atividade antimicrobiana de óleos essenciais de ervas e especiarias

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO

NAIANE DARKLEI DOS SANTOS SILVA

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE

ESPECIARIAS SOBRE PATÓGENOS ISOLADOS DE CARNES

COMERCIALIZADAS EM JUAZEIRO-BA E PETROLINA-PE

Petrolina-PE

2015





Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Vale do São Francisco –

UNIVASF, Campus Petrolina, como

requisito para obtenção do título de Mestre

em Recursos Naturais do Semiárido.

Área de concentração: Química e

Atividade Biológica

Orientador: Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da

Costa

Petrolina-PE

2015

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF.

Bibliotecária: Luciana Souza Oliveira CRB5/1731

Silva, Naiane Darklei dos Santos

S586a

Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de especiarias sobre patógenos isolados de carnes comercializadas em Juazeiro-BA e Petrolina-PE / Naiane Darklei dos Santos Silva . -- Petrolina, 2015.

xv; 81f.: il. 29 cm. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) -

Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina, PE, 2015.

Orientador: Dr. Mateus Matiuzzi da Costa. Banca examinadora: Profa. Dra. Xirley Pereira Nunes, Profa.

Dra.Francesca Silva Dias Nobre 1. Segurança alimentar. 2. Antimicrobiano. 3. Conservante alimentar.

I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 612.3





Dissertação apresentada como requisito

para obtenção do título de Mestre em

Recursos Naturais do Semiárido, pela

Universidade Federal do Vale do São

Francisco.

Aprovado em:_____ de ___________ de ______.

Banca Examinadora

Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa (Universidade Federal do Vale do São Francisco)

Orientador

Profª. Drª. Xirley Pereira Nunes (Universidade Federal do Vale do São Francisco)

Examinadora Interna

Profª. Drª. Francesca Silva Dias Nobre (Universidade Federal do Vale do São Francisco)

Examinadora Externa

Dedico aos meus pais, em especial à minha

mãe, uma grande mulher, meu exemplo de vida

e aos meus irmãos, pelo amor incondicional e

confiança.

Agradecimentos

À Deus, pelo dom da vida, minha força e minha fortaleza nas dificuldades,

por se fazer presente em todos os momentos de minha vida, guiando

minhas decisões e iluminando minhas escolhas.

À minha MÃE, Doraci, meu porto seguro, minha amiga, minha

companheira, pelo seu amor desmedido, por sua compreensão, minha

melhor torcida, meu exemplo de mulher. Te amo mamis linda!!

Ao meu pai, Marcelino (in memorian) mas que está presente

constantemente em nossas vidas, cuidando e vigiando.

Aos meus irmãos, William e Daiane, pelo amor, pela torcida, por serem o

melhor de mim e que amo imensamente, meus companheiros leais e fiéis.

Às minhas sobrinhas lindas, Damarise e Damarília, que me fizeram provar

um dos sentimentos de amor mais lindo, um amor desmedido, de cuidado,

sincero e mais puro que existe.

Ao meu cunhado, Raquildes e cunhada, Carla, pelo carinho e serem mais

do que especiais em minha vida.

Ao meu querido orientador, Professor Dr. Mateus Matiuzzi da Costa, por

ser um exemplo de profissional e pessoa, pela compreensão e por tornar

o laboratório um ambiente em que todos desejam trabalhar.

À professora Dr. Gisele Veneroni Gouvea, pela sua atenção e disposição

em ajudar sempre.

Aos demais professores da pós-graduação pelos ensinamentos no

decorrer desses anos.

À Universidade Federal do Vale do São Francisco (Univasf) onde estou

desde 2006.

À CAPES pelo apoio financeiro durante o período do mestrado.

Às minhas amigas de muitos anos atrás (rs), que mesmo distantes fazem-

se presentes a todo momento, e que o amor só aumenta cada vez mais,

Rafaella, Juliane, Cássia e Danusa.

Às minhas amigas de todos os momentos e das melhores risadas, Késia,

Paola e Renata.

À minha amiga do mestrado, Sandra, pelos dilemas compartilhados e por

ter se tornado tão especial e querida!

À minha amiga Kiscyla, amiga chorona, que tenho um carinho muito

grande.

Às minhas companheiras de mestrado pelo carinho (Sandra, Eriane, Ana

Paula, Amanda, Geórgia, Kiscyla, Jackeline, Paloma, Deize e Fernada).

Aos meus mais que queridos amigos companheiros de laboratório,

Samira, Renilde, Ruan, Graciele, Jennifer, Isabella, Diego, Wilton, Uirá e

Evandro pelos maravilhosos cafés da manhã e almoços, pelas altas

risadas e pela convivência maravilhosa, por tornarem meu ambiente de

trabalho tão prazeroso.

A todos meus colegas do laboratório de Microbiologia e Imunologia

Animal pela maravilhosa equipe, que torna o mesmo um ambiente

prazeroso para trabalhar.

Aos professores da banca por terem aceitado estar presentes na defesa

e contribuírem para a finalização desse trabalho.

Enfim a todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização

deste trabalho.

“Onde quer que haja mulheres e homens, há sempre o

que fazer, há sempre o que ensinar, há sempre o que

aprender.”

(Paulo Freire)

http://pensador.uol.com.br/autor/paulo_freire/

RESUMO

Realizou-se a investigação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis) e cravo da índia (Syzyguim aromaticum), limão tahiti (Citrus latifolia) e manjericão (Ocimum basilicum L.), sobre bactérias isoladas de amostras de carne proveniente do comércio do município de Juazeiro-BA e Petrolina-PE. Analisou-se 17 amostras de carnes para a presença de coliformes totais e termotolerantes, Salmonella spp. e Staphylococcus aureus, onde observou-se que em todas as amostras analisadas foram detectadas a presença de coliformes totais, com valor médio variando de 1,5x101 NMP/g a >1,1x103 NMP/g e quanto a presença de coliformes termotolerantes o valor médio variando de 1,5x101 NMP/g a >1,1x103 NMP/g, onde 88,23% das amostras apresentaram-se fora dos limites máximos estabelecidos pela ANVISA, e quanto a presença de Escherichia coli confirmou-se em 13 (76,47%) amostras. Na determinação de Salmonella spp., treze (76,47%) amostras de carne analisadas apresentaram contaminação em 25g e para Staphylococcus spp., observou-se que 5 (29,41%) amostras apresentaram-se com contagem acima do limite máximo estabelecido pela Resolução RDC nº 12/2001 da ANVISA, sendo a bactéria confirmada em todas as amostras. A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pelo método de microdiluição em caldo e CBM, onde os óleos de manjericão e cravo da índia apresentaram os melhores resultados quando comparados ao controle do diluente com CBM de 3.125µg/mL, apresentando atividade contra todos os isolados testados, enquanto que os óleos de alecrim e limão tahiti apresentaram apenas contra os isolados de Staphylococcus spp. com atividade de fraca a moderada. A partir desses resultados foram selecionados os óleos de manjericão e cravo da índia, devido aos melhores resultados e estabeleceu-se a concentração de 1% e 10% p/v que foram adicionados em 100g de carne moída inoculada com 2,43x108UFC/g de Salmonella enterica ATCC 10708, 2,37x108UFC/g de Escherichia coli ATCC 35218 e 1,36x107UFC/g de Staphylococcus aureus ATCC 25923 e estocadas por 24 horas a 8°C. utilizou-se como controle a carne sem adição de óleo essencial. Nos tempos de 0, 4, 6, 20 e 24 horas de armazenamento realizou-se a contagem bacteriana. Verificou-se que na concentração de 1% os óleos não diminuíram a carga microbiana, já na concentração de 10% ocorreu a diminuição de toda a carga microbiana, exceto para o óleo de manjericão para o S. aureus, onde foi verificada apenas redução da carga microbiana. Palavras-chave: Segurança alimentar. Potencial antimicrobiano. Conservante alimentar.

ABSTRACT It was held to investigate the antimicrobial activity of essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis) and clove (Syzygium aromaticum), limes (Citrus latifolia) and basil (Ocimum basilicum L.) on bacteria isolated from meat samples from the trade in the city of Juazeiro-BA and Petrolina. Analyzed 17 meat samples for the presence of total and fecal coliforms, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus, where it was observed that in all analyzed samples were detected the presence of total coliforms and an average value ranging from 1,5x101 NMP / g> 1,1x103 NMP / g for the presence of coliform the average value ranging of 1,5x101 NMP / g> 1,1x103 NMP / g, where 88.23% of the samples showed up outside the ceilings set by ANVISA, and for the presence of Escherichia coli was confirmed in 13 (76.47% ) samples. In the determination of Salmonella spp., Thirteen (76.47%) meat samples were contaminated in 25g and Staphylococcus spp., Observed that 5 (29.41%) of the samples were presented with counts above the ceiling established by Resolution RDC No. 12/2001 of ANVISA, being confirmed the bacteria in all samples. Evaluation of the antimicrobial activity was performed by microdilution broth method and CBM, where the basil oil and clove showed better results when compared to solvent control with CBM 3.125μg / mL, showing activity against all isolates tested while the rosemary oil and limes showed only against Staphylococcus spp. with weak to moderate activity. From these results we selected the basil oil and clove, due to better results and set the concentration of 1% and 10% w / v were added to 100g of ground beef inoculated with 2,43x108UFC / g Salmonella enterica ATCC 10708, 2,37x108UFC / g Escherichia coli ATCC 35218 and 1,36x107UFC / g of Staphylococcus aureus ATCC 25923 and stored for 24 hours at 8 ° C. It was used as control meat without the addition of essential oil. In times of 0, 4, 6, 20 and 24 hours of storage there was the bacterial count. It was found that at a concentration of 1% oils did not diminish the microbial load, since the concentration of 10% was the reduction of all the microbial load, except for the basil oil for S. aureus, which was observed only reduction of microbial load. Keywords: Food security. Antimicrobial potential. Food preservative.

Lista de Figuras

Figura 1: Características das colônias típicas de E.coli em ágar Mac Conkey...............................................................................................................49 Figura 2: Morfologia da Escherichia coli pelo método de coloração de Gram: cocobcilo gram negativo.....................................................................................49 Figura 3: Características das colônias de Salmonella spp. em ágar Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) .........................................................................................52 Figura 4: Morfologia da Salmonella spp. pelo método de coloração de Gram: Bacilo gram negativo .........................................................................................52 Figura 5: Morfologia do Staphyloccocus spp. pelo método de coloração de Gram: coco gram positivo...................................................................................55

Lista de Tabelas

Tabela 1: Óleos essenciais, composição química e estrutura dos constituintes

majoritários........................................................................................................43

Tabela 2: Qualidade microbiológica das amostras de carne bovina fresca oriundas de feiras-livre e estabelecimentos frigoríficos da cidade de Juazeiro-BA e Petrolina-PE....................................................................................................57 Tabela 3. Médias das contagens de Escherichia coli ATCC 35218, Salmonella enterica ATCC 10718 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 na carne da amostra controle e nos tratamentos com os óleos essenciais de cravo da índia e manjericão a 1% e 10%p/v.................................................................................70

Lista de Gráficos

Gráfico 1. Número de isolados em valores absolutos de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de Alecrim (Rosmarinus officinalis) ............................58 Gráfico 2. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de cravo da índia (Syzyguim aromaticum) .........................................62 Gráfico 3. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de limão tahiti (Citrus latifolia) ............................................................65 Gráfico 4. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum) ....................................................68 Gráfico 5. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Escherichia coli ATCC 35218 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g) ...........................................................................................................................70

Gráfico 6. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Salmonella enterica ATCC 10708 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g) .............................................................................................................71 Gráfico 7. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Staphylococcus aureus ATCC 25923 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g) ..........................................................................................71

Lista de Anexos

Anexo 1: Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais sobre Escherichia coli ATCC 35218 e os isolados obtidos das amostras de carne ...........................................................................................................................94 Anexo 2: Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais sobre Salmonella enterica ATCC 10708 e os isolados obtidos das amostras de carne .................................................................................................................95 Anexo 3: Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 e os isolados obtidos das amostras de carne .............................................................................................................96

Sumário

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................17

2. OJETIVOS ..................................................................................................20

2.1. Objetivo Geral .........................................................................................20

2.2. Objetivos específicos ..............................................................................20

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ..................................................................22

3.1. Qualidade da carne.................................................................................22

3.2. Fontes de contaminação microbiana da carne ........................................23

3.3. Microrganismos responsáveis pelas alterações microbiológicas ............24

3.3.1. Escherichia coli .......................................................................................24

3.3.2. Salmonella spp. ......................................................................................26

3.3.3. Staphylococcus spp. ...............................................................................28

3.4. Controle dos microrganismos .................................................................29

3.5. Conservação de alimentos......................................................................31

3.6. Óleos essenciais .....................................................................................33

3.6.1. Alecrim (Rosmarinus officinalis) ..............................................................35

3.6.2. Cravo da índia (Syzygium aromaticum) ..................................................36

3.6.3. Limão Tahiti (Citrus latifolia) ....................................................................37

3.6.4. Manjericão (Ocimum basilicum) ..............................................................38

4. MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................41

4.1. Isolamento e identificação de linhagens bacterianas .............................41

4.1.1. Detecção e isolamento de Escherichia coli ............................................41

4.1.2. Detecção e isolamento de Salmonella spp. ............................................41

4.1.3. Detecção e isolamento Staphylococcus spp. .........................................42

4.2. Óleos essenciais .....................................................................................42

4.3. Teste de sensibilidade aos óleos essenciais ..........................................44

4.4. Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre bactérias

patogênicas em matriz alimentar de carne moída ..................................45

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................48

5.1. Análise microbiológica ............................................................................48

5.1.1. Coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli ..............................48

5.1.2. Salmonella spp. ......................................................................................51

5.1.3. Staphylococcus spp. ...............................................................................54

5.2. Efeito antimicrobiano dos óleos essenciais .............................................58

5.2.1. Alecrim (Rosmarinus officinalis) ..............................................................58

5.2.2. Cravo da índia (Syzygium aromaticum) ..................................................61

5.2.3. Limão Tahiti (Citrus latifolia) ....................................................................64

5.2.4. Manjericão (Ocimum basilicum) ..............................................................67

5.3. Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre bactérias

patogênicas em matriz alimentar de carne moída ...................................69

6. CONCLUSÕES ...........................................................................................77

7. REFERÊNCIAS ...........................................................................................79

8. ANEXOS .....................................................................................................94

SILVA, N. D.S. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de especiarias sobre patógenos isolados de carnes comercializadas em Juazeiro-BA e Petrolina-PE

18

1. INTRODUÇÃO

O Brasil é um grande produtor de carne bovina e tem no mercado interno o

principal destino de sua produção, e no 1º trimestre de 2015 foram obtidas 1,837

milhões de toneladas de carcaças bovinas, 794,214 mil toneladas de carcaças

de frango e 3,162 milhões de toneladas de carcaças de suínos, sendo 75% para

consumo interno (IBGE, 2015). Nosso país é o maior exportador do mundo,

desde 2008 e segundo o IBGE, no 2º trimestre de 2015, as exportações

brasileiras de carne bovina in natura aumentaram em volume e faturamento. E

de acordo com Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA)

continuará a crescer a uma taxa de 2,15% ao ano (BRASIL, 2014).

Isto, ocorre devido a nova legislação, que fiscaliza a qualidade da carne e os

esforços para erradicar doenças e favorecer o aumento da produção. Em 2008,

aproximadamente 59% do território nacional foram considerados pela

Organização Internacional de Epizootias (OIE) livres da febre aftosa (BRASIL,

2014).

A carne bovina é encontrada em diferentes cortes e apresentações e

empregada em inúmeros derivados cárneos, necessitando de uma alta

manipulação, que quando não realizada da forma adequada, favorece o

desenvolvimento de microrganismos, como as bactérias da família

Enterobacteriaceae e dos gêneros Pseudomonas, Enterococcus e

Staphylococcus aureus, sendo as mais comuns e as patogênicas, Escherichia

coli, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus e Salmonella spp. e,

ocasionalmente, Yersinia enterocolitica, Clostridium botulinum e Bacillus cereus

(MARCHI et al., 2012; RIBEIRO, 2011).

Os alimentos de origem animal são veículos de muitos microrganismos

responsáveis por intoxicações e/ou infecções alimentares, as chamadas

doenças transmitidas por alimentos (DTA) (Food and drug administration – FDA,

2013). As doenças de origem alimentar são de vital interesse para saúde pública,

o Food and Drug Administration (FDA) classifica as doenças transmitidas por

alimentos como a principal preocupação de segurança alimentar, visto que os

episódios de toxi-infecção alimentar ultrapassam em número qualquer outro tipo

de contaminação microbiana por alimento (SIZER & WHITNEY, 2003).


19

A carne bovina está frequentemente envolvida em surtos de toxi-infecções

alimentares, por ser um dos alimentos mais consumidos e suas características

intrínsecas propiciarem um ótimo habitat para desenvolvimento desses

microrganismos. Tornando-se necessário, preocupar-se com a qualidade e

sanidade de produtos de origem animal. Especial atenção deve ocorrer desde a

origem da matéria prima, com a manipulação industrial, artesanal e comercial,

seguindo com o transporte, armazenamento, estocagem e exposição para a

venda ao consumidor, minimizando a contaminação e/ou multiplicação

bacteriana (FERRIER & BUZBY, 2014).

Em destaque, tem-se a utilização de especiarias e ervas adicionadas aos

alimentos em quantidades suficientes, evitando desta forma, a deterioração dos

mesmos (CEYLAN & FUNG, 2004). Estas e seus produtos derivados (óleos

essenciais e extratos) apresentam um potencial relevante como agentes de

inibição do crescimento de microrganismos, os quais eram usados apenas como

vetores de aromas e gostos característicos, e hoje se apresentam como uma

nova perspectiva de emprego (SOUZA et al., 2003).

Esta ação inibitória das especiarias e de seus óleos sobre os diferentes

microrganismos tem sido relatada em diversos estudos (OATTARA et al., 1997;

DORMAN & DEANS, 2000; HAMMER et al., 1999). Também tem sido notado,

que em geral os óleos essenciais extraídos de plantas colhidas durante ou

imediatamente após o florescimento possuem atividade antimicrobiana mais

intensa (MARINO et al., 1999).

Por isso a necessidade de um estudo mais aprofundado quanto a esta

função dos óleos, que pode ser influenciada por vários parâmetros, como o tipo,

composição, concentração, processamento e estocagem. Assim como, o tipo de

microrganismo e composição do substrato utilizado para inibir o crescimento do

microrganismo também podem fornecer resultados distintos para esta

propriedade (BERTINI et al., 2005).

Portanto, busca-se o emprego destes óleos essenciais como conservantes

alimentares, como alternativas de métodos mais suaves, proporcionando um

produto sem muito processamento, que é a utilização dos métodos drásticos de

esterilização, assim como, aumentar o tempo de prateleira dos alimentos.


21

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Avaliar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais de especiarias sobre

patógenos isolados de carnes comercializadas em Juazeiro-BA e Petrolina-PE

in vitro e em matriz alimentar de carne móida.

2.2. Específicos

Isolar e identificar Salmonella spp., Staphylococcus spp. e Escherichia coli

de amostras de carne provenientes do comércio de Juazeiro-BA e

Petrolina-PE;

Avaliar pela técnica de microdiluição em caldo da atividade antibacteriana

in vitro dos óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), cravo

da índia (Syzygium aromaticum L. Merr & Perry), limão tahiti (Citrus

latifólia Tanaka) e manjericão (Ocimum basilicum L.) sobre

microrganismos patogênicos;

Comparar a atividade dos óleos essenciais sobre isolados Salmonella

enterica ATCC 10708, Staphylococcus aureuus ATCC 25923 e

Escherichia coli ATCC 35218 com perfis de susceptibilidade;

Verificar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais em amostras de

carne contaminadas com Salmonella enterica ATCC 10708, Escherichia

coli ATCC 35218 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 partindo dos

valores de CBM (Concentração Bactericida Mínima) obtidos previamente

em estudos in vitro.


23

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Qualidade da carne

A carne, assim como o leite e ovos, apresenta-se como alimento de melhor

composição nutricional, tornando-se de fundamental importância na alimentação

da população (OLIVEIRA et al., 2008). É constituída de 75% de seu peso em

água (variando entre 65 a 80%). As proteínas representam 19% (entre 16 a 22%)

e são um dos componentes mais importantes no aspecto nutricional. As

substâncias nitrogenadas não proteicas totalizam 1,5%, os lipídios representam

entre 1,5 e 13%, o teor de carboidratos varia de 0,5 a 1,3%, além dos numerosos

compostos inorgânicos que totalizam 1% (ALVES et al., 2005). Este alimento

que serve como fonte de energia, com alto teor de ferro, em consequência da

presença dos ácidos graxos essenciais e das vitaminas do complexo B

(OLIVEIRA et al., 2008).

A sua comercialização em feira livre é uma atividade tradicional, um comércio

móvel em centros urbanos, que é motivo de preocupação em decorrência de

suas deficiências higiênico sanitárias, considerando que estes alimentos de

origem animal e seus produtos derivados ficam expostos sob condições

insalubres, sujeitos às ações diretas dos microrganismos patogênicos ou

provenientes da contaminação do ambiente e poluição ambiental, como também

de insetos, quando não estão adequadamente acondicionados ou embalados

(LUNDGREN et al., 2009).

A deterioração é a maior responsável pelas perdas econômicas nas

indústrias processadoras de carne e de produtos derivados, que é causado por

reações químicas, desencadeadas pela ação da luz, do corte ou moagem, do

cozimento e do armazenamento que eventualmente levam à perda de qualidade

e consequente rejeição do consumidor (TAVARES & SERAFINI, 2003). Estas

reações formam vários compostos que alteram as características sensoriais dos

produtos, produzem odores e sabores desagradáveis, diminuem o valor

nutricional do alimento e podem até mesmo ser nocivos à saúde (OLIVEIRA,

2011). Os produtos cárneos são considerados de qualidade microbiológica


24

aceitável quando atendem critérios determinados pela legislação vigente

(BRASIL, 2001).

Análises físico-químicas e microbiológicas devem ser realizadas com o

objetivo de avaliar a qualidade do processo produtivo e do próprio alimento,

avaliando o grau de contaminação por microrganismos deteriorantes, que

orientam o monitoramento e indicam medidas corretivas em pontos críticos de

controle (OLIVEIRA et al., 2008).

Os microrganismos encontrados na carne podem ser provenientes do animal

ou da contaminação durante o processo de abate e/ou processamento

tecnológico (KUMAR et al., 2014). Durante o abate torna-se imprescindível

manter as condições higiênicas necessárias para que se obtenha um produto de

qualidade, assim como, a manutenção das condições de temperatura do

ambiente, estocagem e distribuição para posterior comercialização de um

produto que esteja com suas características físico-químicas, organolépticas e

nutricionais adequadas, as quais são determinadas e mantidas de acordo com

as condições de higiene, conservação, exposição e comercialização

(LUNDGREN et al., 2009).

3.2. Fontes de contaminação microbiana da carne

A microbiota de um alimento é constituída por microrganismos associados à

matéria-prima e por contaminantes, que foram adquiridos durante os processos

de manuseio e processamento e aqueles que tiveram condições de sobreviver

aos métodos aplicados durante o preparo do alimento e seu acondicionamento.

Assim, esses microrganismos podem contaminar alimentos em qualquer um dos

estágios de produção, beneficiamento, manuseio, processamento,

acondicionamento, distribuição e preparo para o consumo (LUNDGREN et al.,

2009).

A maior parte dos alimentos está sujeita a várias fontes potenciais de

microrganismos, porém podem-se controlar os níveis de contaminação e manter

a microbiota em um número aceitável pela legislação vigente, através de

manuseio adequado, conhecimento e emprego de fatores que influenciam o


25

crescimento de microrganismos em alimentos, dentre outras ações (SOARES,

2010).

Assim, obtém-se uma maior validade do produto e uma menor probabilidade

de ocorrer uma infecção ou intoxicação, após o consumo. As fontes de

microrganismos em alimentos podem ser as plantas, que possuem uma

microbiota naturalmente presente, o ar, a água, o solo, os indivíduos (KUMAR et

al., 2014). Os animais têm microrganismos presentes nos pelos, penas, patas,

couro e no intestino, e a eliminação de microrganismos pelos animais contamina

o meio ambiente externo e recomeça todo o ciclo (NASCIMENTO et al., 2014).

A carne quando fresca serve como excelente substrato para o

desenvolvimento de microrganismos, por isso, o local de abate e manipulação

da carne deve seguir as normas higiênicas. A sanitização da carcaça pode ser

incluída, como operação de rotina, no processo de abate de animais para

consumo humano, no sentido de eliminar ou reduzir incidência desses

contaminantes (SIGARINI, 2004). O manuseio direto do produto em mercados

públicos contribui para o acréscimo nas contagens de S. aureus, esse

microrganismo está presente nas mãos, pele e fossas nasais do homem e nem

sempre os manipuladores cultivam hábitos higiênicos adequados (OLIVEIRA et

al., 2011)

Os microrganismos que causam doenças transmitidas por alimentos são

divididos em infecciosos, como Salmonella, Campylobacter e Eschericha coli

patogênicas e os intoxicantes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,

Clostridium botulinum. Os infecciosos multiplicam-se no trato intestinal, já os

intoxicantes são aqueles que produzem toxinas tanto nos alimentos quanto no

trato intestinal e os gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella

que constituem o grupo denominado coliformes totais, que avalia as condições

higiênicas, limpeza e sanitização e também contaminação fecal (PIRES &

PICCOLI, 2012).

3.3. Microrganismos responsáveis pelas alterações microbiológicas

3.3.1. Escherichia coli


26

A Escherichia coli é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae

faz parte da microbiota entérica de mamíferos e aves, são bacilos gram

negativos, não esporulados, fermentam glicose com produção de gás e ácido.

Apresentam antígenos somáticos “O” relacionando-se com polissacarídeos da

membrana externa; antígenos flagelares “H” relacionados com proteínas de

flagelos e os antígenos “K” relacionados com polissacarídeos (HOLT et al.,

1994).

É uma bactéria comensal encontrada em maior quantidade no intestino

grosso. Existem variantes de E. coli que adquiriram virulência: E. coli

enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroinvasiva

(EIEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e

E.coli uropatogenica (UPEC) (KASNOWSKI, 2004).

A E.coli Enterotoxinogênicas (ETEC) causa a conhecida “diarréia do

turista”, quando ingerida em grande quantidade em comida mal cozida ou água

contaminada com fezes, infectam principalmente o intestino delgado,

apresentando dores violentas abdominais, vômitos, diarreias, náuseas e febre

baixa (LUNDGREN et al., 2014). Produzem enterotoxinas termoestável (ST) e

termolábil (LT) com atividade de adenilato ciclase, que ao aumentar o GMPc

dentro do enterócito ocasiona a secreção de eletrólitos, como cloro e sódio, para

o lúmen intestinal, seguidos de água por osmose, resultando em diarreia profusa

aquosa, tipo água de arroz, sem sangue (TANG et al., 2014; LUNDGREN et al.,

2014). Em crianças em decorrência da desidratação, torna-se perigosa, sendo

reconhecida como a segunda causa de mortalidade entre as doenças

infecciosas em crianças menores de 5 anos (BAKHSHI et al., 2013).

E.coli Enteropatogênicas (EPEC) causam diarreias não sanguinolentas

epidêmicas em crianças, possuindo fator de adesão aos enterócitos, produzem

enterotoxinas, destruindo os vilos do intestino delgado, levando a uma má

absorção dos nutrientes e consequentemente uma diarreia osmótica. Há

também febre, náuseas e vômitos (BOUZARI et al., 2000; PALMEIRA et al.,

2001). Os vegetais quando regados com água contaminada podem transmitir a

EPEC. A diarreia causada por EPEC é mais comum e mais grave na infância e

rara em adultos. Já o aparecimento de anticorpos circulantes segue curso

inverso: não são detectáveis na infância e atingem níveis mais elevados nos

adultos. Admite-se, portanto, que a exposição a EPEC durante infância produz


27

imunidade contra este patógeno (SOUSA, 2006; GAVILANES-PARRA et al.,

2013).

E.coli Enteroinvasivas (EIEC) são invasivas e destroem a mucosa

intestinal, causando úlceras e inflamação, ocasionando uma diarreia aquosa

inicial seguida em alguns casos de diarreia com sangue e muco (NEWELL et al.,

2010). E.coli Enterohemorragica (EHEC) causa diarreia aquosa inicial que pode

progredir em colitehemorrágica e síndrome hemolítico-urêmico. As EHEC

possuem fímbrias aderentes e produzem toxina semelhante à produzida pela

Shigella, a shigatoxina, provocam anemia, trombocitopenia e insuficiência renal

aguda (SIGARINI, 2004; MOMTAZ et al., 2013; BANG et al., 2014). As E.coli

Enteroagregativas (EAEC) possuem fímbrias, produzem toxinas semelhantes às

da ETEC, causando diarreia aquosa ou hemorrágica, apresentam-se com

aparência característica, aglutinando-se umas às outras. E.coli uropatogênica

(UPEC) causa frequentemente infecções do trato urinário (ITUs) em mulheres

jovens, por apresentarem receptores específicos na membrana de células do

epitélio da pelve renal (PLATELL et al., 2011).

A presença em alimentos de coliformes a 35ºC, indica condições

higiênicas precárias e de coliformes 45ºC indicadora de contaminação fecal e

presença de bactérias patogênicas que possuem o habitat no trato intestinal.

Qualquer alimento pode estar relacionado a surtos por E. coli quando exposto à

contaminação fecal, destacando-se as carnes cruas, frangos, leite cru, saladas.

O bovino é considerado reservatório natural, tornando a carne bovina o principal

veículo deste patógeno (KASNOWSKI, 2004).

Para crescimento e sobrevivência no alimento deste microrganismo é

necessário a interação de diversos fatores intrínsecos e extrínsecos.

Desenvolve-se em uma temperatura que pode variar de 7 a 46ºC, pH ótimo de

6,0-7,0 e atividade de água mínima é 0,95. É sensível ao aquecimento

dependendo da composição do alimento, pH e atividade de água (Aa), sendo

destruída a uma temperatura de 60ºC por poucos segundos (HOLT et al., 1994).

3.3.2. Salmonella spp.

São bactérias da família das Enterobactereaceae, dividida em três espécies,

a S. enterica, S. bongori e S. subterrânea, com aproximadamente 2.463


28

sorovares, entre os quais 1.367 pertencem a subespécie enterica (MALHEIROS,

2007). Estão amplamente difundidas na natureza e são capazes de infectar o

trato intestinal de todos os animais domésticos e selvagens e o homem (PIRES

& PICCOLI, 2012). São bactérias mesófilas, com temperatura de crescimento

ótimo entre 35 e 37ºC, possuem a forma de bacilos pequenos, a maioria dos

sorotipos é produtora de gás, H2S, lisina e ornitina descarboxilase positiva. São

urease e indol negativos e reduzem o nitrato a nitrito (HOLT et al., 1994). A

Salmonella spp. cresce em pH com intervalo de 4,5 a 9,0 e crescimento ótimo

na faixa de 6,5 a 7,5, pH da maioria dos alimentos de origem animal (HOLT et

al., 1994).

A Salmonella spp., bactéria entérica, é responsável por graves intoxicações

alimentares, nos últimos anos, a incidência de salmonelose aumentou em todo

o mundo, sendo considerado uma das causas mais comuns de doenças

transmitidas por alimentos a nível internacional (OLAIMAT & HOLLEY, 2015). A

maioria é patogênica ao homem, com diferenças de sintomatologia em

decorrência da variação no mecanismo de patogenicidade, idade e resposta

imune do hospedeiro (SILVA et al., 2010).

As salmonelas ocasionam as doenças conhecidas por salmoneloses que são

divididas em três grupos, a febre tifoide (Salmonella typhi), as febres entéricas

(Salmonella paratyphi) e as enterocolites (demais sorovares), atravessam a

camada epitelial intestinal, alcançam a lâmina própria, onde proliferam. São

fagocitadas pelos monócitos e macrófagos, desencadeando uma resposta

inflamatória, decorrente da hiperatividade do sistema reticuloendotelial. Diferente

da febre tifóide, nas enterocolites a penetração de Salmonella spp. fica limitada

à lâmina própria, restrita à mucosa intestinal, raramente observa-se septicemia

ou infecção sistêmica (MALHEIROS, 2007; NASCIMENTO, 2007).

A resposta inflamatória está relacionada também com a liberação de

prostaglandinas, que são estimuladoras de adenilciclase, o que resulta em um

aumento de secreção de água e eletrólitos, provocando diarreia aquosa (SILVA

et al., 2010). Além disso, as Salmonella spp. podem utilizar mecanismos que

contribuem com a infecção, como a cápsula, protegendo contra a fagocitose, os

lipopolissacarídeos (LPS), que são indutores do choque séptico, e as fimbrias

que auxiliam à adesão da bactéria ao hospedeiro (MALHEIROS, 2007).


29

Vários alimentos podem ser contaminados com a Salmonella spp.,

principalmente aqueles que possuem alto teor de umidade, de proteína e de

carboidratos, como carne bovina, suínos, aves, ovos, leite e derivados, frutos do

mar e sobremesas recheadas, que são mais susceptíveis à deterioração (FAI et

al., 2011; SPECTOR & KENYON, 2012). Para ocorrência de uma gastroenterite

é necessário a ingestão de grande número de salmonelas, dependendo do

sorotipo isolado, a dose infectante se encontra entre 2,0x102 a 1,0x106 UFC/g,

assim como, o alimento envolvido e a espécie de Salmonella, pois espécies

adaptadas ao homem necessitam de doses infectantes menores que as não

adaptadas para provocar a mesma sintomatologia característica da doença

(LOUREIRO, 2007). Entretanto, algumas vezes a doença pode ser fatal em

crianças, idosos ou imunocomprometidos, devido à menor resistência às

infecções (SILVA, 2011).

Frutas e vegetais são alimentos que também podem também ser

veiculadores de salmoneloses, e essa contaminação é decorrente do controle

inadequado da temperatura, de práticas de manipulação incorretas ou

contaminação de alimentos crus pelos alimentos processados através do uso de

utensílios de cozinha propiciando a contaminação cruzada entre as carnes

contaminadas e vegetais consumidos in natura (PAULA, 2002). Portanto, o

desenvolvimento de um programa de controle e monitoramento proporciona

melhorias no controle da Salmonella spp., em produtos de origem animal (FILHO

et al., 2011).

3.3.3. Staphylococcus spp.

Staphylococcus é um gênero de bactérias gram positivas, em forma de cocos,

um dos patógenos mais comuns causadores de doença no homem. Na

microbiologia de alimentos, Staphylococcus aureus merece destaque devido a

frequência das intoxicações alimentares causadas pelo consumo de alimentos

contendo suas enterotoxinas termoestáveis, que ao encontrar condições

favoráveis à sua multiplicação no alimento, em poucas horas, a pessoa infectada

apresenta os sinais clínicos (HOLT et al., 1994).

Podem ser encontrados como microbiota de mamíferos, mas podem

sobreviver em diversos ambientes e a desidratação ou secagem. Existem mais


30

de 30 espécies reconhecidas de estafilococos e S. aureus é considerado o mais

patogênico para seres humanos e outros animais, devido à sua capacidade de

colonizar uma vasta gama de espécies, pode ser prontamente transmitido a partir

de uma espécie para outra, incluindo de humanos para outros animais e vice-

versa (CARVALHO et al., 2013).

As enterotoxinas são produzidas durante a fase de crescimento do

microrganismo no alimento, são peptídeos de pequeno peso molecular, não são

destruídas pelos processos de cocção e esterilização. São produzidas as toxinas

A, B, C (C1 e C2), D, E, F e G. A enterotoxina B encontra-se associada a cerca

de 50% dos casos de síndrome do choque tóxico (TSS), pois como

superantígeno, estas toxinas estimulam os linfócitos liberarem citocina as quais

provocam o choque. A toxina 1 (C1) da síndrome do choque tóxico (TSST-1)

pode causar desde intoxicações alimentares até desordens multissistêmicas

(SANTANA, et al., 2010; BRANDÃO et al., 2013).

As enterotoxinas estafilocócicas (SE) são os principais agentes de

intoxicação e são relatadas em vários surtos de doenças transmissíveis por

alimentos (BRANDÃO et al., 2013). Como são termoestáveis, tornam o período

de incubação bastante curto após a ingestão do alimento contaminado (DORES

et al., 2013), a cocção dos alimentos não a destrói, mesmo com o microrganismo

é destruído, mas uma vez formada no alimento pode causar intoxicação

(MEDEIROS et al., 2013).

Staphylococcus aureus também produz uma série de enzimas extracelulares,

onde a mais conhecida é a coagulase, enzima que caracteriza a espécie, esta

coagula o sangue ao transformar o fibrinogênio em fibrina, da mesma forma que

a trombina humana, formando coágulos à volta das bactérias dificultando o seu

reconhecimento e a fagocitose pelas células do sistema imunitário (SANTANA,

et al., 2010).

3.4. Controle dos microrganismos

A carne por ser o alimento mais consumido, torna-se grande a preocupação

quanto ao seu fornecimento saudável, este produto mesmo sendo obtido de um

animal sadio, pode ser contaminado durante o abate e/ou durante o


31

processamento, comercialização e armazenamento inadequados, chegando ao

consumidor e oferecer risco à saúde (NASCIMENTO et al., 2014).

A adoção de medidas eficazes de limpeza e cuidados higiênicos durante todo

o processamento deste alimento, tem o intuito de, senão eliminar, reduzir a carga

microbiana presente. Além do cuidado com o ambiente, é necessário também

adoção de medidas de higiene com os manipuladores dos alimentos

(NASCIMENTO et al., 2014). É imprescindível o estabelecimento destas

medidas para minimização da contaminação, desde a diminuição da

contaminação de matéria-prima, limpeza e sanitização dos equipamentos,

controle de pragas, insetos e roedores, prevenção da contaminação cruzada

entre portadores assintomáticos e matéria-prima, estabelecimento de Boas

Práticas de Fabricação (BPF) entre outras medidas, garantindo a qualidade do

produto, segurança do consumidor e dos manipuladores (ALCANTARA et al.,

2012).

O controle da qualidade do produto final não oferece garantia de qualidade,

devido à dificuldade de analisarem amostras em quantidades suficientes para

obtenção de informações suficientes sobre o lote do produto, além do tempo

prolongado das análises microbiológicas e o alto custo. Portanto, torna-se

necessário uma intervenção na educação para que ocorra a manipulação

adequada dos alimentos, garantindo a segurança no manuseio e o fornecimento

de um alimento seguro à população (ANJOS, 2013).

Um alimento seguro é resultante da idoneidade, integridade e legalidade,

estes requisitos tornam-se fundamentais, pois, além de obter rentabilidade do

produto, há o cumprimento dos requisitos legais e satisfação e segurança do

consumidor. Além disto, seus constituintes ou contaminantes que podem causar

perigo à saúde estão ausentes ou em concentrações abaixo do limite de risco

(SOUZA et al., 2005)

Um alimento pode tornar-se de risco em decorrência de uma manipulação

inadequada, uso de matérias primas cruas e contaminadas, contaminação e/ou

crescimento microbiano, uso inadequado de aditivos químicos, adição acidental

de produtos químicos e poluição ambiental e degradação de nutrientes (FROTA,

2009).


32

3.5. Conservação de alimentos

A conservação de alimentos é aplicada desde épocas pré-históricas em

decorrência da necessidade da estocagem dos alimentos para uso posteriores

fazendo surgir a secagem de carnes ao sol, um dos métodos mais antigos.

Posteriormente, percebeu-se que o uso do sal dos desertos associado à ação

do sol mantinha os alimentos por longos períodos. E a partir daí, iniciou-se o

processo de conservação de alimentos com técnicas empíricas, que se mantêm

até hoje. Mas, a evolução dos conhecimentos científicos e tecnológicos iniciou-

se a descoberta e o desenvolvimento de outros métodos de conservação

(CARDOSO & RUBENSAM, 2011).

Pesquisas na área da microbiologia de alimentos estimularam para

desenvolvimento de estudos voltados à conservação de alimentos para que

recebesse destaque no ramo da ciência dos alimentos (SOUZA et al., 2005;

BAJPAI et al., 2012). A conservação de alimentos tem como objetivos principais

manter os microrganismos sob controle, assim como, preservar a qualidade

sensorial e nutritiva dos mesmos (BARBOSA, 2010).

Os alimentos estão propícios a uma série de alterações desde sua obtenção

ou fabricação até sua aquisição e consumo, as quais irão influenciar na validade,

ou vida de prateleira, que é o período de tempo que o alimento se mantém seguro

para o consumidor, através da conservação de suas características sensoriais,

físicas, químicas, funcionais e nutricionais sob as condições de armazenagem

adequadas (AUN et al., 2011).

A velocidade das alterações microbiológicas é afetada por diversos fatores

que se relacionam com as características intrínsecas do alimento (atividade de

água, pH, composição química e o potencial redox) e os fatores extrínsecos

(temperatura, umidade relativa e a composição) (BARBOSA, 2010). Além da

contaminação por microrganismos, ocorrem também as alterações que podem

ser de natureza bioquímica através da ação de enzimas naturalmente presentes

nos alimentos (CARDOSO & RUBENSAM, 2011).

A conservação de alimentos baseia-se no uso de técnicas que reduzam as

taxas de alterações microbiológicas ligadas à segurança alimentar. São

utilizados vários métodos, como o uso de calor e radiação ionizante, que se

baseiam na inativação de microrganismos, reduzindo a carga microbiana e a


33

desnaturação das proteínas e têm os que possuem como princípio o controle do

crescimento, representado pelas fermentações e os baseados em redução de

temperatura, pH ou atividade de água (BARBOSA, 2010; ANJOS, 2013).

Apesar da diminuição da carga microbiana, estes processos térmicos

apresentam efeitos adversos nas propriedades sensoriais e nutricionais, entre

eles destacam-se, a esterilização, a pasteurização e o branqueamento. Já nas

técnicas que utilizam o frio, têm-se a refrigeração e congelamento, as quais

conservam melhor as propriedades sensoriais e nutricionais do alimento

(FRANCO & LANDGRAF, 2002).

Quando não se pode empregar tratamentos físicos e/ou biológicos na

conservação de alimentos, torna-se necessário o uso de conservantes, que

impedem ou retardam alterações provocadas por microrganismos (SOUZA,

2006). Esses conservantes possuem ação antimicrobiana com efeito no DNA,

membrana plasmática, parede celular, síntese proteica, atividade enzimática,

transporte de nutrientes. Por isso, a escolha do conservante deve ser baseado

no tipo de microrganismo, a facilidade de manuseio, o impacto no paladar, o

custo e a sua eficácia, onde o número de conservantes permitidos é bastante

reduzido (FRANCO & LANDGRAF, 2002). Portanto, faz-se necessário o

desenvolvimento e aplicação de produtos naturais com atividades antioxidante e

antibacteriana, especialmente em produtos cárneos, sendo útil para prolongar a

vida útil de armazenamento e prevenção de doenças alimentares (SOUZA,

2006).

O uso de óleos essenciais poderia surgir como alternativas economicamente

mais viável quando se pretende fazer o uso das propriedades antimicrobianas

destes compostos utilizados na conservação de alimentos. Os compostos ativos

das especiarias estão incluídos na classe dos conservantes de alimentos de

ocorrência natural e alguns tem sua inclusão permitida pelos órgãos reguladores

(ANVISA, 1999).

A avaliação do efeito antimicrobiano é de fundamental importância para a

realização do desenvolvimento de sistemas de bioconservação, que segundo

Trajano et al. (2009) é um sistema de preservação bem aceito, sendo um

procedimento natural para promover a extensão da vida útil e segurança

microbiológica dos alimentos.


34

São relativamente fáceis de obter, apresentam baixa toxicidade em

mamíferos e degradam-se rapidamente na água e no solo, os quais tornam-se

não poluidores do ambiente (KAVANAUGH & RIBBECK, 2012). São compostos

potencialmente utilizados no controle sanitário, que propiciam o desenvolvimento

de técnicas que possam diminuir os efeitos negativos de oxidantes, radicais e

microrganismos, o uso desses metabólitos secundários cresce cada vez mais,

devido a preferência dos consumidores pelos benefícios à saúde (PEREIRA et

al., 2008).

Por isso, a busca constante por produtos naturais como fontes de

antioxidantes com intuito de utilização nos alimentos como conservantes para

minimizar a oxidação dos mesmos, pois muitos antioxidantes naturais, como

extratos de alecrim e especiarias em estudos mostraram ser mais ativos do que

os antioxidantes sintéticos e suas aplicações em alimentos precisam ser

exploradas, assim como, a manutenção das qualidades sensoriais e nutricionais

do alimento (SHAH et al., 2014).

Além da diminuição do uso de aditivos químicos que possuem sua

aplicabilidade questionada quanto a sua segurança, sendo os óleos essenciais

alternativas naturais, assim como, a diminuição de sal ou açúcar por razões

dietéticas, favorecendo o uso de outros condimentos, que possuem como

alternativa o uso associado à combinação de vários óleos, diminuindo o efeito

sensorial e potencialização do efeito antimicrobiano, podendo ser utilizado de

forma segura e efetiva (ALVES, 2010).

3.6. Óleos essenciais

Os óleos essenciais são substâncias derivadas do metabolismo secundário

das plantas, que podem ser classificados nos terpenos e os seus derivados

oxigenados, hidrocarbonetos cíclicos e seus derivados, álcoois de aldeídos

(BERTINI et al., 2005; OKOH, 2010) que possuem como função principal, a

proteção contra predadores (BERALDO et al., 2013).

Podem ser chamados de óleos voláteis, etéreos ou essenciais, as quais são

atribuídas em função de suas características físico-químicas, como serem

líquidos e de aparência oleosa à temperatura ambiente e evaporarem quando


35

expostos ao ar em temperaturas comuns, que os difere dos óleos fixos, além do

aroma intenso e agradável (TAVARES, 2007; BERALDO et al., 2013).

São compostos de composição complexa, com a presença de terpenos

(mono, sesqui e diterpenos) e fenilpropanóides (BRITO, 2007; SIMOES &

SPITZER, 2000), álcoois simples, aldeídos, cetonas, fenóis ésteres, éteres,

óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas e cumarinas até

compostos como enxofre, que podem variar conforme a parte da planta, o grau

de desenvolvimento, o horário e o ambiente que estão localizadas (ROCHA &

SANTOS, 2007).

Estão presente em diferentes concentrações, sendo o majoritário o composto

farmacologicamente ativo, o qual determina as propriedades biológicas

(SANTURIO, 2007; BARBOSA, 2010). Dentre as substâncias estão os

terpenóides e compostos fenólicos como timol, carvona, carvacrol, mentol,

muroleno, citral, eugenol, 1-8 cineol, limoneno, pineno, linalool e seus

precursores (OUSSALAH et al., 2006). Quanto ao mecanismo de ação, este não

está bem caracterizado, associando-se ao caráter lipofílico dos compostos, que

atua através do acúmulo em membranas e perda de energia pelas células

(DUARTE, 2006).

Apresentam atividade antisséptica, propriedades medicamentosas e

flavorizantes, detendo-se maior conhecimento de alguns dos mecanismos de

ação, principalmente quanto ao efeito antimicrobiano (BARBOSA, 2010). A

atividade antimicrobiana deve-se a presença e o nível de concentração dos

diferentes compostos fitoquímicos, como fenólicos, flavonóides, alcalóides,

saponinas, taninos, o carvacrol, terpenos e timol entre outros, os quais são

reconhecidos como a fonte potencial para esta atividade (FALOWO et al., 2014).

Estes compostos exercem seus efeitos diretamente na membrana

citoplasmática, provocando alterações na sua estrutura e funções dos

microrganismos (HOLEY & PATEL, 2005). São também utilizados como

antibióticos, analgésicos, sedativos, anti-inflamatório, antiespasmódico e

anestésico local (BHOWMIK et al., 2012; DIAS, 2008).

O uso indiscriminado de drogas ocasiona a resistência de patógenos

humanos e animais, os quais são bem documentados da evolução biológica,

sendo um sério problema tanto em países desenvolvidos como em

desenvolvimento, por isso busca-se por novas substâncias antimicrobianas


36

provenientes de fontes naturais, apresentando-se importante nas companhias

farmacêuticas, considerando que muitas plantas não são estudadas e que

podem ser avaliadas quanto à ação antimicrobiana (DUARTE, 2006).

3.6.1. Alecrim (Rosmarinus officinalis L.)

O alecrim (Rosmarinus officinalis L.) é uma espécie da família Lamiaceae,

uma planta que cresce em Países do Mediterrâneo, sul da Europa e na região

litorânea através de áreas da Ásia Menor. Sua erva e óleo são usados como

agentes de especiarias e aromatizantes em processamento de alimentos por

estabelecer um sabor desejável, e tem sido objeto de estudo para atividade

antioxidante, antimicrobiana, inseticida, anti-inflamatória, antinociceptiva e

antifúngico, além da sua utilização na medicina tradicional para o tratamento de

depressão, insônias e dores articulares (DERWICH et al., 2011).

Diferentes partes de plantas têm sido usados para obter óleos essenciais,

entre estes incluem as flores, folhas, sementes, raízes, vapores, cascas e

madeira, rica em compostos fenólicos, com alta atividade antimicrobiana contra

microrganismos gram positivos e negativos, mas esta atividade não está bem

caracterizada, devido a quantidade de diferentes compostos químicos presentes

nos óleos essenciais, sendo assim, atribui-se que a atividade antimicrobiana

esteja associada a diversos mecanismos (ROŽMAN & JERŠEK, 2009).

A composição química do óleo essencial da planta de um modo geral,

depende de um número de fatores, como hereditariedade, parte e idade da

planta, método de isolamento, condição ambiental, temporada da coleta,

procedimento de desidratação e condição de armazenamento sob o qual a planta

coletada é mantida até que o óleo essencial seja extraído (OUSSALAH et al.,

2007).

O óleo essencial contém vários compostos em diferentes concentrações,

sendo caracterizado por dois ou três componentes principais, que se apresentam

em concentrações mais elevadas. Estes componentes em maior concentração

são os responsáveis pelas propriedades biológicas dos óleos essenciais, que

atuam sinergicamente ou regulando uns aos outros (VERMA et al., 2011).


37

3.6.2. Cravo da índia (Syzygium aromaticum L. Merr & Perry)

Syzygium aromaticum é uma árvore pertencente à família Myrtaceae,

cultivada nas ilhas da Tanzânia, Madagascar, Indonésia, Ilhas Comores, Brasil

e SriLanka (PINTO et al., 2009), mas o maior produtor é a Indonésia com 50.000

- 60.000t por ano. Uma planta tropical que exige clima quente e úmido, com

precipitação de 2500-3000 mm3, planta perene, chegando a 30 m de altura, o

brotamento das flores ocorre após 5 anos e alcança a plena produção após 15-

20 anos. Sendo que nos últimos 10 anos a sua produção diminuiu devido a

questões agronômicas, que é influenciada pela precipitação de chuva, a

exposição a baixas e altas temperaturas, o comprimento do período seco e

outros parâmetros fisiológicos e ecológicos, além dos econômicos e sociais

(BAIETTO, 2014).

A colheita dos botões de flores é manual para não danificar os ramos, que

afetaria o crescimento, botões são expostos em sol direto por um período de

quatro a cinco dias ou quatro horas em aparelhos de secagem. No entanto, o

principal problema associado com a colheita dos botões de flores intactas

associa-se a falta de qualificação e tempo para separação dos talos. Mesmo que

a fase juvenil de árvores de cravo tenha a duração de cerca de 5 anos, a

produção total ocorre em plantas mais elevadas e vigorosa (BAIETTO, 2014).

A determinação do tempo de colheita é também crucial para otimizar o

rendimento e a concentração de óleos essenciais no produto seco. Seu óleo

essencial é composto de 18 componentes que representam mais de 99% do óleo

essencial de cravo, sendo os principais: eugenol (87%), eugenilo acetato (8%),

β-cariofileno (3,5%) (BAIETTO, 2014), além de outros importantes componentes

que incluem vanilina, ácido crategolico, taninos, ácido gallotanico, salicilato de

metila (analgésico), os flavonóides eugenina, kampferol, ramnetina e eugenitina,

triterpenóides como o ácido oleanólico, estigmasterol e campesterol e vários

sesquiterpenos (HEMA et al., 2010).

Seu óleo essencial tem sido associado a efeitos antisépticos, analgésicos e

anestésicos úteis, sendo amplamente utilizado na medicina dental. Outras

atividades são relatadas, como atividade contra leveduras e fungos filamentosos

e várias espécies de fungos de origem alimentar e patogênico para humanos e


38

estudos têm demonstrado potente efeitos antifúngicos, antivirais e

antibacterianos (SAEED & TARIQ, 2008).

Em relação ao espectro de atividade antifúngica e a relação com a

composição química, torna-se necessário complementar os estudos da atividade

antimicrobiana e sua relação com os compostos isolados. Em decorrência dos

estudos realizados com os extratos das plantas, acredita-se que a ação dos

compostos majoritários do óleo essencial se fundamente na membrana celular

do microrganismo (PINTO et al., 2009). Na Europa, o cravo tornou-se popular

devido à sua capacidade de preservar os alimentos, e mascarar o cheiro de

alimentos mal conservados (BHOWMIK et al., 2012).

3.6.3. Limão tahiti (Citrus latifolia Tanaka)

O gênero Citrus foi classificado em 1875 por Hoocke em somente quatro

espécies, enquanto Engler, em 1931, propôs 11 espécies para o gênero e

Swingle, em 1943, subdividiu o gênero Citrus em dois subgêneros: Papeda e

Citrus, com 16 espécies. Tanaka em 1961 propôs a existência de 159 espécies

para os citros. Essas diferenças com relação ao número de espécies deveram-

se ao fato de Swingle considerar muitos dos representantes desse grupo como

híbridos, enquanto Tanaka os considera como espécies verdadeiras

(BASTIANEL et al., 2001).

Os Citrus estão entre as frutas mais produzidas e consumidas no mundo,

destacando-se as laranjas, tangerinas, limas e limões (OLIVEIRA et al., 2008).

O limão 'Tahiti' (Citrus latifolia Tanaka) é um hibrido de citros, cultivado no

México, América do Sul, América Central, EUA e na Índia. No Brasil é uma

variedade comercial importante, onde são vendidos frescos tanto em mercados

como para indústrias para uma produção de concentrado de suco e óleo

essencial (STENZEL & NEVES, 2004).

Citrus pertence à família Rutaceae, considerado um gênero cosmopolita,

abundante na região tropical, gênero bem conhecido, não só para o consumo,

mas também pelas suas propriedades medicamentosas, devido a presença de

fenóis, incluindo flavonóides, que são potentes antioxidantes, propriedades que

se concentram em extratos obtidos a partir de frutas, além das folhas. Estas


39

plantas frutificam apenas uma vez por ano, no entanto, têm as folhas ao longo

deste tempo como parte das estratégias de cultivo e constituem um material de

resíduos (KAEWSUKSAENG et al., 2011).

As cascas dos frutos possuem diversos metabólitos secundários, produzidos

em decorrência da proteção contra fatores bióticos e abióticos, destacando-se

os terpenoides, carotenoides, cumarinas, furanocumarinas e flavonoides,

principalmente flavononas e flavonas polimetoxiladas, raras em outras plantas

(SIGARINI, 2004), os quais estão presentes em extratos e óleos, que despertam

interesse em diversas áreas de bioatividade, como atividade antibacteriana

(FISHER & PHILLIPS, 2008), antifúngica (LIU et al., 2012), antioxidante (PATIL

et al., 2009), inseticida (SISKOS et al., 2008) entre outras atividades.

As características antimicrobianas dos óleos dos Citrus só foram exploradas

recentemente, apesar da extensa bioatividade (FISHER & PHILLIPS, 2008).

Antimicrobianos naturais parecem ser alternativas viáveis na substituição de

conservantes ou desinfetantes químicos (ASHOK KUMAR et al., 2011), estes

muitas vezes poluidores e até alérgenos que possuem pouca aceitação dos

consumidores. Óleos compõem diversas preparações farmacêuticas pelas suas

propriedades antissépticas, nas áreas de ginecologia, oftalmologia e cirurgia,

mas pouco utilizados em alimentos (GERHARDT et al., 2012).

3.6.4. Manjericão (Ocimum basilicum L.)

O manjericão (Ocimum basilicum L.), pertence à família Lamiaceae,

possuindo entre 50 e 150 espécies (MAZUTTI et al., 2006) é uma planta

herbácea, anual ou perene, que ocorre de forma subespontânea no Brasil, atinge

até 1 m de altura e possui caule muito ramificado faz parte de um grupo de

plantas medicinais e aromáticas de grande valor econômico e tornou-se

importante por apresentar utilização cosmética, na alimentação e indústria

farmacêutica (COSTA et al., 2009), são vulgarmente utilizados como

condimentos em salsicha e indústrias de alimentos congelados, e também na

sua forma natural (OLIVEIRA et al., 2013), originárias de regiões tropicais e

subtropicais da Ásia, da África e da América Central e do Sul (MARTINS et al.,

2010).


40

O teor de óleo essencial contido nesta planta encontra-se na faixa entre 1,5

e 3% dependendo da região geográfica e da espécie (MAZUTTI et al., 2006).

Além deste, destacam-se os flavonóides, taninos, saponinas, ácido caféico e

cânfora. A atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjericão está

associada a seus constituintes metil chavicol e linalol, sendo assim, amplamente

utilizado na medicina popular no combate às infecções bacterianas. (FREIRE et

al., 2014).

A composição dos óleos essenciais extraídos das folhas e dos ápices com

inflorescência do manjericão varia de acordo com a espécie e a localização

geográfica, sendo classificados em quatro quimiotipos, de acordo com os

componentes majoritários do óleo: quimiotipo linalol-metil chavicol, metil

chavicol, metil cinamato e quimiotipo eugenol (MARTINS et al., 2010).

Entre os constituintes majoritários de uma espécie para outra ocorre

variações quanto a constituição, principalmente pelo fato dos componentes do

óleo essencial de Ocimum basilicum L. serem produzidos por duas rotas

bioquímicas diferentes: rota do ácido chiquímico e rota do ácido mevalônico. Na

primeira, os maiores constituintes da espécie são metil cavicol, eugenol, metil

eugenol e cinamato de metila, enquanto que na segunda os componentes

majoritários são linalol e geraniol (MAZUTTI et al., 2006; VENÂNCIO et al., 2011;

LUZ et al., 2013).

Amplamente utilizado na medicina popular como antiespasmódico,

antitérmico, auxiliando também na digestão e no combate de infecções

bacterianas e parasitárias intestinais. A atividade antimicrobiana do óleo

essencial do manjericão tem sido relatada como sendo predominantemente

associada aos seus constituintes majoritários, o metil chavicol e o linalol

(MARTINS et al., 2010).


42

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Isolamento e Identificação de linhagens bacterianas

Foi realizado a coleta de 17 amostras de carne bovina em feiras livres e

estabelecimentos comerciais no período de agosto/2013 a janeiro/2014, 100 g

de cada amostra foram pesados em sacos plásticos estéreis e levadas ao

laboratório de Microbiologia e Imunologia Animal do campus de Ciências

Agrárias da Univasf, onde foram submetidas à análise microbiológica para

isolamento e identificação de Staphylococcus aureus, Salmonella spp. e

Escherichia coli.

4.1.1. Detecção e Isolamento de Escherichia coli

Foram pesados 25g da amostra de carne e adicionados 225mL de água

peptonada e homogeneizada, onde obteve-se a diluição 10-1, e a partir desta

foram obtidas as diluições 10-2 e 10-3. Logo após, foram transferidos 1mL destas

diluições em tubo contendo 9mL de caldo LST (Lauril Sulfato de Sódio) + Durhan

e incubados a 35-37ºC por 24-48h. Os tubos que apresentaram produção de gás

e turbidez, transferiu-se uma alçada para tubos com 10mL de caldo EC e

incubados a 44,5ºC por 24-48h. Os tubos positivos foram estriados em placas

com ágar Mac Conkey e incubados a 35ºC por 24h. Realizou-se a coloração de

Gram para avaliação morfológica das colônias. Duas colônias características

foram transferidas para meio TSA para confirmação através das provas

bioquímicas, onde inoculou-se as colônias típicas em SIM (produção de H2S,

Indol e Motilidade), vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP) e citrato e

incubados a 35°C por 24 +/- 2 horas (Food and drug administration – FDA, 2013).

4.1.2. Detecção e Isolamento de Salmonella spp.


peptonada tamponada e homogeneizada, obtendo uma concentração de 10-1 e

incubado a 37°C por 18+/-2 horas. Logo após, realizou-se o enriquecimento

seletivo, onde transferiu-se 0,1mL para 10mL de RV (Rapapport Vasiliadis) e


43

incubados a 41,5°C em banho-maria por 24+/-3h e 1mL para 10 mL de caldo TT

(Tetrationato) a 37°C por 24+/-3h. Após este período, realizou-se o estriamento

por esgotamento em XLD (Xilose Lisina Desoxicolato) e BS (Bismuto Sulfito) e

incubadas invertidas em estufa a 37+/-1°C por 24+/-3h. Verificou-se colônias

típicas e realizou-se a coloração de Gram para verificar a característica

morfológica da bactérias. Realizou-se o isolamento das colônias típicas para

realização da série bioquímica para identificação, através dos testes com TSI

(Agar Tríplice Açúcar Ferro) e LIA (Lisina Iron Ágar), SIM (produção de H2S, Indol

e Motilidade), vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP) e citrato e

incubados a 35°C por 24 +/- 2 horas (Food and drug administration – FDA, 2013).

4.1.3. Detecção e Isolamento Staphylococcus aureus


peptonada tamponada e homogeneizada, obtendo uma concentração de 10-1,

logo após, retirou-se alíquotas de 1mL e adicionou em tubos com 9mL de Água

peptonada tamponada (APT), obtendo diluições de 10-2 e 10-3. Em seguida,

realizou-se a inoculação na superfície de placas contendo Ágar Baird-Parker.

Sendo inoculado 0,3mL da diluição 10-1 em três placas e 0,1mL em outra, bem

como 0,1mL das diluições 10-2 e 10-3 em outras duas placas. Após a secagem

do inóculo as placas foram invertidas e incubadas a 35-37ºC por 48 horas. Após

esse período identificou-se colônias típicas, as quais apresentam-se como

colônias circulares, pretas ou cinzas escuras, convexas, bordas perfeitas,

rodeadas por uma zona opaca ou halo transparente. Destas colônias típicas

foram escolhidas três colônias características e estriou em ágar Tryptose Soya

Ágar (TSA), em seguida foi realizado coloração de gram para caracterização

morfológica e os testes de catalase, DNAse e PAB (Purple Ágar Base) (Food

and drug administration – FDA, 2013).

4.2. Óleos essenciais

Os óleos essenciais de alecrim (Rosmarinus officinalis L.), cravo da índia

(Syzygium aromaticum L. Merr & Perry) e manjericão (Ocimum basilicum L.)


44

foram extraídos através da destilação a vapor d’água e limão tahiti (Citrus latifolia

Tanaka) extraído através da prensagem a frio das cascas, os quais foram

adquiridos da empresa Laszlo Aromaterapia, situada na cidade de Belo

Horizonte-MG, com composição mostrada na tabela 1.

Tabela 1: Óleos essenciais, composição química e estrutura dos constituintes majoritários.

Condimento Nome

cientifico

Composição

química

Constituinte

majoritário

Estrutura do constituinte

majoritário

Alecrim Rosmarinus

officinalis L.

Cânfora (20-

25%),

1,8-cineol (15-

20%),

Mirceno (2-3%),

Pineno (25-30%),

Verbenona (2-

3%), Borneol (3-

4%),

Acetato de

bornila (1-3%) e

Cimeno (2-3%)

Pineno (25-30%) 2,6,6-Trimetil

biciclo[3.1.1]hept-2-eno ((−)-

α-Pineno)

CH3

CH3 CH3

Cravo da

índia

Syzygium

aromaticum

L. Merr &

Perry

Eugenol (90-

95%),

β -cariofileno (<

1-3%), Acetato

de eugenila (<

1%),

β-cariofileno (< 1-

3%),

α-humuleno (<

1%) e Oxido de

cariofileno (< 1%)

Eugenol (90-

95%)

2-metoxi-4- (2-propenil) fenol

OH O

CH3

CH2


45

Limão Tahiti Citrus

latifólia

Tanaka

Pineno (15-20%),

γ-terpineno (3-

7%), Bisaboleno

(< 4%),

Limoneno (50-

55%), Cimeno (6-

9%), Mirceno (<

2%), Acetato de

Piperitol (1-2%) e

Bergamoteno (2-

3%)

Limoneno (50-

55%)

1-metil-4- (1-metiletenil)-

ciclohexano

CH3

CH3CH2

Manjericão Ocimum

basilicum L.

Linalol (52-58%),

1,8 Cineol (6-

9%), Eugenol (3-

5%), Cadineno

(2-5%), Murolol

(2-6%),

Cariofileno (1-

2%),

Bergamoteno (5-

9%) e

Germacreno (2-

4%)

Linalol (52-58%) 3,7-dimetil-1-6-octadien-3-ol

CH2

OHCH3

CH3CH3

4.3. Teste de Sensibilidade aos óleos essenciais

Foram pesados 0,25 g de cada óleo essencial e diluídos em 5mL de DMSO e

5mL de metanol, obteve-se uma solução estoque na concentração de 25mg/mL.

A técnica de microdiluição em caldo teve como princípio as instruções contidas

no documento M07-A9 (CLSI, 2012), que consistiu na distribuição de 200μL de

caldo Mueller-Hinton em placas de microtitulação, a seguir, 200μL da solução

estoque do óleo essencial foram acrescidos ao primeiro poço e, após

homogeneização, transferidos para o segundo e assim sucessivamente, sendo

obtidas as seguintes concentrações: 12.500μg/mL; 6.250μg/mL; 3.125μg/mL;

1.562,5μg/mL; 781,2μg/mL; 390,6μg/mL; 195,3μg/mL e 97,6μg/mL.


46

Na preparação dos inóculos utilizou-se solução salina para obtenção de

suspensão bacteriana com turvação estabelecida através da leitura em

espectrofotômetro na absorbância de 600nm, obtendo uma densidade óptica de

0,190 para os isolados de Escherichia coli (2,37x108 UFC/mL), 0,145 para os

isolados de Salmonella spp. (2,43x108 UFC/mL) e na absorbância de 546 nm,

com uma densidade óptica de 0,035 para os isolados de Staphylococcus spp.

(1,36x107 UFC/mL), valores obtidos pelo método de contagem utilizando

plaqueamento em profundidade em meio de cultura Plate Count Ágar (PCA).

Desta suspensão retirou-se 100μL e adicionou em 9,9mL de caldo Mueller-

Hinton, da qual retirou-se 10μL que foram inoculados nos poços de microplacas

contendo a diluição dos óleos essenciais de manjericão (Ocimum basilicum L.),

limão tahiti (Citrus latifoliaTanaka), alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e cravo da

índia (Syzyguim aromaticum L.). As microplacas foram incubadas a 37°C por

24h, em condições de aerobiose.

Com a utilização de um replicador retirou-se alíquota de 10μL que foi semeada

em superfície de ágar Mueller-Hinton e incubou-se por 24 horas a 37ºC onde

determinou-se a concentração bactericida mínima (CBM), definida como, a

menor concentração do óleo essencial em estudo capaz de causar a morte do

inóculo. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

4.4. Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre

bactérias patogênicas em carne moída

Realizou-se os ensaios de contaminação artificial em carne moída utilizando

culturas de bactérias patogênicas cultivadas em Triptose Soya ágar (TSA) por

24 horas a 35ºC, as quais foram padronizadas em espectrofotômetro com leitura

de densidade óptica de 0.145, 0.190 e 0.035 obtendo concentração bacteriana

ao redor de 2,43x108 UFC/g de Salmonella enterica ATCC 10708, de 2,37x108

UFC/g de Escherichia coli ATCC 35218 e de 1,36x107 UFC/g de Staphylococcus

aureus ATCC 25923, respectivamente, contagem estas que foram obtidas

previamente pelo método de contagem utilizando plaqueamento em

profundidade em meio de cultura Plate Count Ágar (PCA). Utilizou-se como


47

controle positivo a carne moída com a adição de bactéria e sem adição dos óleos

essenciais.

A introdução de cada bactéria foi realizada diretamente na carne, que foi

previamente esterilizada em recipiente de vidro estéril, desta carne esterilizada

retirou-se 10g e realizou-se a contagem para verificação da ausência de bactéria

e assim, utilizada como controle negativo. Logo após homogeneizou-se a

bactéria no alimento, onde realizou-se a contagem bacteriana, estabelecendo

assim o controle positivo, em seguida adicionou-se o volume do respectivo óleo

essencial correspondente aos valores de 1% e 10% p/v. Após adicionar e

misturar os óleos nas amostras estas foram mantidas em temperatura de 8ºC

por período três horas para realização da primeira contagem (BARBOSA et al.,

2009 com modificações).

Logo após, realizou-se a contagem bacteriana nos tempos de 0, 4, 6, 20 e 24

horas de armazenamento da carne à temperatura de 8ºC, visando verificar a

influência do tempo de contato entre os óleos essenciais e bactérias. Para a

contagem bacteriana utilizou-se diluições seriadas de cada amostra de alimento,

partiu-se da diluição inicial de 10g em 90mL de água peptonada tamponada

estéril obtendo-se a diluição 10-1 e a partir desta realizou-se diluições seriadas

até 10-6, em seguida o plaqueamento em profundidade em meio de cultura Plate

Count Agar (PCA) e incubou a 37oC/24 horas e após este período realizou-se a

contagem de colônias nas placas contendo entre 25 e 250 colônias, com o auxílio

de um contador de colônia. Para o resultado final, o número de colônias foi

multiplicado pelo fator inverso da diluição da respectiva placa de contagem e o

resultado expresso em UFC/g.


49

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Análise microbiológica

5.1.1. Coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli

A Tabela 2 apresenta os valores do número mais provável (NMP/g)

encontrados para coliformes totais e termotolerantes nas amostras das carnes.

Observou-se que em todas as amostras analisadas foram detectadas a presença

de coliformes totais com valor médio >1,1x103 NMP/g em 88,24%, 1,1x103 NMP/g

em 5,88% e 1,5x101 NMP/g em 5,88%. Quanto a presença de coliformes

termotolerantes o valor médio foi >1,1x103 NMP/g em 82,36%, 2,1x102 NMP/g em

5,88%, 1,1x103 NMP/g em 5,88% e 1,5x101 NMP/g em 5,88%. Das amostras

analisadas, 88,23% apresentaram-se fora dos limites máximos estabelecidos

pela ANVISA, através da Resolução RDC n°12 de 02/01/2001 que apresenta

limite de 5,0x103 a 104 NMP/g de coliformes a 45°C (BRASIL, 2001).

Quanto a presença de E.coli confirmou-se em 76,47% (13/17) amostras,

observando-se as características das colônias em ágar Mac Conkey (figura 1) e

identificação através da coloração de Gram, onde apresentaram-se em como

cocobacilos gram negativos (figura 2), e das provas bioquímicas de VM, VP, SIM,

GOF e citrato, onde obteve-se os resultados, positivo, negativo, H2S negativo,

indol positivo e motilidade positiva, fermentativo e negativo, respectivamente.

Sendo este o padrão bioquímico esperado para a espécie (FRANCO e

LANDGRAF, 2002).


50

Figura 1. Características das colônias típicas de E.coli em ágar Mac Conkey.

Fonte: SILVA, N.D.S, 2015.

Figura 2. Morfologia da Escherichia coli pelo método de coloração de Gram: cocobcilo gram negativo



51

A ocorrência em alimentos de coliformes totais a 35°C indica condições

higiênicas precárias e de coliformes termotolerantes a 45°C é considerada

indicadora de contaminação fecal e da possibilidade da presença de bactérias

patogênicas que tem seu habitat no trato intestinal. Segundo Lundgren et al.

(2009) em todas as amostras de carne bovina analisadas foram detectadas a

presença de coliformes totais com valor médio de 1,8x103 NMP/g e

termotolerantes, predominando o valor >2,4x103 NMP/g, equivalendo a 70% das

amostras analisadas.

Silva et al. (2006) mostraram que o grupo dos coliformes totais é utilizado

como indicador geral das condições higiênico sanitárias do ambiente de

processamento de alimentos e que a contagem de E. coli é utilizada como

indicador de contaminação fecal recente. Conclusões que confirmam os estudos

do presente trabalho, onde evidenciou-se que a presença de coliformes totais e

termotolerantes e E.coli pode estar diretamente ligada a manipulação e

conservação inadequadas das amostras de carne analisadas.

Nascimento et al. (2014) encontraram para coliformes a 45°C o valor de

≥1,5x103 NMP/g em 50% das amostras analisadas e ≥2,4x103 NMP/g em 37,5%

para coliformes a 35°C, sugerindo que tais resultados ocorrem em consequência

de as carnes terem sido armazenadas em condições higiênico-sanitárias

inadequadas, ou contaminadas devido às condições de higiene deficitárias dos

locais de abate, processamento, exposição e comercialização, bem como dos

manipuladores em geral.

Foi observado durante a coleta das amostras, principalmente em feiras livres,

que as carnes eram depositadas em barracas sem refrigeração, os

manipuladores não utilizam luvas para manusear, assim como, o local de

comercialização sem estrutura alguma para estabelecer as condições mínimas

de higiene. Assim como, diversos autores que falam da contaminação da carne

bovina e subprodutos nos estabelecimentos comerciais de varejo pode ser

observada de norte a sul do Brasil, onde observa-se que o processamento da

carne, sua moagem e a manipulação nos pontos de venda são feitos em

condições de higiene deficientes (BALBANI & BUTUGAN, 2001; MOURA et al.,

2007; SOARES, 2011; LIMA et al., 2013; NASCIMENTO et al., 2014).

Moura et al. (2007) observaram que 62,50% (15/24) das amostras

encontravam-se fora dos padrões, apresentando-se em condições sanitárias


52

insatisfatórias para o consumo humano, apresentando contagem acima dos

limites estabelecidos de 1,2x104 a 2,5x107 UFC/g para coliformes

termotolerantes, já os coliformes totais, em 79,16% (19/24) as contagens

variaram de 1,1x104 a 3,7x107, sendo insatisfatórias para o consumo.

A qualidade da carne in natura é reduzida significativamente, uma vez que

este é um alimento perecível, que no seu processamento até a chegada ao

consumidor, sofre elevada manipulação, mesmo com o uso de várias técnicas

de conservação (SOARES, 2011). Bezerra et al. (2010) encontraram entre as

carnes de hambúrguer avaliadas, onze (31,4%) fora dos padrões de higiene,

onde mostraram níveis de coliformes fecais acima dos permitidos pela legislação

em decorrência do manejo inadequado.

No presente trabalho notou-se que o manuseio inadequado e as práticas

higiênicas deficientes possivelmente levam à contaminação dos alimentos com

esses microrganismos, bem como, confirmam Tan et al. (2014) que verificaram

a prevalência de E. coli nas mãos de manipuladores de alimentos, que variou de

9,41-14,12% e identificaram alta prevalência deste microrganismo nos alimentos

após preparação, em decorrência da contaminação cruzada entre as mãos dos

manipuladores, constatando que, possivelmente, não mantêm uma higiene

pessoal adequada ao manusear os alimentos.

5.1.2. Salmonella spp.

Das amostras de carne analisadas, 13 (76,47%) apresentaram contaminação

por Salmonella spp. em 25g, sendo confirmada através de provas tintoriais e

bioquímicas, a partir de colônias características (figura 3) onde verificou-se que

através da coloração de Gram as bactérias analisadas apresentaram-se

morfologicamente como bacilos gram negativos (figura 4) e nas provas

bioquímicas de TSI, LIA, VM, VP, SIM e citrato confirmou-se a identificação da

Salmonella spp., padrão bioquímico esperado para a espécie (FRANCO e

LANDGRAF, 2002).

O padrão exigido pela legislação de acordo com a Resolução RDC n°12 de

02/01/2001 determina que o padrão microbiológico adotado no Brasil seja a

ausência de Salmonella spp. em 25g do alimento analisado (BRASIL, 2001). A

inconformidade verificada pela presença de Salmonella spp. na carne,


53

caracteriza-lhe como imprópria para o consumo, por não estar de acordo com o

que é preconizado, onde sua presença pode ocasionar infecções alimentares

severas.

Figura 3. Características das colônias de Salmonella spp. em ágar Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)


Figura 4. Morfologia da Salmonella spp. pelo método de coloração de Gram: Bacilo gram negativo.



54

A detecção desse microrganismo significa risco à saúde do consumidor,

consequência de um produto que não foi adequadamente conservado e

preparado, sendo fundamental que haja um canal de comunicação entre o

fomento e a indústria, através de medidas sanitárias e tecnológicas eficientes,

influenciando na redução da prevalência de Salmonella spp. no produto

(TESSARI et al., 2008).

Moura et al. (2007) observaram que em 7(29,1%) das amostras de carne

caprina analisadas estavam contaminadas por Salmonella spp., assim como,

Nascimento et al. (2014) que detectaram Salmonella spp. em 50% das amostras

de carne moída fresca obtidas em mercado, onde sua presença pode estar

associada a dejetos dos animais no ambiente dos matadouros ou contaminação

da água utilizada nos abatedouros ou nos locais de manipulação do produto.

No presente trabalho, onde foi observado durante a coleta, a manipulação e

armazenamento inadequado dos produtos cárneos, nota-se a importância de

uma higiene adequada no momento da manipulação. Assim como, Gunel et al.

(2015) identificaram Salmonella ssp. em hortaliças na Turquia e verificaram

percentuais em salsa, alface e pimentão de 3,2%, 1,6% e 0,4%,

respectivamente. E o sorotipo Anatum detectado na amostra de salsa

geralmente está associado à carne e produtos de aves, devido a uma

contaminação ocorrida com fezes de animais ou na comercialização,

consequente de uma manipulação inadequada.

Muluneh e Kibret (2015) analisaram os fatores de risco da presença de

Salmonella spp. em carcaças de bovinos em matadouro e verificaram alta

prevalência desta bactéria nas diversas partes da carcaça, possivelmente

associadas com as práticas higiênicas, as quais foram manipuladas por homens

sem o vestuário adequado, não possuíam o hábito de lavar as mãos após a

evisceração do intestino, uso de facas mal higienizadas, além do

estabelecimento não higienizado corretamente.

Park et al. (2015) compararam a qualidade microbiológica das cascas de

ovos de galinha obtidos a partir de um mercado tradicional e um supermercado

moderno, e observaram que a taxa de sobrevivência de S. enterica em ovos

aumentou significativamente com a presença de fezes, sendo que, lavar os ovos

com a água diminuiu os níveis microbiológicos, onde observa-se que as


55

condições higiênicas inadequadas, assim como, as características intrínsecas

do alimento são favoráveis ao desenvolvimento de bactérias.

Li et al. (2015) avaliaram se a presença de Salmonella spp. em nódulos

linfáticos atuavam como fontes de contaminação na produção de carnes moídas,

assim como, as intervenções antes da pré-colheita, como vacinação, se

interfeririam na diminuição da carga microbiana presente nesses nódulos e

consequentemente na carne moída produzida, onde observou-se que esses

cuidados com os animais antes do abate e um manejo realizado de forma

adequado interfere na qualidade do produto final.

Mas alguns estudos mostraram resultados contrários ao do presente estudo,

como os realizados por Lundgren et al. (2009) que não detectaram a presença

de Salmonella spp. em nenhuma das amostras de carne bovina comercializada

em feiras livres e mercados, assim como, Bezerra et al. (2010) que não

detectaram a presença de Salmonella spp. em nenhuma das amostras de

sanduíche analisadas.

5.1.3. Staphylococcus spp.

Todas as amostras de carnes analisadas apresentaram presença de

Staphylococcus spp., onde 12 (70,59%) estavam com contagem abaixo da

permitida, enquanto que 5 (29,41%) das amostras apresentaram-se com

contagem acima do limite máximo estabelecido pela Resolução RDC nº 12/2001,

da ANVISA, que é de 5,0×103 UFC/g (BRASIL, 2001), sendo tais valores

expressos na tabela 3. As colônias características foram identificadas através de

coloração de Gram, onde observou-se cocos gram positivos (figura 5) e testes

de catalase, DNAse e PAB (Purple Ágar Base).


56

Figura 5. Morfologia do Staphyloccocus spp. pelo método de coloração de Gram: coco gram positivo.


A alta incidência de Staphylococcus spp. em carnes comercializadas em feiras

livre é indicativo que esses produtos foram manipulados, e sendo possivelmente

de origem clandestina, sem fiscalização veterinária, não sendo possível

assegurar precisamente as condições higiênico sanitárias dessas carnes e dos

produtos derivados (TAN et al., 2014).

Existe um grande potencial para contaminação com Staphylococcus aureus

durante o processamento dos alimentos, porque os seres humanos são o

principal reservatório, pois este microrganismo está presente nas diversas partes

do corpo, entre elas as mãos e narinas, sendo estas o local primário de

colonização (WU e SU, 2014; BOER et al., 2009; NASCIMENTO et al., 2014,

RESTA & OLIVEIRA, 2013). Sendo de fundamental importância garantir a

segurança microbiológica dos alimentos, evitando a transmissão destes agentes

patogênicos para o consumidor (PESAVENTO et al., 2007).

A detecção destes microrganismos está ligada diretamente a forma de

manipulação deste alimento, onde observou-se que durante a coleta das

amostras de carne não ocorreu adequadamente. Foram manipulados sem o uso

de luvas, sem higiene adequada, favorecendo assim, a contaminação.


57

Nascimento et al. (2014) observaram em seu estudo os locais de

comercialização onde verificaram condições higiênicas insatisfatórias, longe da

considerada ideal para manter os alimentos em condições adequadas para o

consumo, principalmente quando trata-se do comércio em feira-livre, fatos estes

também evidenciados por Lundgren et al. (2009) que retrataram condições

mínimas de estrutura e higiene no ambiente de venda de carnes.

Soares (2011) mostra que o S. aureus é o microrganismo mais patogênico do

gênero e apresenta-se com alto grau de tolerância a compostos como telurito,

neomicina, polimixina, cloreto de mercúrio, usados como agentes seletivos em

meios de cultura e que no Brasil é considerado o segundo patógeno de maior

ocorrência em surtos de intoxicação alimentar, apresentando menor frequência

que a Salmonella spp.

É relatado que surtos de intoxicações ou gastrenterite estafilocócicas são

provocados devido falhas na conservação dos alimentos e contaminação

decorrente de manipulação incorreta, bem como, a manutenção da saúde dos

manipuladores, devendo ser adotado as medidas necessárias evitando assim a

multiplicação bacteriana e consequentemente intoxicações (SOARES, 2011;

BOER et al., 2009). Lundgren et al. (2009) detectaram em todas as amostras

analisadas a presença de Staphylococcus coagulase positiva, com contagem

média de 2,7x105 UFC/g, sendo sua presença confirmada pelo teste da

coagulase.

Os resultados obtidos por Tan et al. (2014) mostraram que a prevalência de

S. aureus em mãos de manipuladores de alimentos variou de 65,88 - 74,12%,

sendo maior que a da E. coli, evidenciando que a higiene pessoal dos

manipuladores não estava sendo suficiente. Bezerra et al. (2010) encontraram

entre as carnes de hambúrguer avaliadas, onze (31,4%) encontravam-se fora

dos padrões de higiene, com níveis de Staphylococcus spp. acima dos

permitidos pela legislação brasileira.

Lima et al. (2013) realizaram uma investigação epidemiológica da ocorrência

de S. aureus em alimentos responsáveis por intoxicações alimentares e

constataram que se devia ao armazenamento de mais de 2 horas dos alimentos

à temperatura ambiente, refrigeração inadequada, cozimento inadequado e

reaquecimento impróprio de produtos alimentares, bem como o uso de matéria-


58

prima sem inspeção, principalmente carnes e ovos, os quais podem ser fontes

de perigos microbiológicos para a saúde pública.

Sendo no presente trabalho, observado que principalmente no comércio de

feira-livre as carnes eram mantidas em barracas, expostas a insetos, sem

refrigeração, condições de armazenamento inadequado o que vai de encontro à

Resolução RDC n. 275/2002 do Ministério da Saúde que dispõe sobre o

regulamento técnico com relação às condições higiênico sanitárias e de boas

práticas de fabricação (BPF) para estabelecimentos de alimentos, bem como em

relação à Portaria nº 304/96, que estabelece critérios para introdução de

modificações nas atividades de distribuição e comercialização de carne bovina,

bubalina, suína e avícola, visando à saúde do consumidor.

Tabela 2: Qualidade microbiológica das amostras de carne bovina fresca oriundas de feiras-livre e estabelecimentos frigoríficos da cidade de Juazeiro-BA e Petrolina-PE.

Amostras CT NMP/g

CTs NMP/g

E. coli Contagem Staphylococcus spp. (UFC/g)

Salmonella spp.

A1 >1,1x103 >1,1x103 - 1,0.104

-

A2 >1,1x103 >1,1x103 - 6,0.102

-

A3 >1,1x103 >1,1x103 - 1,7.104

-

A4 >1,1x103 >1,1x103 - 2,0.103

+

A5 >1,1x103 2,1x102 + 2,0.103 +

A6 >1,1x103 >1,1x103 + 2,05.105

+

A7 >1,1x103 >1,1x103 + 2,0.102

+

A8 1,1x103 1,1x103 + 7,0.102

+

A9 >1,1x103 >1,1x103 + 1,7.104

+

A10 >1,1x103 >1,1x103 + 9,0.103

+

A11 >1,1x103 >1,1x103 + 2,0.103

+

A12 >1,1x103 >1,1x103 + 4,0.103

+

A13 1,5x101 1,5x101 + 1,0.101

+

A14 >1,1x103 >1,1x103 + 1,5.102

+

A15 >1,1x103 >1,1x103 + 7,0.102

+

A16 >1,1x103 >1,1x103 + 4,0.103

+

A17 >1,1x103 >1,1x103 + 3,0.103

-

Total: 17 amostras

*CT: Coliformes Totais; CTs: Coliformes Termotolerantes; NMP/g: Número Mais Provável; *UFC/g: Unidade Formadora de Colônia por grama


59

5.2. Efeito antimicrobiano dos óleos essenciais

5.2.1. Alecrim (Rosmarinus officinalis)

Os testes de atividade antimicrobiana in vitro pelo método de microdiluição

em caldo (gráfico 1) demonstraram que o óleo essencial de alecrim não

apresentou ação inibitória contra nenhum dos isolados de Escherichia coli e

ATCC 35218 (anexo 1), bem como Salmonella spp. e Salmonella enterica ATCC

10708 (anexo 2) quando comparados ao controle do diluente que apresentou

média de 3.125, µg/mL. Já para os isolados de Staphylococcus spp. e

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (anexo 3) observou-se atividade

antimicrobiana para 1 (5,55%) a partir da concentração de 390,62µg/mL, 3

(16,67%) a partir de 781,25µg/mL, 2 (11,11%) a partir de 1.041,67µg/mL, 7

(38,89%) a partir de 1.562,50µg/mL e 5 (27,78%) a partir de 3.125, µg/mL, com

média de 1.743,34µg/mL, apresentando atividade de fraca a moderada.

Gráfico 1. Número de isolados em valores absolutos de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de Alecrim (Rosmarinus officinalis)

Silva et al. (2009) demonstraram que os valores obtidos do óleo essencial

de alecrim para inibição do crescimento de E.coli ultrapassaram os 3% v/v, que

foi o maior valor utilizado naquele estudo, enquanto que o S. aureus apresentou

390,6 781,25 1.041,60 1.562,50 2.604 3.125 4.167 6.2500

5

10

15Escherichia coli

Staphylococcus spp.

Salmonella spp.

Concentração µg/mL

Nú

me

ro d

e i

so

lad

os


60

maior susceptibilidade, apresentando valores extremamente baixos, entre 0,3 e

0,6% v/v. Isto deve-se a possível diferença observada quanto a sensibilidade

bacteriana aos óleos em decorrência da existência de diferenças na estrutura da

parede bacteriana, pela presença de lipopolissacarídeo (LPS) nas bactérias

gram negativas e ausência nas gram positivas, que pode permitir ou não a

entrada de substâncias no interior da bactéria (BERTINI et al., 2005).

Esta característica da presença de LPS confere maior resistência as

bactérias gram negativas por evitar a difusão e acúmulo de óleo essencial na

célula bacteriana (PROBST, 2012), assim como ocorreu com os isolados do

presente estudo, onde observou-se a diferença de sensibilidade entre as

bactérias gram negativas e gram positivas, sendo as positivas mais sensíveis,

em decorrência dessa diferença estrutural da parede.

Na avaliação realizada por Probst et al. (2012) das possíveis diferenças no

perfil de sensibilidade de óleos essenciais sobre linhagens de Salmonella spp.

isoladas de alimentos e de infecções humanas, verificaram que não houve

diferenças significativas, para o R. officinalis que apresentou valores de

9,18mg/ml para Salmonella spp., 9,17mg/ml S. enteritidis isoladas de alimentos

e 9,19mg/ml para S. typhimurium provenientes de infecção. Dados estes que se

diferenciam do presente estudo, onde o mesmo óleo essencial não apresentou

atividade contra os isolados testados provenientes de alimentos. Fato que pode

estar ligado a concentração do óleo essencial, o método de avaliação da

atividade antimicrobiana, assim como, a proporção dos compostos químicos

presentes no óleo (JORDÁN et al., 2013a).

Enfatizando o quimiotipo do óleo de R. officinalis, Jordán et al. (2013b)

verificaram que a atividade antimicrobiana depende da ordem de abundância

dos componentes (eucaliptol, cânfora, a-pineno), notando que os quimiotipos

mostraram forte atividade contra os patógenos alimentares. A presença de

eucaliptol e α-pineno inibiram Salmonella typhimurium, já uma proporção

elevada de α-pineno aumenta a eficácia contra Staphylococcus aureus,

enquanto que a presença de eucaliptol como majoritário diminui

consideravelmente a eficiência, resultados que contradizem ao presente estudo,

pois na avaliação da atividade antimicrobiana, o óleo essencial não apresentou

atividade contra os isolados gram negativos, mesmo apresentando o α-pineno


61

como constituinte majoritário, ou até pela influência da técnica utilizada para

avaliação da sensibilidade (HAYOUNI et al., 2008)

Jordán et al. (2013b) avaliaram a composição química dos óleos essenciais

de R. officiinalis em dois estádios fenológicos e sua atividade antimicrobiana foi

testada pelo método de difusão em disco contra o patógeno E. coli, o qual não

apresentou atividade com zona de inibição <12 mm e contra S. typhimurium

apresentando atividade moderada com zona de inibição <12-20 mm. A E.coli

apresentou-se resistente ao alecrim, em decorrência da influência da

composição química do óleo, que pode variar com a época de colheita,

localização geográfica, método de extração (ZAOUALI et al., 2010). Estes

resultados confirmam os do presente estudo, onde o óleo também não

apresentou atividade antimicrobiana contra os isolados testados.

Na avaliação realizada por Ribeiro (2011) os valores de concentração

inibitória mínima do óleo essencial das folhas frescas de R. officinalis foram

capazes de inibir o desenvolvimento das cepas de E. coli na concentração de

200 μL/mL (20% v/v) e para as cepas de Salmonella spp. de 200 μL/mL (20%

v/v) e 400 μL/mL (40% v/v) e para cepa de Staphylococcus coagulase positiva

de 200 μL/mL (20% v/v).

OKOH et al. (2010) demonstraram que a atividade antibacteriana dos óleos

essenciais de R. officinalis apresentou-se ampla contra os microrganismos

testados, inibindo as bactérias gram positivas, como S. aureus e Bacillus subtilis

e as gram negativas, como E. coli e Klebsiella pneumoniae, com valores de

concentração inibitória mínima variando entre 0,23 mg/ml-1 e 7,5 mg/ml-1. Mas

ocorreu uma maior atividade sobre bactérias gram positivas do que em gram

negativas, assim como, o presente trabalho que evidenciou atividade contra os

isolados gram positivos.

Pesavento et al. (2015) através do teste de difusão em disco, não

conseguiram estabelecer quais foram as bactérias mais inibidas entre gram

negativas e gram-positivas, através da CIM100 e CIM90, mostrando mudanças

na carga bacteriana em função do tempo com as bactérias Listeria

monocytogenes e S. Enteritidis, patógenos importantes na segurança dos

alimentos, observando que R. officinalis foi o mais eficaz contra bactérias gram

negativas em concentrações mais baixas do que as bactérias gram positivas.


62

Packer e Luz (2007) verificaram pelo método de difusão em ágar que o óleo

essencial de alecrim apresentou atividade antimicrobiana contra S. aureus com

formação de halo <10mm e E. coli com halo variando de 10 a 60mm, resultados

contrários aos do presente estudo, onde não foi verificada atividade contra os

isolados de E. coli testados. Vários fatores influenciam no potencial

antimicrobiano dos óleos essenciais, como a época de colheita da planta, a

localização geográfica, o método de extração, a metodologia empregada para

avaliação, sendo este último um fator limitante na comparação com outros

resultados (PIRES & PICCOLI, 2012).

Hentz e Santin (2007) observaram baixa sensibilidade de Salmonella spp.

frente ao óleo essencial de R. officinalis verificando que não houve formação de

halo de inibição, exceto com o óleo essencial puro, quando comparado com a

ação do antibiótico sulfametoxazol. Celiktas et al. (2007) mostraram que o R.

officinalis apresentou atividade moderada contra os isolados de S. aureus ATCC

6.538 P e S. epidermidis ATCC 12228. Trajano et el. (2009) na avaliação da

atividade antimicrobiana do óleo de R. officinalis verificaram baixo espectro de

ação sobre os isolados testados.

Hayouni et al. (2008) avaliaram a atividade antimicrobiana de S. offcinalis e

S. molle pela presença ou ausência de zonas de inibição e os valores de CIM e

evidenciaram que essa atividade antimicrobiana dos óleos é difícil de

correlacionar com um composto específico, devido à sua complexidade e

variabilidade. Tanto no óleo de S. offcinalis quanto no de R. officinalis

apresentam-se com composição semelhante, mostrando que não é somente a

ação do constituinte majoritário, mas sim a interação entre os constituintes do

óleo essencial, principalmente pela presença de hidrocarbonetos oxigenados.

5.2.2. Cravo da índia (Syzygium aromaticum)

No presente estudo, na avaliação da atividade antimicrobiana in vitro do óleo

essencial de cravo da índia (Syzygium aromaticum) (gráfico 2) demonstraram

que houve ação inibitória sobre os 14 (100%) isolados de Escherichia coli e

ATCC 35218, os quais apresentaram-se com ação moderada. Onde observou-

se a atividade antibacteriana para 2 (14,29%) isolados ocorreu a partir da


63

concentração de 520,83 µg/mL e 12 (85,71%) a partir de 781,25µg/mL. Quanto

aos isolados de Salmonella spp. e Salmonella enterica ATCC 10708, o S.

aromaticum apresentou atividade sobre os 14 (100%) isolados, onde para 2

(14,28%) isolados ocorreu a partir da concentração de 651,04µg/mL e 12

(85,72%) a partir de 781,25µg/mL, apresentando uma ação moderada. Já para

os isolados de Staphylococcus spp. e Staphylococcus aureus ATCC 25923, os

18 (100%) isolados foram inibidos pela ação do óleo essencial, onde 4 (22,22%)

ocorreram a partir de 390,62µg/mL, 2 (11,11%) a partir de 325,52µg/mL, 1

(5,56%) a partir de 455,7 µg/mL, 2 (11,11%) a partir de 651,04µg/mL, 2 (11,11%)

a partir de 520,83µg/mL e 7 (38,89%) a partir de 781,25µg/m, apresentando

variação entre os isolados, com ação de elevada a moderada quando

comparados ao controle do diluente que apresentou média de 3.125, µg/mL.

Gráfico 2. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de cravo da índia (Syzygium aromaticum).

325,5 390,6 455,7 520,8 585,9 651,04 716,1 781,250

3

6

9

12

15Escherichia coli

Staphylococcus spp.

Salmonella spp.


Nú

me

ro d

e i

so

lad

os

Probst (2012) demostrou que o óleo essencial de cravo da índia

(Caryophyllus aromaticus) tem excelente potencial antibacteriano, tendo sua

eficácia associada ao composto majoritário eugenol e acetato de eugenila em

concentrações que variaram de 2,4 a 3,0 mg/ml, inibindo E. coli, Salmonella spp.,

S. enteritidis de alimentos, S. typhimurium provenientes de infecção e o S.

aureus. Espécie de cravo diferente do presente estudo, mas na composição o


64

mesmo constituinte majoritário, o eugenol, que vai exercer uma permeabilização

inespecífica na membrana citoplasmática aumentando o potássio e ATP para

fora das células, inibindo a atividade de enzimas essenciais (GAVILANES-

PARRA et al., 2012).

Mazzarrino et al. (2015) também evidenciam a atividade do cravo

(Caryophyllus aromaticus) diferente da espécie do estudo, mas apresenta em

sua composição o mesmo constituinte majoritário, o qual mostrou atividade

intermediária contra Salmonella spp. e uma ação mais forte sobre L.

monocytogenes, sendo a este constituinte atribuída tal atividade, assim como a

presença de compostos fenólicos. Scopel et al. (2014) avaliaram em quatro

condições diferentes de extração que o óleo essencial de S. aromaticum inibiu o

crescimento de E.coli na concentração de 1,0 mg/mL e de S.aureus na

concentração de 4,0, 6,0 e 10 mg/mL, variando de acordo com o método de

extração.

Fior Silvestri et al. (2010) observaram pelo método de difusão em placas e o

método indireto de crescimento bacteriano diferenças significativas entre os

halos de inibição das bactérias avaliadas e demonstraram que o óleo de cravo

da índia (Eugenia caryophyllata) teve maior atividade inibitória sobre as gram

positivas. Tal espécie é diferente do presente trabalho, porém o composto

majoritário é o mesmo, eugenol, logo, atribui-se esta atividade a tal composto,

por isso o óleo essencial de cravo apresentou atividade antimicrobiana sobre

todos os isolados testados.

Trajano et al. (2009) em uma avalição de 11 óleos essenciais de especiarias

quanto a atividade antimicrobiana, observou também que alguns óleos

essenciais têm um espectro de ação maior em relação a outro, a exemplo do

óleo de E. caryophyllata (cravo) que inibiu todas as bactérias testadas, com

formação de halos de inibição de até 30 mm de diâmetro.

Pereira et al. (2008) observaram que o óleo de cravo da índia apresentou os

melhores resultados de inibição do crescimento tanto para E. coli quanto para S.

aureus entre os óleos avaliados, porém não apresentou variação significativa

entre as concentrações 0,1, 0,5, 1 e 5%, que diferiram das concentrações de 10,

20, 30, 40 e 50%, ocorrendo formação do halo de inibição das bactérias E.coli

ATCC 8739 e S. aureus ATCC 8739 em todas as concentrações.


65

Beraldo et al. (2013) encontraram diferentes CIMs para o óleo essencial de

cravo da índia, que apresentou atividade contra S. aureus ATCC 14458,

Escherichia coli ATCC 11229 e Salmonella spp. ATCC 13314 que variaram de

0,04 a 0,06%. Constatando que esta atividade se deve ao composto majoritário

que tem como ação primária promover a ruptura da membrana plasmática,

aumentando a permeabilidade não especifica, que promove o extravasamento

de íons e proteínas intracelulares, inibindo o metabolismo celular, causando a

morte celular (SEPÚLVEDA, 2012; DEVI et al. 2010).

Rodríguez et al. (2014) mostraram que o óleo de cravo apresentou atividade

antimicrobiana contra Streptococcus mutans a partir de concentrações de 1000

até 125μg/ml com comportamento bactericida. E relataram que essa atividade

se deve ao composto majoritário eugenol, que de acordo com o tipo de extração

sua percentagem pode sofrer variação. Assim como, no presente estudo, o qual

apresentou uma atividade moderada, mesmo apresentando uma composição de

90-95% de eugenol.

5.2.3. Limão tahiti (Citrus latifolia)

Nos testes de atividade antimicrobiana in vitro demonstraram que o óleo

essencial de limão tahiti (Citrus latifolia) não apresentou ação inibitória contra

nenhum do isolados de isolados de Escherichia coli e ATCC 35218 (anexo 1),

Salmonella spp. e Salmonella enterica ATCC 10708 (anexo 2) e contra os

isolados de Staçhylococcus ssp. e Staphylococcus aureus ATCC 25924

apresentou ação moderada, com média de 1.208,04 µg/mL (anexo 3) quando

comparados ao controle do diluente que apresentou média de 3.125, µg/mL.,

sendo representado no gráfico 3 o número de isolados por concentração.


66

Gráfico 3. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de limão tahiti (Citrus latifolia).

195,3 390,6 651 781,251.171 1.302 1.562 2.343 2.604 3.125 4.167 5.208 6.2500

3

6

9

12Escherichia coli

Staphylococcus spp.

Salmonella spp.


Nú

me

ro d

e i

so

lad

os

No presente trabalho não pode ser evidenciado uma ação inibitória eficaz

contra os isolados de Salmonella spp. e E. coli, apenas para os isolados de

Staphyloccoccus spp e S. aureus ATCC 25923, onde essa ação pode sofrer

variação de acordo com o método e o isolado bacteriano utilizados, estudos

contrários aos realizados por Pires e Piccoli (2012) que demonstraram bons

resultados do óleo essencial de limão tahiti quanto à inibição do crescimento de

E. coli ATCC 8739, S. aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC

25853 na concentração de 160 μL/mL, mas nas concentrações de 10, 20, 40 e

80 μL/mL não apresentaram significativa variação na formação de halo, o qual

apresentou-se mais eficaz em inibir o crescimento de S. aureus.

Ao realizar uma investigação in vitro da atividade antimicrobiana precisa-se

de métodos que produzam resultados confiáveis e possam ser reproduzidos e

validados, contudo, encontra-se dificuldade pelas peculiaridades dos óleos

essenciais, como volatilidade, insolubilidade em água e complexidade,

características que interferem nos resultados. Por isso, nos testes de

susceptibilidade microbiana, leva-se em consideração a técnica usada, o meio

de cultura, o microrganismo e o óleo essencial testados (NASCIMENTO et al.,

2007).


67

A atividade dos óleos essenciais relaciona-se com a respectiva composição

majoritária, além da configuração estrutural dos componentes constitutivos e os

seus grupos funcionais, assim como, as possíveis interações sinérgicas entre os

componentes, os quais devem ser bastante estudados quando são relacionados

com a atividade antimicrobiana (DORMAN & DEANS, 2000).

No teste in vitro, o presente trabalho demostrou que o óleo essencial de limão

tahiti, com composição de 50-55 % de limoneno não apresentou atividade contra

os isolados testados, o qual pode sofrer variação de acordo com o tipo extração

e quantidade apresentada no óleo estudado. Mesmo alguns estudos

demostrarem alguns componentes eficazes, como os estudos de Chen et al.,

(2008) e Sandasi et al. (2008) que evidenciam cinco os compostos

antimicrobianos comuns, α-pineno, cineol, limoneno, linalol e acetato de geranil,

que têm sido eficazes contra alguns agentes patogênicos de origem alimentar e

resistente aos antibióticos, como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,

Escherichia coli e Campylobacter jejuni.

Hu et al. (2014) avaliando os efeitos da exposição do limoneno sobre o

crescimento de Microcystis aeruginosa e a libertação de substâncias tóxicas

microcistina intracelular verificaram que este monoterpeno a medida do tempo

reduziu o número de células. Microrganismo diferente dos analisados neste

trabalho, mas em comum a substância testada, o limoneno, o constituinte

majoritário do limão tahiti que não apresentou atividade significativa, devido a

diferença de diversos fatores, como o tipo de microrganismo, a substância por

ter sido testada pura, enquanto que no óleo além desta, outras estão presentes.

Bonaccorsi et al. (2012) avaliaram técnicas de identificação e caracterização

dos compostos dos óleos essenciais de limão. Tais dados são fundamentais para

melhorar a disponibilização de informação sobre esses óleos. E com essa

investigação verificaram que alterações químicas são provocadas pela

tecnologia de extração, assim como, a variação sazonal. Somando aos

resultados encontrados no presente estudo, onde o limão tahiti não demonstrou

atividade contra bactérias gram negativas, que pode ser em decorrência da

concentração do composto químico majoritário, devido a técnica empregada,

como a estrutura bacteriana, pois o mesmo apresentou atividade contra alguns

isolado gram positivos.


68

Fisher e Phillips (2008) em sua revisão sobre a utilização de óleos essenciais

com potenciais antimicrobianos em alimentos, notaram que a composição e

mistura de componentes em proporções específicas determina o sabor e

também os possíveis efeitos antimicrobianos dos óleos cítricos, e através de

microscopia eletrônica demonstraram que na presença de óleos cítricos

espécies de Enterococcus sofreram alterações morfológicas, sendo tais

mecanismos de ação não totalmente elucidados, os quais podem ocorrer de

diversas formas, conforme a substância, microrganismo, entre outros fatores.

A intensidade dos óleos diminuir ao longo do tempo devido ao a maioria dos

componentes voláteis, como linalol e limoneno, evaporando primeiro, e os

componentes ativos podem ser perdidos, mudando a atividade antimicrobiana,

diminuindo ao longo do tempo (FISHER e PHILLIPS, 2008).

5.2.4. Manjericão (Ocimum basilicum)

Nos testes de atividade antimicrobiana in vitro demonstraram que houve ação

inibitória do óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum) sobre os 14

(100%) isolados de Escherichia coli e ATCC 35218, com atividade para 13

(92,86%) a partir de 781,25µg/mL e 1 (7,14%) de 1.562,50µg/mL, apresentando-

se com ação moderada (anexo 1 e gráfico 1). Quanto a atividade antimicrobiana

do óleo essencial para os isolados de Salmonella spp. e S. enterica ATCC 10708

observou-se para 12 (85,72%) a partir de 781,25 µg/mL, 1 (7,14%) a partir de

1.041,67µg/mL e 1 (7,14%) a partir de 1.302,08µg/mL, com ação de elevada a

moderada (gráfico 2). Para os isolados de Staphylococcus spp. o O. basilicum

apresentou atividade para 1 (5,55%) a partir de 390,62 µg/mL, 1 (5,55%) a partir

de 455,73 µg/mL, 1(5,55%) a partir de 651,04µg/mL, 7 (38,89%) a partir de

781,25µg/mL, 4 (22,22%) de 1.041,67µg/mL, 3 (16,67%) de 1.562,50µg/mL e 1

(5,55%) a partir de 2.343,75 µg/mL, os quais apresentaram-se com ação

elevada, moderada e fraca (gráfico 3) quando comparados ao controle do

diluente que apresentou média de 3.125, µg/mL.


69

Gráfico 4. Número de isolados de Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp. por Concentração Bactericida Mínima (CBM) de óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum).

390,6 455,7 651 781,25 1.041,6 1.302 1.562,5 2.343,7 3.1250

5

10

15 Escherichia coli

Staphylococcus spp.

Salmonella spp.


Nú

me

ro d

e i

so

lad

os

Alves (2010) verificou que a partir de um gradiente de concentrações do óleo

essencial de O. basilicum realizado por diluições seriadas, o efeito inibitório

sobre E.coli, Salmonella spp. e S. aureus foi de concentrações iguais ou

superiores de 3,13%, onde notou-se que à medida que se aumentou a

concentração ocorreu também o aumento do halo de inibição, mas observou0se

que os halos formados para o S.aureus quando comparados com o tamanho do

halo das demais bactérias foram maiores nas mesmas concentrações.

Evidenciando a sensibilidade maior de bactérias gram positivas.

Em estudo realizado por Hussain et al. (2008) mostraram que o óleo

essencial de O. basilicum apresentou forte atividade antimicrobiana contra todos

os microrganismos testados, através do método de difusão em disco, seguido da

concentração inibitória mínima (CIM) indicaram que o S. aureus foi um dos

microrganismos mais sensíveis mostrando maiores zonas de inibição entre 22,2

-24,4 mm e CIM de 0,9 mg/mL.

Trajano et al. (2009) na avaliação da atividade antimicrobiana do óleo de O.

basilicum verificaram baixo espectro de ação, o qual apresentou atividade

apenas sobre o isolado de E.coli com halo de inibição de 13 mm, assim como no

presente trabalho, o qual também apresentou atividade contra os isolados de

E.coli. Nedorostova et al. (2009) em seus testes verificaram que o O. basilicum

apresentou atividade antimicrobiana contra S.aureus em uma concentração de


70

CIM de 0.53 µl/cm3 na fase de vapor, mostrando que dependendo do método de

extração essa atividade pode também ser diferenciada.

Freire et al. (2014) em seus estudos demonstram que os produtos naturais

avaliados apresentaram propriedades biológicas ativas frente a inibição S.

mutans e S. aureus. Mas o óleo essencial de manjericão apresentou os valores

de atividade mais alto, indicando uma ação menor em relação aos outros,

avalição contrária ao presente estudo, onde o mesmo óleo essencial apresentou

atividade satisfatória sobre os isolados testados. Sendo que, tal atividade pode

sofrer variação de acordo com o método utilizado, os isolados testados, até

mesmo o método e época de extração do óleo essencial.

No presente trabalho os isolados oriundos de carne foram sensíveis ao óleo

essencial de manjericão, sendo tais resultados semelhantes, apesar dos

alimentos serem diferentes, a Martins et al. (2010) que demonstraram que os

sorogrupos de E. coli EPEC testados apresentaram sensibilidade frente à ação

do óleo essencial do manjericão, com halos de inibição variando entre 11,2mm

e 11,6mm e de 11,0mm a 12,0mm para os isolados das alfaces orgânicas e

hidropônicas.

5.3. Ensaio da ação antimicrobiana dos óleos essenciais sobre

bactérias patogênicas em matriz alimentar de carne moída

De acordo com os resultados apresentados na tabela 3 e nos gráficos 5, 6 e

7, os óleos essenciais de cravo e manjericão adicionados à carne na

concentração de 1% p/v, partindo da concentração inibitória mínima encontrada

nos testes in vitro com média de 723,37 μg/mL e 928,8 μg/mL para os isolados

de Escherichia coli, para os isolados de Staphylococccus spp. foi de 582,3 μg/mL

e 1.009 μg/mL e para os isolados de Salmonella spp. foi de 762,6 μg/mL e 837

μg/mL, dos óleos de cravo da índia e manjericão para os isolados,

respectivamente, não proporcionou uma redução da população bacteriana à

medida que aumentou o tempo de contato do óleo essencial com o

microrganismo na matriz alimentar de carne. Já na concentração de 10% p/v o

óleo essencial de cravo da índia em todos os tempos causou a morte microbiana


71

de todos os isolados testados, enquanto que o manjericão não apresentou

atividade apenas frente a ATCC de S. aureus 25923.

Tabela 3. Médias das contagens de Escherichia coli ATCC 35218, Salmonella enterica ATCC 10718 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 na carne da amostra controle e nos tratamentos com os óleos essenciais de cravo da índia e manjericão a 1% e 10%p/v.

E. coli ATCC 35218

S.enterica ATCC 10718

S aureus ATCC 25923

CI 1% CI 10% CI 1% CI 10% CI 1% CI 10%

0h 6,8x105 4,2x104 1,54x106 1,14x105 1,52x106 9,0x105 4h 2,7x105 0 5,5 x105 0 1,28x106 0 6h 2,9 x105 0 3,1 x105 0 1,88x106 0 20h 2,5 x105 0 4,6 x105 0 9,7x105 0 24h 2,0 x105 0 3,5 x105 0 1,30x106 0

MA 1% MA 10% MA 1% MA 10% MA 1% MA 10%

0h 6,8x105 1,02x108 1,54x106 1,07x106 1,52x106 5,9x106 4h 8,2x105 0 1,02 x106 0 1,2x106 5,0x104 6h 5,6x105 0 8,2 x105 0 9,1x105 1,4x105 20h 3,0x105 0 7,6x105 0 8,8 x105 3,0x104 24h 3,2x105 0 6,1 x105 0 8,5 x105 2,0x104

*MA: Manjericão / *CI: Cravo da índia

Gráfico 5. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Escherichia coli ATCC 35218 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g).


0 4 8 12 16 20 240.1

0.3

1

3.2

10CI 1%

CI 10%

MA 1%

MA 10%

Tempo (h)

Un

ida

de

s f

orm

ad

ora

s d

e c

olô

nia

(UF

C/g

x 1

05)


72

Gráfico 6. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Salmonella enterica ATCC 10708 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g).

0 4 8 12 16 20 240.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0 CI 1%

CI 10%

MA 1%

MA 10%

Tempo (h)

Un

ida

de

s f

orm

ad

ora

s d

e c

olô

nia

(UF

C/g

x 1

05)


Gráfico 7. Avaliação do tempo de contato do óleo essencial de cravo da índia e manjericão a 1% e 10% em carne contaminada artificialmente com Staphylococcus aureus ATCC 25923 na diminuição das Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g).

0 4 8 12 16 20 240

10

20

30

40

50

60CI 1%

CI 10%

MA 1%

MA 10%

Tempo (h)

Un

ida

de

s f

orm

ad

ora

s d

e c

olô

nia

(UF

C/g

x 1

05)



73

Na análise in vitro notou-se inviável realizar os testes com o óleo essencial de

R. officinalis e Citrus latifolia na carne, os quais não apresentaram atividade

antimicrobiana, apenas contra alguns isolados de Staphylococcus spp. logo,

também não apresentariam atividade quando em contato com a matriz alimentar

de carne, Já Ribeiro (2011) que analisou ao longo de 168 horas (sete dias) o

óleo essencial R. officinalis em queijo contaminado por E.coli observou que

houve uma redução de 2,3 ciclos logarítmicos na amostra nas primeiras 24h de

armazenamento e esta redução manteve-se, praticamente, estável.

A atividade antimicrobiana não é afetada apenas pelas propriedades

intrínsecas dos alimentos (proteína, teor de gordura, água, antioxidantes,

conservantes, pH, sais e outros aditivos), mas as características extrínsecas

(Temperatura, a embalagem a vácuo, gás, ar e as características do

microrganismo) também pode influenciar (HAYOUNI et al., 2008).

Mendonça (2004) na avaliação realizada do efeito do óleo essencial de cravo

da índia sobre o S. aureus ATCC 25923 testado em diversas concentrações até

a concentração de 50% nos testes in vitro apresentou excelente propriedade

antimicrobiana, mas na matriz alimentar a concentração utilizada foi de 1%, em

decorrência da influência do flavor, o qual ficaria muito evidente quando

adicionado na ricota cremosa, matriz alimentar diferente da do estudo, mas que

evidencia a importância da avaliação da interferência do flavor do óleo essencial

a ser adicionado, associando com sua atividade antimicrobiana.

Já quanto a avaliação do manjericão na concentração de 1% foi observada

baixa atividade, sendo necessário, um aumento da concentração para 10%,

valor elevado devido a aromatização do alimento, e nessa concentração o óleo

foi capaz de diminuir a carga microbiana totalmente, exceto para o S. aureus

ATCC 25923, mas outou-se uma diminuição da carga microbiana à níveis em

que a população bacteriana não seja capaz de produzir toxinas, sendo na

literatura identificadas 14 tipos de enterotoxinas estafilocócicas (SE): SEA, SEB,

SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SEJ (CARMO et al., 2002),

SEK (ORWIN et al.,2001), SEL e SEM (JARRAUD et al., 2001), das quais

algumas dessas podem ser produzidas em alimentos em contagens superior a

106 UFC/g (RIBEIRO, 2011).

O presente trabalho mostrou que os óleos essenciais na concentração de 1%

p/v não foram capazes de reduzir a carga microbiana na matriz alimentar de


74

carne, já Almeida et al. (2013) que também avaliaram o potencial antimicrobiano

dos óleos essenciais de alfavacão (Ocimum gratissimum L.) e de cravo-da-índia

(S. aromaticum) em carne moída de ovinos contaminadas experimentalmente

com S. aureus ATCC 25923 observaram que com o aumento do tempo de

contato do óleo na matriz de carne, os óleos diminuíram a carga microbiana

presente, sendo o cravo da índia o que apresentou o maior efeito.

Os resultados do presente trabalho mostraram que concentração de 1% o

óleo essencial de cravo não apresentou diminuição da carga microbiana, apesar

da boa atividade antimicrobiana in vitro, mas na concentração de 10% ocorreu

diminuição total da carga microbiana presente na carne moída em todos os

tempos. Resultados evidenciados por Bergdoll (1990) mostrou que na atividade

contra S. aureus ocorreu uma redução em torno de 0,5 ciclo logarítmico no

número de células viáveis, essa menor redução do número de células deve-se à

maior resistência dessa bactéria a fatores como o sal, a baixa atividade de água

(aW), mas sem diferença significativa no número de UFC/g nos embutidos do

tratamento com adição de 0,2% de cravo e sem adição de cravo, em nenhum

dos tempos de amostragem.

Magnani (2001) constatou que tanto nos salames tipo italiano fabricados com

a adição de 0,2% de cravo e nos salames sem cravo, houve um decréscimo no

número de células viáveis de Salmonella spp. de 1 a 2 ciclos logarítmicos durante

o período de fermentação, em função do declínio de pH e da associação de

outros fatores do embutido. E depois de 20 dias de processamento do salame

tipo italiano adicionado de 0,2% de cravo não foi possível detectar a presença

de Salmonella spp., apenas no tratamento controle, sem a adição de cravo.

Sepúlveda (2012) avaliou a atividade antimicrobiana do óleo essencial de S.

aromaticum adicionado em amostras de leite achocolatado, onde verificou uma

boa resposta à inibição do crescimento de Rhodotorula mucilaginosa durante o

armazenamento ao longo do tempo, tornando-se uma alternativa na indústria

alimentar por sua inibição eficaz do crescimento desta levedura, mas não

mostrou nenhum efeito significativo, em percentagem de inibição, sugerindo que

doses baixas seria o mais apropriado para utilização neste tipo de produto, em

decorrência das características do óleo essencial, forte flavor.

As fontes naturais são alternativas de compostos antimicrobianos eficazes e

seguros, mas são áreas estratégicas para investigações tanto na indústria de


75

alimentos quanto na área da medicina. Há um interesse crescente na busca do

conhecimento da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais e seus

mecanismos de ação, a cinética de inativação ou sobrevivência, o crescimento

de bactérias expostas a estes produtos (MAZZARRINO et al., 2015).

Observou-se que são necessárias concentrações mais elevadas dos óleos

essenciais utilizados nas amostras de carne, e também ao comparar com os

ensaios in vitro, para obtenção de atividade antimicrobiana satisfatória,

semelhante aos estudos relatados por Burt (2004) e Tajkarimi et al. (2010), que

deve ser levado em consideração, principalmente, o aroma e sabor do alimento

após a adição do óleo essencial. Este é o grande desafio do uso de conservantes

naturais em alimentos, pois, busca-se produtos que agridam menos, que

apresentem propriedade antimicrobiana em baixas concentrações e não

exerçam efeitos sobre as propriedades organolépticas e na composição.

Apesar, dos pontos positivos em relação ao uso de plantas com potencial

antimicrobiano natural, essas questões são confrontadas quanto a esta

aplicação de antimicrobianos de origem vegetal em matrizes alimentares, além

dos custos destes materiais, mas são alternativas saudáveis e funcionais

(PROESTOS et al, 2008; SILVA et al., 2007).

Grosso et al. (2008) registraram baixos efeitos antimicrobianos de extratos

de plantas em produtos de carne contaminados, resultado semelhante ao

presente trabalho, onde evidenciou-se que na matriz alimentar de carne não

houve diminuição significativa da carga microbiana com a adição dos óleos

essenciais na concentração de 1%, porém, na concentração de 10% foi

verificada redução total da carga microbiana de todos os isolados,

principalmente do óleo essencial de manjericão.

Alguns autores relatam que essa ausência de atividade deve ao fato de os

produtos cárneos apresentarem em sua composição gordura, que pode interferir

nos efeitos da aplicação do óleo essencial (BURT, 2004; LIS-BALCHIN et al.,

2003). Lis-Balchin et al. (2003) usando uma combinação de 1% de óleo

essencial de cravo e orégano em caldo de cultura mostraram efeito inibidor

contra a Listeria monocytogenes, no entanto, na mesma concentração não se

mostrou eficaz ao ser introduzido na pasta de carne.

As atividades antimicrobianas têm sido atribuídas à presença de alguns

constituintes nos óleos essenciais, que são os componentes majoritários, sendo


76

grande a variedade de compostos que possuem essa ação, onde se destacam

os monoterpenos fenólicos (carvacrol, timol, eugenol) ou hidrocarbonetos

monoterpênicos (p-cimeno, c-terpineno, a-pineno ou limoneno), álcoois, tais

como terpenóides (borneol, linalol, 1,8-cineol ou geraniol), aldeídos

(cinamaldeído, geranial ou citronnellal) e cetonas (piperitona ou carvona)

(GYAWALI & IBRAHIM, 2014; OUSSALAH et al.2006).

Estes metabólitos secundários possuem vários benefícios, entre eles

propriedades antimicrobianas contra microrganismos patogênicos e

deterioradores. A diversidade estrutural de compostos oriundos de plantas é

imensa, e, o impacto da ação antimicrobiana que produzem contra

microrganismos depende da sua configuração estrutural. É o grupo hidroxilo nos

compostos fenólicos, o responsável pela ação inibitória (LAI & ROY, 2004), os

quais podem interagir com a membrana celular da bactéria, rompe as estruturas

da membrana e ocorre a perda dos constituintes da célula (GYAWALI &

IBRAHIM, 2014).

Os óleos que contêm componentes com estrutura fenólica apresentam alto

potencial antimicrobiano, sendo conhecidos por serem agentes bactericidas ou

bacteriostáticos dependendo da concentração utilizada (OUSSALAH et al.,

2006). Assim como foi observado nos testes na matriz alimentar de carne do

presente estudo, que a atividade do óleo essencial na concentração de 1% p/v

não foi suficiente para diminuir a carga microbiana presente, sendo

consequência da interação com as características do próprio alimento, como, a

porcentagem de gordura.

Os processadores de alimentos e consumidores manifestam o desejo de

reduzir o uso de produtos químicos sintéticos na conservação de alimentos.

Havendo um interesse considerável em extratos e óleos essenciais de ervas

culinárias, especiarias e plantas aromáticas, e que apresentam uma atividade

antimicrobiana notável, diminuindo ou inibindo o desenvolvimento de

microrganismos patogênicos e/ou produtores de toxinas em alimentos

(HAYOUNI et al., 2008).

SILVA, N. D. S. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de ervas e especiarias sobre patógenos de carnes comercializadas em feiras-livres e frigorífico de Juazeiro-BA e Petrolina-PE.

78

6. CONCLUSÕES

Quanto à qualidade microbiológica os resultados mostram que os alimentos

se encontram com irregularidades nas condições higiênico sanitário que implica

em condições insatisfatórias de exposição, manipulação e comercialização do

produto, evidenciado pela detecção de Salmonella spp., Staphylococcus spp. e

Escherichia coli. Isto reflete o problema de saúde pública que a contaminação

dos alimentos significa para o Brasil e todo o mundo.

Já na avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais in vitro, os

óleos de cravo da índia e manjericão foram os que apresentaram os melhores

resultados contra os isolados Salmonella spp., Staphylococcus spp. e

Escherichia coli, enquanto que o de alecrim e limão tahiti apresentaram atividade

apenas para os isolados de Staphylococcus spp.

Nos resultados obtidos na avaliação dos óleos de S. aromaticum (cravo da

índia) e O. basilicum (manjericão) na concentração de 1% p/v na carne, onde foi

observado que a carga microbiana não diminuiu a medida do aumento de tempo

de contato com os óleos. Mas na concentração de 10% p/v ocorreu a morte

bacteriana durante todo o armazenamento, exceto para o óleo de manjericão

contra os isolados de S.aureus, onde ocorreu apenas a diminuição da contagem

bacteriana.

Nota-se que a utilização de óleos essenciais como inibidores de crescimento

bacteriano é uma boa opção para a substituição de aditivos químicos em

alimentos, principalmente dos que apresentaram boa atividade antimicrobiana.

Porém, são necessários estudos quanto à análise sensorial e aceitação do

produto acrescido do óleo essencial, pois, torna-se inviável eliminar os agentes

contaminantes do alimento, mas alterar sabor, aroma e as propriedades

nutritivas.


80

7. REFERÊNCIAS

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Anexos:

Anexo 1. Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais sobre

Escherichia coli ATCC 35218 e os isolados obtidos das amostras de carne.

Óleos essenciais (µg/mL)

Cravo da índia Alecrim Limão tahiti Manjericão

E. coli ATCC 35218 781,25 4.167 6.250 781,25

A5 1 520,83 3.125 3.125 781,25

A6 2 781,25 3.125 3.125 781,25

A7 3 781,25 3.125 3.125 781,25

A8 3 781,25 3.125 4.167 781,25

A9 1 781,25 3.125 6.250 781,25

A10 4 520,83 3.125 4.167 781,25

A11 4 781,25 3.125 3.125 781,25

A12 1 781,25 3.125 3.125 781,25

A13 1 781,25 3.125 3.125 1.562,5

A14 1 781,25 3.125 4.167 781,25

A15 4 781,25 3.125 3.125 781,25

A16 1 781,25 3.125 3.125 781,25

A17 1 781,25 3.125 3.125 781,25

Total: 14 Isolados 744,04

3.199

3.795

837,05


96

Anexo 2. Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais sobre Salmonella enterica ATCC 10708 e os isolados obtidos das amostras de carne.



S. enterica ATCC 10708

781,25 3.125 3.125 781,25

A4 1 781,25 3.125 3.125 781,25

A5 1 781,25 3.125 3.125 781,25

A6 2 781,25 2.604 2.604 781,25

A7 3 781,25 3.125 3.125 781,25

A8 4 781,25 3.125 3.125 781,25

A9 1 651,04 3.125 3.125 781,25

A10 2 781,25 3.125 3.125 781,25

A11 1 781,25 3.125 6.250 781,25

A12 2 781,25 3.125 3.125 781,25

A13 2 781,25 3.125 5.208 1.302,08

A14 7 651,04 3.125 3.125 1.041,66

A15 5 781,25 1.563 1.302 781,25

A16 6 781,25 1.563 3.125 781,25

Total: 14 isolados 762,65

2.865

3.330

837,08


97

Anexo 3. Média da concentração (µg/mL) inibitória mínima dos óleos essenciais sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 e os isolados obtidos das amostras de carne.



S. aureus ATCC 25923 520,83 1.562,50 1.562,50 1.562,50

A1 1 781,25 1.562,50 781,25 781,25

A2 1 390,62 1.041,67 1.171,87 1.041,67

A3 8 651,04 1.562,50 1.302,08 781,25

A4 5 781,25 3.125,00 1.302,08 1.562,50

A5 1 455,73 781,25 781,25 455,73

A6 4 520,83 1.562,50 2.604,17 781,25

A7 1 781,25 3.125,00 3.125,00 1.562,50

A8 1 325,52 781,25 651,04 390,62

A9 1 781,25 781,25 781,25 651,04

A10 1 390,62 1.562,50 390,62 1.041,67

A11 2 781,25 3.125,00 2.343,75 2.343,75

A12 1 390,62 1.562,50 781,25 1.041,67

A13 1 781,25 3.125,00 2.343,75 781,25

A14 1 390,62 3.125,00 651,04 781,25

A15 1 325,52 1.041,67 195,31 781,25

A16 1 781,25 1.562,50 781,25 1.041,67

A17 1 651,04 390,62 195,31 781,25

Total: 18 isolados 582,32 1.743,34

1.208,04

1.099,11

atividade antimicrobiana de óleos essenciais de ervas e especiarias

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