aproveitamento do hidrolisado hemicelulÓsico de...

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

APROVEITAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE EUCALIPTO PARA PRODUÇÃO DE XILITOL UTILIZANDO

PROJETO DE EXPERIMENTOS.

Eliana Vieira Canettieri Orientador: Dr. João Batista de Almeida e Silva

Proc.zi? 202:,;4

Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca

Universitária em .hrnho/2004

Lorena - SP - Brasil 1998

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Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial

APROVEITAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE EUCALIPTO PARA PRODUÇÃO DE XILITOL UTILIZANDO PROJETO DE

EXPERIMENTOS.

Dissertação apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial.

Banca examinadora Dr. João Batista de Almeida e Silva Dr. Urgel de Almeida Lima Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe

Estudante Eliana Vieira Canettieri

Lorena - SP - Brasil 1998


Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial

APROVEITAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE EUCALIPTO PARA PRODUÇÃO DE XILITOL UTILIZANDO PROJETO DE

EXPERIMENTOS.

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora.

Dr. João Batista de Almeida e Silva Orientador e Presidente da Banca Examinadora

Lorena - SP - Brasil 1998 ·

Dedico este trabalho,

Aos meus pais, José e Irene;

Ao meu companheiro de vida, Celso;

À minha filha, Rafaela.

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Dr. João Batista de Almeida e Silva, pela orientação e confiança

depositada.

À Professora Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe, pelos ensinamentos, sugestões e "ombro amigo" nos momentos difíceis.

Aos Professores e Pesquisadores do DEBIQ - FAENQUIL, em especial, Sílvio Silvério, Arnaldo Márcio, Ismael, Inês Roberto, pelos ensinamentos e amizade.

As funcionários do DEBIQ - FAENQUIL, Valquíria, lrani, lsnaldi, Elaine, Ludmila, Cristina, Fernando, Renato, Márcia enfim todos que de alguma maneira colaboraram para a realização deste trabalho.

Ao meu querido amigo Paulinho, pela "força" nos momentos de "carga pesada".

Ao querido "companheiro" Ernesto Acosta pelo companheirismo.

Aos amigos queridos, Sílgia, Luciana, Ely, Tihany, Andrea, Lourdes, Francislene, Robertinho, Rita, às cubanas, Pilar e Irene, enfim a todos os amigos do DEBIQ, pelo carinho e ambiente saudável proporcionado.

Ao DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA - FAENQUIL pela oportunidade da realização do Mestradô.

À FAPESP, pela bolsa de Mestrado concedida.

BIOGRAFIA

Eliana Vieira Canettieri, filha de José Vieira e Irene de Jesus Vieira,

nasceu em Lorena, Estado de São Paulo, em 01 de junho de 1962.

Graduou-se em Engenharia Química pela Universidade Federal de

Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, em dezembro de 1988.

No primeiro semestre de 1989 lecionou na Universidade do Sul de

Santa Catarina, em Tubarão, Santa Catarina. De novembro de 1989 a

novembro de 1995 trabalhou na Indústria Química BASF S.A., Guaratinguetá,

São Paulo.

Em fevereiro de 1996 ingressou no Curso de Mestrado em Biotecnologia

Industrial, do Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia

Química de Lorena.

RESUMO

Aproveitamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para a produção de xilitol utilizando projeto de experimentos. Eliana Vieira Canettieri. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. João Batista de Almeida e Silva (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. Urgel de Almeida Lima e Ora. Maria das Graças de Almeida Felipe. Setembro de 1998.

Neste trabalho foi avaliada a bioconversão xilose-xilitol por Candída guil/iermondií FTI 20037 a partir do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido por hidrólise ácida. Os parâmetros avaliados foram a concentração dos nutrientes sulfato de amônia, cloreto de cálcio e farelo de arroz, o pH, a concentração de xilose no hidrolisado e o tempo de fermentação. Para isso empregou-se a metodologia de superfície de resposta, do Programa STATGRAPHICS versão 6,0, propondo um modelo que melhor representasse o processo. Foi constatado a influência da concentração do sulfato de amônia, do farelo de arroz, do pH e da concentração do hidrolisado. Os melhores resultados foram obtidos após 72h utilizando-se 1, 1 g/L de sulfato de amônia, 5,0 g/L de farelo de arroz, 60 g/L de concentração de xilose no hidrolisado na fermentação conduzidas com pH 8,0 e concentração de células inicial de 3 g/L. Nestas condições obteve-se 1 O g/L resultando em um fator de rendimento de 0,21 g/g e uma produtividade de 0,09 g/L.h. Nestas mesmas condições propostas pelo modelo, exceto a concentração de células do inóculo que foi 1,5 g/L, foi realizado um experimento em fermentador de bancada obtendo-se 25,4 g/L de xilitol, com um fator de rendimento de 0,36 g/g e uma produtividade de 0,35 g/L.h.

ABSTRACT

Use of eucalyptus hemicellulosic hydrolysate for xylitol production utilizing experimental design. Eliana Vieira Canettieri. Departament of Biotechnology - FAENQUIL - BOX 116, Lorena, SP, Brazil. Adviser: João Batista de Almeida e Silva. Committee members: Urgel de Almeida Lima e Maria das Graças Felipe. September, 1998.

This work deals with bioconversion of xylose into xylitol by Candida guilliermondii FTI 20037 using eucalyptus hemicellulosic hydrolysate obtained by acid hydrolysis. The parameters evaluated were ammonium sulfate, calcium chloride, rice bran, pH, xylose concentration in the hydrolysate and fermentation time. For this purpose the response surface methodology of the STATGRAPHICS Program, version 6.0, was used to propose a model to better represent the process. lt was found that ammonium sulfate, rice bran, pH and hydrolysate concentration exerted influence. The best results were given by 1.1 g/L ammonium sulfate, 5 g/L rice bran, 60 g/L xylose concentration in the hydrolysate at pH 8.0 with 3 g/L inoculum content and 72 h of fermentation time. Under these conditions 1 O g/L of xylitol production was attained, resulting in a yield factor of 0.21 g/g and a productivity of 0.09 g/Lh. Also under these conditions, proposed by the model, an with 1.5 g/L inoculum and the results obtained were 25.4 g/L xylltol with a yield factor of 0.36 g/g and a productivity of 0.35 g/Lh.

CONTEÚDO

1.INTRODUÇÃ0 01

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 03

2.1. Materiais Lignocelulósicos e a Madeira de Eucalipto 03

2.2. Xilitol. 07

2.2.1. Propriedades 07

2.2.2. Produção industrial de xilitol - via química 1 O

2.2.3. Produção Alternativa de xilitol - via microbiológica. 14

2.2.3.1. Fatores que influenciam a bioconversão xilose-xilitol... 15

2.2.3.2. Toxicidade dos hidrolisados hemicelulósicos dos materiais

lignocelulósicos e suas influências na bioconversão xilose-

xilitol. 21

3. MATERIAIS E MÉTODOS 25

3. 1. Obtenção e preparo do hidrolisado hemicelulósico 25

3.1.1. Hidrólise ácida. 25

3.1.2. Concentração 26

3.1.3. Tratamento 27

3.2. Microrganismo e preparo do inóculo 27

3.3. Meio e condições de fermentação 28

3.3.1. Ensaios em Frascos Agitados 28

3.3.2. Ensaios em Fermentador de Bancada 29

3.4. Métodos Analíticos 30

3.4.1. Determinação das concentrações de açúcares e ácido acético 30

3.4.2. Determinação da concentração de fenóis 30

3.4.3. concentração celular 31

3.4.4. Determinação do pH 32

3.5. Metodologia de Análise dos Resultados 32

3.5.1. Determinação dos Parâmetros Fermentativos 32

3.5.2. Análise Estatística. 33

3.5.3. Velocidades Instantâneas e Específicas 39

4. RESULTADOS E DISCUSSÃ0 : .40

4.1- Caracterização do Hidrolisado .40

4.2- Ensaios em Frascos Agitados 42

4.3- Ensaios em Fermentador de Bancada 65

5. CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES 72

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74

7. APÊNDICE 89

.. ..{

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1- Composição química dos materiais lignocelulósicos (%) 03

Tabela 2.2- Composição quimica do eucalipto espécie Eucalyptus grandis .... 04

Tabela 2.3- Propriedades físico-químicas do xilitol (MANZ et ai., 1973,

HYVÓNEN et ai., 1982, BAR, 1986) 08

Tabela 3.1- Fatores e níveis avaliados no planejamento fatorial fracionário

26-2································································································34

Tabela 3.2- Esquema do projeto fatorial fracionário 26-2 proposto, considerando

as unidades dos fatores naturais e codificados 36

Tabela 3.3- Matriz de planejamento referente aos fatores avaliados no projeto

fatorial 24 completo com repetição 37

Tabela 3.4- Matriz de planejamento fatorial 24 com Face centrada e duas

repetições no ponto central 38

Tabela 4.1- Características do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido

por hidrólise ácida. .41

Tabela 4.2- Matriz de planejamento e produção de xilitol obtida da fermentação

do Hidrolisado Hemicelulósico de Eucalipto por C. guilliermondii

para o planejamento fatorial fracionário 26-2 com repetição .44

Tabela 4.3- Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student para os

parâmetros estudados na produção de xilitol por C. guílliermondii

em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para o planejamento

f t . 1 f . , . 26-2 ti - 45 a ona racionano com repe rçao .

Tabela 4.4- Matriz de planejamento e produção de xilitol obtida da fermentação

do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guílliermondii,

para um fatorial 24 completo com uma repetição, com correção

dos níveis 46


parâmetros estudados na produção de xilitol por C. guilliermondii

em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para o projeto fatorial

24 completo com repetição .47

Tabela 4.6- Matriz de planejamento e produção de xilitol obtida da composição

do modelo para a fermentação do hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto por C. guilliermondii, para um fatorial 24 face centrada

com duplicata no ponto central e com repetição 55


parâmetros estudados na produção de xilitol por C. guilliermondii

em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para o projeto fatorial

24 face centrada, com duplicata no ponto central e com

repetição 56

Tabela 4.8- Análise de variância para os efeitos estimados no planejamento

fatorial 24 face centrada com duplicata no ponto central. 57

Tabela 4.9- Coeficientes de regressão, erro-padrão, teste t de Student e nível

de significância do planejamento fatorial face centrada para o

modelo que representa a produção de xilitol em hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto 58

Tabela 4.1 O- Análise de variância da regressão do modelo que representa a

produção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto .' 58

Tabela 4.11- Valores da concentração de xilitol em g/L observados

experimentalmente (Yo) e previstos (Yp) pelo modelo 63

Tabela 4.12- Comparação entre os resultados referentes as fermentações em

Shaker e em Fermentador de Bancada - Multigen, utilizando os

fatores nos níveis determindos pelo modelo 71

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1- Esquema da produção de xilitol em larga escala ( JAFFE et ai.,

1974), 12

Figura 2.2- Produção de xilitol e xilose (MELAJA, HAMALAINEN, 1977,

HYVÔNEN et ai., 1982) 13

Figura 2.3- Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras de

xilose (HÃHN-HAGERDAL et ai., 1994) 20

Figura 3.1- Reator de hidrólise utilizado para a obtenção do hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto 25

Figura 3.2- Concentrador utilizado para aumentar o teor de açúcares do

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto 26

Figura 3.3. Fermentador de bancada - MUL TIGEN de 1 L utilizado para

determinação da cinética do modelo 29

Figura 4.1- Diagrama de Interpretação dos efeitos de interação [SA][FA],

encontrados no planejamento fatorial 24 completo .49

Figura 4.2- Diagrama de Interpretação dos efeitos de interação [SA][pH],

encontrados no planejamento fatorial 24 completo 50

Figura 4.3- Diagrama de Interpretação dos efeitos de interação [pH][CO],

encontrados no planejamento fatorial 24 completo 51

Figura 4.4- Distribuição dos resíduos para o modelo quadrático Y que

representa a produção de xilitol por C. guilliermondíi FTI 20037

em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto 60

Figura 4.5- Curvas de níveis descritas pelo modelo quadrático Y que

representa a produção de xilitol por C. guilliermondii FTI 20037


Figura 4.6- Superfície de resposta descrita pelo modelo quadrático Y que

representa a produção de xilitol por C. guilliermondii FTI 20037


Figura 4.7- Consumo de xilose (-•-), concentração celular(-•-) e produção de

xilitol (-•-) na fermentação do hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto, em fermentador de bancada, à 300 rpm, 30 ºC,

Ki.a= 4, 72 h-1 e 3 g/L de células de C. guilliermondii FTI

20037 68

Figura 4.8- Consumo de xilose (-D-), concentração celular(-•-) e produção de

xilitol (-A-) na fermentação do hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto em fermentador de bancada, à 300 rpm, 30 ºC, Ki_a=

4,72 h" e 1,5 g/L de células de C. guilliermondii FTI 20037 69

Figura 4.9- Velocidade específicas de consumo de xilose, q5 (-D-), crescimento

celular, µx (-•-) e formação de xilitol, qp (-A-) na fermentação do

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, em fermentador de

bancada, à 300 rpm, 30 ºC, Ki_a= 4,72 h-1 e 1,5 g/L de células de C.

guilliermondii FTI 20037 70

1. INTRODUÇÃO

Dentre os materiais lignocelulósicos, a madeira, sempre foi reconhecida

como grande fonte de recurso natural para o homem. Desse modo, ela sempre

foi objeto de estudo, a fim de direcionar sua utilização e adaptação para uso

em uma ampla variedade de aplicações.

A produção primária de biomassa, que é estritamente definida como

materiais de origem terrestre, é de aproximadamente 172 bilhões de

toneladas/ano da qual cerca de 82% está relacionada a existência de materiais

lignocelulósicos nas florestas. A madeira, no entanto, é o componente mais

importante. Outros materiais lignocelulósicos são incluídos, como os resíduos

agrícolas (bagaço de cana-de-açúcar, palha de arroz,etc), gramas e outros

resíduos industriais. Esses materiais são únicos em sua composição tanto

quanto suas características químicas, físicas e mecânicas. Eles consistem

principalmente de celulose, hemicelulose, lignina, e uma pequena quantidade

de extrativos.

A descoberta de leveduras capazes de metabolizar pentases,

principalmente D-xilose (principal açúcar presente nos hidrolisados

hemicelulósicos), foi um fato precursor na utilização dessa fonte natural para

obtenção de vários produtos biotecnológicos, tais como, xilitol, etanol, proteína

microbiana, combustíveis líquidos, tais como 2,3-butanodiol e butano! e vários

outros produtos que se utiliza das vias das fósforo-pentase. Portanto os

resíduos hemicelulósicos produzidos pelas florestas de eucalipto,

principalmente oriundas das indústrias papeleiras são uma fonte potencial

para a obtenção destes insumos, que podem ser produzidos por uma hidrólise

destes materiais com posterior processo de fermentação.

Desse modo, tem-se aumentado o interesse pelo uso de recursos

renováveis para minimizar os problemas ambientais e energéticos enfrentados

pela sociedade atual em todo o mundo.

2

Em particular, no Departamento de Biotecnologia da Faculdade de

Engenharia Química de Lorena, despertou o interesse pela pesquisa para

obtenção do xilitol, por ele ser um produto de alto valor agregado e possuir

grande potencial de aplicação industrial. Por exemplo, na área médica, pode

ser utilizado em dietas de diabéticos e obesos, na odontológica, por

apresentar características anticariogênicas e remineralizador de lesões

dentárias e na área alimentícia, pode ser utilizado em sucos, leites

condensados e muitos outros alimentos, sem provocar o escurecimento do

produto a ser consumido. No início as pesquisas iniciaram-se utilizando os

materiais lignocelulósicos como o bagaço de cana-de-açúcar e palha de arroz,

e, em fase inicial, encontram-se as pesquisas referentes ao uso do hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto (Eucalyptus grandis).

Portanto, com a visão voltada ao aproveitamento dos resíduos

lignocelulósicos, este trabalho, tem como objetivo geral a utilização de cavacos

de madeira de eucalipto para a bioconversão de xilose em xilitol e para isto

serão avaliados os parâmetros concentração de nutrientes (sulfato de amônia,

cloreto de cálcio di-hidratado, farelo de arroz), pH, fator de concentração do

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto e o tempo de fermentação, utilizando a

levedura Candida guilliermondii FTI 20037. Como objetivo específico, tem o de

determinar um modelo matemático para frascos agitados que melhor

represente este bioprocesso e avaliar o seu comportamento para fermentador

de bancada. No desenvolvimento da pesquisa foram usadas as metodologias

estatísticas descritas por BOX et ai. (1978) e BARROS NETO et ai. (1995).

3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Materiais Lignocelulósicos e a Madeira de Eucalipto

Dentre as diferentes biomassas que compõem os materiais

lignocelulósicos a madeira de eucalipto constitui um resíduo florestal

abundante. Semelhante a outros materiais, ela é constituída de 3 principais

componentes: celulose, hemicelulose e lignina, nas proporções 4:3:3 (TSAO,

1978). A celulose é um polímero linear de glicose unida por ligações beta (1-

4); a hemicelulose é um polímero ramificado de xilose, arabinose, galactose,

manose e ácidos urônicos, e a lignina é um composto polifenólico constituído

basicamente dos álcoois cumarílico, coniferílico e sinapílico (BISARIA &

GHOSE, 1981 ). Algumas fontes importantes de materiais lignocelulósicos são

listadas na Tabela 2.1.

Tabela 2.1 - Composição química dos materiais lignocelulósicos (%).

Fontes Celulose Hemicelulose Lignina Extrato lignocelulósicos

Madeira dura 43 -47 25- 35 16 - 24 2-8 Madeira mole 40-44 25 -29 25 - 31 1 - 5

Bagaço de cana 40 30 20 10 Palha de arroz * 43,3 26,4 16,3 n.d. Talo de milho 35 25 35 5

Espiga de milho 45 35 15 5 Algodão 95 2 0,9 0,4

Juta 71,5 13,6 13, 1 1,8 Palha de trigo 30 50 15 5

Ramie 76,2 16,7 0,7 6,4 Sisai 73,1 14,2 11,0 1,7

n.d.=não determinado Fonte: HON, D.N.S., 1996;

* EL-MASRY, 1983.

4

A composição de celulose no eucalipto é de 40 a 62%, a de

hemicelulose de 12 a 22% e a de lignina de 15 a 22% (VITAL & DELLA LUCIA,

1986). Na Tabela 2.2 apresenta-se a composição química da madeira de

eucalipto utilizada neste trabalho, determinada por ALMEIDA e SILVA, (1996).

Tabela 2.2 - Composição química do eucalipto espécie Eucalyptus grandis.

Componentes % sobre a matéria seca Celulose 43,4 43 4 ª ,

Hemicelulose 10,6 12 4 ª ' Lignina 28,0 26 Oª 1

ART 60,2 62 3 ª , ARF 48,2 48 2 ª

' ARNF 12,0 14 1 ª 1

Glicose 47,7 47 1 ª , Xilose 13, 1 10 7 ª

1

Cinzas 0,5 0,3 ART = açúcar redutor total, ARF = açúcar redutor fermentescíveis, ARNF = açúcar redutor não

fermentescíveis. Fonte: ª Fundação de Tecnologia Industrial (1977),

b Vital e Della Lucia (1986),

O eucalipto é originário da Austrália, pertence a família Myrtacea,

classificada como madeira dura (hardwood) e é a principal matéria-prima da

indústria brasileira de papel e celulose. Em virtude de seu rápido crescimento

e da aplicabilidade de sua madeira para diversos fins, tem sido a essência

florestal mais procurada para reflorestamento no Brasil (GOMES & COUTO,

1986). Também tem recebido incentivo ao· seu uso devido ao não

comprometimento com as florestas nativas, uma vez que o seu plantio se dá

por reflorestamento. O Código Florestal de 1934 facultou aos proprietários de

florestas heterogêneas transformá-las em homogêneas, para maior facilidade

de sua exploração industrial (DELLA LÚCIA, 1986).

5

A atividade florestal no Brasil ganhou impulso na metade dos anos

sessenta, com o advento dos incentivos fiscais. Em relação ao plantio de

madeira, a legislação de incentivos fiscais promulgada em 1966 contribuiu

para um significativo aumento na programação da área de reflorestamento. Em

1967, o Brasil realizou o plantio de 13.877 hectares de eucaliptos, distribuídos

principalmente pelos Estados de Minas Gerais, Paraná, São Paulo e Mato

Grosso do Sul, que representam juntos cerca de 72% da área reflorestada do

país. Até então, a formação de florestas homogêneas estava restrita a um

pequeno número de empresas do ramo siderúrgico e celulósico

(MAGALHÃES, 1986). Como seu plantio é renovado a cada sete anos, com

apenas 1 hectare de terra consegue-se um rendimento equivalente ao de uma

área de 1 O hectares de uma floresta natural (MEADOWS, 1994).

Considerando que cerca de 21,5 % do total de energia consumida no

Brasil provém do uso de madeira combustível e que o eucalipto é utilizável aos

sete anos de idade, o Brasil tornou-se líder mundial na produção e na

utilização dessa biomassa vegetal (BENTLEY, 1994), que constitui valiosa

fonte energética. O eucalipto ocupa o quarto lugar entre as espécies de

árvores cultivadas em maciços florestais homogêneos no mundo. Segundo

GRANTHAN & HOWARD, (1980) metade do peso total das árvores abatidas

nas florestas permanece no campo como resíduos. As partes mais altas das

árvores, com diâmetros inferiores a 5-7 cm, não são utilizadas pela indústria

de papel e celulose (GOMIDE, 1986).

Da mesma forma, conforme estudos realizados por BRITO et ai. (1979),

somente 51, 7% do peso .seco total do eucalipto é aproveitado pela indústria

brasileira, permanecendo o restante no campo na forma de folhas, galhos,

copas e madeiras finas. Já se propõe o uso da madeira de eucalipto em

indústria moveleira, além da tradicional papeleira, o que contribuirá ainda mais

para grande sobra dessa biomassa.

6

A D-xilose, principal açúcar presente na fração hemicelulósica, pode ser

facilmente obtida pelo processo da hidrólise ácida com bons rendimentos

(GÍRIO et ai, 1989; PESSOA Jr., 1991, ALMEIDA e SILVA, 1991, 1996 e

ALMEIDA e SILVA et ai., 1995a,b). A hidrólise ácida dos materiais

lignocelulósicos rende um hidrolisado rico em açúcares, sobretudo a xilose, a

qual pode ser fermentada por vários microrganismos, (BARBOSA et ai., 1988,

SIRISANSANEEYAKUL et ai., 1995, MAYERHOFF, 1997), tornando promissor

o seu aproveitamento biotecnológico. Seu aproveitamento consiste na

produção de uma gama de produtos de elevado valor agregado e

comercialmente viáveis, como etanol (GONG et ai., 1981, SREENATH et ai.,

1986, ROBERTO et ai., 1991, FERRARI et ai., 1992), acetona, ácido acético,

ácido cítrico (PRATA, 1989), butanol, ácido butírico (SADDLER et ai., 1983),

proteína microbiana (ALMEIDA E SILVA, 1991, 1996, MEYER et ai., 1992,

PESSOA Jr. et ai., 1996), 2,3 butanodiol (PRATA, 1997), ácido lático (SILVA,

1989) e xilitol (CONVERTI & DEL BORGHI, 1996; FELIPE et ai., 1997a,b,

DOMINGUEZ et ai., 1997, PARAJÓ et ai., 1998a,b,c).

7

2.2. Xilitol

2.2.1. Propriedades

O xilitol (CsH120s), um álcool pentahidroxilado (pentiol) de xilose, de

massa molecular 152, 15 g/mol, é um produto intermediário do metabolismo de

carboidratos no homem e em animais. Sua concentração no sangue humano

varia de 0,03 a 0,06 mg/100 ml (MANZ et a/.,1973). É também encontrado em

frutas e vegetais (WANG & van EYS, 1981, HYVÔNEN et ai., 1982), porém,

em baixas concentrações, fato que, do ponto de vista econômico, inviabiliza o

uso dessas fontes para a extração de xilitol (EMODI, 1978). Algumas de suas

propriedades físico-químicas estão descritas na Tabela 2.3.

A importância econômica e social do xilitol deve-se principalmente a seu

potencial como substituto de açúcares convencionais, devido a seu poder

adoçante (EMODI, 1978, HYVÔNEN et ai., 1982), que é comparável ao da

sacarose e superior ao do sorbitol e manitol (BAR, 1986).

O xilitol apresenta também propriedade anticariogênica, pelo fato de não

ser utilizado pelos microrganismos da flora bucal, em particular pela bactéria

Streptococcus mutans, e de consequentemente evitar a formação de ácidos

que atacam o esmalte dos dentes (MAKINEN, 1976, ASSEV et ai., 1983;

ASSEV & ROLLA, 1984; WALER et ai., 1992; AGUIRRE-ZERO et ai., 1993).

Além da redução de cáries dentárias, o xilitol .induz à remineralização do

esmalte dos dentes, revertendo lesões recém-formadas, uma vez que a

composição química da saliva parece ser favoravelmente afetada pelo xilitol,

apresentando um significativo aumento de íons cálcio e fosfato (MAKINEN,

1976). A anticariogenicidade do xilitol é uma característica de grande

importância principalmente para os países do terceiro mundo, onde a

incidência de cáries é extremamente alta.

8

Tabela 2.3 - Propriedades físico-químicas do xilitol (MANZ et ai., 1973, HYVÔNEN et ai., 1982, BAR, 1986)

Fórmula química

Massa molar [g/mol]

Sabor

Odor

Aparência

Ponto de fusão [ºC]

Ponto de ebulição [ºC]

pH de uma solução a 5%

152, 15

doce

inodoro

pó cristalino, branco

92 - 96

216

5-7

Umidade(20ºC,60% URAr) [%] aproximadamente 0,5

Viscosidade a 20 ºC [ cP]

Solubilidade a 30 ºC

Densidade (g/cm3)

Calor de dissolução

Poder adoçante

Valor calórico [kcal/g]

Índice de refração a 25 ºC

Estabi I idade

Higroscopicidade

a 10%: 1,23 ; a 60%: 20,63

68 g/100 g solução, igual a sacarose.(abaixo

desta temperatura o xilitol é menos solúvel,

com o aumento da temperatura o xilitol se

torna significantemente mais solúvel que a

sacarose)

a 10%: 1,03; a 60%: 1,23

+34,8 cal/g (efeito "refrescante")

igual a sacarose, superior ao sorbitol e manitol

4,06

a 10%: 1,3471 ; a 50%: 1,4132

Estável a 120 °c· e sob condições normais de

processamento de alimentos. A caramelização

ocorre se aquecido por vários minutos próximo

ao ponto de ebulição

tem umidade relativa alta, o xilitol é mais

higroscópico que a sacarose mas menos que

o sorbitol

9

Na indústria alimentícia o xilitol tem um grande potencial de aplicação.

Devido à ausência de grupos aldeídices e cetônicos em suas moléculas, o

xilitol não provoca nos alimentos reações de escurecimento do tipo Maillard

(MANZ et el., 1973 ). Sendo assim, ele é apropriado para o processamento, a

temperaturas elevadas, de alimentos nos quais estas reações são

indesejáveis. Uma vez que o xilitol não é fermentado por leveduras, sua

utilização no preparo de xaropes e refrescos é altamente vantajosa, eliminando

a necessidade de pasteurização do produto e da adição de conservantes para

estoque por 4 ou 5 meses em frascos fechados (MANZ et ai., 1973).

Por ser muito bem tolerado pelo organismo humano (MAKINEN, 1976), o

xilitol vem sendo empregado com segurança na área clínica. De fato, esse

adoçante tem sido indicado para pacientes com doenças biliares e renais,

como também para pessoas obesas, já que contribui muito pouco para a

formação de tecidos gordurosos, quando comparado com outros açúcares. O

xilitol pode ser também eficazmente empregado, no tratamento de outras

desordens metabólicas, como a deficiência da enzima glicose 6- fosfato

desidrogenase (EMODI, 1978) e na dieta de diabéticos, por não requerer

insulina para o seu metabolismo (YLIKAHRI, 1979).

No Japão e em países da Europa, o xilitol tem sido amplamente aceito

na nutrição parenteral (TOUSTER, 197 4; MAKINEN, 1976) e no preparo de

soluções parenterais contendo açúcar e aminoácidos, pois, ao contrário do

que ocorre com a glicose, não reage com aminoácidos (FÔRSTER, 1974).

Essas características fazem do xilitol um insumo de grande importância

nas indústrias alimentícia, odontológica e farmacêutica. Como adoçante, é

largamente empregado na Alemanha e na Suíça; no Brasil, é utilizado na

formulação de gomas de mascar, pastilhas e creme dental.

10

2.2.2. Produção Industrial de Xilitol - via química

O xilitol foi primeiramente sintetizado, em 1891, por Fischer e Bertrand,

sob a forma de xarope, através da redução da D-xilose, empregando

amálgama de sódio. A obtenção de xilitol na forma cristalina deu-se em 1942,

por Wolfrom e Kahn, após a redução catalítica, sob alta pressão, de uma

solução de xilose altamente purificada. Somente a partir de 1964 foi possível

encontrar no mercado maiores quantidades de xilitol, que passou a ser

empregado na área clínica, em casos de diabetes, sob a forma de solução

intravenosa, principalmente no Japão e na Alemanha (MANZ et ai., 1973).

A produção de xilitol por via química, em escala comercial, iniciou-se na

Finlândia, com a Finnish Sugar Co. Ltd., Helsink, que tem capacidade para

produzir acima de 3.000 t/ano. Esse processo consiste na hidrogenação

catalítica da xilose pura, obtida através da hidrólise de materiais

lignocelulósicos (JAFFE et ai., 1974; MELAJA & HAMALAINEN, 1977;

HYVÔNEN, et ai., 1982), conforme apresentado nas Figuras 2.1 e 2.2.

De modo geral, são necessárias quatro etapas básicas:

1. desintegração (hidrólise ácida) de materiais naturais ricos em xilana;

2. separação da xilose do hidrolisado por cromatografia, resultando em

uma solução de xilose pura;

3. hidrogenação catalítica da xilose pura a xilitol na presença de

catalisador níquel;

4. cristalização do xilitol na forma ortorrômbica (MELAJA &

HAMALAINEN, 1977).

11

O rendimento e a qualidade do xilitol obtido por esse processo estão

intimamente relacionados com a pureza da solução inicial de xilose, já que a

presença de impurezas interfere no processo de catálise. Além disso, a

produção de xilitol por via química requer várias etapas posteriores de

purificação para remoção de resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos

originados durante o processo de hidrogenação (MELAJA & HAMALAINEN,

1977), o que ocasiona aumento do tempo de processo e encarecimento do

produto.

Nos últimos anos vários trabalhos vem sendo conduzidos na busca de

uma via alternativa para obtenção do xilitol, destacando-se o processo

microbiológico. Este se apresenta promissor, uma vez que não requer uma

solução de xilose de alta pureza já que microrganismos fermentam os próprios

hidrolisados hemicelulósicos obtidos da fração hemicelulósica dos resíduos

lignocelulósicos ricos em xilana (ROBERTO, 1994, PARAJÓ et ai., 1995a,b;

FELIPE, et ai., 1997a,b). - ·~

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13

Melaço de pen tose

Hidrólise da matéria-prima contendo pentoses

Solução de pentases

Troca iônica

Purificação final e remoção de cor

,····························--·································

Solução de pentose purificada ,. ; - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -1

Hidrogenação

Solução de poliáis

... Fracionamento e Fracionamento e

+-- cristalização cristalização

---+

.. ···············-··--························

Melaço pen tose

XILOSE XILITOL

Figura 2.2 - Produção de xilitol e xilose (MELAJA & HAMALAINEN, 1977,

HYVÔNEN et ai., 1982)

14

2.2.3. Produção Alternativa de xilitol - Via microbiológica

O processo microbiológico tornou-se possível a partir da descoberta por

ONISH & SUZUKI (1966), de leveduras fermentadoras da xilose, nas quais se

acha presente a enzima xilose-redutase (E.C.1.1.1.21) que catalisa a redução

de xilose a xilitol na presença dos cofatores NAD(P)H ou NADH, no início do

metabolismo da xilose (BARNETT, 1976, JEFFRIES, 1983). Posteriormente,

ocorre a participação da enzima xilitol desidrogenase (E.C.1.1.1.9), que

emprega NAD+ ou NAD(P)+ como cofator, oxidando o xilitol a xilulose

(SLININGER et ai., 1987). A xilulose é fosforilada a xilulose 5-fosfato, que, na

via das fosfopentoses, é convertida em frutose-fosfato. A frutose-fosfato pode

ser convertida em piruvato, através da conexão com a via Embden Meyerhof

Parnas - EMP ou retornar à via das fosfopentoses (TAYLOR et ai., 1990, WEBB

& LEE, 1990; ROSEIRO et a/., 1991; NOLLEAU et ai., 1993), conforme

esquema apresentado na Figura 2.3.

A produção microbiológica de xilitol depende da utilização de

microrganismos capazes de metabolizar xilose e do meio adequado para a

conversão de xilose em xilitol. Assim, diferentes espécies de microrganismos

capazes de metabolizar pentase tem sido estudadas, algumas espécies de

leveduras como Candída sp (GONG et ai., 1981 ), C. utilis (SCHER,

HORECKER, 1966), C. mogíí ATCC 18364 (SIRISANSANEEYAKUL, REUSS,

1992), C. shehatae (GÍRIO et ai., 1989; SÁNCHEZ et ai., 1997), C. parapsílosís

(NOLLEAU et ai., 1995; PREZIOSI-BELLOY et ai., 1997), C. tropícalís

(BARBOSA et ai., 1988), C. guíllíermondíí FTI 20037 (BARBOSA et ai., 1988,

FELIPE et ai., 1995, ROBERTO et ai., 1996a,b, SILVA et ai., 1998a).

15

Ainda leveduras como Pichia stipitis (SKOOG, HAHN-HAGERDAL,

1990), Debaryomyces hansenii (ROSEIRO et ai., 1991, GÍRIO et ai., 1994,

PARAJÓ et ai., 1995a,b), Pachysolen tannophilus (ROEBUCK et ai., 1995) e

Rhodosporidium toruloides (FREER et ai., 1997) têm sido estudadas a fim de

avaliar seu potencial para esta bioconversão. A bactéria Enterobacter

liquefaciens (YOSHITAKE et ai., 1976) foi também identificada como produtora

de xilitol.

2.2.3.1. Fatores que influenciam a bioconversão xilose - xilitol

O processo microbilógico de obtenção de xilitol tem sido objeto de

estudo de muitos grupos de pesquisadores empregando diferentes espécies

de leveduras visando à obtenção de um modelo representativo para esta

transformação. Diferentes fatores regulam a bioconversão xilose - xilitol, entre

os quais a presença de glicose (du PREZ et ai., 1986, FELIPE et ai., 1993), a

concentração inicial de xilose (MEYRIAL et ai., 1991, NOLLEAU et ai., 1993), o

pH (SLININGER et ai., 1990, FELIPE et ai., 1997b), a temperatura (BARBOSA

et ai., 1988), a aeração (WINKELHAUSEN, et ai., 1996, PARAJÓ et ai., 1996a,

SILVA et ai., 1997) e a concentração de células no inóculo (PAROJÓ et ai.,

1996a, ROBERTO et ai., 1996a, FELIPE et ai., 1997a)

• Presença de glicose

A presença de glicose no meio pode ser considerado um fator limitante

para a bioconversão de xilose-xilitol, por essa ser metabolizada

preferencialmente, em relação à xilose (du PREZ et ai., 1986). Tem sido

observada a utilização preferencial de glicose em meio contendo glicose e

xilose (BICHO et ai., 1988, du PREEZ et ai., 1986). FELIPE et ai. (1993).

Cultivando a levedura C. guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana,

16

verificou que o efeito da glicose está relacionado à relação glicose/xilose

presente no meio, sendo que quanto maior esta proporção maior a inibição

causada pela glicose. Segundo estes autores, quando a concentração de

glicose foi inferior a 10% do total de xilose, a produção de xilitol não foi

prejudicada, De acordo com SILVA et ai. (1998b), a ausência de glicose no

meio de fermentação acarretou um aumento de mais de 40% na produção de

xilitol.

• Concentração inicial de xilose

A concentração inicial de xilose é um fator importante, sendo variável de

acordo com a espécie de microrganismo empregado. Estudos realizados com

as leveduras O. hansenii (PARAJÓ et ai., 1996a) e C. guilliermondii (NOLLEAU

et ai., 1993, FELIPE, 1994), mostraram que a produção de xilitol é favorecida

pelo aumento da concentração desse açúcar no meio de fermentação.

Segundo GONG et ai. (1981) a produção de xilitol por C. tropicalis HPX2 foi

favorecida quando aumentou-se a concentração de xilose de 50 para 200 g/L.

Segundo NOLLEAU et ai. (1993), em fermentações conduzidas com

C. guilliermondii, utilizando um meio contendo 300 g/L de xilose inicial, a

produção foi favorecida, obtendo-se um rendimento de 0,75 g de xilitol / g de

xilose. Esses autores ainda constataram que a tolerância dessa levedura à

concentração de xilose aumentou em condições de maior disponibilidade de

02 , sugerindo que as diferenças encontradas quanto à tolerância ótima da

concentração de xilose pode estar relacionada às diferentes condições de

fermentação ernpreqadas. Por outro lado, MEYRIAL et ai. (1991) verificaram

para a mesma levedura a inibição pelo substrato em concentrações de xilose

superiores a 200 g/L.

• pH:

Outro fator importante na bioconversão de xilose em xilitol é o pH do

meio de fermentação. FELIPE et ai. (1997b) estudando o efeito do pH na

17

fermentação do bagaço de cana-de-açúcar, constatou inibição do consumo de

glicose, xilose e arabinose, bem como, a produção de xilitol e células em pH

inferior a 4,5. Contudo, em valores de pH superior ou igual 5,5 a levedura C.

guilliermondíi produziu xilitol com um rendimento de 0,75 g xilitol I g xilose e

produtividade de 0,57 g/Lh. ROBERTO et ai. (1996b), também estudaram

diferentes valores de pH inicial do hidrolisado de palha de arroz para produção

de xilitol, verificando o melhor rendimento (0,68 g xilitol / g xilose) e

produtividade (0,51 g/Lh) em pH 5,3.

• Temperatura

A temperatura também exerce grande influência no metabolismo dos

microrganismos e deve ser ajustada ao seu cultivo (BROCK et ai., 1994 ). A

faixa adequada de temperatura para o crescimento de leveduras varia de 20 a

30 ºC, no entanto, existem espécies que crescem em uma faixa mais ampla,

entre O e 47 ºC (PELCZAR et ai., 1980). Segundo ROEBUCK et ai. (1995), a

temperatura ótima para o crescimento da levedura P. tannophilus em meio

sintético foi 31,5 ºC. Para a C. guilliermondíi foi verificado que, tanto para o

consumo de xilose quanto para a produção de xilitol, as temperaturas na faixa

de 30 a 35 ºC apresentaram-se mais favoráveis (BARBOSA et ai., 1988).

• Aeração

O nível de aeração é um fator determinante na formação do produto

(ROSEIRO, etal., 1991). NOLLEAU etal. (1993) verificaram que o acúmulo de

xilitol é função da velocidade de transferência de oxigênio. Este fato pode ser

atribuído à disponibilidade do cofator da enzima xilitol desidrogenase, o NAD+,

o qual é recuperado na cadeia respiratória (JEFFRIES, 1983, HAHN-

HAGERDAL et ai., 1994). Desse modo, a disponibilidade de 02 está ligada à

necessidade de recuperação das coenzimas necessárias na via de utilização

18

de xilose (ROSEIRO et et., 1991 ). Portanto, em condições de baixa velocidade

de transferência de 02 ocorre um aumento da concentração de NADH, inibindo

as etapas seguintes do metabolismo de xilose e promovendo a excreção e o

acúmulo de xilitol (ROSEIRO et el., 1991, HAHN-HAGERDAL et ai., 1994).

SILVA et ai. (1997), cultivando C. guíllíermondii em hidrolisado de

bagaço de cana com uma concentração inicial de xilose de 62, 13 g/L e

agitação de 400 rpm, mostraram que nos experimentos com maior crescimento

celular (10,29 g/L), com aeração de 0,80 vvm, houve um rendimento de 0,49 g

xilitol / g xilose e uma produtividade de O, 70 g/Lh, e nos experimentos onde o

crescimento celular foi baixo (0, 75 g/L), com O, 1 O vvm, obteve-se 0,45 g xilitol /

g xilose e 0,04 g/Lh. No entanto, os melhores resultados foram em 0,45 vvm,

com um crescimento celular de 5, 19 g/L produzindo 0,67 g xilitol I g xilose e

0,87 g/Lh. FELIPE et ai. (1996a), estudaram a influência da aeração no cultivo

de C. guíllíermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Estes

autores, observaram que o aumento da aeração de 0,4 para 0,8 vvm,

proporcionou um aumento de 179 % na produtividade em xilitol, após 48 h.

• Concentração de células no lnóculo

FELIPE et ai. (1997a), estudaram o efeito da concentração de células e

da idade do inóculo na formação de xilitol por C. guíllíermondii cultivada em

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, em frascos agitados com uma

concentração inicial de xilose de 54,5 g/L. Os melhores resultados ocorreram

ao utilizar 3,0 g/L de células, com idade de 24 h, o que resultou num

rendimento de O, 7 4 g xilitol / g xilose e uma produtividade de 0, 75 g/Lh.

Segundo ROBERTO et ai. (1996a), cultivando esta mesma levedura em

~idrolisado de palha de arroz com concentração inicial de xilose de 79,3 g/L,

19

os melhores resultados 0,71 g xilitol / g xilose e 0,56 g/Lh foram obtidos com

0,9 g/L de.inóculo e idade de 24 h. Isto mostra que altas densidades iniciais de

células não exercem efeito positivo no hidrolisado de palha de arroz. Quando o

efeito da concentração celular sobre a produção de xilitol foi avaliado em

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, com concentração inicial de xilose de

200 g/L, também foi constatado o favorecimento da bioconversão pela

levedura D. hansenii NRRL Y-7426, pela utilização de 3,0 g/L de inóculo, o que

resultou numa produtividade em xilitol de 1,47 g/Lh (DOMINGUEZ et ai., 1997).

Conforme apresentado anteriormente, a bioconversão de xilose em xilitol

é influenciada por esses diferentes fatores e, possivelmente, existe um efeito

sinérgico entre eles.

20

Xilose Glicose

Consumo de Açúcares

Glicose

NADP+ l NADPH~ J - f ~ Glicose BP

6 Fosfogluconato l e~ Frutose 6P ~~ ~op+ 1

Xilulose Ribulose 5P NADP.. + l / ~ .r , -,-,-------------Frutose 1,6 P

X.1 1 5 R1bose5P,, .: ~ ,uose P ./ ,, / -- ~/ ,,'~ / / , Gliceraldeído 3P Dihidroxi

/ I I Sedoheptulose 7P / acetona P

Xilose NADPH ---1,-- NADH NADP+ ~ NAD+

Xilitol

NAD~--/ NAD/

I 1

NADH

Y- NADH ~ NAD+

Glicerol 3P

1 Frutose 6P

/ ./

/

Frutose 6P · - - - Gliceraldeido 3P - - Glicerol

NADH r Ciclo CAC ....... ...--

0 NAD+

Piruvato C°'2~C02

Aceti\ CoA Aceta\deldo ('

\ J_ NADH <; ~NAD+

Acetato NADH

') Etanol

NAo+ Cadeia

Respiratória NADH

Figura 2.3 - Metabolismo de xilose e glicose em leveduras fermentadoras de

xilose (HAHN-HÂGERDAL et ai., 1994)

21

2.2.3.2. Toxicidade dos hidrolisados hemicelulósicos dos materiais lignocelulósicos e suas influências na bioconversão xilose - xilitol

Muitas pesquisas referem-se à bioconversão xilose - xilitol em meio

sintético (SILVA et ai., 1994, FELIPE et ai., 1995). No entanto, os resultados

obtidos nem sempre são aplicados aos hidrolisados hemicelulósicos de

materiais lignocelulósicos, como o bagaço de cana-de-açúcar, palha de arroz

ou madeira de eucalipto, nos quais se verifica perda no rendimento e na

produtividade em xilitol. Isto se deve, principalmente, à presença de compostos

tóxicos provenientes da hidrólise da estrutura lignocelulósica (PEREGO et ai.,

1990, ALMEIDA e SILVA, 1996, FELIPE et ai., 1997a) os quais agem como

inibidores do metabolismo dos microrganismos.

Dentre estes compostos destacam-se o 5-hidroximetil-2 furfuraldeído ou

hidroximetilfurfural (SANCHES & BAUTISTA, 1988), 2-furfuraldeído ou furfural

(SANCHES & BAUTISTA, 1988, ALVES, 1997), ácido acético (FELIPE et ai.,

1995), como também os compostos fenólicos oriundos da degradação da

lignina (CHUNG & LEE, 1985).

O 5-hidroximetil-2 furfuraldeído ou hidroximetilfurfural é originário da

degradação parcial da glicose, enquanto a degradação da xilose resulta na

formação do 2-furfuraldeído ou furfural (NIMZ & CASTEN, 1986). O ácido

acético é originado dos grupos acetil das cadeias laterais da hemicelulose

(FENGEL & WEGENER, 1989). A hemicelulose tem uma estrutura aberta que

favorece a sua utilização em processos fermentativos, pois é mais

prontamente hidrolisável através de processos físicos, químicos ou

enzimáticos (GONG, 1983, JEFFRIES, 1983). Segundo JEFFRIES, (1983) e

22

SINGH et ai. (1995) a configuração molecular da hemicelulose facilita a

difusão de ácidos no polímero aumentando a velocidade de hidrólise, tornando

os açúcares hemicelulósicos mais facilmente recuperáveis do que a glicose da

celulose. Conforme estudos realizados por CHUNG & LEE (1985), a presença

desses compostos tóxicos é um dos principais fatores responsáveis pela baixa

fermentabilidade dos hidrolisados hemicelulósicos de materiais

lignocelulósicos, sendo necessário a sua remoção para potencializar a sua

aplicabi !idade.

SANCHEZ & BAUTISTA (1988), estudando os efeitos do furfural e 5-

HMF no metabolismo oxidativo e fermentativo de C. guilliermondii e S.

cerevisiae , constataram que o furfural e 5-HMF agem in vitro sobre muitas

enzimas da glicólise. O maior efeito inibitório observado foi sobre a triose-

fosfato-dehydrogenase (EC 5.3.1.1) e em segundo lugar sobre a álcool-

dehydrogenase (EC 1.1.1.1 ). Do contrário, uma estimulação da atividade da

hexoquinase (EC 2.7.1.1) foi observada, ainda que as consequencias ainda

não são conhecidas. WEIGERT et ai. (1988), estudando a influência do furfural

no crescimento aeróbico da levedura Pichia stipitis, verificou a inibição da

respiração e produção de álcool furfurílico, influenciando a taxa de

crescimento de P. stipitis. Esse estudo mostra que a enzima álcool-

dehidrogenase (ADH) foi a principal responsável pela redução de furfural a

álcool furfurílico. Assim sendo, esses resultados sugerem que a inibição do

crescimento no início da 'fermentação provocados pelo 5-HMF e furfural são

provavelmente causados por suas ações sobre as enzimas chaves da via

glicolítica, tais como: triose-fosfato-dehydrogenase e álcool dehydrogenase

(SANCHEZ & BAUTISTA, 1988).

Dentre estes compostos tóxicos presentes nos hidrolisados, o ácido

acético tem sido apontado como um dos principais inibidores da bioconversão

xilose - xilitol em hidrolisados hemicelulósicos (FERRARI et ai., 1992, HAHN-

HÂGERDAL et ai., 1994, FELIPE et ai., 1997a,b). Este ácido vem sendo

apontado como forte inibidor do metabolismo de xilose, quando em

concentrações acima de 3,0 g/L (FELIPE et ai., 1995). Quando o ácido acético

(pKa = 4, 75) se acumula intracelularmente, ele dissocia devido ao pH

intracelular ser neutro, causando acidificação da célula, visto que a sua forma

dissociada não pode difundir através da membrana citoplasmática. Tem sido

sugerido que quando o pH intracelular decresce, o gradiente de próton na

membrana não consegue ser mantido, resultando em um desacoplamento da

produção de energia e sistemas de transporte, que são dependentes dos

gradientes de prótons (HERRERO et ai., 1985). Sua toxicidade é aumentada

em condições de baixo pH, devido à maior proporção de moléculas não

dissociadas em relação ao meio com pH próximo ao neutro (NODA et ai.,

1982).

Muitas metodologias tem sido desenvolvidas na tentativa de remover ou

diminuir a concentração dos compostos tóxicos a fim de minimizar seus efeitos

inibitórios sobre o metabolismo microbiano. Dentre elas, o tratamento

adequado do hidrolisado com carvão ativo (PARAJÓ et ai., 1995b; PARAJÓ et

ai., 1996b), o uso de resinas de troca iônica (MADDOX & MURRAY, 1983,

CONVERTI & DEL BORGHI, 1996) e a neutralização do pH do hidrolisado com

a adição de ácidos e bases (ROBERTO et ai., 1991; ALVES, 1997, SILVA et

ai., 1998a,b). A utilização de resinas é uma técnica de alto custo, enquanto

que o tratamento pelo ajuste do pH, empregando uma adequada combinação

de bases e ácidos, se apresenta promissor em função do baixo custo e dos

resultados já obtidos (ROBERTO et ai., 1991, ALVES, et ai., 1996).

24

Uma outra alternativa utilizada para minimizar os efeitos dos inibidores

sobre o metabolismo microbiano é o emprego de alta densidade celular

(FELIPE et ai., 1996b, PARAJÓ et ai., 1996a) bem como a adaptação do

microrganismo ao hidrolisado (CHEN & GONG, 1985, FELIPE, 1994, FELIPE

et ai., 1996b, SENE et ai., 1998). Segundo SCHNEIDER (1996), uma

alternativa é a remoção do ácido acético do hidrolisado utilizando um mutante

de S. cerevisae, que cresce em ácido acético mas não em D-xilose, D-glicose,

D-manose, ou D-frutose, aliado ao posterior processo de fermentação de

xilose. Os resultados demonstraram a possibilidade de usar a técnica sem

apreciável perda de açúcares, porém encontrou pequena conversão da D-

xilose em xilitol.

25

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Obtenção e preparo do hidrolisado hemicelulósico

3.1.1. Hidrólise ácida

O hidrolisado hemicelulósico foi obtido por hidrólise ácida de cavacos de

eucalipto, espécie Eucalyptus grandis, com tamanho médio de 20x1 Ox5 mm e teor

de umidade de 29%, de acordo com as condições de hidrólise descritas por

ALMEIDA e SILVA (1996), que consistem em: relação cavaco:solução ácida de

1:4,5; temperatura de 156 ºC, tempo de 27 min, e concentração da solução ácida

0,35% (p/v) H2S04. O reator utilizado para a hidrólise está apresentado na Figura

3.1. O hidrolisado obtido foi armazenado em bombonas de 50 L e estocado em

câmara fria a 4 ºC.

Figura 3.1 - Reator de hidrólise utilizado para a obtenção do hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto.

26

3.1.2. Concentração

A fim de aumentar o teor de xilose, o hidrolisado foi concentrado em

evaporador a vácuo de 4 L de capacidade útil, (Figura 3.2), operando à 70 ± 5 ºC.

O hidrolisado original e os concentrados foram caracterizados quanto ao pH,

concentração de açúcares (glicose, xilose, arabinose) e ácido acético. Somente

no hidrolisado original foi feita análise de fenóis.

Figura 3.2 - Concentrador utilizado para aumentar o teor de açúcares do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

27

3.1.3. Tratamento

O hidrolisado, antes de ser usado como meio de fermentação, foi

submetido a um tratamento visando a redução da concentração dos compostos

tóxicos provenientes do processo de hidrólise. O tratamento do hidrolisado foi

baseado no trabalho realizado por ALVES ( 1997) e constou da elevação do pH

inicial de 1,9 para 7,0 com CaO comercial e abaixamento para 5,5 com H3P04, e

posterior adição de 10% de carvão ativo sob agitação de 200 rpm por 1 h a 30 ºC.

A cada alteração do pH e também após tratamento com carvão, o precipitado

formado foi removido por filtração à vácuo, em funil de porcelana e papel de filtro

qualitativo Klabin. Nesta etapa, foi feito o ajuste de pH no hidrolisado com H3P04

ou NaOH 5N, conforme pH estipulado no planejamento estatístico (Tabela 3.2)

para o meio de fermentação. Por último, o hidrolisado foi autoclavado a 111 ºC

por 15 min.

3.2. Microrganismo e preparo do inóculo

Os experimentos foram conduzidos com a levedura Candida guilliermondii

FTI 20037, da coleção de culturas do Grupo de Processos Fermentativos -

Departamento de Biotecnologia - FAENQUIL, selecionada por BARBOSA et ai.

(1988). O inóculo foi preparado a partir de células obtidas de uma cultura estoque

de C. guilliermondii, mantida a 4 ºCem ágar extrato de malte inclinado.

O cultivo da levedura foi feito inoculando-se células da cultura estoque

recém repicada (1 a 3 dias) em meio sintético, com a seguinte composição, em

g/L: 30,0 D-xilose, 7,0 glicose, 2,0 (NH4)2S04, O, 1 CaCb.2H20 e 20,0 farelo de

arroz. As soluções de D-xilose, glicose, sulfato de amônia, cloreto de cálcio di-

hidratado e o extrato de farelo de arroz, foram preparadas separadamente nas

concentrações de 250, 200, 250, 50 e 200 g/L, respectivamente, e estocadas em

geladeira.

28

As soluções de xilose, glicose e extrato de farelo de arroz foram

autoclavadas a 111 ºC por 15 min e as demais soluções de nutrientes foram

esterilizadas a 121 ºC por 20 min (autoclave SOC. FABBE L TOA). Foram

utilizados frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 50 ml de meio em incubadora

de movimento rotatório (New Brunswick, Scientific Co.), sob agitação de 200 rpm,

a 30 ºC, por 24 h.

Após o cultivo, as células foram separadas por centrifugação a 2000 rpm

por 15 min, ressuspensas em água destilada estérilizada, lavadas e, após nova

centrifugação, foi preparada a suspensão de células utilizada como inóculo. A

concentração inicial de células em cada frasco foi em torno de 108 células/ml,

equivalente a) g7L, em fermentador de bancada também foi utilizado 1,5 g/L de

células.

3.3. Meio e condições de fermentação

3.3.1- Ensaios em Frascos Agitados

O meio de fermentação foi preparado com o hidrolisado original e o

concentrado, sempre suplementados com diferentes nutrientes: (NH4)2S04,

CaC'2.2H20 e extrato de farelo de arroz, cujas concentrações seguiram a matriz

de planejamento de experimentos (Tabela 3.2).

Os ensaios foram conduzidos com 50 ml de meio esterilizados em frascos

Erlenmeyer de 125 ml, em incubadora de movimento rotatório a 200 rpm, 30 ºC,

por 72 ou 96 h.

29

3.3.2- Ensaios em fermentador de bancada

Após a obtenção dos resultados nos experimentos em frascos agitados,

baseado no modelo encontrado, foi realizado um experimento em fermentador de

bancada tipo "MUL TIGEN" (New Brunswick, Scientific Co.) (Figura 3.3), de 1 L de

capacidade total, para verificar o comportamento e a cinética do processo. O meio

de fermentação utilizado foi a condição prevista pelo modelo para frascos

agitados, composto pelo hidrolisado cuja concentração foi três vezes maior que a

original, 5,0 g/L de extrato de farelo de arroz e 1, 1 g/L de (NH4)zS04 , com pH

ajustado para 8,0 com NaOH SN e a fermentação conduzida a 300 rpm, 0,6 vvm

(Ki..a = 4,72 h·\ 30 ºC por 96 h, com uma concentração de células de 3 g/L e 1,5

gil no inóculo.

Figura 3.3 - Fermentador de bancada - MUL TIGEN de 1 L utilizado para

determinação da cinética do modelo.

30

3.4. Métodos Analíticos

As fermentações foram acompanhadas por meio da análise de amostras

retiradas de acordo com os tempos estabelecidos na matriz de planejamento,

para verificação do teor de glicose, xilose, arabinose, xilitol e ácido acético, da

concentração celular e do pH. A dosagem de fenóis foi feita somente no

hidrolisado hemicelulósico original.

3.4.1. Determinação das concentrações de açúcares e ácido acético

A determinação dos teores de açúcares (glicose, xilose, arabinose, xilitol) e

de ácido acético foi feita por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em

cromatógrafo WATERS 410, utilizando coluna 810-RAD Aminex HPX-87H (300 x

7,8 mm). O eluente empregado foi ácido sulfúrico 0,01 N, o fluxo 0,6 ml/min, a

temperatura da coluna 45 ºC e o volume de amostra injetado 20 µL.

Após diluição as amostras foram filtradas em filtro Sep Pak C18

(MILLIPORE). O eluente, antes de ser utilizado, foi filtrado a vácuo em membrana

HAWP 0,45 µm (MILLIPORE) e desgaseificado em banho de ultrassom

(Microsonic SX-50) por 30 minutos.

3.4.2. Determinação da concentração de fenóis

Para a determinação do teor dos compostos fenólicos no hidrolisado

original utilizou-se o método colorímétrico descrito por KIM e YOO (1996) e

GUERRA (1998).

31

Foi preparada uma curva padrão a partir de uma solução-mãe de fenol : 1 g

de fenol recém destilado, completando-se o volume com H20 destilada para

250ml em balão volumétrico. Desta solução-mãe, foram pipetados 2; 4; 6; 7; e

8 ml completando-se cada uma destas para um volume de 200 ml em balão f volumétrico. De cada uma destas soluções pipetou-se 1,5 ml e adicionaram-se-, ~0

0,05 ml de ~Fe(CN)s 8mM, e 0,05 ml de uma solução 0, 1 M de FeCl36H20 em)

O, 1 M de HCI. Após 5 minutos leu-se a densidade óptica a 700 nm em

espectofotômetro Beckman DU-608. A curva padrão é representada pela

equação: DO=a+bx, onde DO=absorbância, a=intercepto, b=dependente e

x=concentração de fenol presente.

Para a determinação da concentração de fenol no hidrolisado, tomou-se S1')

1 ml da amostra a ser analisada, diluiu-se (1 :50) e fez-se o ajuste do pH para 7,0

com NaOH 0,05N. Desta solução, pipytou-se 1,5 ml adicionaram-se 0,05 ml de

~Fe(CN)s 8mM, e 0,05 ml de uma solução 0, 1 M de FeCl36H20 em O, 1 M de

HCI. Após 5 minutos leu-se a DO a 700 nm no espectofotômetro, utilizando a

curva padrão de fenol previamente preparada.

3.4.3. Concentração celular

As concentrações celulares para o preparo do inóculo e para os ensaios no

fermentador de bancada foram determinadas por turbidimetria em

espectrofotômetro Beckman OU 6408 em que a concentração (g/L) foi calculada

por uma curva padrão que correlaciona a absorbância a 600 nm e a massa das

células secas obtidas do cultivo por 24 hem meio sintético.

N_g_§_ experimentos realizados em Shaker o crescimento celular. ( células/ml)

nos tempos inicial e final da fermentação foi avaliado por contagem de células em

câmara de Neubauer (1/400 mm2 x 1/10 mm). _t,.Jos experimentos conduzidos em

Multigen foi adotado o Método de espectrometria.'

32

3.4.4. Determinação do pH

Os valores de pH do hidrolisado original e após concentrado e o

acompanhamento das fermentações foram determinados em pHmetro Micronal

modelo 374.

3.5. Metodologia de Análise dos Resultados

3.5.1. Determinação dos Parâmetros Fermentativos

Os parâmetros fermentativos, isto é, fator de rendimento, produtividade e

eficiência de conversão foram determinados como segue:

• Fator de rendimento

Y pts = g (xilitol produzido) I g (xilose consumida)

• Produtividade

Q P = g / L (xilitol produzido)/ h (tempo)

• Eficiência de conversão

n ' =(Yptsl0,917).100

*%calculada admitindo-se que o rendimento teórico é de 0,917 g xilitol / g xilose,

segundo BARBOSA et ai. (1988).

33

3.5.2. Análise Estatística

O delineamento experimental inicial foi um planejamento fatorial fracionário

26·2 com repetição (BOX et ai., 1978, BARROS NETO et ai., 1995), sendo que os

fatores estudados e seus respectivos níveis avaliados no cultivo da levedura

C. guillíermondii no hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para produção de

xilitol, estão apresentados na Tabela 3.1. Os sinais (-1) e (+1) representam os

níveis mínimos e máximos dos fatores, respectivamente. A matriz de planejamento

está apresentada na Tabela 3.2.

Os resultados experimentais obtidos foram analisados estatisticamente, de

acordo com o planejamento pré-estabelecido, para verificar os efeitos dos fatores

em estudo. A análise dos dados foi efetuada pelo programa STATGRAPHICS,

versão 6.0, considerando o nível de significância de 5%. Os resultados foram

expressos em tabelas de estimativas de efeitos, erros-padrão teste t de Student, e

ainda em tabelas de análise de variância com colunas de causa de variação (CV),

graus de liberdade (GL), soma de quadrados (SQ), quadrado médio (QM) e nível

de significância (p).

34

Tabela 3.1-Fatores e níveis avaliados no planejamento fatorial fracionário 26-2.

[SA]

[CA]

[FA]

[pH]

[CO]

[T]

Níveis

(-1) (+1)

1 ,O g/L 3,0 g/L

0,0 g/L 1 ,O g/L

5,0 g/L 20,0 g/L

4,0 8,0

15 g/L 45 g/L

72 h 96 h

Fatores (*)

(*) [SA]=sulfato de amônia, [CA]=cloreto de cálcio di-hidratado, [FA]=farelo de arroz, [pH]=pH, [CO]=concentração de xilose do hidrolisado, [T]=tempo de fermentação.

Para a análise estatística dos dados foi necessário corrigir os níveis

codificados para os fatores pH e fator concentração de xilose no hidrolisado, uma

vez que os valores utilizados para a realização dos experimentos sofreram alguns

desvios dos valores planejados inicialmente. A codificação dos níveis dos fatores

foi estabelecida segundo a equação 3.1:

em que,

Xi é o valor codificado,

• X= valor real,

IX 12 = o valor médio entre os níveis superiores e inferiores,

óX 12 = a média da diferença entre os níveis superiores e inferiores.

35

As variáveis sulfato de amônia, cloreto de cálcio di-hidratado, farelo de

arroz, pH, concentração de xilose do hidrolisado e o tempo, foram analisadas

estatisticamente, de acordo com o planejamento preestabelecido (Tabela 3.2),

para avaliar os efeitos principais e as interações entre os fatores.

O modelo estatístico proposto foi baseado na metodologia da superfície de

resposta, cuja equação foi determinada pela análise de regressão múltipla linear

utilizando o programa STATGRAPHICS versão 6,0, conforme a equação 3.2.

descrita abaixo:

em que,

Yi = variável dependente ou variável resposta,

b = coeficientes de regressão,

X= nível dos fatores experimentais com unidades codificadas,

ei = erro aleatório.

Após a análise estatística dos dados, os fatores que não apresentaram

efeitos significativos foram desprezados e os fatores que apresentaram efeitos

foram utilizados para compor o planejamento seguinte, um fatorial 24 completo

com uma repetição, cuja matriz de planejamento está apresentada na Tabela

3.3. A análise estatística do planejamento fatorial 24 completo serviu para

confirmar os resultados anteriores, sendo propostos ensaios no ponto central,

o que resultou em uma matriz de planejamento 24 com face centrada e duas

repetições no ponto central (Tabela 3.4.).

C/) o "O C/) (1) "O <U "O e ::J C/) <U

o "O e ~ (1)

"O ·;;; e o o o ..... C/) o o. e o.

N <i:, N o ·;::

·<U e o ·c3 <U

<l= <U ·;:: o ..... ~ o C/) ..... o (1) "O ....... <U e u a..~ o "O

"O 8 <U (1)

E-~ (1) <U ::J !... e, ::J C/) ..... wê N M cu ã, .e cu 1-

º~ºººººººººººººººº oã~~~~~~~~~~~~~~~~ -~~~~~~~~~~~~~~~~

.......... ~~ 00 00 00 00 Ü -oo - -oo - -oo - -oo - - rn ~~ ~~ ~~ ~~ .........

.......... ~~ºººººººººººººººº CfJâ~M~M~M~M~M~M~M~M .........

C/) cu "O cu o ..:: I =-c5 a.. o o C/) (1)

"O ~ cu u, "O e ::,

C/)

~ ::, I êu o. e

1-

o ü

~ Cf)

C/) o ·ro C/) e (1)

T'""'" T"""' T'""'" T'""'" T'""'" T'""'" T'""'" T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T'""'"

• •++++• •++• • • •++

.,- T'""'" .,- .,- .,- T"""' T"""' T- T"""' T"""' .,- T"""' T'""'" .,- T"""' T"""' 1 1 1 1 1 1 1 1 + + + + + + + +

T"""' ,:- T"""' .,- T"""' T"""' .,...... T"""' ,:- T"""' .,...... T"""' T"""' .,...... T"""' T"""'

• •++• •++• •++• •++

T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T"""' T'""'" T"""' T'""'" T"""' T"""' T"""' T"""' 1 + 1 + I + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 +

ºººººººººººººººº s;:i' s;:i' ~- s;:i' ~- s;:i' s;:i' ~- a:f cô co- cô cô cô co- cô

37

Tabela 3.3 - Matriz de Planejamento referente aos fatores avaliados no projeto fatorial 24 completo com uma repetição.

ensaios SA FA eH co 1 -1 -1 -1 -1 2 +1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 5 -1 -1 +1 -1 6 +1 -1 +1 -1 7 -1 +1 +1 -1 8 +1 +1 +1 -1 9 -1 -1 -1 +1 10 +1 -1 -1 +1 11 -1 +1 -1 +1 12 +1 +1 -1 +1 13 -1 -1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 15 -1 +1 +1 +1 16 +1 +1 +1 +1 17 -1 -1 -1 -1 18 +1 -1 -1 -1 19 -1 +1 -1 -1 20 +1 +1 -1 -1 21 -1 -1 +1 -1 22 +1 -1 +1 -1 23 -1 +1 +1 -1 24 +1 +1 +1 -1 25 -1 -1 -1 +1 26 +1 -1 -1 +1 27 -1 +1 -1 +1 28 +1 +1 -1 +1 29 -1 -1 +1 +1 30 +1 -1 +1 +1 31 -1 +1 +1 +1 32 +1 +1 +1 +1

38

Tabela 3.4 - Matriz de Planejamento fatorial 24 com face centrada e duas repetições no ponto central.

ensaios SA FA pH co 1 -1 -1 -1 -1 2 +1 -1 -1 -1 3 -1 +1 -1 -1 4 +1 +1 -1 -1 5 -1 -1 +1 -1 6 +1 -1 +1 -1 7 -1 +1 +1 -1 8 +1 +1 +1 -1 9 -1 -1 .-1 +1 10 +1 -1 -1 +1 11 -1 +1 -1 +1 12 +1 +1 -1 +1 13 -1 -1 +1 +1 14 +1 -1 +1 +1 15 -1 +1 +1 +1 16 +1 +1 +1 +1 17 -1 o o o 18 +1 o o o 19 o -1 o o 20 o +1 o o 21 o o -1 o 22 Ç) o +1 o 23 o o o -1 24 o o o +1 25 o o o o 26 o o o o

39

3.5.3. Velocidades Instantâneas e Específicas

As velocidades instantâneas de crescimento ( dX/dt), consumo de substrato

(-dS/dt) e formação de produto (dP/dt) foram calculadas para os ensaios

conduzidos em fermentador de bancada conforme método proposto por LE DUY &

ZAJIC (1973). As velocidades específicas de crescimento (µx), consumo de xilose

(-qs) e produção de xilitol (qp) foram obtidas pela divisão das velocidades

instantâneas pela concentração celular nos pontos onde foram calculadas as

derivadas.

(. -. -

40

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Caracterização do Hidrolisado

Com as condições de hidrólise utilizadas conforme descrito no ítem

3.1.1., foi obtido o hidrolisado da fração hemicelulósica cuja composição

monomérica de açúcares, ácido acético e fenóis está apresentada na Tabela

4.1.

O hidrolisado hemicelulósico obtido foi uma mistura de

monossacarídeos, predominantemente xilose. Semelhante ao constatado nos

hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-açúcar (du TOIT et ai.,

1984, ALVES, 1997), de eucalipto (PARAJÓ et ai., 1996a) e de palha de arroz

(ROBERTO et ai., 1996a,b).

Outro açúcar presente no hidrolisado é a glicose, que dependendo de

sua concentração pode inibir a bioconversão xilose-xilitol. No hidrolisado

original, ou seja, anterior ao procedimento de concentração à vácuo, observou-

se uma relação de 7,5 gramas de xilose para cada grama de glicose. Após

concentrara três e quatro vezes, essa proporção _foi aumentada para 9,1 e 8,7,

respectivamente. Pelos resultados nota-se que a concentração dos açúcares

xilose, glicose e arabinose foram aumentadas proporcionalmente ao fator de

concentração utilizado.

Além dos açúcares, o ácido acético presente, não teve sua

concentração aumentada proporcionalmente aos fatores de concentração

utilizados. O aumento foi de 25 % quando concentrado três vezes e de 60 %

quando concentrado quatro vezes. RODRIGUES (1997) observou

comportamento semelhante em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar,

tendo o ácido acético aumentado em 38% e 54%, respectivamente. Este

41

comportamento pode ser atribuido às condições do processo de concentração

do hidrolisado e às características físico-químicas desses compostos.

Nota-se ainda na Tabela 4.1 que o aumento da concentração do

hidrolisado acarretou um decréscimo do pH inicial de 1,9 para 1,5 e 1,4 após a

concentração de três e quatro vezes, respectivamente. Segundo ÇÔRREA et

ai. (1995) este fato se deve, provavelmente, ao aumento da concentração de

íons H+ provenientes do ácido sulfúrico utilizado na hidrólise ácida e ao

aumento da concentração do ácido acético. Este ácido tem sido considerado

como forte inibidor da fermentação de xilose em xilitol (HERRERO et ai., 1985,

FELIPE et ai., 1995, 1997).

A presença de fenóis, outro composto tóxico, também foi constatada no

hidrolisado com uma concentração superior à presente nos hidrolisados de

bagaço, que é da ordem de 0,04 g/L, de acordo com RODRIGUES et ai.

(1998).

Tabela 4.1 - Características do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido por hidrólise ácida

Características Hidrolisado

original 3XC 4XC

pH 1,9., 1,5 1,4

Glicose (g/L) 2,!:>4 6,50 8,58 \

Xilose (g/L) 19, 17 5~.21 75,12

Arabinose (g/L) 0,41 0,98 1,49

Ácido Acético (g/L) 5,03 6,33 8,06

Fenóis (g/L) 1,25 n.d. n.d.

3XC = três vezes concentrado do hidrolisado original, 4XC = quatro vezes concentrado do hidrolisado original.

n.d. = não determinado

42

4.2. Ensaios em Frascos Agitados

Em se tratando da utilização do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto

para produção de xilitol por C. guilliermondii, baseanda em estudos iniciais

realizados por CANETTIERI et ai. (1997), PARAJÓ et ai. (1996a) e FELIPE et

ai. (1996b), decidiu-se empregar um nível de inóculo de 3 g/L (108 células/ml).

As fermentações foram conduzidas empregando-se um planejamento

fatorial fracionário 26-2 com repetição. A matriz e os resultados referentes à

produção de xilitol decorrentes deste planejamento estão apresentados na

Tabela 4.2. Os níveis de pH e [CO] foram corrigidos pois foi verificado variação

entre os valores experimentais e os propostos inicialmente. Nota-se que nos

ensaios 2,8, 18, 19 e 24, conduzidos em pH 4,0 e com hidrolisado concentrado,

não ocorreu produção de xilitol. Os melhores resultados em xilitol ocorreu nos

ensaios 11, 13, 27 e 29 conduzidos em pH 8,0 com hidrolisado concentrado.

Verificou-se baixo consumo de xilose aliado a uma baixa produção de xilitol em

pH 4,0, enquanto que os melhores resultados 7,61 e 6,82 g/L de xilitol foram

em pH 8,0 com hidrolisado concentrado. Nos ensaios 1,7,12 e 14 verificou-se

baixa produção de xilitol, o que pode ser atribuído à baixa concentração inicial

de xilose do hidrolisado (15 g/L) e baixo pH (4,0).

Outro açúcar presente no hidrolisado numa concentração muito baixa é

a arabinose, sendo parcialmente consumida.

Os resultados experimentais da produção de xilitol apresentados na

Tabela 4.2 foram utilizados para estimar os efeitos principais das variáveis e

seus efeitos de interações, os quais estão apresentados na Tabela 4.3.

Verifica-se pela análise dos efeitos, que as variáveis [SA], [pH] e [CO] são

43

significativas a nível de 5% de probabilidade, como efeito principal. Nota-se

ainda que as interações [SA][FA]+[CA][CO], [SA][pH]+[CO][T] e

[SA][T]+[pH][CO] são significativas a nível de 5% de probabilidade. Todavia, a

determinação exata dos efeitos de interação que realmente eram significativos,

tornou-se difícil porque estavam confundidos. Assim, foi feita uma análise

criteriosa a fim de identificar qual a interação que de fato era significativa para

o processo. Desprezando os fatores não significativos, resultou nos fatores

[SA], [FA], [pH] e [CO], de acordo com um planejamento fatorial completo 24,

apresentado na Tabela 4.4 com os respectivos resultados de xilitol.

A Tabela 4.5 mostra a estimativa dos efeitos, erros-padrão e o teste t de

Student para os parâmetros da obtenção de xilitol, utilizando fatorial 24

completo, confirmando os fatores e interações significativas. Também mostra

que o [FA] é um fator significativo, uma vez que sua interação com o [SA] é

significativa. Assim, pode ser eliminado do planejamento os fatores [CA] e [T],

Ainda na Tabela 4.5, verificá-se pela estimativa dos efeitos que o fator [SA]

ocasiona uma perda em xilitol de 0,71 g/L quando é aumentado de 1 para 3

g/L, o fator [pH] proporciona um ganho de 3,86 g/L quando aumentado de 4,0

para 8,0 e o fator [CO] também aumenta em 1,26 g/L a produção de xilitol,

quando a concentração do hidrolisado é aumentada em 3 vezes. As interações

entre o [SA][FA], [SA][pH] e [pH][CO] também apresentam efeito significativo

(p<0,05). Isto indica que o nível de um fator interfere no nível do outro, o que

pode ser melhor visualizado pelas Figuras 4.1, 4.2 e 4.3.

44

Tabela 4.2 - Matriz de planejamento e produção de xilitol obtida da fermentação do Hidrolisado Hemicelulósico de Eucalipto por C. guilliermondii para o planejamento fatorial fracionário 26-2

com repetição.

ensaios SA CA FA pH co T xilitol /L

1 -1,08 -0,96 . 0,69 2 + -1,22 +1,23 o 3 + -1,29 +1,28 + 0,19 4 + + -0,86 -0,98 + 0,48 5 + -1,04 +1,32 + 0,61 6 + + -0,71 -0,98 + 1,71 7 + + -0,79 -1,04 0,64 8 + + + -1,26 +0,98 o 9 +1,52 -1,02 + 5,65 10 + +1,22 +1, 18 + 5,51 11 + +1, 17 +1, 18 6,39 12 + + +1,37 -1,07 2,04 13 + +0,98 +1,48 6,74 14 + + +1,03 -1,09 2,94 15 + + +0,98 -0,98 + 2,61 16 + + + +0,96 +1,28 + 5,37 17 -0,93 -0,95 0,61 18 + -1,03 +1,49 o 19 + -1,05 +1,43 + o 20 + + -0,98 -0,97 + 0,65 21 + -1,01 +1,05 + 0,45 22 + + -0,80 -0,97 + 1,62 23 + + -0,84 -1;00 0,79 24 + + + -0,98 +0,97 o 25 +1,43 - -0,96 + 4,47 26 + +1,23 +1,31 + 5,13 27 + +1,28 +0,99 8,83 28 + +· +1,42 -1,06 2,96 29 + +1, 10 +0,94 6,91 30 + + +1,09 -1,09 2,32 31 + + +1,08 -1,08 + 3,26 32 + + + +1, 11 +0,79 + 5,76

[SA] = (NH4)iS04 (g/L); [CA] = CaCl2.2H20 (g/L); [FA] = Farelo de arroz (g/L);

[pH] = pH; [CO] = concentração de xilose do hidrolisado; [T] = tempo (h).

* significativo a nível de 5% de probabilidade (t = 2, 11 O)

45

Tabela 4.3 - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student para os parâmetros estudados na produção de xilitol por C. guillíermondíí em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para o planejamento fatorial fracionário 25•2 com repetição.

efeitos e interações estimativas erros-padrão t

Média 2,418 ± 0,100 -

[SA] -0,659 ±0,200 3,295 *

[CA] -0,232 ± 0,200 1, 160

[FA] 0,099 ± 0,200 0,495

[pH] 3,966 ± 0,183 21,672 *

[CO] 1,326 ± 0, 181 7,326 *

[T] 0,045 ± 0,200 0,225

[SA][CA]+[FA][CO] 0,063 ± 0,200 0,315

[SA][FA]+[CA][CO] 0,504 ± 0,200 2,520 *

[SA][pH]+[CO][T] -0,768 ± 0,182 4,220 *

[SA][CO]+[CA][FA]+[pH][T] -0,247 ± 0, 181 1,365

[SA][T]+[pH][CO] 1,790 ± 0,200 8,950 *

[CA][pH]+[F A][T] 0,076 ± 0,182 0,417

[CA][T]+[FA][pH] -0, 134 ± 0,200 0,670

46

Tabela 4.4 - Matriz de planejamento e produção de xilitol obtida da fermentação do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guilliermondíí, para um fatorial 24 completo com repetição.

ensaios [SA] [FA] [pH] [CO] xilitol /L

1 -1,08 -0,96 0,69 2 + -0,86 -0,98 0,48 3 + -0,79 -1,04 0,64 4 + + -0,71 -0,98 1,71 5 +1,52 -1,02 5,65 6 + +1,37 -1,07 2,04 7 + +0,98 -0,98 2,61 8 + + +1,03 -1,09 2,94 9 -1,29 +1,28 0,19 10 + -1,22 +1,23 o 11 + -1,04 +1,32 0,61 12 + + -1,26 +0,98 o 13 +0,98 +1, 18 6,39 14 + +1,22 +1, 18 5,51 15 + +0,98 +1,48 6,74 16 + + +0,96 +1,28 5,37 17 -0,93 -0,95 0,61 18 + -0,98 -0,97 0,65 19 + -0,84 -1,00 0,79 20 + + -0,80 -0,97 1,62 21 +1,43 -0,96 4,47 22 + +1,42 -1,06 2,96 23 + +1,08 -1,08 3,26 24 + + +1,09 -1,09 2,32 25 -1,05 +1,43 o 26 + -1,03 +1,49 o 27 + -1,01 +1,05 0,45 28 + + -0,98 , +0,97 o 29 +1,10 +0,99 8,83 30 + +1,23 +1,31 5,13 31 + +1,10 +0,94 6,91 32 + + +1, 11 +0,79 5,76

47

Tabela 4.5 - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student para os parâmetros estudados na produção de xilitol por C. guilliermondíi em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para o projeto fatorial 24 completo com repetição.


Média . 2,552 ± 0, 111

[SA] -0,713 ± 0,219 3,256 *

[FA] -0,036 ± 0,219 0,164

[pH] 3,859 ± 0,205 18,824 *

[CO] 1,257 ± 0,200 6,285 *

[SA][FA] 0,602 ± 0,218 2,761 *

[SA][pH] -0,828 ±0,202 4,100 *

[SA][CO] -0,353 ±0,200 1,765 ·-

[FA][pH] -0, 157 ± 0,204 0,770 - - [FA][CO] 0,002 ± 0,200 0,010

[pH][CO] 1,504 ±0,183 8,219 *

* significativo ao nível de 5% de probabilidade (t = 2,08647)

48

A Figura 4.1 mostra a interação entre os fatores [SA] e [FA]. O aumento

do farelo de arroz de 5 para 20 g/L quando a concentração de sulfato de

amônia é de 1 g/L causa uma perda de 0,64 g/L de xilitol, enquanto essa

mesma variação de farelo de arroz causa um aumento de 0,57 g/L de xilitol

quando a concentração de sulfato de amônia é de 3 g/L. Por outro lado, a

variação de 1 para 3 g/L de sulfato de amônia em associação com 5 g/L de

farelo de arroz, provoca uma perda de 1,32 g/L de xilitol, e em associação com

20 g/L de farelo causa uma perda de O, 11 g/L em xilitol.

Na Figura 4.2 nota-se que o aumento do pH de 4,0 para 8,0 com uma

concentração de sulfato de amônia de 1 g/L proporciona um aumento de 4,68

g/L em xilitol, enquanto nessa mesma variação de pH, com uma concentração

de sulfato de amônia de 3 g/L, ocorre um aumento de 3,03 g/L em xilitol. Na

variação de sulfato de amônia de 1 para 3 g/L verifica-se um aumento de O, 11

g/L em xilitol em pH 4,0 e resulta numa perda de 1,54 g/L em pH 8,0 nessa

mesma variação de sulfato.

A Figura 4.3 mostra a interação entre o pH e a concentração do

hidrolisado. Observa-se que o aumento da concentração de xilose no

hidrolisado de 15 para 45 g/L em pH 4,0 causa uma perda de 0,25 g/L na

produção de xilitol, enquanto que com esta mesma variação de xilose no

hidrolisado em pH 8,0 produz um ganho de 2,76 g/L em xilitol. A variação do

pH de 4,0 para 8,0, utilizando 15 g/L de xilose no hidrolisado, proporciona um

aumento de 2,35 g/L em xilitol, e, analisando essa mesma variação de pH com

45 g/L de xilose no hidrolisado, há um aumento de 5,36 g/L de xilitol.

(20g/L) 1

[FA]

(5g/L) -1 -1

(1 g!L)

2,61 -0,11

49

2,50

-0,64

3,25 -1,32 1,93

0,57

1 (3 g!L)

Figura 4.1 - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação [SA][FA],

encontrados no planejamento fatorial 24 completo.

[SA]

(8,0)

pH

(4,0) -1 -1

(1 g/L)

5,27 -1,54 3,73

1 (3 g/L)

Figura 4.2 - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação [SA][pH],

encontrados no planejemento fatorial 24 completo.

4,68 3,03

0,11 0,59 0,70

[SA]

(45g/L) 1

[CO]

(15g/L) -1 -1

(4,0)

0,52 5,36 5,88

51

-0,25 2,76

1 (8,0)

Figura 4.3 - Diagrama de interpretação dos efeitos de interação [pH][CO],

encontrados no planejamento fatorial 24 completo.

0,77 2,35 3,12

[pH]

52

A fim de verificar a curvatura do modelo, ou seja, identificar se o modelo

é quadrático ou linear, ou ainda a tendência para a otimização dos resultados,

foi avaliado um planejamento fatorial 24 completo com repetição incluindo o

ponto central. Os resultados referentes à concentração de xilitol encontrados

no ponto central utilizando 1,5 g/L de sulfato de amônia, 12,5 g/L de farelo de

arroz, concentração do hidrolisado 1,5 vezes à do original, em pH 6,0 foram:

1,96; 1,64; 1,92 e 2, 17 g/l. Como a média 1,92 g/L obtida nos experimentos

conduzidos no ponto central, difere da média 2,67 g/L, obtida no fatorial, isto

indica que a equação de um modelo quadrático é mais adequada para

representar o processo que a de um modelo linear. Os resultados até então

obtidos são considerados baixos quando comparados com os de FELIPE et ai.

(1997a), que cultivaram a levedura C. guil/iermondii FTI 20037 em hidrolisado

hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar com uma concentração inicial de

xilose de 54,5 g/L. Estes autores conseguiram uma produção de xilitol de 34,0

g/L, o que correspondeu a um rendimento de 0,74 g xilitol/g xilose. SILVA et ai.

(1997) também observou boa produção de xilitol (41,76 g/L) com rendimento

de 0,67 g xilitol/g xilose a partir de hidrolisado de bagaço contendo 62, 13 g/L

de xilose inicial, com essa mesma levedura.

Uma das causas da baixa fermentabilidade do hidrolisado de eucalipto",

encontrada neste trabalho pode ser atribuída aos compostos tóxicos gerados ~ 4 durante a hidrólise. Entre eles pode-se citar o ácido acético (produzido dos J

grupos acetil), presente em torno de 10% da concentração de xilose (TABELA

4. 1 ), outros compostos como o furfural (gerado pela degradação da pentase) e

os fenóis, embora estes últimos estejam presentes em concentrações muito

baixas.

53

Outro fator que pode estar influenciando nos baixos resultados obtidos é

o tratamento do hidrolisado empregado antes da fermentação. Para o

tratamento do hidrolisado usamos a técnica de alteração do pH inicial pela

adição de bases e ácidos. Após o tratamento não foi constatado redução na

concentração do ácido acético, o que sugere a necessidade de trabalhos

futuros para melhoria do procedimento de tratamento. Segundo FELIPE et ai.

(1995) o ácido acético é potente inibidor da produção de xilitol por C.

guilliermondii. Estes autores relataram que a inibição da bioconversão xilose-

xilitol pelo ácido acético também está associada ao baixo pH do meio de

fermentação devido ao maior número de moléculas de ácido na sua forma não

dissociada, dificultando a produção de energia e o transporte de nutrientes

(HERRERO et ai., 1985, FELIPE et ai., 1997b). Segundo HAHN-HÃGERDAL et

ai. (1994) a dificuldade em detectar acetaldeído e ácido acético é devido a

estes compostos possuirem uma alta volatilidade. No nosso trabalho foi

constatado que, durante o ajuste do pH do hidrolisado para 8,0 com NaOH 5N,

seguida da autoclavagem, ocorria uma queda do pH para 5,5, sendo este, /

portanto, o pH utilizado na fermentação. Acredita-se que concomitantemente à

alteração deste pH, ocorreu a precipitação de algum componente no meio de

fermentação, o que poderia de alguma forma ter prejudicado o metabolismo de

xilose pela levedura. Desse modo, obtivemos baixa produção de xilitol aliada

ao baixo consumo de xilose.

Novos experimentos foram realizados seguindo-se um planejamento

fatorial 24 com face centrada e duplicata no ponto central, para obtenção do

modelo matemático representativo do processo, através da metodologia de

superfície de resposta. A matriz referente a esse planejamento e a resposta da

produção de xilitol em g/L estão apresentados na Tabela 4.6.

54

A Tabela 4. 7 apresenta as estimativas dos efeitos, erros-padrão e teste t

de "Student" referentes a produção de xilitol para o planejamento fatorial 24 face

centrada com duplicata no ponto central. Conforme os resultados apresentados

nesta Tabela, observa-se que ao nível de 5% de probabilidade os fatores [SA],

[pH] e [CO] são significativos, e que somente a estimativa quadrática para o

fator [SA] é significativa em nível de 5% de probabilidade, apresentando efeito

positivo de 2, 19 g/L sobre a produção de xilitol, além da interação [pH][CO].

Com base nos resultados de variância e nível de significância (p) apresentados

na Tabela 4.8, foram utilizadas somente as estimativas que apresentaram

efeitos significativos em nível de probabilidade menor que 5% para a

determinação do modelo quadrático. Os resultados estão apresentados nas

Tabelas 4.9 e 4.1 O, em que X1 representa o [SA], X2 o [pH] e Na [CO].

55

Tabela 4.6 - Matriz de planejamento e produção de xilitol obtida da composição do modelo para a fermentação do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guilliermondii, para o fatorial 24 face centrada com duplicata no ponto central.

ensaios SA FA pH [CO] xilitol (g/L)

1 -1 -1 -1,00 -0,95 0,65

2 +1 -1 -0,92 -0,97 0,56

3 -1 +1 -0,81 -1,02 0,71

4 +1 +1 -0,75 -0,97 1,66

5 -1 -1 +1,47 -0,99 5,06

6 +1 -1 +1,39 -1,06 2,50

7 -1 +1 +1,03 -1,03 2,93

8 +1 +1 +1,06 -1,09 2,63

9 -1 -1 -1, 17 +1,35 0,09

10 +1 -1 -1, 12 +1,36 o 11 -1 +1 -1,02 +1,18 0,53 , ..

12 +1 +1 -1, 12 +0,97 o - r

13 -1 -1 +1,04 +1,08 7,61

14 +1 -1 +1,22 +1,24 5,32

15 -1 +1 +1,04 +1,21 6,82

16 +1 +1 +1,03 +1,03 5,56

17 -1 o +0,84 -0,14 6,45

18 +1 o +0,91 -0, 13 2,64

19 o -1 +0,96 -0, 16 4,54

20 o +1 +0,82 -0,21 3,02

21 o o -0,84 -0,08 0,37

22 o o +1,09 -0,03 3,99

23 o o +1, 10 -1,01 0,86

24 o o +0,79 1,7 6,43

25 o o +0,91 -0,47 1,80

26 o o +1,33 -0,77 2,04

56

Tabela 4.7 - Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de Student para os parâmetros estudados na produção de xilitol por C. guílliermondíi em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para o projeto fatorial 24 face centrada com duplicata no ponto central.


média 2,611 ± 0,684

[SA] -0,952 ± 0,382 2,492 *

[FA] -0,600 ± 0,467 1,285

[pH] 4,285 ± 0,438 9,783 *

[CO] 1,616 ± 0,385 4,197 *

[SA][FA] 0,668 ± 0,403 1,657

[SA][pH] -0,931 ± 0,363 2,565 *

[SA][CO] -0, 188 ± 0,382 0,492

[FA][pH] -0,406 ± 0,377 1,077

[FA][CO] 0,247 ± 0,403 0,613

[pH][CO] 1,219 ± 0,461 2,644 *

[SA]2 2, 191 ± 0,918 2,387 *

[FA]2 0,756 ± 0,926 0,816

[pH]2 -2,640 ± 1,585 1,666

[C0]2 0,006 ± 0,491 0,012

* significativo ao nível de 5% de probabilidade (t = 2,20156)

57

Tabela 4.8 - Análise de variância para os efeitos estimados no planejamento fatorial 24 face centrada com duplicata no ponto central.

Efeito SQ GL MO F p

[SA] 3,941 1 3,941 6,20 0,030

[FA] 1,050 1 1,050 1,65 0,225

[pH] 60,745 1 60,745 95,49 0,000

[CO] 11,186 1 11, 186 17,58 0,001

[SA][FA] 1,745 1 1,745 2,74 0,126

[SA][pH] 4,179 1 4,179 6,57 0,026

[SA][CO] 0,155 1 0,155 0,24 0,637

[FA][pH] 0,738 1 0,738 1, 16 0,305

[FA][CO] 0,239 1 0,239 0,38 0,559

[pH][CO] 4,459 1 4,459 7,01 0,023

[SA]2 3,622 1 3,622 5,69 0,036

[FA]2 0,424 1 0,424 0,67 0,440

[pH]2 1,764 1 1,764 2,77 0,124

[C0]2 0,000 1 0,000 0,00 0,991

Resíduos 7.000 11 0,636

Total 144, 107 25

R2 = 0,92 , GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrática; MQ = média quadrática

58

Tabela 4.9 - Coeficientes da regressão, erro-padrão, teste t de Student e nível de significância do planejamento fatorial face centrada para o modelo que representa a produção de xilitol em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

Variáveis Coeficientes Erros-padrão t p

constante 1,609 0,305 5,266 0,0000

X1 -0,492 0,187 -2,628 0,0166

X2 1,923 0,165 11,669 0,0000

x3 0,756 0,163 4,644 0,0002

X1X2 -0,486 0,175 -2,775 0,0121

X2X3 0,865 0,153 5,636 0,0000

X/ 1,010 0,347 2,913 0,0089

Tabela 4.10 - Análise de variância da regressão do modelo que representa a produção de xilitol por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto.

CF GL SQ QM F p

Modelo

Resíduos

6

19

132,455

11,652

22,076

0,613

35,997 0,0000

Total 25 144,107

R = 0,92

Baseado na análise de variância, conforme resultados apresentados na

Tabela 4.1 O, verifica-se que os coeficientes do modelo são significativos em

nível de 5% de probabilidade, proporcionando um coeficiente de determinação

R2=0,92.

59

Os resíduos para o modelo quadrático determinado estão aleatoriamente

distribuídos em torno do valor zero e da média dos resultados calculados pelo

modelo (Figura 4.4), demonstrando que não existe nenhuma tendência no

modelo. Isto sugere que o coeficiente de determinação de 0,92 para o modelo

proposto explica 92% da variância dos ensaios, e o percentual não-explicado

está relacionado com o erro puro dos experimentos, ou seja, é devido a erros de

metodologia da própria análise (BARROS NETO et ai., 1995).

A análise de variância da regressão e o coeficiente de determinação do

modelo, R2 = 0,92 , mostrada na Tabela 4.1 O, revelam que o modelo matemático

é significativo para representar a produção de xilitol em frascos agitados e pode

ser expresso pela equação ( 4.1 ):

em que:

Y é a concentração de xilitol em g/L prevista pelo modelo,

X1 e ~ são o sulfato de amônia e a concentração de xilose no hidrolisado, respectivamente.

1.8 . .... - - - ·- - : - ; ·--~-- . . . . . . . .

o.a .,, o ::, o 0.3 a, l&J a:

-o.e

-0.7

-1.2

1.3

: o . . . ······· ··-··· ..!. P. .; ) --(

. . . .

·····O·. . . . ....... -- .. -·· .. - - ,. . . . . . . . . .

60

30

Figura 4.4 - Distribuição dos resíduos para o modelo quadrático Y que representa a produção de xilitol por C. guilliermondií FTI 20037 em hidrolisado de eucalipto.

o

. éº . . o: : : : : .Po : : ·:. -- ····:· - .. ·····: ····:·o· -:· ·:· ·:· . . o . . . o: o . : : . : : ;

.;.Q ;--·······ó·········'.·· ;.·-·······!··········;· . o : . o : : . : . o 1 ! : ; : . .

o . : . : D . : - -~ ··: - ., . . . . - ·: · : . ; : o o Q . : o

: . o : ..:. - : - : -: ·: : -:··

o 5 10 15 20

ENSAIOS

61

Através da derivada parcial da equação do modelo em relação as

variáveis, verifica-se que o valor máximo de produção de xilitol é obtido em

sulfato de amônio e concentração de xilose no hidrolisado de -0,9 e 1,97, que

correspondem a 1, 1 g/L [SA] e 60,0 g/L [CO], respectivamente.

Esse modelo estima uma produção máxima de 8,343 g/L de xilitol, que

pode ser visto nas curvas de nível (Figura 4.5) e na superfície de resposta do

modelo (Figura 4.6) para frascos agitados utilizando 5 g/L de farelo de arroz

após 72 h de fermentação. O modelo indicou que melhores resultados poderia

ser obtidos com o aumento da concentração de xilose no hidrolisado. No

entanto, com o aumento da concentração do hidrolisado de cinco e seis vezes

maior que a original foi constatado perda de açúcar e volume após a operação

do tratamento.

2.,..........,.............,.... .......... ..,.... ........... ....,,..... ..................... ...,,...~~ ............ ~~~ .......... "='""J

1.8 1.6 1.4 1.2

1 0.8 0.6

[CO] 0.4 0.2

o -0.2 -0.4 -0.6 -0.8

- 2.092 - 2.509 - 2.926 - 3.342 - 3.759 - 4.176

4.593 5.009 5.426

--· 5.843 - 6.260 - 6.676 - 7.093

7.510 7.927

-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 O 0.2 0.4 0.6 0.8 1 - 8.343

[SA]

Figura 4.5 - Curvas de nível descritas pelo modelo quadrático para produção de

xilitol por C. guilliermondii FTI 20037 em hidrolisado hemicelulósico

de eucalipto.

62

- 2.089 - 2.506 - 2.923 - 3.340 - 3.757 - 4.174 m 4.591 D 5.008 l'B 5.425 tE 5.842 111111 6.259 - 6.675 - 7.092 - 7.509 - 7.926 - 8.343

Figura 4.6 - Superfície de resposta descrita pelo modelo quadrático para

produção de xilitol por C. guilliermondii FTI 20037 em hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto.

63

Na Tabela 4.11 pode ser visto uma outra maneira de confirmar o

modelo, mostra uma comparação entre os valores de produção de xilitol em

g/L obtidos experimentalmente (Yo) e os previstos pelo modelo (Yp).

Comparando-se os valores residuais com a variância do erro S/ (=3,41) nota-

se que nenhum dos resíduos individuais excede a 2 vezes a raiz quadrada da

variância dos resíduos (SEN, 1997). Isto confirma uma boa adequação do

modelo de regressão.

Tabela 4.11 - Valores da concentração de xilitol em g/L observados experimentalmente e previstos pelo modelo.

Número de observações

Valores obtidos (Yo)

Valores previstos (Yp)

Residual (Yo - Ye)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

0,65 0,56 0,71 1,66 5,06 2,50 2,93 2,63 0,09 0,00 0,53 0,00 7,61 5,32 6,82 5,56 6,45 2,64 4,54 3,02 0,37 3,99 0,86 6,43 1,80 2,04

0,80 0,84 1, 10 0,94 4,65 2,05 3,90 1,83 -0,05 0,23 0,50 0,31 7,40 6,12 7,62 5,30 4,93 3,23 3,20 2,88 -0,01 3,65 2,00 5,99 2,63 2,70

-0, 15 -0,28 -0,39 0,71 0,41 0,45 -0,97 0,80 0,14 -0,23 0,03 -0,31 0,20 -0,80 -0,80 0,26 1,52 -0,59 1,34 0,14 0,38 0,33 -1, 14 0,44 -0,83 -0,66

64

Após as condições ótimas terem sido identificadas pela derivada do

modelo, realizaram-se novos ensaios para a validação do modelo. O

experimento para a confirmação do modelo proposto foi realizado

empregando-se um meio suplementado com 1, 1 g/L de sulfato de amônia

(correspondendo ao nível -0,9), 5,0 g/L de farelo de arroz (correspondendo ao

nível -1,0), concentração do hidrolisado três vezes maior que a do original

(correspondendo ao nível +1,97), pH ajustado para 8,0 (correspondendo ao

nível +1,0). Estes níveis foram encontrados, visando maximizar os resultados

através da superfície de resposta obtida para o modelo: Para estes níveis das

variáveis, a resposta produção de xilitol foi prevista em 8,34 g/L (Figura 4.5 e

4.6). O resultado experimental obtido em xilitol foi 1 O g/L, não apresentando

diferenças significativas entre o valor previsto e o experimental, considerando-

se o desvio padrão. Desta forma, o modelo proposto pode ser considerado

adequado e representativo do processo de produção de xilitol por C.

guil/íermondii em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, em frascos agitados.

65

4.3 - Ensaios em Fermentador de Bancada

Os ensaios em fermentador de bancada foram realizados a fim de

verificar o comportamento da fermentação do hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto por C. guilliermondii para as condições do modelo obtido para frascos

agitados. Empregou-se um volume de meio 1 O vezes maior que o utilizado em .

frascos Erlenmeyer, permitindo um melhor acompanhamento do processo

fermentativo.

O tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto foi o mesmo

empregado para a fermentação em frascos agitados, conforme item 3.1.3. A

composição do meio foi a obtida no modelo para frascos agitados, com 1, 1 g/L

sulfato de amônio, 5,0 g/L farelo de arroz, 60 g/L de xilose no hidrolisado, e pH

ajustado para 8,0 com NaOH 5N. Empregou-se um inóculo de 3 g/L. A

agitação e a aeração foram de 300 rpm e 0,6 wm, respectivamente (valores

baseados em trabalhos já conduzidos anteriormente por FELIPE (1994), e por

ALVES (1997). Com essa aeração foi obtido um KLa de 4,72 n:'. Nestas

condições de fermentação, os resultados obtidos estão apresentados na

Figura 4. 7, na qual nota-se uma baixa produção de xilitol. Após 72h de

fermentação verifica-se uma produção de 4,85 g/L de xilitol (valor abaixo do

previsto pelo modelo), sobra de açúcar no meio e ainda constata-se que não

houve crescimento celular. Com base nesses resultados obtidos, sabendo que

a produção de xilitol está associada ao crescimento conforme constatado por

ROBERTO ( 1997) no cultivo de C. guil/iermondii em hidrolisado de palha de

arroz e também sabendo da literatura que fermentadores requerem menores

níveis de concentrações celulares comparados a Shaker, pois a agitação e

aeração presentes nos fermentadores proporcionam maior oxigenação do meio

favorecendo o crescimento celular, foi decidido realizar uma outra fermentação

66

utilizando uma menor concentração de células no inóculo, acreditando que

com uma menor população de células, aumentaria a disponibilidade de

oxigênio no meio favorecendo o crescimento celular. A aeração e agitação

permneceram como do ensaio anterior. Assim, foi realizado novo experimento

em Fermentador de bancada com uma concentração de 1,5 g/L de células de

inóculo.

De fato com uma menor concentração de células no inóculo o consumo

de xilose pela levedura C. guilliermondii foi favorecido, também verificado por

ROBERTO et ai. (1996a) em hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz. Na

Figura 4.8 estão apresentadas as concentrações de xilose, de células e de

xilitol, para 1,5 g/L de células de C. guilliermondii FTI 20037. Nesta condição

de fermentação, após 72 h verifica-se um consumo de 95% de xilose, um

crescimento celular de 9,4 g/L e uma produção de xilitol de 25,4 g/L. A Tabela

4.12 mostra que os parâmetros rendimento, produtividade e eficiência de

conversão aumentaram de O, 19 gxilitol/gxilose; 0,07 g/Lh; 21,0 % para 0,36

gxilitol/gxilose; 0,35 g/Lh; 38,9 %, respectivamente com a redução da

concentração de células no inóculo de 3,0 para 1,5 g/L.

Ainda para estas condições foram determinadas as velocidades

específicas de crescimento, de consumo de xilose e formação de xilitol. A

variação das velocidades específicas de crescimento (µx), consumo de xilose

(q8) e formação de xilitol (qp) em função do tempo estão mostradas na Figura

4.9. Observa-se que a máxima velocidade específica de consumo de xilose (qs)

foi de 0,36 g/g.h. Para o crescimento celular (µx) a máxima velocidade

específica foi de 0,032 n', obtida na fase inicial da fermentação,

provavelmente devido à rápida utilização de glicose. Nota-se o decréscimo

desta de 0,015 h" em 42 e 48 h, aumentando novamente até 0,023 h"1 no final

da fermentação. ROBERTO (1997), observou em fermentação com palha de

arroz, a mesma velocidade inicial específica de 0,032 h"1 , no entanto decorrido

67

o período de 1 O h, já completamente esgotada a glicose do meio e no início do

consumo de xilose, a velocidade específica de crescimento diminuiu para 0,05

h-1. No caso da formação de xilitol ( qp), no nosso trabalho foi de O, 11 g xilitol/g

xilose.h, similar a encontrada por ROBERTO (1997) em hidrolisado de palha

de arroz (O, 12 g xilitol/g xilose. h), utilizando a mesma levedura.

Uma outra explicação para os baixos resultados, além do grau de

inóculo, seria a taxa de oxigênio fornecida ao processo. Para frascos agitados

não sabemos a aeração utilizada, já em fermentador de bancada foi adotado a

condição de 0,6 vvm, com agitação de 300 rpm, o que correspondeu a um KLa

de 4,72 h'. Segundo SREENATH et ai. (1986), em estudos realizados com C.

shehatae, em condições estritamente anaeróbicas esta levedura foi capaz de

consumir xilose, no entanto, na presença de oxigênio, tanto o crescimento

celular quanto o consumo de xilose foram favorecidos. Esses autores sugerem

que o açúcar residual verificado nas fermentações conduzidas na ausência de

oxigênio ou mesmo com insuficiente nível de oxigênio, pode ser atribuído a

inibição de um sistema de transporte ativo.

68

60 \ •••••• ,· 5

•••• 50 ,• <, ,· ~ ·-·=·· " 4 ~ 40 / ~·····=·=·····\ e• CD -

i ... • ... ... 8 / ~ 3 ~

!30 t ••. @ >< /. • ~ 2 D) ~ ã

/

• ,e 10

o o O 12 24 36 48 60 72 84 96

Tempo (h)

Figura 4.7- Consumo de xilose (•), concentração celular(•), produção de xilitol

( •) na fermentação em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, em

fermentador de bancada, à 300 rpm, 30 ºC, KLa = 4,72 n:' e 3 g/L

de células de C. guilliermondii FTI 20037.

60

- ,:::! 40 .9 Q) C/) o "5( 20

o 20 40 60

Tempo (h)

69

25

20

o

Figura 4.8 - Consumo de xilose (• ), concentração celular ( • ), produção

de xilitol (A) durante fermentação em hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto, em Fermentador de Bancada,

à 300 rpm, 30 ºC, KLa = 4, 72 h-1 e 1,5 g/L de células de e. guilliermondii FTI 20037.

70

......... s: 0,30 ,!2> C) -e. 0,25 O" (1) z 0,20

,!2> ,9 0,15

r/)

O" .....:;. 0,10

'.e: - =,)( 0,05

O,CJ0-+-.......-.......--.---.---.---.---.---.---.---.---.--.-- 0 12 24 36 48 60 72

Tempo (h)

0,35

Figura 4.9 - Velocidades específicas de consumo de xilose, q5 (•), de

crescimento celular, µx (•) e de formação de xilitol, qp (.6.)

durante fermentação em hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto, em Fermentador de Bancada, à 300 rpm,

30 ºC, KLa = 4,72 h-1 e 1,5 g/L de células de e. guil/iermondii FTI 20037.

71

Tabela 4.12- Comparação entre os resultados referentes as fermentações em

"Shaker'' e em Fermentador de Bancada - Multigen, utilizando os

fatores nos níveis determinados pelo modelo.

Shaker Multigen Multigen

(200 rpm, 30 ºC) (300 rpm, 30 ºC, (300 rpm, 30 ºC,

KLa=4,72 h') KLa= 4,72 h-1)

concentração inicial

de células no 3,0 g/L 3,0 g/L 1,5 g/L

lnóculo (2,5.108 cel/mL) (2,8.108 cel/mL) (1,9.108 cel/ml)

72

5. CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

• Os resultados do presente trabalho permitem concluir que o

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto pode ser empregado para a obtenção

de xilitol por via biotecnológica e sugerem que a produção de xilitol está

associada ao crescimento.

• Através da metodologia estatística utilizada foi possível estabelecer

um modelo matemático para a produção de xilitol em frascos agitados dado

pela equação: Y = 3,53 - 0,98 X1 + 1,62 ~ 1,01X/, em que: Y é a

concentração de xilitol em g/L prevista pelo modelo, X1 e X3 são o sulfato de

amônia e a concentração de xilose no hidrolisado, respectivamente. Este

modelo mostrou-se adequado, uma vez que a concentração de xilitol obtida

experimentalmente ficou próxima do valor teórico previsto pelo mesmo.

• A maior produção de xilitol obtida foi de 1 O, 1 g/L, resultando em um

fator de rendimento de 0,21 g/g e uma produtividade de 0,09 g/L.h, para

frascos agitados. Em fermentador de bancada conseguimos melhorar a

produção de xilitol para. 25,4 g/L, o que corresponde a um rendimento e

produtividade de 0,36 g/g e 0,35 g/L.h, respectivamente.

• É necessário dar continuidade ao estudo fazendo uma análise e

caracterização dos compostos fenólicos presentes no hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto, para assim, estabelecer um tratamento adequado

para a retirada dos inibidores do metabolismo microbiano

73

• São importante os estudos detalhados em fermentadores de bancada

para avaliação dos parâmetros nível de inóculo e coeficiente volumétrico de

transferência de oxigênio (Kt.a) no cultivo da levedura C. guilliermondii em

hidrolisado de eucalipto, para se poder traçar um perfil mais completo da

cinética do processo.

• Atualmente muitos trabalhos estão sendo desenvolvidos visando a

separação e posterior purificação do xilitol do meio fermentado. Alguns

métodos já estão sendo listados como mais apropriados, para separação: os

métodos cromatográficos e para purificação: cristalização, uso de resinas de

troca iônica, etc.

74

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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89

7. APÊNDICE

90

• RESULTADOS DAS FERMENTAÇÕES CONDUZIDAS EM FRASCOS AGITADOS:

Tabela 1A - Variação da concentração de açúcares na fermentação do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guilliermondíí FTI 20037 no planejamento fatorial fracionário 26·2 , considerando a média.

ensaios glicose xilose arabinose

início final início final início final

1 2,83 2,31 15,64 14,65 0,47 0,34

2 6,63 6,42 50,38 47,80 1,44 1, 18

3 6,71 6,17 50,33 47,49 1,22 1,04

4 2,55 2,38 15,34 13,52 0,53 0,38

5 6,48 6,44 47,79 44,18 1,23 1,02

6 2,58 15,35 7,93 0,33 0,25

7 2,56 2, 11 14,69 10,88 0,45 0,23

8 6,59 5,65 44,60 39,84 1,27 1, 13

9 2,01 15, 17 0,23 0,41

10 7,49 48,63 5,56 1,30 1,04

11 6,59 0,22 45,92 6,97 1,04 0,82

12 1,96 14,05 0,44 0,39

13 6,53 48,08 6,14 1,32 1, 19

14 1,98 0,10 13,60 .0,40 0,48

15 1,94 14,56 0,10 0,35 0, 11

16 5,65 45,50 2,15 1,24 0,91

91

Tabela 2A - Consumo de xilose e de ácido acético e produção de xilitol e de células e variação do pH, durante a fermentação do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guilliermondii, no planejamento fatorial fracionário 26-2, considerando a média.

ensaios consumo de consumo de xilitol (g/L) células x 108 pH final

xilose [%] ác. acético [%] (cels/ml)

1 6,33 11,07 0,65 2,88 3,76

2 5, 12 0,50 4,58 3,62

3 5,64 4,95 0,09 1,72 3,48

4 11,86 15,24 0,56 1,53 3,73

5 7,55 9,45 0,53 1,63 3,56

6 48,34 10,44 1,66 2,03 3,99

7 25,94 0,71 2,36 3,88

8 10,67 12,69 4,96 3,64

9 98,48 38,89 5,06 3,73 7,75

10 88,57 0,93 5,32 2,13 5,28

11 84,82 19, 12 7,61 2,15 5,20

12 100 54,53 2,50 2,71 8,01

13 87,23 13,33 6,82 2,52 5,34

14 97,06 2,12 2,63 3,27 7,85

15 99,31 100 2,93 3,55 7,75

16 95,27 5,56 2,33 5,35

.. ·-··~----/

92

Tabela 3A - Análise de variância para os efeitos estimados no planejamento fatorial fracionário 26-2 com repetição.

Efeito SQ GL MQ F p

[SA] 3,422 1 3,422 10,81 0,004

[CA] 0,427 1 0,427 1,35 0,261

[FA] 0,079 1 0,079 0,25 0,629

[pH] 148,838 1 148,838 470, 17 0,000

[CO] 16,903 1 16,903 53,40 0,000

[T] 0,016 1 0,016 0,05 0,828

[SA][CA]+[FA][CO] 0,032 1 0,032 0,10 0,758

[SA][FA]+[CA][CO] 2,010 1 2,010 6,35 0,022

[SA][pH]+[CO][T] 5,613 1 5,613 17,73 0,001

[SA][CO]+[CA][FA]+[pH][T] 0,587 1 0,587 1,85 O, 191

[SA][T]+[pH][CO] 25,590 1 25,590 80,84 0,000

[CA][pH)+[FA][T] 0,055 1 0,055 0,17 0,687

[CA][T]+[FA][pH] 0,142 1 0,142 0,45 0,518

Bloco 0,011 1 0,011 0,04 0,854

Erro total 5,382 17 0,316

Total 208, 117 31

R2 = 0,97; GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrática; MQ = média quadrática

93

Tabela 4A - Análise de variância para os efeitos dos fatores do planejamento fatorial 24 completo com repetição

Efeito SQ GL MQ F p

[SA] 4,014 1 4,014 10,58 0,004

[FA] 0,010 1 0,010 0,03 0,874

[pH] 133,727 1 133,727 352,48 0,000

[CO] 15,076 1 15,076 39,74 0,000

[SA][FA] 2,881 1 2,881 7,59 0,012

[SA][pH] 6,405 1 6,405 16,88 0,000

[SA][CO] 1, 188 1 1, 188 3,13 0,0921

[FA][pH] 0,223 1 0,223 0,59 0,461

[FA][T] 0,000 1 0,000 0,00 0,993

[pH][CO] 25,696 1 25,696 67,73 0,000

Bloco 0,014 1 0,014 0,04 0,851

Erro total 7,588 20 0,379 -- - - Total 208, 117 31

R2 = 0,96; GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrática; MQ = média quadrática

-··-'

94

Tabela 5A - Análise de variância para os efeitos estimados no planejamento fatorial 24 com duplicata no ponto central com repetição.

Efeito SQ GL MO F p

[SA] 3,954 1 3,954 5,97 0,022

[FA] 0,010 1 0,010 0,02 0,903

[pH] 125,718 1 125,718 189,74 0,000

[CO] 19,262 1 19,262 29,07 0,000

[SA][FA] 2,929 1 2,929 4,42 0,046

[SA][pH] 6,405 1 6,405 9,67 0,005

[SA][CO] 1,265 1 1,265 1,91 0,180

[FA][pH] 0,416 1 0,416 . 0,63 0,444

[FA][CO] 0,000 1 0,000 0,00 0,996

[pH][CO] 29,803 1 29,803 44,98 0,000

Bloco 0,136 1 0,136 0,20 0,660

Erro total 15,902 24 0,663

Total 35

R2 = 0,92 , GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrática; MQ = média quadrática

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Tabela 6A - Variação da concentração de açúcares na fermentação do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto por C. guílliermondii para o planejamento fatorial 24 face centrada com duplicata no ponto central, considerando a média.

ensaios ~li cose xilose arabinose início final início final início final

1 2,83 2,31 15,64 14,64 0,47 0,34 2 2,55 2,38 15,34 13,52 0,53 0,38 3 2,56 2, 11 14,69 10,88 0,45 0,23 4 2,58 15,35 7,93 0,33 0,25 5 2,01 15, 17 0,23 0,41 6 1,96 14,05 0,44 0,39 7 1,94 14,56 0,10 0,35 0, 11 8 1,98 0,10 13,60 0,40 0,48 9 6,71 6,17 50,33 47,49 1,22 1,04 10 6,63 6,42 50,38 47,80 1,44 1, 18 11 6,48 6,44 47,79 44,18 1,23 1,02 12 6,59 5,65 44,60 39,84 1,27 1, 13 13 6,59 0,22 45,92 6,97 1,04 0,82 14 7,49 48,63 5,56 1,30 1,04 15 6,53 48,08 6,14 1,32 1, 19 16 5,65 45,50 2,15 1,24 0,91 17 2,59 27,85 0,37 0,41 0,30 18 2,41 27,99 0,94 0,45 0,40 19 2,44 27,64 0,75 0,44 0,42 20 2,50 26,87 0,82 0,45 0,40 21 2,33 0,74 31, 18 27,64 0,49 0,41 22 2,67 0,16 30,41 0,96 0,48 0,39 23 1,30 14,86 0,22 0,45 0,22 24 4,90 0,25 59,83 35,82 0,76 0,80 25 3,34 22,97 0,45 0,24 26 2,36 18,38 0,45 0,10

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Tabela 7A - Consumo de xilose e ácido acético, produção de xilitol e células e variação do pH, durante o cultivo de C. guilliermondíí em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para o planejamento fatorial 24 face centrada com duplicata no ponto central, considerando a média.

ensaios consumo de consumo de xilose (%) ác. acético

(%)

xilitol (g/L)

células x 108

(cels/ml)

pH final

1 6,33 11,07 2 11,86 15,24 3 25,94 4 48,34 10,44 5 98,48 38,89 6 100 54,53 7 99,31 100 8 97,06 2, 12 9 5,64 4,95 10 5,12 0,50 11 7,55 9,45 12 10,67 12,69 13 84,82 19,12 14 97,06 2,12 15 87,23 13,33 16 95,27 17 98,67 43,14 18 96,64 26,49 19 97,28 11,72 20 96,95 3,82 21 11,35 26,33 22 96,84 21,55 23 98,52 23,33 24 40, 13 12,44 25 100 25,60 26 100 43,51

0,65 0,56 0,71 1,66 5,06 2,50 2,93 2,63 0,09

0,53

7,61 2,63 6,82 5,56 6,45 2,64 4,54 3,02 0,37 3,99 0,86 6,43

1,8 2,0

2,88 1,53 2,36 2,03 3,73 2,71 3,55 3,27 1,72 4,58. 1,63 4,96 2,15 3,27 2,52 2,33 6,0 6,0 2,3 3,0 2, 1 3,6 3,9 2,7 4,1 3,6

3,76 3,73 3,88 3,99 7,75 8,01 7,75 7,85 3,48 3,62 3,56 3,64 5,20 7,85 5,34 5,35 7,30 5,07 4,96 4,93 3,78 5,02 5,17 5,12 5,39 7,72

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• RESULTADOS DAS FERMENTAÇÕES CONDUZIDAS EM FERMENTADOR DE BANCADA:

Tabela 8A - Parâmetros cinéticos do cultivo de C. guilliermondii FTI 20037 em hidrolisado hemicelulósico de eucalipto em Fermentador de Bancada, à 300 rpm, 30 ºC, KLa= 4, 72 h-1, com 1 ,5 g/L de inóculo inicial.

T s X p dX/dt dS/dt dP/dt n (*) (*) µX qs qp

(h) (g/L) (g/L) (g/L) (') (") (") (h-1) (g/g.h) (g/g.h)

o 74,0 1 ,57 o 0,076 -0,833 0,075 0,048 0,531 0,048

12 64,0 2,48 0,9 0,080 -0,892 0,124 0,032 0,360 0,050

24 52,5 3,50 3,0 0,095 -0,930 0,224 0,027 0,266 0,064

30 47,0 4,10 4,5 0,104 -0,957 0,291 0,025 0,233 0,071

36 41,0 4,75 6,5 0,092 -1,000 0,374 0,019 0,211 0,079

42 35,0 5,20 9,0 0,079 -1,000 0,457 0,015 0,192 0,088

48 29,0 5,70 12,0 0,083 -0,910 0,577 0,015 0,160 0,101

54 24,0 6,20 16,0 0,108 -1,023 0,707 0,017 0,165 O, 114 ·-

60 16,0 7,00 20,5 0,161 -1, 140 0,611 0,023 0,163 0,087 - ~-,..,

66 10,0 8,13 23,5 0,200 -1,000 0,365 0,025 0,123 0,045

72 4,0 9,40 25,0 0,212 -1 ,000 0,250 0,023 0,106 0,027

(*) valores obtidos pelo Programa VELOCESP, em que: dX/dt, dS/dt e dP/dt são velocidades instantâneas e µx, q, e q, são velocidades específicas, calculadas pelo Método de Le Duy e Zajic.

aproveitamento do hidrolisado hemicelulÓsico de...

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