UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTACÂMPUS DE JABOTICABAL

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE

unesp

DISCIPLINA – ECOTOXICOLOGIA

6a. Aula – Ensaios de avaliação de toxicidade aguda para organismos

bioindicadores terrestres de contaminação ambiental (minhocas)

Doutoranda Ana Carla Coleone de Carvalho - Assistente de Suporte Acadêmico II

Dr. Joaquim Gonçalves Machado Neto - Prof. Responsável

6A. AULA ECOTOXICOLOGIA

1 - Introdução ecotoxicologia

2 - Bioindicadores terrestres: minhocas

3 - Toxicologia regulamentadora – (Registro)

4 – Testes toxicidade - minhocas

5 - Exemplos

• Termo “Ecotoxicologia” – criado em 1969 pelo Dr. Rene Truhaut;

Ecotoxicologia: estudo dos efeitos adversos de

substâncias químicas com o objetivo de proteger

espécies naturais e populações (TRUHAUT, 1977).

Ensaios ecotoxicológicos: testes que utilizam diferentes tipos de

organismos vivos representativos no ambiente para analisar os efeitos que

substâncias podem ter sobre eles (RUBINGER, 2009).

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS ou BIOENSAIOS:

São realizados para detectar a toxicidade de efluentes, determinar o grau,

ou o efeito biológico, de novos produtos químicos (ex.: produtos

farmacêuticos, etc.) - a cada dia mais lançados no meio ambiente, o que

podem causar nos indivíduos, nas comunidades e populações, para se evitar

as crises epidemiológicas e afins.

ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS: São realizados por métodos de

comparação entre uma substância "genérica" já conhecida e a nova

substância desconhecida, para identificar os efeitos que as mesmas

causam quando inseridas no meio de cultura de células vivas.

Na atualidade, substâncias químicas

desconhecidas são produzidas de forma

intencional ou como subprodutos de determinadas

atividades produtivas e necessitam de análise.

OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.

Agudos: São "estudos experimentais feitos com organismos-

teste que determinam se um efeito adverso observado ocorre em

um curto período de tempo (em geral até 14 dias) após

administração de uma única dose da substância testada ou após

múltiplas dosagem administradas em até 24 horas”.

OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.

Crônicos: “Os organismos-teste são observados durante uma

grande parte do tempo de vida, quando acontece a exposição

ao agente-teste; os efeitos crônicos persistem por um longo

período de tempo, e podem ser evidentes imediatamente após

a exposição ou não”.

IMPORTÂNCIA*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER

UTILIZADOS PARA:

• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes

líquidos;

• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;

• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes

líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).

CL/CE 50

IMPORTÂNCIA*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER

UTILIZADOS PARA:

• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes

líquidos;

• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;

• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes

líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).

CL/CE 50

IMPORTÂNCIA*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER

UTILIZADOS PARA:

• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes

líquidos;

• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;

• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes

líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).

CL/CE 50

IMPORTÂNCIA

• Avaliar a necessidade de tratamento de efluentes líquidos quanto

as exigências de controle ambiental;

• Avaliar a qualidade das águas (complementam a análise físico-

química dos laboratórios);

• Avaliar a sensibilidade relativa de organismos aquáticos;

• Estimar os impactos provocados em acidentes ambientais (ARAGÃO

e ARAÚJO, 2006).

Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos

• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.

•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,

dureza da água, etc.

•Duração do Ensaio

•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi

estáticos, de fluxo continuo).

•Amostragem simples ou composta.

Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos

• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.

•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,

dureza da água, etc.

•Duração do Ensaio

•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi

estáticos, de fluxo continuo).

•Amostragem simples ou composta.

Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos

• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.

•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,

dureza da água, etc.

•Duração do Ensaio

•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi

estáticos, de fluxo continuo).

•Amostragem simples ou composta.

Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos

• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.

•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,

dureza da água, etc.

•Duração do Ensaio

•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi

estáticos, de fluxo continuo).

•Amostragem simples ou composta.

A suscetibilidade está ligada ao aparato metabólico de

cada espécie, mas depende:

Comportamento, alimentação, modo de vida,

fases de desenvolvimento, etc.

IMPORTÂNCIA DAS MINHOCAS PARA O SOLO E VEGETAIS

RESTOS ORGÂNICOS NO SOLO

(ANIMAIS E VEGETAIS)

Nutrientes

Microrg.

úteis

Penetração de

ar no solo

Penetração e

retenção de

água no solo

VEGETAIS

GALERIAS FEZES DETRITÍVORAS - MORTOS

40% a 90% da biomassa de

macrofauna da maioria dos

ecossistemas tropicais (Fragoso et al. 1999)

< Erosão do solo

Homogenização do

solo

FATORES LIMITANTES DO

CRESCIMENTO DAS MINHOCAS

- Umidade

- Matéria Orgânica em decomposição

POPULAÇÃO DE MINHOCAS NOS SOLOS

DE BOA PASTAGEM (MEINICKE, 1993)

- ADULTAS – 800/m2 , Peso = 400 g/m2

- JOVENS – 20.000/m2 , Peso = 26 g/m2

TOXICOLOGIA REGULAMENTADORA – (Registro )

Baseada em dados obtidos em

testes realizados pela toxicologia

descritiva

Responsável pelas decisões sobre um produto químico

Se oferece ou não riscos

ao ser comercializado

dentro de fins específicos

Remédios, cosméticos, aditivos em alimentos, agrotóxicos,

Normas sobre o total permitido no ambiente, nas águas, no

solo

Praticada por agências regulamentadoras nacionais e internacionais

Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA

Art. 4. Para efeito de classificação quanto ao Potencial de Periculosidade

Ambiental (PPA de agrotóxicos), seus componentes e afins o interessado

deverá apresentar a documentação completa conforme estabelecida nos

anexos I, III, IV, V e X

ANEXO IV

PARTE C – CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS

PARTE D – TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO

PARTE E – COMPORTAMENTO NO SOLO

PARTE F – TOXICIDADE PARA ANIMAIS SUPERIORES

PARTE G – POTENCIAL GENOTÓXICO, EMBRIOFETOTÓXICO E CARCINOGÊNICO

D.1 – Microrganismos.

D.2 – Algas.

D.3 – Organismos do solo (minhocas)

D.4 – Abelhas.

D.5 – Microcrustáceos. D.5.1 – Agudo. D.5.2 – Crônico

D.6 -- Peixes. D.6.1 – Agudo. D.6.2 – Crônico.

D.7 – Bioconcentração em peixes.

D.8 – Aves. D.8.1 – Dose única. D.8.2 – Dieta. D.8.3 – Reprodução.

D.9 – Plantas. D.9.1 – Fitotoxicidade para plantas não-alvo

IBAMA (1987) - PARTE D – TOXICIDADE PARA

ORGANISMOS NÃO-ALVO

Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA

Art. 3. A classificação quanto ao Potencial de Periculosidade Ambiental

(PPA) baseia-se nos parâmetros biocumulação, persistência, transporte,

toxicidade a diversos organismos, POTENCIAL MUTAGÊNICO,

TERATOGÊNICO, CARCINOGÊNICO, obedecendo a seguinte graduação:

Classe I – Produto altamente perigoso

Classe II – Produto Muito perigoso

Classe III – Produto Perigoso

Classe IV – Produto Pouco Perigoso

TESTES PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE

AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS

1- TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO (OECD, Protocolo nº 207)

2- TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD, Protocolo nº 207)

3- TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984) (IBAMA, 1987)

4- TESTE COM A UTILIZAÇÃO DE SOLOS (ABNT NBR 15537:2007 2014)

1. TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO

SUBSTRATO TESTE: Papel de filtro qualitativo padrão (WHATMAN nº 180. PESO = 85

mg/m2)

SOLUÇÃO: Água deionizada, concentrações crescentes (mg/cm2), colocar com pipeta

sobre o papel.

SUBSTRATO CONTROLE: Papel + água deionizada.

RECIPIENTE: Frasco de vidro: 8,0 1 cm de altura e de 3 0,5 cm

CONDIÇÕES – Sala climatizada (20 2°C), ESCURO

AVALIAÇÃO DA MORTALIDADE: 48 h de exposição

ESPÉCIE – Eisenia foetida

RESULTADOS: % Mortalidade – CL50 (mg/cm2).

SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA: Cloroacetamida

2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL

SUBSTRATO TESTE: Substrato básico (10% de turfa (pH 6,0), finamente moída; 20%

de caolinita; 69% de areia de quartzo industrial, com + de 50% de part. de 0,05 - 0,2

mm ; e 1% CaCO3 pulverizado)

UMIDADE: Água deionizada (25 - 42% peso. sub. básico)

CONDIÇÕES - Sala Climatizada (20 2°C), CLARO.

ANIMAIS – Adulto e com Clitélo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo

Aclimatados por 24 h no substrato básico

TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente

AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição

SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.

RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)

VANTAGEM – Resultados são usados para se estabelecer as dosagens no teste

de avaliação de toxicidade crônica

3. TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984)

FUNDAMENTO: Exposição de minhocas adultas por 14 dias, em substrato

ARTISOL

SUBSTRATO ARTISOL: 1.425 g de bolas de vidro com 1 - 1,5 cm ; 90 g de sílica

amorfa - sílica gel em pó, impalpável; 215 ml de água destilada com a

concentração da substância dissolvida.

Misturar tudo em um cristalizador de vidro.

Colocar 10 Animais adultos, com clitélo, manter por 14 dias em sala climatizada,

20 2°C, ESCURO.

AVALIAÇÃO: CL(I)50, 14 dias – Conc. Letal Inicial Média.

CONTROLE DE QUALIDADE:

a. < 10% de Mortalidade na testemunha

b. CL(I)50, 14 dias para a CLOROACETAMIDA deve estar

entre: 35 a 160 mg/kg de sílica.

4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL

SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e

areia industrial peneirada (70%)

UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água

CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2°C), fotoperíodo de 12h.

ANIMAIS – Adulto e com Clitelo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo

Aclimatados por 24 h no substrato básico

TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente

AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição

SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.

RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)

4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL

SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e

areia industrial peneirada (70%)

UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água

CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2°C), fotoperíodo de 12h.

ANIMAIS – Adulto e com Clitelo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo

Aclimatados por 24 h no substrato básico

TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente

AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição

SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.

RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)

D.3.1. Toxicidade Aguda para Minhocas - Eisenia foetida

Cloroacetamida

CL(I)50 = 110,06 mg/kg

Controle de Qualidade

IBAMA (Sílica)

35 < CL(I)50 < 160 mg/kg

ICHINOSE,

1992)

CL (I) 50 (mg/kg)Intervalo de confiança

(mg/kg)

110,06 95,48 - 126,95

RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E

RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL

Cloroacetamida

CL(I)50 = 110,06 mg/kg

Controle de Qualidade

IBAMA (Sílica)

35 < CL(I)50 < 160 mg/kg

ICHINOSE,

1992)

CL (I) 50 (mg/kg)Intervalo de confiança

(mg/kg)

110,06 95,48 - 126,95

RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E

RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL

COLEONE, 2014

Benomil

Substrato CL (I) 50 Int. Confiança

Artisol 8,06 c 4,60 – 14,57

Areia 0,58 d 0,31 – 1,21

Latossolo Ver. Escuro 13,06 b 9,26 – 18,54

Latossolo Roxo 10,82 bc 6,42 – 18,67

Litossol 45,40 a 26,73 – 78,77

ICHINOSE, 1992)

Parathion methyl

Substrato CL (I) 50 Int. Confiança

Artisol 73,61 b 52,15 – 109,65

Areia 8,81 d 7,10 – 10,94

Latossolo Ver. Escuro 86,69 b 64,14 – 117,79

Latossolo Roxo 53,59 c 40,54 -- 86,51

Litossol 191,73 a 132,25 – 269,73

ICHINOSE, 1992)

Paraquat

Substrato CL (I) 50 Int. Confiança

Artisol 929,47 b 779,57 – 1.108,88

Areia 207,44 d 157,06 – 274,11

Latossolo Ver. Escuro 783,43 c 658,12 – 934,54

Latossolo Roxo 752,65 c 631,27 – 899,35

Litossol 1.458,80 a 1.316,01 – 1.618,26

ICHINOSE, 1992)

(COLEONE, 2014)

Teste de Fuga – comportamental (Bush et al., 2010)

ISO 17512-1 (2007)

NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)

- 10 organismos;

- 20 ± 4 ºC;

- 500 g;

- 48 h

- A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.

Teste de Fuga – comportamental (Bush et al., 2010)

ISO 17512-1 (2007)

NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)

- 10 organismos;

- 20 ± 4 ºC;

- 500 g;

- 48 h

- A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.

Teste de Fuga – comportamental (Bush et al., 2010)

ISO 17512-1 (2007)

NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)

- 10 organismos;

- 20 ± 4 ºC;

- 500 g;

- 48 h

- A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.

Machado (2016) - Os organismos da espécie Eisenia andrei

demonstraram sensibilidade ao agrotóxico glifosato,

evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta

substância química quando presente no solo, deste modo

podem ser utilizadas para auxiliar no monitoramento

ambiental de áreas contaminadas.

AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE

AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)

TOXICIDADE AGUDA

CL50

Con. Ambiental Estimada

CAE

RELAÇÃO

CL50 : CAE

CL50< 10 x CAE

10 x CAE < CL50< 100 x CAE

CL50 > 100 x CAE

80 < 10 x 10

Testes subletais

Testes de campo

10 x 10 < 500 < 100 x 10

Estudos de efeitos

sobre o peso, etc

2.000 > 100 x 10

Provavelmente

baixo Risco

AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE

AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)

TOXICIDADE AGUDA

CL50

Con. Ambiental Estimada

CAE

RELAÇÃO

CL50 : CAE

CL50< 10 x CAE

10 x CAE < CL50< 100 x CAE

CL50 > 100 x CAE

80 < 10 x 10

Testes subletais

Testes de campo

10 x 10 < 500 < 100 x 10

Estudos de efeitos

sobre o peso, etc

2.000 > 100 x 10

Provavelmente

baixo Risco

Tratamento com água – todos os gravetos de macieira foram

movimentados e uma grande parte carregada, total ou

parcialmente, para dentro do solo.

Tratamento com 0,27% de ethilparathion – redução na

atividade das minhocas: apenas 4 gravetos foram

movimentdos e 2 carregados para dentro do solo.

Tratamento com 0,005% de benomyl – redução na

atividade das minhocas: só 1 graveto foi carregado

para dentro do solo e muitos não movimentados.

Tratamento com 0,025% de benomyl – redução

drástica na atividade das minhocas. Maior efeito que

o ethilparathion em concentração semelhante.

Tratamento sem minhocas – testemunha com apenas o

solo e os gravetos de folhas de macieira.

Efeito de agrotóxicos sobre minhocas, com base na eficiência em remover gravetos da nervura central de folhas de macieira

com 12 horas de exposição no solo.

TESTES DE TOXICIDADE CRÔNICA

SOLO: ARTIFICIAL / ARTISOL / CAMPO

Avaliação de efeitos sobre:

- Crescimento (massa)

- Reprodução - produção de jovens

- Produção de casulos

- Comportamento

- Fisiologia, Morfologia

CONCENTRAÇÕES SUBLETAIS

ISO (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR

STANDARDIZATION), 1998, ISO 11268-2.

Soil quality – Effects of polutants on

earthworms (Eisenia fetida) – Part 2:

determination of effects on reproduction.

Geneva, ISO.

Amostra originada da garagem de ônibus:

- 96% dos organismos fugiram da seçãocontaminada para a seção onde estava osolo controle - amostra é tóxica,apresentando sua função de habitatlimitada.

- A toxicidade foi confirmada pelos ensaiosde letalidade e reprodução.

- 100% mortalidade adultos;- Não houve reprodução.

- Ensaio de comportamento: indicadorrápido da toxicidade da amostra e podeser aplicado como complementação daavaliação de áreas contaminadas.

Ação hormônios Baía Guanabara: - minhocas engordaram 30%.- Não se reproduzem.

Sedimento da Foz do Rio Meriti:- Todas minhocas morreram.- Acumulo de material pesado.

PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos para

minhocas

1 - Pesar 1 kg de substrato: Areia / Solo Argiloso / Solo orgânico em sacos plásticos.

2 - Colocar caldas com agrotóxicos, volume suficiente para manter 80% de

umidade areia e solo orgânico - solo argiloso - * tratamentos

3 - Misturar a calda com o substrato dentro do saco plástico

4 - Colocar 10 minhocas, previamente pesadas, na superfície do substrato

5 - Fechar a “Boca” do saco plástico com arame plastificado

6 - Furar a parte de cima do saco plástico com estilete, para trocas de ar.

PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos

para minhocas

AVALIAÇÃO - 14 DIAS DE EXPOSÇÃO

1 - Abrir os sacos plásticos e despejar o substrato sobre uma folha de

jornal

2 - Procurar e separar as minhocas vivas – contar

3 - Pesar as minhocas vivas encontradas em cada saco plástico.

4 - Calcular a CL(I)50 e a redução no peso médio dos animais.

Tratamentos

METHYL PARATHION (Folisuper®)AREIA1 – TESTEMUNHA2 – 4 mg/kg substrato3 – 8 mg/kg substrato4 – 16 mg/kg substrato5 – 32 mg/kg substrato6 – 64 mg/kg substrato

Tratamentos

METHYL PARATHION (Folisuper®)ARGILOSO7 - TESTEMUNHA8 – 20 mg/kg substrato9 – 40 mg/kg substrato10 – 80 mg/kg substrato11 – 100 mg/kg substrato12 – 160 mg/kg substrato

Tratamentos

METHYL PARATHION (Folisuper®)SOLO ORGÂNICO13 - TESTEMUNHA14 – 60 mg/kg substrato15 - 120 mg/kg substrato16 – 180 mg/kg substrato17 – 240 mg/kg substrato18 – 300 mg/kg substrato