimo. (Xtd) Xantenodiona MI80, (Bz) Benznidazol, (NI) Não infectado e (NIT) Não

infectado tratado com a MI80.

4.3.6 Tratamento com a xantenodiona MI80 e avaliação da

toxicidade renal e hepática

Lesões hepáticas e ou renais induzidas por fármacos constituem um dos principais

problemas a serem solucionados na busca por novos fármacos. Neste contexto foi dosado

no plasma dos animais, ureia e creatinina para verificação de possível lesão renal, além

de AST/TGO e ALT/TGP para avaliar se houve toxicidade hepática.

Verificou-se que o tratamento com a MI80 não gerou toxicidade renal e hepática,

uma vez que os valores desses marcadores no plasma nos animais não infectados e tratdos

com a MI80 foram similares ao grupo controle NI (Fig.23). Foi observada elevação das

enzimas hepáticas nos grupos infectados com a cepa Y com e sem tratamento com a MI80

66

em ralção aos controles não infectados. Para cepa CL, apenas o grupo infectado e sem

tratamento elevou a produção de ALT/TGP.

Figura 23 - Concentrações plasmáticas de TGO (A), TGP (B), ureia (C) e creatinina (D) de

camundongos infectados com as cepas Y e CL do T. cruzi, tratados com 50mg/kg durante

10 dias por via oral. O símbolo (*) representa diferença estatística (p<0,05) em relação aos

controles NI e NIT (#) representa p<0.05 em relação ao grupo infectado e tratado com Bz e (&)

indica diferença entre o grupo infectado e não tratado e o grupo tratado com a MI80. (, (Bz)

Benznidazol, (NI) não infectado e (NIT) não infectado tratado com a MI80

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0 .8

67

5. DISCUSSÃO

Doenças negligenciadas como a tripanossomíase americana geram grandes impactos

em países de clima tropical (WHO, 2012). Há pouco incentivo, principalmente pela indústria

farmacêutica, para o desenvolvimento de novos compostos/fármacos que possam mudar esta

realidade (Nwaka e Hudson, 2006). Além disso, a complexidade genética dos

tripanosomastídeos, associado ao desequilíbrio da resposta imune provocado pela interação

parasita-hospedeiro, permanece parcialmente incompreendida e contribui negativamente

para a ausência de uma boa estratégia terapêutica (Tarleton, Rick L., 2003; Tarleton, R. L.,

2003; Tarleton et al., 2007)

Para sanar esta lacuna, muitos pesquisadores têm se esforçado na busca de compostos

alternativos, advindos de várias bibliotecas, com diferentes esqueletos moleculares e radicais

(Pinto et al., 2005; Bustamante e Tarleton, 2011). No presente estudo, foram testados doze

compostos, oriundos de uma biblioteca de xantenodionas (1-8-octahidroxantonas) com

potenciais atividades anti-T. cruzi, anti-inflamatória e cardioprotetora (Lin et al., 1996;

Garrido et al., 2001; Jiang, D.-J. et al., 2004; Dar et al., 2005; Jassar et al., 2005; Librowski

et al., 2005; Chomnawang et al., 2007; Marona et al., 2008; Bumrungpert et al., 2010;

Szkaradek et al., 2015; Shagufta e Ahmad, 2016; Daei Farshchi Adli et al., 2018). Por estas

razões, estas moléculas despertaram a atenção do nosso grupo pela possibilidade de alterar

positivamente a intrínseca relação existente entre a infecção pelo T. cruzi e a

imunopatogênese cardíaca desenvolvida em seu hospedeiro mamífero.

Encontrar e desenvolver um novo medicamento é um processo longo, complexo,

dispendioso e altamente arriscado. A pesquisa e o desenvolvimento, para a maioria dos

fármacos disponíveis hoje, exigiram de 12 a 24 anos, desde o início de seus projetos até

alcançarem as prateleiras das farmácias. Além disso, muitas pesquisas possuem custo

elevado e, ao final, não atingem os resultado esperado (Lombardino e Lowe Iii, 2004). Por

isso vários (e diferentes) protocolos para validação de compostos ativos contra o T. cruzi

encontram-se descritos na literatura (Canavaci et al., 2010; Romanha et al., 2010;

Bustamante e Tarleton, 2011; Chatelain e Konar, 2015; Osorio-Méndez e Cevallos, 2019).

Experimentos em modelos celulares são fundamentais para uma rápida triagem de

68

compostos, uma vez que o uso de animais para este fim está sendo descontinuado (Zingales

et al., 2009; Bustamante e Tarleton, 2011).

Neste trabalho, estratégias in vitro foram utilizadas inicialmente para testar a

atividade tripanocida das xantenodionas. A mudança da posição dos átomos dentro da

molécula alterou substancialmente sua atividade contra o T. cruzi, principalmente para os

compostos MI79, MI80 e MI81. Já foi demonstrado que xantonas extraídas de fungos e

plantas, como a Garcinea intermedia e Garcinea subelíptica possuem comprovada ação em

epimastigotas e tripomastigotas da cepa Tulahuen, com valores de IC50 menores do que os

encontrados por nosso grupo (Abe et al., 2003; Abe et al., 2004; Pontius et al., 2008).

Entretanto é interessante ressaltar que esta cepa Y é descrita como parcialmente resistente

ao Bz (Zingales et al., 2009), e, de uma maneira geral os trabalhos disponíveis utilizam

cepas sensíveis.

Este fato nos encorajou a avaliar a ação citotóxica dos mesmos compostos em

macrófagos de camundongos. O padrão internacional preconiza que a concentração a ser

usada para experimentação mantenha no mínimo 70% de viabilidade celular (ISSO:109935,

2009). Concentrações que reduzam este valor já padronizado são consideradas citotóxicas.

É sabido que mesmo apresentando uma boa ação contra parasitos, a toxicidade das xantonas

na maioria dos relatos é alta, o que inviabiliza seu uso para o fim parasitológico (Abe et al.,

2003; Pinto et al., 2005; Al-Massarani et al., 2013). Nossos achados corroboram

parcialmente com a literatura, uma vez que a maior parte das xantenodionas são tóxicas

apenas nas maiores concentrações, acima de 100µM/mL. Entre os compostos análogos,

MI79, MI80 e MI81, os valores de CC50 foram similares evidenciando que esta pequena

mudança na posição dos átomos dentro da molécula não foi prejudicial para células de

mamíferos.

Vale lembrar que os valores de IC50 e CC50 são fundamentais para a determinação

do índice de seletividade, que consiste na razão entre a concentração citotóxica de 50% para

as células de mamíferos e a concentração de inibição de 50% para o T. cruzi. O valor

encontrado para o IS indica quantas vezes o composto é mais toxico para o parasita do que

para as células hospedeiras (Nwaka e Hudson, 2006). Dessa maneira, foi calculado o IS para

as seis xantenodionas testadas e observou-se que, apesar de apresentarem atividade

tripanocida, o IS não foi satisfatório neste modelo. Há autores que estabelecem um índice de

69

seletividade >50 para que o composto chegue a próxima etapa em testes de atividade

tripanocida (Nwaka e Hudson, 2006).

A baixa seletividade também é um problema conhecido dos pesquisadores que

trabalham com esta molécula. Al-Massarani et al. (2013), mostrou um bom potencial

tripanocida de xantonas naturais, entretanto sua alta citotoxidade fez com que estes

compostos não se tornassem atrativos para estudos futuros. O mesmo perfil foi observado

por Abe et al. (2004) que encontrou ISs insatisfatórios, mesmo usando cepas do T. cruzi

susceptíveis ao Bz. Para reduzir os efeitos nocivos das xantonas em células de mamíferos e,

consequentemente, reduzir a sua toxicidade, vários autores têm sugerido mudanças

conformais na molécula. Esta prática é descrita principalmente para atividade anti-malárica

das xantonas e pode garantir a otimização dos compostos. Além disso, estas pequenas

mudanças conformacionais também podem aumentar ou diminuir a polaridade da molécula,

o que interfere diretamente em sua ação (Kelly et al., 2002; Fotie et al., 2003; Tjahjani,

2017).

Existe uma necessidade de novos compostos para o tratamento da infecção pelo T.

cruzi em todos os estágios da doença de Chagas (Rodriques Coura e De Castro, 2002;

Tarleton et al., 2007; Urbina, 2010). Apesar de vários estudos serem publicados anualmente,

há uma falha nos testes in vitro e in vivo que, em sua maioria, não são totalmente adequados

para comprovar a eficiência das drogas (Chatelain, 2015). Vários ensaios colorimétricos e

fluorimétricos foram desenvolvidos para rastrear compostos anti-T.cruzi (Muelas-Serrano et

al., 2000; Vega et al., 2005; Rolon et al., 2006). Esses testes são mais precisos e objetivos

do que o método tradicional que envolve contagem visual microscópica.

No protocolo de triagem de drogas anti-T.cruzi, proposto por Romanha e cols.

(2010), foi sugerido o uso de parasitos geneticamente modificados expressando o gene da

b-galactosidase descrito por Buckner et al. (1996). Mesmo que amplamente utilizado, este

método apresenta desvantagem, pois só é possível realizar uma leitura de ponto final após a

adição de detergente e com um substrato conversível. Linhagens de T. cruzi expressando

repórteres alternativos como proteínas fluorescentes (tdTomato) já foram descritas e

demonstram que os parasitas emitem fluorescência em todas as fases evolutivas sendo

possível avaliar o crescimento ou inibição dos parasitos de maneira contínua (Darocha et al.,

2004; Guevara et al., 2005; Hyland et al., 2008). Entre as vantagens do uso destes parasitas

fluorescentes para ensaios in vitro, está a eliminação da necessidade de fixação ou de

70

permeabilização e a detecção de fluorescência com o mínimo manuseio, usando um

fluorímetro e um “screener” baseado em microscópio ou mesmo outro sistema de imagem

(Canavaci et al., 2010).

Baseados em ensaios de alto rendimento para triagem de compostos com atividade

anti-T.cruzi, os experimento in vitro descritos a seguir foram realizados no laboratório do

Dr. Rick L Tarleton, na Universidade da Geórgia (USA), durante meu período de doutorado

sanduíche. Este laboratório desenvolve estratégias para ensaios de alta performance em

triagem de fármacos, tanto em modelos celulares, quando murinos (Canavaci et al., 2010;

Bustamante et al., 2014). Zingales et al. (2014) recomendam que a triagem de compostos

anti-T.cruzi deva ser realizada em amastigotas intracelulares. Apesar dos ensaios em

epimastigotas e tripomastigotas serem muito menos trabalhosos, os resultados não são

coerentes com os encontrados em amastigotas. Assim, em nosso estudo foram utilizadas

células Vero gamma irradiadas para os ensaios de atividade em formas intracelulares do T.

cruzi . A irradiação gamma nas células é capaz de inibir a replicação, fazendo com que não

haja crescimento celular exacerbado (Yan e Moreno, 1998). Optou-se por usar a cepa CL

tdtomato, uma vez que Sánchez-Valdéz et al. (2018) mostraram que o tratamento com o Bz

elimina de maneira rápida e eficiente a maior parte dos parasitas independentemente da

cepa, mantendo a taxa de “clearence” parasitário similiar.

Assim, os doze derivados de xantenodionas propostos em nosso estudo foram

testados utilizando a plataforma descrita previamente. Entre todos os compostos, apenas três

apresentaram ação tripanocida relevante. É importante chamar a atenção para os análogos

MI79, MI80 e MI81, dos quais apenas o MI80 mostrou ação anti-T.cruzi sem induzir

citotoxidade, ou seja, atuou diretamente sob o parasito. Outro aspecto relevante foi a maior

atividade da MI80, MI24 e MI25 em eliminar formas intracelulares, ou amastigotas. Este

resultado corrobora com o trabalho de De Oliveira Caleare et al. (2013) que testou xantonas

extraídas de uma árvore nativa do cerrado brasileiro, o pau santo, para ação anti- T.cruzi.

Isoladamente, outros autores avaliaram a ação de xantonas derivadas de fontes naturais e

verificaram maior atividade em formas flageladas do T. cruzi do que em amastigotas,

discordando dos nossos resultados (Pontius et al., 2008; Dua et al., 2009; Al-Massarani et

al., 2013)

Paralelamente foram realizados, ainda, ensaios para verificação da toxicidade celular

usando o reagente AlamarBlue. Nesta etapa, testou-se os mesmos compostos usados nos

71

experimentos com J774A.1 e foram adicionados outros seis. Para os compostos testados em

ambos os ensaios, colorimétricos e fluorimétricos (MI17, MI24, MI25, MI79, MI80 e MI81),

observou-se que o tipo celular e a estratégia metodológica para determinar a citotoxidade

não alteraram resultados, uma vez que os valores de CC50 foram similares e o perfil de

viabilidade celular também. Já para as xantenodionas não testadas previamente a maior parte

teve a viabilidade celular reduzida a 70% ou mais, em concentrações menores do que a

necessária para os experimentos em amastigotas (50µM/mL). Conforme discutido nos

parágrafos anteriores, a citotoxidade dessa classe de compostos não é a ideal para

experimentos de bioatividade. Além disso, a apolaridade de algumas xantenodionas pode ter

contribuído para a redução da viabilidade celular e atividade tripanocida. Mais uma vez,

reforçamos a necessidade de ajustes moleculares que permitam adequar a polaridade destas

moléculas e melhorar sua eficiência

Após avaliarmos o perfil de citotoxidade e a atividade tripanocida, elegemos o

composto MI80 para prosseguir com os ensaios in vivo. Nosso objetivo inicial era não

somente avaliar a ação anti-T.cruzi, mas também a ação destes compostos na resposta

inflamatória do hospedeiro frente a infecção. Assim, a abordagem tradicional, descritas nos

protocolos para descoberta de novos compostos com atividade anti-T.cruzi, pôde ser

flexibilizado para responder a estas perguntas. A escolha da linhagem animal (camundongo

Swiss fêmeas) foi feita baseada nos protocolos descritos por Romanha et al. (2010) e

Chatelain e Konar (2015). Este modelo é recomendado devido ao “background” genético

dos animais e por apresentarem um perfil de infecção aguda com alta parasitemia e níveis

de mortalidade, permitindo uma comparação entre o efeito do composto testado e o efeito

do Bz. Além disso, desde 2014, agências de pesquisa internacionais preconizam o uso de

fêmeas em experimentos nos quais a doença, objeto do estudo, não tenha correlação com

fatores genéticos como o gênero (Collins, 2014; Mccullough et al., 2014).

A escolha das cepas também foi baseada nos mesmos protocolos para descoberta de

novos fármacos para doença de Chagas descritos acima, por apresentarem resistência

moderada ou não ao Bz e ao nifurtimox (Filardi & Brener, 1987) e serem usadas

rotineiramente em estudos in vitro e in vivo para atividade de testes de fármacos. Além disso,

o uso destas cepas neste tipo de ensaio permite a identificação rápida (menos de 40 dias) da

dose ideal necessária para etapas subsequentes no processo de triagem (Romanha et al.,

2010; Bustamante e Tarleton, 2011; Zingales et al., 2014; Chatelain e Konar, 2015).

72

Não há trabalhos em modelo animal que envolvendo o T. cruzi e as xantendionas,

sendo necessária a verificação da dose máxima tolerada e sua influência na parasitemia.

Revisando a literatura para estabelecer o esquema de tratamento, foi observado que os

xantenos naturais possuem baixa biodisponibilidade oral em roedores (Gutierrez-Orozco e

Failla, 2013). Em camundongos C57BL/6 quando α-MG foi administrada por gavagem oral

em uma suspensão oleosa (100 mg / kg), uma concentração plasmática máxima de 1,38 μmol

/ L foi alcançada em 30 min (Petiwala et al., 2014). Além disso, o α-MG foi detectado no

plasma 24 h após a administração oral, sugerindo um padrão de eliminação lento (Atulkumar

et al., 2012). Por esta razão foram infectados animais com a cepa Y do T. cruzi e testadas

cinco doses da MI80 (800, 400, 200, 100 e 50mg/kg) em duas vias, oral e intraperitoneal,

por 10 dias.. Como os animais tratados por gavagem tiveram maior taxa de sobrevivência do

que os animais que receberam a MI80 por injeção intraperitoneal foi priorizada a via oral,

na menor dose capaz de reduzir a parasitemia (50mg/kg) sem causar a mortalidade dos

animais.

Observamos em nosso estudo uma redução da parasitemia em animais infectados

com a cepa Y do T.cruzi e tratados com a MI80. A partir destes resultados iniciais, foram

infectados novos camundongos com as cepas Y (parcialmente resistente ao Bz) e CL

(susceptível ao Bz) do T. cruzi com o objetivo de avaliar oefeito da dose de 50mg/kg na

redução da parasitemia e dos parâmetros inflamatórios. Nos animais infectados com a cepa

Y, dez dias de tratamento diário foi capaz de reduzir em 40% o número de parasitos

circulantes pelo exame de sangue a fresco, além de prevenir a mortalidade dos animais.

Parasitemia e mortalidade são critérios básicos no teste de composto com atividade anti-T.

cruzi (Romanha et al., 2010). Apesar desta redução não ser significativa (p<0,05) quando

comparada ao grupo controle infectado e não tratado, ela pode interferir diretamente na

inflamação do miocárdio (Caldas et al., 2014). Para a cepa CL, o período pré-patente ocorre

entre o 6º e o 7º dias após a infecção e há um aumento da parasitemia a partir do 16º dia,

atingindo o pico no 22º dia (Zingales et al., 1997). Nossos experimentos em animais

infectados com a cepa CL foram interrompidos ao final de 18 dias de infecção e 10 dias de

tratamento, não sendo possível avaliar alterações no auge da circulação de parasitos no

sangue.

Durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi, a resposta imunológica exacerbada é

frequentemente observada no miocárdio, gerando lesões associadas que, em casos extremos

pode levar a morte em consequência de uma resposta inflamatória sistêmica (Rossi e

73

Mengel, 1992; Gutierrez et al., 2009). Com o objetivo de avaliar o impacto do tratamento e

a consequente redução da parasitemia na evolução das lesões cardíacas, realizou-se a análise

quantitativa do número de células inflamatórias no miocárdio dos camundongos infectados.

Os resultados alcançados apontam que a existência e intensidade das lesões cardíacas estão

associadas com a cepa do parasito e à sua sensibilidade aos compostos utilizados no

tratamento. Apesar de não haver induzido a cura parasitológica, a MI80 mostrou-se efetiva

em reduzir as lesões cardíacas nos animais infectados com a cepa Y e CL. Em concordância

com os resultados alcançados em nosso trabalho, Caldas et al. (2019), mostrou em modelo

cão, que a redução do número de parasitas tem efeito benéfico e é capaz de prevenir lesões

cardíacas nos estágios iniciais da infecção.

Além da avaliação histológica do tecido cardíaco, avaliou-se também o efeito’ do

tratamento com a MI80 no padrão de produção de mediadores inflamatórios. O gatilho e a

manutenção da resposta inflamatória está diretamente relacionado a ativação de vias de

sinalização celular, como a NF-kb (Bistrian, 2007; Ang et al., 2011; Arthur e Ley, 2013;

Afonina et al., 2017). Neste contexto, foi avaliado a produção do ligante de Rank (RankL),

citocina caracterizada como receptor ativador da via NF-kb. Os resultados mostraram um

aumento significativo desta proteína nos animais infectados com a cepa CL para o grupo

controle não tratado e tratados com a MI80. Estes achados sugerem que a infecção pode ser

fator responsável pela ativação da via e o tratamento com a MI80 não foi capaz de limitar

este processo. Trabalhos recentes já revelaram que a mangiferina, uma xantona natural, tem

a capacidade de inibir a ativação de NF-kB induzida por RankL in vitro, entretanto, não estão

descritos na literatura o envolvimento desta citocina em modelos in vivo (Ang et al., 2011;

Ma et al., 2015; Ding et al., 2018). Para os animais infectados com a cepa Y não houve

diferença entre nenhum grupo avaliado, possivelmente relacionado a características

intrínsecas da cepa do T.cruzi (Brener e Chiari, 1967; Brener et al., 1976; Filardi e Brener,

1987; Callejas-Hernández et al., 2018). O aumento de CCL2 foi coerente com os resultados

da análise histológica, uma vez que houve um predomínio de células mononucleares.

Nos animais infectados com a cepa Y ou CL e tratados com a MI80, a redução da

intensidade das lesões não foi acompanhada de redução dos níveis de IFN e CCL2. Como

esperado e característico da infecção (Talvani e Teixeira, 2011), para os grupos controles

infectados e não tratados houve um aumento destes mediadores. A produção de CCL2 está

relacionado tanto ao crescimento parasitário e a morfogênese de tripomastigotas quanto ao

74

aumento na ativação e ao recrutamento de infiltrado inflamatório para o coração (Marino

Ana Paula et al., 2004; Guedes et al., 2010).

Ressaltamos que o grupo infectado com a cepa CL e tratado com a MI80 apresentou

aumento da produção da IL-10. Trabalhos anteriores do nosso grupo já mostraram que a

elevação desta citocina está associada a proteção do miocárdio e consequentemente redução

do dano cardíaco na infecção pelo T.cruzi em modelo murino(De Paula Costa et al., 2010;

Penitente et al., 2015; Leite et al., 2017). Possivelmente, alteraçoes relacionadas tanto pela

redução da parasitemia quanto ao quadro inflamatório após o tratamento com a MI80 possam

estar envolvidos neste evento. Para os demais grupos, não foi observada diferença nos níveis

de IL-10 e acreditamos que o tempo de experimentação não tenha sido longo o suficiente

para promover mudanças na produção desta citocinas anti-inflamatória (Reed et al., 1994;

Cunha-Neto et al., 1998)

Nossos resultados demonstraram que apesar de não induzir à cura parasitológica, o

tratamento com a MI80 foi eficaz em reduzir o infiltrado inflamatório nos animais infectados

com a cepa Y e CL do T. cruzi e, esta redução, pode estar associada com diminuição, mesmo

que não significativa, da parasitemia. Ademais, existem incontestáveis hipóteses que esta

classe de compostos possui ação cardioprotetora, principalmente por mecanismos

antioxidantes (Dai et al., 2004; Jiang, D. J. et al., 2004; Marona et al., 2008; Frangogiannis,

2014; Szkaradek et al., 2015; Imran et al., 2017). Sabendo-se que as cepas Y e CL do T.cruzi

são cardiotrópicas e não havendo relação entre a intensidade de inflamação no miocárdio e

redução de mediadores inflamatórios, sugere-se um potencial efeito cardioprotetor gerado

pela xantenodiona, não elucidado neste estudo.

O tratamento com a xantenodiona MI80 não induziu o aparecimento de reações

adversas detectáveis. Além disso, não foi verificada toxicidade hepática e renal, tendo como

parâmetros as concentrações de AST/TGO e ALT/TGP, ureia e creatinina dosados no plasma

dos animais não infectados e tratados com 50mg/kg da MI80. Foi observado um aumento

das enzimas hepáticas nos animais infectados, possivelmente pelos metabólitos gerados a

partir da infecção pelo T. cruzi (Penas et al., 2016). Há indícios que as xantonas exerçam

papel hepatoprotetor em modelos de toxicidade induzida por D-galactosamina (GAL),

revertendo os efeitos adversos causados por esta toxina (Das et al., 2012). Em discordância

dos resultados já descritos na literatura(Novaes et al., 2015), neste estudo o tratamento com

75

Bz não foi capaz de elevar as enzimas indicativas de dano hepático possivelmente pelo

rápido período de tratamento (10 dias).

Mesmo em condições experimentais, os modelos de infecção pelo T. cruzi envolvem

vários parâmetros muitas vezes não controlados, incluindo a relação entre a exposição e a

cura, via de administração, tempo e duração do tratamento, linhagem do camundongo,

interações parasita-hospedeiro e tipo de resposta imune (Chatelain e Konar, 2015). Deste

modo, levando em consideração estes parâmetros, o derivado MI80 do 1,8-

dioxooctahydroxanthenos apresenta-se como uma alternativa segura e promissora para

novos estudos envolvendo o tratamento da infecção pelo T. cruzi em modelo experimental.

São necessários ainda, mais estudos que demonstrem os mecanismos de cardioproteção neste

modelo de infecção experimental com o objetivo de estabelecer a interação destes compostos

com o T. cruzi e o hospedeiro vertebrado.

76

6. CONCLUSÃO

Nossos achados mostraram que o 1,8-dioxo-octa-hidroxanteno apresenta efeito anti-

parasitário limitado, entretanto na infeção aguda em modelo murino, o tratamento por um

período de 10 dias, com 50mg/kg, refletiu na redução dos parâmetros inflamatórios

associados ao T.cruzi.

77

7. REFERÊNCIAS

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