apostila microbiologia geral bio 2012

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Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Quimica

Prof. Rodrigo Pires do Nascimento

2012

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1. Introdução ao Laboratório de Microbiologia

Os microrganismos são encontrados em praticamente todos os ambientes naturais,

como ar, água, solo, alimentos, esgoto, corpo humano, plantas, animais, fendas hidrotermais, lagos salinos, etc. Nestas condições, eles se apresentam como populações mistas, e para que possamos estudá-los no laboratório, necessitamos separá-los em espécies individuais, formando culturas puras. Definições Cultura Pura – consiste no crescimento, em meio nutritivo adequado, de um conjunto de células idênticas, correspondentes à mesma espécie de microrganismo. Colônia – aglomerado de clones (células idênticas) oriundos da multiplicação de uma célula mãe (progressão geométrica), em um meio nutritivo sólido, visível a olho nu. Esterilização – consiste na eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em determinado material ou ambiente. Assepsia – procedimento que envolve o uso das manobras assépticas, que são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde não são desejados.

Apresentação do Laboratório de Microbiologia

Normas de Segurança em Laboratório

Observação dos Microrganismos no Ambiente

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Cultivo de Microrganismos: Meios de Cultura sólidos líquidos semi-sólidos (agar em pé) Vidraria tubos (rosca, algodão, alumínio) pipeta Pasteur beckers placas de Petri Erlenmeyers balões volumétricos Câmaras de Cultivo banhos incubadoras

Câmaras de Inoculação câmara asséptica câmara de fluxo laminar

Esterilização: Autoclave Forno Pasteur Filtros Esterilizantes Transferência de Microrganismos: Alças e agulhas de inoculação Pipetas (vidro ou plástico) “Swabs”

Preservação dos Microrganismos: Refrigeradores Freezers Liofilizadores Outros materiais de laboratório: Bico de Bunsen Cânulas de placas e pipetas Algodão cardado Papel de embrulho Espátulas e Pinças

agar inclinado agar em placa

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2. Normas de Segurança de Aulas Práticas No decorrer das aulas, o aluno irá trabalhar com material de baixo risco infeccioso e, por conseguinte, será responsável pela sua própria segurança, pela segurança dos seus colegas, dos funcionários encarregados pela limpeza da sala e das pessoas que se aproximarem. Mesmo que o risco seja baixo, cuidado nunca é demais. Deste modo, a sua atitude na sala de aula deverá ser consciente e sobretudo responsável com as normas de segurança aplicadas a qualquer Laboratório de Microbiologia NB-1. Assim sendo, visando minimizar os acidentes e aumentar o nível de consciência dos profissionais de laboratório é importante seguir algumas normas: Dentro do laboratório de microbiologia, sempre use um jaleco, guarda-pó ou avental. Este equipamento de proteção individual (EPI) protegerá você e suas roupas comuns contra contaminações e danos, eventualmente, causados por corantes ou outras substâncias; Não fume no interior da sala. Lembre-se que há gás, material inflamável e equipamentos sensíveis a fumaça (microscópios); Assim que entrar no Laboratório, lavar as mãos antes de realizar qualquer atividade de aula prática ou pesquisa; Após trabalhar com qualquer tipo de material microbiológico, infeccioso ou não, faça a desinfecção das mãos com solução germicida, água e sabão e também faça a limpeza da bancada; Cuidado com gestos bruscos e impetuosos no decorrer de uma prática ou de um experimento, pois você pode quebrar algum frasco, espalhando assim material biológico que pode ser infeccioso; Qualquer contato de mãos, partes expostas do corpo ou vestes, com material possivelmente infeccioso, deverá ser comunicado ao responsável imediatamente, que orientará sobre as providências necessárias; Nunca coloque o instrumental (alças, pipetas, etc.) sobre a mesa, após ter sido utilizado. Flambe alças e agulhas antes e depois de usar (VERIFIQUE A PRESENÇA DE DEPÓSITOS APROPRIADOS PARA O DESCARTE DE PLACAS DE PETRI E PIPETAS);

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Antes de acender o Bico de Bunsen, verifique se a entrada de ar do bico esta na posição correta e se a saída de gás esta fechada; Para abrir e fechar um tubo que contenha material microbiológico ou meio de cultura a ser inoculado, segure-o com a mão esquerda (se for destro), tire a tampa com a mão direita e procure retê-la com o dedo mínimo, sempre dentro da zona de segurança do Bico de Bunsen. Aproxime então a boca do tubo na chama do bico, inocule ou retire o material e novamente aproxime a boca do tubo na chama. NUNCA DEIXE A TAMPA OU ROLHA SOBRE A MESA. Ao utilizar o microscópio, não esqueça de ao findar a sua utilização, desliga-lo, coloca-lo na posição inicial, retirar a lâmina, limpar a objetiva com lenço de papel (caso utilize a objetiva de imersão) e cobri-lo adequadamente; Coloque as lâminas utilizadas em uma travessa de vidro contendo desinfetante; Não mexa, sem autorização do responsável, em nenhum equipamento do laboratório. EVITE ACIDENTES; Não abra, sem a ordem do professor, os meios de cultura que estiverem sobre a mesa. EVITE CONTAMINAÇÃO. Nunca pipete com a boca ácidos, bases ou suspensões com microrganismos. Sempre que possível use pipetadores ou peras; Dentro de um laboratório de microbiologia não se deve comer, beber, fazer higiene bucal, maquilagem ou roer as unhas; Cabelos compridos devem ser mantidos presos para evitar acidentes; Mantenha as unhas bem cortadas; Utilize vestimentas adequadas. Sandálias abertas ou Chinelos não são permitidos dentro do laboratório. Assim você evita qualquer dano em caso de um possível acidente; Qualquer problema que venha a ocorrer comunique imediatamente ao responsável.

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3. Boas Práticas de Laboratório • É o conjunto de normas que dizem respeito à organização e às condições sob as quais estudos em laboratório e/ou campo são planejados, realizados, monitorados, registrados e relatados. 3.1. APLICAÇÕES • estudos que fundamentam a concessão, renovação ou modificação de registro e pesquisas de produtos químicos, biológicos ou biotecnológicos; • testes de produtos químicos, biológicos ou biotecnológicos para obtenção de propriedades físicas, químicas, físico-químicas e dados de segurança; • estudos de campos; • estudos conduzidos em laboratórios de qualquer natureza. 3.2. UNIDADE OPERACIONAL: Laboratório • A Unidade Operacional engloba instalações, equipamentos e pessoal necessário para a condução dos estudos. • O Diretor de Estudos (Pesquisador Principal) é o principal responsável pela condução do estudo em toda a sua extensão.

Risco Biológico

Produto Radioativo

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• A Unidade de Garantia de Qualidade é uma pessoa ou um grupo de pessoas, designado pelo Diretor de Estudos para executar as atividades relacionadas à garantia de qualidade. • Os Procedimentos Operacionais Padrão (POPs) são procedimentos escritos que descrevem como conduzir as rotinas laboratoriais ou atividades normalmente não especificadas ou detalhadas no protocolo de estudo. • O Patrocinador (Agência de Fomento) é a pessoa ou entidade que dá apoio a um estudo através de provisões financeiras ou outros recursos. 3.3. ESTUDO • O Estudo é um ensaio ou conjunto de ensaios nos quais uma ou mais substâncias-teste são estudadas para a obtenção de dados sobre suas propriedades e/ou segurança, com respeito à saúde humana, vegetal, animal e ao meio ambiente. • O Protocolo (Plano) de Estudos é o documento que define o título, o objetivo do estudo e como será conduzido. • O Sistema-Teste é qualquer animal, planta, microrganismos, sistema químico, físico, biológico ou biotecnológico ainda não exposto a substância-teste ou substância de referência. • Os Dados Brutos são documentos de laboratório, registros, memorandos, notas ou cópias fiéis aos mesmos, resultantes de observações originais e das atividades de um estudo. • O Espécime é qualquer material derivado de um sistema-teste encaminhado para exame, análise ou armazenamento. • A Data do Início do Estudo é a data na qual se inicia o trabalho no sistema-teste, devidamente autorizado e assinado pelo Diretor de Estudos. • A Data do Término do Estudo é a data na qual se termina o trabalho no sistema-teste, em que os últimos dados brutos são coletados. • A Data de Finalização do Estudo é a data na qual se o relatório final é assinado pelo Diretor de Estudos. • A Agenda-Mestre é uma tabela onde constam dados referentes aos estudos conduzidos segundo os princípios da BPL, contendo, no mínimo, os seguintes dados: substância-teste, sistema-teste, natureza do estudo, data do início do estudo, estado em que se encontra o estudo, identidade do patrocinador e nome do diretor de estudos.

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4. Níveis de Biossegurança e Classes de Risco

Para manipulação dos microrganismos pertencentes a cada uma das quatro classes de risco devem ser atendidos alguns requisitos de segurança, conforme o nível de contenção necessário. Estes níveis de contenção são denominados de níveis de Biossegurança. Os níveis são designados em ordem crescente, pelo grau de proteção proporcionado ao pessoal do laboratório, meio ambiente e à comunidade.

4.1. Nível de Biossegurança 1

É o nível de contenção laboratorial que se aplica aos laboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos pertencentes a classe de risco 1. Não é requerida nenhuma característica de desenho, além de um bom planejamento espacial e funcional e a adoção de boas práticas laboratoriais.

O nível de Biossegurança 1 é adequado ao trabalho que envolva agentes bem caracterizados e conhecidos por não provocarem doença em seres humanos sadios e que possuam mínimo risco ao pessoal do laboratório e ao meio ambiente. O laboratório não está separado das demais dependências da edificação. O trabalho é conduzido, em geral, em bancada, com adoção das boas práticas laboratoriais (BPL). Equipamentos específicos de proteção ou características especiais de construção não são geralmente usados ou exigidos. O pessoal do laboratório deve ter treinamento específico nos procedimentos realizados no laboratório e devem ser supervisionados por um profissional treinado em Biossegurança e com conhecimentos específicos da área. Abaixo relacionamos os padrões e práticas especiais, equipamentos de segurança e detalhamento de itens referentes às instalações que devem ser respeitados quando houver a manipulação de agentes classificados como microrganismos da classe de risco 1.

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É o laboratório de contenção, onde são manipulados microrganismos da classe de risco 2. Aplica-se aos laboratórios clínicos ou hospitalares de níveis primários de diagnóstico, sendo necessário, além da adoção das boas práticas, o uso de barreiras físicas primárias (cabine de segurança biológica e equipamentos de proteção individual) e secundárias (desenho e organização do laboratório). O nível de Biossegurança 2 é semelhante ao nível de Biossegurança 1, sendo acrescentado de especificidades que veremos a seguir. É adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado para as pessoais e para o meio ambiente, classificados como microrganismos da classe de risco 2. Difere do NB-1 nos seguintes aspectos:

(1) O pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no manejo de agentes patogênicos e devem ser supervisionados por profissionais competentes;

(2) o acesso ao laboratório deve ser limitado durante os procedimentos operacionais;

(3) precauções extremas serão tomadas em relação a objetos perfuro-cortantes infectados;

(4) determinados procedimentos nos quais exista possibilidade de formação de aerossóis e borrifos infecciosos devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica ou outros equipamentos de contenção física.


É destinado ao trabalho com microrganismos da classe de risco 3 ou para manipulação de grandes volumes e altas concentrações de microrganismos da classe de risco 2. Para este nível de contenção são requeridos além dos itens referidos no nível 2, desenho e construção laboratoriais especiais. Deve ser mantido controle rígido quanto a operação, inspeção e manutenção das instalações e equipamentos e o pessoal técnico deve receber treinamento específico sobre procedimentos de segurança para a manipulação destes microrganismos. O nível de Biossegurança 3 possui semelhanças ao

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nível de Biossegurança 2 e ao nível de Biossegurança 1, sendo acrescentado de especificidades que veremos a seguir, por isso recomendamos a leitura dos dois níveis anteriores.

O laboratório de nível de Biossegurança 3, ou de contenção, destina-se ao trabalho com agentes de risco biológico da classe 3, ou seja, com microrganismos que acarretam elevado risco individual e baixo risco para a comunidade. É aplicável para laboratórios clínicos, de diagnóstico, ensino e pesquisa ou de produção onde o trabalho com agentes exóticos possa causar doenças sérias ou potencialmente fatais, como resultado de exposição por inalação. A equipe profissional deve possuir treinamento específico no manejo de agentes patogênicos, potencialmente letais, devendo ser supervisionados por profissional altamente capacitado e que possua vasta experiência com estes agentes.

Esse nível de contenção exige a intensificação dos programas de boas práticas laboratoriais e de segurança, além da existência obrigatória de dispositivos de segurança e do uso, igualmente obrigatório, de cabine de segurança biológica. Os trabalhadores devem usar roupas de proteção específicas para esta área e equipamentos de proteção individual. Além das práticas padrões e especiais estabelecidas para os laboratórios NB-1 e NB-2, devem ser adotadas as recomendações abaixo descritas que se aplicam à manipulação de agentes classificados como sendo da classe de risco 3.


Também chamado de laboratório de contenção máxima, destina-se a manipulação de microrganismos da classe de risco 4, onde há o mais alto nível de contenção, além de representar uma unidade geográfica e funcionalmente independente de outras áreas. Esses laboratórios requerem, além dos requisitos físicos e operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de contenção (instalações, desenho equipamentos de proteção) e procedimentos especiais de segurança. O nível de Biossegurança 4 possui semelhanças quanto aos procedimentos e práticas estabelecidas ao nível de Biossegurança 3, nível de Biossegurança 2 e ao nível de Biossegurança 1, sendo

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acrescentado de especificidades que veremos a seguir, por isso recomendamos a leitura dos três níveis anteriores, sendo que só deve operar com técnicos especializados e treinados em procedimentos de Biossegurança. Recomenda-se que os laboratórios de nível de Biossegurança 4, ou de contenção máxima, só funcionem sob o controle direto das autoridades sanitárias, além disso, dada a grande complexidade do trabalho, a equipe do laboratório deverá ter um treinamento específico e completo direcionado para a manipulação de agentes infecciosos extremamente perigosos e deverá ser capaz de entender as funções da contenção primária e secundária, das práticas padrões específicas, do equipamento de contenção e das características do planejamento do laboratório. É necessária a elaboração de um manual de trabalho pormenorizado; este deve ser testado previamente através de exercícios de treinamento.

O nível de Biossegurança 4 é indicado para o trabalho que envolva agentes exóticos e perigosos que exponham o indivíduo a um alto risco de contaminação de infecções que podem ser fatais, além de apresentarem um potencial relevado de transmissão por aerossóis, classificados como microrganismos da classe de risco 4. Os trabalhadores devem ser supervisionados por profissionais altamente competentes, treinados e com vasta experiência no manuseio dos agentes manuseados, além dos procedimentos de segurança específicos. O acesso ao laboratório deve ser rigorosamente controlado por sistemas automatizados. A instalação laboratorial deve estar localizada em uma edificação separada ou em uma área controlada dentro do edifício, que seja totalmente isolada de todas as outras. Um manual de operações específico para as instalações deve ser preparado ou adotado. O trabalho deve ser executado exclusivamente dentro de cabines de segurança biológica Classe III ou dentro de cabines de segurança biológica da Classe II associadas ao uso de roupas de proteção com pressão positiva, ventiladas por sistema de suporte de vida. O laboratório do nível de Biossegurança 4 deve possuir características específicas quanto ao projeto e a engenharia para prevenção da disseminação de microorganismos no meio ambiente

Todos os procedimentos dentro do laboratório devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica Classe III ou cabines de Classe II usadas em associação com roupas de proteção pessoal com pressão positiva e ventiladas por sistema de suporte de vida.

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Existem dois modelos de laboratório de nível de Biossegurança 4:

(A) Laboratório onde todas as manipulações do agente são realizadas em uma cabine de segurança biológica Classe III

(B) Laboratório onde a equipe usa uma roupa de proteção de pressão positiva.

Os laboratórios de nível de Biossegurança 4 podem se basear em um dos modelos ou em uma combinação dos dois modelos na construção de um só laboratório. Se a combinação for utilizada, cada tipo deve atender todos os requisitos identificados para o mesmo.

4.5. CLASSES DE RISCO

A classificação de risco de um determinado microrganismo patogênico baseia-se em diversos critérios que orientam a avaliação de risco e está, principalmente orientada pelo potencial de risco que oferece ao indivíduo, à comunidade e ao meio ambiente. Cada país adota uma classificação, onde os microrganismos exóticos sofrem um controle rigoroso das autoridades de saúde pública.

Até 1995, o Brasil utilizava as classificações existentes mundialmente, tais como a do Center for Disease Control (CDC), National Institute of Health (NIH), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Comunidade Européia, dentre muitas. Todas as classificações utilizam os mesmos critérios para a avaliação de risco dos microrganismos, porém existem alguns critérios variáveis de acordo com a realidade epidemiológica local, o que pode levar à confusões. No Brasil, em 1995, com a formação da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança, em cumprimento da Lei nº 8.974 e do decreto nº 1.752, do Ministério de Ciência e Tecnologia, surgem uma série de instruções normativas, para o gerenciamento e normatização do trabalho com engenharia genética e a liberação no ambiente de OGMs em todo o território brasileiro. Dentre elas está a Instrução Normativa nº 7, de julho de 1997, que estabelece normas para o trabalho em contenção com organismos geneticamente modificados e, apresenta, em seu anexo, a classificação de agentes etiológicos humanos e animais com base no risco apresentado.

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Esta instrução agrupa os microrganismos em classes de 1 a 4, sendo a classe 1 a de menor risco e a classe 4 a de maior risco.

4.5.1. Classe de risco 1

O risco individual e para a comunidade é ausente ou muito baixo, ou seja, são microrganismos que têm baixa probabilidade de provocar infecções no homem ou em animais. Exemplos: Bacillus subtilis, Serratia marcescens.


O risco individual é moderado e para a comunidade é baixo. São microrganismos que podem provocar infecções, porém, dispõe-se de medidas terapêuticas e profiláticas eficientes, sendo o risco de propagação limitado. Exemplos: Klebisiella pneumoniae, Vírus da Febre Amarela e Schistosoma mansoni, Salmonella tiphymurium.


O risco individual é alto e para a comunidade é limitado. O patógeno pode provocar infecções no homem e nos animais graves, podendo se propagar de indivíduo para indivíduo, porém existem medidas terapêuticas e de profilaxia. Exemplos: Vírus da Encefalite Equina Venezuelana, HIV e Mycobacterium tuberculosis.


O risco individual e para a comunidade é elevado. São microrganismos que representam sério risco para o homem e para os animais, sendo altamente patogênicos, de fácil propagação, não existindo medidas profiláticas ou terapêuticas. Exemplos: Vírus Marburg e Vírus Ebola.

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5. Manobras Assépticas

As manobras assépticas vão impedir, por exemplo, que os microrganismos presentes no ar, ou depositados sobre as mais variadas superfícies que possam estar próximas ao ambiente de trabalho e que podem ser carregados com as partículas de poeira. Assim, impede-se que ocorra a contaminação de materiais estéreis e meios de cultivo estéreis por estes microrganismos, ou ainda, impedir a contaminação de culturas pura. Objetivo: Conceitos de esterilização, desinfecção e assepsia; Descrever as principais técnicas de manobras assépticas; Desenvolver habilidade de manipular tubos de ensaio contendo meio de cultivo estéril, bem como transferir microrganismos de um meio sólido para outro meio sólido e também meio líquido. Materiais: Tubos vazios esterilizados (18 x 150 mm); tubos contendo meio caldo simples; pipetas estéreis (ou ponteiras de 100 – 1000 L); tubos de ágar simples inclinado; tubos com crescimento de Serratia; alças e agulhas de platina; algodão cardado; papel de embrulho; pipetas Pasteur. Procedimentos:

1- Distribuir o caldo simples estéril do tubo estéril para um outro tubo vazio e estéril, utilizando pipeta Pasteur ou pipeta graduada estéril (2 mL) ou ponteiras estéreis (100 – 1000 L)

2- Transferir uma pequena quantidade do crescimento de Serratia marcescens em tubo contendo ágar simples inclinado para um outro tubo contendo o mesmo meio de cultivo estéril, com auxílio de uma alça de platina.

3- Transferir uma pequena quantidade do crescimento de Serratia marcescens em tubo contendo ágar simples inclinado para um outro tubo contendo caldo simples estéril.

4- Incubar todos os tubos a 28°C por 72 horas.

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Interpretação dos Resultados:

Observar, nos tubos de caldo simples, submetidos à transferência em condições de assepsia, características como ausência de turvação, não formação de película ou depósito no meio de cultivo. Se por algum motivo for observado qualquer um dos itens mencionados, significa que a manobra asséptica não foi conduzida corretamente.

Observar, nos tubos de ágar simples inclinado submetidos à inoculação com S. marcescens, colônias com aspecto vermelho-alaranjado. Se por algum motivo não for observado colônias com essa coloração, indica que o procedimento de assepsia não foi conduzido de maneira correta.

Observar, nos tubos de caldo simples submetidos à inoculação com S. marcescens, se houve ou não turbidez. Porém, neste caso, não é possível determinar se houve ou não contaminação, pois a grande maioria das bactérias cresce turvando meio de cultivo líquido.

1 2 3 4 5 flambar a alça remover as tampas e transferir a flambar os tubos e flambar a alça flambar os tubos cultura retampar novamente

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PRINCIPAIS TÉCNICAS DE MANOBRAS ASSÉPTICAS

6. Observações Microscópicas de Microrganismos

Os microrganismos constituem um grupo de seres vivos com dimensões

reduzidas e bastante variáveis de acordo com o grupo a que pertencem. Os procariotos podem variar de 0,3 a 1 m (exceto o Epulopiscium, que pode chegar a 600 m). Os eucariotos constituem o grupo mais heterogêneo, variando de 10 a 100 m. Os vírus, por sua vez, apresentam uma organização estrutural totalmente diferente daquelas encontradas em células, e variam de 27 a 300 nm.

A visualização dos microrganismos somente pode ser feita através de um equipamento denominado microscópio. O microscópio pode ser óptico (utiliza a luz visível ou ultravioleta para gerar a imagem de um objeto que normalmente está colocado sobre uma lâmina de vidro) ou eletrônico.

a) Trabalhar dentro da zona de segurança do bico de Bunsen ( 10 cm de raio), ou seja, os recipientes com meio de cultivo ou não devem ser abertos próximos a chama do bico; b) Flambar a alça antes e após a inoculação, SEMPRE; c) Deixar arrefecer o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança, preferencialmente na parte interna do recipiente, com meio de cultivo; d) Com o auxílio do dedo menor, retirar a rolha de algodão, mantendo a alça bem firme na mão. Em hipótese alguma coloque a alça ou a rolha na bancada ou mesmo retire da zona de segurança; e) Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio de cultivo estéril, imediatamente após abri-los e antes de fechá-los; f) Introduzir a alça de platina, já arrefecida na zona de segurança, dentro do tubo e retirar o conteúdo. g) Abrir uma pipeta ou uma caixa de ponteiras estéreis dentro da zona de segurança, flamba-la rapidamente, quando for pipeta de vidro e mantê-la dentro da zona de segurança.

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A grande maioria dos microscópios ópticos é capaz de fornecer um aumento final de até 1200 vezes, dependendo das lentes e dos condensadores, mas sem grandes resoluções. Porém, a resolução é a capacidade que um sistema óptico tem de distinguir objetos separados por pequenas distâncias. Assim, define-se como limite de resolução a distância mínima entre dois objetos a partir da qual estes podem ser vistos como entidades individualizadas. O limite de resolução do microscópio óptico é de aproximadamente 0,2 m e é conseguido através da seguinte fórmula:

Onde o D corresponde ao limite de resolução (menor distância entre dois detalhes separáveis) e corresponde ao comprimento de onda da luz visível, cujo valor mais comumente utilizado é de 0,5 m e NA, a abertura numérica. A trajetória da luz de um microscópio óptico não corresponde exatamente ao modelo teórico fundamentado nos estudos de óptica geométrica. A luz cria diferentes rotas decorrentes da sua interação com diferentes tipos de materiais que não pertencem (lâminas) ou que pertencem (lentes, aberturas, anéis de difração, espelhos) aos microscópios. As interações podem ser definidas como Transmissão, Reflexão, Difração, Absorção e Refração. As interações da luz com as lentes dos microscópios ópticos causam distorções na imagem formada do objeto que quase sempre são percebidas pelo observador como uma falta de foco ou definição final da imagem. As distorções mais clássicas da microscopia óptica são conhecidas pelo nome de aberrações e são causadas por diferenças no plano do feixe de luz paralela que entra pelas lentes do microscópio. A aberração esférica é causada pelo formato das lentes que desviam certos componentes do feixe luminoso provocando diferentes planos de foco. A aberração cromática é derivada dos diferentes planos de foco de cada um dos comprimentos de onda que formam a luz branca. A curvatura de campo faz com que a imagem de um objeto plano seja curva, ou seja, o objeto terá foco apenas na região central.

D = 0,61 NA

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As aberrações são corrigidas com o uso de lentes compostas formadas por até 10 lentes inseridas no corpo de uma lente objetiva, onde são combinados formatos e materiais diferentes para que se façam as correções necessárias. Existem diferentes tipos de lentes objetivas:

a) Acromática – apresenta a melhor correção da aberração cromática para a região central do espectro de luz visível. São satisfatórias para a observação direta, pois o nosso olho é mais sensível exatamente ao comprimento de onda verde.

b) Semi-acromática – possui fluorita na sua composição, semelhante a acromática. c) Apocromática – a correção da aberração cromática se dá sobre todo o espectro

visível. d) Plan-acromática – correção equivalente à das acromáticas e correção para

curvatura de campo.

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e) Plan-apocromática – correção equivalente à das apocromáticas e correção de curvatura de campo.

As lentes objetivas são identificadas por uma série de códigos impressos no corpo

de cada uma delas, os quais fornecem todas as informações necessárias para que se escolha a melhor objetiva para a observação de diferentes amostras.

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Cuidados no uso do microscópio

a) Nunca força-lo. Todas as conecções devem funcionar suavemente. Caso contrário,

chame o professor;

b) As lentes da objetiva nunca devem tocar a lâmina. Portanto, nunca focalizar

abaixando o canhão com o parafuso macrométrico olhando para a ocular;

c) Não tocar as lentes. Se estiverem sujas, limpe-as com algodão ou com pano que serão

fornecidos;

d) Limpar sempre a objetiva de imersão após o uso. Se o óleo está endurecido, pode

aplicar um pouco de xilol sobre o algodão. Cuidado, pois um excesso de xilol pode

dissolver o cimento das lentes;

e) Não esquecer a lâmina no microscópio após o uso;

f) Manter a platina sempre limpa e seca. Limpa-la com o guardanapo apropriado.

g) Não inclinar o microscópio, pois neste curso quase todas as técnicas empregadas

exigem que a lâmina seja examinada sempre na posição horizontal;

h) Quando o microscópio não estiver em uso, deverá ser guardado coberto ou em sua

caixa;

i) Habitue-se não deixar a fonte de luz acesa quando não estiver utilizando o

microscópio

Uso do microscópio

a) Com a amostra a ser examinada sempre na parte superior, colocar a lâmina sobre a

platina, tomando o cuidado de que a parte a ser examinada esteja bem no centro;

b) Ajustar a iluminação de forma a que passe maior quantidade possível de luz através da

amostra;

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c) Colocar a objetiva de menor aumento e abaixar o canhão utilizando o parafuso

micrométrico até que a lente esteja cerca de 0,5 cm da lâmina. Nunca efetuar esta

operação olhando pela ocular;

d) Olhar pela ocular e levantar levemente o canhão até obter uma focalização grosseira.

Se não conseguir, repetir a operação;

e) Após focalizar grosseiramente, utilizar o parafuso micrométrico para uma focalização

fina;

f) Acertar a quantidade de luz, movimentando o diafragma. A iluminação deve ser

adequada, nem fraca nem excessiva. Nunca movimentar o condensador para baixo para

diminuir a quantidade de luz. O condensador deve estar sempre em posição elevada;

g) Se necessário um aumento maior, girar o revolver para utilizar a objetiva de aumento

45X. Reajustar a focalização com o parafuso micrométrico e a iluminação com o

diafragma.

h) Para utilizar a objetiva 100X, é necessária a colocação de uma gota de óleo sobre a

lâmina depois da perfeita focalização com as objetivas de aumento 10X e 45X.

Observando lateralmente, girar o revolver até encaixar a objetiva de aumento 100X,

ficando esta imersa no óleo e sem que a lente toque na lâmina. A seguir, reajustar o foco

com o parafuso micrométrico e a iluminação como no item f. Nunca tentar focalizar

diretamente com as objetivas de maior aumento

Objetivos: Manusear adequadamente um microscópio óptico; conhecer os principais métodos de observação microscópica de microrganismos; distinguir morfologicamente bactérias, leveduras, bolores e protozoários; identificar os principais tipos morfológicos de bactérias.

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Materiais: lâminas, lamínulas, microscópios ópticos, lupas, bateria de corantes da coloração de Gram (cristal violeta, lugol, fucsina), alça, bico de Bunsen, placas ou tubos com crescimento microbiano (Escherichia coli, Bacillus subtillis, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Streptomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Aspergilus niger). 1ª PARTE (Coloração de Gram) Procedimentos:

Culturas bacterianas em meio sólido ou líquido, corante cristal violeta, corante

fucsina básica, lugol, etanol-acetona (1:1 v:v), lâmina de microscopia; microscópio óptico

e bico de Bunsen.

A. Composição dos corantes

A.1. Solução de cristal violeta (corante)

Solução A Solução B

Cristal violeta 2,0 g Oxalato de amônia 0,8 g

Etanol:acetona 20 ml Água destilada 100 ml

Misturar as soluções A e B e deixar em repouso por 24 horas antes do uso.

A.2. Solução de fucsina (contra-corante)

Fucsina 1,0 g

Água destilada 100 ml

A.3. Solução de lugol (fixador)

Iodo 1,0 g

Iodeto de potássio 2,0 g

Água destilada 100 ml

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Coletar uma pequena amostra de uma suspensão de células microbianas ou de uma

colônia crescida em agar sólido, com o auxílio de uma alça devidamente flambada

(estéril).

B. Preparo do esfregaço na superfície da lâmina

C. Coloração de Gram 1- Preparo do esfregaço da bactéria. Deve-se suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

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2- Adicionar solução de Cristal Violeta ou Violeta de Genciana sobre a superfície da lâmina onde se encontra o esfregaço e deixar em repouso por 1 minuto; 3- Descartar o excesso de corante e enxaguar a lâmina com água destilada; 4- Adicionar solução de Lugol (fixador) sobre a superfície da lâmina onde se encontra o esfregaço corado e deixar em repouso por 1 minuto; 5- Adicionar suavemente com álcool 96º para remover o complexo insolúvel p-rosa-anilina (máximo de 5 segundos) e depois enxaguar a lâmina com água destilada para remover excesso de solvente; 6- Adicionar a solução de Fucsina ou Safranina sobre a superfície da lâmina onde se encontra o esfregaço e deixar em contato por cerca de 40 segundos. Princípio da Coloração de Gram e Interpretação dos Resultados

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo

médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, e que

consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os

reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a

separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a

determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares

de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante

um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias

Gram-negativas não o fazem.

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana

crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido

de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-

negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma

coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo (p-rosa-anilina),

insolúvel, em sua porção hidrofílica (citoplasma e espaço periplasmático) e hidrofóbica

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(membrana). Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1

v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-

negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro

lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e

provoca a contração dos poros da peptidoglicana, tornando-as impermeáveis ao

complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da

descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção

do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A

retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e

químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e

integridade.

Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário (contra-corante), a

fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta

escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-

positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou

químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir

parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material

fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são

obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo

azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituída pelo corante vermelho safranina.

A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que

por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-

acetona pode ser substituído por álcool 95%.

As figuras 1 e 2 mostram células de bactérias Gram-positiva e as figuras 3 e 4

mostram células de bactérias Gram-negativa, ambas coradas pelo método de Gram e

observadas ao microscópio óptico com aumento de 1000 vezes.

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Figura 1 – Bacillus subtilis Figura 2 – Streptococcus oralis

Figura 3 – Escherichia coli Figura 4 – Neisseria gonorrhoeae

2ª PARTE (visualização de fungos e leveduras)

Em casos clínicos, a observação de um fungo na amostra biológica tem grande

valor diagnóstico, pois demonstra a invasão do fungo no tecido e permite uma

informação imediata ao médico, a qual pode ser crucial para determinar a terapia

apropriada ao paciente. No entanto, se a quantidade da amostra biológica for

insuficiente para o exame microscópico e cultura do material, a cultura, na maioria das

amostras, tem prioridade sobre o exame microscópico, desde que é método mais

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específico e em muitos casos, mais sensível. O exame microscópico da amostra é

realizado por várias técnicas, dependendo do tipo da amostra e suspeita clínica.

- Lactofenol de Amann

É o mais usado em laboratórios de fitopatologia. Excelente para coloração de esporos e

micélios de fungos hialinos. Apresenta índice de refração de 1,45. Usualmente adiciona-

se ao Lactofenol de Amann, azul de algodão (corante) na proporção de 0,1 a 0,5%.

Composição:

Ácido lático p.a. ------------------10ml

Água destilada --------------------10ml

Fenol crist. ------------------------ 10ml

- Liquido de montagem de Shear

Composição:

Acetato de potássio(solução aquosa a 2%) -------- 300ml

Glicerina -------------------------------------------------- 120ml

Álcool etílico 95% -------------------------------------- 180ml

Glicerina p.a.

Água

- Azul de Amann

Composição:

Lactofenol de Amann mais azul de algodão a 0,1 –0,5%

Lactofuscina

Fuscina ácida -------------------------------------- 0,1g

Ácido lático --------------------------------------100ml

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EXAME MICROSCÓPICO DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA

CHINA)

Utilizada em amostras de líquor, urina, secreções ou exsudatos, para visualização

de leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra

o fundo negro proporcionado pela tinta. Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota

do sedimento da amostra centrifugada, sobre uma lâmina. Cobrir a preparação com

lamínula e observar ao microscópio óptico (objetivas de 10x e 40 x). Nesta técnica, um

erro bastante frequente é confundir linfócitos com células de leveduras. A diferenciação

é feita pela refringência da parede celular e das inclusões no citoplasma das leveduras,

além da presença de brotamentos.

Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cápsula

polissacarídica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim

EXAME MICROSCÓPICO COM COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

Todos os fungos são “Gram-positivos” (coram-se de roxo), assim a utilização da

coloração não visa a diferenciação dos microrganismos, mas possibilita discriminar

elementos fúngicos de artefatos existentes em urina, secreções e fezes. A amostra é

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espalhada de modo homogêneo, em movimentos circulares, em uma lâmina de

microscopia, fixada com calor e submetida à coloração.

EXAME MICROSCÓPICO UTILIZANDO FITA ADESIVA

Preparações grosseiras para exame rápido podem ser obtidas estendendo-se sobre

a superfície da lesão ou da cultura em placa de Petri um pedaço de fita adesiva

transparente (durex). A fita é removida cuidadosamente e readerida à lâmina, contendo 1

gota do corante azul de lactofenol. Procedendo-se a observação ao microscópio,

utilizando aumento de 100x, 400x ou 1000x. A técnica se presta especialmente para

fungos que esporulam na superfície de lesões / placas de Petri contendo meio de cultivo

e cujos esporos não são produzidos no interior da frutificação.

Com relação as amostras ambientais, a utilização de visualização microscópica é

essencial para a sua identificação e classificação, através da observação de estruturas de

reprodução. Primeiramente amostras ambientais devem ser coletadas e transportadas

para o laboratório para serem processadas (isolamento por diluição seriada). Após

cultivar e purificar os fungos isolados da amostra ambiental, a observação microscópica

pode ser conduzida por 2 maneiras: (i) microcultivo: lâminas contendo uma fina camada

de meio de cultivo, no qual o fungo é inoculado; (ii) técnica da fita adesiva

EXAME MICROSCÓPICO UTILIZANDO FITA ADESIVA

Preparações para exame rápido podem ser obtidas estendendo-se sobre a

superfície cultura do fungo em placa de Petri um pedaço de fita adesiva transparente

(durex). A fita é removida cuidadosamente e readerida à lâmina, contendo 1 gota do

corante azul de lactofenol. Procedendo-se a observação ao microscópio, utilizando

aumento de 100x, 400x ou 1000x. A técnica se presta especialmente para fungos que

esporulam na superfície de lesões / placas de Petri contendo meio de cultivo e cujos

esporos não são produzidos no interior da frutificação.

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EXAME MICROSCÓPICO DIRETO EM MICROCULTIVO

Para executar esta técnica, é necessário ter uma placa de microcultivo esterilizada.

Esta deve conter papel de filtro umedecido com água destilada estéril no fundo da placa

e sobre o papel um bastão de vidro em forma de “U” junto com uma lâmina e lamínula.

A placa funcionará como uma câmara úmida para o crescimento do fungo na superfície

do meio de cultivo sobre a lâmina.

a) Lâmina para microscopia com meio de cultura após inoculação do fungo.

b) Bastão de vidro encurvado em forma de "U".

c) Papel de filtro embebido em água destilada estéril.

d) Placa de Petri.

e) Lamínula.

f) Meio de cultura.

g) Fungo filamentoso.

b a c d

f e g

apostila microbiologia geral bio 2012

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