atividade anti-inflamatÓria e antimicobacteriana de ... · 1.5.1 fármacos anti-inflamatórios...

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ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E ANTIMICOBACTERIANA DE

ESPÉCIES VEGETAIS OCORRENTES NO BRASIL COM ÊNFASE EM

Cecropia pachystachya e Vochysia divergens

THATIANA LOPES BIÁ VENTURA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ

FEVEREIRO 2011

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THATIANA LOPES BIÁ VENTURA

Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro, como parte das exigências para

obtenção do título de Mestre em Biociências

e Biotecnologia.

Orientadora: Drª Michelle Frazão Muzitano

Campos dos Goytacazes, RJ

Fevereiro 2011

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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia do Reconhecer, do Centro de Biociências e

Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, sob a orientação da

Profa Drª. Michelle Frazão Muzitano e co-orientação da Profª Drª Elena Lassounskaia.

Apoio:

• UENF- Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro

• FAPERJ - Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à

Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

• CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível superior

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Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,

como parte das exigências para obtenção do

título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

Aprovada em 17 de fevereiro de 2011.

Comissão examinadora:

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Aos meus pais, Ricardo e Nadir

e minha irmã Cínthia, por

todo amor, afeto e dedicação.

Obrigada por me fazerem

vencer o medo de partir em

busca dos meus sonhos...

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Ao Felipe, meu noivo, pelo

imenso amor, companheirismo,

paciência nos momentos difíceis

da minha vida. Amo você...

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Agradecimentos

“AGRADECER É ADMITIR QUE HOUVE UM MINUTO EM QUE SE PRECISOU DE ALGUÉM. AGRADECER É RECONHECER QUE

O HOMEM JAMAIS PODERÁ LOGRAR PARA SI O DOM DE SER AUTO-SUFICIENTE."

(AUTOR DESCONHECIDO)

A Deus, por ter me dado força nos momentos de fraqueza, luz nos momentos de

escuridão e por ter transformado os obstáculos em meios. Senhor, obrigado pelas

perdas e pelas conquistas.

A UENF, por ter me acolhido durante 6 anos e ter me transformado como pessoa,

me proporcionado muitos amigos, experiências incríveis e todo conhecimento obtido.

À minha orientadora, Michelle, pela amizade, paciência, por sua dedicada orientação

e todo conhecimento transmitido. Obrigada pelo exemplo profissional e pessoal...

por ter me ensinado com suas escolhas a valorizar mais o meu trabalho e tudo que

está ao meu redor. Não encontro palavras para definir as emoções que nos uniram

nestes 2 anos.

À Elena, minha co-orientadora, por ter me auxiliado durante este trabalho e ter me

aceitado no seu grupo de pesquisa desde o 2° período de graduação. Obrigada por

suas palavras, seu exemplo e dedicação.

Aos professores Milton, Daniela e Juliana por terem aceitado participar da minha

banca de defesa e compartilhar este momento comigo e a professora Alba, por ter

aceitado tão gentilmente revisar esta dissertação.

À professora Sônia Costa, colaboradora imprescindível, por ter acreditado nesta

parceria e ter cedido gentilmente as amostras das espécies vegetais obtidas pela

sua equipe de pesquisa.

A todos os alunos do NPPN/UFRJ que contribuíram direta ou indiretamente com

este trabalho, em especial a Marcela, a Maria Fernanda e a Fernanda José.

Ao meu pequeno grande grupo de trabalho: Isabela, Maíra, Sanderson e Marlon,

pessoas maravilhosas com quem aprendi muito. Superamos os momentos difíceis

que passamos com companheirismo e amizade. Obrigada por tudo!

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Ao Marlon, especialmente, um grande amigo e parceiro profissional, por toda

compreensão e paciência me ajudando em todos os momentos em que precisei.

Não tenho palavras para descrever tudo o que têm feito por mim. Serei sempre

grata!

Ao grupo Elenetes: Verônica, Simone, Marcelle, Fabrício, Giliane e Eduardo que

sempre me tiveram como parte do grupo e me ensinaram muito do que hoje sei.

Ao corpo técnico-administrativo do LBR: Juliana, Núbia, Rita, Verônica, Fernando e

Jorge pela atenção e disponibilidade nos trabalhos laboratoriais.

Aos meus amigos da UENF: William, Layla, Monique, Claudinha, Amélia, Natália,

Tarsila, Polyana, Sara, Antônio, Andreza e Bruno por dividirem comigo risos,

conhecimentos, expectativas e pela motivação ao longo da caminhada.

A minha amiga de república Josi, uma pessoa especial a quem confio um espaço

reservado em meu coração.

A minha dinda Diléia, por estar sempre presente durante a minha vida e pelo seu

apoio imprescindível em todos os momentos.

A minha avó Alidéia, por sempre me incentivar e por me fazer parte das suas

orações e a minha avó Florinda (in memoriam) por todo carisma e felicidade que me

destinou, sei que está torcendo por mim aonde esteja.

A tia Marlene e Dirlene, pelo apoio e incentivo durante minha formação acadêmica.

Obrigado pelas palavras e pelos momentos de descontração.

A CAPES, pela concessão da bolsa de Pós-graduação.

A todos que embora no anonimato desta relação, têm

conhecimento do seu valor para com este trabalho pois

sabem que colaboraram. Obrigada!

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ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................

ÍNDICE DE TABELAS ----------------------------------------------------------------------

ABREVIATURAS ...............................................................................................

RESUMO ............................................................................................................

ABSTRACT ........................................................................................................

1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................

1.1 Inflamação ..............................................................................................

1.1.1 Inflamação aguda .......................................................................

1.1.2 Inflamação crônica .....................................................................

1.2 Mediadores químicos ...........................................................................

1.2.1. Óxido Nítrico ..............................................................................

1.2.2. Metabólitos do ácido araquidônico .........................................

1.2.2.1 COX-2 e prostaglandinas ...............................................

1.2.3 Citocinas .....................................................................................

1.3 Manifestações sistêmicas da inflamação ..........................................

1.4 Inflamação relacionada à imunopatologia na tuberculose .............

1.5 Tratamento convencional e suas limitações ....................................

1.5.1 Fármacos anti-inflamatórios ....................................................

1.5.1.1 Glicocorticóides ...............................................................

1.5.1.2 Anti-inflamatórios não esteroidais .................................

1.5.2 Tratamento da tuberculose .......................................................

1.6 Substâncias de origem vegetal como fonte de novos fármacos....

1.6.1- A espécie Vochysia divergens Pohl e espécies afins............

1.6.2- A espécie Cecropia pachystachya Trécul e espécies afins

2. OBJETIVOS ...................................................................................................

2.1. Objetivo geral ........................................................................................

2.2. Objetivos específicos ..........................................................................

3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................

3.1 Obtenção do material vegetal .............................................................

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3.2 Cultura celular e preparação dos ensaios de macrófagos RAW

264.7..............................................................................................................

3.3 Ensaio da capacidade de inibição da produção de óxido nítrico

(NO) ..............................................................................................................

3.4 Testes de citotoxicidade (ensaio de MTT e LDH) ..............................

3.5 Bioensaio com células L929 e análise da produção de TNF-α α α α por

macrófagos ................................................................................................

3.6 Ensaio da capacidade de inibição da produção de PGE2 .................

3.7 Avaliação da capacidade de inibição da expressão da iNOS ...........

3.7.1 Obtenção dos extratos celulares totais ......................................

3.7.2- SDS-PAGE e Western Blotting ...………………………………….

3.8 Avaliação da atividade antioxidante ...................................................

3.9 Ensaio da inibição da proliferação linfocítica ....................................

3.10 Avaliação indireta da capacidade de inibição da atividade da

enzima iNOS .................................................................................................

3.11 Atividade Antimicobacteriana ...........................................................

3.12 Análise Estatística ..............................................................................

4. RESULTADOS ...............................................................................................

4.1 Screening preliminar dos extratos aquosos obtidos quanto à

citotoxicidade e modulação da produção de óxido nítrico ................

4.2 Avaliação da atividade inibitória dos 11 extratos aquosos

selecionados através de curva de concentração-resposta (2º

screening) ...................................................................................................

4.2.1 Modulação da produção de óxido nítrico e citotoxicidade ......

4.2.2 Modulação da produção do fator de necrose tumoral (TNF-αααα).

4.3 Avaliação da capacidade de modulação da proliferação linfocítica

pelos extratos aquosos selecionados .....................................................

4.4 Análise da atividade antioxidante dos extratos aquosos

selecionados ..............................................................................................

4.5 Seleção dos extratos aquosos para estudo de suas frações e

substância isolada .....................................................................................

4.5.1 Obtenção das frações e substância isolada do extrato de V.

divergens ....................................................................................................

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4.5.2 Atividade modulatória na produção de óxido nítrico e

citotoxicidade das frações e substâncias isoladas do extrato aquoso

de V. divergens ..........................................................................................

4.5.3 Modulação da produção do fator de necrose tumoral (TNF-αααα)

pelas frações e substância isolada do extrato aquoso de V.

divergens ....................................................................................................

4.5.4 Análise da atividade antioxidante das frações isoladas do

extrato aquoso de V. divergens e da luteolina ........................................

4.5.5 Avaliação indireta do mecanismo de ação do extrato aquoso,

frações e da luteolina na atividade da enzima iNOS ..............................

4.5.6 Análise da capacidade de modulação da expressão enzimática

da iNOS pelo extrato aquoso da V. divergens, frações e luteolina .......

4.5.7 Avaliação da capacidade de inibição da produção de PGE2 pelo

extrato aquoso da V. divergens, frações e luteolina ..............................

4.5.8 Verificação da capacidade das frações e da luteolina em inibir o

crescimento de M. bovis BCG ..................................................................

4.5.9 Obtenção das frações e substância isolada do extrato de C.

pachystachya .............................................................................................


citotoxicidade dos extratos de C. pachystachya coletada em Arraial

do Cabo e suas frações .............................................................................


citotoxicidade dos extratos de C. pachystachya coletada na Barra da

Tijuca e suas frações .................................................................................

4.5.12 Modulação da produção do fator de necrose tumoral (TNF-αααα)

pelos extratos, frações e substância isolada de C. pachystachya .......

4.5.13 Análise da atividade antioxidante dos extratos, frações e

substância isolada de C. pachystachya ..................................................

4.5.14 Avaliação indireta do mecanismo de ação do extrato aquoso,

frações e da orientina na atividade da enzima iNOS ..............................

4.5.15 Análise da capacidade de modulação da expressão enzimática

da iNOS pelos extratos aquosos de C. pachystachya, a fração

butanólica e a orientina .............................................................................

4.5.16 Avaliação da capacidade de inibição da produção de PGE2

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pelos extratos aquosos de C. pachystachya, a fração butanólica e a

orientina ......................................................................................................

4.5.17 Verificação da capacidade de inibição do crescimento de M.

bovis BCG pela fração butanólica e o flavonoide isolado orientina .....

5. DISCUSSÃO .................................................................................................. 6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Representação do mecanismo de indução de adesão leucócito-endotélio na inflamação em resposta a um agente quimiotático .................. 3

Figura 2 - Representação esquemática dos possíveis eventos de evolução do processo inflamatório agudo ...................................................... 5

Figura 3 - Interações do macrófago-linfócito na inflamação crônica ............ 7

Figura 4- Diagrama resumido dos mediadores derivados de fosfolipídios e suas ações, com os locais de ação de agentes anti-inflamatórios ............... 10

Figura 5 - Principais características da tuberculose: da infecção a defesa . 15

Figura 6 - Mecanismo de ação dos anti-inflamatórios esteroidais (glicocorticóides) ................................................................................................

Figura 7 – Estrutura química dos glicocorticoides, hidrocortisona e dexametasona .....................................................................................................

Figura 8 - Estrutura química dos AINEs não-seletivos com amplo uso na terapêutica atual .................................................................................................

Figura 9 - Estrutura química dos AINEs seletivos a COX-2 ...........................

Figura 10 – Estrutura química de fármacos antimicobacterianos convencionais .....................................................................................................

Figura 11 – Estrutura química inibidor padrão de iNOS, Acetato de NG-Metil-Arginina.......................................................................................................

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Figura 12 - Curva de padronização do inibidor de iNOS, L-NMMA, para o modelo de inflamação proposto RAW 264.7 e sua citotoxicidade................. 41

Figura 13 - Percentual de inibição da produção de óxido nítrico e citotoxicidade das espécies selecionadas através de um screening preliminar em relação aos seus respectivos controles .................................. 45

Figura 14 - Efeito modulatório na produção do NO e citotoxicidade dos extratos aquosos selecionados no 2º screening ............................................ 49

Figura 15 - Modulação da produção de TNF-αααα através do bioensaio com fibroblastos murinos L929 ................................................................................. 50

Figura 16 - Percentual de citotoxicidade frente ao TNF-αααα em fibroblastos murinos L929 através do método de MTT ........................................................ 51

Figura 17 – Estrutura química do fármaco imunossupressor Ciclosporina A ...........................................................................................................................

Figura 18 - Efeito modulatório e citotoxicidade dos extratos aquosos selecionados no 2º screening na proliferação de linfócitos ..........................

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Figura 19 - Padronização da atividade antioxidante do nitroprussiato de sódio .................................................................................................................... 55

Figura 20 - Percentual de sequestro de óxido nítrico pelos extratos selecionados na presença do SNP ................................................................... 57

Figura 21 - Estrtura química da 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo isolada do extrato de V. divergens .................................... 59

Figura 22 - Efeito modulatório na produção do NO e citotoxicidade das frações, 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo isoladas do extrato aquoso de V. divergens e da luteolina ................................................ 60

Figura 23 - Percentual de citotoxicidade das frações, 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo isoladas do extrato aquoso de V. divergens e da luteolina a fibroblastos L929 ................................................... 63

Figura 24 - Percentual de sequestro de óxido nítrico das frações isoladas do extrato aquoso de V. divergens e da luteolina ........................................... 64

Figura 25 - Avaliação da capacidade de modulação da atividade enzimática da iNOS pelo extrato aquoso de V. divergens, frações e a luteolina ............................................................................................................... 66

Figura 26 - Avaliação da capacidade de inibição da expressão enzimática da iNOS pelo extrato aquoso da V. divergens, suas frações e da luteolina.. 68

Figura 27 - Percentual de inibição da produção de PGE2 pelo extrato aquoso de V. divergens, suas frações e a luteolina ....................................... 70

Figura 28 - Curva de padronização para DMSO e o fármaco controle, a rifampicina .......................................................................................................... 71

Figura 29 - Efeito inibitório no crescimento de M. bovis BCG pelas frações butanólica, em diclorometano e em acetato de etila e a luteolina.................. 73

Figura 30 - Estrutura química da orientina isolada do extrato das folhas fêmeas de C. pachystachya............................................................................... 74

Figura 31 - Modulação da produção de NO e citotoxicidade dos extratos das folhas e inflorescências masculinas e femininas de C. pachystachya . 77

Figura 32 - Modulação da produção de NO e citotoxicidade das frações aquosa, butanólica e orientina purificadas do extrato aquoso das folhas fêmeas de C. pachystachya .............................................................................. 79

Figura 33 - Modulação da produção de NO e citotoxicidade dos extratos aquosos das folhas fêmeas, folhas masculinas e infrutescências de C. pachystachya coletadas na Barra da Tijuca .................................................... 81

Figura 34 - Efeito modulatório dos extratos aquosos de C. pachystachya e

| vii

suas frações (Barra da Tijuca) frente ao NO e sua toxicidade ...................... 82

Figura 35 - Percentual de citotoxicidade dos extratos aquosos das folhas masculinas e das folhas e inflorescências femininas de C. pachystachya frente aos fibroblastos L929 .............................................................................. 84

Figura 36 - Percentual de citotoxicidade das frações aquosa e butanólica e da orientina purificados do extrato aquoso das folhas femininas de C. pachystachya ao fibroblasto L929 .................................................................... 85

Figura 37 - Percentual de sequestro de óxido nítrico pelos extratos aquosos das folhas masculinas e das folhas e inflorescências femininas de C. pachystachya ............................................................................................

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Figura 38 - Percentual de sequestro de óxido nítrico pelas frações aquosa e butanólica e da orientina purificados do extrato aquoso das folhas femininas de C. pachystachya .......................................................................... 87

Figura 39 - Avaliação da capacidade de modulação da atividade enzimática da iNOS pelos extratos aquosos de C.pachystachya, a fração butanólica e a orientina ..................................................................................... 88

Figura 40 - Avaliação da capacidade de inibição da expressão enzimática da iNOS pelos extratos aquosos da Cecropia pachystachya, pela fração butanólica e a orientina ..................................................................................... 90

Figura 41 - Percentual de inibição da produção de PGE2 pelos extratos aquosos das folhas masculinas, das folhas e inflorescências femininas C. pachystachya, fração butanólica e a orientina ................................................ 92

Figura 42 - Efeito inibitório no crescimento de M. bovis BCG pela fração butanólica e a orientina purificada do extrato das folhas fêmeas de C. pachystachya ...................................................................................................... 93

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ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 - Espécies vegetais estudadas .......................................................... 38

Tabela 2 - Percentual de inibição da produção de óxido nítrico e percentual de citotoxicidade pelo método de LDH e MTT dos 26 extratos aquosos através de um screening preliminar ................................................. 43

Tabela 3 - Percentuais de inibição da produção de óxido nítrico, de citotoxicidade pelo método de LDH e MTT e IC50 dos 11 extratos aquosos selecionados no 2º screening de atividade ..................................................... 47

Tabela 4 - Relação das partes coletadas dos indivíduos femininos e masculinos em Arraial do Cabo/RJ e seus respectivos fracionamentos ..... 73

Tabela 5 - Relação das partes coletadas dos indivíduos femininos e masculinos na Barra da Tijuca/RJ e seus respectivos fracionamentos ....... 74

Tabela 6 - Estrutura da molécula de VdF, da orientina e da luteolina e seus respectivos IC50 nas atividades estudadas .................................................... 104

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ABREVIATURAS

• AA- ácido araquidônico

• ADC - suplemento de albumina, dextrose, catalase

• AINES - anti-inflamatórios não esteroidais

• Akt – proteína quinase B

• AP-1 – Proteína de ativação-1

• BCG – Bacilo Calmette-Guérin

• Bcl-2 – linfoma de células B 2

• cGMP-NO – guanosina 3,5-monofosfato cíclica – óxido nítrico

• COX- ciclooxigenase

• cPLA2 - fosfolipases A2 citoplasmáticas

• CR – receptor de complemento

• CXCL – ligante da quimiocina CXC

• D.O. – densidade ótica

• DAB – diaminobenzidina

• DC - célula dendrítica

• DMEM-F12- Dulbecco's Modified Eagle Medium

• DMF – dimetilfamamida

• DMSO – dimetil sufóxido

• DNA – ácido desoxirribonucleico

• dsRNA - ácido ribonucléico dupla fita

• EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético

• eNOS - óxido nítrico sintase endotelial

• FF – folha fêmea

• Fr. AcOEt – fração em acetato de etila

• Fr. Aqr – fração aquosa residual

• Fr. BuOH – fração butanólica

• Fr. CH2Cl2 – fração em diclorometano

• GR – receptores de glicocorticoides

• HAT - histona acetiltransferase

• HCl – ácido clorídrico

• HIV - vírus da imunodeficiência adquirida

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• ICAM-1 - molécula de adesão intracelular-1

• IFN-γ - interferon gama

• IKK2 – inibidor de I-κB- kinase-2

• IL- interleucina

• iNOS - óxido nítrico sintase induzida

• kDa- quilodálton

• LDH – lactato desidrogenase

• L-NMMA - Acetato de NG-Metil-L-Arginina

• LPS - lipopolissacarídeo

• LTB4 - leucotrieno B4

• M-CSF - fator estimulador de colônias em macrófagos

• MDR – tuberculose multidroga resistente

• MTb – Mycobacterium tuberculosis

• MTT - 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil tetrazol – sal de tetrazol

• NAD - nicotinamida adenina dinucleotídeo

• NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)

• NF-κB - fator de transcrição nuclear κb

• NK – célula natural killer

• nNOS - óxido nítrico sintase neuronal

• NO - óxido nítrico

• NOS - óxido nítrico sintase

• PBMC – células mononucleares do sangue periférico

• PBS - salina fosfatada tamponada

• PBST – salina fosfatada tamponada acrescida de Tween (detergente)

• PHA –fitohemaglutinina

• RLO- radicais livres de oxigênio

• RLN- radicais livres de nitrogênio

• RNAm – ácido ribonucleotídeo mensageiro

• RNI – reativos intermediários de nitrogênio

• ROI – reativos intermediários de oxigênio

• SAR – relação estrutura-atividade

• SBF – soro fetal bovino

• SDS – dodecilsulfato de sódio

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• SNP – Nitroprussiato de sódio

• sPLA2 - fosfolipases A2 secretadas

• T CD4+ - linfócito T auxilar CD4+

• Th17 – Subpopulação de célula T auxiliar -17

• TLR – Toll like receptor

• TNF-α - fator de necrose tumoral-alfa

• TXA2 - tromboxano A2

• VCAM-1 - molécula de adesão celular e vascular-1

• VdF - 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo

• VEGF – fator de crescimento endotelial vascular

| xii

RESUMO

O processo inflamatório é um mecanismo de proteção mediado por diversos fatores

químicos. A desregulação ou interferência no controle da resposta inflamatória

conduzem a um estado reacional persistente do sistema imune que pode requerer

tratamento. O uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) é atualmente a principal

abordagem terapêutica apesar da grande incidência de efeitos adversos. O mecanismo

imunológico da patogenia na tuberculose e o aumento no número de pacientes

resistentes ao tratamento convencional incentivam a pesquisa por imunoterápicos que

além de microbicida atuem na inflamação exacerbada observada na doença.

Substâncias de origem vegetal, pertencentes às mais diversas classes químicas, vem

sendo investigadas quanto à atividade anti-inflamatória e antimicobacteriana. Dentre

elas, destacam-se os flavonoides. O objetivo deste trabalho foi buscar extratos ou

substâncias de origem vegetal que pudessem ser utilizadas no tratamento dos

processos inflamatórios e infecções micobacterianas. Macrófagos murinos RAW 264.7

estimulados com LPS e tratados foram utilizados para avaliação da ação modulatória

dos extratos e o Mycobacterium bovis BCG foi utilizado para testes de inibição do

crescimento micobacteriano. O screening de atividade inibitória da produção de NO e de

citotoxicidade selecionou 11 espécies, sendo elas: Vochysia divergens, Andira

cuyabensis, Sida santaremensis, Phyllanthus amarus, Pavonia angustifolia, Sabicea

aspera, Sebastiania corniculata, Vernonia scabra, Rynchanthera novemnervia, Persea

americana e o extrato aquoso das folhas fêmeas da Cecropia pachystachya. Os extratos

aquosos das folhas fêmeas de C. pachystachya e da V. divergens foram selecionados

para continuação do estudo. A fração butanólica do extrato de V. divergens e sua

substância isolada a 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo assim como a

fração butanólica do extrato das folhas fêmeas de C. pachystachya e a orientina foram

capazes de inibir a produção de NO, TNF-α e PGE2 além de inibir o crescimento

micobacteriano. O mecanismo de ação inibitória da produção de NO relacionou-se de

forma significativa com a expressão enzimática da iNOS. A posição e o tipo de

glicosilação assim como a presença de metoxilas influenciam o potencial de ação das

substâncias isoladas testadas conferindo a orientina maior destaque. Os resultados

indicam um potencial promissor das frações e substâncias isoladas no desenvolvimento

de novas terapêuticas para o tratamento da inflamação, da imunopatogenia da

tuberculose além do potencial microbicida. Palavras-chave: produtos naturais, anti-

inflamatório, antimicobacteriano, Cecropia pachystachya, Vochysia divergens

| xiii

ABSTRACT

The inflammatory process is a protective mechanism mediated by various chemical

factors. Desregulation or interference in the controlling of inflammatory reaction leading

to a persistent state of immune system activity that may require treatment. The use of

non-steroidal anti-inflammatory drugs is currently the main therapeutic approach despite

the high incidence of adverse effects. The immunological mechanism of pathogenesis in

tuberculosis and an increasing number of patients resistant to conventional treatment

encourage the search for new immunotherapeutic that beyond microbicide activity can

act also in the exacerbated inflammation observed in this disease. Substances of plant

origin, belonging to several chemical classes, have been investigated for anti-

inflammatory and antimycobacterial activities. Among these are the flavonoids. The aim

of this study was to find plant extracts or substances which could be used in the

treatment of inflammatory processes and mycobacterial infection. Murine macrophages

RAW 264.7 stimulated with LPS and treated were used to evaluate the modulatory

activity of extracts. Mycobacterium bovis BCG was used to test samples inhibition of

mycobacterial growth. The screening of inhibitory activity of NO production and

cytotoxicity selected 11 species: Vochysia divergens, Andira cuyabensis, Sida

santaremensis, Phyllanthus amarus, Pavonia angustifolia, Sabicea aspera, Sebastiania

corniculata, Vernonia scabra, Rynchanthera novemnervia, Persea americana and C.

pachystachya female leaf. The aqueous extracts of V. divergens and C. pachystachya

were selected for further study. The butanolic fraction of V. divergens extract and its

isolated substance 3’,5-dimethoxy luteolin-7-O-β-glucopyranoside and the butanol

fraction of female leaf aqueous extract of C. pachystachya and orientin were capable to

inhibit the production of NO, TNF-α e PGE2. In addition, they inhibit the mycobacterial

growth. The inhibitory NO production mechanism is significantly related with the inhibition

of iNOS enzymatic expression. The position and glycosylation type, as well as the

methoxyl presence, influence the action of the isolated substances, highlighting orientin.

Results indicate a promising potential of fractions and isolated substances in the

development of new therapeutics for treatment of inflammation and tuberculosis

immunopathogenesis, besides their microbicide potential. Keyword: natural products,

anti-inflammatory, antimycobacterium, Cecropia pachystachya, Vochysia divergens.

|||| 1

1- INTRODUÇÃO

1.1- INFLAMAÇÃO

A inflamação é conhecida desde a Antiguidade (aproximadamente 3000 a.C.),

tendo suas características clínicas primariamente descritas em papiros egípcios

(ROBBINS et al., 2001). A primeira descrição dos seus princípios fundamentais foi feita

por Aulus Cornelius Celsus (30 a 50 a.C.), na Roma Antiga, onde listou os quatro sinais

cardinais da inflamação: rubor, edema, calor e dor. A estes sinais Galeno (138 a 201

d.C.), ajuntou um quinto sinal: a perda de função. Mais tarde, com auxílio do

microscópio Virchow descreveu as reações celulares, Conheim analisou os fenômenos

vasculares e Metchnikoff descreveu a fagocitose (DA SILVA et al., 2003).

No decorrer dos séculos, vários cientistas contribuíram para a fundamentação

das bases do processo inflamatório, enriquecendo os conhecimentos sobre as células

participantes e os mediadores químicos envolvidos; como o envolvimento de

mastócitos descritos em 1877 por Paul Ehrlich, da histamina na “reação tríplice

cutânea” em 1927 por Lewis, dos macrófagos na constituição dos granulomas por

Virchow e no desenvolvimento de agentes anti-inflamatórios (DA SILVA et al., 2003;

ROBBINS et al., 2001).

Atualmente sabe-se que a inflamação é um mecanismo de proteção

evolucionariamente conservado, e composto de complexas alterações sequenciais no

tecido para eliminar a causa inicial da lesão celular que pode ter sido provocada por

agentes infecciosos ou por substâncias provindas de seu metabolismo

(microorganismos e toxinas) como também por agentes físicos (radiação, queimadura e

trauma), ou químicos (substâncias caústicas) (CARVALHO, 2004; GAESTEL et al.,

2009). Cada estímulo provoca um padrão característico de resposta que, apesar da

diversidade e complexidade dos mediadores químicos, apresentam variação

relativamente pequena (CARVALHO, 2004).

O processo inflamatório envolve o tecido conjuntivo, incluindo o plasma, células

circulantes, vasos sanguíneos e constituintes celulares e extracelulares. As respostas

vasculares e celulares são mediadas por fatores químicos derivados do plasma ou de

células quando há estímulo inflamatório. A interação destes mediadores, juntos ou em

sequência, com componentes celulares e vasculares influencia a duração e evolução

da resposta inflamatória (ROBBINS et al., 2001). No decorrer do processo inflamatório

podem ser reconhecidas reações de curta duração e rápida instalação, que duram de 1

|||| 2

a 2 semanas, pertencentes ao grupo das inflamações agudas, e/ou reações que

persistem por mais tempo, meses ou anos, de velocidade lenta e insidiosa,

pertencentes ao grupo das inflamações crônicas (RANG et al., 2007; DA SILVA et al.,

2003).

Ambos podem se restringir a fenômenos locais ou envolver fenômenos

sistêmicos. As características, extensão e gravidade do processo inflamatório

dependem de fatores relacionados com o hospedeiro (estado nutricional e fatores

genéticos) e com a natureza e patogenicidade do agente agressor (CARVALHO, 2004).

1.1.1- INFLAMAÇÃO AGUDA

A inflamação aguda é uma resposta imediata e inicialmente inespecífica

independente do tipo de agressor, contudo as vias de integração da sinalização do

sistema imune são altamente coordenadas o que assegura que o processo seja auto-

limitante (SERHAN et al.,2007). As principais características deste tipo de inflamação

são a exsudação de líquidos e proteínas plasmáticas e a migração de leucócitos,

predominantemente neutrófilos. Assim, os eventos vasculares exercem um papel tão

importante quanto os eventos celulares (ROBBINS et al., 2001).

Os eventos vasculares iniciam logo após a lesão e se desenvolvem em

velocidades variáveis dependendo da intensidade da agressão. Primeiramente,

ocorrem alterações no calibre vascular conduzindo ao aumento do fluxo sanguíneo,

causador do calor e do rubor na área inflamada, logo seguido pelo alentecimento da

circulação e instalação do processo de estase sanguínea permitindo a marginalização

leucocitária (SZEKANECZ et al., 2004). O aumento da permeabilidade vascular devido

às alterações estruturais na rede microvascular permite as proteínas plasmáticas

deixarem a circulação e se acumularem no tecido intersticial (exsudação), o que causa

o edema. O extravasamento plasmático pode ocorrer por alargamento das junções

intercelulares endoteliais das vênulas ou por lesão direta nas mesmas (DA SILVA et al.,

2003; ROBBINS et al., 2001).

A vasodilatação e o aumento da permeabilidade vascular com exsudação são

provocados por mediadores químicos produzidos a partir do plasma e das células

(COUTINHO et al., 2009).

Apesar dos eventos vasculares serem pouco relatados, os sistemas vasculares

sanguíneo e linfático são essenciais para as reações de defesa, assim células

endoteliais ativadas promovem o recrutamento de leucócitos até o sítio inflamatório

|||| 3

enquanto os vasos linfáticos transportam antígenos e células apresentadoras de

antígenos até os linfonodos, onde estimulam linfócitos T e B a iniciar uma resposta

imune antígeno-específica (RUËGG, 2006).

Dentre as células envolvidas na inflamação aguda algumas (células endoteliais

vasculares, mastócitos e macrófagos teciduais) estão normalmente presentes nos

tecidos, enquanto outras (plaquetas e leucócitos) têm acesso ao mesmo através da

corrente sanguínea (RANG et al., 2007; ROBBINS et al., 2001; RUËGG, 2006). Os

neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no ser humano e expressam uma gama

de moléculas de adesão (LUSTER et al., 2005).

Estas células, em particular polimorfonucleares, tendem a se acumular no sítio

de infecção, como pode ser observado na Figura 1, compondo o mecanismo inato, a

primeira linha de defesa ao patógeno ou ao agente nocivo e filogeneticamente o mais

antigo (DA SILVA et al., 2003; RUËGG, 2006). A migração processa-se em etapas: (1)

emigração em direção ao estímulo quimiotático; (2) marginalização, rolamento e

adesão; (3) saída do vaso sanguíneo por diapedese e (4) fagocitose e desgranulação a

partir da ativação leucocitária (DA SILVA et al., 2003; ROBBINS et al., 2001).

Figura 1- Representação do mecanismo de indução de adesão leucócito-endotélio na inflamação em resposta a um agente quimiotático (ABBAS AND LICHTMAN, 2005).

Infecções ou injúrias teciduais conduzem a liberação de mediadores químicos

responsáveis pelo recrutamento de leucócitos (neutrófilos polimorfonucleares) a área

inflamada (SERHAN et al.,2007; SERHAN et al.,2008). O desenvolvimento da estase

local permite a orientação periférica dos leucócitos e a interação destes com moléculas

|||| 4

de adesão na parede das células endoteliais que são estimuladas por fatores químicos

a serem liberadas de grânulos para a superfície das células. Primeiramente a interação

é frágil, ocasionando o processo de rolamento do leucócito sobre a superfície

endotelial. Posteriormente, sobre ação do TNF-α e IL-1β, as células endoteliais

expressam E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 que permite maior estabilidade a interação

leucócito-endotélio propiciando a adesão leucocitária, projeção de pseudópodes por

entre as células endoteliais e diapedese (DA SILVA et al., 2003; ROBBINS et al.,

2001). Após atravessarem a membrana basal os leucócitos aderentes migram até o

local da infecção ao longo de um gradiente de fatores quimiotáticos.

Os neutrófilos são as primeiras células a migrar, seguido de monócitos e

linfócitos. Além de orientar a migração leucocitária os agentes quimiotáticos também

ativam estas células conduzindo a fagocitose, a desgranulação e secreção enzimática,

produção de mediadores químicos e lesão tecidual devido à liberação moderada de

produtos não apenas no interior do fagossomo, mas no espaço extracelular (DA SILVA

et al., 2003; ROBBINS et al., 2001).

A diminuição do estímulo inflamatório após a neutralização e eliminação do

agente causal, auto-limita a síntese de mediadores e conduz ao catabolismo dos

mesmos reduzindo a sinalização pró-inflamatória. A liberação de fatores que previnem

o tráfico de polimorfonucleares e a formação do edema inicia o processo de resolução

da resposta inflamatória aguda e o retorno a homeostasia, evitando danos teciduais

devido a produção prolongada ou inapropriada de mediadores químicos pelos

polimorfonucleares juntamente com a limpeza de debris celulares (SERHAN et al.,

2007; SERHAN et al., 2008). As rotas de saída disponíveis a leucócitos incluem

recirculação sistêmica (menos descrita) ou morte local seguida pela fagocitose

realizada pelos macrófagos recrutados. Uma vez completada a fagocitose, o macrófago

pode permanecer no tecido ou morrer através de apoptose. A inflamação aguda pode

culminar em resolução completa, com a cicatrização e reconstituição tecidual ou cura

por fibrose, quando a destruição tecidual é significativa, posterior ou não a formação de

abscessos ou ainda evoluir para a inflamação crônica, mostrado na Figura 2

(GAESTEL et al., 2009; SERHAN et al., 2008).

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Figura 2- Representação esquemática dos possíveis eventos de evolução do processo inflamatório agudo (ROBBINS et al., 2001).

1.1.2 – INFLAMAÇÃO CRÔNICA

A inflamação crônica origina-se posterior a uma inflamação aguda ou a resposta

pode ser crônica quase desde o início (RUËGG, 2006). A transição de aguda para

crônica pode ocorrer devido à persistência do agente lesivo, interferência no processo

de reparo tecidual, desregulação de qualquer etapa acima citada ou resultado de surtos

agudos repetitivos (DA SILVA et al., 2003; ROBBINS et al., 2001). Algumas situações,

além de uma resposta aguda defeituosa, favorecem o estabelecimento da inflamação

crônica, como: exposição prolongada a material não-degradável (sílica) e reações auto-

imunes (ROBBINS et al., 2001).

O processo define-se por uma inflamação ativa, onde a destruição tecidual e a

tentativa de reparo tecidual ocorrem simultaneamente. O foco inflamatório crônico

distingui-se substancialmente dos modelos de inflamação aguda. Os eventos

vasculares são mais discretos, a destruição e o reparo tecidual são caracterizados por

substituição do parênquima por tecido conjuntivo rico em fibroblasto (fibrose),

importante perda da função orgânica tecidual, e proliferação de pequenos vasos

sanguíneos (angiogênese) (DA SILVA et al., 2003; GAESTEL et al., 2009).

|||| 6

Nos eventos celulares crônicos, ao contrário da inflamação aguda, que se

manifesta por infiltrado leucocítico há presença de infiltrados mononucleares, que

incluem macrófagos, linfócitos e plasmócitos, reflexo de persistente estado reacional do

sistema imune.

Os macrófagos são células centrais na inflamação crônica, em virtude da sua

capacidade de secretar o maior número de produtos biologicamente ativos, como fator

de necrose tumoral (TNF-α), IL-1β, óxido nítrico (NO), mediadores lipídicos, fatores de

crescimento entre outros. São células mononucleares fagocíticas que se originam de

um precursor comum na medula óssea (monoblasto) que dará origem aos monócitos

sanguíneos (DA SILVA et al., 2003; ROBBINS et al., 2001). Os monócitos circulantes

de acordo com seu fenótipo e estímulo apropriado podem migrar para o sítio de

inflamação e se diferenciar em macrófagos teciduais residentes ou células dendríticas

(DCs) (CASTELLHEIM et al., 2009; CHO et al., 2008).

Os macrófagos estão estrategicamente dispostos nos tecidos e apesar de

responderem quase tão rápido quanto os neutrófilos possuem uma meia-vida maior e

persistem por mais tempo no sítio inflamatório e não são terminalmente diferenciados o

que propicia a proliferação (CASTELLHEIM et al., 2009). Além da fagocitose, os

macrófagos residentes são responsáveis por iniciar e regular a resposta imune inata, e

consequentemente a liberação de uma gama de mediadores quimioatraindo e ativando

leucócitos e linfócitos para a contenção da inflamação. As citocinas liberadas por

linfócitos T estimulados, principalmente interferon-γ (IFN-γ), são mecanismos

importantes para o acúmulo de macrófagos no local e sua sobrevivência prolongada,

como pode ser visto na Figura 3 (LUSTER et al., 2005) e pela potencialização das

suas funções.

Os linfócitos T são mobilizados nas reações imunológicas mediadas por

anticorpos e células, mas também, por razões desconhecidas na inflamação sem

mediação imune (DA SILVA et al., 2003). As DCs, por serem células profissionais na

apresentação de antígenos migram até os linfonodos onde ativam células T. As células

NKs também são importantes fontes de IFN-γ e dependem de sinais de células

acessórias para se ativarem (CASTELLHEIM et al., 2009).

Os plasmócitos produzem anticorpos direcionados a antígenos persistentes no

local da inflamação (ROBBINS et al., 2001; LUSTER et al., 2005; CASTELLHEIM et al.,

2009).

|||| 7

Assim, a gama de mediadores químicos produzidos por macrófagos, linfócitos e

plasmócitos de maneira prolongada e de forma inapropriada conduz a grave lesão

tecidual, principal característica da inflamação crônica.

Figura 3- Interações do macrófago-linfócito na inflamação crônica (ROBBINS et al., 2001)

1.2– MEDIADORES QUÍMICOS

O repertório altamente complexo de reações que constitui a resposta

inflamatória a agressores, sejam eles infecciosos ou não, resultam da produção de

diversos mediadores químicos. São substâncias exógenas (toxinas bacterianas ou

irritantes químicos) ou endógenas que uma vez produzidas desencadeiam, mantêm e

ampliam diversos processos envolvidos na resposta inflamatória (CARVALHO, 2004;

ROBBINS et al., 2001).

Os mediadores endógenos originam-se do plasma, estando presentes neste sob

formas precursoras que geralmente são ativadas por alterações proteolíticas, ou das

células, sendo normalmente em grânulos intracelulares que precisam ser secretados

ou são sintetizados em resposta a um estímulo (ROBBINS et al., 2001).

A maioria dos mediadores induz seus efeitos ligando-se a receptores específicos

existentes na célula-alvo, porém alguns têm atividade direta como enzimas ou sendo

tóxicos. São altamente regulados e depois de liberados a maioria destes apresenta

rápida decadência (ex. metabólitos do ácido araquidônico), ou inativação por enzimas

ou são eliminados de outra forma (remoção por antioxidantes). Deste modo, o sistema

de verificação e balanços na regulação das ações destes mediadores é imprescindível

(RANG et al., 2007).

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Os mediadores plasmáticos compreendem quatro sistemas enzimáticos que se

interrelacionam para mediar muitos efeitos na inflamação. Eles incluem o sistema

complemento, sistema de coagulação, sistema fibrinolítico e sistema das cininas. Estes

sistemas são regulados através de vários mecanismos cruzados (MARKIEWSKI et al.,

2007).

Os mediadores endógenos celulares pré-formados compreendem as aminas

vasoativas: histamina e serotonina, sendo ambas amplamente distribuídas nos tecidos.

Os mastócitos são a maior fonte de histamina, seguida por basófilos e plaquetas. A

serotonina é um segundo mediador vasoativo que induz efeitos semelhantes à

histamina, sendo encontrados em grânulos densos plaquetários (ROBBINS et al., 2001;

RANG et al., 2007).

Outros mediadores celulares, como as quimiocinas, citocinas, óxido nítrico e

mediadores lipídicos, possuem grande destaque no contexto inflamatório,

principalmente devido a sua expressão significativa nos distintos processos

patofisiológicos. O mecanismo de ação isolado ou em conjunto destes mediadores vem

sendo cada vez mais estudado na tentativa de se estabelecer tratamentos mais

eficazes. A seguir são detalhados os mediadores químicos que serão abordados neste

trabalho.

1.2.1– ÓXIDO NÍTRICO

Em 1818, Prout reportou grandes quantias de nitrato na urina de um paciente

febril. O estudo sobre este achado ficou pausado durante 163 anos. Em 1981,

Tannenbaum observou em voluntários humanos que a excreção de óxidos de

nitrogênio excedia a entrada deles no organismo (GREEN et al., 1981). Trabalhos com

camundongos infectados com Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette-Guérin) ou

tratados com lipopolissacarídeo (LPS) realizados por Stuehr e Marletta identificaram

uma célula particular responsável pela produção de NO, o macrófago ativado

(BOGDAN et al., 2001).

Quando óxido nítrico formalmente adentrou no campo imunológico, entre 1985 e

1990, seu papel no sistema imune foi simplesmente definido: NO é um produto de

macrófagos ativados por citocinas, compostos microbianos ou ambos, derivado do

aminoácido L-arginina pela atividade enzimática da óxido nítrico sintase induzida,

também conhecida por iNOS ou NOS2 (MACMICKING et al., 1997).

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Três isoformas de NOS distintas foram caracterizadas. A NOS neuronal (nNOS,

NOS I) é expressa predominantemente em neurônios no cérebro e sistema nervoso

periférico. A NOS endotelial (eNOS, NOS III) é principalmente expressa em células

endoteliais. Ambos nNOS e eNOS são constitutivamente expressas e cálcio-

dependente (KORHONEN et al., 2005; MACMICKING et al., 1997).

A terceira isoforma é a NOS induzida (iNOS, NOS II) mencionada anteriormente.

A exposição a produtos microbianos, como LPS, dsRNA ou citocinas pró-inflamatórias

IL-1, TNF-α e IFN-γ induz a expressão do gene da iNOS em várias células

inflamatórias. Esta isoforma de NOS é cálcio-independente e responsável pela

produção de níveis altos de NO durante períodos prolongados. A NOS ativa é

responsável pela conversão de L-arginina em NO e L-citrulina requerendo NADPH e O2

como co-substrato (KORHONEN et al., 2005).

O NO é produzido por células dendríticas, NKs, mastócitos, monócitos,

macrófagos, células de Kupffer, eosinófilos e neutrófilos e também por outras células

envolvidas na resposta imune como células endoteliais, células epiteliais, fibroblastos,

queratinócitos, condrócitos, hepatócitos, células mesangiais e células de Schwan

(BOGDAN et al., 2001). O NO não atua por meio de receptores, a especificidade do

alvo celular depende de sua concentração, sua reatividade química e da proximidade

com as células-alvo (COLEMAN et al.,2001).

O NO tem vários papéis no sistema imune, sendo um agente tóxico para

organismos infecciosos, indutor ou supressor de apoptose, imunoregulador

principalmente pró-inflamatório, vasoregulador, na agregação plaquetária e também na

neurotransmissão (BOGDAN et al., 2001; AZADMEHR et al., 2009). É um potente

vasodilatador, aumentando a permeabilidade vascular e a produção de

prostaglandinas, regula o recrutamento de leucócitos e exerce ação citotóxica contra

microrganismos. A expressão aumentada de iNOS tem sido observada em pacientes

com infecção do trato urinário, tuberculose, malária, sepse e em tumores, onde as altas

concentrações de NO são responsáveis pela angiogênese, hiperpermeabilidade

vascular e consequentemente desenvolvimento do tumor (GUZIK et al., 2003). Existe

um tênue limite de concentração tissular entre a não-toxicidade às células do

hospedeiro e a toxicidade necessária para ação antimicrobicida. (GUZIK et al., 2003).

|||| 10

1.2.2– METABÓLITOS DO ÁCIDO ARAQUIDÔNICO

O ácido araquidônico (AA) foi colocado em foco como importante fonte de

mediadores lipídicos a partir de duas observações realizadas em 1930. Primeiro, a

constatação de que alguns ácidos graxos, entre eles AA, são essenciais para o

crescimento, reprodução e manutenção da integridade de certos tecidos e órgãos e

posteriormente, a vinculação das atividades vasodepressora e contratora da fibra

muscular lisa exibida pela prostaglandina (DA SILVA et al., 2003). O AA ou ácido

eicosatetraenóico é um ácido graxo essencial com 20 átomos de carbono embebidos

na membrana celular como fosfolipídeos esterificados.

Em resposta a uma variedade de estímulos, os AA são liberados da membrana a

partir da atuação das fosfolipases secretadas (sPLA2) ou citoplasmáticas (cPLA2), as

fosfolipases C também podem estar associadas a estas funções, porém, em menor

grau (RAO et al., 2008). O ácido araquidônico livre pode ser metabolizado a vários

mediadores lipídicos conhecidos coletivamente como eicosanóides através da via das

ciclooxigenases e lipoxigenases (Figura 4) (RANG et al., 2007).

Figura 4- Diagrama resumido dos mediadores derivados de fosfolipídios e suas ações, com os locais de ação de agentes anti-inflamatórios (RANG et al., 2007).

|||| 11

A via das ciclooxigenases é composta por duas enzimas: COX-1, responsável

pela síntese basal de protaglandinas (PGs) envolvidas na manutenção de funções

homeostáticas enquanto a COX-2 é importante na síntese de PGs induzida por

estímulos inflamatórios e em alguns tecidos, como o renal e o cardíaco já foi observado

a expressão constitutiva de COX-2 relacionado intimamente com os efeitos adversos

ocasionados pelos AINES seletivos (RAO et al., 2008).

Da ação destas enzimas também resulta a síntese de tromboxanos. A via das

lipooxigenases está relacionada à produção de leucotrienos. O LTB4 é o principal

leucotrieno envolvido no processo inflamatório. Exerce potente atividade quimiotática

para leucócitos, eosinófilos e monócitos, promovendo a migração destes tipos celulares

para o local afetado (COUTINHO et al., 2009).

Uma nova isoforma foi acrescida, por Simmons, as ciclooxigenases em 2002: a

COX-3, num estudo em caninos no qual a COX-3 apresentava-se como uma variante

do splicing alternativo de COX-1, entretanto estudos a fim de se obter maiores

informações a respeito de sua função e modulação ainda estão sendo desenvolvidos

(RAO et al., 2008).

1.2.2.1- COX-2 E PROSTAGLANDINAS

A primeira preparação purificada da enzima COX foi relatada em 1976

(MIYAMOTO et al., 1976). Mais de uma década depois, em 1990, Needleman,

Simmons e Herschman, relataram uma isoforma induzida chamada nos dias de hoje de

COX-2. Ambas isoformas catalisam uma reação de ciclooxigenase na qual o substrato

AA forma um endoperóxido cíclico, a prostaglandina G2 que por ser altamente instável,

logo é convertida em prostaglandina H2, também instável. As isoformas COX-1 e COX-

2 compartilham 60-65% de similaridades em sequências dentro da mesma espécie e

aproximadamente 85-90% entre espécies diferentes (RAO et al., 2008).

A partir da PGH2, os prostanóides mais importantes formados são a PGE2,

PGD2, PGF2α, PGI2 (prostaciclina) e tromboxano A2. A prostaciclina possui ação

vasodilatadora, além de potencializar os efeitos quimiotáticos e aumentar a

permeabilidade de outros mediadores. As prostaglandinas PGE2, PGD2 e PGF2α

também são vasodilatadoras, exarcebam o edema além de estarem envolvidas na

patogenia da dor e da febre (FOSSLIEN et al., 2001).

Tem sido mostrado que a COX-2 é superexpressa em 40% de adenomas

coloretais e em 80% de adenocarcinomas (EISINGER et al., 2007) e relaciona-se

|||| 12

intimamente com a invasão e metástase tumoral (LI, 2005). A expressão de COX-2

está associada com muitos aspectos da tumorogênese e suas contribuições incluem:

no aumento da expressão do fator de crescimento pró-angiogênico-VEGF; na produção

aumentada de TXA2, PGE2 e PGI2, os quais estimulam diretamente a migração celular

e indução da angiogênese e também na potencial inibição da apoptose endotelial pela

via Akt ou Bcl-2 (GATELY, 2000).

1.2.3– CITOCINAS

As citocinas são peptídeos de importância substancial na imunidade tecidual

produzidos por vários tipos celulares (principalmente linfócitos e macrófagos ativados).

Nos humanos saudáveis são produzidos em níveis constitutivos e atuam de maneira

autócrina, parácrina e sistêmica (CASTELLHEIM et al., 2009). As citocinas que mais se

destacam no contexto inflamatório são o TNF-α, IL-1, IL-8 e IFN-γ.

O TNF-α e a IL-1 compartilham várias propriedades biológicas. Ambos são

produzidos por macrófagos ativados e a IL-1 por vários outros tipos celulares e seus

efeitos podem atuar tanto no local da infecção como sistemicamente, ativando as

células alvo a produção de inúmeros mediadores inflamatórios. Atuam também

estimulando a hematopoiese, promovem crescimento e diferenciação de células B e

apresentação de antígenos a células T (BALKWILL et al., 2001).

Suas funções mais importantes são os efeitos locais sobre o endotélio e as

reações sistêmicas de fase aguda (febre). O TNF-α também causa agregação e

ativação de neutrófilos e a liberação de enzimas proteolíticas contribuindo para a lesão

tecidual, além de aumentar a quantidade de citocinas secundárias e mediadores

lipídicos como as prostaciclinas. A expressão de TNF-α tem sido detectada em vários

cânceres humanos incluindo os de mama, próstata, coloretal, linfomas e leucemias

(KUNDU et al., 2008).

1.3 – MANIFESTAÇÕES SITÊMICAS DA INFLAMAÇÃO

O processo inflamatório necessita de forte regulação em cada etapa e o mínimo

descontrole na persistência infecciosa, a baixa capacidade homeostática do hospedeiro

ou ampla magnitude do agente agressor desencadeia manifestações sistêmicas que

conduzem a progressão exarcebada do quadro inflamatório. São estes quadros

inflamatórios deletérios que tornam a inflamação um objeto de estudo importante e

ressaltam a busca por métodos de controle do processo.

|||| 13

A febre é uma das manifestações sistêmicas mais destacadas e está

intimamente relacionada a infecções persistentes, ocorre devido à interação

prolongada e intensa de citocinas como TNF-α e IL-1β e de PGE2 com receptores

vasculares do centro termorregulador do hipotálamo. A dor também ocorre por

intermédio do TNF-α, IL-1β e da bradicinina ao interagirem com nocireceptores. As

dores extremas ocorrem pela interação excessiva de prostaglandinas com os mesmos

(CHO et al., 2008; ROBBINS et al., 2001). Muitas doenças auto-imunes com quadros

febris e dores intensas podem ser destacadas: Síndrome de Muckle-Wells, Síndrome

da Hiper-Imunoglobulina D, Síndrome Multi-inflamatória Neonatal (GAESTEL et al.,

2009).

A produção excessiva de TNF-α e IL-1β também induz a leucocitose devido à

liberação acelerada de células pós-mitóticas da medula óssea, porém em algumas

infecções onde o sistema imune encontra-se fortemente sobrecarregado ocorre

leucopenia, por exemplo, febre tifóide (ROBBINS et al., 2001).

1.4- INFLAMAÇÃO RELACIONADA À IMUNOPATOLOGIA NA

TUBERCULOSE

Muitas patologias procedem ou são acompanhadas de um processo inflamatório

agudo e/ou crônico, com elevada produção de mediadores químicos de forma a

ocasionar lesão tecidual, disfunção de múltiplos órgãos e em último caso, o óbito

(SKIPPEN et al., 2008). Anormalidades associadas com inflamação são observadas

em arteriosclerose, doença de Alzheimer, câncer e tuberculose (GAESTEL et al.,

2009).

Um terço da população mundial está infectado pela Mycobacterium tuberculosis

(MTb), mas somente 10% destes desenvolvem a doença. O Brasil é o 14º país em

número de notificações (114.000 casos novos) (WHO, 2009), tendo a região sudeste o

maior número de casos (49%) e o Estado do Rio de Janeiro é um dos mais atingidos

(80-100 casos/100.000 habitantes) (http://www.cve.saude.sp.gov.br).

A tuberculose é causada por bacilos bacterianos álcool-ácido resistentes. O

principal agente etiológico da tuberculose humana é o M. tuberculosis. O crescimento

dos casos de tuberculose ocorre devido ao aumento dos casos de co-infecção com

HIV, o aparecimento de cepas resistentes e o índice de migração da população para o

exterior (NUNN et al., 2005).

|||| 14

O Mycobacterium bovis é responsável pela tuberculose bovina, uma zoonose de

caráter inflamatório, infecto-contagiosa, cujo hospedeiro primário é o bovino. Também é

patogênica para humanos (10-18% de todos os casos), produzindo lesões semelhantes

à doença induzida pelo M. tuberculosis e manifestações extrapulmonares (KOLDITZ et

al., 2010).

A resposta imune contra micobactérias é predominantemente mediada por

células. A contaminação ocorre principalmente através da inalação de partículas

infecciosas em suspensão no aerossol. No interior dos pulmões, os bacilos se alojam

no trato respiratório, onde entram em contato com as células do sistema imune inato,

infectando os macrófagos e as células dendríticas alveolares. Após a infecção o bacilo

pode ser eliminado, entrar em estado de latência ou desencadear uma infecção

disseminada evoluindo para uma doença aguda, podendo levar o indivíduo à morte,

principalmente nos casos de queda imunológica (DHEDA, et al., 2010).

A entrada do patógeno na célula envolve processos de interações específicas

receptor-ligante, tais como receptores: Toll-like 2 (TLR2), CD14, receptor de manose,

receptores scavenger e receptores de complemento CR1, CR2 e CR4, tendo início o

processo de fagocitose (GLICKMAN AND JACOBS, 2001).

As micobactérias, para sobreviver modificam a composição do fagossoma,

evitando a fusão com o lisossoma. Após a infecção inicial, os macrófagos alveolares

liberam citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α para recrutamento

de linfócitos e monócitos para os pulmões. A subpopulação de células Th17 vem

ganhando importância na resposta contra micobactérias, através da estimulação pela

IL-17, da secreção das quimiocinas CXCL1 e CXCL2, que participam do recrutamento

de neutrófilos para o sítio da infecção (KHADER AND COOPER, 2008).

As células T CD4+ ativam os macrófagos através da produção de IFN-γ, gerando

uma resposta granulomatosa, além de promover o aumento da resposta microbicida

nos macrófagos (reativos de oxigênio e nitrogênio) (JAYACHANDRAN et al., 2007). A

formação de granulomas na fase crônica da infecção pulmonar contribui para manter o

crescimento micobacteriano estável e prevenir o crescimento latente do bacilo, porém

os granulomas circunscritos ou até mesmo difusos comprometem o órgão, devido à

ampla área necrosada, com formação de cavidades, levando o indivíduo à morte por

disfunção pulmonar. O TNF-α exerce um papel central na formação e manutenção do

granuloma, sendo considerado tanto protetor como patológico (Figura 5) (LYADOVA,

et al., 2010).

|||| 15

Figura 5- Principais características da tuberculose: da infecção a defesa (adaptado de

KAUFMAMNN, 2001).

Em geral, a produção destes mediadores pro-inflamatórios são essenciais para o

recrutamento de células ao sítio de infecção, formação e manutenção do granuloma e

para resposta inflamatória a micobactéria. Para tal, um rigoroso controle da resposta

inflamatória é necessário para prevenir a imunopatologia, já que a ativação

inapropriada e excessiva do sistema imune e a produção ampliada de mediadores

químicos conduzem a severidade da inflamação e consequentemente da tuberculose

(GARLANDA et al., 2007).

O entendimento da patogênese na tuberculose depende da probabilidade e da

intensidade de transmissão aerogênica do M. tuberculosis a uma pessoa num espaço

aéreo comum, da duração da exposição, tosse, expectoração, fatores sócio-

econômicos e genéticos relacionados ao hospedeiro e características relacionadas com

a cepa micobacteriana, tais como: virulência e a taxa de replicação bacteriana no

pulmão que correlaciona com o dano tecidual (pneumonia) e mortalidade (DHEDA, et

al., 2010; LÓPEZ et al., 2003).

|||| 16

Resultados de nosso grupo têm mostrado que a inflamação leva a um aumento

da gravidade da tuberculose em camundongos C57Bl/6, levando o animal a morte,

devido ao aumento de infiltrado celular, necrose tecidual e consequentemente a

disfunção pulmonar, especialmente para infecções por M. bovis e M. tuberculosis,

diferentemente do que ocorre para M. avium (AMARAL, 2010).

Estudos recentes têm correlacionado à variabilidade genética das cepas de M.

tuberculosis e M. bovis com a virulência e imunopatologia ocasionada. Camundongos

BALB/c infectados com M. bovis, proveniente de isolados clínicos tanto de gado quanto

humano, mostraram-se letais em 28 dias de infecção, apresentando pneumonia súbita

com necrose extensiva, o que está associado à rápida e alta expressão de IFN-γ e

iNOS (LÉON et al., 2009). Outros autores estudaram a imunopatologia ocasionada por

diferentes cepas da família Beijing (MTb) e observaram alta patogenicidade para

modelo murino utilizado enquanto outras famílias micobacterianas mostraram

mortalidade reduzida. A expressão de genes relacionados com a inflamação (IL-1β, IL-

6, TNF-α, CXCL2 e iNOS) aumentou em camundongos BALB/c, resultando em uma

abundância relativa desses fatores nos pulmões (LÉON et al., 2009) e no baço

(GARLANDA et al., 2007).

1.5- TRATAMENTO CONVENCIONAL E SUAS LIMITAÇÕES

1.5.1- FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS

Os fármacos anti-inflamatórios são capazes de interferir no processo

fisiopatológico da inflamação, objetivando minimizar os danos teciduais e proporcionar

maior conforto ao paciente. Os principais agentes anti-inflamatórios são representados

pelos glicocorticóides e pelos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs).

1.5.1.1- GLICOCORTICÓIDES

A ação anti-inflamatória de hormônios glicocorticóides foi descoberta por Hench

a mais de 50 anos, através da observação de sintomas mais brandos da artrite

reumatóide e icterícia em grávidas com artrite reumatóide, situações nas quais há

aumento na produção de esteróides no corpo. Assim, passou-se a utilizar doses

maiores de cortisona em pacientes com artrite reumatóide e no ano de 1950, Hench foi

premiado com o Nobel em fisiologia e medicina. Os glicocorticóides sintéticos foram

|||| 17

desenvolvidos apesar dos efeitos colaterais ainda mal relatados se tornando a base da

terapia anti-inflamatória e imunossupressora (SAKLATVALA et al., 2002).

Os glicocorticóides inibem a expressão de muitos genes envolvidos na resposta

inflamatória e imune. Isto inclui citocinas, quimiocinas, receptores de superfície celular,

moléculas de adesão, fatores de crescimento vascular, proteinases e enzimas como a

COX-2 e iNOS (BARNES et al., 2006). A ação anti-inflamatória dos glicocorticoides

deve-se, principalmente, à inibição da transcrição do gene da enzima COX-2 e à

indução da proteína lipocortina, inibidora da enzima fosfolipase A2, além de reduzirem

os níveis de produção de TNF-α e IL-1 (RANG et al., 2007).

Os corticosteróides difundem-se rapidamente pelas membranas celulares e se

ligam a receptores de glicocorticóides (GRs) no citoplasma. Estes receptores

citoplasmáticos são normalmente ligados a proteínas, conhecidas como chaperonas.

Uma vez que os corticosteróides ligam-se aos GRs, mudanças na estrutura do receptor

resultam na dissociação de chaperona, expondo os sinais de localização nuclear no

GR. Esse evento resulta no transporte do complexo GR-corticosteróide ao núcleo onde

se liga a regiões específicas do DNA conhecidas como promotores de genes

responsivos a corticosteróides conduzindo a repressão de genes inflamatórios ou a

expressão de outros genes que colaborem com este processo (Figura 6) (ADCOCK et

al., 2006; RANG et al., 2007).

Figura 6- Mecanismo de ação dos anti-inflamatórios esteroidais (glicocorticóides).

Genes inflamatórios são ativados através de estímulos que resultam em ativação da proteína

IKK 2, o qual ativa o fator de transcrição nuclear κB (NF-κB), permitindo sua translocação

para o núcleo celular. Após isto, NF-κB se liga a sítios de reconhecimento específico κB e

também a co-ativadores que possuem atividade histona acetiltransferase intrínseca (HAT).

Isto resulta na acetilação das histonas e na expressão de genes inflamatórios. Os

|||| 18

glicocorticoides se ligam a receptores no citoplasma, translocam-se para o núcleo onde

inibem HAT diretamente e recrutam histonas desacetilases, que revertem a acetilação,

suprimindo a expressão gênica inflamatória (BARNES et al., 2006) .

O uso de corticóides é intenso na terapia de doenças auto-imunes e na

prevenção e/ou tratamento da rejeição a transplantes. Embora a terapia com

corticosteróides inaláveis seja efetuada para asma, os efeitos colaterais sistêmicos são

severos principalmente em crianças. A distribuição de corticosteróides inalados em

pacientes asmáticos ocorre principalmente nas vias aéreas de maior calibre, como a

inflamação é preferencialmente localizada em vias aéreas de menor calibre, em

pacientes severos, os corticosteróides não suprimem adequadamente a inflamação

(BARNES et al., 2006). Como exemplo de glicocorticóide pode-se destacar a

hidrocortisona e dexametasona (RANG et al., 2007).

Figura 7- Estrutura química dos glicocorticóides, hidrocortisona e dexametasona (COUTINHO et al., 2009).

Os efeitos adversos severos dos glicocorticóides limitam seu uso, destacam-se

toxicidade elevada, osteoporose, diabetes, hipertensão, cataratas, ressecamento da

pele, e a característica aparência da síndrome de Cushing. Eles também suprimem o

eixo adrenal-pituitário-hipotalâmico e seu crescimento conjunto (SAKLATVALA et al.,

2002).

A resistência aos efeitos terapêuticos dos corticosteróides é vista em pacientes

com doenças inflamatórias não-pulmonares e doenças auto-imunes como artrite

reumatóide e doenças inflamatórias intestinais.

Os principais fármacos utilizados no tratamento dos sintomas da inflamação são

os anti-inflamatórios não-esteroidais.

|||| 19

1.5.1.2- ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO-ESTEROIDAIS (AINES)

Os AINES constituem uma classe importante de fármacos com aplicações

terapêuticas que se expandem por vários séculos.

Após o século 17, o composto ativo da salicina das cascas do tronco do

salgueiro (Salix alba, Salicaceae) foi identificado na Europa e a Companhia Kolbe na

Alemanha iniciou a produção em massa do ácido salicílico em 1860. O ácido

acetilsalicílico, a forma mais palatável do ácido salicílico foi introduzida comercialmente

no mercado pela Bayer em 1899, deste modo a Aspirina® é o AINE mais antigo (RAO

et al., 2008).

Porém, não se conhecia o mecanismo de ação de anti-inflamatórios e

analgésicos como a aspirina e indometacina, o que permaneceu até o início de 1960.

Em 1970, John Vane elucidou o mecanismo de ação da Aspirina® e outras drogas anti-

inflamatórias não esteroidais (AINES). O sucesso da terapia dos AINES nas patologias

inflamatórias como artrite reumatóide e osteoartrite validou a inibição da COX

satisfatoriamente, porém a toxicidade e os efeitos colaterais drásticos difundidos pelos

AINES provaram ser uma desvantagem durante terapias em longo prazo (RAO et al.,

2008; RANG et al., 2007).

Os AINES incluem uma diversidade de agentes e em geral, todos os seus

efeitos estão relacionados com a inibição da ação da COX na produção de

protaglandinas e tromboxanos (CARVALHO, 2004; RANG et al., 2007).

Os AINES tradicionais atuam de forma não-seletiva inibindo ambas as isoformas

de COX e destacam-se neste grupo: a Aspirina®, a indometacina, o piroxicam e o

ibuprofeno.

Figura 8- Estrutura química de AINEs não-seletivos com amplo uso na terapêutica atual (COUTINHO et al., 2009).

|||| 20

Estes apresentam diversos efeitos colaterais além da toxicidade inerente,

principalmente por inibirem de modo significativo ou moderado a ação da COX-1. O

efeito adverso mais importante são os distúrbios gastrointestinais (dispepsia, diarréia,

náusea e vômitos) e 1 em cada 5 usuários crônicos tendem a produzir ulceração

gástrica e duodenal (RAO et al., 2008; RANG et al., 2007), devido a inibição da

produção de prostaglandinas gastroprotetoras (PGE2 e PGI2) envolvidas na via da

COX-1 (RAO et al., 2008). As lesões cutâneas (erupções leves a fotossensibilidade)

são o segundo efeito mais destacado e outros como efeitos renais adversos, distúrbios

medulares e hepáticos ocorrem em menor freqüência (RANG et al., 2007).

Deste modo, a comunidade científica e as companhias farmacêuticas focaram

seus esforços na busca de inibidores seletivos para COX-2, com menores efeitos

colaterais adversos.

Em 1999, G.D. Searle e Pfizer lançou o primeiro inibidor de COX-2 seletivo: o

celecoxibe (Celebrex®). Seguido pelo rofecoxibe (Vioxx®) lançado pela Merck. Em

pouco tempo os coxibes (celecoxibe e rofecoxibe) alcançaram grande disseminação de

uso excedendo um bilhão de dólares em 15 meses nos Estados Unidos (FITZGERALD

et al., 2001). Outros fármacos também mostram ser mais seletivos para COX-2 do que

para COX-1, como por exemplo, nimesulida e etodolaco (Figura 9) (COUTINHO et al.,

2009).

Figura 9- Estrutura química de AINEs seletivos a COX-2 (RAO et al., 2008).

Apesar do sucesso inicial logo após o lançamento dos inibidores seletivos de

COX-2, efeitos adversos cardiovasculares e renais têm sido relatados e em altas

|||| 21

doses, efeitos gastrointestinais. Estudos adicionais demonstraram que os inibidores

seletivos de COX-2 podem romper o equilíbrio natural entre tromboxano A2 pró-

trombótico e prostaciclina anti-trobótica aumentando potencialmente a possibilidade de

um evento trombótico cardiovascular (SOLOMON et al., 2004). Estes efeitos adversos

observados ocorrem devido a inibição da produção constitutiva de COX-2 em alguns

tecidos (RAO et al., 2008).

Em setembro de 2004, a Merck retirou do mercado mundial o Vioxx® e em abril

de 2005, o estudo dos coxibes conduziu a conclusão do Comitê norte-americano sobre

os riscos cardiovasculares e a suspensão do Bextra® (valdecoxibe) da Pfizer. O

Celecoxibe permaneceu no mercado comercializado somente com indicação tarja preta

e os efeitos cardiovasculares adversos explicitados na bula (FITZGERALD et al., 2001).

No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária intensificou o controle

sobre a venda dos AINEs seletivos para COX-2, publicando a inclusão de seus

fármacos na lista de substâncias sob controle especial (Lista C1 da Portaria 344/98) -

Resolução RDC nº. 79, de 04 de novembro de 2008, assim os AINES seletivos só

podem ser vendidos com retenção da receita médica pelo estabelecimento

farmacêutico (COUTINHO et al., 2009).

Devido a grande parte dos AINEs disponíveis no mercado possuírem efeitos

indesejáveis significativos, a necessidade de novos medicamentos anti-inflamatórios

contribui para o avanço da pesquisa por novas moléculas, mais seguras, eficazes e

com menos efeitos colaterais.

1.5.2- TRATAMENTO DA TUBERCULOSE

O tratamento convencional da tuberculose envolve o uso de cinco fármacos

padrões ou de primeira-linha, os antimicrobianos: estreptomicina, rifampicina,

etambutol, isoniazida e pirazinamida. O tratamento leva pelo menos de 6 a 9 meses o

que na maioria das vezes conduz a não adesão do paciente ao tratamento ou

desistência antes deste período, além da toxidez significativa das drogas. Nos casos de

má administração ou abandono do tratamento, pode-se desenvolver resistência aos

fármacos utilizados e consequentemente tuberculose multi-droga resistente (MDR)

(ZHANG et al., 2006).

Neste caso há resistência à isoniazida e rifampicina, com ou sem resistência a

outras drogas; sendo utilizadas drogas de segunda-linha, injetáveis, capreomicina,

canamicina e amicacina, mais caras, com mais efeitos colaterais, o período de uso

|||| 22

prolongado e geralmente com menor efetividade em pacientes com HIV (Figura 10)

(JANIN, 2007).

Figura 10- Estrutura química de fármacos antimicobacterianos convencionais. (A) Fármacos padrões ou de primeira-linha e (B) fármacos injetáveis ou de segunda-linha (adaptado de JANIN, 2007).

A proteção efetuada atualmente é através da vacina BCG desenvolvida por

Albert Calmette e Camille Guérin e o nível de proteção conferido é variável, de acordo

com diversidade gênica das populações vacinadas e a qualidade das cepas de BCG.

Assim, previne a forma disseminada entre crianças o que não ocorre para adultos ou

em casos de reinfecção. Além disso, a vacina não reduz a taxa de transmissão do

bacilo (MAARTENS et al., 2007).

A chance de sucesso na geração de novos fármacos em 2010 foi fracamente

observada e os gastos estimados em mais de US$ 400 milhões (MAARTENS et al.,

2007). Vale a pena ressaltar que nenhum novo fármaco antituberculose foi introduzido

no mercado nos últimos 40 anos (JANIN, 2007).

No que diz respeito a M. bovis, no Brasil não existe um programa específico para

o controle da tuberculose bovina; essa atividade está inserida num programa genérico

denominado Programa de Controle das Doenças Animais, porém a dimensão do

rebanho brasileiro e os abatedouros ilegais dificultam a contenção da disseminação

para humanos (http://www.cve.saude.sp.gov.br).

|||| 23

Os recentes estudos do mecanismo imunológico da patogenia na tuberculose,

os índices de mortalidade, a rápida disseminação da doença e o aumento no número

de pacientes extensivamente resistentes ao tratamento convencional são essenciais

para o incentivo à busca por novos imunoterápicos contra tuberculose.

O interesse farmacológico consiste em novos fármacos ou moléculas que

tenham ação em cepas MDR, possuam baixa toxidez, menor duração do tratamento,

mecanismo micobactericida rápido, sejam capazes de penetrar na célula hospedeira e

exercer atividade antimicobateriana no ambiente intracelular e que possam ter

administração por via oral, ao contrário de alguns fármacos injetáveis atualmente em

uso como a estreptomicina, a canamicina e a capreomicina (JANIN, 2007). Além disso,

fármacos ou moléculas naturais com características anti-inflamatórias e que sejam

microbicidas poderão atuar paralelamente tanto na contenção do patógeno quanto na

resposta inflamatória intensa observada na fase aguda permitindo maior sobrevida para

o paciente.

1.6- SUBSTÂNCIAS DE ORIGEM VEGETAL COMO FONTE DE NOVOS

FÁRMACOS

Registros fósseis datam o uso de plantas como medicamentos desde o período

mediano do Paleolítico, 60.000 mil anos atrás. Observando o comportamento instintivo

dos animais, as plantas eram utilizadas no tratamento das enfermidades mesmo antes

de se conhecerem as causas das enfermidades (VERPOORTE, 2000).

O estudo das plantas como fonte de agentes terapêuticos visa: 1) isolar

compostos bioativos, por exemplo, digoxina, morfina, vinblastina e vincristina; 2)

produzir compostos bioativos por semi-síntese para a obtenção de atividades mais

eficazes e menos tóxicas, por exemplo, metformina, oxicodon (e outros analgésicos),

taxotere, e teniposideo baseados respectivamente em galegina, morfina, taxol,

podofilotoxina e 3) usar toda a planta ou parte dela como um fitoterápico, por exemplo,

Ginkgo biloba (FABRICANT, 2001).

A Organização de Saúde Mundial, estima que cerca de 65% da população

mundial incorpora aos cuidados médicos o uso de plantas da medicina tradicional (uso

etnobotânico). O estudo etnobotânico ao longo dos anos permitiu associar plantas

altamente diversificadas a atividades biológicas a partir da observação, descrição e

investigação experimental, baseada principalmente na botânica, química, bioquímica e

|||| 24

farmacologia o que contribuiu amplamente para a descoberta de produtos naturais com

atividade biológica (FARNSWORTH et al., 1994).

Estima-se que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica atual foram

desenvolvidos a partir de fontes naturais: 25% de plantas, 13% de micro-organismos e

3% de animais (COUTINHO et al., 2009) e se forem considerados as 250.000 espécies

de plantas estimadas (angiospermas e gminospermas) somente 6% tiveram atividade

biológica estudada (VERPOORTE, 2000).

Os produtos manufaturados de plantas medicinais são altamente

comercializáveis e as estimativas de lucro nos países desenvolvidos são de 60 a 80

bilhões de dólares (TALHOUK et al., 2007).

Substâncias de origem vegetal, pertencentes às mais diversas classes químicas,

possuem atividade anti-inflamatória comprovada cientificamente. Dentre elas,

destacam-se terpenos (TOLSTIKOVA et al., 2006; SIMÕES et al., 2004), taninos

(ZHAO et al., 2008), alcalóides (RAMSEWAK et al., 1999; SIMÕES et al., 2004),

lignanas (BAN et al., 2002), saponinas (SIMÕES et al., 2004); cumarinas (SÍLVAN et

al., 1996) e flavonóides (GUERRA et al., 2006). Um exemplo recente é o anti-

inflamatório fitoterápico Acheflan®, indicado no tratamento local de processos

inflamatórios e o Daflon 500 mg®, medicamento composto por fração flavonoídica

purificada que apresenta ação venotônica e vasoprotetora (COUTINHO et al., 2009).

Estudos recentes têm evidenciado a atividade antimicobacteriana de

substâncias de origem vegetal, tais como: β-clorovinil e seus análogos na inibição da

produção de TNF-α e IL-6 como também moderada atividade micobacteriana

(BANDGAR, et al., 2010); análogos de licochalcona A exibiram de 90-92% de atividade

na inibição do crescimento em MTb H37Rv (NOWAKOWSKA, 2007), M. bovis e M.

avium (OKUNADE, et al., 2004) e extratos etanólicos de Psychotria stachyoides

mostraram tanto atividade anti-inflamatória inibindo a produção de NO quanto atividade

antimicobacteriana, inibindo o crescimento de M. bovis BCG (MORAES et al., 2010).

No Brasil, calcula-se que existam cerca de 120.000 espécies de plantas

distribuídas por áreas ainda conservadas de vegetação e reservas privadas em

diferentes regiões do país, destacando-se: Pantanal Matogrossense, Floresta

Amazônica e Mata Atlântica. Nestas são encontradas um vasto número de espécies

vegetais utilizadas para fins medicinais sem comprovação científica e muitas outras

não utilizadas a serem pesquisadas (DALMOLIN, 2009).

|||| 25

O estudo das atividades farmacológicas das espécies vegetais ocorrentes no

Brasil vem divulgando diferentes extratos, frações e classes químicas com grande

potencial terapêutico, o que representa uma alternativa promissora diante dos

processos inflamatórios e doenças a eles relacionados, além de validar seu uso

etnobotânico.

Neste trabalho, a partir de um screening de 26 extratos vegetais utilizando como

modelo macrófagos RAW 264.7 estimulados por LPS e tratados as espécies vegetais

Vochysia divergens e Cecropia pachystachya se destacaram, e por esta razão foram

enfocadas abaixo.

1.6.1- A ESPÉCIE Vochysia divergens Pohl E ESPÉCIES AFINS

A espécie Vochysia divergens foi descrita por Pohl em 1831, sendo conhecida

popularmente como cambará. Esta espécie pertence à família Vochysiaceae que

possui 6 gêneros e cerca de 200 espécies distribuídas pela América tropical e oeste

da África. O gênero Vochysia é o maior da família Vochysiaceae compreendendo 105

espécies (MAYWORM et al., 2000; WENIGER et al., 2005). Encontra-se largamente

distribuído pela América tropical (México ao Brasil) (GUARIM NETO, 2006).

O fato de V.divergens ser uma espécie encontrada em três diferentes biomas do

Brasil: o Cerrado, a Floresta Amazônica e o Pantanal, conseguindo neste último bioma

expandir-se territorialmente inclusive em condições em que a inundação se mantém

por um período relativamente longo, desperta grande interesse por parte dos

pesquisadores desde aspectos ecofisiológicos até suas diversas atribuições

terapêuticas na medicina popular (DA CUNHA et al., 2007).

Cambarazais são formações florestais monodominantes de Vochysia divergens

Pohl. Apresentam características ecológicas e fisiológicas que favorecem seu rápido

espalhamento e dominância em campos sazonalmente inundados, ocupando cerca de

3,1% da área do Pantanal matogrossense. Sua alta taxa de crescimento sob intensa

luminosidade, sua tolerância à condição de prolongado alagamento, a capacidade de

suas plântulas para manter suas folhas intactas embaixo da superfície da água e a

grande produção de sementes espalhadas pelo vento e água são algumas delas

(DALMOLIN, 2009).

O cambará é uma árvore grande e frondosa, suas folhas, com aproximadamente

8 a 12 cm de comprimento e 3 a 4 cm de largura, são de tonalidade amarelo-

esverdeada. Possui inflorescências terminais com numerosas flores amarelas formadas

|||| 26

no outono-primavera, sendo muito visitado por beija-flores e colibris. Os frutos

apresentam-se em forma cápsulas oblongas, com 4 a 5 sementes (PIO CORRÊA,

1984).

A espécie Vochysia divergens Pohl possui interesse econômico para a

comunidade pantaneira, como a utilização da sua madeira na carpintaria, construção

de canoas, veículo de transporte indispensável neste ecossistema. As folhas do

cambará são utilizadas na forma de chás, de forma considerável, na terapia de

doenças respiratórias, como gripe e asma, e distúrbios digestivos. As cascas do caule

também são utilizadas como xaropes para o tratamento de apendicites (GUARIM

NETO, 2006).

Apesar do interesse econômico e da ampla utilização terapêutica da V.

divergens existem poucos relatos acerca da composição química e da atividade

biológica. Os estudos fitoquímicos têm sido baseados principalmente no isolamento e

caracterização de cinco triterpenos e um esteroide do extrato etanólico de cascas

(HESS et al., 1995), no entanto o uso popular desta espécie baseia-se em extratos

aquosos (CORRÊA, 2007).

Estudos têm evidenciado atividades biológicas relacionadas à espécie, tais

como: atividade bactericida frente às bactérias gram-positivas, principalmente

Staphylococcus aureus pelo extrato etanólico das cascas de V. divergens (HESS et al.,

1995), atividade antinociceptiva, de forma dose-dependente, em camundongos

submetidos a testes nociceptivos com formalina (dor e inflamação) e contorções

abdominais induzidas por ácido acético (CORRÊA, 2007), atividade anti- alodínica em

camundongos suiço, pelo ácido tormêntico (BORTALANZA et al., 2002) e atividade

antifúngica, pelo ácido sérico ambos isolados das cascas de V. divergens (ZUCARO et

al., 2000).

Outras espécies do gênero Vochysia também possuem relatos de atividade

biológica baseados em triterpenos, esteroides e em menor grau compostos fenólicos.

Atividade anti-inflamatória já foi observada para triterpenos em Vochysia pacifica

(WENIGER et al., 2006) e atividade gastoprotetora para o extrato metanólico e fração

butanólica de Vochysia tucanorum (GOMES, et al., 2009).

1.6.2- A ESPÉCIE Cecropia pachystachya Trécul E ESPÉCIES AFINS

A espécie Cecropia pachystachya foi descrita por Auguste Trécul em 1847 e

faz parte atualmente da família Urticaceae, tendo pertencido à família Cecropiaceae e

|||| 27

Moraceae. No Brasil, a espécie é conhecida por embaúba, imbaíba, umbaúba, ambaí,

dentre outras variações. Estas denominações provêm do termo “ambaíba”, que no

tupi significa árvore oca, uma alusão aos caules ocos das espécies de Cecropia

(LORENZI AND SOUZA, 2001). Outros nomes populares de espécies desta família

são: guarumo e yarumo na Colômbia e no Equador, yongol no Perú e yagrumo na

Venezuela.

O gênero Cecropia foi descrito pelo botânico Loefling, em 1758, e compreende

mais de 70 espécies, apesar de existirem controvérsias entre os botânicos sobre a

definição de algumas espécies como sinonímias de outras, como é o caso de C.

catharinensis e C. lyratiloba tratadas como sinonímias de C. pachystachya (JOSÉ,

2009). As espécies de Cecropia são nativas da América tropical, encontrando-se

amplamente distribuídas desde o sul do México até o norte da Argentina. Cerca de

50% delas podem ser encontradas nas florestas montanas e submontanas andinas,

mais concentradas no norte dos Andes, na Colômbia e Equador (ARAGÃO et al.,

2010).

A espécie Cecropia pachystachya são árvores silvestres de até 15 metros de

altura, com tronco de cor esbranquiçada. Ocorrem abundantemente na vegetação

secundária das matas úmidas do litoral e das serras do Sul e Sudeste brasileiro

(LORENZI AND SOUZA, 2001). Florescem de setembro a outubro e frutificam de maio

a junho.

Várias espécies do gênero Cecropia são utilizadas na medicina popular da

América Latina, com variações na indicação terapêutica dependendo do país e das

espécies empregadas. São utilizadas para o tratamento de hepatite, diabetes,

úlceras, inflamações do útero e ovários, leucorréia, gonorréia, disenteria, problemas

respiratórios e como ativadoras das funções cardíaca e circulatória, cicatrizantes,

espasmolíticas, febrífugas e diuréticas. Usualmente se empregam as folhas e os brotos

em pó, em diversos tipos de preparações, sendo as mais comuns, infusão, decocção e

extrato alcoólico relatando-se também o emprego das raízes e das flores (LUENGAS-

CAICEDO, 2005; FRANCK et al., 1996).

Sabe-se também que as folhas de algumas espécies são usadas para polir

móveis, limpar utensílios, como alimento para o gado e como fonte de extração

industrial de celulose; seus galhos são utilizados na confecção de instrumentos de

percussão na Colômbia ou de flautas; as fibras do córtex são usadas como cordas,

redes e fibras de arco de flecha e a madeira serve para fabricar caixões baratos, salto

|||| 28

de calçados, fósforos, lápis, jangadas, etc. As árvores têm sido utilizadas ainda para

trabalhos de paisagismo (LORENZI AND SOUZA, 2001; JOSÉ, 2009).

As espécies de Cecropia desempenham também papel ecológico por serem um

grupo de árvores pioneiras em regiões úmidas ou semi-úmidas, sendo a mais comum

na Mata Atlântica. Fornecem suas folhas e infrutescências como alimento de diferentes

animais, em especial os mamíferos, e pela sua associação com formigas,

principalmente com as do gênero Azteca (LORENZI AND SOUZA, 2001; JOSÉ, 2009).

A espécie mais estudada deste gênero quanto à atividade farmacológica é C.

glaziovii, enquanto outras, como por exemplo, C. pachystachya e C. hololeuca são

pouco estudadas. O extrato etanólico de C. pellata muito utilizado na medicina

colombiana possui atividade diurética, cardiotônica e anti-bacteriana frente à

Escherichia coli (ROJAS et al., 2006), assim como o extrato aquoso e a fração

purificada de C. glaziovii foram capazes de reduzir broncoespasmos induzidos por

histamina em cobaias e de relaxar os músculos traqueais, aparentemente por um efeito

tipo agonista β-adrenérgico (DELARCINA et al., 2007). O extrato aquoso de C.

obtusifolia mostrou efeito analgésico periférico e atividade anti-inflamatória sistêmica

em camundongos suíços (PÉREZ-GUERRERO et al., 2001).

O extrato hexânico de C. pachystachya e o sitosterol isolado do mesmo

apresentaram atividade anti-inflamatória em ensaios de edema de pata induzido por

carragenina em ratos (ARAGÃO et al., 2010). Já o extrato diclorometânico das folhas e

o ácido pomólico, um dos quatro triterpenos identificados na amostra, reduziram o

edema de pata em rato, inibiram a viabilidade das células humanas polimorfonucleares

de forma dependente do tempo e da dose através de apoptose e não produziram

necrose nuclear (JOSÉ, 2009). O extrato aquoso das folhas apresentaram efeitos

hipotensivos, cardiotônicos e sedativos. Observou-se também que o extrato metanólico

das folhas de C. pachystachya possui atividades antioxidantes e efeitos

hipoglicemiantes em ratos, estas atividades foram relacionadas ao ácido clorogênico e

flavonóides C- glicosilados isolados do extrato (ARAGÃO et al., 2010).

|||| 29

2- OBJETIVOS

2.1- OBJETIVO GERAL

Estudar extratos vegetais, frações e substâncias isoladas das espécies de C.

pachystachya e V. divergens que possam ser utilizadas no tratamento dos processos

inflamatórios e infecções micobacterianas. Assim como, validar cientificamente ou não

o uso popular das plantas a serem utilizadas para ambas desordens clínicas.

2.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar a atividade anti-inflamatória dos extratos vegetais e suas frações

em macrófagos RAW 264.7 estimulados por LPS através da capacidade de inibir a

produção de óxido nítrico (NO) e prostaglandina (PGE2);

• Avaliar a capacidade de inibição do TNF-α através do bioensaio de L929;

• Avaliar a citotoxidade dos extratos, frações e substâncias isoladas

selecionados através do teste de MTT e LDH;

• Verificar se a ação inibitória observada é concentração-dependente;

• Avaliar se o mecanismo de ação dos extratos, frações e substâncias

isoladas selecionadas está associado a expressão ou atividade enzimática da iNOS;

• Avaliar a atividade antioxidante dos extratos, frações e substâncias

isoladas selecionados utilizando um doador de NO, o nitroprussiato de sódio (SNP);

• Avaliar a ação dos extratos, frações e substâncias isoladas selecionados

num perfil inflamatório crônico quanto à inibição da proliferação linfocítica em PBMC

estimulados por fitohemaglutinina (PHA);

• Analisar a ação das frações e substâncias selecionadas no crescimento

de M. bovis BCG.

|||| 30

3- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1- Obtenção do material vegetal

Os extratos vegetais, frações e substâncias isoladas foram obtidos através de

uma parceria entre o Laboratório de Biologia do Reconhecer/UENF e o grupo de

pesquisa da Drª Sônia Soares Costa, do Núcleo de Pesquisas de Produtos

Naturais/UFRJ. O extrato aquoso das folhas das espécies testadas foi obtido através

do processo de decocção (utilização do decocto) enquanto para as espécies que

possuíam amostras também das inflorescências e infrutescências foi obtido a partir de

trituração em água destilada a 20% (p/v), em temperatura ambiente e posteriormente

centrifugado. Os extratos vegetais liofilizados foram ressuspendidos em PBS estéril na

concentração de 10 mg/mL e filtrados em membrana Millipore 0,22 µm. As espécies

selecionadas para os testes com frações e substâncias isoladas foram Vochysia

divergens (A exsicata depositada no Herbário do Departamento de Botânica da UFPR-

UPCB 46164) e Cecropia pachystachya (exsicata depositada no herbário do Museu

Nacional-R208147). Estas foram escolhidas por corresponderem ao critério

estabelecido no item 4.2 e terem o fracionamento e purificações realizados enquanto

as demais espécies não o possuíam. As frações foram obtidas através de processos de

precipitação com etanol, partição com solventes orgânicos e cromatografia. A partir das

frações foram realizadas purificações cromatográficas para obtenção de substâncias

isoladas. As frações polares e apolares foram liofilizadas e armazenadas e

posteriormente ressuspendidas em PBS 1X na concentração de10mg/mL ou em DMSO

(Sigma-Aldrich) na concentração de 20mg/mL de acordo com a sua polaridade assim

como as substâncias isoladas. A lista das espécies vegetais utilizadas está elencada

na Tabela 1 (item 3.13) assim como os nomes populares e uso etnomedicinal das

mesmas.

3.2- Cultura Celular e preparação dos ensaios de macrófagos RAW 264.7

Macrófagos murinos peritoneais da linhagem celular RAW 264.7 obtidos da

ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), foram cultivados em

Dulbecco’s Modified Medium F-12 (DMEM F-12) (Gibco BRL), suplementado com 10%

de soro fetal bovino (FBS) (Gibco BRL) em estufa (Forma Scientific – water-jacketed

incubator) à 37oC e 5% de CO2. Células RAW 264.7 (5×105 células/mL) foram

plaqueadas em placa de 96 poços, em um volume de 0,2 mL/poço, (Corning, USA). A

|||| 31

placa foi mantida em estufa de 37ºC e 5% CO2 por 3 horas para aderência dos

macrófagos e estabilidade da cultura. Após este período, o sobrenadante da cultura foi

removido cuidadosamente para retirada de células não aderentes e substituído por

DMEM-F12 suplementado com 2% de FBS contendo ou não lipolissacarídeo, [1µg/mL]

(LPS, Escherichia coli 055:B5; Sigma-Aldrich, USA) na ausência ou presença dos

extratos, frações ou substâncias isoladas. A placa foi mantida em estufa de 37ºC, 5%

CO2 e após 24h de incubação, o sobrenadante da cultura foi coletado para avaliação

quanto à capacidade de inibição da produção de NO, TNF-α, PGE2 e citotoxicidade.

Primeiramente, foi realizado screening dos extratos obtidos através do ensaio de

Griess e do teste de citotoxicidade para escolha preliminar de extratos capazes de inibir

a produção de NO (> 40%) e de baixa citotoxicidade (<40%), no qual os extratos foram

testados numa única concentração de 500µg/mL. Nos experimentos seguintes, os

extratos selecionados foram testados nas concentrações de 20µg/mL, 100µg/mL e

500µg/mL. As frações dos extratos selecionados foram testadas posteriormente nas

concentrações de 100, 20, 4µg/mL e as substâncias isoladas nas concentrações de

100, 20, 4, 0,8µg/mL. Também foi utilizada a substância luteolina (Sigma-Aldrich USA)

nas mesmas concentrações utilizadas para as substâncias isoladas, por corresponder

a aglicona da substância isolada presente no extrato de Vochysia divergens.

3.3- Ensaio da capacidade de inibição da produção de óxido nítrico (NO)

A produção de NO foi estimada indiretamente, medindo-se a concentração de

nitrito. 50µl dos sobrenadantes (obtido conforme item 3.2) foram adicionados aos 100µl

de reagente de Griess (p-aminobenzenosulfonamida 1% + diidrocloreto de

naftilenodiamino 0,1% em 5% de ácido fosfórico, Sigma Chemical Co.), recém

preparado. Após 10 min, a absorbância foi medida no comprimento de onda de 570nm

em espectrofotômetro de placa (Dynatech MR5000). A concentração de nitrito no

sobrenadante foi determinada usando como referência uma curva de nitrito de sódio

decrescida do valor obtido com os aditivos sem células. Foram utilizados como controle

da produção de NO, macrófagos estimulados com LPS a 1µg/mL (positivo ou C+) e

macrófagos não estimulados (negativo ou C-), ambos não tratados com as amostras

(GRIESS, 1939; CHI, et al., 2001). Também usou-se um inibidor padrão de iNOS, L-

NMMA (Acetato de NG-Metil-L-Arginina, Sigma-Aldrich,USA) para comparação da

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capacidade de inibição da produção de NO. O percentual de inibição foi calculado

através da fórmula:

3.4- Testes de citotoxicidade (ensaio de MTT e LDH)

O teste de citotoxicidade dos extratos, frações e substâncias isoladas foi

efetuado utilizando o ensaio de LDH e de MTT. Para o MTT, as células foram

plaqueadas na concentração e condição de cultura citados no item 3.2, num volume

final de 100µl. Após 2 horas para a aderência dos macrófagos, as células foram

estimuladas ou não com 1µg/mL de LPS em combinação ou não com os extratos,

frações e substâncias isoladas por 24horas. Ao final da incubação, 5 µl de 3-

(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil tetrazol [5mg/mL] (MTT, Sigma-Aldrich) foram

adicionados em cada poço e 2h depois o sobrenadante da placa foi removido e os

cristais formados solubilizados por HCl (4mM) adicionado em isopropanol (Vetec). As

densidades óticas (D.O.) obtidas foram convertidas em percentual de ciototoxicidade

para comparação com os resultados obtidos nos ensaios de LDH. Foram utilizados

como controle macrófagos estimulados e tratados com 1% de Triton X-100 (controle

positivo ou D.O. C+) e macrófagos estimulados e não tratados (controle negativo ou

D.O. C-) A leitura foi feita por espectofotômetro de placa a 570nm (RASO et al., 2001) e

utilizou-se a seguinte fórmula:

No caso do LDH, para analisar o teor da enzima lactato desidrogenase no

sobrenadante da cultura, estas também foram plaqueadas e tratadas conforme

realizado para o MTT e mantidas em incubação por 24h. 50µl do sobrenadante da

amostra foram coletados e acrescidos de 100 µl de solução de alumen férrico e

substrato, mantendo-se a 37ºC por 3 min. Após, acrescentou-se 100 µl da solução de

NAD e fenasina metasulfato, mantendo-se a 37ºC por mais 5min (Kit comercial

Labrax). A leitura foi feita em espectofotômetro de placa a 490nm. Para obtenção da

lise máxima foram utilizados 1% de Triton x-100 (Vetec Chemical) (controle positivo ou

D.O. C+) e lise mínima, o sobrenadante de cultura de macrófagos estimulados e não

100- ((NOamostra – NOC-)*100/ NOC+ - NOC-)

100- ((D.O.amostra – D.O. C+) *100/ D.O. C- - D.O. C+ )

|||| 33

tratados (controle negativo ou D.O. C-) (MORAES et al., 2010). Para o cálculo de

percentual de citotoxicidade nos ensaios de LDH utilizou-se:

3.5- Bioensaio com células L929 e análise da produção de TNF-α α α α por

macrófagos

As células L929 (linhagem de fibroblasto murinho, ATCC) foram cultivadas em

meio DMEM-F12 suplementado com 10% de FBS durante o período necessário para

formação de uma monocamada celular. Para o bioensaio, o sobrenadante celular foi

removido e a monocamada celular foi lavada com PBS 1X para remoção completa de

FBS e em seguida tratadas com solução de tripsina 0,025%+ EDTA 0,2%. As células

foram centrifugadas (1200 rpm, 5’, 22ºC) e ressuspendidas em meio DMEM-F12

contendo 10% de SFB e 20µg/mL de gentamicina (Invitrogen) sendo plaqueadas na

concentração 2 X 105 células/mL, em placa de 96 poços. Após a incubação a 37ºC por

24h, o meio da cultura foi removido e 50µl de DMEM-F12 suplementado com 10% de

FBS e 2µg/mL de actinomicina D (Sigma, USA) foram adicionados em cada poço,

seguidos de 50µl do sobrenadante proveniente da cultura celular de RAW 264.7 (obtido

de acordo com o item 3.2). Após nova incubação por 24h a 37ºC e 5% CO2, a

viabilidade celular da L929 foi determinada através da técnica do MTT, descrita no item

3.4 (MOSMANN, 1983; SHIAU et al., 2001). Para mensurar a concentração de TNF-α

encontrada nas amostras utilizou-se uma curva-padrão com TNF-α recombinante

murinho (Biosource, USA). Também foi calculado o percentual de morte celular das

células L929 utilizando como controles, o sobrenadante da cultura de macrófagos não

estimulados (controle negativo) e o sobrenadante da cultura de macrófagos

estimulados (controle positivo) ambos não tratados por meio da fórmula:

3.6- Ensaio da capacidade de inibição da produção de PGE2

A avaliação da capacidade de inibição da produção de PGE2 pelos extratos,

frações e substâncias isoladas foi avaliada utilizando-se o sobrenadante da cultura de

(D.O. amostra- D.O. C-) *100/ (D.O. C+ - D.O. C-)

100- ((D.O.amostra – D.O. C+) *100/ D.O.C- - D.O.C+)

|||| 34

macrófagos RAW 264.7 (cultivados e tratados segundo item 3.2). O teor de PGE2

presente nos mesmos foi determinado através do kit comercial de imunoensaio para

dosagem de PGE2 (R&D system). A concentração de PGE2 presente nas amostras foi

comparada a uma curva-padrão de PGE2. O percentual de inibição da produção de

PGE2 foi calculado utilizando-se como controles, sobrenadante da cultura de

macrófagos não estimulados (negativo) e sobrenadantes da cultura de macrófagos

estimulados ambos não tratados por meio da fórmula utilizada no item 3.3

(ZEILHOFER, 2005).

3.7- Avaliação da capacidade de inibição da expressão da iNOS

3.7.1- Obtenção dos extratos celulares totais

Macrófagos RAW 264.7 foram plaqueados na concentração de 1,5 X 106 em

placas de 24 poços (Corning) e incubados por 3h em estufa (37ºC a 5% CO2) e após

isto, os macrófagos confluentes foram tratados de acordo com o item 3.2. Após

incubação de 24h, os poços foram lavados 2 X com PBS morno (1mL/poço) e o

sedimento celular foi lisado. Os extratos celulares foram obtidos através da

ressuspensão dos sedimentos de 1x106 células em 100µL de tampão de lise (12,5mL

H2O destilada, 5mLTris HCl 1M, 20mL SDS 10%, 10mL glicerol). As amostras foram

agitadas e ao lisado celular foi adicionado 5% de 2- β- mercaptoetanol (Sigma-Aldrich)

e 2% de azul de bromofenol (Acrõs Organic). O lisado celular de cada amostra foi

congelado a -20ºC. A concentração de proteína foi calculada pelo método de Bradford

usando albumina sérica bovina como padrão (AMARAL, 2010).

3.7.2- SDS-PAGE e Western Blotting

Quantias iguais de proteína (100 µg) do lisado celular foram fervidas por 5

minutos e submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida, em gel descontínuo

constituído de: gel separador (10% acrilamida, 0,2% bisacrilamida, 0,1% SDS e 0,375M

tris pH 8,8), gel de empacotamento (5% acrilamida, 0,5% bisacrilamida, 0,1% SDS e

0,125M tris pH 6,8) e tampão de corrida (25mM tris, 192mM glicina e 0,1% SDS pH

8,3). As corridas eletroforéticas foram realizadas no sistema de gel (MiniVE Vertical

Eletrophoresis System, GE- Healthcare), utilizando-se tampão de corrida sob 80V

constante no gel de empacotamento e 120V constante no gel separador. O Western

Blotting foi executado transferindo as proteínas corridas no gel para uma membrana de

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nitrocelulose, 0,45 µM (Amersham Hybond- ECL, GE-Healthcare), a 20 mA em

temperatura ambiente. A membrana foi bloqueada com 5% leite desnatado dissolvido

em PBS overnight a 4ºC, e posteriormente lavada 3X com PBST 0,05% e incubada

com o anticorpo primário anti- iNOS policlonal (Santa Cruz Biotechnology) 1:1000 em

PBST 0,05% acrescido de 2% de leite desnatado, por 1 hora. Em seguida, a membrana

foi lavada três vezes com PBS e incubada com anticorpo secundário (anti-rabbit IgG

conjugado com peroxidase na diluição de 1:5000 em PBST 0,05% (Santa Cruz

Biotechnology) por 1 h. Subseqüentemente, a membrana foi lavada extensivamente

com PBST 0,05% e revelada com solução de 0,5mg de 3,3'-diaminobenzidine (DAB,

GE-Healthcare) em 50mM de Tris HCl, pH.7.5 e 0,03% peróxido de hidrogênio. As

bandas protéicas reveladas foram digitalizadas e comparadas ao peso molecular

padrão (Rainbow - GE-Healthcare) (CHI et al., 2001).

3.8 – Avaliação da atividade antioxidante

Para o ensaio com o doador de óxido nítrico, o nitroprussiato de sódio (SNP)

(Vetec Chemical), foi preparada uma solução estoque a 100 mM desta em PBS. A

Solução de SNP (5µl) foi adicionada a 95 µL de meio de cultura DMEM-F12 não-

suplementado, contendo os extratos, frações, substâncias isoladas. As soluções foram

incubadas a 25°C por 2,5 h. Após este período, foi realizado o teste colorimétrico de

Griess, como mencionado anteriormente para determinar a concentração de nitrito no

meio (item 3.3). Utilizou-se como controle, as amostras de DMEM-F12 acrescido de

SNP (controle positivo) e as amostras somente de DMEM-F12 (controle negativo)

ambos não tratados. A concentração de nitrito presente no meio foi comparada a curva

padrão de rutina. E os percentuais de sequestro de nitrito seguiram a fórmula descrita

no item 3.3 (ZHAI et al., 2009).

3.9 - Ensaio da inibição da proliferação linfocítica

Sangue venoso foi coletado de indivíduos saudáveis em sistema de tubos

“VacutainerTM (Becton Dikinson) contendo heparina sódica, para obtenção de células

mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram coletados 30 mL de sangue por

indivíduo. O sangue coletado foi sobreposto vagarosamente sobre o Ficoll-PaqueTM

Plus (Amersham Pharmacia Biotech), na proporção de 2:1, em tubos de 50 mL e

submetidos à centrifugação (500 g, temperatura ambiente, tempo de 40 minutos). As

células mononucleares do sangue periférico formam uma camada logo abaixo do

|||| 36

plasma e das plaquetas, em forma de anel que se encontra acima do colchão de Ficoll.

Tais células foram coletadas e lavadas com meio, RPMI-1640, Roswell Park Memorial

Institute (GIBCO) não suplementado, através de três centrifugações a 40C por 10

minutos. Após este processo as células foram ressuspendidas em meio RPMI-1640. A

partir desta suspensão, uma alíquota foi retirada para contagem das células em câmara

de Neubauer. Em seguida, plaqueadas em placa de 96 poços (1 x 105 células/ poço)

num volume de 100µL. Adicionou-se a este volume mais 100 µL de RPMI-1640

suplementado com 20% de FBS, 0,4% de gentamicina, 0,1mM de L-glutamina e 5

µg/mL de PHA (fitohemaglutinina, Sigma-Aldrich) por 5 dias a 37°C e 5% de CO2 na

ausência ou presença dos extratos. A proliferação foi avaliada através do método

colorimétrico utilizando o sal de tetrazol, MTT, adicionado 2h antes da leitura. Após 2h,

a placa foi centrifugada (1200 rpm, 5’, 22ºC) e o sobrenadante removido. Os critais

foram solubilizados conforme descrito no item 3.4 e a leitura feita em espectrofotômetro

de placa a 570nm. A ciclosporina A (Sigma-Aldrich) foi utilizada como fármaco

imunossupressor controle. E os percentuais de inibição da proliferação linfocítica foram

baseados nos controles: linfócitos estimulados com PHA, linfócitos não estimulados e

linfócitos estimulados lisados com 1% de Triton X-100, uma vez que o sobrenadante da

cultura de linfócitos também foi analisada quanto a morte celular (WANG et al., 1998).

3.10- Avaliação indireta da capacidade de inibição da atividade da enzima

iNOS

Macrófagos RAW 264.7 foram cultivados e plaqueados de acordo com item 3.2.

Após o plaqueamento, a cultura foi incubada por 3h na estufa para aderência celular e

o sobrenadante foi removido e substituído por DMEM-F12 suplementado com 2% de

FBS e LPS [1µg/mL] por 12h, no volume de 100µl/poço. Subsequente, ao pré-estímulo

as células foram lavadas com PBS estéril 1X, em temperatura ambiente, e foram

tratadas com os extratos, frações e substâncias isoladas por mais 12h. Finalmente, o

sobrenadante foi coletado e a concentração de nitrito mensurado através do método de

Greiss descrito no item 3.3. Foram usados como controle: macrófagos não tratados

com LPS e macrófagos pré-tratados com LPS por 12h e DMEM-F12 suplementado

com 10% de FBS nas últimas 12h (HO et al., 2007).

|||| 37

3.11- Atividade Antimicobacteriana

As amostras, extratos, frações e substâncias isoladas, foram avaliadas quanto à

sua atividade antimicobacteriana utilizando ensaio com sal de tetrazol em placa de 96

poços. Nesse ensaio, foi preparado uma suspensão de Mycobacterium bovis BCG a

partir da vacina de BCG (vacina onco-BCG viva, cepa Moreau, Copenhagen

SEED#July, 1978) cedida pelo Instituto Butantan/SP (3 x 107 CFU/ml). Previamente,

300 µl desta suspensão foram incubados com 7,2 ml de meio de cultura 7H9 (BACTO)

suplementado com ADC (BC). Quando na fase logarítmica de crescimento 50µl foram

plaqueados em placa de 96 poços (1 x 106 CFU/poço). As amostras dos extratos,

frações e substâncias isoladas (50 µl) foram diluídas em 7H9 + ADC em concentração

2 vezes maior do que a concentração final desejada. A placa selada foi então incubada

a 37°C por 7 dias. Após esse período, adicionou-se 10 µl de uma solução de sal de

tetrazol (MTT – 5 mg/ml em PBS estéril) e 3 horas depois, 100µl de tampão de lise foi

adicionado (20% p/v de SDS / 50% de DMF em água destilada – pH 4.7). A leitura foi

feita no espectrofotômetro de placa em 570 nm. Como controle positivo de atividade foi

utilizado 7H9 suplementado não acrescido de bactérias e a curva padrão de referência

de rifampicina. O controle negativo de atividade foram os poços acrescidos de

bactérias e não tratados. A padronização da dosagem das micobactérias foi feita em

espectrofotômetro (Hitachi – Modelo U-1100) em DO 600 nm (GOMES-FLOREZ et al.,

1995).

3.12- Análise Estatística

Os dados foram relatados pela média ± desvio padrão e avaliado por análise de

variância One-Way ANOVA seguido por Teste de Tukey, sendo considerado

significante P <0,05 através do software GraphPad Prism 4.0. Todos os experimentos

foram realizados em triplicata (n=3).

|||| 38

TABELA 1: ESPÉCIES VEGETAIS ESTUDADAS

|||| 39

|||| 40

4- RESULTADOS

Buscou-se, com o uso de extratos de origem vegetal, suas frações e substâncias

isoladas avaliar a capacidade dos mesmos em modular o processo inflamatório frente

ao NO, TNF-α, PGE2 e proliferação linfocítica, sua influência sobre a iNOS assim como

a ação em patologias intimamente relacionadas à inflamação, como a tuberculose e

sua citotoxicidade. Os extratos de 25 espécies vegetais ocorrentes no Brasil, suas

frações e substâncias isoladas fazem parte do banco de amostras bioativas do

Laboratório de Química de Produtos Naturais Bioativos/NPPN/UFRJ.

Para estudar o perfil imunofarmacológico das espécies selecionadas, utilizou-se

como modelo: macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7, fibroblastos murinos da

linhagem L929, células mononucleares do sangue periférico, micobactérias

Mycobacterium bovis BCG e o nitroprussiato de sódio (SNP).

4.1- Screening preliminar dos extratos aquosos obtidos quanto à

citotoxicidade e modulação da produção de óxido nítrico

Previamente ao screening dos extratos aquosos obtidos, a concentração de uso

do L-NMMA (responsável por inibir a síntese ou a ação do NO proveniente da ação da

iNOS), foi padronizada para o modelo de inflamação proposto, macrófagos RAW 264.7,

verificando sua capacidade de inibição da produção de NO e sua citotoxicidade a fim

de proporcionar um grau de comparação apurado entre o mesmo e os diferentes

extratos aquosos obtidos. O L-NMMA (Figura 11) foi testado nas concentrações de

100, 20 e 4µg/mL, estabelecendo-se como critério de escolha a capacidade de inibir a

produção de NO em no mínimo 40% e apresentar citotoxicidade menor que 40% para

as concentrações testadas.

Figura 11- Estrutura química do inibidor padrão de iNOS, Acetato de NG-Metil-L-Arginina (VALLANCE et al., 2002).

|||| 41

Como pode ser observado na Figura 12A, a concentração de 20µg/mL mostrou

47,15±4,70% de inibição da produção de NO, enquanto a concentração de 4µg/mL não

foi capaz de inibir em mais de 40% a produção de NO, sendo esta de 24,59±2,96

percentuais. A concentração de 100µg/mL apresentou uma aparente inibição de

84,68±3,67%, no entanto, a mesma apresentou alta taxa de citotoxicidade em ambos

os testes, 53,68±3,36% de liberação específica de lactato desidrogenase e 51,19±2,5%

de citotoxicidade através do teste de MTT, não havendo, portanto inibição da produção

de NO mas morte celular. Para a concentração de 20µg/mL as taxas de toxicidez foram

de 3,36±1,10% no teste de LDH e 15,58±2,52% para o teste de MTT enquanto que a

concentração de 4µg/mL não demonstrou citotoxicidade superior a 8% em ambos

testes realizados (1,29±0,86 para o LDH e 6,47±1,42% para o MTT) (Figura 12B

e12C). Deste modo, a concentração de 20µg/mL foi a que melhor se enquadrou dentro

dos critérios estabelecidos e foi utilizada nesta concentração em todos os experimentos

realizados.

Figura 12- Curva de padronização do inibidor de iNOS, L-NMMA, para o modelo de inflamação proposto RAW 264.7 e sua citotoxicidade. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com 1µg/mL de LPS e tratados com L-NMMA nas concentrações de 100, 20 e 4µg/mL por 24h. (A) Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO. Sendo o controle negativo, macrófagos não tratados e não estimulados por LPS (100,00±3,63%/ 4,55±0,96µM), e o controle positivo, macrófagos estimulados por LPS e não tratados (0,00±2,61%/ 48,11±0,69µM). P<0.001 (*) em relação ao grupo não tratado (0µg/mL). (B) Os percentuais de citotoxicidade pelo método do LDH foram comparados ao controle negativo, macrófagos estimulados e não tratados (1,25±1,10%/D.O. 0,00±0,01) e ao controle positivo, macrófagos estimulados e

C

B A

*

*

*

*

*

*

|||| 42

tratados com 1% de Triton X-100 (100,26±0,27%/ D.O. 0,77±0,17). P<0.001 (*) em relação ao grupo não tratado (0 µg/mL). (C) Os percentuais de citotoxicidade pelo método do MTT foram comparados ao controle negativo, macrófagos estimulados e não tratados (1,17±2,76%/ D.O. 0,97±0,02) e ao controle positivo, macrófagos estimulados e tratados com 1% de Triton X-100 (100,00±1,67%/ D.O. 0,08±0,01). P<0.001 (*) em relação ao grupo não tratado (0 µg/mL). Médias aritméticas ± desvio padrão (n = 3)

As amostras de espécies vegetais da flora brasileira da região do Pantanal em

Mato Grosso (Reserva Particular do Patrimônio Natural SESC Pantanal) e espécies

vegetais nativas e exóticas de ocorrência em muitas regiões do Brasil foram obtidas em

colaboração com o NPPN/UFRJ a partir de estudos baseados nos hábitos alimentares

de herbívoros nativos e o uso etnomedicinal destas espécies (OLIVEIRA et al., 2005).

Todas as amostras recebidas foram ressuspendidas em PBS para a obtenção

do extrato aquoso e filtradas em membrana 0,22µm para esterilização e posterior uso

em cultura celular. Inicialmente, foi realizado um screening preliminar dos 26 extratos

vegetais recebidos, nos quais 25 extratos foram obtidos utilizando-se as folhas dos

espécimes e 1 extrato aquoso obtido das inflorescências da espécie Kalanchoe

tubiflora. A seleção dos extratos vegetais iniciou-se pela investigação da capacidade

dos mesmos em inibir a produção de óxido nítrico, de acordo com o critério

estabelecido anteriormente de no mínimo 40% e citotoxicidade menor que 40% para a

maior concentração testada dos extratos vegetais, 500µg/mL, em ambos os testes de

toxicidez efetuados.

Este critério para escolha dos extratos vegetais foi baseado em estudos literários

relacionados e no fato dos extratos serem compostos de uma gama de substâncias e

estas por sua vez poderiam não ser responsáveis pela ação toxicológica.

Como pode ser observado na Tabela 2, o extrato aquoso da Ludwigia nervosa

apresentou níveis de toxicidade acima do critério estabelecido de 40% tanto no teste de

MTT quanto no teste de liberação específica de LDH. Deste modo, os números

relacionados à porcentagem de inibição da produção de NO foram mascarados pelo

alto índice de morte celular.

As espécies do gênero Mimosa, família Mimosaceae, M. debilis e M.

xanthocentra não apresentaram atividade inibitória para a produção de NO, porém, ao

contrário de M. debilis, a espécie M. xanthocentra foi tóxica à cultura de macrófagos.

Outras espécies como E. indica, D. distortum, S. dendroideum. e L. alba não

apresentaram citotoxicidade nos testes de LDH e MTT de acordo com os critérios

estabelecidos, no entanto também não foram capazes de inibir a produção de óxido

nítrico apesar destas espécies terem uso etnobotânico (Tabela 1) associado a

|||| 43

tratamento de processos inflamatórios. Deste modo sua atividade anti-inflamatória pode

estar relacionada a outros mecanismos.

As amostras do gênero Kalanchoe testadas não foram capazes de inibir a

produção de NO e algumas espécies se mostraram tóxicas tais como: K. pinnata, K.

brasiliensis, K. thyrsiflora e o extrato aquoso das folhas do K. tubiflora enquanto o

extrato aquoso das inflorescências do K. tubiflora e os extratos do K. daigremontiana e

do K. blossfeldiana não apresentaram toxicidez elevada quando comparada as outras

espécies do gênero testadas. A diferença no percentual de citotoxicidade encontrada

entre os métodos de LDH e MTT se deve a particularidades dos mesmos e também a

coloração escura de alguns extratos aquosos.

Tabela 2- Percentual de inibição da produção de óxido nítrico e percentual de citotoxicidade pelo método de LDH e MTT dos 26 extratos aquosos através de um screening preliminar

Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO. Os

controles foram positivo: 2,33±1,33%/ 38,22±0,50µM e negativo: 100,00±3,52%/ 0,77±1,34µM (P<0,001 para

todas as amostras em relação ao grupo não tratado exceto C. pachystachya FF) e os percentuais de

citotoxicidade por LDH aos controles negativo: 0,01±1,53%/ D.O. 0,00±0,01 e positivo: 100±14,33%/ D.O.

ESPÉCIE [500 % de inibição da produção de NO DH MTT

Andira cuyabensis 52,52±10,27 35,03±1,29 29,41±3,37

Cecropia pachystachya FF 96,73±0,89 39,31±2,34 37,37±1,18

Desmodium distortum 29,08±7,12 52,86±2,54 87,48±2,79

Eleusine indica 37,98±6,23 0,40±8,65 19,07±7,32

Kalanchoe blossfeldiana 9,19±4,39 27,94±15,36 42,19±23,71

Kalanchoe brasiliensis 6,52±4,20 14,25±5,86 56,74±12,18

Kalanchoe daigremontiana 10,38±5,55 22,87±1,77 51,62±3,46

Kalanchoe pinnata 27,59±8,64 53,55±14,07 66,69±0,145

Kalanchoe thyrsiflora 12,46±5,65 34,92±12,28 44,78±7,19

Kalanchoe tubiflora F 6,52±1,85 41,08±1,43 43,19±0,8

Kalanchoe tubiflora I 18,10±1,36 10,25±0,63 26,80±5,27

Lippia alba 34,42±3,21 24,79±7,78 36,83±11,54

Ludwigia nervosa 62,01± 1,78 52,26±6,17 85,44±2,19

Melochia villosa 9,79±2,57 59,02±13,09 72,25±12,67

Mimosa debilis 7,71±3,21 10,06±1,80 42,61±3,65

Mimosa xanthocentra 2,07±4,01 64,04±3,69 67,63±3,61

Pavonia angustifolia 65,57±3,88 8,66±1,35 29,36±5,54

Persea americana 63,50±4,01 19,88±2,14 34,94±1,36

Phyllanthus amarus 66,76±1,85 26,59±3,91 35,28±2,32

Rynchanthera novemnervia 70,62±0,51 18,71±0,86 23,44±1,58

Sabicea aspera 60,53±3,37 8,21±6,40 24,83±1,16

Sebastiania corniculata 71,21±6,05 31,52±3,47 33,97±1,95

Sedum dendroideum 31,75±1,58 19,96±6,45 37,48±4,23

Sida santaremensis 47,47±2,86 3,24±4,99 19,50±1,95

Vernonia scabra 72,70±0,89 12,49±5,40 24,36±3,77

Vochysia divergens 48,96±0,51 0,52±5,53 8,76±1,53

-NMMA 48,07±3,37 1,97±1,36 18,74±0,80

|||| 44

1,11±0,15 (P<0,001 para C. pachystachya FF, A. cuyabensis, P. amarus e S. corniculata e P<0,01 para P.

americana) enquanto os percentuais de citotoxicidade por MTT aos controles negativo: 4,49±1,39%/ D.O.

0,09±0,00 e positivo:100,09±0,38%/ D.O. 2,06±0,15. As siglas (FF) significam folha do indivíduo fêmea, (F)

folha e (I) inflorescência (P<0,001 para todas as amostras exceto V. divergens, P<0,05, em relação ao em

relação ao grupo não tratado). Médias aritméticas ± desvio padrão (n = 3)

Dentre as espécies selecionadas encontram-se o extrato aquoso de V.

divergens, A. cuyabensis, S. santaremensis, P. amarus, P. angustifolia, S. aspera, S.

corniculata, V. scabra, R. novemnervia, P. americana e o extrato aquoso das folhas

fêmeas da C. pachystachya, destacadas de cinza na Tabela 2.

Ao comparar as taxas de inibição da produção de NO entre o L-NMMA na

concentração de 20µg/mL (48,071±3,37), e os extratos aquosos das 11 espécies

selecionadas a 500µg/mL, observa-se atividade inibitória por parte de alguns extratos

bastante similar ao inibidor padrão, como visto para V.divergens (48,961±0,51), S.

santaremensis (47,477±2,86) e A. cuyabensis (52,522±10,27).

Outros extratos aquosos possuem uma atividade inibitória superior em 12% à

taxa apresentada pelo L-NMMA, tais como: S. aspera (60,534±3,37), P. americana

(63,501±4,01), P. angustifolia (65,578±3,88), P. amarus (66,765±1,85), R. novemnervia

(70,622±0,51), S. corniculata (71,216±6,05) e V. scabra (72,700±0,89), destacando-se

a atividade inibitória do extrato aquoso das folhas fêmeas de C. pachystachya

(96,735±0,89) com uma taxa de inibição a cerca de 48% a mais do que apresentada

pelo L-NMMA (Figura 13).

Deve-se levar em consideração que apesar das concentrações serem diferentes

em 25X, o inibidor utilizado como padrão é um composto purificado enquanto os

extratos aquosos se constituem de uma gama de moléculas, no qual a(s) substância(s)

responsável(is) pela atividade inibitória encontra(m)-se em quantidade(s) minoritária(s)

podendo atuar em sinergismo. Os percentuais de citotoxicidade do L-NMMA e o dos 11

extratos aquosos quando comparados mostram que apesar dos extratos aquosos

estarem em uma concentração muito superior (25 vezes) ao utilizado para o L-NMMA,

todos os extratos permaneceram dentro do critério estabelecido de até 40%. Além

disso, a concentração de uso dos extratos poderia aumentar a probabilidade de

interferência na atividade inibitória por substâncias tóxicas presentes.

Em contrapartida, a concentração de 100µg/mL (5 vezes menor a utilizada para

os extratos aquosos) do L-NMMA foi responsável por mais de 50% de morte celular

para ambos os testes de toxicidez como visto anteriormente nas Figuras 12B e 12C.

|||| 45

Uma melhor comparação entre as atividades dos extratos e do L-NMMA pode ser

observada nos experimentos subseqüentes onde as amostras foram avaliadas em

diferentes concentrações de forma a estudar a relação dose-resposta. A Figura 13

mostra para fins de comparação a atividade inibidora da produção de NO e a

citotoxicidade apenas dos 11 extratos selecionados.

Figura 13- Percentual de inibição da produção de óxido nítrico e citotoxicidade das espécies selecionadas através de um screening preliminar em relação aos seus respectivos controles. Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles positivo: 2,33±1,33%/ 38,22±0,50µM e negativo: 100,00±3,52%/ 0,77±1,34µM (P<0,001 para todas as amostras em relação ao grupo não tratado exceto C. pachystachya FF). Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 0,01±1,53%/ D.O. 0,00±0,01 e positivo: 100±14,33%/ D.O. 1,11±0,15 (P<0,001 para C. pachystachya FF, A. cuyabensis, P. amarus e S. corniculata e P<0,01 para P. americana) e os percentuais de citotoxicidade por MTT aos controles negativo: 4,49±1,39%/ D.O. 0,09±0,00 e positivo: 100,09±0,38%/ D.O. 2,06±0,15 (P<0,001 para todas as amostras exceto V. divergens, P<0,05, em relação ao em relação ao grupo não tratado). Concentração das amostras 500 µg/mL e concentração do padrão L-NMMA 20 µg/mL. O percentual de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO.

4.2- Avaliação da atividade inibitória dos 11 extratos aquosos selecionados

através de curva de concentração-resposta (2º screening)

A fim de estudar a extensão da atividade inibitória apresentada pelos 11 extratos

aquosos selecionados e escolher dentre estes os que apresentaram melhor

desempenho na inibição da produção de NO e menores taxas de citotoxicidade

realizamos um segundo screening por meio de curvas de dose-resposta. Foi incluída

nesta etapa a observação da ação dos extratos aquosos frente ao fator de necrose

tumoral, o TNF-α.

|||| 46

4.2.1- Modulação da produção de óxido nítrico e citotoxicidade

Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com lipopolissacarídeo na mesma

concentração utilizada para o screening preliminar e tratados com os extratos aquosos

nas concentrações de 500, 100 e 20µg/mL. Na Tabela 3, encontram-se os valores

percentuais de inibição da produção de NO, de citotoxicidade por LDH e MTT e os

valores de IC50 (concentração necessária para inibir 50% da atividade observada) para

os 11 extratos selecionados. O valor do IC50 foi calculado por análise de regressão

não-linear.

Todos os extratos aquosos apresentaram atividade na modulação da produção

de NO de forma dose dependente, assim como redução das taxas de citotoxicidade

(Figura 14).

Os extratos de S. santaremensis, A. cuyabensis e V. divergens por

demonstrarem uma modulação da produção de NO bastante similar ao L-NMMA na

concentração de 500µg/mL, ao serem diluídos não mantiveram sua ação inibitória,

tendo o IC50, próximo ou maior que a concentração testada de 500µg/mL

(625,2±0,42µg/mL, 465,2±0,40µg/mL e 481,2±0,42µg/mL respectivamente). Estes são

os maiores índices de IC50 entre os 11 extratos das espécies estudadas, sendo,

portanto os menos potentes.

Em relação à atividade de inibição observada no tratamento efetuado com os

extratos aquosos de A. cuyabensis e S. santaremensis não se observa diferença

estatisticamente significativa entre a ação dos extratos em nenhuma das

concentrações testadas, havendo diferença significante destes para o extrato da V.

divergens (P<0,001) (Figura 14A).

Outros extratos, como P. angustifolia, S. aspera, V. scabra e R. novemnervia

apesar de terem obtidos resultados bastante expressivos na concentração de

500µg/mL comparado ao L-NMMA e a outros extratos aquosos citados acima, quando

diluídos a 100 µg/mL não alcançaram 40% de inibição da produção de NO e

consequentemente para a de 20 µg/mL. O extrato da P. angustifolia, dentre os quatro,

possui a menor potência inibitória, visto o seu IC50 (349,1±0,37µg/mL). A ação

modulatória dos extratos de R. novemnervia e V. scabra não são significativamente

diferentes para as concentrações testadas e ambos, assim como o extrato de S. aspera

são diferentes do extrato da P. angustifolia na concentração de 100µg/mL, P<0,05. O

valor do IC50 indica que o extrato da R. novemnervia (159,9±0,34µg/mL) e o da V.

|||| 47

scabra (181,8±0,35µg/mL) são mais potentes que o extrato da S. aspera

(209,7±0,36µg/mL) (Figura 14A).

Tabela 3- Percentuais de inibição da produção de óxido nítrico, de citotoxicidade pelo método de LDH e MTT e IC50 dos 11 extratos aquosos selecionados no 2º screening de atividade

Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO. O controle positivo foi de: 0,00±4,58%/ 38,22±1,57µM e negativo: 99,99±2,44%/ 3,88±0,83µM e os percentuais de citotoxicidade por LDH aos controles negativo: 1,03±1,68%/ D.O. 0,01±0,00 e positivo: 100±4,46%/ D.O. 0,92±0,04 e pelo método do MTT aos controles negativo: 5,86±4,41%/ D.O. 0,42±0,01 e positivo:100,05±2,82%/ D.O. 0,07±0,01. A sigla (FF) significa folha fêmea.

% de inibição

de NO

% de citotoxicidade

LDH

% de citotoxicidade

MTT

IC 50 (NO)

( µ µ µ µg/mL)

C. pachystachya FF 500 µµµµg/mL 98,48±3,16 37,01±0,98 40,88±1,75

9,64±0,00 100 µµµµg/mL 84,81±0,43 34,62±0,53 3,46±1,75

20 µµµµg/mL 75,44±4,18 21,17±0,44 1,88±0,84

V. divergens 500 µµµµg/mL 52,10±1,37 9,66±1,81 8,34±5,31

481,2±0,42 100 µµµµg/mL 27,83±1,37 1,65±2,21 10,46±7,31

20 µµµµg/mL 11,04±2,80 3,31±1,65 4,81±3,65

A. cuyabensis 500 µµµµg/mL 50,16±5,49 26,51±4,92 36,18±0,16

465,2±0,40 100 µµµµg/mL 27,83±1,94 5,95±3,25 3,87±5,98

20 µµµµg/mL 24,92±1,37 1,65±1,37 3,99±1,82

S. santaremensis 500 µµµµg/mL 47,48±0,88 2,9±0,22 14,57±4,36 625,2±0,42

100 µµµµg/mL 35,56±5,32 2,00±0,14 7,06±0,09

20 µµµµg/mL 29,91±2,66 2,05±0,07 5,90±5,18

P. amarus 500 µµµµg/mL 67,15±8,92 35,13±1,99 31,13±6,13

43,95±0,21 100 µµµµg/mL 59,87±2,74 9,16±0,76 15,98±2,82

20 µµµµg/mL 51,13±2,56 6,20±6,37 19,38±0,99

P. angustifolia 500 µµµµg/mL 65,30±1,37 9,30±3,06 26,19±0,99

349,1±0,37 100 µµµµg/mL 22,94±1,86 2,38±0,21 20,32±1,66

20 µµµµg/mL 20,31±6,17 0,07±2,66 5,17±5,81

S. aspera 500 µµµµg/mL 65,21±3,43 16,8±2,19 18,91±2,32

209,7±0,36 100 µµµµg/mL 35,11±0,68 3,21±1,71 3,05±2,81

20 µµµµg/mL 20,55±2,05 2,23±1,30 5,39±1,49

S. corniculata 500 µµµµg/mL 78,80±6,17 27,88±3,73 21,50±1,64

89,69±0,29 100 µµµµg/mL 50,16±6,86 7,21±2,08 15,98±3,48

20 µµµµg/mL 26,53±4,58 6,96±7,73 7,87±3,98

V. scabra 500 µµµµg/mL 75,06±0,68 18,56±1,14 17,86±8,80

181,8±0,35 100 µµµµg/mL 32,25±1,78 3,89±0,45 13,39±4,81

20 µµµµg/mL 18,77±0,48 5,84±0,91 16,80±5,24

R. novemnervia 500 µµµµg/mL 71,52±4,23 19,69±0,57 17,62±3,15

159,9±0,34 100 µµµµg/mL 35,59±4,11 1,83±1,35 15,98±3,48

20 µµµµg/mL 25,89±1,37 3,95±2,06 14,10±4,81

P. americana 500 µµµµg/mL 64,85±7,35 23,81±0,67 34,59±2,79

142,3±0,33 100 µµµµg/mL 46,23±7,98 17,79±1,04 31,91±2,79

20 µµµµg/mL 35,98±4,40 0,79±0,37 26,91±1,04

L-NMMA Inibidor 48,22±4,44 0,25±0,27 11,40±1,32

|||| 48

A manutenção da atividade modulatória da produção de NO, na concentração de

100 µg/mL, em no mínimo 40% foi observada para os extratos aquosos da P.

americana (46,23±7,98) e da S. corniculata (50,16±6,86), onde mesmo cinco vezes

mais diluído apresentaram atividade similar ao L-NMMA (Figura 14A). Deste modo,

pode-se optar pela concentração de 100µg/mL tendo uma taxa percentual de toxicidez

em torno de 17,79±1,04 e 7,21±2,08 no teste de LDH e 31,91±2,79 e 15,98±3,48 no

teste do MTT respectivamente (Figura 14B e 14C), porém não houve atividade

inibitória para a concentração de 20µg/mL. O extrato da S. corniculata difere-se

estatisticamente da concentração de 500µg/mL, P<0,01 do extrato da P. americana. Os

valores de IC50 mostram que o extrato da S. corniculata é mais potente

(89,69±0,29µg/mL) do que o extrato da P. americana (142,3±0,33µg/mL).

Destacaram-se neste 2º screening os extratos aquosos das folhas fêmeas de C.

pachystachya e do P. amarus, que em todas as concentrações testadas na curva

apresentaram atividade inibitória para produção de NO. Além disso, estando na mesma

concentração utilizada para o inibidor, 20µg/mL, os extratos mostraram ser mais

eficazes (75,44±4,18 e 51,13±2,56 respectivamente) do que o L-NMMA (Figura 14A).

Seus percentuais de citotoxicidade também foram expressivamente reduzidos, sendo

de 21,17±0,44 e 6,20±6,37 no teste de LDH para o extrato das folhas fêmeas de C.

pachystachya e P. amarus e de 1,88±0,84 e 19,38±0,99 no teste de MTT (Figura 14B

e 14C). Os valores de IC50 apresentado pelo extrato da C. pachystachya FF foi menor

que 20 µg/mL (IC50 calculado: 9,642±0,00µg/mL) foi o menor dentre os 11 extratos,

sendo, portanto o mais potente, seguido pelo obtido com o extrato de P. amarus

(43,95±0,21µg/mL).

As taxas percentuais alcançadas no teste de citotoxicidade por LDH e por MTT

reduziram-se de acordo com as diluições efetuadas para todos os extratos utilizados,

ocorrendo de forma dose dependente para o LDH e para o MTT, exceto nestes: V.

divergens, S. aspera, V. scabra e P. amarus (Figura 14B e 14C).

|||| 49

Figura 14- Efeito modulatório na produção do NO e citotoxicidade dos extratos aquosos selecionados no 2º screening. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com LPS 1µg/mL e tratados com os extratos aquosos selecionados anteriormente nas concentrações de 500, 100 e 20µg/mL. (A) Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção do NO. O controle positivo foi de: 0,00±4,58%/ 38,22±1,57µM e negativo: 99,99±2,44%/ 3,88±0,83µM. (B) Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 1,03±1,68%/ D.O. 0,01±0,00 e positivo: 100±4,46%/ D.O. 0,92±0,04 e (C) os percentuais de citotoxicidade por MTT aos controles negativo: 5,86±4,41%/ D.O. 0,42±0,01 e positivo: 100,05±2,82%/ D.O. 0,07±0,01. A legenda no lado direito inferior refere-se a todos os gráficos estando os extratos no mesmo padrão

4.2.2- Modulação da produção do fator de necrose tumoral (TNF-αααα)

Sabe-se que a citocina pró-inflamatória TNF-α produzida pelos macrófagos,

assim como o NO, está intimamente envolvida na resposta inflamatória e apesar de

seus efeitos protetores, o TNF-α também possui efeitos deletérios quando em altas

concentrações (BALKWILL et al., 2001). Dessa maneira, os 11 extratos aquosos

selecionados foram estudados quanto à sua capacidade de modular a produção de

Legenda

A B

C

|||| 50

TNF-α pelos macrófagos estimulados com LPS a 1µg/mL através do bioensaio com

fibroblastos murinos L929.

Neste ensaio, investigamos de forma indireta a presença de TNF-α no

sobrenadante da cultura de macrófagos RAW 264.7 estimulados e tratados com os

extratos nas concentrações de 500, 100 e 20µg/mL. Após 24 horas, o sobrenadante da

cultura celular foi repassado à cultura de L929 e nesta foi adicionado meio de cultura

acrescido de actinomicina D (2µg/mL). Pelo fato das células L929 serem sensíveis a

presença de TNF-α, a quantidade do mesmo no sobrenadante da cultura está

associada ao índice de morte celular.

Os extratos aquosos testados não foram capazes de modular expressivamente a

produção de TNF-α quando comparados ao grupo controle estimulado e não tratado,

alguns deles tiveram influência sobre a produção de TNF-α e podem ter a atividade

inibitória alcançada quando purificados, como pode ser observado na Figura 15.

Figura 15- Modulação da produção de TNF-α α α α através do bioensaio com fibroblastos murinos L929. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados e tratados com os 11 extratos aquosos selecionados na concentração de 500, 100 e 20µg/mL por 24h. O sobrenadante da cultura foi adicionado à cultura de células L929 previamente plaqueadas por mais 24h. Avaliação da concentração de TNF-α no sobrenadante da cultura de fibroblastos murinos L929 foi comparada a curva padrão de TNF-α murinho recombinante.

O extrato das folhas fêmeas da C. pachystachya, e o extrato da S. corniculata

apenas na concentração de 500µg/mL, apresentaram aproximadamente 23% e 15% de

redução do percentual de citotoxicidade do TNF-α para L929 (Figura 16) e quando

|||| 51

comparado aos demais extratos foram os que obtiveram melhor desempenho na

modulação da produção do TNF-α (P<0,001).

Analisando a Figura 16, percebe-se que o sobrenadante dos extratos da P.

angustifolia e da A. cuyabensis não apresentaram influência sobre a produção de TNF-

α. Nos poços tratados com estas amostras se observou alto efeito citotóxico para a

L929 provocado pelo TNF-α. Até mesmo na maior concentração testada não houve

diferença significativa em relação ao controle positivo.

Os extratos da V. divergens, P. americana, P. amarus, S. aspera, V. scabra e da

R. novemnervia embora não tenham sido capazes de influenciar a modulação da

produção de TNF-α como os extratos da C. pachystachya FF e S. corniculata, na

concentração de 500µg/mL são estatisticamente diferentes do controle positivo

(P<0,001).

Figura 16- Percentual de citotoxicidade frente ao TNF-αααα em fibroblastos murinos L929 através do método de MTT. Os percentuais de citotoxicidade por MTT foram comparados aos controles negativo: 12,38±3,94%/13,95±3,16pg/mL e positivo: 100,12±0,92%/ 3337,60±3,82pg/mL. A região do gráfico entre aproximadamente 77% e 100% de citotoxicidade foi ampliada para melhor observação de cada extrato testado.

4.3- Avaliação da capacidade de modulação da proliferação linfocítica

pelos extratos aquosos selecionados

O processo inflamatório crônico é caracterizado pela presença de infiltrados

mononucleares. O persistente estado reacional do sistema imune intensifica o influxo

|||| 52

de linfócitos, células-chave na resposta imune adaptativa, e a produção de IFN-γ,

citocina responsável pelo acúmulo de macrófagos no local da inflamação, assim como

sua proliferação e a liberação de uma gama de citocinas pelos mesmos que por sua

vez propiciam a continuação do processo de ativação e o influxo de linfócitos (DA

SILVA et al., 2003). A proliferação contínua e inapropriada de linfócitos conduz a

liberação acentuada de uma gama de mediadores químicos responsáveis pela

destruição tecidual. Deste modo, avaliamos se os extratos aquosos selecionados

seriam capazes de modular a proliferação linfocítica, tendo uma ação

imunossupressora.

Obtivemos células da medula óssea periférica (PBMC) que foram plaqueadas e

estimuladas com fitohemaglutinina (0,5µg/mL) e tratadas com os extratos aquosos na

concentração de 500, 100 e 20µg/mL durante 5 dias. A capacidade de modulação foi

comparada ao da Ciclosporina A, conhecida por apresentar potente atividade

imunossupressora, utilizada na concentração de 8µg/mL, com uma taxa percentual de

inibição de 91,02±2,30 (Figura 17).

Figura 17- Estrutura química do fármaco imunossupressor Ciclosporina A (http://www.netdrugs.info).

Ao analisarmos a Figura 18A, observamos que o extrato de P. amarus foi o que

mais se destacou na modulação da proliferação linfocítica 67,55±2,32% na

|||| 53

concentração de 500µg/mL e 41,82±5,15% na concentração de 100µg/mL, na menor

concentração não se observa mais uma inibição expressiva (20,56±4,65%).

Os extratos de S. corniculata e C.pachystachya FF, na maior concentração,

demonstraram diferença significativa na atividade inibitória, P<0,05 quando comparado

ao extrato de P.amarus. Ambos não possuem diferença na capacidade de inibição

entre eles, tendo inibido 53,41±0,49% e 49,58±1,16% respectivamente. Todavia, nas

concentrações de 100 e 20µg/mL, a modulação não foi mantida sendo reduzida a

28,78±0,99% e 25,96±2,32% para S. corniculata e 31,02±2,49 e 14,45±0,99% para C.

pachystachya FF.

A atividade dos três extratos relatados quando comparada com o do fármaco

padrão utilizado mostra-se bastante expressiva para a concentração de 500µg/mL,

levando em consideração que os extratos aquosos são constituídos por uma gama de

substâncias.

Outros extratos, como A. cuyabensis e R. novemnervia apresentaram atividade

de inibição intermediária, 44,06±0,66% e 41,71±1,66% cada, para a maior

concentração testada não mantendo a mesma atividade modulatória nas menores

concentrações.

A capacidade de modular a proliferação linfocítica dos extratos P. americana, V.

scabra, S. santaremensis, S. aspera, P. angustifolia e V. divergens foi inferior a 40%

desde 500µg/mL. A atividade modulatória dos extratos de V. divergens e P. angustifolia

foram as menores.

De modo geral, a capacidade de modulação da proliferação linfocítica ocorreu

de maneira concentração-dependente para todos os extratos e para averiguar se a

atividade inibitória vista não estava relacionada à morte celular, a liberação específica

de lactato desidrogenase foi mensurada. Na Figura 18B, pode-se comparar os pontos

de maior atividade inibitória com o percentual de morte celular que se manteve abaixo

de 40%, tendo o extrato de P. amarus índices de liberação específica de LDH de

37,34±0,27%, S. corniculata, de 33,61±1,92% e C. pachystachya FF, de 33,45±0,82%.

|||| 54

Figura 18- Efeito modulatório e citotoxicidade dos extratos aquosos selecionados no 2º screening na proliferação de linfócitos. Células mononucleares do sangue periférico foram estimuladas com PHA (0,5µg/mL) e tratadas com os extratos aquosos selecionados nas concentrações de 500, 100 e 20µg/mL. (A) Os percentuais de inibição da proliferação linfocítica foram comparados aos controles positivo: 9,52±1,54%/ D.O. 0,09±0,00 e negativo: 94,39±5,99/ D.O. 0,46±0,00. (B) Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 9,88±1,99%/ D.O.0,16±0,02 e positivo: 100±4,46%/ D.O. 1,08±0,04. O percentual de inibição da proliferação linfocítica foi comparado ao observado para o fármaco padrão, Ciclosporina A (91,02±2,30), na concentração de 8µg/mL,

4.4- Análise da atividade antioxidante dos extratos aquosos selecionados

O processo inflamatório gera a produção de radicais livres de oxigênio (RLO) e

de nitrogênio (RLN), que apesar de exercerem funções importantes relacionadas à

eliminação do agente invasivo, também são responsáveis pela lesão tecidual e o

agravamento da patologia (CARVALHO, 2004). A neutralização dos radicais livres pode

ser aplicada na minimização dos danos teciduais nos quadros inflamatórios.

Nesta etapa, iniciamos o estudo do mecanismo da atividade inibitória da

produção de NO pelos extratos aquosos selecionados, avaliando se ocorre sequestro

da molécula de NO por parte dos extratos ou se a atividade de inibição está associada

à modulação da enzima iNOS.

Para tal avaliação utilizamos um modelo experimental onde o nitroprussiato de

sódio, um doador de óxido nítrico, simula a presença do macrófago estimulado, para a

análise apenas do mecanismo de ação sobre a molécula de NO liberada. Inicialmente,

padronizamos o método de avaliação da atividade antioxidante para maior proximidade

|||| 55

com o ensaio celular em termos de quantidade em micromolar de NO. Outros fatores

também foram avaliados como a presença ou ausência de luz e o tempo de exposição

ao SNP uma vez que na literatura não havia menção sobre o primeiro fator e o tempo

de exposição de extratos vegetais ou meio celular ao SNP diferia entre autores.

Como pode ser observado na Figura 19A, a incidência de luz interfere na

liberação de óxido nítrico pelo SNP. A presença de luz acarreta maior liberação de NO

a partir do SNP, independente da concentração de SNP utilizada nestas condições,

enquanto na ausência de luz, as concentrações de 5, 10 e 15mM não são

estatisticamente diferentes do controle negativo. As concentrações de 5, 10, 15 e

20mM de SNP na ausência de luz não se diferenciam significativamente da

concentração de 5mM de SNP na presença de luz.

Após verificar a importância da presença de luz foi observado que a

concentração de 10mM de SNP libera uma quantidade de NO2- em micromolar

semelhante a obtida no ensaio celular, sendo escolhida, portanto para ser usado na

avaliação da atividade antioxidante dos extratos.

Sabendo que a melhor concentração para representar o ensaio celular foi a de

10mM utilizamos esta para verificar qual seria o melhor tempo de exposição do SNP a

luz nesta concentração. O tempo de exposição do SNP de 150 minutos, na

concentração de 10mM, foi o que melhor se enquadrou nos parâmetros celulares de

acordo com a quantidade de NO2- em micromolar obtida no estímulo da RAW 264.7. A

partir de 250 minutos de exposição a quantidade de NO2- liberada não é

estatisticamente diferente, mostrando a saturação da liberação de NO pelo SNP

(Figura 19B).

Figura 19- Padronização da atividade antioxidante do nitroprussiato de sódio. (A) O SNP, nas concentrações de 5 a 25mM, foi diluído em DMEM-F12 e exposto ou não a luz durante 150 min. (B) Avaliação do tempo de exposição do SNP a luz na concentração de 10mM. A quantidade em milimolar de NO2

- obtida foi comparada ao controle sem SNP (3,13±0,08µM).

A B

|||| 56

Posterior à padronização do método de avaliação da atividade antioxidante pelo

SNP, os 11 extratos selecionados foram diluídos na concentração de 500, 100 e

20µg/mL em DMEM-F12 e expostos a concentração de 10mM de SNP por 150

minutos. Após este período, a quantidade de nitrito presente no meio foi mensurada por

reação de Griess.

Todos os extratos testados apresentaram percentuais de sequestro pouco

expressivos quando comparados as maiores concentrações testadas para o flavonoide

rutina, conhecido por sua atividade antioxidante, apesar de todos os extratos serem

significativamente diferentes do controle positivo, DMEM-F12 acrescido de 10mM de

SNP (76,66±0,49µM) (Figura 20).

Os extratos aquosos de R. novemnervia, S. corniculata e P.amarus foram os que

apresentaram menor atividade sequestradora na maior concentração testada, tendo

16,49±0,00%, 16,75±0,73% e 16,53±1,09% respectivamente, além disso os mesmos

mantiveram sua ação sequestradora bem similar desde a menor concentração e se

diferem estatisticamente do padrão exibido pela rutina na menor concentração

(32,01±0,70).

O extrato da S. aspera sequestrou em torno de 6% nas menores concentrações,

porém na concentração de 500µg/mL o percentual de sequestro quadruplicou

(24,48±2,55) mesmo permanecendo abaixo do visto para a rutina na menor

concentração (P<0,001).

O percentual de sequestro exibido por V. divergens (32,47±0,72), P. americana

(28,86±0,72) e P. angustifolia (31,18±1,09) na maior concentração testada, é

significativamente similar ao visto para rutina a 4µg/mL.

Os extratos aquosos de V. scabra, A. cuyabensis, C. pachystachya FF e S.

santaremensis apresentaram percentual de sequestro intermediário dentre o grupo e

comparados ao flavonoide padrão, independente de sua concentração observamos

diferença significativa na capacidade de sequestro.

|||| 57

Figura 20- Percentual de sequestro de óxido nítrico pelos extratos selecionados na presença do SNP. O percentual de sequestro foi comparado ao controle negativo: 100,00±0,52%/ 4,66±0,41µM e ao controle positivo: 0,00±0,72%/ 69,66±1,41µM. O flavonoide rutina foi utilizado como referência da atividade antioxidante. (P<0,001)

4.5- Seleção dos extratos aquosos para estudo de suas frações e

substância isolada

Nesta etapa, selecionamos os extratos que teriam sua atividade biológica

explorada através do estudo de suas frações e substâncias isoladas para

compreendermos quais seriam as possíveis moléculas responsáveis pelas atividades

de inibição observadas.

Levamos em consideração o desempenho dos 11 extratos aquosos no

screening de atividade modulatória de NO, TNF-α, proliferação linfocítica e atividade

antioxidante como também os extratos que já estivessem em fase de purificação pela

equipe da Profa Sônia Costa no NPPN/UFRJ. Dessa forma, seria possível desenvolver

um fracionamento biomonitorado pelos ensaios biológicos, avaliando a atividade das

frações e subseqüentemente das substâncias isoladas das frações mais ativas.

Após avaliar estes dois critérios foram selecionados os extratos aquosos da V.

divergens e o da folha fêmea de C. pachystachya. Embora o extrato da V. divergens

tenha apresentado menor destaque nas atividades avaliadas, os relatos literários sobre

|||| 58

atividade biológica da espécie são bastante expressivos demonstrando que uma

melhor atividade possa ser alcançada a partir do estudo das partes purificadas

Primeiramente descrevemos os resultados obtidos para as frações e substância

isolada do extrato de V. divergens e, posteriormente, para o extrato de C.

pachystachya.

4.5.1- Obtenção das frações e substância isolada do extrato de V.

divergens.

O decocto das folhas de V. divergens foi purificado com auxílio de três técnicas:

precipitação com etanol, partição com solventes orgânicos e cromatografia.

Primeiramente, o decocto foi precipitado em etanol para a separação do sobrenadante

contendo micrometabólitos, substâncias de interesse para o estudo. Este sobrenadante

foi então particionado na presença de três solventes orgânicos (diclorometano, acetato

de etila e n- butanol) em ordem crescente de polaridade. Foram obtidas uma fração em

diclorometano (Vd Fr.CH2Cl2), uma em acetato de etila (Vd Fr.AcOEt), uma fração

butanólica (Vd Fr.BuOH) e uma fração aquosa residual (Vd Fr.Aqr).

As frações butanólicas e em acetato de etila foram analisadas por cromatografia

e em ambas foram verificadas a presença de flavonoides. Por a fração butanólica

apresentar atividade biológica mais expressiva que a fração em acetato de etila, como

pode ser observado a seguir, esta foi posteriormente fracionada e um flavonoide foi

isolado (VdF). O flavonoide isolado é a 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo

e sua estrutura se encontra em seguida (Figura 21).

A fração butanólica, de acetato de etila, de diclorometano e o flavonoide isolado

estavam liofilizados e foram ressuspendidos em DMSO na concentração de 20mg/mL,

para diminuir a concentração de DMSO exposta a cultura celular, enquanto a fração

aquosa foi ressuspendida em PBS na concentração de 10mg/mL. Todas as amostras

foram filtradas antes de sua utilização.

|||| 59

Figura 21- Estrutura química da 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo isolada do extrato de V. divergens

4.5.2- Atividade modulatória na produção de óxido nítrico e citotoxicidade

das frações e substâncias isoladas do extrato aquoso de V. divergens

Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com LPS e tratados com as frações

butanólica (Vd Fr. BuOH), em diclorometano (Vd Fr. CH2Cl2), em acetato de etila (Vd

Fr AcOEt) nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL e pelo flavonoide isolado da

fração butanólica (VdF), nas concentrações de 100, 20 e 4µg/mL. Para comparação da

capacidade de modulação foi utilizado o extrato aquoso da V. divergens e o flavonoide

luteolina purificado (Sigma Aldrich) uma vez que sua estrutura corresponde à parte

aglicona do flavonoide isolado e a massa obtida do mesmo ser muito pequena não

permitindo seu teste além da avaliação da capacidade modulatória de NO, TNF-α e de

sua citotoxicidade.

Na Figura 22A notamos que a fração em diclorometano na concentração de

500µg/mL exibiu um percentual de inibição de 50,76±3,68 e quando cinco vezes diluído

reduziu sua atividade em torno de 11%. Nas menores concentrações testadas não

houve inibição acima de 40% da produção de NO, assim como ocorrido para o extrato

aquoso de V. divergens. Apenas a concentração de 4µg/mL desta fração não se

diferenciou do grupo não tratado ao contrário do visto para a mesma concentração do

extrato (P<0,01), refletido no valor de IC50 de 375,4±0,41µg/mL. Os testes de

citotoxicidade por LDH e MTT mostraram que a fração em diclorometano não foi tóxica

a cultura celular mesmo na concentração de 500µg/mL, sendo de 13,47±1,30% e

27,17±2,95% respectivamente (Figura 22B e 22C).

|||| 60

Figura 22- Efeito modulatório na produção do NO e citotoxicidade das frações, 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo isoladas do extrato aquoso de V. divergens e da luteolina. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com LPS 1µg/mL e tratados com as frações: butanólica, em diclorometano, em acetato de etila e aquosa nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL e com o flavonoide isolado, nas concentrações de 100, 20 e 4µg/mL. (A) Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO. O controle positivo foi de: 0,00±0,09%/ 38,12±0,21µM e negativo: 100,00±1,05%/ 3,85±0,36µM. (B) Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 5,44±0,90%/ D.O. 0,00±0,04 e positivo: 99,94±0,12%/ D.O. 0,84±0,08 e (C) os percentuais de citotoxicidade por MTT aos controles negativo: 11,26±5,78%/ D.O. 0,09±0,03 e positivo: 100,09±2,81%/ D.O. 1,14±0,06. A legenda no lado direito inferior refere-se a todos os gráficos.

A fração aquosa mesmo na maior concentração não foi capaz de modular em

mais de 40% a produção de óxido nítrico, sendo diferente do extrato aquoso de V.

divergens na concentração de 500, 100µg/mL (P<0,05) e 20 µg/mL (P<0,01). As

menores concentrações não apresentaram diferença significativa do grupo não tratado,

tendo o valor de IC50 maior que 500µg/mL (588,6±0,44µg/mL), o maior observado entre

LEGENDA

A B

C

|||| 61

as frações testadas. Esta fração exibiu em torno de 16 a 19% de toxicidez em ambos

os métodos na maior concentração testada.

A fração em acetato de etila apresentou 81,76±5,02% de inibição da produção

de NO a 500µg/mL, contudo não manteve esta ação modulatória a 100µg/mL

(33,43±0,52%), P<0,01 em relação ao extrato aquoso da V. divergens na mesma

concentração. A concentração de 4µg/mL não se diferenciou do percentual obtido pelo

grupo não tratado (IC50: 151,2±0,33µg/mL). Quando comparado as substâncias

isoladas VdF e luteolina todas as concentrações exibiram P<0,001. Nesta fração o

percentual de toxicidade não ultrapassou 40%, sendo 27,23±0,40 no teste de LDH e

35,18±1,67 no teste de MTT.

A fração que se destacou expressivamente pela atividade inibitória foi a

butanólica, no qual as concentrações de 500, 100 e 20µg/mL mostraram percentual de

98,17±2,10; 97,569±5,54 e 60,487±1,05, respectivamente. A concentração de 4µg/mL

diferencia-se significativamente do percentual observado para as substâncias

purificadas VdF e a luteolina (P<0,001). Quando comparado ao extrato aquoso de V.

divergens sua ação modulatória é maior logo acima de 20µg/mL, sendo a atividade

inibitória apresentada nesta diferente estatisticamente da concentração de 500µg/mL

(P<0,001). Todas as concentrações utilizadas apresentaram citotoxicidade dentro do

limite de 40% para 500µg/mL. Por ter sido a fração que mais se destacou seu IC50 é

15,15±0,07µg/mL, a fração mais potente do extrato da V. divergens.

No que diz respeito à substância isolada da fração butanólica, VdF, percebe-se

que este é 20 vezes mais potente que o extrato aquoso da V. divergens e seu IC50

calculado é de 25,16±0,17µg/mL. Entretanto, em relação à fração butanólica, o VdF

demonstrou uma atividade inibitória 1,5 vezes menor para as concentrações acima de

20µg/mL, diferença vista nos valores de IC50. Todas as concentrações do VdF testadas

tiveram toxicidez inferior a 30% no teste de MTT e 6% no teste de LDH. A luteolina

comercial purificada apresentou perfil de ação bem semelhante ao observado para o

VdF, as concentrações de 4 e 20µg/mL não se diferenciam. O percentual de inibição da

luteolina a 100µg/mL é maior que o de VdF e encoberto pela taxa de morte celular

nesta concentração, sendo de 45,13±1,11% para liberação de lactato desidrogenase e

48,49±4,39% no teste de MTT.

Vale enfatizar que o flavonide VdF é bem menos tóxico do que a aglicona

luteolina. Deste modo seu IC50 é 21,16±0,12µg/mL, similar ao visto para o VdF. O VdF

|||| 62

é uma das substâncias responsáveis pela atividade inibitória presente na fração

butanólica e, consequentemente, do extrato aquoso.

O inibidor padrão de iNOS também foi utilizado, 20µg/mL (46,05±3,20%), e sua

ação foi maior do que a vista para a fração aquosa e similar a fração em diclorometano

ambas na maior concentração. A fração em acetato de etila apresentou maior taxa de

inibição somente a 500µg/mL enquanto a fração butanólica nas concentrações de 500,

100 e 20µg/mL exibiram taxas bem acima ao L-NMMA. O flavonoide isolado a

100µg/mL foi duas vezes mais eficiente que o inibidor padrão, não sendo tóxico e a

luteolina nesta concentração teve atividade similar ao L-NMMA.

4.5.3- Modulação da produção do fator de necrose tumoral (TNF-αααα) pelas

frações e substância isolada do extrato aquoso de V. divergens

Como visto no item 4.2.2, o extrato da V. divergens inibiu fracamente a produção

de TNF-α, o mesmo sendo visto para a fração em diclorometano onde somente a

concentração de 500µg/mL foi diferente do controle tratado (0µg/mL), P<0,001. A

fração aquosa em nenhuma concentração se diferenciou do controle tratado. Ambas as

frações mostraram valor de IC50 muito maior que 500µg/mL, sendo as frações menos

potentes que o extrato aquoso (Figura 23).

A fração em acetato de etila, na concentração de 500µg/mL e 100µg/mL, inibiu a

produção de TNF-α em 45,68±1,60% (P<0,001) e 10,40±1,12% (P<0,01)

respectivamente em relação ao controle tratado. O IC50 desta fração é pouco maior que

500µg/mL (631,8±0,44µg/mL), sendo mais potente que a fração aquosa, fração em

diclorometano e o extrato da V.divergens.

A maior atividade modulatória da produção de TNF-α foi observada para a

fração butanólica. Na maior concentração foi observada 40,05±0,47% de toxicidade

para o fibroblasto L929, ou seja, em torno de 60% de inibição da produção de TNF-α,

contudo esta ação não foi mantida quando diluído cinco vezes, 60,62±6,23% de

citotoxicidade para a linhagem L929.

A fração butanólica é a mais potente que o extrato aquoso de V. divergens,

tendo o IC50 equivalente a 206,9±0,37µg/mL. A concentração de 100µg/mL desta

fração possui ação similar a concentração de 500µg/mL da fração em acetato de etila.

|||| 63

A substância isolada, 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo, inibiu

significativamente a produção de TNF-α (P<0,001), em todas as concentrações

testadas, tendo em 100µg/mL, 41.12±0.77 % de inibição e IC50 de 170,5±0,35µg/mL.

Quando comparado a luteolina, o perfil de atividade inibitória é bastante similar com

IC50 de 102,1±0,30 µg/mL, embora a maior concentração da mesma tenha

citotoxicidade acima de 40%. O IC50 encontrado na fração butanólica e na substância

isolada, VdF, são próximos e a concentração de 100µg/mL de ambas não diferem entre

si, assim não somente o 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo deve ser

responsável pela atividade na modulação da produção de TNF-α (Figura 23).

Figura 23- Percentual de citotoxicidade das frações, 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo isoladas do extrato aquoso de V. divergens e da luteolina a fibroblastos L929. Os percentuais de citotoxicidade obtidos através do teste de MTT foram comparados ao controle negativo 9,10±3,97/ 11,46±0,08pg/mL e ao controle positivo 100,16±1,62/ 3338,67±5,41pg/mL.

4.5.4- Análise da atividade antioxidante das frações isoladas do extrato

aquoso de V. divergens e da luteolina

As frações em diclorometano e acetato de etila não possuem diferença em

relação ao grupo não tratado nas duas menores concentrações testadas enquanto para

a fração butanólica somente a concentração de 4µg/mL não possui diferença do

mesmo. Todavia nas concentrações de 100 e 500µg/mL para as frações em

diclorometano e acetato de etila e nas concentrações de 20, 100 e 500µg/mL da fração

butanólica ocorre sequestro do NO liberado em quantidades pequenas, menos de 20%

de sequestro. A fração aquosa em todas as concentrações se distingue do controle não

tratado, mas não apresenta percentual de sequestro superior a 20%. Deste modo, as

|||| 64

frações sequestram muito pouco NO liberado pelo SNP em relação ao visto para o

extrato aquoso da V. divergens (32,37±0,65%) na maior concentração testada e para o

flavonoide padrão utilizado como controle da atividade antioxidante, a rutina, sendo

deste diferente estatisticamente em todas as concentrações (Figura 24).

Como não havia mais quantidade de 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-

glucopiranosídeo, o VdF, a luteolina foi utilizada para todos os experimentos adiante

como substituto do mesmo uma vez que demonstrou um perfil de atividade similar além

de ser a parte aglicona que compõem o VdF. O percentual de sequestro apresentado

pela luteolina foi 10% a menos em comparação ao extrato aquoso de V. divergens e

20% a menos comparado a rutina.

Os dados mostram que a fração butanólica e a luteolina, as que mais se

destacaram, sequestram pouca quantidade de NO e sua expressiva atividade inibitória

dos níveis de NO na cultura de macrófagos estimulados, por conseguinte, está

relacionada a outro tipo de mecanismo de modulação.

Figura 24- Percentual de sequestro de óxido nítrico das frações isoladas do extrato aquoso de V. divergens e da luteolina. O percentual de sequestro foi comparado ao controle negativo: 100,00±0,02%/ 4,60±0,11µM e ao controle positivo: 0,00±0,05%/ 70,51±0,36µM. O flavonoide rutina foi utilizado como referência da atividade antioxidante. (P<0,001)

|||| 65

4.5.5- Avaliação indireta do mecanismo de ação do extrato aquoso, frações

e da luteolina na atividade da enzima iNOS

Sabe-se que após os macrófagos serem ativados, a transcrição do gene iNOS é

iniciada aproximadamente 1 hora após, enquanto a expressão protéica ocorre 3 a 4

horas depois. Em 8 horas, os níveis de RNAm iNOS e da proteína são

consideravelmente aumentados (ZHAI et al., 2009).

Para estudar o mecanismo de supressão da produção de NO, inicialmente

avaliamos se o extrato aquoso, frações e a luteolina eram capazes de modular a

atividade da enzima iNOS. Assim, macrófagos RAW 264.7 foram estimulados durante

12 horas por LPS (1µg/mL) na ausência de tratamento e posteriormente todo o

sobrenadante foi retirado e substituído por DMEM-F12 acrescido de 10% de SBF e as

diluições dos extratos, frações e a luteolina por mais 12 horas sem a presença de

estímulo. O sobrenadante retirado foi utilizado para dosagem da produção de NO pelo

método de Greiss para confirmar há eficiência do estímulo e da inibição.

A fração aquosa não foi utilizada devido seu baixo desempenho nos

experimentos realizados anteriormente. Como se pode observar na Figura 25, a

fração em diclorometano é diferente do grupo não tratado apenas na concentração de

500µg/mL (P<0,001), contudo somente 16,96±4,49% da produção de NO foi modulada.

A fração em acetato de etila foi diferente do grupo tratado nas concentrações de

20 (P<0,05), 100 (P<0,05) e 500µg/mL (P<0,001), tendo na última modulado a

produção de NO em 26,15±1,49%.

A fração butanólica apresentou diferença estatística do controle positivo em

todas as concentrações testadas e das frações foi a que melhor modulou a atividade da

iNOS exibindo 44,52±0,50 de inibição da produção de NO. Avaliando o percentual de

sequestro obtido pela fração ser menor que 20% e esta possuir um percentual de

inibição elevado pode-se sugerir que haja outro mecanismo envolvido, como a ação na

expressão enzimática da iNOS. A modulação da atividade enzimática não pode ser

completamente descartada, porém, sua participação parece ser menos marcante.

A luteolina apresentou um perfil de modulação similar ao da fração butanólica

nas concentrações menores, 14,84±0,50%, para a concentração de 20µg/mL e

18,02±0,99 na maior concentração.

Na ausência do pré-tratamento da cultura, a luteolina (21,16±0,12µg/mL) foi

menos potente que a fração butanólica (15,15±0,07µg/mL) uma vez que seu IC50 foi

|||| 66

maior, porém na condição de pré-tratamento a fração butanólica (>500µg/mL) foi

menos potente que a luteolina (364,1±0,40µg/mL) indicando que embora a ação

modulatória na produção de NO vista para luteolina seja menor do que para a fração

butanólica, a ação inibitória da luteolina está mais vinculada a modulação da atividade

enzimática da iNOS do que ocorre para a fração.

Figura 25- Avaliação da capacidade de modulação da atividade enzimática da iNOS pelo extrato aquoso de V. divergens, frações e a luteolina. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados por 12h e posteriormente tratados na ausência de estímulo por mais 12h. A concentração de NO2

- em micromolar foi comparada ao controle negativo: 5,66±0,41µM.

4.5.6- Análise da capacidade de modulação da expressão enzimática da

iNOS pelo extrato aquoso da V. divergens, frações e luteolina

Após avaliar a ação do extrato aquoso, das frações e da luteolina na atividade

sequestradora de NO e na atividade enzimática da iNOS continuamos o estudo dos

mecanismos de ação quanto a expressão enzimática da iNOS. Para tal, macrófagos

RAW 264.7 foram estimulados por LPS e tratados com o extrato, frações e substância

isolada durante 24 horas. Posteriormente o lisado celular foi preparado e 100µg de

proteínas de cada amostra foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida e

logo após a técnica de Western blotting, onde a membrana de nitrocelulose foi tratada

com anticorpo anti-iNOS murino.

A proteína iNOS possui peso molecular de aproximadamente 114 kDa. O peso

molecular Rainbow (GE Heatlhcare) foi utilizado como padrão para comparação com a

banda protéica obtida.

|||| 67

As amostras referentes à espécie C. pachystachya foram preparadas e

submetidas junto com as amostras da espécie V. divergens a eletroforese em gel

contínuo e por isso os resultados de ambas estão sendo mostrados, porém os

comentários para os resultados exibidos pela espécie C. pachystachya serão feitos

posteriormente na parte destinada a descrição da sua atividade biológica.

Na Figura 26 C, observamos que o extrato aquoso possui baixa capacidade de

modular a expressão enzimática da iNOS visto a presença de uma banda bastante

significativa quando a concentração de tratamento foi de 100µg/mL; ainda a 500µg/mL

houve marcação moderada para iNOS o que justifica o extrato aquoso da V. divergens

ter exibido moderada capacidade de inibir a produção de NO no ensaio de Greiss

mesmo na maior concentração.

Com relação às frações, a fração em diclorometano apresentou capacidade

modulatória inferior à observada para a fração em acetato de etila uma vez que se

pode notar a presença da banda protéica de iNOS em baixa intensidade na

concentração de 500µg/mL, o que não é visto para a fração em acetato de etila. Na

menor concentração de tratamento ambas as frações exibiram marcação para a

presença de iNOS. O que justifica a fração em diclorometano ter apresentado menor

inibição da produção de NO e consequentemente menor IC50 que o observado para a

fração em acetato de etila (Figura 26 B).

A fração butanólica mostrou expressivo desempenho na inibição da expressão

da proteína iNOS visto não apresentar marcação na região correspondente a 114 kDa

e o IC50 ser o menor apresentado dentre as outras frações e substância isolada

corrobora a eficácia da fração butanólica.

A luteolina na concentração de 100µg/mL não apresentou marcação da banda

protéica para iNOS contudo deve-se considerar sua maior toxicidade nesta

concentração. Na concentração de 20µg/mL, houve presença da banda protéica

justificada por sua inibição da produção de NO nesta concentração ser em torno de

44% (Figura 26 A).

Após avaliar os três possíveis mecanismos de inibição da produção de NO para

o extrato aquoso da V. divergens, suas frações e para a luteolina observamos que o

mecanismo de ação inibitório das amostras tem haver de forma pronunciada com a

modulação da expressão enzimática da iNOS e em menor grau com a atividade

antioxidante, não podendo-se excluir em alguns casos como da fração butanólica sua

possível atuação na atividade enzimática da iNOS.

|||| 68

Figura 26- Avaliação da capacidade de inibição da expressão enzimática da iNOS pelo extrato aquoso da Vochysia divergens, suas frações e da luteolina. As membranas foram nomeadas por letras de A a D para auxiliar na observação

|||| 69

4.5.7- Avaliação da capacidade de inibição da produção de PGE2 pelo

extrato aquoso da V. divergens, frações e luteolina

A prostaglandina E2 é um mediador lipídico presente em altas concentrações

nos processos inflamatórios contínuos, sendo responsável pela ação vasodilatadora,

exarcebação do edema além de estar intimamente envolvida na patogenia da dor e da

febre (FOSSLIEN et al., 2001). Deste modo, a capacidade de modular este mediador

químico é de grande relevância para controle da inflamação.

Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados por LPS e tratados com o extrato

aquoso de V. divergens, as frações butanólica, em diclorometano e em acetato de etila

e a luteolina. Após 24 horas, com auxílio de Kit comercial, a dosagem de

prostaglandina E2 foi efetuada e a concentração da mesma para cada sobrenadante

coletado foi comparada a uma curva de PGE2 padrão.

Para descartar a possibilidade da inibição da PGE2 ter sido encoberta pela

ausência ou fraca ação do estímulo uma quantidade maior do mesmo sobrenadante foi

coletada e testada primeiramente no ensaio de Greiss. Todas as amostras

demonstraram através deste ensaio terem sido devidamente estimuladas apresentando

resultados similares ao observado no ensaio de Greiss realizado anteriormente.

Na Figura 27 podemos observar que o extrato aquoso de V. divergens não

apresentou inibição da produção de PGE2 superior a 12%, mesmo na maior

concentração testada. Como também, a fração em diclorometano não influenciou a

modulação da produção de prostaglandina E2 uma vez que na concentração de

100µg/mL demonstrou 7,98±2,95% de atividade, similar ao encontrado para o extrato.

Ambos, em todas as concentrações testadas foram diferentes do controle positivo

(P<0,001) e tiveram o IC50 calculado superior a 500µg/mL.

A fração em acetato de etila, a 100µg/mL inibiu fracamente a produção de PGE2

em 36,82±0,42% e quando diluída cinco vezes a atividade inibitória foi reduzida para

26%, na menor concentração não houve diferença para o percentual apresentado do

visto para o extrato e para a fração em diclorometano. O IC50 calculado foi de

132,2±0,32 µg/mL.

O melhor desempenho na capacidade de modular a produção de PGE2 foi da

fração butanólica que inibiu aproximadamente 12 vezes mais que a fração em acetato

de etila e quatro vezes mais que a luteolina. Na maior concentração testada o

percentual de inibição não foi diferente do controle positivo tendo 81,73±12,70% de

|||| 70

atividade e mesmo na concentração de 20µg/mL o percentual de inibição foi superior a

60%. O IC50 obtido foi de 10,66±0,01µg/mL, o que indica que a fração butanólica está

diretamente associada à inibição da produção de PGE2.

A luteolina embora tenha conseguido na maior concentração testada inibir mais

de 50% da produção de PGE2, a 20µg/mL sua ação modulatória foi de 40%, deve-se

levar em conta que esta concentração é menos tóxica. Visto seu desempenho ter sido

abaixo da fração butanólica e por se tratar de um flavonoide purificado, para modular a

produção de PGE2 expressivamente assim como visto para o NO, de forma menos

acentuada, a luteolina deve ter sua função associada à outra(s) molécula(s). O valor de

IC50 corrobora os dados sendo para luteolina de 43,45±0,21µg/mL. Assim a luteolina é

menos eficaz que a fração butanólica e também menos potente.

Figura 27- Percentual de inibição da produção de PGE2 pelo extrato aquoso de V. divergens, suas frações e a luteolina. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados e tratados com o extrato nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL e com as frações e a luteolina nas concentrações de 100, 20 e 4µg/mL. Após 24 horas o sobrenadante foi coletado e a concentração de PGE2 presente no sobrenadante dosada através de Kit comercial e comparada a uma curva padrão de PGE2. O percentual de inibição foi comparado ao controle negativo: 99,99±1,30%/ 0,08±0,37µM e ao controle positivo: 0,01±2,10%/ 701,06±3,66.

4.5.8- Verificação da capacidade das frações e da luteolina em inibir o

crescimento de M. bovis BCG

A busca por extratos ou substâncias que sejam capazes de inibir o crescimento

micobacteriano é essencial para o tratamento da tuberculose de forma mais rápida e

menos tóxica. Para algumas cepas micobacterianas o processo inflamatório está

associado à imunopatogenia, deste modo extratos ou substâncias de capacidade anti-

|||| 71

inflamatória comprovada se tornam ainda mais interessantes para o tratamento

ocorrendo o controle da resposta inflamatória exacerbada além da inibição do

crescimento micobacteriano.

Assim, foram escolhidas as frações butanólicas, em diclorometano e em acetato

de etila e a luteolina nas concentrações de 100, 20 e 4µg/mL para avaliar se estas

poderiam inibir o crescimento micobacteriano.

O extrato aquoso da V. divergens não foi avaliado porque no primeiro teste

realizado com outros extratos aquosos escolhidos (M. xanthocentra, P. americana e E.

indica) através do uso etnobotânico em doenças respiratórias, foi observado que a

polaridade dos extratos (aquoso) influenciou negativamente a inibição do crescimento

micobacteriano uma vez que a parede celular micobacteriana possui um perfil lipofílico.

As amostras avaliadas foram diluídas em DMSO na concentração de 20mg/mL e uma

curva padrão do mesmo foi efetuada para que a inibição do crescimento não fosse

devido à morte celular pelos efeitos tóxicos do DMSO. Testaram-se diluições de meio

de cultura bacteriano 7H9 acrescido dos seguintes percentuais de DMSO: 0,5%, 1%,

2%, 4% e 8%. Observando a Figura 28, percebe-se que o melhor percentual de uso

está em torno de 0,5% e 1%, por conseguinte todas as amostras foram diluídas de

forma a manterem este percentual de DMSO para cultura nos testes realizados.

As frações e a luteolina tiveram sua capacidade de inibição comparada ao

fármaco padrão utilizado no tratamento da tuberculose, a rifampicina, que foi testada

nas concentrações de 0,03µg/mL, 0,01µg/mL, 0,0033µg/mL e 0,0011µg/mL. Nas três

maiores concentrações a rifampicina apresentou mais de 90% de inibição no

crescimento bacteriano e na menor concentração testada 70% (Figura 29).

Figura 28- Curva de padronização para DMSO e o fármaco controle, a rifampicina. (P<0,001 em relação ao meio acrescido de M. bovis BCG)

*

* * *

* * *

|||| 72

A fração em diclorometano apresentou na maior concentração de inibição do

crescimento de M. bovis BCG, 69,64±0,40%, e quando cinco vezes diluído exibiu

42,19±1,02%, porém na concentração de 4µg/mL a ação inibitória foi inferior a 25%. O

IC50 verificado para esta fração foi de 41,05±0,17µg/mL, sendo o menor dentre os

demais avaliados.

A fração em acetato de etila demonstrou 85,83±0,40% de inibição do

crescimento micobacteriano a 100µg/mL e mesmo diluído a 20µg/mL apresentou

57,80±1,22% de atividade, sendo esta em torno de 40% na menor concentração. O

IC50 foi de 11,05±0,01µg/mL. Quando comparado a rifampicina, a maior concentração

testada para a fração em acetato de etila exibiu uma potência bem próxima.

A fração de melhor desempenho foi a butanólica, na qual observa-se

98,04±1,02% de atividade inibitória a 100µg/mL e mesmo a 20µg/mL apresenta

91,90±0,40%. Mesmo na menor concentração a fração butanólica exerceu 85% de

inibição no crescimento bacteriano, o que reflete no seu IC50 de 2,52±0,00µg/mL. Os

dados anteriores somados aos da atividade antimicobacteriana sugerem que esta

fração possa vir a ter bom desempenho na imunopatogenia da tuberculose (Figura 29).

Quando analisado a ação da luteolina, sua atividade na maior concentração não

é diferente estatisticamente da observada para a fração butanólica, porém a 100µg/mL,

a citotoxicidade é maior que 40%, como visto anteriormente. Na concentração de

20µg/mL houve 85% de inibição, similar ao observado para a menor concentração da

fração butanólica enquanto a 4µg/mL a luteolina inibe em torno de 75% o crescimento

da M. bovis BCG. O IC50 é bem próximo ao apresentado pela fração butanólica, sendo

de 3,2µg/mL. Outras moléculas podem estar associadas à atividade inibitória junto à

luteolina e seus derivados na fração butanólica como vem sendo visto nos resultados

anteriores.

|||| 73

Figura 29- Efeito inibitório no crescimento de M. bovis BCG pelas frações butanólica, em diclorometano e em acetato de etila e a luteolina. O percentual de inibição foi comparado ao controle negativo: 99,95±0,08%/ D.O. 0,08±0,01 e ao controle positivo: 2,04±0,21%/ D.O. 0,69±0,07.

4.5.9- Obtenção das frações e substância isolada do extrato de C.

pachystachya

O gênero Cecropia é constituído por espécies dióicas, possuindo indivíduos

macho e fêmea. Após analisarmos a atividade biológica das folhas fêmeas da Cecropia

pachystachya e esta apresentar expressiva atividade de inibição da produção de NO e

na modulação do TNF-α quando comparado aos outros extratos iniciamos o estudo da

atividade biológica das frações purificadas da folha fêmea.

Por se tratar de um indivíduo dióico estudamos atividade biológica do extrato

aquoso das folhas masculinas, inflorescências femininas e masculinas e

infrutescências assim como suas frações. Obtivemos amostras de extrato a partir de

duas coletas realizadas pela equipe colaborada da UFRJ/NPPN sob orientação da

Profª Drª Sonia S. Costa. A primeira coleta foi realizada em Arraial do Cabo e desta

foram obtidos folhas e inflorescências femininas e masculinas. A partir desta foram

obtidas as seguintes frações:

Tabela 4 – Relação das partes coletadas dos indivíduos femininos e masculinos em Arraial do Cabo/RJ e seus respectivos fracionamentos.

Arraial do Cabo/RJ Extrato aquoso Fração butanólica Fração aquosa

Folhas fêmeas X X X

Folhas masculinas X

Inflorescência feminina X

Inflorescência masculina X

|||| 74

O extrato aquoso das folhas foi obtido por processo de decocção. O decocto foi

precipitado em etanol e o sobrenadante foi coletado. Enquanto as inflorescências foram

submetidas a um processo de extração aquosa 20% (p/v) e o precipitado em etanol

separado do sobrenadante. O sobrenadante foi particionado em butanol no caso das

folhas fêmeas originando uma fração butanólica e uma fração aquosa residual.

Uma segunda coleta foi realizada na Barra da Tijuca e nesta os indivíduos

femininos não apresentavam mais inflorescências por isso as infrutescências foram

coletadas e as seguintes frações obtidas:

Tabela 5 – Relação das partes coletadas dos indivíduos femininos e masculinos na Barra da Tijuca/RJ e seus respectivos fracionamentos.

A obtenção dos extratos das folhas ocorreu de acordo com o relatado acima e o

extrato das infrutescências obtido similarmente ao executado para as inflorescências.

O flavonoide orientina foi isolado da fração butanólica do extrato das folhas

fêmeas de Cecropia pachystachya coletada em Arraial do Cabo e sua estrutura é

mostrada abaixo na Figura 30.

Figura 30- Estrtura química da orientina isolada do extrato das folhas fêmeas de C. pachystachya.

Barra da Tijuca/RJ Extrato aquoso Fração butanólica Fração aquosa

Folhas fêmeas X X X

Folhas masculinas X X X

Infrutescências X X X

|||| 75


dos extratos de C. pachystachya coletada em Arraial do Cabo e suas frações

Primeiramente os extratos das folhas e inflorescências femininas e masculinas

provenientes da coleta de Arraial do Cabo foram testados quanto a sua capacidade de

inibição da produção de óxido nítrico para comparação dos percentuais obtidos. As

amostras foram diluídas nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL. Todos os

extratos aquosos de C. pachystachya coletados em Arraial do Cabo/ RJ apresentaram

atividade diferente do grupo não tratado, P<0,001 em todas as concentrações testadas.

Na Figura 31 pode-se observar a atividade modulatória dos extratos na produção de

NO e sua citotoxicidade.

O extrato aquoso das inflorescências masculinas nas duas maiores

concentrações testadas demonstrou uma aparente inibição da produção de NO visto

seu percentual de citotoxicidade através do teste de LDH e MTT ser de 47,20±1,47% e

65,85±8,14% respectivamente, na concentração de 500µg/mL e mesmo diluído cinco

vezes a toxicidade ainda permaneceu em torno de 40% de morte celular. A

concentração de 20µg/mL inibiu 52,40±7,51% da produção de NO com um percentual

de toxicidade em torno de 34% em ambos os testes efetuados, contudo na menor

concentração a ação inibitória frente ao NO é menor que o critério proposto

inicialmente de 40%. O IC50 avaliado por regressão não linear foi de 19,8±0,05µg/mL.

Comparado ao extrato aquoso das inflorescências masculinas de C.

pachystachya, as inflorescências femininas foram menos tóxicas uma vez que o

percentual de citotoxicidade avaliado nos testes de LDH e MTT para as mesmas não

ultrapassou 40% de toxicidade. O percentual de inibição da produção de NO do extrato

das inflorescências femininas a 500µg/mL foi de 83,16±2,68% e na concentração de

100µg/mL, 68,73±0,53% e mesmo diluído a 20µg/mL a ação inibitória se mantém em

torno de 60% e a 4µg/mL a modulação da produção de NO é inferior a 40%. O IC50

avaliado é de 14,47±0,06µg/mL, o segundo melhor dentre os extratos testados.

No que diz respeito ao extrato aquoso das folhas masculinas, não há diferença

significativa entre o mesmo e o extrato das inflorescências femininas nas três menores

concentrações, contudo na concentração de 500µg/mL (P<0,01) o extrato das folhas

masculinas possui atividade inibitória de 77,21±1,58%, inferior ao observado para o

extrato das inflorescências femininas mesmo tendo um bom desempenho. Isto reflete

|||| 76

no IC50 calculado de 24,22±0,14µg/mL, sendo menos potente que o extrato das

inflorescências femininas. Este extrato foi o que menor apresentou taxa de toxicidade,

inferior a 30%, em ambos os testes realizados.

O extrato de maior destaque é o das folhas fêmeas sendo diferente

significativamente dos demais extratos nas concentrações de 20, 100 e 500µg/mL

(P<0,001). Na maior concentração observa-se 98,48±3,16% de atividade inibitória, não

havendo diferença do controle negativo. Na concentração de 100 µg/mL, a atividade

encontrada é de 84,81±0,43% e na de 20µg/mL, 74,44±4,18%. Em todas as

concentrações relatadas acima houve diferença significativa comparada aos demais

extratos (P<0,001), somente na menor concentração não se observa a mesma. O IC50

calculado é de 7,68±0,00µg/mL, sendo, portanto o extrato mais potente.

Deste modo, os extratos dos indivíduos femininos apresentam melhor índice de

atividade inibitória da produção de NO quando comparado aos indivíduos masculinos e

as folhas fêmeas detêm maior quantidade de metabólitos secundários envolvidos na

atividade observada do que as inflorescências femininas.

O inibidor padrão de iNOS foi utilizado e a 20µg/mL (47,59±2,87%) sua ação foi

similar a observada para o extrato aquoso das folhas masculinas enquanto os demais

extratos, também na mesma concentração, exibiram atividade inibitória maior que o L-

NMMA.

|||| 77

Figura 31- Modulação da produção de NO e citotoxicidade dos extratos das folhas e inflorescências masculinas e femininas de C. pachystachya. (A) Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com LPS 1µg/mL e tratados com os extratos de C. pachystachya nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL. (A) Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO. O controle positivo foi de: 0,00±1,51%/ 45,00±0,62µM e negativo: 100,02±0,87%/ 3,35±0,36µM. (B) Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 0,04±0,70%/ D.O. 0,14±0,09 e positivo: 99,67±4,60%/ D.O.1,44±0,08 e (C) os percentuais de citotoxicidade por MTT aos controles negativo: 9,16±4,77%/ D.O. 1,08±0,05 e positivo: 100,12±0,28%/ D.O. 0,09±0,03. A legenda no lado direito inferior refere-se a todos os gráficos.

O extrato aquoso das folhas fêmeas de C. pachystachya teve sua fração aquosa

(Fr. Aqr) e butanólica (Fr. BuOH) e a substância isolada da mesma, a orientina,

avaliadas na modulação da produção de NO uma vez que o extrato apresentou melhor

desempenho e possuía fracionamento.

Como observado na Figura 32, a fração aquosa do extrato das folhas fêmeas

não apresentou capacidade modulatória na produção de NO, alcançando somente

21,52±2,66% de inibição da produção de NO para a maior concentração testada, além

disso, a concentração de 4µg/mL não se diferenciou do grupo não tratado e o IC50

A B

C

|||| 78

calculado ultrapassou 500µg/mL. Não foi observada toxicidade à cultura celular

proveniente desta fração estando em torno de 15% em ambos os testes efetuados.

A fração butanólica exibiu expressiva atividade de inibição da produção de NO e

nas maiores concentrações sua ação modulatória foi similar à vista para o extrato

aquoso das folhas fêmeas, no entanto na concentração de 4µg/mL a atividade

modulatória da fração foi de 51,39±5,80%. O valor de IC50 calculado para a fração é

menor que o observado para o extrato aquoso, sendo de 5,84±0,00µg/mL e por isso

mais potente e de mesma eficácia observada no extrato aquoso. A fração butanólica

não exibiu citotoxicidade superior a 20%.

A substância isolada da fração butanólica, a orientina, demonstrou ampla

capacidade de modulação da produção de NO. Em todas as concentrações testadas a

orientina foi significativamente diferente do extrato aquoso da folha fêmea e da fração

butanólica (P<0,001) e na concentração de 100µg/mL seus índices foram similares ao

do controle negativo. Mesmo diluído cinco vezes seu percentual de inibição foi de

88,96±2,08 e na concentração de 4µg/mL, 66,17±5,19%. Esta capacidade inibitória

pode ser avaliada também tendo em vista seu valor de IC50 de 3,5±0,00µg/mL. O

percentual de citotoxicidade na maior concentração foi de 34,93±0,19 para o teste de

LDH e 27,57±3,38 para o teste de MTT. Os dados acima sugerem que a orientina está

diretamente associada à atividade vista para o extrato aquoso e para a fração

butanólica na modulação da produção de NO.

A atividade modulatória do L-NMMA na concentração de 20µg/mL

(48,02±0,08%) quando comparado ao da fração butanólica e da orientina na mesma

concentração foi, aproximadamente, duas vezes menor para a fração e 2,5 vezes para

a orientina.

|||| 79

Figura 32- Modulação da produção de NO e citotoxicidade das frações aquosa, butanólica e orientina purificadas do extrato aquoso das folhas fêmeas de C. pachystachya. (A) Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com LPS 1µg/mL e tratados com as frações aquosa e butanólica, nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL, e com o flavonoide isolado, a orientina, nas concentrações de 100, 20 e 4µg/mL. (A) Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO. O controle positivo foi de: 0,00±1,51%/ 45,00±0,62µM e negativo: 100,02±0,87%/ 3,35±0,36µM. (B) Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 0,04±0,76%/ D.O.0,14±0,09 e positivo: 99,67±4,60%/ D.O.1,44±0,08 e (C) os percentuais de citotoxicidade por MTT aos controles negativo: 9,16±4,77%/ D.O. 1,08±0,05 e positivo: 100,12±0,28%/ D.O. 0,09±0,03. A legenda no lado direito inferior refere-se a todos os gráficos.


dos extratos de C. pachystachya coletada na Barra da Tijuca e suas frações

Como relatado anteriormente no momento da coleta não havia mais a presença

de inflorescência nas espécies vegetais e, por isso coletou-se as infrutescências assim

como as folhas do indivíduo masculino e feminino. Inicialmente os extratos foram

testados quanto à modulação da produção de NO e sua citotoxicidade.

Todos os extratos provenientes da coleta na Barra da Tijuca apresentaram

baixos percentuais de inibição da produção de óxido nítrico em relação aos extratos

das mesmas partes do vegetal coletadas em Arraial do Cabo, embora todas as

concentrações tenham exibido atividade diferente do grupo não tratado.

A B

C

|||| 80

Na Figura 33 pode-se perceber que o perfil de inibição apresentado pelos

extratos de ambas as regiões são similares, o extrato proveniente da coleta na Barra

da Tijuca que exibe maior atividade modulatória é o das folhas femininas, seguido pelo

extrato das infrutescências e por último o extrato das folhas masculinas. Novamente, os

indivíduos femininos apresentam maior capacidade modulatória do que os indivíduos

masculinos.

Na maior concentração avaliada, o percentual de inibição da produção de NO do

extrato das folhas femininas, das folhas masculinas e das infrutescências foi de

32,62±2,96; 22,97±3,12 e 29,28±0,02 respectivamente. Comparado à ação do L-NMMA

(47,56±0,36%) todos os extratos exibiram menor atividade inibitória.

O extrato das folhas e das inflorescências femininas (Arraial do Cabo) foram

aproximadamente 90 vezes mais ativo que o extrato das folhas femininas e

infrutescências provenientes da Barra da Tijuca enquanto o extrato das folhas

masculinas (Arraial do Cabo) foi 62 vezes mais ativo, refletindo no alto valor de IC50

obtido para tais extratos da 2ª coleta (Barra da Tijuca).

O percentual de citotoxicidade apresentado pelos extratos da coleta na Barra da

Tijuca foi menor do que para os extratos da remessa de Arraial do Cabo e mantiveram

a mesma característica vista para os primeiros testados, as folhas masculinas são

menos tóxicas do que as infrutescências e folhas femininas em ambos os testes

independente da região de coleta.

Apesar dos extratos referentes à Barra da Tijuca não terem sido capazes de

modular a produção de óxido nítrico como observado para os extratos provenientes de

Arraial do Cabo, as suas frações foram analisadas a fim de observar se haveria

melhora no desempenho das atividades inibitórias. Portanto, foram analisadas frente à

modulação de NO as frações butanólicas e aquosas que já haviam sido purificadas dos

extratos das folhas femininas e masculinas e do extrato das infrutescências.

|||| 81

Figura 33- Modulação da produção de NO e citotoxicidade dos extratos aquosos das folhas fêmeas, folhas masculinas e infrutescências de C. pachystachya coletadas na Barra da Tijuca e em Arraial do Cabo. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com LPS 1µg/mL e tratados com os extratos de C.

pachystachya nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL (A) Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção. O controle positivo foi de: 0,00±0,34%/ 44,37±0,62µM e negativo: 99,98±0,65%/ 3,22±0,36µM. (B) Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 0,44±0,76%/ D.O. 0,14±0,09 e positivo: 101,67±2,31%/ D.O.1,56±0,12 e (C) os percentuais de citotoxicidade por MTT aos controles negativo: 3,45±0,89%/ D.O. 1,28±0,03 e positivo: 100,00±1,29%/ D.O. 0,05±0,12. A legenda no lado direito inferior refere-se a todos os gráficos e as letras “B” e “A” indicam o local de coleta: Barra da Tijuca e Arraial do Cabo.

As frações butanólicas, de um modo geral, apresentaram melhor atividade que

as frações aquosas para todos os extratos testados, como pode ser visto na Figura 34.

A avaliação da atividade biológica proporcionada pelo fracionamento dos extratos

exibiu pouca melhora da capacidade modulatória comparada à atividade inibitória da

fração butanólica do extrato das folhas femininas coletadas em Arraial do Cabo.

C

A B

|||| 82

Figura 34- Efeito modulatório dos extratos aquosos de C. pachystachya e suas frações (Barra da Tijuca) frente ao NO e sua toxicidade. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados com LPS 1µg/mL e tratados com os extratos e frações de C. pachystachya nas concentrações de 500, 100, 20 e 4µg/mL (A, C, E) Os percentuais de inibição da produção de NO foram comparados aos controles de produção de NO. O controle positivo foi de: 0,00±1,51%/ 44,30±0,62µM e negativo: 100,02±0,87%/ 3,22±0,30µM. (B, D, F) Os percentuais de citotoxicidade por LDH foram comparados aos controles negativo: 0,04±0,76%/D.O. 0,14±0,09 e positivo: 99,67±4,60%/ D.O.1,44±0,08.

A melhor atividade inibitória das frações foi vista somente na concentração de

500µg/mL e a fração com melhor desempenho nesta concentração foi a fração

A B

C D

E F

|||| 83

butanólica das folhas femininas apresentando 52,88±0,75% de inibição da produção de

NO. O IC50 calculado foi de 421,5±0,41µg/mL.

A fração butanólica das infrutescências apresentaram 45,77±2,32% de

capacidade modulatória enquanto a fração butanólica das folhas masculinas exibiram

43,79±1,16%, ambas apresentaram IC50 maior que 500µg/mL. Nenhuma das frações

aquosas testadas foi capaz de inibir significativamente a produção de NO.

A fração butanólica purificada das folhas fêmeas coletadas em Arraial do Cabo é

85 vezes mais ativa do que a fração butanólica da mesma parte do vegetal oriunda da

Barra da Tijuca.

Deste modo, mesmo após o processo de fracionamento não foi possível a

obtenção de uma melhor atividade visto que em concentrações elevadas as frações por

estarem mais purificadas deveriam exibir maior capacidade de inibição quando

comparado aos extratos, somente a fração butanólica das folhas femininas exibiu o

dobro de atividade a 500µg/mL que não se manteve quando cinco vezes diluída.

Relacionando a atividade do L-NMMA, na concentração de 20µg/mL

(48,13±0,20%), algumas frações butanólicas exibiram atividade similar como a das

folhas femininas e a da infrutescência enquanto a fração butanólica das folhas

masculinas exibiu taxa percentual inferior.

Por terem apresentado baixa atividade modulatória frente ao observado para os

extratos da primeira coleta (Arraial do Cabo), os extratos e frações da Barra da Tijuca

não foram avaliados em outros testes.

4.5.12- Modulação da produção do fator de necrose tumoral (TNF-αααα) pelos

extratos, frações e substância isolada de C. pachystachya

O extrato das folhas fêmeas de C. pachystachya, como visto anteriormente, foi o

que mais inibiu a produção de TNF-α dentre os extratos de outras espécies testadas no

2º screening, apresentando 23% de inibição.

Para compreendermos como decorreria a modulação do TNF-α por extratos de

indivíduos femininos e masculinos de C. pachystachya assim como de partes distintas

do vegetal, o percentual de inibição da produção de TNF-α pelo extrato das folhas

femininas foi comparado ao obtido pelos extratos das folhas masculinas e

inflorescências femininas. O extrato das inflorescências masculinas não foi testado por

apresentar citotoxicidade elevada para os testes de LDH e MTT.

|||| 84

Na Figura 35, percebe-se que os extratos provenientes das partes dos

indivíduos femininos possuem uma atividade melhor do que as mesmas de indivíduos

masculinos. Nas menores concentrações testadas não houve diferença do grupo não

tratado.

Somente na maior concentração todos os extratos modularam mesmo que em

baixa quantidade a produção de TNF-α . O extrato das folhas fêmeas demonstrou

melhor desempenho na capacidade de modulação do que os demais, inibindo 24% da

produção de TNF-α enquanto o extrato das inflorescências femininas exibiu 17% de

atividade. O extrato das folhas masculinas manteve o perfil observado na inibição da

produção de NO sendo o menos ativo, modulando cerca de 9% da produção de TNF-α.

Figura 35- Percentual de citotoxicidade dos extratos aquosos das folhas masculinas e das folhas e inflorescências femininas de C. pachystachya frente aos fibroblastos L929. A inibição da produção de TNF-α foi medida indiretamente pelo bioensaio com L929 utilizando o sobrenadante proveniente do tratamento com a RAW 264.7. Os percentuais de citotoxicidade obtidos através do teste de MTT foram comparados ao controle negativo 9,10±3,97%/ 11,46±0,08pg/mL e ao controle positivo 100,16±1,62%/ 3338,67±5,41pg/mL.

.

Como o extrato aquoso das folhas fêmeas teve o melhor desempenho na

modulação da citocina TNF-α e considerando o mesmo ter frações purificadas com

bons resultados na inibição da produção de NO, estas foram avaliadas na produção de

TNF-α e os resultados são mostrados na Figura 36.

A fração aquosa das folhas fêmeas não apresentou diferença significativa do

grupo não tratado nas concentrações de 4 e 20µg/mL somente nas maiores

concentrações (P<0,05). Mesmo a 500µg/mL seu percentual de inibição foi menor do

|||| 85

que o observado para o extrato aquoso e para a fração butanólica, sendo de

92,39±0,97% seu percentual de citotoxicidade.

A fração butanólica por sua vez, nas menores concentrações não exibiu

diferença do grupo não tratado, e na concentração de 100µg/mL sua capacidade

modulatória foi similar ao observado para o extrato aquoso se diferenciando deste

(P<0,001) na maior concentração apresentando em torno de 40% de inibição da

produção de TNF-α. Apesar do desempenho da fração butanólica comparado ao do

extrato aquoso ter sido mais expressivo, os dados sugerem que outra fração pode estar

relacionada à inibição da produção de TNF-α, visto seu IC50 superior a 500µg/mL.

A substância isolada da fração butanólica, a orientina, apresentou em todas as

concentrações diferença significativa do controle positivo, da fração aquosa e

butanólica e do extrato aquoso (P<0,001). Na menor concentração o percentual de

citotoxicidade para a L929 foi de 90,95±1,02 e na concentração de 20µg/mL,

67,57±0,89%, ou seja, inibiu a produção de TNF-α em mais de 30%, ação modulatória

acima do observado para o extrato aquoso na concentração de 500µg/mL. Na maior

concentração testada para a orientina, a inibição da produção do fator de necrose

tumoral foi de 58,69±1,02%. O valor de IC50 calculado por regressão não linear foi de

55,63µg/mL. O valor de IC50 calculado e a diferença significativa (P<0,001) do controle

negativo sugerem que a orientina embora possua excelente capacidade modulatória da

produção de TNF-α, atue conjuntamente a outra(s) molécula(s) que aparentemente

não estão presentes na fração butanólica.

Figura 36- Percentual de citotoxicidade das frações aquosa e butanólica e da orientina purificados do extrato aquoso das folhas femininas de C. pachystachya ao fibroblasto L929. Os percentuais de citotoxicidade obtidos através do teste de MTT foram comparados ao controle negativo 9,10±3,97%/ 11,46±0,08pg/mL e ao controle positivo 100,16±1,62%/ 3338,67±5,41pg/mL.

|||| 86

4.5.13- Análise da atividade antioxidante dos extratos, frações e substância

isolada de C. pachystachya

Para compreender o mecanismo de inibição da produção de NO vista para os

extratos, frações e substância isolada do extrato aquoso de C. pachystachya e

averiguar se poderia estar relacionado à atividade antioxidante dos mesmos, o ensaio

com nitroprussiato de sódio, SNP, foi realizado.

Na Figura 37 observamos que o extrato da folha masculina em todas as

concentrações testadas se mostrou diferente do grupo não tratado (P<0,001) sendo o

extrato com maior percentual de atividade sequestradora. Na concentração de

500µg/mL, este exibiu 33,73±2,06% de ação antioxidante similar ao visto para o

flavonoide padrão, a rutina, na menor concentração testada. Assim parte da atividade

inibitória obtida pelo extrato se deve na verdade ao sequestro da molécula de NO.

Os extratos das folhas e das inflorescências femininas possuem um perfil bem

similar em todas as concentrações não sendo diferentes estatisticamente. Na maior

concentração a atividade de sequestro foi inferior a 25%. O percentual de sequestro

menor do que observado para a rutina e para as folhas masculinas sugerem que a

inibição da produção de NO pelos extratos oriundos das partes vegetais de indivíduos

femininos está relacionada a outro tipo de mecanismo de modulação, como a

modulação da atividade ou expressão enzimática da iNOS.

Figura 37- Percentual de sequestro de óxido nítrico pelos extratos aquosos das folhas masculinas e das folhas e inflorescências femininas de C. pachystachya. O percentual de sequestro foi comparado ao controle negativo: 100,00±0,02%/ 4,60±0,11µM e ao controle positivo: 0,00±0,05%/ 70,51±0,36µM. O flavonoide rutina foi utilizado como referência da atividade antioxidante.

|||| 87

As frações aquosa e butanólica também foram avaliadas quanto a atividade

antioxidante assim como a orientina. A fração aquosa na menor concentração não

apresentou diferença do grupo não tratado e mesmo na concentração de 500µg/mL

seu percentual de sequestro não ultrapassou 17% enquanto a fração butanólica obteve

um percentual de sequestro similar ao exibido pelo extrato aquoso. Do mesmo modo, a

substância isolada também apresentou baixo percentual de sequestro, em torno de

18%, abaixo do observado para a fração butanólica de onde foi purificada (Figura 38).

A fração butanólica e a orientina possuem outro mecanismo de ação assim

como o extrato aquoso das folhas fêmeas que respondam pelo sua expressiva inibição

da produção de NO.

Figura 38- Percentual de sequestro de óxido nítrico pelas frações aquosa e butanólica e da orientina purificados do extrato aquoso das folhas femininas de C. pachystachya. O percentual de sequestro foi comparado ao controle negativo: 100,00±0,02%/ 4,60±0,11µM e ao controle positivo: 0,00±0,05%/ 70,51±0,36µM. O flavonoide rutina foi utilizado como referência da atividade antioxidante.

4.5.14- Avaliação indireta do mecanismo de ação do extrato aquoso,

frações e da orientina na atividade da enzima iNOS

Para avaliação do mecanismo de ação baseado na modulação indireta da

atividade enzimática da iNOS foram testados os extratos das folhas masculinas e das

inflorescências e folhas femininas, e deste último apenas a fração butanólica e a

orientina visto que a fração aquosa não exibiu atividade inibitória na produção de NO.

Todas as amostras testadas tiveram similaridade com o grupo não tratado

somente na concentração de 4µg/mL.

|||| 88

Ao analisarmos a Figura 39 observamos que o tratamento com o extrato

aquoso das folhas masculinas reduziu mais a quantidade em micromolar de NO do que

os demais extratos, apresentando um percentual de atividade de 27,56±0,50%,

entretanto ao se considerar seu percentual de sequestro de NO ser em torno de 33%, o

valor percentual obtido para a ação inibitória da atividade enzimática da iNOS foi

encoberto pelo mecanismo antioxidante exibido pelo extrato.

O extrato das folhas fêmeas assim como o das inflorescências femininas, na

maior concentração testada, demonstraram percentuais de atividade de 19,43±0,99% e

20,49±0,50%. A fração butanólica exibiu 18,37±1,49% de atividade enquanto a

orientina na maior concentração apresentou 11,66±1,99%.

O IC50 calculado para todas as amostras foi maior que 500µg/mL, justificando o

fato de não haver por parte das amostras influencia sobre a atividade enzimática da

iNOS.

Deste modo, os dados indicam que para a espécie de C. pachystachya,

independente da parte do vegetal avaliada ou do sexo do indivíduo, não ocorre

modulação da atividade enzimática da iNOS, o que sugere outro mecanismo de ação

baseado na inibição da expressão enzimática.

Figura 39- Avaliação da capacidade de modulação da atividade enzimática da iNOS pelos extratos aquosos de C.pachystachya, a fração butanólica e a orientina. Macrófagos RAW 264.7 foram estimulados por 12h e posteriormente tratados n ausência de estímulo por mais 12h. A concentração de NO2

- em micromolar foi comparada ao controle negativo: 1,46±0,47µM. O eixo Y correspondente à concentração de NO em micromolar foi ampliado na região entre 45 e 65µM para melhor análise dos resultados.

|||| 89

4.5.15- Análise da capacidade de modulação da expressão enzimática da

iNOS pelos extratos aquosos de C. pachystachya, a fração butanólica e a

orientina

Os extratos aquosos de C. pachystachya, a fração butanólica e a orientina

purificados do extrato aquoso da folha feminina foram avaliados quanto a capacidade

de modular a expressão enzimática da iNOS, uma vez que a atividade sequestradora

de NO e que a capacidade modulatória da atividade enzimática da iNOS observada

teve baixos índices percentuais, com exceção do extrato das folhas masculinas que

exibiu uma atividade relativamente maior dentre os outros.

Os extratos aquosos na maior concentração foram capazes de modular a

expressão enzimática da iNOS, porém quando diluídos cinco vezes o extrato aquoso

das folhas masculinas apresentou marcação para a banda protéica da iNOS de forma

mais intensa do que a observada para a inflorescência feminina (Figura 40 A).

O extrato aquoso das folhas femininas na concentração de 500µg/mL não exibiu

marcação e na concentração de 100µg/mL ainda não houve significativa marcação

como observado para os outros extratos.

Isto condiz com os resultados obtidos no ensaio da reação de Greiss onde, as

partes do vegetal do indivíduo feminino possuem maior atividade do que as do

indivíduo masculino, sendo a modulação do extrato das folhas maior do que a do

extrato das inflorescências.

A fração butanólica foi expressivamente ativa quando testada a 100µg/mL e na

concentração de 20µg/mL apesar de ter ocorrido redução da capacidade de modulação

da expressão enzimática da iNOS comparado aos outros extratos à fração butanólica

ainda deteve maior capacidade de modulação.

O tratamento com a orientina não apresentou, em nenhuma das concentrações,

expressão enzimática da iNOS justificando seu expressivo potencial de inibição da

produção de iNOS (Figura 40 B).

Comparando a atividade de inibição entre as espécies V. divergens e C.

pachystachya percebemos que o extrato das folhas femininas da última demonstrou

melhor desempenho na modulação da expressão enzimática.

|||| 90

Figura 26- Avaliação da capacidade de inibição da expressão enzimática da iNOS pelo extrato aquoso da Vochysia divergens, suas frações e da luteolina. As membranas foram nomeadas por letras de A a D para auxiliar na observação

Figura 40- Avaliação da capacidade de inibição da expressão enzimática da iNOS pelos extratos aquosos da Cecropia pachystachya, pela fração butanólica e a orientina . As membranas foram nomeadas por letras de A a D para auxiliar na observação.

|||| 91

4.5.16- Avaliação da capacidade de inibição da produção de PGE2 pelos

extratos aquosos de C. pachystachya, a fração butanólica e a orientina

Ao avaliar a capacidade modulatória dos extratos de C. pachystachya quanto à

produção de prostaglandina E2 observamos que o extrato das folhas femininas possui o

melhor desempenho visto que nas maiores concentrações testadas o percentual de

inibição foi de 70,55±0,42 e 49,80±3,81 respectivamente, nas demais concentrações a

atividade foi inferior a 40%. O IC50 calculado para o extrato foi de 81,66±0,28µg/mL

(Figura 41).

O extrato das inflorescências femininas demonstrou atividade modulatória

inferior ao visto para o extrato das folhas fêmeas, sendo 6 vezes menos ativo. Na

concentração de 500µg/mL a atividade inibitória foi de 43,91±0,56% e nas menores

concentrações o percentual encontrado foi inferior a 30% o que pode ser confirmado

pelo seu IC50 de 494,3±0,43µg/mL.

Dentre os extratos, as folhas masculinas exibiram menor atividade. Na maior

concentração o percentual de inibição da produção de PGE2 foi inferior a 40% e seu

IC50 superior a 500µg/mL.

Com relação à fração butanólica, sua atividade foi bastante similar à observada

para o extrato das folhas fêmeas na concentração de 100µg/mL, tendo 55,58±4,09% e

quando diluída 4 vezes sua atividade foi maior que o do extrato para a mesma

concentração, sendo de 41,31±8,18%, porém na menor concentração a capacidade

modulatória foi inferior a 20%. O IC50 calculado para a fração butanólica foi de

56,54±0,24µg/mL.

A orientina, a 100µg/mL inibiu 91,61±5,64% porém na concentração de 20µg/mL

sua atividade reduziu em mais da metade, 36,72±3,66%. O IC50 exibido pela orientina

foi de 25,76±0,12µg/mL. A capacidade de inibição observada para a PGE2 é inferior à

observada para o NO o que sugere que para esta ação outra(s) molécula(s) possa(m)

estar envolvida(s).

Os extratos das partes femininas exibiram melhor atividade modulatória para a

produção de PGE2 em relação ao das folhas masculinas apesar de todos terem

apresentado redução da sua capacidade inibitória quando comparado a atividade

observada para o óxido nítrico.

|||| 92

Todas as amostras independente de concentração (P<0,001) foram diferentes

do controle não tratado exceto a concentração de 100µg/mL da orientina que não

demonstrou tal diferença.

Figura 41- Percentual de inibição da produção de PGE2 pelos extratos aquosos das folhas masculinas, das folhas e inflorescências femininas C. pachystachya, fração butanólica e a orientina. O percentual de inibição foi comparado ao controle negativo: 99,99±1,30%/ 0,08±0,37µM e ao controle positivo: 0,01±2,10%/ 701,06±3,66 µM.

4.5.17- Verificação da capacidade de inibição do crescimento de M. bovis

BCG pela fração butanólica e o flavonoide isolado orientina

Para avaliação da inibição do crescimento micobacteriano no que diz respeito à

espécie C. pachystachya somente a fração butanólica proveniente do fracionamento do

extrato das folhas femininas e o flavonoide isolado desta fração puderam ser testados,

visto que a polaridade dos extratos aquosos influencia a análise da atividade como

relatado anteriormente.

A fração butanólica e a orientina foram testados nas mesmas concentrações de

100, 20 e 4µg/mL para comparação direta das atividades observadas. A concentração

de DMSO exposta à cultura bacteriana foi criteriosamente mantida entre 0,5% e 1% de

acordo com a curva de padronização mostrada no item 4.5.8, Figura 28.

Para as três maiores concentrações a rifampicina apresentou novamente mais

de 90% de inibição no crescimento bacteriano e na menor concentração testada 70%.

Na maior concentração testada à fração butanólica apresentou 91,32±0,61% de

inibição do crescimento micobacteriano quando diluída cinco vezes o percentual de

|||| 93

atividade reduziu para 64,45±0,24 e na concentração de 4µg/mL a capacidade de

modulação do crescimento da M. bovis BCG foi inferior a 50%. O IC50 calculado para a

atividade da fração butanólica foi de 7,88±0,04µg/mL (Figura 42).

Figura 42- Efeito inibitório no crescimento de M. bovis BCG pela fração butanólica e a orientina purificada do extrato das folhas fêmeas de C. pachystachya.

O flavonoide isolado não apresentou diferença significativa do controle não

tratado e não infectado na maior concentração testada, tendo um percentual de inibição

de 97,32±0,30% e mesmo diluído cinco vezes a atividade inibitória permaneceu em

aproximadamente 90% somente na menor concentração houve uma redução da ação

modulatória para 74%. O IC50 avaliado foi de 3,00±0,01µg/mL.

Mesmo considerando a diferença nas concentrações utilizadas para a

rifampicina e a orientina pode-se perceber que a mesma demonstrou uma excelente

atividade inibitória com uma toxicidade celular muito inferior a observada no tratamento

efetuado com rifampicina.

Do mesmo modo quando comparada a atividade inibitória da orientina a da

luteolina, parte aglicona do flavonoide isolado da V. divergens, observamos que apesar

do IC50 ser próximo a orientina não possui percentual de toxicidade celular elevado e

também pode ser interessante no controle da replicação bacteriana e na

imunopatogenia da tuberculose.

|||| 94

5- DISCUSSÃO

Os anti-inflamatórios estão entre os agentes terapêuticos mais utilizados

no mundo, porém apresentam limitações com relação à sua potência, eficácia e efeitos

adversos que vão desde efeitos gastrointestinais até alterações cardiovasculares

(CALIXTO et al., 2008) e o tratamento da imunopatogenia na tuberculose não faz parte

do procedimento padrão utilizado atualmente, além disso a toxicidade elevada dos

fármacos utilizados e a duração do tratamento elevam os casos de abandono.

Embora alternativas venham sendo desenvolvidas, como os recentes

moduladores ou anti-citocinas (anti- IL-1β e anti- TNF-α), os custos de utilização são

muito superiores ao dos anti-inflamatórios convencionais e a via de administração é

subcutânea, pelo menos duas vezes por semana (CALIXTO et al., 2008). Deste modo

a busca por novas alternativas que exploram o potencial da biodiversidade brasileira

têm sido crescente na área científica e têm elevado o interesse econômico das

indústrias farmacêuticas em renovar o quadro atual de baixa eficácia e alta toxicidade

dos anti-inflamatórios (VERPOORTE et al., 2005).

Neste contexto avaliamos o perfil imunofarmacológico de espécies vegetais da

flora brasileira da região do Pantanal em Mato Grosso (Reserva Particular do

Patrimônio Natural SESC Pantanal) e espécies vegetais nativas e exóticas de

ocorrência em muitas regiões do Brasil obtidas em colaboração com o NPPN/UFRJ a

partir de estudos baseados nos hábitos alimentares de herbívoros nativos (cervos) e no

uso etnomedicinal destas espécies, de forma a validar cientificamente ou não o uso

popular destas espécies vegetais no tratamento do processo inflamatório e em

infecções micobacterianas.

Dados da literatura mostram que moléculas de origem vegetal apresentam

importantes atividades anti-inflamatórias e que muitas de suas ações são relacionadas

à habilidade de inibir a síntese ou ação de citocinas, quimiocinas e moléculas de

adesão, vias do ácido araquidônico e NO (WERZ, 2007; AZADMEHR et al., 2009;

KASSUYA et al., 2005).

Inicialmente os extratos foram avaliados por meio de um screening de atividade

considerando sua capacidade em modular a produção de óxido nítrico e sua

citotoxicidade. Extratos vegetais brutos ou fracionados e às vezes compostos isolados

são utilizados para realizar screening da atividade antibacteriana, anti-inflamatória,

|||| 95

antioxidante, bem como propriedades psicotrópicas e neurotrópicas (CALIXTO et al.,

2008).

O screening de atividade farmacológica permite avaliar as propriedades

medicinais que um extrato vegetal possa exibir, oferecendo alternativas sustentáveis e

ambientalmente corretas, onde vários ensaios podem ser utilizados para testar a

atividade biológica utilizando-se uma fármaco padrão que ateste a efetividade do

ensaio. Além disso, o screening permite por meio de testes inicialmente simples e

rápidos selecionar extratos vegetais promissores para etapas futuras de um estudo

comparando sua ação modulatória entre diferentes ensaios e entre as espécies

selecionadas para tal avaliação (FENNEL, 2004).

Muitos grupos de pesquisa em todo mundo têm realizado estudos de screening

com espécies da flora nativa de determinada região baseados no uso etnobotânico

específico avaliando a capacidade anti-inflamatória e também antimicobacteriana.

Maldini et al. 2009 realizou screening da atividade anti-inflamatória tópica de quatro

plantas da flora tradicional da América Central enquanto Siriwatanametanon et al. 2010

efetuou screening da atividade anti-inflamatória, anticancer e antioxidante de nove

plantas utilizadas na medicina tradicional tailandesa. Screening da atividade anti-

inflamatória e da citotoxicidade de 24 espécies utilizadas na Palestina foi realizado por

Kaileh et al. 2007. A atividade antimicobacteriana de espécies vegetais também é

buscada através de screening, como no estudo de 54 espécies da África do Sul por

McGawa et al. 2008 e de espécies medicinais indianas por Gautam et al. 2007.

Para seleção dos extratos utilizamos como critério um percentual de inibição da

produção de NO de no mínimo 40%, uma vez que os extratos são compostos de uma

miríade de substâncias no qual a(s) substância(s) responsável(is) pela atividade

encontra(m)-se em quantidades minoritárias. No que diz respeito aos testes

toxicológicos utilizamos a avaliação da liberação específica da lactato desidrogenase

(LDH), enzima citoplasmática importante na rota metabólica celular e o ensaio de

viabilidade pelo método de metabolização do MTT avaliando a funcionalidade das

mitocôndrias. Nestes ensaios o percentual de citotoxicidade mostrado pelos extratos

deveria ser inferior a 40%. Este percentual de citotoxicidade foi utilizado como critério

de seleção no screening para evitar que fossem retirados do estudo extratos vegetais

promissores. Visto que as substâncias responsáveis pela toxicidade poderiam não

corresponder à substância relacionada a atividade inibitória estando em concentração

minoritária.

|||| 96

No primeiro screening foram testados 26 extratos vegetais e destes 11 extratos

foram selecionados segundo o critério estabelecido, sendo eles: extrato das folhas

fêmeas de C. pachystachya, A. cuyabensis, V. divergens, P. americana, R.

novemnervia, P. amarus, S. corniculata, V. scabra, S. aspera, P. angustifolia e S.

santaremensis.

A L. alba, apesar dos vários dados científicos demonstrando sua

capacidade anti-viral (RUFFA et al., 2004), anti-bacteriana, analgésica entre outras

(COSTA et al., 2006), não inibiu a produção de NO mesmo não sendo tóxica. As

amostras do gênero Kalanchoe testadas não foram capazes de inibir a produção de NO

sendo em alguns casos tóxicas (K. pinnata), no entanto os dados literários relatam

efeitos anti-inflamatórios in vivo por espécies deste gênero especialmente por

substâncias isoladas destas espécies como a quercetina que também possui relatos in

vitro (HÄMÄLÄINEN et al., 2007; COSTA et al., 2008), sendo no caso do extrato

aquoso constituinte minoritário tendo efeito reduzido.

Os extratos selecionados foram submetidos a outro screening de atividade desta

vez em curva de concentração-dependência avaliando o potencial da atividade

modulatória não somente na produção de NO como também na produção de TNF-α

além da avaliação da atividade antioxidante e da ação na proliferação linfocítica. Todos

os extratos escolhidos inibiram a produção de óxido nítrico de forma dose-dependente

o que não foi observado na produção de TNF-α. Não foi observada inibição expressiva

da produção do mesmo, embora o extrato de C. pachystachya e o de S. corniculata

tenham se destacado entre os demais na maior concentração testada.

Dentre os 11 extratos aquosos, todos foram capazes de inibir a proliferação

linfocítica de maneira concentração-dependente sendo o extrato de P. amarus, S.

corniculata e o das folhas fêmeas de C. pachystachya os mais ativos.

Na atividade antioxidante, os extratos exibiram percentual de sequestro pouco

expressivo em relação à rutina onde a maior capacidade sequestradora dentre os

extratos foi de V. divergens, P. angustifolia e P. americana.

Devido algumas das espécies selecionadas não serem classicamente medicinais

não se encontram relatos de estudo relacionados à atividade anti-inflamatória na

literatura apenas, quando encontrado, estudos fitoquímicos e atividade antioxidante,

isto ocorre para A. cuyabensis, R. novemnervia, P. angustifolia, S. aspera e

S.corniculata (OLIVEIRA et al., 2005).

|||| 97

O extrato aquoso das folhas da P. americana possui relatos de atividade anti-

inflamatória e analgésica in vivo, demonstrando uma inibição dose-dependente de

ambas as fases do teste de dor por formalina em camundongos suiços, redução da

contorção abdominal induzida por ácido acético e elevação do limiar de dor no teste da

placa quente, sendo similar a morfina (ADEYEMI et al., 2002). O extrato também

mostrou uma inibição dose-dependente do edema de pata induzido por carragenina. A

atividade antimicrobial já foi descrita para o extrato etanólico da P. americana, inibindo

o crescimento de bactérias gram positivas e negativas (exceto Escherichia coli) e

também da levedura Zygosaccharomyces bailii (RAYMOND et al., 2010).

Na literatura não há descrição de atividade biológica para a espécie S.

santaremensis, porém outras espécies do gênero como a S. acuta e S. cordifolia

possuem relatos. O extrato etanólico da planta inteira S. acuta mostrou atividade

analgésica no teste de placa quente e o extrato metanólico foi capaz de inibir o

crescimento de M. smegmatis (MALAIRAJAN et al., 2006; GAUTAM et al., 2007). A

maior parte dos dados literários enfoca a atividade anti-inflamatória do extrato etanólico

e em acetato de etila das raízes de S. cordifolia e analgésica do extrato em acetato de

etila das partes aéreas da mesma. O extrato etanólico de S. cordifolia já foi purificado e

o alcaloide isolado do mesmo demonstrou atividade anti-inflamatória in vivo em ratos

albinos (SWATHY et al., 2010).

A espécie P. amarus possui relatos literários ligados à atividade anti-plasmodial

e também atividade anti-inflamatória e anti-alodínica de lignanas isoladas do extrato

evidenciando uma possível interação com o receptor do fator ativador de plaquetas.

Outras espécies do gênero também possuem relatos, como P. emblica que possui

atividade antioxidante e anti-inflamatória descritas, inibindo a produção de TNF-α, pelo

extrato etanólico além de efeito gastoprotetor ao uso de AINES (CHATTERJEE et al.,

2010; LIU et al., 2009). Também já foi descrito para a espécie atividade antimicrobial

dos componentes voláteis do óleo essencial do vegetal. Outras espécies do gênero

como, P. polyphyllus possuem lignanas e o ácido 4-O- metilgálico isolados com ação

inibitória na produção de NO, TNF-α e IL-12 em macrófagos peritoneais de

camundongo (RAO et al., 2006). Os compostos isolados do extrato etanólico de P.

urinaria também demostraram atividade antioxidante e anti-inflamatória in vitro. A

atividade antimicobacteriana foi descrita somente para a fração rica em alcaloides

isolada do extrato aquoso das folhas de P. discoideus (MENSAH et al., 1990).

|||| 98

Para a espécie Vernonia scabra não há relatos de atividade anti-inflamatória

embora haja descrição de atividade antioxidante e outras espécies da família venham

sendo bastante estudadas e os principais constituintes químicos presentes sejam

sesquiterpenos e flavonóides, como por exemplo, a V. cinerea. O extrato metanólico,

clorofórmico e em éter das folhas da planta possuem atividade anti-inflamatória

reduzindo o edema ocasionado em ratos albinos pela carragenina, atividade

analgésica, reduzindo as contorções induzidas por ácido acético além da atividade anti-

pirética (IWALEWA et al., 2003). Ao extrato metanólico também são acrescentadas a

atividade antioxidante e inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias

(PRATHEESHKUMAR et al., 2004). Compostos isolados do extrato metanólico da folha

de V. colorata demonstraram do mesmo modo atividade anti-inflamtória in vivo (CIOFFI

et al., 2001) como também a vernoniosida B2 isolada do extrato metanólico das folhas

de V. condensata mostraram atividade anti-inflamatória in vivo e analgésica

(VALVERDE et al., 2008).

Após a realização dos screenings, foram escolhidos mediante o desempenho

nos testes anteriores e pela presença de fracionamento e purificações, os extratos

aquosos das folhas fêmeas de Cecropia pachystachya e da Vochysia divergens.

As frações butanólicas, aquosa, em acetato de etila e em diclorometano, o

flavonoide isolado, 3’,5-dimetoxi luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo e a luteolina foram

testadas. A fração aquosa não demonstrou atividade nos testes efetuados enquanto a

fração em diclorometano inibiu a produção de NO moderadamente de maneira dose-

dependente com baixo percentual de sequestro de NO, ausência de modulação da

atividade enzimática da iNOS e pouca capacidade de modular a expressão enzimática

da iNOS. Não mostrou inibição para a produção de TNF-α e PGE2 como também para

o crescimento micobacteriano.

A fração em acetato de etila apresentou inibição dose-dependente do

crescimento micobacteriano e da produção de NO estando seu mecanismo de ação

vinculado à modulação da expressão e não da atividade enzimática da iNOS e

ocorrência de pouco atividade antioxidante. Apresentou pouca capacidade modulatória

para a produção de TNF-α e PGE2. A atividade encontrada nesta fração pode ser

justificada pela mesma ser composta por flavonoides de alta e média polaridade

também encontrados na fração butanólica o que sugere que a(s) substância(s) que

auxilia(m) a luteolina na atividade modulatória esteja presente em menor quantidade na

|||| 99

fração em acetato de etila visto que a fração butanólica possui um perfil flavonoídico

mais rico observado em cromatografia em camada delgada (CORRÊA , 2007)

A expressiva capacidade modulatória de V. divergens na inibição da produção

de óxido nítrico, PGE2 e TNF-α vista na fração butanólica indicam que a fração é a

responsável pela atividade modulatória do extrato de V. divergens, tendo como

mecanismo de ação marcante a inibição da expressão enzimática da iNOS e em menor

grau o sequestro do NO e a inibição da atividade enzimática da iNOS. A ampla inibição

do crescimento micobacteriano sugere que esta fração possa vir a ter bom

desempenho na imunopatogenia da tuberculose associado ao controle da proliferação

bacteriana.

O flavonoide isolado, 3’,5-dimetoxi-luteolina-7-O-β-glucopiranosídeo (VdF)

mostrou inibição da produção de NO e TNF-α de maneira dose dependente com menor

citotoxicidade. A ausência de metoxilas nas posições 3’ e 5 e da glicosilação na

posição 7 tornou a estrutura da luteolina mais citotóxica que o VdF embora apresente

expressiva atividade em menor concentração na inibição da produção de PGE2 e do

crescimento micobacteriano. A luteolina atua por meio da inibição da expressão

enzimática da iNOS com pouca atividade antioxidante observada. Como sua ação

modulatória é menor ou próxima da vista para a fração butanólica acredita-se que o

flavonoide esteja em associação à outra(s) molécula(s) presentes na fração butanólica

e em menor quantidade na fração em acetato de etila.

Para o extrato vegetal de Cecropia pachystachya observou-se que os extratos

de partes do vegetal de indivíduos femininos são mais ativos do que extratos de partes

de indivíduos masculinos, a saber, as folhas são mais ativas que as inflorescências, no

que diz respeito à modulação da produção de NO, TNF-α, PGE2, inibição da expressão

enzimática da iNOS e inibição do crescimento micobacteriano.

Outro dado interessante é que apesar deste perfil de atividade ocorrer para os

extratos provenientes da Barra da Tijuca (Rio de Janeiro, RJ) a ação modulatória e a

citotoxicidade foi muito inferior ao observado para os extratos oriundos de Arraial do

Cabo (RJ).

A origem e qualidade da matéria prima desempenham um papel preponderante

na qualidade e estabilidade dos fitoterápicos (CALIXTO et al., 2008). A composição

química quali- e quantitativa pode variar de uma colheita para outra e,

conseqüentemente, a qualidade e o valor terapêutico do extrato. Algumas das

variáveis que influenciam na composição e quantidade de metabólitos secundários

|||| 100

disponíveis em uma matéria-prima vegetal são: clima (temperatura, regime de chuvas,

fotoperiodo, intensidade de luz etc.), altitude, disponibilidade de água, nutrientes, idade

da planta, exposição à microflora, insetos ou poluentes, época e hora da colheita,

método de colheita, secagem, empacotamento, armazenagem. Outros fatores ainda

devem ser considerados, tais como o emprego de planta fresca ou seca, transporte da

matéria-prima vegetal e a parte da planta coletada (GOSSLAU et al., 2011).

Os extratos aquosos de C. pachystachya de modo geral exibiram ação

modulatória da produção de NO, TNF-α, PGE2 e inibição do crescimento

micobacteriano de forma concentração-dependente, tendo o extrato das folhas

femininas se destacado entre os demais. Na avaliação da atividade sequestradora de

NO, o extrato das folhas masculinas apresentou o maior percentual, estando seu

mecanismo de ação relacionado mais intimamente a atividade antioxidante e em menor

grau a atividade modulatória da expressão da iNOS ao contrário do observado para o

extrato das folhas fêmeas e inflorescências. O extrato das inflorescências masculinas

demonstrou toxicidade elevada dentre os outros extratos.

A ação inibitória da atividade da iNOS não foi observada independente do sexo

ou parte do vegetal relacionada, assim os extratos de folhas e inflorescências femininas

têm como mecanismo de ação marcante a inibição da expressão enzimática da iNOS.

Das frações testadas, a fração aquosa não mostrou atividade em nenhum teste

enquanto a fração butanólica foi expressivamente ativa em todos os padrões

inflamatórios analisados, sendo responsável pela inibição da produção de NO e

expressão enzimática da iNOS. Contudo na inibição da produção de TNF-α e PGE2 os

dados sugerem que haja modulação associada a outra fração.

O flavonoide orientina mostrou expressiva atividade modulatória quando

comparado à fração butanólica estando diretamente associada à inibição da produção

de NO. Para a produção de TNF-α e PGE2, a orientina, embora possua excelente

capacidade modulatória de ambos, apresentou ainda diferença significativa do controle

negativo indicando que a mesma possui sinergismo com outra(s) molécula(s) que

aparentemente não estão presentes na fração butanólica.

Os dados obtidos durante este estudo podem ser corroborados com os relatos

provenientes da literatura.

Existem poucos estudos sobre a composição química e a atividade biológica de

V. divergens, especialmente do extrato aquoso das folhas intimamente relacionado ao

uso etnobotânico. Os dados literários relatam atividade bactericida do extrato etanólico

|||| 101

das cascas de V. divergens, da fração em acetato de etila e alguns compostos isolados

desta como o ácido sérico frente às bactérias gram-positivas, principalmente

Staphylococcus aureus (HESS et al., 1995) e para o ácido sérico ainda foi descrita a

atividade anti-fúngica (ZUCARO et al., 2000).

O extrato etanólico das cascas de V. divergens também possui descrita atividade

antinociceptiva, de forma dose-dependente, em camundongos submetidos a testes

com formalina (dor e inflamação) e contorções abdominais induzidas por ácido acético

(CORRÊA, 2007). O ácido tormêntico (triterpeno) isolado das cascas do caule de V.

divergens apresentou atividade anti-alodínica para dores inflamatórias e neuropáticas

persistentes em camundongos suíços (BORTALANZA et al., 2002).

Outras espécies do gênero Vochysia também possuem relatos de atividade

biológica baseados em triterpenos, esteroides e em menor grau compostos fenólicos. A

atividade anti-inflamatória já foi observada para triterpenos isolados do extrato

metanólico das cascas de V. pacifica, inibindo a atividade da isoenzima fosfodiesterase

4 (WENIGER et al., 2006) e atividade gastoprotetora e antioxidante para a fração

butanólica e o extrato metanólico das cascas de Vochysia tucanorum em roedores

(GOMES, et al., 2009).

O flavonoide isolado do extrato aquoso das folhas de V.divergens é uma 5-

metoxiflavona, que pela primeira vez foi descrito para a família Vochyseacea. Estas

estruturas são incomuns na natureza e por isso suas propriedades biológicas são

pouco estudadas. Foram relatados efeito gastoprotetor de 5-metoxiflavonas contra

AINES e também efeitos citotóxicos a linhagem celular de câncer de pulmão e

carcinoma cervical (CORRÊA, 2007; RAHMAN et al., 2007). Estudos de estrutura-

atividade entre luteolina e luteolina-7-glicosídeo indicam que ambas possuem atividade

inibitória na produção de iNOS e COX-2 sendo que em altas concentrações a atividade

inibitória da luteolina é influenciada pelo seu perfil citotóxico, como foi observado em

nosso trabalho (HU et al., 2004).

A luteolina possui inúmeros relatos na literatura de acordo com o observado

neste trabalho. A atividade anti-inflamatória da luteolina e da luteolina-7-O-glicosídeo

foi descrita para a inibição da produção de TNF-α, da expressão da iNOS e produção

de NO em macrófagos ativados por LPS estando associada a inibição da via de

sinalização do NF-κB envolvendo o mecanismo de inibição da fosforilação de IκB-

α (COMALADA et al, 2006; PARK et al., 2011). Também já foi observado a inibição da

produção de citocinas pró-inflamatórias e estímulo da expressão do RNAm de IL-10

|||| 102

(PAUL et al., 2006), atividade anti-asmática e inibição da produção de prostaglandina

E2 (JIM et al., 2009), além da redução da proliferação de macrófagos derivados da

medula óssea estimulados por M-CSF (fator estimulador de colônias em macrófagos)

(COMALADA et al., 2006).

Outra ação modulatória vista para luteolina é a atenuação da atividade

promotora de ICAM-1 induzida por TNF-α associada à via de sinalização AP-1 (CHEN

et al., 2007).

Além de atividades anti-inflamatórias observadas em macrófago, a luteolina

possui efeitos na homeostasia de células microgliais com atividade anti-inflamatória,

antioxidante e neuroprotetora (DIRSCHERL et al., 2010), atividade anti-fibrótica por

inibir a inflamação pulmonar (CHEN et al., 2010).

Do mesmo modo, a atividade antimicobacteriana de luteolina-7- O-glicosídeo

também tem sido descrita para M. smegmatis (LECHNER et al., 2008) e M.

tuberculosis (YEUNG et al., 2009). A luteolina também possui atividade anti-microbial a

bactérias gram-negativas, gram-positivas e fungos (KUETE et al., 2008).

A respeito da espécie Cecropia pachystachya poucos trabalhos são relatados na

literatura principalmente no que concerne a atividade biológica. A espécie mais

estudada deste gênero quanto à atividade farmacológica é C. glaziovii, enquanto

outras, como por exemplo, C. pachystachya e C. hololeuca são pouco estudadas.

O extrato etanólico da planta inteira de C. pellata muito utilizado na medicina

colombiana possui atividade diurética, cardiotônica e anti-bacteriana frente à

Escherichia coli (ROJAS et al., 2006) O extrato aquoso da planta e a fração butanólica

purificada de C. glaziovii foram capazes de reduzir broncoespasmos induzidos por

histamina em cobaias e de relaxar os músculos traqueais, aparentemente por um efeito

tipo agonista β-adrenérgico (DELARCINA et al., 2007) e de reduzir a secreção de ácido

gástrico em camundongos suíços (SOUCCAR et al., 2008). O extrato aquoso das

folhas de C. obtusifolia mostrou efeito analgésico periférico e atividade anti-inflamatória

sistêmica em camundongos suíços (PÉREZ-GUERRERO et al., 2001).

O extrato hexânico de C. pachystachya e o sitosterol isolado do mesmo

apresentaram atividade anti-inflamatória em ensaios de edema de pata induzido por

carragenina em ratos (ARAGÃO et al., 2010). Já o extrato diclorometânico das folhas e

o ácido pomólico, um dos quatro triterpenos identificados na amostra, reduziram o

edema de pata em ratos, inibiram a viabilidade das células humanas

|||| 103

polimorfonucleares de forma dose e tempo dependente através de apoptose e não

produziram necrose nuclear (SCHINELLA et al., 2008).

O extrato aquoso das folhas de C. pachystachya apresentaram efeitos

hipotensivos, cardiotônicos e sedativos e o extrato metanólico de Cecropia lyratiloba e

sua fração flavonoídica inibiram a contractibilidade do músculo cardíaco e liso

provocado por adrenalina (RAMOS ALMEIDA et al., 2006). Observou-se também que o

extrato metanólico das folhas de C. pachystachya possui atividades antioxidantes e

efeitos hipoglicemiantes em ratos, estas atividades foram relacionadas ao ácido

clorogênico e flavonóides C- glicosilados isolados do extrato (ARAGÃO et al., 2010). A

baixa toxicidade do extrato aquoso das folhas de C. pachystachya foi verificada por

Bigliani et al. 2010 após analisar amostras de órgãos de camundongos suiços tratados

oralmente com o extrato.

A substância isolada da fração butanólica das folhas fêmeas de Cecropia

pachystachya, a orientina possui alguns relatos na literatura em sua maioria

fitoquímicos. A atividade biológica descrita para a orientina está relacionada à

vasodilatação dos anéis aórticos torácicos via NO-cGMP e a inibição da contração

vascular do músculo liso atuando nos canais de Ca+2 (FU et al., 2005). Outra atividade

relatada foi à proteção de camundongos suíços contra a letalidade da radiação,

protegendo-os de danos cromossomais e em células progenitoras da medula óssea

(NAYAK et al., 2005).

A orientina é um flavonoide que possui como parte aglicona a luteolina, sendo,

portanto uma luteolina-C-glicosilada.

Devido ao parentesco estrutural entre os flavonóides ativos de V. divergens e de

C. pachystachya, por ambos serem derivados naturais da aglicona luteolina, a tabela

abaixo foi elaborada de forma a possibilitar uma melhor comparação entre a atividade

desses flavonóides. Comparação esta feita também com a aglicona luteolina já

estudada biologicamente. Entre os três flavonóides avaliados a orientina mostrou-se

mais ativa. Quando comparada a luteolina, a única diferença estrutural é a C-

glicosilação na posição 8 do anel A. A presença da glicose levou a um aumento

significativo da atividade para a inibição da produção de NO, TNF-α e PGE2. Porém, a

glicosilação em VdF não resultou em aumento da atividade em relação a luteolina. Isso

sugere que a posição e o tipo da glicosilação sejam fatores importantes, assim como as

metoxilações.

|||| 104

Tabela 6- Estrutura da molécula de VdF, da orientina e da luteolina e seus respectivos IC50 nas atividades estudadas.

Os resultados do presente trabalho indicam que a espécie V. divergens

biossintetiza derivados metoxilados e glicosilados de luteolina tão ativos quanto a

aglicona, porém menos tóxicos, como pode ser observado na tabela acima. E que a

orientina, flavonóide isolado da espécie C. pachystachya é mais ativa que a aglicona

correspondente luteolina e também menos citotóxica.

Alguns estudos de relação estrutura-atividade de flavonóides e inibição de

mediadores inflamatórios podem ser encontrados na literatura. Têm sido relatado que a

presença de hidroxilações nas posições 3 e 4 do anel B da estrutura flavonoídica

aumenta a ação modulatória na atividade de inibição da produção de TNF-α enquanto

a presença de apenas uma hidroxila diminui o grau de inibição e a ausência deste

grupo revoga o efeito inibitório. Para efeitos na inibição da iNOS ou na produção de NO

são requeridos a presença de pelo menos três hidroxilas (COMALADA et al., 2006).

Este é o caso da luteolina e de seus derivados que possuem padrão catecólico de

oxigenação no anel B e oxigenações também no anel A. Estudos mostram que

oxigenação na posição 5 do anel A contribui significativamente para a ação anti-

inflamatória (ODONTUYA et al., 2004). Essa característica estrutural também pode ser

observada nos flavonóides avaliados neste presente trabalho.

Comalada et al. 2006 avaliaram o potencial anti-inflamatório de 9 flavonóides

agliconas: kaempferol, quercetina, apigenina, crisina, diosmetina, luteolina, daidzeina,

genisteina e hesperetina. Dentre eles, a luteolina se mostrou mais ativa na inibição do

NO e do TNF-α.

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Os flavonóides têm apresentado uma ampla gama de atividades biológicas,

incluindo atividade anti-inflamatória. Embora uma quantidade significativa de

flavonóides esteja presente nas plantas na forma de glicosídeos, as determinações das

atividades biológicas de flavonóides foram realizadas principalmente para as agliconas.

Estudos envolvendo glicosídeos de kaempferol, quercetina e aromadendrina e sua

atividade anti-inflamatória decorrente da supressão dos níveis de NO em células da

microglia BV2 estimuladas por LPS indicaram que a glicosilação atenuou a atividade

supressora de agliconas. Apesar de atenuada, alguns dos glicosídeos, dependendo da

posição e grau de glicosilação, mantiveram a capacidade inibitória da produção de NO.

Estes resultados sugerem que a glicosilação de flavonóides deve ser considerada

como um modulador importante de atividade biológica (KWON et al., 2004).

Outros autores mostram que a porção glicosídica de substâncias biologicamente

ativas pode ser um fator crucial para sua atividade biológica mas em muitos casos a

glicosilação melhora apenas os parâmetros farmacocinéticos (KREN & MARTÍNKOVÁ,

2001). A presença de metoxilas como substituintes em flavonóides pode interferir

consideravelmente na atividade anti-inflamatória dos mesmos, como pode ser

observado no trabalho de KIM et al. 2007 que estudou 41 chalconas sintéticas. Nesse

trabalho, os autores concluem que as estruturas mais ativas possuem uma metoxila na

posição adjacente a carbonila. O flavonoide ativo isolado de V. divergens, 3’,5-

dimetoxi-luteolina-7-O-β-glucopiranosídeo, apesar de não ser uma chalcona, possui

uma das metoxilas na posição indicada no estudo de relação estrutura-atividade (SAR)

citado (na posição adjacente a carbonila).

Muitos estudos de atividade farmacológica de extratos vegetais utilizam

solventes apolares na extração, como o hexano e o diclorometano, não privilegiando as

substâncias presentes nos chás, que são as formas mais comuns de utilização das

plantas medicinais. Esse é um diferencial do presente trabalho que vale a pena ser

ressaltado. A extração aquosa favorece a extração dos glicosídeos presentes nos

vegetais e que no presente trabalho mostraram-se importantes moléculas ativas.

Muitos dos estudos na literatura envolvendo atividade farmacológica de extratos

vegetais não chegam a identificar frações e componentes total ou parcialmente

responsáveis pela atividade. A identificação da orientina e do VdF nos extratos ativos

além de permitir o estudo da atividade de análogos ainda mais ativos permite o controle

de qualidade pois podem ser utilizados como marcadores químicos.

|||| 106

Os outros extratos bioativos identificados neste trabalho, porém não investigados

quanto aos responsáveis pela atividade e quanto ao mecanismo de ação, abrem um

leque de possibilidade para novos projetos de pesquisa. Além disso, o aprofundamento

do estudo das frações mais ativas de V. divergens e C. pachystachya para identificação

de outras substâncias bioativas além das identificadas no presente trabalho também

será prioridade.

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6- CONCLUSÕES

O trabalho possibilitou o estudo de extratos vegetais, a partir de um screening

envolvendo inicialmente 25 espécies que pudessem ser utilizadas para o tratamento da

inflamação e de infecções micobacterianas, visando validar ou não seu uso

etnobotânico, visto que a maioria não apresenta relatos científicos na literatura. Deste

modo pôde-se concluir que:

• Embora o estudo tenha sido focado em V. divergens e C. pachystachya, outras

espécies selecionadas (A. cuyabensis, S. santaremensis, P. amarus, P.

angustifolia, S. aspera, S. corniculata, V. scabra, R. novemnervia, P. americana)

demonstraram um potencial promissor para o tratamento da inflamação;

• O processo de purificação contribuiu para a verificação de frações e substâncias

envolvidas na atividade anti-inflamatória e antimicobacteriana como a fração

butanólica do extrato de V. divergens e sua substância isolada o 3’,5-dimetoxi

luteolina- 7-O-β-glucopiranosídeo (primeiro relato de atividade anti-inflamatória

para uma 5-metoxiflavona da família Vochyseaceae);

• O estudo dos diferentes extratos de C. pachystachya mostrou que no caso de

espécies dióicas, o sexo e a parte do vegetal coletada influenciam na atividade

biológica, deste modo o extrato das folhas femininas foi o mais ativo;

• A fração butanólica e a orientina, flavonóide isolado dessa fração, são

responsáveis pela atividade anti-inflamatória e antimicobacteriana do extrato das

folhas fêmeas de C. pachystachya;

• A fração butanólica isolada de V. divergens e de C. pachystachya assim como

as substâncias isoladas das mesmas possuem mecanismo de ação marcante na

inibição da expressão enzimática da iNOS;

• As estrutura aglicona da luteolina compartilhada pela orientina e VdF, permitiu

inferir que a posição e o tipo de glicosilação assim como a presença de metoxilas

influenciam a atividade anti-inflamatória e a inibição do crescimento

micobacteriano garantido a orientina maior atividade comparado ao VdF e a

luteolina como também menor citotoxicidade vista para VdF.

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