apresentação do lcga dez.2012
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DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS GERMINATIVAS
DE TECIDO TESTICULAR EQUINO TRANSPLANTADO
EM CAMUNDONGOS
Germ cell development in equine testis tissue
xenografted into mice
Reproduction Researsh, 2006
Pedro Augusto Cordeiro Borges
Introdução
Enxerto de diferentes espécies em camundongos
Eficiência da espermatogênese
* Eficiente * Ineficiente
- Porcos - Gatos
- Bodes - Macacos
-Touros
Honaramooz,Oatley;Snedaker, 2004; Rathi, 2005
Honaramooz, 2002
2
Introdução
Enxerto de tecido testicular equino não relatado
Modelo in vivo - entendimento da espermatogênese
- tratamentos semelhantes
- animais experimentais
- descendência por ICSI
- cavalos valiosos
castração ou morte
(Cochran et al. 1998)
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Introdução
Gonadotrofinas crescimento e desenvolvimento testicular
Enxerto em camund. Castrado gonadotrofinas endogenas
LH Leyding testosterona Feedback
Diferenças ↓ eficiência da espermatogênese
Suplementação com gonadotrofinas melhorar a espermatogênese
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Objetivo
Eficiência da espermatogênese
Efeito da administração de gonadotrofinas
5
Material e Métodos
6
Material e Métodos
• Experimento 1
Standardbred
2 semanas Welsh pony
5 mesesWarmblood
10 meses Quarterhorse
12 mesesThoroughbred
4 anos
7
Material e Métodos
• Experimento 1
Remoção da cápsula e do
tecido conjuntivo
1 – 2 mm
Dulbecco’s
Eagle’s
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Material e Métodos
• Experimento 1
6 semanas
Imunossuprimidos
9
Material e Métodos
• Experimento 1
Anestesiados e castrados Comissão Institucional de
Usos e Cuidados com os
Animais – Universidade da
Pensilvânia
Base
histológica
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Material e Métodos
• Experimento 2
Shetland pony
8 meses
Thoroughbred
12 meses
14 semanas após
20 semanas
25 semanas após
10 semanas
PSMG 10 UI
hCG 10 UI
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• Recuperação e analise dos tecidos transplantados
Material e Métodos
Eutanásia • Inalação de CO2
Fixação • Solução de Bouin’s
Banhos • Etanol 70%
Parafina • Histologia
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Material e Métodos
• Recuperação e analise dos tecidos transplantados
Todos os túbulos seminíferos avaliados
Maturação lúmen e espermatogênese
Células germinativas morfologia e localização
Túbulos degenerados sem distinção de tipos celulares
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Material e Métodos
• Recuperação e analise dos tecidos transplantados
Tecidos saudáveis x degenerados
Apenas os saudáveis analisados
Camundongo = unidade experimental
Vesículas seminais pesadas secreção de testosterona
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Análise estatística
NRC-nude e ICR-scid
Chi-square ou Student
ANOVA
SigmaStat 3.0
Média e Desvio
P< 0,05
15
Resultados
16
Experimento 1
17
Resultados
65 % saudáveis
2-4 vezes maior
% d
e
tecid
os s
audáveis
recupe
rados
Idade do doador
Figura 1. Porcentagem de tecidos saudáveis recuperados por doador, 4 ou 8
meses após o enxerto (n=6 receptores por doador)
84,6%
93,8%
56,3%65%
20,3%
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• Espermatogênese e desenvolvimento dos túbulos seminíferos
Células intersticiais e poucos cordões
Espermatogônias
Tecidos recuperados (4 e 8 meses) pouco desenvolvidos
- 35, 7% cordões túbulos
- 52 % degenerados
- Espermatogônias
- Após 8 meses lóbulos mais aparente
Resultados
19
ResultadosP
orc
enta
gem
de t
úbulo
s s
em
inífero
s
Tempo em meses
Figura 2. A porcentagem de túbulos
seminíferos contendo o tipo de célula
germinativa indicada é demonstrada para o
tecido proveniente do Welsh pony - 5 meses
Espermatidés alongadas
Espermatides arredondadas
Espermatócitos em paquíteno
Espermatogônia
Sem células germinativas
0 – cachos e arranjo em lóbulos
8 – espermatócitos em paquíteno
4,8 0,8 % de túbulos
degenerados
Welsh pony
5 meses
20
Resultados
Figura 3. Aspecto histológico do tecido testicular equino (Welsh pony – 5 meses),
antes de transplantado (A), apresentando apenas espermatogônias , e recuperado
após 8 meses (B), apresentando espermatócitos em paquíteno.
Welsh pony
5 meses
21
ResultadosP
orc
enta
gem
de t
úbulo
s s
em
inífero
s
Tempo em meses
Figura 4. A porcentagem de túbulos
seminíferos contendo o tipo de célula
germinativa indicada é demonstrada para o
tecido proveniente do Warmblood 10 meses
Espermatidés alongadas
Espermatides arredondadas
Espermatócitos em paquíteno
Espermatogônia
Sem células germinativas
0 – Espermatócitos em paquíteno
4 – Redução significativa
8 – Espermátides alongadas
7,7 1,5 % de túbulos degenerados
Warmblood
10 meses
22
Resultados
Figura 5. Aspecto histológico do tecido testicular equino (Warmblood– 10 meses),
antes de transplantado (C), apresentando espermatócitos em paquíteno como o
tipo celular mais maduro, e recuperado após 8 meses (D), apresentando
espermátides alongadas.
Warmblood
10 meses
23
Resultados
Porc
enta
gem
de t
úbu
los s
em
inífero
s
Tempo em meses
Figura 6. A porcentagem de túbulos
seminíferos contendo o tipo de célula
germinativa indicada é demonstrada para o
tecido proveniente do Quarterhorse12 meses
Espermatidés alongadas
Espermatides arredondadas
Espermatócitos em paquíteno
Espermatogônia
Sem células germinativas
0 – Espermátides alongadas
4 – Espermatócitos em paquíteno
8 – Retomada da espermatogênese
6,5 2,2 % de túbulos degenerados
Quarterhorse
12 meses
24
Resultados
Figura 7. Aspecto histológico do tecido testicular equino (Quarterhorse – 12
meses), antes de transplantado (E), apresentando espermatogênese completa e
recuperado após 8 meses (F), apresentando espermatócitos em paquíteno como o
tipo celular mais maduro.
Quarterhorse
12 meses
25
Resultados
Porc
enta
gem
de t
úbu
los s
em
inífero
s
Tempo em meses
Figura 8. A porcentagem de túbulos
seminíferos contendo o tipo de célula
germinativa indicada é demonstrada para o
tecido proveniente do Thoroughbred 4 anos
Espermatidés alongadas
Espermatides arredondadas
Espermatócitos em paquíteno
Espermatogônia
Sem células germinativas
0 – Espermátides alongadas
4 – Redução significativa
8 – Retomada da espermatogênese
46,8 13,9 % de túbulos degenerados
Thoroughbred
4 anos
26
Resultados
Figura 9. Aspecto histológico do tecido testicular equino (Thoroughbred – 4 anos),
antes de transplantado (G), apresentando espermatogênese completa e
recuperado após 8 meses (H), apresentando espermatócitos em paquíteno como o
tipo celular mais maduro.
Thoroughbred
4 anos
27
Experimento 2
28
Resultados
• Efeito da gonadotrofina nos tecidos enxertados (experimento 2)
- Antes do transplante
Thoroughbred e Welsh pony espermatogônias
Recuperados 8 meses
10 semanas 20 semanas
- 3 tratados com gonadotrofina
- 3 grupo controle
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• Welsh pony – 8 meses
Resultados
Porc
enta
gem
de t
úbulo
s s
em
inífero
s
Tempo em meses
Figura 10. A porcentagem de túbulos
seminíferos contendo o tipo de célula
germinativa indicada é demonstrada para o
grupo controle e o grupo tratado com
gonadotrofina, com tecidos provenientes do
doador de 8 meses de idade.
Espermatidés alongadas
Espermatides arredondadas
Espermatócitos em paquíteno
Espermatogônia
Sem células germinativas
0 – Gonócitos
8 – Espermatócitos em paquíteno
8 - Espermatides alongadas
30
Resultados
Figura 11. Aspecto histológico do tecido testicular do doador de 8 meses, antes
do transplante (A) e após recuperação (8 meses), para o grupo controle (B) e
para o grupo tratado com gonadotrofina (C).
Antes Tratado - gonadotrofinaControle
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• Thoroughbred – 12 meses
Resultados
Porc
enta
gem
de t
úbulo
s s
em
inífero
s
Tempo em meses
Figura 10. A porcentagem de túbulos
seminíferos contendo o tipo de célula
germinativa indicada é demonstrada para o
grupo controle e o grupo tratado com
gonadotrofina, com tecidos provenientes do
doador de 12 meses de idade.
Espermatidés alongadas
Espermatides arredondadas
Espermatócitos em paquíteno
Espermatogônia
Sem células germinativas
0 – Gonócitos
8 – Espermatogônias
8 - Espermatócitos em paquíteno
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Resultados
Figura 13. Aspecto histológico do tecido testicular do doador de 12 meses, antes
do transplante (D) e após recuperação (8 meses), para o grupo controle (E) e
para o grupo tratado com gonadotrofina (F).
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• Peso das vesículas seminais
177 30.8 mg 4 meses após o transplante
130.9 27.4 mg 8 meses após o transplante
Sem tecidos saudáveis 15.6 2.7 mg
Tecido equino transplantado produção de testosterona
Administração de gonadotrofina sem significância
Resultados
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Considerações finais
Espermatogênese até meiose
Gonadotrofinas exógenas
Tecido testicular de equinos – modelo – espermatogênese
Fisiologia e Fisiopatologia
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DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS GERMINATIVAS
DE TECIDO TESTICULAR EQUINO TRANSPLANTADO
EM CAMUNDONGOS
Germ cell development in equine testis tissue
xenografted into mice
Reproduction Researsh, 2006
Pedro Augusto Cordeiro Borges