apostila de microbiologia 1

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

RROOTTEEIIRROO DDEE AAUULLAASS PPRRÁÁTTIICCAASS DDEE

MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA EE IIMMUUNNOOLLOOGGIIAA

R o t e i r o d e A u l a s P r á t i c a s d e M i c r o b i o l o g i a e I m u n o l o g i a

Í N D I C E

I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO ------------------------------------------------------ 3

II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS ------------------------------------------- 9

III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ---------------------------------------------------16

IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS -------------19

V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO --------------22

VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS -----------27

VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS ----------------33

VIII – REAÇÕES ANTÍGENO ANTICORPO --------------------------------------------------37

IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS -----------------------------------------------------41

E s t e r i l i z a ç ã o e D e s i n f e c ç ã o

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I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO Esterilização é o processo de destruição por meio de agentes físicos ou químicos de todas as formas de vida microbiana (vírus, bactérias, fungos e esporos) presentes num material.

A esterilização pode ser realizada por agentes físicos e químicos.

⇒ ESTERILIZAÇÃO POR MÉTODOS FÍSICOS

1. Calor Úmido 1.1. Autoclavação - É um processo de esterilização pelo

vapor sob pressão em câmaras conhecidas como “autoclaves” onde vapor de água é mantido em temperatura acima de 100oC, pelo emprego de pressão maior que a atmosférica, a uma temperatura de 121oC. O tempo de exposição depende do material a ser esterilizado. Este processo é utilizado para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos, meios de cultivo e outros.

1.2. Tindalização ou esterilização fracionada - Processo de esterilização na temperatura de 100oC durante 30 minutos, repetindo-se o aquecimento 2 a 3 dias consecutivos. Este processo é usado na bacteriologia para a esterilização de certos meios de cultura que se alteram em temperaturas elevada, como meios contendo açúcares, leite etc.

2. Calor Seco 2.1. Forno de Pasteur - Neste processo são empregados

fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada e mantida pelo tempo necessário para que haja esterilização. É realizada em temperatura de 170-180oC, em estufas elétricas por 1 a 2 horas. O material a ser esterilizado deve ser distribuído de modo uniforme para facilitar a distribuição do calor que emana das paredes laterais e da base da estufa. Este processo é indicado para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos passíveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas, pó e óleos.

2.2. Incineração - É um processo usado para materiais descartáveis e carcaça de animais utilizados em experimentos.

2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de Bunsen utilizado em rotina de laboratório para esterilização de alças de platina e bordas da boca de tubos e balões.


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3. Filtração - É um processo usado para esterilização de gases e líquidos tais como soros, soluções de enzimas e vitaminas, açúcares, que não podem ser submetidos ao calor. A filtração consiste em passar o material a ser esterilizado por filtros de poros muito pequenos que não permitem a passagem de bactérias e fungos.

3.1. Tipos de filtros: Disco de amianto - Filtro de SEITZ Membrana de ester de celulose- Millipore Filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA) – removem quase todos os microrganismos maiores que

0,3µm de diâmetro. São utilizados para reduzir o número de micróbios transmitidos pelo ar.

4. Radiações 4.1. Radiação ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na

esterilização do ar e de ambientes. Na indústria de alimentos são aplicados para esterilização de superfícies de pães, xaropes, sacos plásticos, garrafas de água mineral, carnes mantidas sob refrigeração. Porém, seu uso é limitado, devido a seu baixo poder de penetração, pois trata-se de radiação não ionizante.

4.2- Raios gama e raios X (radiações ionizantes)têm alto poder de penetração. Raios gama tem sido empregado na esterilização de certas vacinas e sanitização de alimentos embalados.

⇒ MÉTODOS QUÍMICOS • Glutaraldeído 2% - As soluções de glutaraldeído são indicadas para esterilização ou desinfecção de instrumentos médicos cirúrgicos sensíveis ao calor, equipamentos de anestesia gasosa, fibroscópios, partes ópticas de endoscópios etc. Exposição em torno de 18 horas.

• Formaldeído (Solução Alcoólica 8%) - A fórmula alcoólica apresenta 8% de Formaldeído. Sua atividade germicida é atribuída à inativação de proteínas e ácidos nucléicos microbianos. Exposição em torno de 18 horas.

• Formaldeído (solução aquosa 10%) - As soluções aquosas além de não liberar vapores irritantes não possuem os inconvenientes das soluções alcoólicas sobre lentes de equipamentos ópticos e artigos de poliestireno e borracha em exposições prolongadas. Exposição em torno de 18 horas.

⇒ MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS • Estes métodos associam o produto químico com o uso de equipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo e a segurança dos profissionais de saúde, sendo utilizado para materiais termosensíveis.


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• 1 – Esterilização por óxido de etileno: A esterilização é realizada à baixa temperatura em torno de 54ºC durante 8 a 12 horas. Para materiais de implantes e próteses se recomenda uma aeração ambiental em torno de 7 dias.

• Esterilização por vapor de formaldeído à baixa temperatura: A esterilização por vapor de formaldeído é realizada em autoclaves, em concentrações baixas em torno de 2% sob forma de vapor, em temperaturas que variam entre 73ºC e 82ºC durante 90 e 180 minutos. Precauções - As precauções recomendadas para estas soluções consistem em utilizar luvas ou pinças para o manuseio de artigos nelas imersas e, nos casos das soluções alcoólicas, mantê-las em cubas de esterilização fechadas em ambientes ventilados.

DESINFECÇÃO E ASSEPSIA * Desinfecção - A Desinfecção consiste na destruição ou

redução dos microrganismos na forma vegetativa, presentes num material inanimado ou superfícies inertes, mediante a aplicação de agentes físicos ou químicos. A desinfecção não implica a eliminação de todos microrganismos viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies ou local tratado.

* Assepsia - É o termo usado para designar o processo de desinfecção de tecidos vivos. Os anti-sépticos são preparações contendo substâncias microbiocidas ou microbiostáticas podendo ser usadas na pele, mucosas e ferimentos. Exemplos: soluções alcoólicas, soluções iodadas, soluções de permanganato de potássio, formulações à base de sais de prata, iodóforos, etc.

Obervações: − Não são recomendados a utilização de iodofóros no recém-

nascido, pois pode ocorrer absorção transcutânea de iodo com supressão da função tireoideana.

− Para a finalidade de antissepsia, não são permitidas as formulações contendo mercuriais orgânicos, acetona, quaternários de amônio, hipoclorito a 0,5%, éter e clorofórmio.

A desinfecção pode ser realizada por agentes físicos e químicos. • AGENTES FÍSICOS: 1.0. Pasteurização - É um processo empregado na indústria de

alimentos que elimina microrganismos patogênicos (bacilos tíficos, paratíficos e desintéricos, brucelas, estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como o leite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os a temperatura de 63oC por 30 minutos ou 75oC por 15 segundos.


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Os tempos e as temperaturas de pasteurização dependem do método e do produto a ser tratado. A pasteurização não é um processo de esterilização, uma vez que esporos e bactérias não patogênicas podem permanecer viáveis.

1.1. Água Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de lavados com detergente adequado, podem ser desinfetados por imersão em água a 100oC durante 10 minutos.

• AGENTES QUÍMICOS: Principais compostos utilizados em desinfecção e assepsia:

– Álcoois - soluções a 70% e 80%

– Fenóis e Derivados - Fenol, Cresóis, Ac. salicílico e Ác. Benzóico.

– Halogênios - Iodo, Iodóforos (Polivinil Piralidona-Iodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sódio ou cálcio).

– Metais Pesados - Mercúrio (Mercúrio Cromo, Mertiolato), Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre).

– Corantes - Verde brilhante e malaquita. Violeta de Genciana, Azul de Metileno.

– Detergentes Sintéticos -Aniônicos: laurilsulfato de sódio -Catiônicos: cloreto de cetilpiridínio.

– Oxidantes - Água oxigenada, permanganato de potássio. – Ácidos, Álcalis - Ác. Sulfúrico, Ác. clorídico, soda

(NaOH).

NOTAS: As seguintes precauções deverão ser tomadas para evitar

a sobrevivência de microrganismos contaminantes, falhas de esterilização ou a recontaminação dos artigos esterilizados, independentes do processo de esterilização.

1. A escolha do processo de esterilização

− Processo de esterilização mais eficaz é o vapor saturado sob pressão, seguindo-se o calor seco e os esterilizantes químicos.A escolha depende da natureza do artigo a ser esterilizado.

2. Limpeza prévia − A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, sangue, pus

e outras secreções) protege os microrganismos contaminantes do contato indispensável com o agente esterilizante. Por outro lado, quanto menor for o número de microrganismos presentes, maior será a possibilidade de esterilização. Assim, é necessário lavar cuidadosamente todos os artigos em soluções desencrostantes (hiploclorito de sódio, detergentes sintéticos etc), e enxaguá-los abundantemente com água corrente e no último enxague com água destilada ou deionizada antes de submetê-los a qualquer processo de esterilização.


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3. Invólucros e pacotes

− Os invólucros devem permitir o contato dos artigos com o agente esterilizante, bem como mantê-los livres de microrganismos durante a estocagem. A permeabilidade ao vapor e ao óxido de etileno, a impermeabilidade a partículas, a ruptura e a flexibilidade são as características mais importantes para a seleção de um invólucro.

4. Estocagem

− Após a esterilização, é essencial que os pacotes estejam íntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidade dos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido da câmara ainda estiver quente, o vapor contido no papel condensa na temperatura ambiente, criando uma pressão negativa que aspira o ar (contaminado) do ambiente através do invólucro. Este atua como se fosse um filtro, deixando-se penetrar pelo ar e retendo células, partículas bacterianas ou não. Se este invólucro não estiver íntegro, os artigos no pacote sofrerão recontaminação. A umidade além de diminuir a resistência de invólucros de papel, facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtração do ar. Para evitar a contaminação posterior, recomenda-se o uso de cestos metálicos.

− Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos possível, sempre com delicadeza e estocados em ambientes limpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em torno de 25oC, reesterilizados quinzenalmente quando não utilizados.

5. Medidas Preventivas

− Uso de luvas, Avental e, se necessário, máscara.

− Materiais contaminados por agentes patógenos devem ser esterilizados antes de serem descartados.

− Após o manuseio de materiais contaminados por agentes microbianos, lavar cuidadosamente as mãos com sabão ou soluções detergentes antissépticas, como soluções aquosas de Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidina a 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% de clorofenol. Aula Prática - Análise do efeito da ação de anti-sépticos

relacionada ao crescimento bacteriano.

Objetivo: Observar o efeito de anti-sépticos sobre o crescimento bacteriano na superfície da pele das mãos. Materiais: “Swab” estéril Placa com meio de cultura Ágar nutriente.


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Anti-sépticos: Sabão líquido e Solução álcool-iodado e álcool 70%

Técnica: 1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos,

sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a placa. 2. Lavar as mãos com água corrente e sabão líquido, deixar a

água escorrer espontaneamente em seguida colocar a ponta dos dedos sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a placa rapidamente.

3. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool iodado 2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2.

4. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool 70%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2.

5. Incubar a 37ºC por 24 horas. OBS:

• Esta prática deverá ser realizada com apenas um aluno de cada grupo.

• Para observação da eficácia dos anti-sépticos, utilizar dedos diferentes.

Resultado: Ação dos Agentes Crescimento Bacteriano

Álcool Iodado Álcool 70% Sabão Sem anti-sépticos

T é c n i c a s d e C o l o r a ç ã o d e B a c t é r i a s

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II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS As técnicas de coloração iniciadas por Paul Erlich e

Robert Koch (1843-1910) permitiram ao microbiólogo distinguir as células bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho e arranjo celular e diferenciá-las de acordo com as suas características tintoriais. Os corantes são divididos em dois grupos: os ácidos e os básicos. Os corantes básicos são sais com base corada que se unem eficazmente a substratos ácidos, tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azul de metileno, cristal violeta, fucsina básica, safranina). As bactérias comportam-se como material nuclear e desse modo, quase todos os corantes utilizados em bacteriologia são corantes básicos. Os corantes ácidos tendem a corar mais eficientemente os substratos básicos, como o citoplasma. MORFOLOGIA

As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo.

− Tamanho - as bactérias são microscópicas medindo desde 0,3

por 0,8µm até 10 por 25µm. As espécies de maior interesse

médico medem entre 0,5 a 1µm por 2 a 5µm.

− Forma - as bactérias podem ser classificadas quanto a forma em três grupos básicos: Cocos - células esféricas. Bacilos - células cilíndricas, em forma de bastonetes. Espirilos - células espiriladas. Algumas delas se comportam como bacilos curvos, em forma de vírgula, que podem ser denominados víbrios. Ex: Vibrio cholerae. Arranjos - Grupamentos bacterianos.

Dependendo do plano e do número de divisões através das

quais as bactérias continuam unidas, podem aparecer os seguintes arranjos:

1.Cocos Pares: diplococos (ex.: gonococos) Cadeias: (ex.: estreptococos) Tétrades ou cúbicos (Sarcina) Cocos em cachos (ex.: estafilococos)

2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como células isoladas, porém ocasionalmente, pode-se observar: bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos). Após a divisão de algumas bactérias, podem ocorrer movimentos característicos, por exemplo:, um movimento em chicotada pode levar as bactérias a posições paralelas.


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Divisões repetidas e seguidas desses movimentos determinam posições semelhantes a letras chinesas características do bacilo diftérico.

PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇO BACTERIANO PARA COLORAÇÃO 1-Preparação a partir de meio líquido

Usando alça de platina estéril, colocar duas a três alíquotas de cultura bacteriana preparada em meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia.

Espalhar sobre a lâmina, fazendo movimentos circulares de dentro para fora e deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente. Em seguida, realizar a fixação passando duas a três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen.

2-Preparação a partir de meio sólido

Colocar uma pequena gota de água destilada numa lâmina. Com alça de platina colocar sobre a lâmina uma pequena porção do crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lâmina e prosseguir a preparação como no item anterior.

3-Preparação a partir de material biológico

Usando um swab estéril (zaragatoa), friccionar a superfície da mucosa ou lesão oral por exemplo e fazer um esfregaço circular na superfície de uma lâmina. Deixar secar à temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo de ensaio e executar a fixação, como no item anterior.

COLORAÇÃO SIMPLES

Técnica de coloração caracterizada pelo uso de apenas um corante, permitindo a observação da forma, tamanho e grupamento da célula bacteriana. Esta técnica de coloração é bastante utilizada para a detecção de cocos que causam meningite (Neisseria meningitidis), em amostra de líquido cefalorraquidiano (LCR).

MÉTODO 1)Preparar o esfregaço bacteriano em lâminas; 2)Cobrir toda a lâmina com solução de azul de metileno, aguar dar 5 minutos e desprezar o corante na pia;

3)Lavar a lâmina rapidamente em água corrente, secar com papel de filtro ou à temperatura ambiente (sem esfregar) e observar em objetiva de imersão.

RESULTADO

Visualizar, descrever a morfologia e arranjo das bactérias existente na lâmina.


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COLORAÇÃO DE GRAM (Coloração diferencial) Este método de coloração foi empiricamente desenvolvido

pelo bacteriologista dinamarquês, Christian Gram, em 1884, e permite distinção entre diferentes bactérias que podem mostrar uma morfologia similar, porém com propriedades tintoriais diferentes. A coloração de Gram classifica as bactérias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas.

TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM

1)cobrir toda a lâmina com solução de cristal violeta, aguardar um minuto e desprezar o corante na pia;

2)cobrir a lâmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar o lugol na pia;

3)inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar a lâmina rapidamente em água corrente.

4)cobrir a lâmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos. Lavar, secar e observar em objetiva de imersão.

NOTAS 1)O Cristal violeta só se liga a parede celular bacteriana após a adição da solução de lugol (mordente)

2)O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco. 3)O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal violeta, poderá aparecer como artefato.

4)O descoramento para mais ou menos é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool-acetona.

5)A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células Gram Positivas freqüentemente se tornam Gram Negativas.

Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à parede da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo cristal violeta poderá ser retirado da célula, nessa fase de coloração. RESULTADO

Visualizar, desenhar a morfologia e classificar as bactérias nas lâminas de acordo com o seu comportamento diante dos corantes de Gram:

Bactérias Gram positivas → coradas em roxo

Bactérias Gram negativas → coradas em rosa INTERPRETAÇÃO

A coloração de Gram classifica as bactérias em Gram positivas ou Gram negativas. O mecanismo da coloração de Gram, se refere à composição da parede celular, sendo que as Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano e ácido teicóico, e as Gram negativas, uma fina camada de


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peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com o álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram negativas. Assim, o complexo cristal violeta iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído.

COLORAÇÃO DIFERENCIAL PELO MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882)

A coloração de Ziehl-Neelsen é o método para a pesquisa de bacilos álcool ácido resistentes (BAAR) incluindo-se o bacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactérias atípicas. Este método de coloração se baseia na propriedade das micobactérias de se corarem inicialmente pela carbolfucsina (a fucsina dissolvida numa solução de fenol-álcool-água) e resistirem a uma descoloração por álcool-ácido.

Através desta coloração, podemos visualizar um grupo restrito de bactérias que possuem sua parede celular constituída de lipídeos em grande concentração, devido a presença de cêras e ácidos graxos de cadeia longa(ácidos micólicos), que conferem à célula a característica de álcool-ácido resistência. COLETA DO MATERIAL 1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia. 2- Obter, de preferência o primeiro escarro da manha antes da ingestão de alimentos. 3- Orientar o paciente para escovar os dentes com água (não utilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes, inclusive com gargarejos. 4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossir profundamente, recolhendo o material no frasco de coleta estéril. 5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostra após nebulização. 6- Enviar ao laboratório o mais breve possível. O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares são impróprias para análise bacteriológica, pois não são representativas do processo infeccioso. PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO

Colocar as amostras em lâminas (novas e desengorduradas) com aplicador de madeira. Escolher a partícula mais densa ou uma mistura da amostra, quando só existirem pequenas


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partículas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar a amostra em 1/3 da lâmina, deixar secar à temperatura ambiente e fixar como no procedimento anterior.

Técnica: 1)Cobrir toda a lâmina com fucsina fenicada. 2)Com auxílio de uma chama, aquecer a lâmina, pela sua parte inferior até emitir vapores. Repetir duas vezes esperando o corante esfriar. Aguardar 5 minutos, não deixando o corante nem ferver nem secar.

3)Lavar a lâmina com água corrente, suavemente. 4)Inclinar a lâmina descorar com solução álcool ácido clorídrico, até não sair mais corante.

5)Lavar a lâmina com água corrente. 6)Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno de Loeffler durante 30 segundos.

7)Lavar a lâmina em água corrente. 8)Deixar secar e observar ao microscópio, com a objetiva de imersão.

Notas: 1.Na coloração de Ziehl, o aquecimento não deve ser feito muito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas até ligeira emissão de vapores.

2.A coloração de fundo é feita para corar bactérias e outras estruturas que foram diferenciadas, para o efeito contrastante ou distinção entre as bactérias e células presentes no material.

RESULTADO:

Visualizar, esquematizar e classificar as bactérias existentes nas lâminas. A classificação deverá ser quanto à resistência ou não das bactérias ao descoramento em álcool ácido.

Bactérias álcool ácido resistente (BAAR) permanecem coradas de vermelho pela fucsina.

Bactérias não álcool ácido resistente (BNAAR) não retém a fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno.

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE GRAM Preparação do Cristal de Violeta: Cristal violeta 1g Ácido fênico 2g Álcool absoluto 10ml Água destilada 100ml Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o

álcool. Juntar aos poucos o ácido fênico, misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homogênea. Juntar a água


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pouco a pouco, misturando bem. Filtrar após 24 horas de repouso, em papel de filtro.

Preparação do Lugol: Iodo 1g Iodeto de potássio 2g Água destilada 300ml Triturar o iodo com o iodeto de potássio em gral de

vidro. Juntar a água e misturar bem. Preparar em quantidade que seja usada antes de 30 dias.

Preparação de álcool acetona: Álcool 800ml Acetona 200ml Unir os dois componentes e misturar bem. Preparação da Fucsina para Coloração de Gram: Fucsina 2,5g Álcool etílico 100ml Água destilada 90ml A solução estoque (fucsina e álcool etílico) deve ser

preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem. Para usar 10ml da solução em 90ml de água destilada, isto é, diluir a 10% em água destilada.

Armazenamento de corantes: Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro

âmbar em local onde as condições ambientais sejam favoráveis, com temperatura entre 20 e 25ºC (T.A.) e sem teor de umidade.

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN Preparação de Fucsina fenicada: Fucsina básica 1g Álcool a 95% 10ml Fenol fundido 5g Água destilada 100ml Dissolver num gral o corante no álcool. Adicionar aos

poucos o ácido fênico, misturando sempre, de modo a obter uma mistura bem homogênea. Juntar a água pouco a pouco, lavando o gral.

Filtrar após 24 horas de repouso. Ácido clorídrico Álcool 95% 100ml Ácido clorídrico (dens. 1,19) 1ml


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Azul de Loeffler A)Azul de metileno 10,3g Álcool a 95% 30ml

B)Solução de hidrato de sódio a 0,01% 1ml Água destilada 100ml

Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em água destilada.

M e i o s d e C u l t i v o B a c t e r i a n o

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III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO Meios de cultivo são compostos de água e de nutrientes

essenciais ao crescimento de microrganismos. Basicamente, um meio de cultivo deve conter além de

extrato de carne para o fornecimento de proteínas, carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sódio.

A constituição de um meio de cultivo adequado é bastante variada e depende das exigências nutricionais do microrganismo.

Os meios de cultivo são utilizados para o isolamento e identificação de microrganismos, testes para controle de esterilização ambiental, análise de alimentos e de água, etc.

Os meios de cultivo podem ser preparados no laboratório de microbiologia de duas formas: (1) a partir de seus ingredientes básicos, (2) dos desidratados disponíveis comercialmente, ou podem ser comprados prontos para uso em tubos de ensaio ou placas de Petri.

Didaticamente, os meios de cultivo podem ser classificados quanto à consistência e quanto à função. a) Quanto à consistência: o meio pode ser líquido, semi-sólido

e sólido.

− Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão dissolvidos em aquosa. São os caldos (“broth”).

− Meio semi-sólido: Esse meio possui na sua composição além dos nutrientes, ágar (polissacarídeo extraído de algas marinhas) a 0,5%.

− Meio sólido: É um meio que possui na sua composição nutrientes e um teor de 1,5% de ágar. Apresentado em placas ou tubos inclinados ou não.

b) Quanto à função: O meio de cultivo pode ser enriquecedor,

seletivo, diferenciador e de manutenção.

− Meio enriquecedor ou enriquecido: É aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento. Ex.: BHI, Ágar sangue, Ágar chocolate.

− Meio seletivo: É aquele que contém substâncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, sem impedir o crescimento de outros.

Ex.: Ágar SS (Salmonella, Shigella)

− Meio diferenciador ou indicador: É empregado para detectar colônias bacterianas com propriedades distintas. As bactérias acidogênicas são conhecidas pela ação da cor do indicador ácido-base adicionado ao meio. As bactérias que hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas zonas claras produzidas nos meios contendo suspensões de amido. Bactérias hemolíticas são visualizadas pelas alterações produzidas no ágar sangue. Os produtores de gás sulfídrico


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formam uma zona escura de sulfito ferro no meio contendo excesso de ferro.

Ex.: Ágar EMB, Ágar sangue.

− Meio de manutenção: É um meio utilizado para estocagem e deve ser de baixo teor nutritivo para evitar a rápida morte celular, devido a eliminação de substâncias tóxicas resultantes do metabolismo dos microrganismos.

Ex.: Ágar Nutriente. Preparação: Um fator que influencia na preparação do meio de cultivo

é a temperatura. Ao preparar um meio de cultivo não podemos manter à temperatura ambiente uma solução não estéril por mais de uma hora, devido a possibilidade de evaporação da água e de crescimento microbiano. Alguns componentes são utilizados pelos microrganismos e os demais, pelo efeito da evaporação, se concentram. Após preparados os meios devem ser esterilizados pelo processo de esterilização adequada.

Técnica Preparação de meio líquido: Meio de B.H.I. (Brain-Heart-Infusion). Componentes do meio:

Infusão de coração ................... 250g Infusão de cérebro ................... 200g Peptona ............................... 10g Dextrose................................ 2g Cloreto de Sódio ....................... 5g Fosfato de Sódio ..................... 2,5g Água destilada ...................... 100ml

Execução

a)Adicionar 100ml de água destilada aos ingredientes previamente pesados;

b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen ou forno de microondas;

c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml por tubo. Colocar tampão de algodão em cada tubo;

d)Autoclavar (121ºC por 15 a 20 minutos). Preparação de meio sólido: Meio Ágar nutriente (Ágar Base) ou Ágar Gelose. Componentes do meio:

Extrato de Carne ....................... 3g Peptona ................................ 5g Ágar ................................. 15g Água destilada ..................... 1000ml


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Conservação dos meios de cultivo

Após preparados, os meios devem ficar à temperatura ambiente até o esfriamento total. Quando a quantidade de meio preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve ser armazenado em geladeira dentro de sacos plásticos para evitar desidratação. Quando a quantidade de meio for grande e não de uso imediato, deve ser distribuído em frascos com rolha, selados com tampas de alumínio e logo após autoclavados.

A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode ser conservada à temperatura ambiente durante anos e outros que contenham substâncias termolábeis em sua composição são guardados em geladeiras.

Para usar frascos de meio líquido, abrimos o selo de alumínio, retiramos a rolha de borracha com cuidados assépticos e, em ambiente estéril, transferimos o meio para tubos estéreis (através de pipetas).

Para usar frascos de meio sólido, fundimos o ágar imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno de microondas a temperatura de 100oC. Após a fusão do ágar abrimos o selo de alumínio, retiramos a rolha de borracha e transferimos o meio para tubos (através de pipetas estéreis) ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura ambiente.

I s o l a m e n t o e I d e n t i f i c a ç ã o d e B a c t é r i a s G r a m P o s i t i v a s

_______________________________________________________________________ 19

IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS Em se tratando de material clínico para ser submetido a

exame bacteriológico este deve ser colhido antes da administração de antimicrobianos, porque se a bactéria for sensível àquele antibiótico, dificilmente ela crescerá nos meios de cultura. A bactéria poderá estar morta no momento da colheita ou então ter o seu crescimento inibido pelo antimicrobiano presente no material clínico.

1- ISOLAMENTO - As bactérias podem ser cultivadas in vitro em meios de cultura que lhes forneçam todas as condições nutricionais e ambientais necessárias ao seu crescimento.

As culturas são feitas pela semeadura dos materiais clínicos em meios sólidos distribuídos em placa de Petri, em tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos.

Depois de semeados os meios devem ser incubados em temperatura e atmosfera adequadas. O período de incubação varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactéria. A grande maioria das bactérias pode ser cultivada em 24 a 48 horas. Exceções são feitas para o cultivo de Neisseria (14-16hs) e Mycobacterium (até 21 dias).

Material para colheita e isolamento: Abaixador de língua "Swab" Ágar sangue Procedimento: Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto

da superfície do meio distribuído em placa e semear pela técnica de estrias. Incubar a placa a 37ºC por 24h e fazer a identificação bioquímica e diferenciação de atividade hemolítica e enzimática.

2- IDENTIFICAÇÃO: 2-1 Gênero: Streptococcus

As espécies de maior interesse clínico são:

Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,

Streptococcus pneumoniae. Atividade hemolítica Os estreptococos podem ser classificados de acordo com o

atividade hemolítica no no meio de ágar sangue em:

a)β-hemolíticos: quando lisam completamente as hemácias (in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona clara ao redor da colônia.


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b)α-hemolíticos: quando causam lise incompleta das hemáceas com liberação de pigmento verde (redução da hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor da colônia.

c)γ-hemolítico: ausência de atividade hemolítica.

Morfologia celular: Corados pelo método de Gram, aparecem como Gram

positivos esféricos ou lanceolados, de tamanho variável, isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas.

Diferenciação bioquímica:

Estreptococos α-hemolíticos Utilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para

diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensível a optoquina) de estreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o Teste de Solubilidade em Bile. As bactérias solúveis em Bile são da espécie Streptococcus pneumoniae, as bactérias insolúveis em Bile são de estreptococcos viridescentes.

Estreptococos β-hemolíticos

Os estreptococos β-hemolíticos elaboram carboidratos grupo-específicos. Estes carboidratos são utilizados em reações de precipitação com anti-soros específicos, que possibilitem a separação dos grupos. Grupo A é representado pelo Streptoccus pyogenes. 1. O Teste de sensibilidade à Bacitracina permite separar os

estreptococos do grupo A (cerca de 85%) dos demais grupos. Nos resultados de identificação baseados nesta prova deve-

se indicar estreptococos β-hemolíticos do grupo A pelo teste de Bacitracina.

2. Pyr Teste – Baseado na hidrólise enzimática da L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide. Destina-se a identificação do Streptococcus pyogenes. A hidrólise através da enzima L-pyrroglutamyl-aminopeptidase, presente nesta bactéria é verificada através da reação do PYR Reagente com a beta-naphtylamide livre que forma uma base de SHIFF de coloração vermelha-cereja.

2-2 Gênero Staphylococcus

As três espécies de maior interesse clínico são: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus saprophyticus.

Morfologia celular São cocos Gram positivos que podem apresentar-se

isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados em cachos.

Identificação e diferenciação


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a)Atividade enzimática Prova de coagulase: A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de cultura em caldo. Incubar em banho-maria a 37ºC e verificar a intervalos de 30 minutos, se há formação de coágulo. O

Staphylococcus aureus é produtor de coagulase. O Staphylococcus epidermidis, não produtor de coagulase, é usualmente considerado não patogênico mas pode estar envolvido em certas situações clínicas: endocardite bacteriana, em cirurgia com prótese, em transplante de medula e em cateterismo venoso (Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica – Ministério da Saúde).

b)Sensibilidade a novobiocina Teste de novobiocina Preparar uma suspensão em caldo e semear em ágar. Colocar um disco de novobiocina (5mg), incubar a 37ºC por 24 horas e verificar a formação de um halo de inibição de 14mm. Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente a droga) do S. epidermidis (sensível a droga). O S. saprophyticus é causa relativamente freqüente de infecção do trato urinário em pacientes jovens.

Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação

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V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO

Introdução: A análise da sensibilidade das bactérias aos agentes

antimiccrobianos está relacionada à várias técnicas ou métodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar a sensibilidade e a resistência de determinado microrganismo a antimicrobianos.

DETERMINAÇÃO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTÉRIAS

A identificação de bactérias isoladas de espécimens clínicas necessita de teste complementar para determinar o perfil de sensibilidade daquela espécie frente a quimioterápicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas disponíveis no combate àquela infecção, são estudadas por grupos (aminoglicosídeos, betalactâmicos, fluorquinolonas, macrolídeos, peptídeos e sulfas) e em concentrações padronizadas (proporcionais às concentrações atingidas no soro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "in vitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinado isolado bacteriano são selecionadas pela seletividade tóxica, efeitos secundários, facilidade de administração (oral e parenteral), e pelos custos do tratamento. Várias técnicas foram desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby, Bauer & Turck (1966) é utilizada mundialmente por apresentar resultados rápidos e seguros.

Um segundo tipo de teste de sensibilidade é realizado utilizando-se espécies não patogênicos, para fins de pesquisa básica, quando se deseja estudar mecanismos de ação das drogas ou modelos de resistência antimicrobiana ou ainda para marcar uma população. Neste caso, são determinados os grupos de drogas e a concentração mínima inibitória (CMI) por método quantitativo.

Objetivos: 1) Avaliação da atividade e do espectro de ação de novos

agentes antimicrobianos; 2) Nos estudos de populações bacterianas, para estabelecer o

padrão de sensibilidade sob o efeito seletivo de antimicrobianos;

3) Como marcadores epidemiológicos.

Fundamento: Substâncias antimicrobianas são incorporadas ao meio de cultivo (líquido ou ágar), em concentrações inibitórias para aqueles organismos sensíveis. A

concentração é dada em µg/ml ou Unidades Internacionais (UI).


___________________________________________________________________________ 23

Métodos: 1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianas são bactericidas para determinada espécie bacteriana numa determinada concentração. Ex.: Técnica de Kirby Bauer(1966).

2.Quantitativo - Pesquisa que concentração de determinada droga antimicrobiana é inibitória para uma espécie bacteriana isolada. Determinação da concentração mínima inibitória (CMI).

Método de difusão com disco (Técnica Kirby Bauer): Difusão da droga, sob forma de disco ou comprimido na superfície do meio sólido. 1. Padronização do inóculo bacteriano:

A partir da placa original da cultura bacteriana do microrganismo a ser testado são transferidas 4 a 5 colônias para um meio de cultura líquido (Caldo-Soja-Caseína, Caldo BHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a 4 horas. A densidade do inóculo deve ser comparada com a escala de turbidez de McFarland (ácido sulfúrico + cloreto de bário), equivalente a 104 bactérias por ml de meio. 2. Semeio: Realizado através de “swab” estéril embebido no inóculo bacteriano e passado em toda a área da superfície do meio ágar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixar secar por 2 minutos.

Com auxílio de uma pinça estéril colocar sob a superfície do meio inoculado os discos de antibióticos em pontos eqüidistantes (30 mm).

Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquela população bacteriana por 18-24h.

Leitura: Observar halo de inibição em torno do disco de antimicrobiano. O diâmetro deste halo é medido em mm (halômetro) e comparado com a tabela recomendada pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Para cada agente antimicrobiano, o diâmetro do halo poderá ser interpretado como sensível (S), resistente (R) ou intermediário (I).

Teste E: Método de difusão mais avançado que permite estimar a concentração mínima inibitória (CMI), a mais baixa concentração de antibiótico que impede o crescimento bacteriano. Uma tira revestida de plástico contendo um gradiente de concentração do antibiótico, e a CMI pode ser lida em uma escala impressa na tira.

Utilização de Drogas de baixa difusão: moléculas grandes e polarizadas. Considerar pequenos halos como sensíveis.

Drogas de alta difusão: moléculas pequenas e apolares. Considerar halos com maiores diâmetros que os padrões.


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Considera-se uma população sensível a determinada droga quando esta população é inibida por concentração três ou mais vezes inferior a concentração que a substância atinge no sangue. Amostras resistentes são inibidas por concentrações intermediárias.

Ex.: Droga X atinge concentração sérica de 32µg/ml.

Populações que são inibidas por 8µg são consideradas

sensíveis e aquelas inibidas por concentrações acima de 16µg consideradas resistentes.

Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretação: Utilização de meio muito ricos ou muito pobres em composição de "simular" falsos microrganismos resistentes ou sensíveis. Utilização de inóculos muito concentrados (densos) e formação de tapetes de células mortas entre bactérias vivas e a droga. Para algumas infecções como difteria (C. diphteriae), meningite meningocócica não são realizados antibiogramas. Utilizam-se drogas de escolha. Devido a variabilidade de marcas de resistência a drogas devem ser realizados sempre nas bactérias Enteropatogênicas (Salmonella, Shigella, E. coli soropatogênicas e para Mycobacterium tuberculosis). Observar a concentração da droga que impregna o papel de filtro que compõe o disco ou comprimido. Observar prazo de validade das drogas ensaiadas.

Seleção de substâncias antibióticas: Bactérias gram positivas: Penicilina, Eritromicina,

Clindamicina, Gentamicina e Tetraciclinas. Para Staphylococcus não precisa testar Ampicilina e Carbenicilina (Produtores de betalactamases). A meticilina representa betalactâmico (penicilina) não degradada pela betalactamase.

Bactérias gram negativas (Enterobacteriaceae):

Ampicilina, Cefalosporinas, Gentamicina, Tetraciclinas, Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina.

Infecções urinárias: Ampicilina, Ac. Nalidíxico,

Nitrofurantoínas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas. Para infecções por Pseudomonas sp.: Carbenicilina,

Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina. Para infecções por cêpas de Anaeróbios: Bacteróides,

Peptococos, Fusobactérias e Clostrídios: Clindamicina, Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas.


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Microrganismos de referência Mantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E.

coli (ATCC25922). Teste esses microrganismos de referência, pelo método

que foi descrito, usando discos de antibióticos representativos daqueles a serem empregados no teste de isolados clínicos.

Comparações de resultados para os microrganismos-

controle de teste para teste oferecem uma verificação na reprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dos discos-teste.

Limitações do método

O método de interpretação descrito aqui se refere a patógenos de crescimento rápido e não deve ser aplicado a microrganismos de crescimento lento, para os quais os critérios dos halos não são apropriados. E para antibióticos que se difudem lentamente em ágar, ex: polimixina B.


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Tabela 1.

Limites para interpretação do antibiograma com 24 antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica.

Zonas de inibição (em mm)

Antibacteriano Símb. Conc. disco

Resistente Intermediário

Sensível

Amicacina AM 30mcg 14 ou menos 15-18 17 ou mais Ampicilina ao testar microrganismos Gram-negativos e enterococos

AP

10mcg

11 ou menos

12-13

14 ou mais

Ampicilina ao testar estafilococos e microrganismos sensíveis à penicilina G

AP

10mcg

20 ou menos

21-28

29 ou mais

Ampicilina ao testar Haemophilus sp.

AP

10mcg

19 ou menos

___

20 ou mais

Bacitracina BC 10un. 8 ou menos 9-12 13 ou mais Carbenicilina ao testar Proteus sp. E E. coli.

CR

100mcg

17 ou menos

18-22

23 ou mais

Carbenicilina ao testar Pseudomonas aeruginosa

CR

100mcg

13 ou menos

14-16

17 ou mais

Cefalotina ao relatar sensibilidade a todas as cefalosporinas

CF

30mcg

14 ou menos

15-17

18 ou mais

Clindamicina ao relatar sensibilidade à clindamicina e à lindomicina

CL

2mcg

14 ou menos

15-16

17 ou mais

Cloranfenicol Colistidina Eritromicina Estreptomicina Gentamicina Konanilcina Nalidíxico, ácido Neomicina Nitrofurantoína Novoblocina Oxocilina

CO CL EL ET GN KN AN NO NT NV OX

30mcg 10mcg 15mcg 20mcg 20mcg 30mcg 30mcg 30mcg 300mcg 30mcg 6mcg

12 ou menos 8 ou menos 13 ou menos 11 ou menos 12 ou menos 13 ou menos 13 ou menos 12 ou menos 14 ou menos 17 ou menos 9 ou menos

13-17 9-10 14-17 12-14 13-14 14-17 14-18 13-16 15-16 18-21 10-13

18 ou mais 11 ou mais 18 ou mais 15 ou mais 15 ou mais 18 ou mais 19 ou mais 17 ou mais 17 ou mais 22 ou mais 14 ou mais

Penicilina G. ao testar Estafilococos

PN

10un.

20 ou menos

21-28

29 ou mais

Penicilina G. ao testar outros microrganismos

PN

10un.

11 ou menos

12-21

22 ou mais

Penicilina G. PL 50un. 8 ou menos 0-11 12 ou mais Sulfazotrin (Sulfatomoxazol + Trimetoprin)

SFT

25mcg

10 ou menos

11-15

16 ou mais

Sulfonamidas Tetraciclina Tobramicina Vancomicina

SF TT TB VC

300mcg 30mcg 10mcg 30mcg

12 ou menos 14 ou menos 12 ou menos 9 ou menos

13-16 15-18 13-14 10-11

17 ou mais 19 ou mais 15 ou mais 12 ou mais

I s o l a m e n t o e I d e n t i f i c a ç ã o d e B a c t é r i a s G r a m N e g a t i v a s

___________________________________________________________________________ 27

VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS As bactérias Gram-negativas incluem vários gêneros de

bacilos fermentadores de carboidratos (Enterobactérias) ou não fermentadores de carboidratos (Ex.: Pseudomonas, Acinetobacter). Os bacilos mais freqüentemente isolados de amostras clínicas em laboratórios de microbiologia pertencem a família Enterobacteriaceae e são denominados enterobactérias (Ex: Escherichia coli, Klebsiella,

Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, Proteus, Serratia, etc.). Esses bacilos estão amplamente distribuídos na natureza e são encontrados principalmente no trato intestinal do homem e de animais.

O isolamento e identificação das bactérias Gram-negativas baseiam-se principalmente em reações bioquímicas que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo bacteriano.

1 - ISOLAMENTO Para o isolamento dos bacilos Gram-negativos são

utilizados principalmente meios seletivos diferenciais.

a) Meios de isolamento Ágar salmonella Shigella (SS), Ágar Hektoen (HE), Ágar MacConkey, Ágar Verde Brilhante, Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB), Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Ágar Bismuto Sulfito. b) Técnica de semeio para isolamento

Transferir o inóculo bacteriano para um ponto da superfície do meio de cultivo distribuído em placa e semear pela técnica de estrias utilizando a alça de platina

flambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer a diferenciação e identificação bioquímica. 2 - IDENTIFICAÇÃO (Provas bioquímicas) 2-1. Fermentação de carboidratos (lactose, sacarose, glicose)

Nos sistemas de provas bacteriológicas o processo de

fermentação é detectado por observação visual das mudanças de cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos ácidos são formados pelas bactérias.

a) Princípio

Os testes de fermentação de carboidratos determinam a capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado


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açúcar, incorporado numa concentração de 0,5 a 1,0% em meio base de vermelho de fenol, produzindo ácidos com ou sem gás. b) Meio: base de vermelho de fenol Indicador de pH: Vermelho de fenol Ácido (cor amarela) - pH < 6,8 Alcalino (cor rosa) - pH > 8,4 Neutro (cor laranja) - pH = 7,4 c) Técnica

Transferir, com alça de platina estéril, uma colônia bacteriana isolada para o meio líquido vermelho de fenol

adicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oC por 18-24h.

d) Resultado

POSITIVO: cor amarela -- presença de ácido (carboidrato fermentado)

NEGATIVO: cor rosa -- ausência de ácido (Carboidrato não fermentado) 2-2 Ágar TSI (Ágar Tríplice-açúcar-ferro)

a) Princípio

No meio TSI distribuído em tubos de ensaio observa-se a fermentação ou não dos açúcares (lactose, glicose e sacarose) pelas bactérias Gram-negativas, com produção ou não de gás CO2. Também pode se observar a formação de H2S (gás sulfídrico

ou sulfeto de hidrogênio) pela sua reação com o sulfato ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de sulfeto ferroso que se manifesta por uma reação visível de cor negra. b) Meio TSI

Neste meio, além do ágar e das fontes de carbono e de nitrogênio, também estão presentes o tiossulfato de sódio que é uma fonte de enxofre para a produção de H2S e o indicador

de pH vermelho de fenol,que já foi visto no tópico anterior. c) Técnica

Transferir a colônia bacteriana isolada para o meio TSI, utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio em uma única picada. Em seguida, fazem-se estrias na superfície inclinada. Incubar

a 37oC por 18-24h.

d) Resultado e interpretação O resultado é obtido pela visualização da mudança de cor

no pico (superfície inclinada) e no fundo (profundidade) do tubo de ensaio contendo o ágar TSI:


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• Pico alcalino/fundo alcalino - Ausência de fermentação dos açucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter.

• Pico alcalino/fundo ácido - Fermentação apenas da glicose. Ex: Shigella.

• Pico alcalino/fundo ácido e negro - Fermentação da glicose e produção de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter.

• Pico ácido/fundo ácido - Fermentação dos três açucares. Ex: Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outros componentes do grupo coliforme. 2-3. Motilidade

a) Princípio e meio

O meio de cultivo apropriado para teste de motilidade bacteriana deve ser semi-sólido (0,5% de agar) para permitir a difusão de bactérias móveis. b) Técnica

Inocular em uma única picada a colônia bacteriana isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estéril.

Incubar a 37oC por 18-24h. c) Resultado

A motilidade bacteriana é detectada pelo exame macroscópico do meio para se observar uma zona de crescimento difuso (turbidez) que parte da linha de inoculação feita com a agulha de platina. 2-4. Citrato

a) Princípio

Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono para seu metabolismo e crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrogênio presente no meio também será, havendo liberação da amônia com a conseqüente alcalinização do meio. b) Meio: Ágar Citrato de Simmons

Este é um meio sólido no qual a única fonte de carbono é o citrato de sódio, tendo como indicador de pH o azul de bromotimol. c) Técnica

A bactéria em estudo é inoculada na superfície do ágar inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfície do meio,

utilizando-se a alça de platina flambada. Incubar a 37oC por 18-24h ou até 3 dias, se necessário.

d) Resultado POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilização do citrato


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NEGATIVO: meio verde (neutro) - Não utilização do citrato 2-5. Teste da lisina descarboxilase

a) Princípio

Determinar a habilidade enzimática de uma determinada bactéria em descarboxilar o aminoácido lisina, com a subsequente alcalinização do meio devido a formação de amina alcalina (cadaverina). b) Meio LIA (Ágar lisina ferro)

Este meio contém como indicador o púrpura de bromocresol:

Ácido: cor amarela -- pH < 5.2 Neutro a básico: cor púrpura -- pH = 6.8

c) Técnica A bactéria teste é inoculada em uma única picada no meio

LIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platina estéril. Em seguida, fazem-se estrias na superfície

inclinada. Incubar a 37oC por 24h. d) Resultado POSITIVO: meio púrpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilação da lisina e conseqüente formação de aminas. NEGATIVO: meio amarelo (ácido) - Não ocorreu a descarboxilação da lisina. A acidificação do meio ocorre porque a bactéria fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio. 2-6. Teste de Indol

a) Princípio

Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol a partir da molécula de triptofano. Quando ocorre a degradação deste aminoácido por bactérias que possuem a enzima triptofanase ocorre a formação de: Indol, ácido pirúvico e amônia. Este teste é útil para diferenciar a E.coli (indol positiva) de outras enterobactérias. b) Meio e reativo • Caldo Triptofano • Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composição: p-

dimetilaminobenzaldeído, HCL concentrado, álcool isoamílico (Kovac), álcool etílico absoluto (Ehrlich).

c) Técnica

Inocular o caldo triptofano com a bactéria em estudo e

incubar a 37oC por 18-24h. Em seguida, adicionar gotas do reativo de Kovac no tubo. d) Resultado


___________________________________________________________________________ 31

O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfície do meio após a adição do reativo indica a presença de indol e uma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada de álcool quando o indol produzido reage com o p-Dimetilaminobenzaldeído presente nos reativos de Ehrlich ou de Kovac. 2-7. Teste de urease

a) Princípio

Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar enzimaticamente a uréia pela urease com a formação de duas moléculas de amônia (NH3), resultando na alcalinização do

meio.

b) Meio caldo uréia Este meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol,

já visto anteriormente. c) Técnica

Inocular o caldo uréia com uma alça de platina carregada

de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por 18-24h.

d) Resultado POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presença de urease NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausência de urease 3 – MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO AUTOMATIZADOS 3-1. Sistema API 20E (bio Mérieux) – Identificação de Enterobactérias

O sistema de identificação API 20E consiste em tiras

plásticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contêm os substratos desidratados (meio de identificação bioquímica) e uma câmara plástica de incubação com tampa frouxa. Cada compartimento possui um pequeno orifício superior através do qual a suspensão bacteriana diluída em solução salina ou água destilada estéril pode ser inoculada com uma pipeta. A ação bacteriana sobre o substrato produz mudança de cor que é interpretada visualmente em 24 horas a 35ºC. O fabricante fornece folhas de trabalho para registro das interpretações visuais das reações coloridas, que em seguida são convertidas em número do biótipo de 7 dígitos, levando a identificação da espécie bacteriana.

Os 20 substratos incluídos para identificação de enterobactérias são: ONPG, arginina diidrolase, lisina descarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto de hidrogênio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges-


___________________________________________________________________________ 32

Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol, ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose.

Pelo sistema API 20E são identificadas mais de 100 espécies de bactérias Gram-negativas. Esse sistema é um dos mais utilizados nos laboratórios clínicos e de pesquisa.

Obs: Também são comercializados outros sistemas API para identificação de bactérias Gram-positivas. 3-2. Sistema VITEK

O sistema VITEK (bio Mérieux) é um sistema computadorizado que consiste em um módulo gerador de vácuo, leitor-incubador, computador-impressora e um monitor de computador. Este sistema é utilizado com cartões de teste VITEK para identificação bacteriana e provas de susceptibilidade a antibióticos, totalmente automatizadas. Este sistema permite a identificação de enterobactérias em 8 horas, sendo aceito como um método confiável para identificação rápida de bacilos Gram negativos nos laboratórios de microbiologia clínica.

Cada cartão de identificação possui 30 testes bioquímicos que não necessita adição de reagentes, evitando erros. VITEK é capaz de detectar mais de 300 espécies de microrganismos (bactérias Gram-negativos e Gram-positivos e leveduras).

A s p e c t o s M i c r o s c ó p i c o s e M a c r o s c ó p i c o s d o s F u n g o s 4 0

________________________________________________________________________

VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS Os fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos, obtendo sua alimentação a partir de matéria orgânica inanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos. Estes microrganismos causam doenças humanas, em animais e vegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (ou mofos) e as leveduras. Os bolores são filamentosos e pluricelulares e as leveduras se apresentam sob forma unicelular.

Conhecer os aspectos microscópicos e macroscópicos dos fungos é de extrema importância para a identificação destes organismos que são agentes etiológicos de processos infecciosos, de reações de hipersensibilidade imediata e tardia e produtores de micotoxinas.

A coleta do material é o primeiro passo para obtenção de um resultado laboratorial confiável. Deve-se sempre questionar o paciente em relação ao uso de medicações antifúngicas tópicas e/ou sistêmicas. Caso o paciente esteja fazendo uso da medicação, o mesmo deverá ser orientado a suspendê-la por um período de 15 dias, em caso de uso tópico e 1 mês, quando se tratar de drogas de uso sistêmico. Esta suspensão deve ser realizada com autorização médica.

É de grande importância que todos os espécimes clínicos encaminhados para diagnóstico laboratorial, venham acompanhados de uma ficha, que contenha no mínimo as seguintes informações: identificação e procedência do paciente, tempo de evolução da lesão, localização e aspectos clínicos da lesão, possíveis contatos com animais e solo, uso de drogas.

1)ASPECTOS MICROSCÓPICOS DOS FUNGOS 1.1- Exame microscópico direto

O diagnóstico microbiológico e imunológico das micoses pode ser feito pelo exame microscópico direto, exame histopatológico, cultivos, testes intradérmicos, pesquisa de anticorpos séricos e de antígenos. O exame microscópico direto é o método mais usado no diagnóstico de rotina das micoses por ser rápido e sensível, permitindo a visualização do fungo e em muitas ocasiões, sua identificação. É importante salientar que a realização do cultivo paralelamente ao exame direto é imprescindível para um completo diagnóstico laboratorial micológico.

A técnica de preparação para o exame direto, varia de acordo com o material biológico a ser investigado e da suspeita clínica da etiologia do processo.

♦ Preparação do exame direto com amostras clínicas densas (p.ex.: escamas epidérmicas, ungueais e pêlos):


________________________________________________________________________ a) Clarificar a amostra clínica, já sobre a lâmina, com 1 gota

da solução de hidróxido de potássio (KOH) a 10-20%; b) Aquecer suavemente a lâmina na chama do bico de Bunsen; o

calor juntamente com o KOH vai dissolver a queratina presente na amostra, clareando o material de fundo; esperar 10 minutos, tempo necessário para clarear o material de fundo.

c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodão (ou azul de Amann);

d) Cobrir com lamínula; e) Examinar ao microscópio com objetiva de 40X.

Exemplos de algumas características morfológicas dos fungos:

célula brotante

Pseudo-micélio Hifa cenocítica Hifa septada

Hifa artrosporada

Epidermophyton sp Microsporum sp Trichophyton sp

A- Macroconídeos B- Microconídeos


________________________________________________________________________

♦ Preparação da lâmina a partir do cultivo de fungos: a) Colocar 1 a 2 gotas do corante lactofenol azul-

algodão; b) Retirar uma pequena porção da colônia (do micélio

reprodutivo ou aéreo, no caso dos fungos filamentosos) e colocar sobre a lâmina;

c) Cobrir com lamínula; d) Observar ao microscópio com objetiva de 40X. Após o preparo da lâmina podemos visualizar os aspectos microscópicos dos fungos. Observações: � As amostras de consistência líquida e relativamente

claras podem ser examinadas diretamente ao microscópio após a mistura em uma gota de solução salina em lâmina de vidro.

� A utilização do corante lactofenol azul-algodão é importante porque o fenol inviabializa os microrganismos vivos e o azul-algodão cora a quitina, presente nas paredes das células fúngicas.

1.2- Aspectos microscópicos dos fungos filamentosos ou

bolores O fungo filamentoso se origina a partir de um

esporo, que emite um filamento tubular microscópico, chamado hifa, que posteriormente se ramifica formando um conjunto de hifas denominado micélio, que pode ser vegetativo ou reprodutivo (aéreo). Algumas hifas apresentam paredes transversais ou septos e são chamadas hifas septadas, outras não possuem septos e são chamadas hifas cenocíticas .

Microscopicamente, os bolores são identificados principalmente pelos tipos de esporos, corpos de frutificação e hifas. Os esporos são muito importantes na classificação dos fungos, sendo as classes diferenciadas, primariamente, pelas características morfológicas dos esporos.

A análise conjunta das características microscópicas, em geral, permite a classificação genérica do fungo. A definição da espécie, geralmente, é tarefa de laboratórios de referência.

1.3- Aspectos microscópicos das leveduras

Como leveduras, os fungos apresentam-se unicelulares com forma oval ou arredondada. A reprodução assexuada das leveduras ocorre principalmente por gemulação ou brotamento. Algumas vezes, após a gemulação, as leveduras e as células-filhas ficam aderidas, formando uma estrutura conhecida como pseudomicélio (p.ex., Candida). As leveduras também podem se reproduzir sexuadamente através de ascosporos ou basidiosporos. Portanto, a observação microscópica de


________________________________________________________________________ estruturas assexuadas e sexuadas é bastante empregada na identificação genérica das leveduras.

2) ASPECTOS MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS (Observação macroscópica das colônias em meio sólido).

Ao contrário do que se verifica no estudo das infecções bacterianas, em que o cultivo é o principal método diagnóstico, nas infecções fúngicas ele é um complemento do exame microscópico direto. As razões que podem contribuir para isso, são o crescimento lento dos fungos e as dificuldades para cultivar alguns deles.

O isolamento primário, seguido da correta identificação dos agentes etiológicos, é uma condição indispensável para o diagnóstico laboratorial das micoses, e, para tanto, a escolha do meio de cultura adequado é uma tarefa de extrema importância.

Uma ampla variedade de meios de cultura pode ser utilizada num laboratório de micologia, atendendo a diversos fins, tais como: isolamento primário do fungo a partir dos espécimes clínicos, a identificação taxonômica dos gêneros e espécies, a estocagem e manutenção em micoteca, e, mais recentemente a execução de testes de susceptibilidade frente a diferentes antifúngicos.

A seleção do meio a ser empregado deve, basicamente, levar em consideração o tipo de amostra biológica a ser semeado e a suspeita clínica.

Apesar da variedade de meios de cultivo disponíveis(muitos vendidos pronto para uso, outros preparados artesanalmente), o ágar Sabouraud ainda é o meio mais utilizado dentro de um labotatório de micologia. A esse meio podem ser acrescidos muitos inibidores,tais como o cloranfenicol e a cicloeximida, objetivando otimizar o isolamento em espécimes clínicas possivelmente contaminadas por bactérias e fungos anemófilos (fungos que apresentam suas estruturas de reprodução comumente vetorizadas por correntes de ar). O meio de Sabouraud é o principal meio de cultura utilizado na micologia médica. É utilizado para o cultivo primário geral dos fungos (leveduras, filamentosos e alguns dimórficos), emespecial para Dermatofítos, uma vez que as principais características macro e microscópicas desse grupamento fúngico são descritas a partir do seu crescimento nesse meio.

Porém é importante salientar que alguns fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus, Fusarium,

Scopulariopsis, ou algumas leveduras como o Cryptococcus neoformans, por exemplo, podem ter seu crescimento inibido na presença da cicloeximida.

As características principais deste meio são o seu pH ácido (5.8) e seu elevado teor em glicose, que o torna mais seletivo para fungos, dificultando o


________________________________________________________________________ crescimento bacteriano. Entretanto, o meio não é totalmente impediente para bactérias, por esta razão deve ser acrescido de antibióticos que inibem o crescimento destes microrganismos. O clorafenicol é um dos antibióticos mais utilizados, pela comodidade do seu uso, pois pode ser esterelizado na autoclave e pelo seu amplo espectro de ação.

A composição do ágar Sabouraud foi,inicialmente proposta pelo micologista Raymond Jacques Sabouraud, em 1904, e vem apresentando diversas modificações com o passar dos anos, com alterações na quantidade de alguns componentes, tais como a dextrose e a adição de substâncias inibidoras , como o clorofenicol e a cicloeximida. COMPOSIÇÃO DO MEIO ÁGAR SABOURAUD: Dextrose (glicose) ---- 20g Peptona -------------- 10g Ágar ------------------ 20g Água ---------------- 1.000ml pH final = 5.6 Dissolver agar, peptona e dextrose em água destilada, aquecendo em banho-maria. Autoclavar, por 15 minutos, a 121°C.


________________________________________________________________________ OUTROS MEIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO DOS FUNGOS: ágar batata dextrose, ágar malte, ágar fubá, ágar extrato de levedura glicose, etc. 2.1- Aspectos macroscópicos dos fungos filamentosos

A morfologia das colônias dos fungos filamentosos é um importante dado e pode auxiliar bastante em sua identificação. Para isso são feitas observações quanto à textura, cor, topografia, consistência, contorno da colônia, etc.

TEXTURA– A textura da colônia refere-se às características dos micélios aéreos em seu conjunto e pode ter aspecto:

• ALGODONOSO OU COTONOSO: micélio aéreo denso e alto;

• AVELUDADO: micélio aéreo baixo, lembrando veludo;

• PULVURULENTO: hifas planas, esfarelam-se facilmente devido à densa produção de conídias;

• CÉREO OU GLABROSO: superfície lisa, pois não produzem micélio aéreo.

COR- A colônia pode ser branca, amarelada, acinzentada, alaranjada, verde, rosa, creme, marrom, etc. A cor do verso e anverso da colônia e os anéis concêntricos de diferentes cores são aspectos a serem considerados na identificação. CONSISTÊNCIA- A colônias pode ser pastosa, branda, coriácea, mole, etc. CONTORNO- A colônia pode ser circular, oval, elíptica, irregular, etc. 2.2- Aspectos macroscópicos das leveduras

A maioria das leveduras cresce adequadamente a 30oC ou à temperatura ambiente em ágar Sabouraud. Características como cor, consistência, bordos, superfície e topografia também são observadas em meios de cultivo sólidos. Com 2 a 3 dias de incubação formam-se colônias de cor branca a creme, amarelada, alaranjada ou vermelha, de textura pastosa, mucóides ou secas, lisas ou enrugadas.

A habilidade da levedura crescer a 37oC é uma característica importante; a maioria das leveduras patogênicas cresce bem a 30-37oC, enquanto as saprófitas não crescem em temperaturas mais elevadas.


________________________________________________________________________

ASPECTOS DAS COLÔNIAS FÚNGICAS QUANTO AO RELEVO 1. Cerebriformes 2. Rugosas 3. Apiculadas 4. Crateriformes

A s p e c t o s M i c r o s c ó p i c o s e M a c r o s c ó p i c o s d o s F u n g o s

___________________________________________________________________________ 40

ASPECTOS DE COLÔNIAS FÚNGICAS QUANTO À TEXTURA 1.Algodonosas 2.Furfuráceas 3.Penungentes 4.Arenosas 5.Veludosas 6.Glabrosas

41VIII – REAÇÕES ANTÍGENO ANTICORPO Introdução teórica

A exposição de epítopos (antígenos=imunógenos) a um sistema de células e tecidos imunologicamente competentes, origina estimulação de linfócitos B e T . Os primeiros(LB), diferenciam-se após divisões mitóticas, em plasmócitos que são células munidas de um Sistema de membranas (Golgi e RE)próprios de células produtores e secretoras de proteínas. Estas proteínas são glicoproteínas globulares com função de se combinar quimicamente com os elementos que formam parte do epítopo que deu origem a todo este fenômeno celular e secretor.

Os linfócitos T, ao serem estimulados, secretam interleucinas, que são proteínas cuja função é estimular outros linfócitos T e B (interleucinas 2,4) macrófagos, NK, linfócitos citotóxicos (interferon gama)por exemplo.

Apenas discutiremos, por enquanto, a ação das globulinas produzidas pelos plasmócitos: Os anticorpos ou imunoglobulinas.

AÇÕES IN VITRO: Reações antígeno anticorpo

Estas acontecem entre a porção Fab das moléculas de anticorpo e o epítopo dos imunógenos. Nesta porção Fab, é que se estabelecem ligações não covalentes fracas como :pontes de Hidrogênio, ligações eletrostáticas, hidrófobas e mediante forças de Van der Waals. Conhecendo os tipos de ligações que se estabelecem e mantêm unidos o complexo antígeno- anticorpo, fica fácil entender o conceito de especificidade, pois somente poderão se formar estas ligações em número suficiente para se manterem estáveis, SE O ANTICORPO REALMENTE FÔR DIRIGIDO CONTRA ESSE EPÍTOPO. Se as ligações se formam também a nível de estrutura primária e secundária do anticorpo, formando numerosas ligações de curto alcance, o complexo é estável.

Então, numa primeira instancia, deve haver interação química entre imunógeno (antígeno quando falamos de reação in vitro

E FAB do anticorpo. Numa Segunda etapa, grande número de moléculas do complexo antígeno-anticorpo, tendem a formar malhas que naturalmente sedimentam como grumos grosseiros ou como sedimento fino, dependendo da condição física do antígeno. Se particulado (hemácias, bactérias, protozoários) se observam grumos; se solúvel, se forma fino precipitado com o imunocomplexo. ALGUNS CONCEITOS IMPORTANTES: � Através das reações sorológicas pode-se pesquisar

anticorpos contra um determinado antígeno bacteriano, parasitário, micótico, ou até mesmo contra componentes do

42próprio indivíduo como acontece nas doenças autoimunes. Nestes casos ,variações no título de anticorpos indicam evolução ou involução da doença ou infecção. Já ,quando interessa utilizar estas reações para detectar antígenos circulantes no soro ou plasma, basta saber se estes existem ou não, as reações podem ser apenas qualitativas. Se quiser quantificar o antígeno, basta comparar o resultado com concentrações de padrões bem quantificados.

� Título: é a maior diluição do soro que ainda reage positivamente numa reação antígeno-anticorpo. Assim, um alto título indica uma grande quantidade de anticorpos(foi necessário diluir muito os anticorpos presentes para que estes desaparecessem na unidade de volume pré-fixada. Ex.: título 1/10<1/455.Este último contém mais anticorpos que 1/10,pois foi necessário diluir os soros 455 vezes, para que não ficasse mais anticorpos no tubo de ensaio.

� Sensibilidade da reação; Qualidade de uma determinada técnica, que permite detectar pequenas quantidade s de antígeno ou anticorpo no material analisado. Por exemplo,as

técnicas imunoenzimáticas, detectam <1µµµµg de anticorpo ou antígeno, enquanto que as reações que utilizam radioimunoensaio, detectam anticorpos ou antígenos na ordem de picogramas.

� Especificidade: Qualidade de uma técnica que permite que a reação antígeno anticorpo aconteça com epítopos que são exclusivos de uma determinada doença. Quando há reação com outros epítopos, outros anticorpos também entram a somar na reação, e estamos frente a reações cruzadas ou falso positivas

� REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO DIRETA Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma integra ou fragmentada. Hemácias, bactérias, fungos e protozoários podem ser aglutinados diretamente por anticorpos. REAÇÕES DE PRECIPITAÇÀO Ao reagir antígenos solúveis com seus respectivos anticorpos, formam se redes que tendem a precipitar. Nesta reação é possível observar que as reações antígeno-anticorpo dependem das concentrações do antígeno e dos anticorpos presentes. Assim se formará um complexo estável quando Antígeno e anticorpo estejam em concentrações equivalentes, de outro modo, haverá dissolução do complexo e o precipitado não se forma, embora haja Ag e Ac. As reações de precipitação hoje em dia, são executadas em meios semi sólidos como géis de agarose (gel neutro, incolor).

Tanto antígeno e anticorpo podem difundir neste meio, dependendo do seu tamanho molecular, até encontrar as proporções ótimas de antígeno anticorpo, então precipitam formando linhas ou halos de precipitação no local. Varias

43aplicações existem na rotina laboratorial para estas técnicas:

� Imunodifusão radial � Imunodifusão dupla � Imunoeletroforese � Contra imunoeletroforese

REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO –TÉCNICA DE VDRL Teste não treponêmico para o diagnóstico de Sífilis: VDRL

A técnica de VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory)

é um exemplo de reação de floculação, cujo objetivo é a

pesquisa de anticorpos em um indivíduo com suspeita de

sífilis, sendo esta doença causada pela espiroqueta

Treponema pallidum sub-espécie pallidum.

A técnica de VDRL pode ser realizada através dos métodos

qualitativo e quantitativo. É utilizada como triagem

sorológica para a pesquisa de anticorpos em um indíviduo com

suspeita de sífilis e também para acompanhamento da resposta

terapêutica do paciente positivo, através da titulação dos

anticorpos. A cardiolipina é o antígeno utilizado na técnica

que pesquisa anticorpos, chamados de reagina. Trata-se de um

fosfolípideo que atualmente é preparado a partir do coração

bovino, sendo assim denominado cardiolipina. Aparentemente,

ocorre produção de um anticorpo denominado “reagina” na

sífilis, que reage com este complexo de cardiolopina-

lipoproteína. Não se sabe exatamente por que a reagina é

produzida; todavia, não se trata de um anticorpo específico

contra o T. pallidum. Os espiroquetas possuem uma substância

lipóide, e é possível que esta substância seja

suficientemente semelhante ao complexo de cardiolipina-

lipoproteína para que os anticorpos produzidos contra o

antígeno lipóide dos espiroquetas também possam reagir com a

cardiolipina.

Um fato de grande importância nesse teste de triagem

sorológica para Sífilis , é que nem todo sifilítico comprovado

44através de provas treponêmicas, produz reação positiva para

essa prova de VDRL. Outro dado de grande importância

laboratorial, é o fato de cerca de 2% de pacientes na sífilis

primária e secundária serem falsamente negativos devido a um

excesso de antígenos (fenômeno conhecido como pró-zona).

Devido a esta ocorrência a OMS, sugeriu a realização desse

teste de triagem, qualitatiamente e quantitativamente na

diluição de 1/8 para todos pacientes submetidos a esse meio

de diagnóstico laboratorial.

Por outro lado, alguns pacientes apresentam resultados falso-

positivos, sem possuir a doença ou terem se submetido a algum

tipo de exposição. Segue abaixo as principais causas de

resultados falso-positivos:

1. Infecções virais ou bacterianas e em muitos estados

febris, como hipersensibilidade ou vacinação;

2. Doenças sistêmicas crônicas, com presença de anticorpos

antifosfolípideos;

3. Doenças reumatóides do colágeno;

4. Doenças infecciosas como Malária e Tuberculose;

5. Doenças treponêmicas não-sifilíticas, como bouba,

pinta, Borrelia (doença de Lyme) ou febre recidivante.

Material para um grupo

Método qualitativo

VDRL, soro positivo e negativo, ponteiras, pipeta automática

de 50 µl, lâminas, luva descartável, óculos protetor.

Procedimento:

• Sobre a lâmina limpa marcar retângulos.

• Colocar 50 µl de da amostra do soro positivo e do soro

negativo.

• Colocar uma gota do antígeno (cardioplina).

45• Homogenizar durante um minuto com movimentos de vaivém

para que ocorra a reação Antígeno-Anticorpo e observar a

presença ou não de floculação na lâmina.

Leitura dos resultados:

O resultado observado pela floculação que ocorrerá,

poderá ser uma floculação leve, moderada ou intensa,dependerá

da presença do título dos anticorpos no soro do indivíduo.

46 TESTE RÁPIDO DE TRIAGEM QUALITATIVA PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS PARA HIV 1/2. O teste rápido HIV 1/2 - Bio-Manguinhos é um teste de triagem, que usa um coquetel de antígenos para detectar anticorpos para HIV 1/2 em soro, plasma ou sangue total humano. O teste se baseia nas tecnologias de imunocromatografia e fluxo lateral. Resumo: O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é um retrovírus, identificado em 1983 como agente etiológico da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida. A AIDS é caracterizada por alterações em função e número na população de linfócitos T (T helper), que desempenha um papel chave na resposta imunológica do hospedeiro humano, deixando os portadores deste vírus suscetíveis a infecções oportunistas e certas malignidades. O HIV é constituído por uma molécula de RNA, protegida por um capsídeo e um envelope. O envelope do vírus é o principal alvo da resposta imune. A presença do vírus faz com que o sistema imune dos pacientes produza anticorpos anti-HIV. A detecção destes anticorpos deve ser usada como parte do diagnóstico laboratorial para o HIV 1/2. Ensaios de ELISA, Imunofluorescência, Western Blot, técnica da Cadeia de Polimerase (PCR) entre outros, complementam o diagnóstico laboratorial definitivo para AIDS. PRINCÍPIO DO TESTE: O Teste Rápido HIV- 1/2 – Bio-Manguinhos emprega a combinação de uma proteína conjugada com partículas de ouro coloidal e antígenos de HIV 1/2 ligados a uma fase sólida (membrana). A amostra é aplicada ao respectivo poço (S), seguida da adição de um tampão de corrida. O tampão proporciona o fluxo lateral dos componentes liberados, promovendo a ligação dos anticorpos aos antígenos. Os anticorpos presentes, em casos positivos, se ligam às proteínas específicas conjugadas ao ouro coloidal. No caso de uma amostra ser positiva o complexo “imuno-conjugado” migra na membrana de nitrocelulose, sendo capturado pelos antígenos fixados na área do TESTE(T), produzindo uma linha roxo/rosa. Na ausência de anticorpos para HIV 1/2, a linha não aparece na área do teste. Nos dois casos, a amostra continua a migrar na membrana produzindo uma linha roxo/rosa na área de CONTROLE(C), o que caracteriza o funcionamento adequado dos reagentes.

47

COLETA DA AMOSTRA: O teste Rápido HIV 1/2, Bio-Manguinhos é realizado com soro, plasma, ou sangue total humano. Soro: o soro é obtido do sangue total coletado assepticamente por punção venosa em tubo sem anticoagulante. Aguardar o sangue coagular a temperatura ambiente e centrifugar a 2000rpm, durante 10 minutos. Separar o soro do coágulo para evitar hemólise. Plasma: coletar o sangue total em tubo com anticoagulante, centrifugar a 2000rpm durante 10 minutos e separar o plasma sobrenadante. Sangue total: Coletar o sangue em tubo com EDTA, heparina ou citrato de sódio. Para sangue de ponta digital, utilizar a lanceta, conforme as instruções, desprezando a primeira gota. Coletar a segunda gota com a alça coletora descartável. Para todos os materiais, seguir as instruções do procedimento do teste, como demonstrado a seguir.

48

Procedimento para interpretação dos resultados a seguir:

50

IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. AMATO NETO, V. et al. Antibióticos na Prática Médica.

2. BAILEY, R. et al. Diagnóstico Microbiológico.Editora médica Pan

Americana S.A 1973. 3a ed.

3. JAWETZ, E. et al. Microbiologia Médica. 18. ed. Guanabara

Koogan, 1996.

4. KONEMAN E.W.; ALLEN S.D.; JANDA W.M.; SCHRECKENBERGER P.C. & WINN JÚNIOR W.C.

Diagnóstico Microbiológico Texto e Atlas colorido 5aed. Medsi,

2001.

5. LACAZ, C.L. Micologia Médica, 1995.

6. PELCZAR M.J., CHAN E.C.S; KRIEG N.R. Microbiologia: conceitos e

aplicações. v.1, 2a ed. Makron Books, 1996.

7. ROITMAN, I. Tratado de Microbiologia. Vol. 1.

8. TRABULSI, L.R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O F.; CANDEIAS J.A N.;

Microbiologia. 3a. ed. Atheneu, 2002.

9. RAVEL, Richard. LABORATÓRIO CLÍNICO: APLICAÇÕES CLÍNICAS DOS

DADOS LABORATORIAIS. 6ª edição. Editora Guanabara Koogan, 1995.

10. SIDRIM, J.J.C & ROCHA, M.F.G. MICOLOGIA MÉDICA À LUZ DE

AUTORES CONTEMPORÂNEOS. Editora Guanabara Koogan, 2004.

apostila de microbiologia 1

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