Apresentação:Tainá Coelho,Vanessa Pfeilsticker(Internato em Pediatria, 6ª Série)Coordenação: Paulo R Margotto

www.paulomargotto.com.br

Uso empírico precoce de antibiótico nos recém-nascidos pré-termos associa-secom menor diversidade bacteriana e maior abundância relativa de Enterobacter

Introdução• Os antibióticos são os medicamentos administrados mais

comumente prescritos para crianças em Unidades Neonatais de Terapia Intensiva¹.

• Mesmo sendo baixa a incidência de sepse precoce, os recém-nascidos (RN) pré-pré-termos recebem antibioticoterapia empírica nos primeiros dias de vida quando se suspeita de infecção2,3.

• Apesar do uso de antibioticoterapia empírica em recém-nascidos pré- termos (RNPT) ser indicado na suspeita de sepse precoce, infecção intrauterina oculta que precipitou trabalho de parto prematuro, rotura prematura de membranas ovulares e corioamnionite, o seu uso parece ser prudente, mas no entanto, a duração do tratamento é na grande maioria das vezes arbitrária e baseada na percepção clínica4,5.

Introdução• Quando se inicia a antibioticoterapia empírica, muitos clínicas usam-

na por 2 dias. mas no entanto, tem sido prolongado por 5 dias ou mais frente a fatores, como rotura prolongada de membrana, corioamnionite, necessidade de reanimação, desconforto respiratório e intolerância alimentar

• Infelizmente, a antibioticoterapia empírica precoce tem potencial para causar danos assim como benefícios para os RNPT, por impedir a colonização microbiana inicial6,7.

• Nestes RN prematuros, a colonização microbiana consiste em menos espécies benéficas, pouca diversidade bacteriana e mais patógenos do que os observados nos RN a termo saudáveis8-11.

• Porém não se sabe até que ponto esse fato pode ser atribuído ao alto uso de antibiótico.

Introdução• Apesar do maior entendimento dos microrganismos que

vivem com e dentro do organismo, os estudos sobre RNPT não tentaram avaliar o impacto do uso de antimicrobiano na microbiota intestinal.

• O uso irrestrito de antimicrobianos pode ter consequências persistentes na redução da diversidade dos microrganismos e mesmo após sua suspensão, não é garantida a recuperação total da microbiota saudável12.

• O uso de antibioticoterapia empírica precoce em RNPT está associado a um aumento no risco de desenvolver enterocolite necrosante, sepse e morte13-15.

• Aberrante colonização precoce intestinal pode contribuir para a fisiopatologia da enterocolite necrosante8,11,16.

HIPÓTESE A SER TESTADA

• Os autores testaram a hipótese de que o uso intensivo de antibiótico precoce nos pré-termos altera a ontogenicidade da microbiota e diminui a diversidade microbiana em um estudo longitudinal de colonização intestinal em 74 recém-nascidos pré-termos.

• Amostras seriadas de fezes foram coletadas entre 4-23 dias de vida para testar qualquer diferenças no estabelecimento precoce do microbioma intestinal pelo uso empírico precoce e intensivo de antibiótico

Metodologia

• Foram registradas crianças de 3 UTIN de Cincinnati, Ohio, como parte de um estudo de coorte sobre novos biomarcadores para casos de enterocolite necrosante (ECN), sepse ou morte em RN≤ 32semanas de idade gestacional (IG).

• Nenhuma criança teve ECN, sepse ou óbito na primeira semana de vida e não foram identificadas anomalias congênitas.

Metodologia

• Exposição à antibioticoterapia empírica precoce foi definida como início do antibiótico (ATB) no primerio dia de vida.

• A duração foi determinada com base no total de dias de uso contínuo de ATB com culturas negativas.

• Sepse foi definida de acordo com resultados positivos de hemocultura, cultura de líquor, urocultura ou cultura estéril de sítio.

• A ECN foi baseada nos critérios II ou III de Bell.

Metodologia

• Nessa coorte a antibioticoterapia empírica consistiu no uso de ampicilina e gentamicina, usando- se dose padrão. Foram divididos 3 grupos:

Sem ATB: 0 dias. Uso curto de ATB: 1-4 dias.

Uso prolongado de ATB: 5-7 dias.

Metodologia• Foram coletadas várias amostras de fezes

durante as primeiras três semanas. – 1ªsemana: 4-7 dias.– 2ªsemana: 10-16 dias.– 3ªsemana: 20-23 dias.

• DNA bacteriano foi extraído dessas amostras através de um dos dois métodos:– Fenol- clorofórmio– Kit QiaAmp DNA (Qiagen, Valencia, Califórnia)

• A sequência 16S do DNA ribossomal foi feita pelo Instituto Broad.

Análise Estatística

• Dados sequenciais foram gerados de 256 amostras a partir de 81 crianças.

• Amostras seguidas de ECN e sepse foram excluídas, assim como 5 crianças com apenas 1 semana de coleta de amostras.

• Um total de 74 pacientes com 239 amostras ficaram disponíveis para estudo.

Análise Estatística

• Variáveis categóricas foram testadas pelo teste de Fischer e as contínuas pelo ANOVA. O teste não- paramétrico de Kruskal- Wallis foi usado para comparar diferenças na diversidade entre os grupos.

• Foram usadas as percepções quantitativas do Programa de Ecologia Microbiana para calcular o índice de diversidade de Simpson, que media tanto a riqueza de espécies quanto a regularidade delas.

Análise Estatística• Para considerar as múltiplas amostras por

criança, foram usadas modelos alfa de equações de estimação generalizadas (GEE), para analisar as diferenças entre o índice de Simpson entre as crianças com níveis diferentes do uso de ATB.

• A associação entre uso precoce de ATB e abundância relativa das duas unidades taxonômicas operacionais mais comuns, foi avaliada por um modelo de regressão linear.

• Essa duas unidades foram classificadas como Enterobacter e Staphylococcus.

Resultados

• Das 74 crianças:– 13 (18%) não receberam ATB;– 48 (64%) fizeram uso curto;– 13 (18%) fizeram uso prolongado.

• A duração e início da antibioticoterapia empírica precoce foi determinada a partir da percepção clínica do risco de infecção.

• Na tabela II, as características clínicas e demográficas dos 3 grupos estudados, sendo evidenciadas as diferenças significativas

Resultados

Resultados• Uso prolongado de ATB foi maior na 1ª semana

de vida em 14 crianças que posteriormente desenvolveram ECN ou sepse ou morreram (P=0,04). No entanto, como esses casos ocorreram em RN< 29 semanas de IG, o maior uso de ATB nesse grupo pode confundir os resultados.

• Se analisar apenas o grupo de RN< 29 semanas, o uso de ATB na 1ª semana não diferiu significantemente quando comparado com os controles (P=0,208).

Resultados• 1ª semana de vida:

- Sem ATB: Staphylococcus (41%), Enterococcus (26%), e Enterobacter (19%).

- Curto período de ATB (1-4 dias): Enterobacter (40%), Enterococcus e Staphylococcus.

- Tratamento intensivo com ATB (5-7 dias): Enterococcus (34%), Clostridium (33%), Staphylococcus (11%) e Escherichia (8%).

Figura 1

Resultados• 2ª semana de vida:

- Sem ATB: Enterobacter, seguido por: Staphylococcus, Enterococcus e Escherichia.

- Curto período de ATB: Staphylococcus, Enterococcus e Escherichia.

- Tratamento intensivo com ATB: Enterobacter (57%), Escherichia (21%), Enterococcus (15%) e Staphylococcus (7%) = 90% da microbiota.

Figura 1

Resultados• 3ª semana de vida:- Sem ATB: Enterobacter (36%), Enterococcus (17%),

Clostridia (17%), Veillonella (16%) e Escherichia (11%).

- Curto período de ATB: Enterobacter (48%) e Enterococcus

(16%) gêneros mais comuns, seguidos por: Escherichia(13%), Clostridia (9%) e Veillonella (7%).

- Tratamento intensivo com ATB: gênero mais comum: Enterobacter (47%), seguido por: Enterococcus (35%).

Figura 1

Resultados

Qual seria a importância estatística dessa mudança na microbiota intestinal pós-

antibioticoterapia precoce?

-Quantificar a associação entre a exposição precoce aos ATB e a abundância relativa dos dois maiores grupos de unidade taxonômica (Enterobacter e Staphylococcus).

Resultados• Enterobacter:

- Aumentou significativamente com o uso de ATB empírico na semana 2 (com exposição intensiva a ATB – P=.016 e curto período de ATB – P=.006).

- Entretanto, não houve aumento significativo na semana 3 pós-natal com exposição intensiva a ATB durante a primeira semana.

• Staphylococcus:

- O uso intensivo de ATB na primeira semana mostrou relação apenas com a diminuição relativa de Staphylococcus na semana 2 (P<0.001), mas não na semana 3.

- Uso de ATB por curto período foi associado com aumento relativo de Staphylococcus na semana 3.

Discussão

• Os dados do presente estudo sustentam a hipótese de que o uso intensivo e precoce de ATB no RN pré-termo está associado com importante alteração na microbiota intestinal e potencializa os riscos de Enterocolite Necrosante, Sepse ou Morte.

• A REDUÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA PERSISTIU POR MAIS DE 3 SEMANAS, com o uso intensivo de antibióticos

Discussão• O uso intensivo de ATB cursa principalmente com aumento

relativo de Enterobacter.• Por ser um estudo pequeno, pode haver viés de

confundimento (principalmente pela diferença entre casos-controle e fatores como a IG).

• Entretanto, estes achados são consistentes quando comparados a grandes estudos realizados previamente13-15.

• Em um estudo de caso e controle de 20 pré-termos com e sem ECN, Wang et al8 demonstraram pronunciada baixa diversidade bacteriana nos RN que desenvolveram ECN, com aumento de proteobactéria próximo ao dia da ocorrência da ECN.

• Achados semelhantes ocorreram nos estudos de Morrow Al et al16 e Walsh MC et al17.

Discussão• O uso de ATB seleciona Enterobacter muitas vezes patogênicas e resistentes a

beta-lactamase27.• O aumento de Enterobacter devido a antibioticoterapia pode ocorrer através de

mecanismos alternativos, notavelmente pela modificação de imunidade inata.• Bebês que receberam ATB por curto período, tiveram padrão de alteração na

microbiota (SUPRIMIRAM A DIVERSIDADE DA MICROBIOTA TEMPORARIAMENTE|), mas na 3ª semana, voltaram a diversidade inicial (ao contrário dos que fizeram o uso de ATB por mais de 5 dias).

• Os RN que não receberam antibióticos tiveram um aumento da diversidade da microbiota, como relatado por outros autores33.

• Uso intensivo de ATB foi bastante significativo em crianças que evoluíram com ECN, sepse ou morte13-14.

• Especula-se que o mecanismo subjacente desta associação esteja relacionado á morte de bactérias comensais, resultando no crescimento de bactérias patogênicas. É neste mecanismo que se baseam os estudos com probióticos na proteção da ECN34-35.

Discussão• Outros fatores importantes para a composição da microbiota

intestinal: tipo de parto e tipo de alimentação (neste presente estudo, mais de 90% dos RN receberam leite humano da própria mãe ou pasteurizado, iniciado no segundo dia de vida, alcançando nutrição enteral plena por volta de 2 semanas37).Assim, o viés da alimentação não interferiu no presente estudo (foi seguido protocolo de alimentação e a grande maioria recebeu leite materno).

• Entre as limitações: infrequente defecação precoce nos pré-termos nos primeiros dias de vida, com obtenção de poucas amostras, podendo não captar totalmente o efeito na microbiotas; baixa incidência de ECN, sepse e morte

Discussão

• A duração da antibioticoterapia empírica de ampicilina + gentamicina em RN pré-termo tem correlação com a redução da diversidade da microbiota intestinal que continuou através da 3ª semana do estudo

• Antibioticoterapia intensiva disbiose precede ou precipita ECN, sepse e morte.

Nota do Editor do site, Dr. Paulo R. Margotto

Estudando juntos! Aqui e Agora!

• MicrobiotaMicrobiota (flora gastrintestinal): população de (flora gastrintestinal): população de organismos microscópicos que habitam um órgão do organismos microscópicos que habitam um órgão do corpo ou parte de uma pessoa.corpo ou parte de uma pessoa.

• MicrobiomaMicrobioma: única população inteira de : única população inteira de microrganismos e seus elementos genéticos microrganismos e seus elementos genéticos completo que habitam o corpo de uma pessoa.completo que habitam o corpo de uma pessoa.

Adulto: 1 trilhão de bactérias no intestino Adulto: 1 trilhão de bactérias no intestino (10 a 100 vezes que as próprias células humanas)(10 a 100 vezes que as próprias células humanas)

Ao nascimento: trato gastrintestinal é estérilAo nascimento: trato gastrintestinal é estéril

Microbiota intestinal e o uso de probióticos:perspectivas futuras (I Seminário de Controle de Infecção em Neonatologia, 6 de maio de

2014)Autor(es): Paulo R. Margotto

Maioria: Bidifobacteria, Enterobacteria, Clostridia, Lactobacilo, Enterococo (mais de 1000 diferentes espécies de bactérias)

Vandenplas Y et al,2011;Sdepaniun V, 2012

Efeitos significativos sobre a microbiota intestinalEfeitos significativos sobre a microbiota intestinal

• Composição difere entre alimentados ao seioComposição difere entre alimentados ao seio (mais bifidobacterias) e (mais bifidobacterias) e fórmulafórmula (flora “tipo (flora “tipo adullto”:mais adullto”:mais E.coliE.coli e bacterioide) e bacterioide)

Leite materno:oferece 10Leite materno:oferece 1099 bactérias vivas por litro! bactérias vivas por litro!

• Tipo de partoTipo de parto: cesariana os recém-nascidos não são expostos as floras vaginal e fecal : cesariana os recém-nascidos não são expostos as floras vaginal e fecal maternasmaternas

-atraso na colonização (composta por bactérias anareróbias, como-atraso na colonização (composta por bactérias anareróbias, como EnterobacterEnterobacter -RN cesarianas: mais diabetes tipo 1, asma e alergia-RN cesarianas: mais diabetes tipo 1, asma e alergia

• Pré-termo:Pré-termo: -colonizados por baixo número de bactérias benéficas (bifidobacteria e Lactobacilli).-colonizados por baixo número de bactérias benéficas (bifidobacteria e Lactobacilli). -alto número de bactérias potencialmente patogênicas (Enterobacteria e E.coli).-alto número de bactérias potencialmente patogênicas (Enterobacteria e E.coli). -alto número de espécies de -alto número de espécies de Baterioide,Baterioide, Enterococo e Estreptococo; Enterococo e Estreptococo; ClostridiumClostridium, ,

SthaphylococcuSthaphylococcus e s e KlebsiellaKlebsiella: : UMA FESTA!UMA FESTA!

Microbiota intestinal

Cileborg MS et al (2012); Douglas-Escobar M et, 2013; Vandenplas Y et al,2011;Sdepaniun V, 2012;Neu J, 2010; Mshvildadze,2010

Efeitos significativos sobre a microbiota intestinal: Efeitos significativos sobre a microbiota intestinal:

Uso de antibióticosUso de antibióticos• a ampla utilização prolongada de antibióticosa ampla utilização prolongada de antibióticos pode pode prejudicarprejudicar

importantes eventos de transição necessários para a importantes eventos de transição necessários para a homeostase homeostase intestinalintestinal..

• interação anormal entre o epitélio intestinal e a microbiota luminal interação anormal entre o epitélio intestinal e a microbiota luminal quando a colonização é interrompida com antibióticos de amplo espectro.quando a colonização é interrompida com antibióticos de amplo espectro.

• A ativação dos receptores A ativação dos receptores toll-liketoll-like por bactérias comensais parece ser por bactérias comensais parece ser crítica para a proteção contra lesões do intestino e mortalidade associada.crítica para a proteção contra lesões do intestino e mortalidade associada.

• A A falta de diversidade de espécies bacterianasfalta de diversidade de espécies bacterianas e a e a abundância de abundância de espécies Proteobacteriaespécies Proteobacteria associadas com o uso amplo de antibióticos associadas com o uso amplo de antibióticos

• A falta pode predispor à estimulação inflamatória que pode ajudar a A falta pode predispor à estimulação inflamatória que pode ajudar a explicar a susceptibilidade dos recém-nascidos prematuros a sepse tardia explicar a susceptibilidade dos recém-nascidos prematuros a sepse tardia e a enterocolite necrosante. e a enterocolite necrosante.

Kupala VS, 2011Kupala VS, 2011

Microbiota intestinal

• Cottom et al(2009):Cottom et al(2009):enterocolite necrosante e morteenterocolite necrosante e morte• 4039 RN<1000g4039 RN<1000g

Regressão logística multivariada

-Tempo prolongado de antibióticos altera o desenvolvimento fisiológico e imunológico intestinal enterocolite necrosante

-Redução da flora bacteriana colonização por fungo candidíase neonatal

Antibioticoterapia empírica prolongada (Antibioticoterapia empírica prolongada (≥5dias;culturas ≥5dias;culturas negativasnegativas))

Patel, 2011:50% sem bacteremia provada recebem tratamento para a sepse

(situação diagnostica problemática!)

Microbiota intestinalMicrobiota intestinal

• Alexandre et al (2011):estudo caso-controle (com e sem Alexandre et al (2011):estudo caso-controle (com e sem enterocolite necrosante-ECN)enterocolite necrosante-ECN)

Antibioticoterapia empírica prolongada (Antibioticoterapia empírica prolongada (≥5dias;culturas ≥5dias;culturas negativasnegativas))

Após 1-2 dias de exposição ao antibiótico, o risco de desenvolver ECN aumentou 1,19 vezes e continuou a

aumentar com a exposição adicional ao antibiótico ( 1,43 para 3-4 dias; 1,71 para 5-6 dias; 2,05 para 7-8 dias; 2,45

para 9 a 10 dias e 2,94 acima de 10 dias)Nos RN SEM SEPSE, A exposição ao antibiótico foi um risco significativamente independente para ECN

Microbiota intestinalMicrobiota intestinal

• Kupala VS, 2011:365 RN Kupala VS, 2011:365 RN ≤32sem;≤1500g≤32sem;≤1500g• Regressão logística (controle de IG, peso, rotura prematura de Regressão logística (controle de IG, peso, rotura prematura de

membrana, vent mec, uso de leite materno)membrana, vent mec, uso de leite materno)

Antibioticoterapia empírica prolongada (Antibioticoterapia empírica prolongada (≥5dias;culturas ≥5dias;culturas negativasnegativas))

para cada dia de antibioticoterapia empírica inicial, a odds ratio (OR) para sepse tardia, enterocolite necrosante ou

morte e para sepse tardia, aumentou significativamente.

Microbiota intestinalMicrobiota intestinal

• Dieta precoce com leite humanoDieta precoce com leite humano(Colostroterapia nos RN pré-termos extremos)(Colostroterapia nos RN pré-termos extremos)

• Evitar a Antibioticoterapia prolongadaEvitar a Antibioticoterapia prolongada• Evitar o uso de RanitidinaEvitar o uso de Ranitidina

MICROBIOTA INTESTINAL E ENTEROCOLITE NECROSANTEMICROBIOTA INTESTINAL E ENTEROCOLITE NECROSANTE

Á luz dos conhecimentos, como prevenir

Infecções (OR 5.5; IC a 95%:2.9-10.4, P < 0,001) Sepse, Pneumonia,ITUEnterocolite necrosante (OR 6.6; IC a 95%: 1.7–25.0 Taxa de mortalidade :6 vezes maior

Terrin,G, 2012

O suco gástrico é o maior mecanismo de defesa não imune

Menos ECN:(4.6 vs 14%)(RR:0,3;IC a 95%: 0.13–0.71) Menos ECN/Morte (6,3 vs 15,1%): RR:0,28;IC a 95%:0.13–0.58) Hamilton,2014

Muito mais precisa ser aprendido sobre a flora Muito mais precisa ser aprendido sobre a flora intestinal e suas interações com o intestinal e suas interações com o

desenvolvimento do trato intestinal antes de desenvolvimento do trato intestinal antes de podermos rotineiramente manipular opodermos rotineiramente manipular o

ecossistema microbiano intestinal.ecossistema microbiano intestinal.

Neu J, 2014

OBRIGADO!

Dr. Paulo R. Margotto, Ddas Mônica, Camila, Tainá, Aressa, Vanessa, Nathalia e LaisaEstudantes da Escola Superior de Ciências da Saúde e Universidade Católica de Brasília