apostila de microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS DA SADE

DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL

DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

RROOTTEEIIRROO DDEE AAUULLAASS PPRRTTIICCAASS DDEE

MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA EE IIMMUUNNOOLLOOGGIIAA

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R ot e i r o d e Aul a s Pr t i ca s d e M i cr ob io lo g i a e Im un olo g i a

N D I C EI - ESTERILIZAO E DESINFECO-------------------------------------------------------- 3

II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS -------------------------------------------- 9

III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16

IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS -------------19

V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO ---------------22

VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS ----------- 27

VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS -----------------33

VIII REAES ANTGENO ANTICORPO --------------------------------------------------41

IX REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ------------------------------------------------------50


E s t er i l i za o e D e s in f e c o 3

I - ESTERILIZAO E DESINFECO

Esterilizao o processo de destruio por meio de agentesfsicos ou qumicos de todas as formas de vida microbiana(vrus, bactrias, fungos e esporos) presentes num material.

A esterilizao pode ser realizada por agentes fsicos equmicos.

ESTERILIZAO POR MTODOS FSICOS1. Calor mido2.1.1. Autoclavao - um processo de esterilizao pelo

vapor sob presso em cmaras conhecidas como autoclavesonde vapor de gua mantido em temperatura acima de100oC, pelo emprego de presso maior que a atmosfrica, auma temperatura de 121oC. O tempo de exposio depende domaterial a ser esterilizado. Este processo utilizadopara esterilizar vidraria, instrumentos cirrgicos, meiosde cultivo e outros.

1.2. Tindalizao ou esterilizao fracionada - Processode esterilizao na temperatura de 100oC durante 30minutos, repetindo-se o aquecimento 2 a 3 diasconsecutivos. Este processo usado na bacteriologia paraa esterilizao de certos meios de cultura que se alteramem temperaturas elevada, como meios contendo acares,leite etc.

3. Calor Seco2.1. Forno de Pasteur - Neste processo so empregados

fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada emantida pelo tempo necessrio para que hajaesterilizao. realizada em temperatura de 170-180oC,em estufas eltricas por 1 a 2 horas. O material a seresterilizado deve ser distribudo de modo uniforme parafacilitar a distribuio do calor que emana das paredeslaterais e da base da estufa. Este processo indicadopara esterilizar vidraria, instrumentos cirrgicospassveis de serem oxidados pelo vapor, e materiaisimpermeveis como ceras, pomadas, p e leos.

2.2. Incinerao - um processo usado para materiaisdescartveis e carcaa de animais utilizados emexperimentos.

2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico deBunsen utilizado em rotina de laboratrio paraesterilizao de alas de platina e bordas da boca detubos e bales.


E s t er i l i za o e D e s in f e c o 4

3. Filtrao - um processo usado para esterilizao degases e lquidos tais como soros, solues de enzimas evitaminas, acares, que no podem ser submetidos aocalor. A filtrao consiste em passar o material a seresterilizado por filtros de poros muito pequenos que nopermitem a passagem de bactrias e fungos.

3.1. Tipos de filtros:

Disco de amianto - Filtro de SEITZMembrana de ester de celulose- MilliporeFiltros de partculas de ar de alta eficincia (HEPA) removem quase todos os microrganismos maiores que0,3 m de dimetro. So utilizados para reduzir onmero de micrbios transmitidos pelo ar.

4. Radiaes4.1. Radiao ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na

esterilizao do ar e de ambientes. Na indstria dealimentos so aplicados para esterilizao desuperfcies de pes, xaropes, sacos plsticos, garrafasde gua mineral, carnes mantidas sob refrigerao.Porm, seu uso limitado, devido a seu baixo poder depenetrao, pois trata-se de radiao no ionizante.

4.2- Raios gama e raios X (radiaes ionizantes)tm altopoder de penetrao. Raios gama tm sido empregadosna esterilizao de certas vacinas e sanitizao dealimentos embalados.

MTODOS QUMICOS Glutaraldedo 2% - As solues de glutaraldedo soindicadas para esterilizao ou desinfeco de instrumentosmdicos cirrgicos sensveis ao calor, equipamentos deanestesia gasosa, fibroscpios,partespticas de endoscpiosetc. Exposio em torno de 18 horas.

Formaldedo (Soluo Alcolica 8%) - A frmula alcolicaapresenta 8% de Formaldedo. Sua atividade germicida atribuda inativao de protenas e cidos nuclicosmicrobianos. Exposio em torno de 18 horas.

Formaldedo (soluo aquosa 10%) - As solues aquosas almde no liberar vapores irritantes no possuem osinconvenientes das solues alcolicas sobre lentes deequipamentos pticos e artigos de poliestireno e borrachaem exposies prolongadas. Exposio em torno de 18 horas.

Es t er i l i z a o e D e s in f e c o 5Create PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.

MTODOS FSICO-QUMICOS

Estes mtodos associam o produto qumico com o uso deequipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo ea segurana dos profissionais de sade, sendo utilizadopara materiais termosensveis.

1 Esterilizao por xido de etileno: A esterilizao realizada baixa temperatura em torno de 54C durante 8 a 12horas. Para materiais de implantes e prteses se recomenda umaaerao ambiental em torno de 7 dias.

Esterilizao por vapor de formaldedo baixa temperatura:A esterilizao por vapor de formaldedo realizada emautoclaves, em concentraes baixas em torno de 2% sobforma de vapor, em temperaturas que variam entre 73C e82C durante 90 e 180 minutos.

Precaues - As precaues recomendadas para estas soluesconsistem em utilizar luvas ou pinas para o manuseio deartigos nelas imersas e, nos casos das solues alcolicas,mant-las em cubas de esterilizao fechadas em ambientesventilados.

DESINFECO E ASSEPSIA* Desinfeco - A Desinfeco consiste na destruio ou

reduo dos microrganismos na forma vegetativa, presentesnum material inanimado ou superfcies inertes, mediante aaplicao de agentes fsicos ou qumicos. A desinfeco noimplica a eliminao de todos microrganismos viveis, pormelimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfciesou local tratado.

* Assepsia - o termo usado para designar o processo dedesinfeco de tecidos vivos. Os anti-spticos sopreparaes contendo substncias microbiocidas oumicrobiostticas podendo ser usadasna pele, mucosas eferimentos. Exemplos: solues alcolicas, soluesiodadas, solues de permanganato de potssio, formulaes base de sais de prata, iodforos, etc.

Observaes: No so recomendados a utilizao de iodofros no recm-

nascido, pois pode ocorrer absoro transcutnea de iodocom supresso da funo tireoideana.


E s t er i l i za o e D e s in f e c o 6 Para a finalidade de antissepsia, no so permitidas as

formulaes contendo mercuriais orgnicos, acetona,quaternrios de amnio, hipoclorito a 0,5%, ter eclorofrmio.

A desinfeco pode ser realizada por agentes fsicos equmicos. AGENTES FSICOS:1.0. Pasteurizao - um processo empregado na indstria de

alimentos que elimina microrganismos patognicos (bacilostficos, paratficos e desintricos, brucelas,estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como oleite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os atemperatura de 63oC por 30 minutos ou 75oC por 15segundos. Os tempos e as temperaturas de pasteurizaodependem do mtodo e do produto a ser tratado. Apasteurizao no um processo de esterilizao, uma vezque esporos e bactrias no patognicas podem permanecerviveis.

1.1.gua Fervente - Artigos de pequeno porte, depois delavados com detergente adequado, podem ser desinfetadospor imerso em gua a 100oC durante 10 minutos.

AGENTES QUMICOS:Principais compostos utilizados em desinfeco e assepsia:

lcoois - solues a 70% e 80% Fenis e Derivados - Fenol, Cresis, Ac. saliclico e c.

Benzico. Halognios - Iodo, Iodforos (Polivinil Piralidona-

Iodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sdio ou clcio). Metais Pesados - Mercrio (Mercrio Cromo,Mertiolato),

Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre). Corantes - Verde brilhante e malaquita. Violeta

Genciana, Azul de Metileno.de

Detergentes Sintticos-Aninicos: laurilsulfato de sdio-Catinicos: cloreto de cetilpiridnio.

Oxidantes - gua oxigenada, permanganato de potssio. cidos, lcalis - c. Sulfrico, c. clordico, soda

(NaOH).


E s t er i l i z a o e D e s in f e c o 7

NOTAS:As seguintes precaues devero ser tomadas para evitar

a sobrevivncia de microrganismos contaminantes, falhas deesterilizao ou a recontaminao dos artigos esterilizados,independentes do processo de esterilizao.

1. A escolha do processo de esterilizao

Processo de esterilizao mais eficaz o vapor saturadosob presso, seguindo-se o calor seco e os esterilizantesqumicos.A escolha depende da natureza do artigo a seresterilizado.

2. Limpeza prvia

A presena de matria orgnica (leo, gordura, sangue, puse outras secrees) protege os microrganismos contaminantesdo contato indispensvel com o agente esterilizante. Poroutro lado, quanto menor for o nmero de microrganismospresentes, maior ser a possibilidade de esterilizao.Assim, necessrio lavar cuidadosamente todos os artigosem solues desencrostantes (hiploclorito de sdio,detergentes sintticos etc), e enxagu-los abundantementecom gua corrente e no ltimo enxague com gua destilada oudeionizada antes de submet-los a qualquer processo deesterilizao.

3. Invlucros e pacotes

Os invlucros devem permitir o contato dos artigos com oagente esterilizante, bem como mant-los livres demicrorganismos durantea estocagem. A permeabilidade aovapor e ao xido de etileno, a impermeabilidade apartculas, a ruptura e a flexibilidade so ascaractersticas mais importantes para a seleo de uminvlucro.

4. Estocagem Aps a esterilizao, essencial que os pacotes estejam

ntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidadedos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido dacmara ainda estiver quente, o vapor contido no papelcondensa na temperatura ambiente, criando uma pressonegativa que aspira o ar (contaminado) do ambiente atravsCreate PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.

do invlucro. Este atua como se fosse um filtro, deixando-se penetrar pelo ar e retendo clulas, partculasbacterianas ou no. Se este invlucro no estiver ntegro,os artigos no pacote sofrero recontaminao. A umidadealm de diminuir a resistncia de invlucros de papel,facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtrao doar. Para evitar a contaminao posterior, recomenda-se ouso de cestos metlicos.

Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menospossvel, sempre com delicadeza e estocados em ambienteslimpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em tornode 25oC, reesterilizados quinzenalmente quando noutilizados.

5. Medidas Preventivas

Uso de luvas, Avental e, se necessrio, mscara.

Materiais contaminados por agentes patgenos devem seresterilizados antes de serem descartados.

Aps o manuseio de materiais contaminados por agentesmicrobianos, lavar cuidadosamente as mos com sabo ousolues detergentes antisspticas, como solues aquosasde Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidinaa 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% declorofenol.


E s t er i l i za o e D e s in f e c o 8Aula Prtica - Anlise do efeito da ao de antisspticos

relacionada ao crescimento bacteriano.Objetivo: Observar o efeito de antisspticos sobre ocrescimento bacteriano na superfcie da pele das mos.

Materiais:Swab estrilPlaca com meio de cultura gar nutriente.Antisspticos: Sabo lquido e Soluo lcool-iodado,lcool 70% e lcool gel.

Tcnica:1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos,

sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar a placa.2. Lavar as mos com gua corrente e sabo lquido, deixar a

gua escorrer espontaneamente em seguida colocar a pontados dedos sobre a superfcie do meio de cultura. Fechar aplaca rapidamente.

3. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool iodado2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedossobre o meio de cultura, como item 2.

4. Friccionar a ponta dos dedos com soluo de lcool 70% edepois com lcool gel. Esperar secar, em seguida colocar aponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2.5. Incubar a 37C por 24 horas.

Resultado:Ao dos Agentes Crescimento Bacteriano

lcool Iodadolcool 70%SaboSem anti-spticos


T cn i ca s d e Co lo ra o d e B a c t r i a s 9II TCNICAS DE COLORAO DE BACTRIAS

As tcnicas de colorao iniciadas por Paul Erlich eRobert Koch (1843-1910) permitiram ao microbilogo distinguiras clulas bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho earranjo celular e diferenci-las de acordo com as suascaractersticas tintoriais. Os corantes so divididos em doisgrupos: os cidos e os bsicos. Os corantes bsicos so saiscom base corada que se unem eficazmente a substratos cidos,tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azulde metileno, cristal violeta, fucsina bsica, safranina). Asbactrias comportam-se como material nuclear e desse modo,quase todos os corantes utilizados em bacteriologia socorantes bsicos. Os corantes cidos tendem a corar maiseficientemente os substratos bsicos, como o citoplasma.

MORFOLOGIAAs clulas bacterianas so caracterizadas

morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo.

Tamanho - as bactrias so microscpicas medindo desde 0,3por 0,8 m at 10 por 25 m. As espcies de maiorinteresse mdico medem entre 0,5 a 1 m por 2 a 5 m.

Forma - as bactrias podem ser classificadas quanto a formaem trs grupos bsicos:

Cocos - clulas esfricas.Bacilos - clulas cilndricas, em forma de bastonetes.Espirilos - clulas espiriladas. Algumas delas se comportamcomo bacilos curvos, em forma de vrgula, que podem serdenominados vbrios. Ex: Vibrio cholerae.

Arranjos - Grupamentos bacterianos.Dependendo do plano e do nmero de divises atravs das

quais as bactrias continuam unidas, podem aparecer osseguintes arranjos:

1.CocosPares: diplococos (ex.: gonococos)Cadeias: (ex.: estreptococos)Ttrades ou cbicos (Sarcina)Cocos em cachos (ex.: estafilococos)

2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como clulasisoladas, porm ocasionalmente, pode-se observar: bacilosaos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos).Aps a diviso de algumas bactrias, podem ocorrermovimentos caractersticos, por exemplo: um movimento emchicotada pode levar as bactrias a posies paralelas.


T c n i ca s d e Co lo ra o d e B a c t r ia s 10

Divises repetidas e seguidas desses movimentos determinamposies semelhantes a letras chinesas caractersticas dobacilo diftrico.

PREPARAO DE ESFREGAO BACTERIANO PARA COLORAO1-Preparao a partir de meio lquido

Usando ala de platina estril, colocar duas a trsalquotas de cultura bacteriana preparada em meio lquidosobre a superfcie de uma lmina de microscopia.

Espalhar sobre a lmina, fazendo movimentos circularesde dentro para fora e deixar o esfregao secar a temperaturaambiente. Em seguida, realizar a fixao passando duas a trsvezes a lmina na chama do bico de Bunsen.

2-Preparao a partir de meio slido

Colocar uma pequena gota de gua destilada numa lmina.Com ala de platina colocar sobre a lmina uma pequena porodo crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lmina eprosseguir a preparao como no item anterior.

3-Preparao a partir de material biolgico

Usando um swab estril (zaragatoa), friccionar asuperfcie da mucosa ou leso oral por exemplo e fazer umesfregao circular na superfcie de uma lmina. Deixar secar temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo deensaio e executar a fixao, como no item anterior.

COLORAO SIMPLESTcnica de colorao caracterizada pelo uso de apenas um

corante, permitindo a observao da forma, tamanho egrupamento da clula bacteriana. Esta tcnica de colorao bastante utilizada para a deteco de cocos que causammeningite (Neisseria meningitidis), em amostra de lquidocefalorraquidiano (LCR).

MTODO

1)Preparar o esfregao bacteriano em lminas;2)Cobrir toda a lmina com soluo de azul de metileno, aguardar 5 minutos e desprezar o corante na pia;

3)Lavar a lmina rapidamente em gua corrente, secar compapel de filtro ou temperatura ambiente (sem esfregar) eobservar em objetiva de imerso.

RESULTADO

Visualizar, descrever a morfologia e arranjo dasbactrias existente na lmina.


T c n i ca s d e Co lo ra o d e B a c t r ia s 11

COLORAO DE GRAM (Colorao diferencial)Este mtodo de colorao foi empiricamente desenvolvido

pelo bacteriologista dinamarqus, Christian Gram, em 1884, epermite distino entre diferentes bactrias que podemmostrar uma morfologia similar, porm com propriedadestintoriais diferentes. A colorao de Gram classifica asbactrias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas.TCNICA DE COLORAO DE GRAM1)cobrir toda a lmina com soluo de cristal violeta,aguardar um minuto e desprezar o corante na pia;

2)cobrir a lmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar olugol na pia;

3)inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona at que no hajadesprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar almina rapidamente em gua corrente.

4)cobrir a lmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos.Lavar, secar e observar em objetiva de imerso.

NOTAS

1)O Cristal violeta s se liga a parede celular bacterianaaps a adio da soluo de lugol (mordente)

2)O etanol poder ser usado como agente descorante fraco.3)O material dos corantes empregados na tcnica,principalmente sedimento do cristal violeta, poderaparecer como artefato.

4)O descoramento para mais ou menos resultante da incorretadiferenciao pelo lcool-acetona.

5)A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamentalna colorao de Gram. Em culturas envelhecidas, clulasGram Positivas freqentemente se tornam Gram Negativas.

Enzimas lticas excretadas normalmente por culturasenvelhecidas podem causar danos parede da clula, como porexemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (lcool-acetona). Conseqentemente, o complexo iodo cristal violetapoder ser retirado da clula, nessa fase de colorao.

RESULTADO

Visualizar, desenhar a morfologia e classificar asbactrias nas lminas de acordo com o seu comportamentodiante dos corantes de Gram:

Bactrias Gram positivas coradas em roxoBactrias Gram negativas coradas em rosa

INTERPRETAOA colorao de Gram classifica as bactrias em Gram

positivas ou Gram negativas. O mecanismo da colorao deGram, se refere composio da parede celular, sendo que asCreate PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.

T cn i ca s d e Co lo ra o d e B a c t r i a s 12

Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano ecido teicico, e as Gram negativas, uma fina camada depeptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada compostapor lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas elipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, otratamento com o lcool(ou lcool-acetona) extrai oslipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidadeaumentada da parede celular das bactrias Gram negativas.Assim, o complexocristal violeta iodo(CV-I) pode serretirado e as bactrias Gram negativas so descoradas. Aparede celular das bactrias Gram positivas, em virtude desua composio diferente, torna-se desidratada durante otratamento com lcool, a porosidade diminui, a permeabilidade reduzida e o complexo CV-I no pode ser extrado.

COLORAO DIFERENCIAL PELO MTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882)A colorao de Ziehl-Neelsen o mtodo para a pesquisa

de bacilos lcool cido resistentes (BAAR) incluindo-se obacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactriasatpicas. Este mtodo de colorao se baseia na propriedadedas micobactrias de se corarem inicialmente pelacarbolfucsina (a fucsina dissolvida numa soluo de fenol-lcool-gua) e resistirem a uma descolorao por lcool-cido.

Atravs desta colorao, podemos visualizar um gruporestrito de bactrias que possuem sua parede celularconstituda delipdeos em grande concentrao, devido apresena de cras e cidos graxos de cadeia longa(cidosmiclicos), que conferem clula a caracterstica de lcool-cido resistncia.

COLETA DO MATERIAL1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia.2- Obter, de preferncia o primeiro escarro da manha antes daingesto de alimentos.3- Orientar o paciente para escovar os dentes com gua (noutilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes,inclusive com gargarejos.4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossirprofundamente, recolhendo o material no frasco de coletaestril.5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostraaps nebulizao.6- Enviar ao laboratrio o mais breve possvel.

O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivaresso imprprias para anlise bacteriolgica, pois no sorepresentativas do processo infeccioso.



PREPARAO DO ESFREGAO

Colocar as amostras em lminas (novas e desengorduradas)com aplicador de madeira. Escolher a partcula mais densa ouuma mistura da amostra, quando s existirem pequenaspartculas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar aamostra em 1/3 da lmina, deixar secar temperatura ambientee fixar como no procedimento anterior.Tcnica:

1)Cobrir toda a lmina com fucsina fenicada.2)Com auxlio de uma chama, aquecer a lmina, pela sua parteinferior at emitir vapores. Repetir duas vezes esperando ocorante esfriar. Aguardar 5 minutos, no deixando o corantenem ferver nem secar.

3)Lavar a lmina com gua corrente, suavemente.4)Inclinar a lmina descorar com soluo lcool cidoclordrico, at no sair mais corante.

5)Lavar a lmina com gua corrente.6)Cobrir o esfregao com soluo de azul de metileno deLoeffler durante 30 segundos.

7)Lavar a lmina em gua corrente.8)Deixar secar e observar ao microscpio, com a objetiva deimerso.

Notas:

1.Na colorao de Ziehl, o aquecimento no deve ser feitomuito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas atligeira emisso de vapores.

2.A colorao de fundo feita para corar bactrias e outrasestruturas que foram diferenciadas, para o efeitocontrastante ou distino entre as bactrias e clulaspresentes no material.

RESULTADO:

Visualizar, esquematizar e classificar as bactriasexistentes nas lminas. A classificao dever ser quanto resistncia ou no das bactrias ao descoramento em lcoolcido.

Bactrias lcool cido resistente (BAAR) permanecemcoradas de vermelho pela fucsina.

Bactrias no lcool cido resistente (BNAAR) no retma fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno.



BAAR por campo microscpico ResultadoNenhum bacilo em 100 camposobservados

Negativo

Menos de 1 bacilo por campo, em100 campos observados

+

De 1 a 10 bacilos por campo, em50 campos observados

++

Mais de 10 bacilos por campo, em20 campos observados

+++

TCNICAS DE PREPARAO DOS CORANTES DE GRAMPreparao do Cristal de Violeta:Cristal violeta 1gcido fnico 2glcool absoluto 10mlgua destilada 100ml

Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar olcool. Juntar aos poucos o cido fnico, misturando sempre,de modo a obter uma mistura bem homognea. Juntar a guapouco a pouco, misturando bem. Filtrar aps 24 horas derepouso, em papel de filtro.

Preparao do Lugol:Iodo 1gIodeto de potssio 2ggua destilada 300mlTriturar o iodo com o iodeto de potssio em gral de

vidro. Juntar a gua e misturar bem. Preparar em quantidadeque seja usada antes de 30 dias.

Preparao de lcool acetona:lcool 800mlAcetona 200mlUnir os dois componentes e misturar bem.Preparao da Fucsina para Colorao de Gram:Fucsina 2,5glcool etlico 100mlgua destilada 90mlA soluo estoque (fucsina e lcool etlico) deve ser

preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem.Para usar 10ml da soluo em 90ml de gua destilada, isto ,diluir a 10% em gua destilada.

Armazenamento de corantes:Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro


T cn i ca s d e Co lo ra o d e B a c t r i a s 15mbar em local onde as condies ambientais sejam favorveis,com temperatura entre 20 e 25C (T.A.) e sem teor de umidade.

TCNICAS DE PREPARAO DOS CORANTES DE ZIEHL-NEELSENPreparao de Fucsina fenicada:Fucsina bsica 1glcool a 95% 10mlFenol fundido 5ggua destilada 100ml

Dissolver num gral o corante no lcool. Adicionar aospoucos o cido fnico, misturando sempre, de modo a obter umamistura bem homognea. Juntar a gua pouco a pouco, lavando ogral.

Filtrar aps 24 horas de repouso.

cido clordricolcool 95% 100mlcido clordrico (dens. 1,19) 1ml

Azul de LoefflerA)Azul de metileno 10,3glcool a 95% 30ml

B)Soluo de hidrato de sdio a 0,01% 1mlgua destilada 100ml

Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em gua destilada.


M e io s d e Cu l t i v o Ba c t er i an o 16

III MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO

Meios de cultivo uma mistura de nutrientes, saisminerais e gua que propiciam o crescimento in vitrode bactrias. A constituio de um meio de cultivo bastante variada, pois os micro-organismos apresentam umaampla diversidade metablica. Portanto os meios de cultivo possuemcomponentes nutricionais variados promovendo o crescimento demicro-organismos mais exigentes e menos exigentes.

At 1880 os micro-organismos eram cultivados em meioslquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meiosslidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas(culturas puras) separando-as de espcies contaminadas.

Os meios de cultivo so utilizados para o isolamento eidentificao de micro-organismos, teste para controle deesterilizao ambiental, anlise de alimentos e de gua, etc. Amaioria das bactrias cresce em meios de cultura. Exceto asriqutsias e clamdias por serem parasitas intracelularesobrigatrios s se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivocelular).Basicamente, um meio de cultivo deve conter alm deextrato de carne para o fornecimento de protenas,carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sdio.

A preparao dos meios de cultivo pode ser realizada nolaboratrio de microbiologia de duas formas:(1)a partir de seus ingredientes bsicos.(2)a partir dos desidratados disponveis comercialmente, oupodem ser comprados prontos para uso em tubos de ensaio ou placasde Petri.

Didaticamente, os meios de cultivo cultivo podem serclassificados quanto consistncia, quanto procedncia, quanto composio, e quanto funo.

a) Quanto consistncia: os meios podem ser lquido, semi-slido eslido.

Meio lquido: aquele em que os nutrientes estodissolvidos em aquosa. So os caldos (broth). utilizado paraativao das culturas, repiques de micro-organismos, provasbioqumicas dentre outros.

Meio semi-slido: Esse meio possui na sua composio alm dosnutrientes, gar (polissacardeoextrado de algas

marinhas) na concentrao de 0,075% a 0,5%. usado para Meio slido: um meio que possui na sua composionutrientes e uma concentrao de 1,0 a 2,0% de Agar e distribudoem placas,tubos em vertical ou inclinados.

b)Quanto a procedncia: os meios podem ser:naturais,artificiais sintticos, ou artificiais complexos.

- Meios naturais: So aqueles de origem vegetal (batata,po)Animal( gema de ovo, carne, crebro etc.)

- Meios artificiais sintticos: So aqueles de composio qumicaCreate PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.

definida. Ex: Glicose- Meios artificiais complexos: So aqueles que se desconhece a

exata composio qumica. Ex:Extrato de carne.

c) Quanto funo: O meio de cultivo pode ser enriquecedor,seletivo, diferenciador e de manuteno. Meio enriquecedor ou enriquecido: aquele que t e m s u ac a p a c i d a d e n u t r i c i o n a l , p e r m i t i n d o oc r e s c i m e n t o d e m i c r o - o r g a n i s m o s e x i g e n t e s .E x : B H I , g a r s a n g u e , A g a r c h o c o l a t e .

Meio seletivo: aquele que contm substncias que inibem ocrescimento de certos micro-organismos, sem impedir o crescimentode outros.Ex: gar SS,(Salmonella , Shigella)

Meio diferenciador ou indicador: empregado para detectarcolnias bacterianas com propriedades distintas. Asbactrias acidognicas so conhecidas pela ao da cor doindicador cido-base adicionado ao meio.

As bactrias que hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelaszonas claras produzidas nos meios contendo suspenses de amido.Bactrias hemolticas so visualizadas pelas

alteraes produzidas no gar sangue.Os produtores de gs sulfdrico formam uma zona escura de sulfito

de ferro no meio contendo excesso de ferro. Ex: gar EMB, garsangue.

- Meio de manuteno: um meio utilizado para estocagem de baixoteor nutritivo para evitar a rpida morte celular, devido aeliminao de substncias txicas resultantes do metabolismo dosmicro-organismos. Ex: gar nutriente.

- Meio para crescimento anaerbico: Como os anaerbios nosobrevivem na presena de oxignio so utilizados meiosespeciais denominados meios redutores, esses meios contmingredientes como o tioglicolato de sdio, que se combinamquimicamente com o oxignio dissolvido e o eliminam do meio decultura.Outros mtodos: Jarra de anaerobiose, estufas de dixido decarbono.

Preparao:Um fator que influencia na preparao do meio de cultivo a

temperatura. Ao preparar um meio de cultivo no podemos mantertemperatura ambiente uma soluo no estril por

mais de uma hora devido possibilidade de evaporao dagua decrescimento microbiano.

Alguns componentes so utilizados pelos microrganismos e osdemais, pelo efeito d o crescimento microbiano.Algunscomponentes so utilizados pelos micro-organismos e osdemais, pelo efeito da evaporao,se concentram. Aps preparadosos meios devem ser esterilizados pelo processo de esterilizaoadequada.


Tcnica:Preparao de meio lquido: Meio de B.H.I. (Brain-Heart-Infusion).Componentes do meio:

Infuso de corao ................... 250gInfuso de crebro ................... 200gPeptona ............................... 10gDextrose................................ 2gCloreto de Sdio ....................... 5gFosfato de Sdio ..................... .2,5ggua destilada ....................... 100ml

Execuo:a)Adicionar 100ml de gua destilada aos ingredientespreviamente pesados;

b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsenou forno de microondas;

c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10mlpor tubo. Colocar tampo de algodo em cada tubo;

d)Autoclavar (121C por 15 a 20 minutos).

Preparao de meio slido: Meio gar nutriente (gar Base) ougar Gelose.Componentes do meio:

Extrato de Carne ....................... 3gPeptona ................................ 5ggar .................................. 15ggua destilada ...................... 1000ml


M e io s d e Cu l t i v o Ba c t er i an o 18

Conservao dos meios de cultivoAps preparados, os meios devem ficar temperatura

ambiente at o esfriamento total. Quando a quantidade de meiopreparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deveser armazenado em geladeira dentro de sacos plsticos paraevitar desidratao. Quando a quantidade de meio for grande eno de uso imediato, deve ser distribudo em frascos comrolha, selados com tampas dealumnio e logo apsautoclavados.

A maioria dos meios de cultura na forma desidratada podeser conservada temperatura ambiente durante anos e outrosque contenham substncias termolbeis em sua composio soguardados em geladeiras.

Para usar frascos de meio lquido, abrimos o selo dealumnio, retiramos a rolha de borracha com cuidadosasspticos e, em ambiente estril, transferimos o meio paratubos estreis (atravs de pipetas).

Para usar frascos de meio slido, fundimos o garimergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou fornode microondas a temperatura de 100oC. Aps a fuso do garabrimos o selo de alumnio, retiramos a rolha de borracha etransferimos o meio para tubos (atravs de pipetas estreis)ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperaturaambiente.

TCNICAS DE SEMEIOOBJETIVOS- Identificao das tcnicas de semeadura mais empregadas na rotinabacteriolgica.- Cultivo de bactrias com finalidade de obteno de cultura pura,ou seja, uma populao onde todas as bactrias se originam de umanica clula bacteriana.

Toda manipulao de culturas bacterianas, meios e instrumentalnecessrio deve ser feita seguindo-se procedimentos bsicos deassepsia visando evitar qualquer tipo de contaminao.

A) Meio inclinado-Estria sinuosa- semear com ala de platina, em zigue-zague partindoda base para a extremidade da superfcie inclinada do meio, estetipo de semeadura permite a obteno de melhor massa de micro-organismos.-Em estria reta- semear com agulha de platina, em estria reta,partindo da base para a extremidade da superfcie inclinada do meio,ou em profundidade e superfcie, este tipo de semeio utilizado emprovas bioqumicas para identificao bacteriana.

B) Meio em p (camada alta)- Em picada: com agulha de platina fazer o inculo penetrar de 0,5 a


1,0 cm no centro do meio de cultura.Este tipo de semeadura bastante utilizado para conservao de

bactrias no meio de cultura e quando o meio de cultura semi-slido utilizado para a verificao de motilidade.

C) Em placa de PetriC.1 Em superfcie- Estrias mltiplas ou esgotamento: Fazer o inculo em um ponto dasuperfcie do meio, flambar a ala, deixar esfriar e da semear emzigue-zague em toda superfcie do meio.

Este tipo de semeadura empregado para isolamento bacteriano,obteno de u.f.c. isolados.

- Por distenso: Com pipeta estril, colocar no centro da superfciedo meio 0,1 ml da suspenso e espalhar uniformimente com Swab ouAla de Drigalski. Com swab obteremos crescimento confluente e comala de Drigalski, utilizamos para contagem. Usa-se paradeterminados testes e antibiogramas.

C.2 Em Profundidade ou Disseminao- Por Plate: Depositar na placa de Petri 0,1 ml ou 1,0 ml dasuspenso bacteriana . Adicionar 10 ml do meio fundido em tubo deensaio e resfriado a 45-50C. Homogeneizar com movimentos giratriosda placa sobre uma superfcie plana. Utilizado para isolamento,contagem, identificao bacteriana, conforme o meio de culturautilizado.

D) Repique por pescaria: Colnia em placa de Petri retirada atravsde uma agulha para um meio de cultura lquido ou slido. Mtodoempregado para isolamento bacteriano.


I so lam en t o e Id en t i f i c a o d e B a c t r ia s G ram P os i t i v a s 19

IV ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM POSITIVAS

Em se tratando de material clnico para ser submetido aexame bacteriolgico este deve ser colhido antes daadministrao de antimicrobianos, porque se a bactria forsensvel quele antibitico, dificilmente ela crescer nosmeios de cultura. A bactria poder estar morta no momento dacolheita ou ento ter o seu crescimento inibido peloantimicrobiano presente no material clnico.

1- ISOLAMENTO - As bactrias podem ser cultivadas in vitro emmeios de cultura que lhes forneam todas as condiesnutricionais e ambientais necessrias ao seu crescimento.

As culturas so feitas pela semeadura dos materiaisclnicos em meios slidos distribudos em placa de Petri, emtubos de ensaio ou em outros tipos de frascos.

Depois de semeados os meios devem ser incubados emtemperatura e atmosfera adequadas. O perodo de incubaovaria de acordo com a velocidade de crescimento da bactria.A grande maioria das bactrias pode ser cultivada em 24 a 48horas. Excees so feitas para o cultivo de Neisseria (14-16hs) e Mycobacterium (at 21 dias).

Material para colheita e isolamento:Abaixador de lngua"Swab"gar sangue

Procedimento:Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto

da superfcie do meio distribudo em placa e semear pelatcnica de estrias. Incubar a placa a 37C por 24h e fazer aidentificao bioqumica e diferenciao de atividadehemoltica e enzimtica.

2- IDENTIFICAO:2-1 Gnero: Streptococcus

As espcies de maior interesse clnico so:Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,Streptococcus pneumoniae.



Os Streptococcus so identificados de acordo com:1) Atividade hemolticaa)b-hemolticos: quando lisam completamente as hemcias(in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona claraao redor da colnia.

b)a-hemolticos: quando causam lise incompleta dashemceas com liberao de pigmento verde (reduo dahemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor dacolnia.

c)g-hemoltico: ausncia de atividade hemoltica.

2) Morfologia celular:Corados pelo mtodo de Gram, aparecem como Gram

positivos esfricos ou lanceolados, de tamanho varivel,isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas.

3) Diferenciao bioqumica:So utilizados testes com antimicrobianos para

diferenciao de Streptococcus alfa, beta e gamahemolticos, como tambm so realizados testespresuntivos para pesquisa de enzimas produzidaspelos isolados.

4) Composio antignicaOs estreptococos b-hemolticos elaboram carboidratos que

so utilizados em reaes de precipitao com anti-soroespecfico, que possibilita a separao dos grupos. RebecaLancefield padronizou a classificao deste gnero de acordocom esta composio grupo especficos antignica da paredecelular.

Estreptococos a-hemolticosUtilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para

diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensvel a optoquina) deestreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o Testede Solubilidade em Bile. As bactrias solveis em Bile so daespcie Streptococcus pneumoniae, as bactrias insolveis emBile so de estreptococcos viridescentes.

Teste de optoquinaFinalidade:A optoquina (etil-hidrocuprenahidroclordrica) umfarmaco solvel em gua que se difunde rapidamente em meiode cultura slido. Para este teste, em geral, utiliza-se odisco de optoquina de6 mm contendo 5 g da droga. O teste


tem sensibilidade maior que 95%, sendo considerado debaixo custo e simples de ser realizado.Procedimento:

Preparar uma suspenso do isolado em soluo salina a0,85% estril com densidade tica de 0,08 a 0,1 aocomprimento de onda de 625 nm, ou correspondente a 0,5 daescala de McFarland;

Semear a suspenso em uma placa de gar sangue de carneiro5% de forma a obter crescimento confluente;

Aps a absoro da suspenso pelo meio de cultura, colocarum disco de optoquina na superfcie do meio semeado, com oauxlio de uma pina;

Incubar a 352C e 5 - 7% de CO2 por 18 - 24 h; Fazer a leitura do halo de inibio do crescimento

bacteriano.Interpretao:Presena de halo 14 mm indica que a cultura sensvel optoquina, sendo identificado Streptococcus pneumoniae.

Estreptococos -hemolticosTeste da BacitracinaFinalidade:O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outrascepas do grupo A de outros grupos de Streptococcus -hemolticos (Grupo B, C e G).Procedimento: Um disco de 0,04 U de bacitracina aplicado a uma placa

de gar sangue de carneiro que tenha um inculo com 4 ou 5colnias puras de Streptococcus spp., a ser testado.

Incubar 12 horas (overnight) a 35 2C.Interpretao:A presena de halo de 10mm inibio ao redor do disco interpretado como sensibilidade a bacitracina e indicativode S. pyogenes.


I so lam en t o e I d en t i f i c a o d e B a c t r i a s Gram P o s i t i v a s 22

Teste de CampO teste visa a identificao de linhagens de S.agalactiae (grupo B). Estas linhagens produzem o fatorCAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atuasinergicamente com a -hemolisina produzida peloStaphylococcus aureus em gar sangue.

Procedimento: Semear um inculo de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (ou

cepa de S. aureus com duplo halo de hemlise) de um pontoa outro da placa de gar sangue;

Semear perpendicularmente (90) a colniade Streptococcus -hemoltico a ser testada, sem que hajao contato com a estria de Staphylococcus aureus;

Incubar a 352C em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h.Interpretao: A formao de uma seta ou meia-lua convergindo para

o S.aureus na interseco do crescimento das duasbactrias indica que o teste positivo e indicativode S.agalactiae;

Se no houver formao de seta ou meia-lua, o teste negativo e a cepa no pertence ao grupo B de Lancefield.



2-2 Gnero StaphylococcusAs trs espcies de maior interesse clnico so:

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,Staphylococcus saprophyticus.

Morfologia celular

So cocos Gram positivos que podem apresentar-seisolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados emcachos.

Identificao e diferenciao

a)Atividade enzimtica

Prova de coagulase:

A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de culturaem caldo. Incubar em banho-maria a 37C e verificar aintervalos de 30 minutos, se h formao de cogulo. OStaphylococcus aureus produtor de coagulase.

Staphylococcus epidermidis, no produtor de coagulase, usualmente considerado no patognico mas pode estarenvolvido em certas situaes clnicas: endocarditebacteriana, em cirurgia com prtese, em transplante de medulae em cateterismo venoso.

b)Sensibilidade a novobiocina

Teste de novobiocina

Preparar uma suspenso em caldo e semear em gar. Colocarum disco de novobiocina (5mg), incubar a 37C por 24 horase verificar a formao de um halo de inibio de 14mm.

Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente aofarmacoa) do S. epidermidis (sensvel a droga). O S.saprophyticus causa relativamente freqente de infeco dotrato urinrio em pacientes jovens.

C) Teste de Fermentao do ManitolFinalidade:

Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar omanitol contendo 7,5% de cloreto de sdio.

Procedimento: Fazer pequenos crculos no gar com a colnia suspeita; Incubar a 352C por 18 - 24 h.Leitura:Formao de halo amarelo ao redor das colnias.


Interpretao: Formao de halo amarelo ao redor das colnias,

identifica Staphylococcus aureus; Meio permanece inalterado ao redor das colnias,

identifica Staphylococcus coagulase negativa.

Obs.: Outras espcies de estafilococos, com pouca frequncia,tambm podem produzir cido a partir do manitol, portanto tambmdevem ser testados quanto produo de coagulase.

d) Teste da Catalase

O teste da catalase utilizado para diferenciar osestafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalasenegativa). Entretanto, existem relatos na literaturade Staphylococcus aureus catalase negativa relacionados aprocessos infecciosos, embora raros, descritos em vrios pases,inclusive no Brasil.

Procedimento:

Colocar uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) 3%sobre uma lmina;

Com auxlio de fio bacteriolgico, agregar a colnia em estudona gota de perxido de hidrognio.

INTERPRETAO

Positivo: Presena imediata de bolhas - a produo deefervescncia indica a converso do H2O2 em gua e oxigniogasoso.

Negativo: Ausncia de bolhas ou efervescncia.

RECOMENDAESEvitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrcitos

podem produzir reao fraca de catalase.Para controle utilizar outra linhagem de Staphylococcus para o

controle positivo e como controle negativo Streptococcus spp.


Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao 22

V ANTIBIOGRAMA: TCNICAS DE PREPARAO E INTERPRETAO

Introduo:A anlise da sensibilidade das bactrias aos agentes

antimiccrobianos est relacionada vrias tcnicas oumtodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar asensibilidade e a resistncia de determinado microrganismo aantimicrobianos.

DETERMINAO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTRIASA identificao de bactrias isoladas de espcimens

clnicas necessita de teste complementar para determinar operfil de sensibilidade daquela espcie frente aquimioterpicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogasdisponveis no combate quela infeco, so estudadas porgrupos (aminoglicosdeos, betalactmicos, fluorquinolonas,macroldeos, peptdeos e sulfas) e em concentraespadronizadas (proporcionais s concentraes atingidas nosoro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "invitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinadoisolado bacteriano so selecionadas pela seletividade txica,efeitos secundrios, facilidade de administrao (oral eparenteral), epelos custos do tratamento. Vrias tcnicasforam desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby,Bauer & Turck (1966) utilizada mundialmente por apresentarresultados rpidos e seguros.

Um segundo tipo de teste de sensibilidade realizadoutilizando-se espcies no patognicos, para fins de pesquisabsica, quando se deseja estudar mecanismos de ao dasdrogas ou modelos de resistncia antimicrobiana ou ainda paramarcar uma populao. Neste caso, so determinados os gruposde drogas e a concentrao mnima inibitria (CMI) por mtodoquantitativo.

Objetivos:1) Avaliao da atividade e

agentes antimicrobianos;do espectro de ao de novos

2) Nos estudos de populaespadro de sensibilidade

bacterianas, para estabelecer osob o efeito seletivo de

antimicrobianos;3) Como marcadores epidemiolgicos.

Fundamento: Substncias antimicrobianas so incorporadas aomeio de cultivo (lquido ou gar), emconcentraesinibitrias para aqueles organismos sensveis. A concentrao dada em g/ml ou Unidades Internacionais(UI).


Mtodos:Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao 23

1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianasso bactericidas para determinada espcie bacteriana numadeterminada concentrao. Ex.: Tcnica de KirbyBauer(1966).

2.Quantitativo - Pesquisa que concentrao de determinadadroga antimicrobiana inibitria para uma espciebacteriana isolada. Determinao da concentrao mnimainibitria (CMI).

Mtodo de difuso com disco (Tcnica Kirby Bauer):Difuso da droga, sob forma de disco ou comprimido nasuperfcie do meio slido.1. Padronizao do inculo bacteriano:

A partir da placa original da cultura bacteriana domicrorganismo a ser testado so transferidas 4 a 5 colniaspara um meio de cultura lquido (Caldo-Soja-Casena, CaldoBHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a4 horas. A densidade do inculo deve ser comparada com aescala de turbidez de McFarland (cido sulfrico + cloreto debrio), equivalente a 104 bactrias por ml de meio.2. Semeio: Realizado atravs de swab estril embebido noinculo bacteriano e passado em toda a rea da superfcie domeio gar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixarsecar por 2 minutos.

Com auxlio de uma pina estril colocar sob asuperfcie do meio inoculado os discos de antibiticos empontos eqidistantes (30 mm).

Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquelapopulao bacteriana por 18-24h.

Leitura: Observar halo de inibio em torno do disco deantimicrobiano. O dimetro deste halo medido em mm(halmetro) e comparado com a tabela recomendada pelo C L S I(Clinical Laboratory Standards Institute, 2010). Para cada

agente antimicrobiano, o dimetro dohalo poderserinterpretado como sensvel (S), resistente (R) ouintermedirio (I).

Utilizao de Drogas de baixa difuso: molculas grandes epolarizadas. Considerar pequenos halos como sensveis.

Drogas de alta difuso: molculas pequenas e apolares.Considerar halos com maiores dimetros que os padres.


Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao 24Considera-se uma populao sensvel a determinada drogaquando esta populao inibida por concentrao trs ou maisvezes inferior a concentrao que a substncia atinge nosangue. Amostras resistentes so inibidas por concentraesintermedirias.Ex.: Droga X atinge concentrao srica de

32 g/ml. Populaes que so inibidas por8 g so consideradas sensveis e aquelas inibidas

por concentraes acima de 16 gconsideradas resistentes.

Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretao:1.Utilizao de meio muito ricos ou muito pobres em

composio de "simular" falsos microrganismos resistentes ousensveis.

2.Utilizao de inculos muito concentrados (densos) eformao de tapetes de clulas mortas entre bactrias vivas ea droga.

3.Para algumas infeces como difteria (C. diphteriae),meningite meningoccica no so realizados antibiogramas.Utilizam-se drogas de escolha.

4.Devido a variabilidade de marcas de resistncia adrogas devem ser realizados sempre nas bactriasEnteropatognicas (Salmonella, Shigella, E. colisoropatognicas e para Mycobacterium tuberculosis).

5.Observar a concentrao da droga que impregna o papelde filtro que compe o disco ou comprimido.

6.Observar prazo de validade das drogas ensaiadas.

Seleo de substncias antibiticas:Bactrias gram positivas: Penicilina, Eritromicina,

Clindamicina, Gentamicina e Tetraciclinas. ParaStaphylococcus no precisa testar Ampicilina e Carbenicilina(Produtores de betalactamases). A meticilina representabetalactmico (penicilina) no degradada pela betalactamase.

Bactrias gram negativas (Enterobacteriaceae):Ampicilina, Cefalosporinas, Gentamicina, Tetraciclinas,Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina.

Infeces urinrias: Ampicilina, Ac. Nalidxico,Nitrofurantonas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas.

Para infeces por Pseudomonas sp.: Carbenicilina,Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina.

Para infeces por cpas de Anaerbios: Bacterides,Peptococos, Fusobactrias e Clostrdios: Clindamicina,Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas.

Microrganismos de refernciaMantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E.

coli (ATCC25922).


Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao 25Teste esses microrganismos de referncia, pelo mtodo

que foi descrito, usando discos de antibiticosrepresentativos daqueles a serem empregados no teste deisolados clnicos.

Comparaes de resultados para os microrganismos-controle de teste para teste oferecem uma verificao nareprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dosdiscos-teste.

Limitaes do mtodoO mtodo de interpretao descrito aqui se refere a

patgenos de crescimento rpido e no deve ser aplicado amicrorganismos de crescimento lento, para os quais oscritrios dos halos no so apropriados. E para antibiticosque se difudem lentamente em gar, ex: polimixina B.

Mtodo QuantitativoE-test: Teste epsilomtrico, mtodo de difuso mais avanado

que permite estimar a concentrao mnima inibitria (CMI), a maisbaixa concentrao de antibitico que impede o crescimentobacteriano. Uma tira revestida de plstico contendo um gradiente deconcentrao do antimicrobiano, e a CMI pode ser lida em uma escalaimpressa na tira.

Etapas para realizao da tcnica:

As etapas iniciais so semelhantes tcnica de Kirby Bauer, como apreparao do inoculo bacteriano e semeio. As fitas do E-testconsiste numa fita plstica fina, inerte e no porosa de 5mm largurae 50mm de comprimento. Um lado da fita marcado com uma escala deleitura de CIM em mcg/ml. Um cdigo de letras designa a identidadedo antibitico. Um gradiente exponencial pr-definido do frmacoseco e estabilizado mobilizado no outro lado da fita, com umaconcentrao mxima em "a" e mnima em "b", como demonstrado naFigura abaixo.


Antibacteriano Smb. Conc.disco

Zonas de inibio (em mm)Resistente Interme

dirioSensvel

Amicacina AM 30mcg 14 ou menos 15-18 17 ou maisAmpicilina aotestarmicrorganismosGram-negativos eenterococos

AP 10mcg 11 ou menos 12-13 14 ou mais

Ampicilina aotestarestafilococos emicrorganismossensveis penicilina G

AP 10mcg 20 ou menos 21-28 29 ou mais

Ampicilina aotestar Haemophilussp.

AP 10mcg 19 ou menos 20 ou mais

Bacitracina BC 10un. 8 ou menos 9-12 13 ou maisCarbenicilina aotestar Proteus sp.E E. coli.

CR 100mcg 17 ou menos 18-22 23 ou mais

Carbenicilina aotestar Pseudomonasaeruginosa

CR 100mcg 13 ou menos 14-16 17 ou mais

Cefalotina aorelatarsensibilidade atodas ascefalosporinas

CF 30mcg 14 ou menos 15-1718 ou mais

Clindamicina aorelatarsensibilidade clindamicina e lindomicina

CL 2mcg 14 ou menos 15-16 17 ou mais

CloranfenicolColistidinaEritromicinaEstreptomicinaGentamicinaKonanilcinaNalidxico, cidoNeomicinaNitrofurantonaNovoblocinaOxocilina

COCLELETGNKNANNONTNVOX

30mcg10mcg15mcg20mcg20mcg30mcg30mcg30mcg300mcg30mcg6mcg

12 ou menos8 ou menos13 ou menos11 ou menos12 ou menos13 ou menos13 ou menos12 ou menos14 ou menos17 ou menos9 ou menos

13-179-1014-1712-1413-1414-1714-1813-1615-1618-2110-13

18 ou mais11 ou mais18 ou mais15 ou mais15 ou mais18 ou mais19 ou mais17 ou mais17 ou mais22 ou mais14 ou mais

Penicilina G. aotestarEstafilococos

PN 10un. 20 ou menos 21-28 29 ou mais

Penicilina G. aotestar outrosmicrorganismos

PN 10un. 11 ou menos 12-21 22 ou mais

Penicilina G. PL 50un. 8 ou menos 0-11 12 ou maisSulfazotrin(Sulfatomoxazol +Trimetoprin)

SFT 25mcg 10 ou menos 11-15 16 ou mais

SulfonamidasTetraciclinaTobramicinaVancomicina

SFTTTBVC

300mcg30mcg10mcg30mcg

12 ou menos14 ou menos12 ou menos9 ou menos

13-1615-1813-1410-11

17 ou mais19 ou mais15 ou mais12 ou mais

Antibiograma: Tcnicas de Preparao e Interpretao 26

Tabela 1.Limites para interpretao do antibiograma com 24

antibacterianos de uso corrente na teraputica clnica.


I so lam en t o e Id en t i f i c a o d e B a c t r ia s G ram Ne ga t i va s 27

VI ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM NEGATIVAS

As bactrias gram-negativas incluem vrios gneros debacilos fermentadores de carboidratos(Enterobactrias;famlia Enterobacteriaceae ) ou no fermentadores decarboidratos (Ex.:Pseudomonas, Acinetobacter). Asenterobactrias (Ex: Escherichia coli, Klebsiella,Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, Proteus,Serratia, etc.)so os bacilos mais freqentemente isoladosde amostras clnicas em laboratrios de microbiologia. Essesbacilos esto amplamente distribudos nanatureza e soencontrados principalmente no trato intestinal dohomem e de animais. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniaee Pseudomonas aeruginosa so as bactrias gram-negativas maisenvolvidas em infeces hospitalares.

A identificao das bactrias Gram-negativas baseiam-se principalmente em reaes bioqumicasque ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismobacteriano.

1 - ISOLAMENTOPara o isolamento dos bacilos gram-negativos so

utilizados principalmente meios seletivos diferenciais.

a) Meios de isolamentogar salmonella Shigella (SS), gar Hektoen (HE), garMacConkey, gar Verde Brilhante, gar Eosina Azul de Metileno(EMB), gar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e gar BismutoSulfito, etc.

b) Tcnica de semeio para isolamentoTransferir o inculo bacteriano para um ponto da

superfcie do meio de cultivo distribudo em placa e semearpela tcnica de estrias utilizando a ala de platinaflambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer adiferenciao e identificao bioqumica.

2 - IDENTIFICAO (Provas bioqumicas)2-1. Fermentao de carboidratos (lactose, sacarose,glicose)

Nos sistemas de provas bacteriolgicas o processo defermentao detectado por observao visual das mudanas decor dos indicadores de pH do meio quando os produtos cidosso formados pelas bactrias.

a) PrincpioOs testes de fermentao de carboidratos determinam a

capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinadoCreate PDF with GetPDF on Windows 7, Vista, XP, Server 2003, 2008. To remove the mark, buy a license.

I so lam en t o e Id en t i f i c a o d e B a c t r ia s G ram Ne ga t i va s 28acar, incorporado numa concentrao de 0,5 a 1,0% em meiobase de vermelho de fenol, produzindo cidos com ou sem gs.Todas as enterobactrias fermentam a glicose pela via Embden-Meyerhof, formando cido pirvico.

b) Meio: base de vermelho de fenolIndicador de pH: Vermelho de fenolcido (cor amarela) - pH < 6,8Alcalino(cor vermelha)-pH >8,4Neutro (cor laranja) - pH = 7,4

c) TcnicaTransferir, com ala de platina estril, uma colnia

bacteriana isolada para o meio lquido vermelho de fenoladicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oCpor 18-24h.

d) ResultadoPOSITIVO: cor amarela -- presena de cido (carboidrato

fermentado)NEGATIVO: cor vermelha -- ausncia de cido (Carboidrato

no fermentado)

2-2 Teste TSI (gar Trplice-acar-ferro)a) Princpio

No meio TSI distribudo em tubos de ensaio observa-se afermentao ou no dos acares (lactose, glicose e sacarose)pelas bactrias Gram-negativas, com produo ou no de gsCO2. Tambm pode se observar a formao de H2S (gs sulfdricoou sulfeto de hidrognio) pela sua reao com o sulfatoferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado desulfeto ferroso que se manifesta por uma reao visvel decor negra.

b) Meio TSINeste meio, alm do gar e das fontes de carbono e de

nitrognio, tambm esto presentes o tiossulfato de sdio que uma fonte de enxofre para a produo de H2S e o indicadorde pH vermelho de fenol,que j foi visto no tpico anterior.

c) TcnicaTransferir a colnia bacteriana isolada para o meio TSI,

utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculaodever ter a profundidade de 2/3 do meio em uma nica picada.Em seguida, fazem-se estrias na superfcie inclinada. Incubara 37oC por 18-24h.

d) Resultado e interpretaoO resultado obtido pela visualizao da mudana de cor

no pico (superfcie inclinada) e no fundo (profundidade) dotubo de ensaio contendo o gar TSI:


I so lam en t o e Id en t i f i c a o d e B a c t r ia s G ram Ne ga t i va s 29 Pico alcalino/fundo alcalino - Ausncia de fermentao dos

aucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter. Pico alcalino/fundo cido - Fermentao apenas da glicose.

Ex: Shigella. Pico alcalino/fundo cido e negro - Fermentao da glicose

e produo de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter. Pico cido/fundo cido - Fermentao dos trs aucares. Ex:

Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outroscomponentes do grupo coliforme.

2-3. Teste de Motilidadea) Princpio e meio

O meio de cultivo apropriado para teste de motilidadebacteriana deve ser semi-slido (0,5% de agar) para permitira difuso de bactrias mveis. O meio SIM (S= H2S,I=Indol,M=Motilidade) um dos meios utilizados para o teste demotilidade, como tambm para o teste de indol que ser vistoem seguida.

b) TcnicaInocular em uma nica picada a colnia bacteriana

isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estril.Incubar a 37oC por 18-24h.

c) ResultadoA motilidade bacteriana detectada pelo exame

macroscpico do meio para se observar uma zona de crescimentodifuso (turbidez) que parte da linha de inoculao feita coma agulha de platina.

2-4. Teste do Citratoa) Princpio

Determinar se um microrganismo capaz de utilizar ocitrato como nica fonte de carbono para seu metabolismo ecrescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrognio(do fosfato de amnia) presente no meio tambm ser, havendoliberao da amnia com a conseqente alcalinizao do meio.

b) Meio: gar Citrato de SimmonsEste um meio slido no qual a nica fonte de carbono

o citrato de sdio (obs: no contm protenas ou carboidratosque so fontes de carbono,tendo como indicador de pH o azulde bromotimol.

c) TcnicaA bactria em estudo inoculada na superfcie do gar

inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfcie do meio,utilizando-se a ala de platina flambada. Incubar a 37oC por18-24h ou at 3 dias, se necessrio.


d) ResultadoPOSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilizao do citratoNEGATIVO: meio verde (neutro) - No utilizao do citrato

2-5. Teste da lisina descarboxilasea) Princpio

Determinar a habilidade enzimtica de uma determinadabactria em descarboxilar o aminocido lisina, com asubsequente alcalinizao do meio devido a formao de aminaalcalina (cadaverina).

b) Meio LIA (gar lisina ferro)Este meio contm como indicador o prpura de

bromocresol:

c) Tcnicacido: cor amarela -- pH < 5.2Neutro a bsico: cor prpura -- pH = 6.8

A bactria teste inoculada em uma nica picada no meioLIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platinaestril. Em seguida, fazem-se estrias na superfcieinclinada. Incubar a 37oC por 24h.

d) ResultadoPOSITIVO: meio prpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilaoda lisina e conseqente formao de aminas.NEGATIVO: meio amarelo (cido) - No ocorreu a descarboxilaoda lisina. A acidificao do meio ocorre porque a bactriafermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio.

2-6. Teste de Indola) Princpio

Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol(benzil pirrol) a partir da molcula de triptofano ououtros aminocido presentes no meio SIM. Quando ocorre adegradao deste aminocido por bactrias que possuem aenzima triptofanase ocorre a formao de: Indol,cido pirvico e amnia. Este teste til para diferenciar aE.coli (indol positiva) de outras enterobactrias.

b) Meio e reativo Meio SIM Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composio: p-

dimetilaminobenzaldedo, HCL concentrado, lcoolisoamlico (Kovac), lcool etlico absoluto (Ehrlich).

c) TcnicaInocular com agulha de platina o meio SIM com a

bactria em estudo e incubar a 37oC por 18-24h.Em seguida,adicionar gotas do reativo Ehrlich ou de Kovacno tubo.d) Resultado


I so lam en t o e Id en t i f i c a o d e B a c t r ia s G ram Ne ga t i va s 31O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfcie do

meio aps a adio do reativo indica a presena de indol euma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada delcool quando o indol produzido reage com o p-Dimetilaminobenzaldedo presente nos reativos de Ehrlich oude Kovac.

2-7. Teste de ureasea) Princpio

Determinar a habilidade de um microrganismo em degradarenzimaticamente a uria pela urease com a formao de duasmolculas de amnia (NH3), resultando na alcalinizao domeio.

b) Meio caldo uriaEste meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol,

j visto anteriormente.

c) TcnicaInocular o caldo uria com uma ala de platina carregada

de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por18-24h, ou at 48h se necessrio.

d) ResultadoPOSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presena de ureaseNEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausncia de urease

3 MTODOS RAPIDOS DE IDENTIFICAO3-1. Sistema API 20E (bio Mrieux) Identificao deEnterobactrias

O sistema de identificao API 20E consiste em tirasplsticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contm ossubstratos desidratados (meio de identificao bioqumica) euma cmara plstica de incubao com tampa frouxa. Cadacompartimento possui um pequeno orifcio superior atravs doqual a suspenso bacteriana diluda em soluo salina ou guadestilada estril pode ser inoculada com uma pipeta. A aobacteriana sobre o substrato produz mudana de cor que interpretada visualmente em 24 horas a 35C. O fabricantefornece folhas de trabalho para registro das interpretaesvisuais das reaes coloridas, que em seguida so convertidasem nmero do bitipo de 7 dgitos, levando a identificao daespcie bacteriana.

Os 20 substratos includos para identificao deenterobactrias so: ONPG, arginina diidrolase, lisinadescarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto dehidrognio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges-


I so lam en t o e Id en t i f i c a o d e B a c t r ia s G ram Ne ga t i va s 32Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol,ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose.

Pelo sistema API 20E so identificadas mais de 100espcies de bactrias gram-negativas. Esse sistema um dosmais utilizados nos laboratrios clnicos e de pesquisa.

Obs: Tambm so comercializados outros sistemas API paraidentificao de bactrias Gram-positivas.

3-2. Sistema VITEK (SISTEMA AUTOMATIZADO)O sistema VITEK (bio Mrieux) um sistema

computadorizado que consiste em um mdulo gerador de vcuo,leitor-incubador, computador-impressora e um monitor decomputador. Este sistema utilizado com cartes de testeVITEK para identificao bacteriana e provas desusceptibilidade a antibiticos, totalmente automatizadas.Este sistema permite a identificao de enterobactrias em 8horas, sendo aceito como um mtodo confivel paraidentificao rpida de bacilos gram negativos noslaboratrios de microbiologia clnica.

Cada carto de identificao possui 30 testesbioqumicos que no necessita adio de reagentes, evitandoerros. VITEK capaz de detectar mais de 300 espcies demicrorganismos (bactrias gram-negativas e gram-positivas eleveduras).

Tabela de Identificao Bioqumica de Enterobactrias

Indol + -/+ - - - -/+ - - - - + - + + +Citrato de Simmons - - d + + + + + +/- + d + - + -H2S (TSI) - - + + +/- - - - - - + + - - -Urease - - - - dw +w +w - - dw + + + + -Motilidade +/- - + + + - + + + + + + + + +Lisina d - + + - + - + + + - - - - -Ornitina d d + + d - + + + + - + + - -Glicose + + + + + + + + + +/- +/- + d -/+ -Lactose + - - d d + + + -/+ -/+ - - - - -Sacarose d - - - d + + + d + + d - d d_

(+) positivo,( - ) negativo, (d) positiva tardia, reao pode ocorrer em at 72h, (w) reao fraca, (+/-) maioria positiva,

(-/+) maioria negativa


A sp e c t o s Mi c ro sc p i co s e Ma c ro s c p ic o s do s F ung o s 33

VII ASPECTOS MICROSCPICOS E MACROSCPICOS DOS FUNGOS

Os fungos so organismos eucariticos, heterotrficos,obtendo sua alimentao a partir de matria orgnicainanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos.Estes microrganismos causam doenas humanas, em animais evegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (oumofos) e as leveduras. Os bolores so filamentosos epluricelulares e as leveduras se apresentam sob formaunicelular.

Conhecer os aspectos microscpicos e macroscpicos dosfungos de extrema importncia para a identificao destesorganismos que so agentes etiolgicos de processosinfecciosos, de reaes de hipersensibilidade imediata etardia e produtores de micotoxinas.

A coleta do material o primeiro passo paraobteno de um resultado laboratorial confivel. Deve-sesempre questionar o paciente em relao ao uso de medicaesantifngicas tpicas e/ou sistmicas. Caso o paciente estejafazendo uso da medicao, o mesmo dever ser orientado asuspend-la por um perodo de 15 dias, em caso de uso tpicoe 1 ms, quando se tratar de drogas de uso sistmico. Estasuspenso deve ser realizada com autorizao mdica.

de grande importncia que todos os espcimesclnicos encaminhados para diagnstico laboratorial, venhamacompanhados de uma ficha, que contenha no mnimo asseguintes informaes: identificao e procedncia dopaciente, tempo de evoluo da leso, localizao e aspectosclnicos da leso, possveis contatos com animais e solo, usode drogas.

1)ASPECTOS MICROSCPICOS DOS FUNGOS1.1- Exame microscpico direto

O diagnstico microbiolgico e imunolgico das micosespode ser feito pelo exame microscpico direto, examehistopatolgico, cultivos, testes intradrmicos, pesquisa deanticorpos sricos e de antgenos. O exame microscpicodireto o mtodo mais usado no diagnstico de rotina dasmicoses por ser rpido e sensvel, permitindo a visualizaodo fungo e em muitas ocasies, sua identificao. importante salientar que a realizao do cultivoparalelamente ao exame direto imprescindvel para umcompleto diagnstico laboratorial micolgico.

A tcnica de preparao para o exame direto, varia deacordo com o material biolgico a ser investigado e dasuspeita clnica da etiologia do processo. Preparao do exame direto com amostras clnicas densas

(p.ex.: escamas epidrmicas, ungueais e plos):



a) Clarificar a amostra clnica, j sobre a lmina, com 1 gotada soluo de hidrxido de potssio (KOH) a 10-20%;

b) Aquecer suavemente a lmina na chama do bico de Bunsen; ocalor juntamente com o KOH vai dissolver a queratinapresente na amostra, clareando o material de fundo; esperar10 minutos, tempo necessrio para clarear o material defundo.

c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodo(ou azul de Amann);

d) Cobrir com lamnula;e) Examinar ao microscpio com objetiva de 40X.

Exemplos de algumas caractersticas morfolgicas dosfungos:

clula brotante

Pseudo-miclio Hifa cenoctica Hifa septada

Hifa artrosporada

Epidermophyton sp Microsporum sp Trichophyton sp

A- MacrocondeosB- Microcondeos


A sp e c t o s Mi c ro sc p i co s e Ma c ro s c p ic o s do s F ung o s 35 Preparao da lmina a partir do cultivo de fungos:a) Colocar 1 a 2 gotas do corante lactofenol azul-algodo;b) Retirar uma pequena poro da colnia (do miclio

reprodutivo ou areo, no caso dos fungos filamentosos) ecolocar sobre a lmina;

c) Cobrir com lamnula;d) Observar ao microscpio com objetiva de 40X.Aps o preparo da lmina podemos visualizar os aspectosmicroscpicos dos fungos.

Observaes:9 As amostras de consistncia lquida e relativamente claras

podem ser examinadas diretamente ao microscpio aps amistura em uma gota de soluo salina em lmina de vidro.

9 A utilizao do corante lactofenol azul-algodo importante porque o fenol inviabializa os microrganismosvivos e o azul-algodo cora a quitina, presente nas paredesdas clulas fngicas.

1.2- Aspectos microscpicos dos fungos filamentosos ou boloresO fungo filamentoso se origina a partir de um esporo,

que emite um filamento tubular microscpico, chamado hifa,que posteriormente se ramifica formando um conjunto de hifasdenominado miclio, que pode ser vegetativo ou reprodutivo(areo). Algumas hifas apresentam paredes transversais ouseptos e so chamadas hifas septadas, outras no possuemseptos e so chamadas hifas cenocticas .

Microscopicamente, os bolores so identificadosprincipalmente pelos tipos de esporos, corpos de frutificaoe hifas. Os esporos so muito importantes na classificaodos fungos, sendo as classes diferenciadas, primariamente,pelas caractersticas morfolgicas dos esporos.

A anlise conjunta das caractersticas microscpicas,em geral, permite a classificao genrica do fungo. Adefinio da espcie, geralmente, tarefa de laboratrios dereferncia.

1.3- Aspectos microscpicos das levedurasComo leveduras, os fungos apresentam-se unicelulares

com forma oval ou arredondada. A reproduo assexuada dasleveduras ocorre principalmente por gemulao ou brotamento.Algumas vezes, aps a gemulao, as leveduras e as clulas-filhas ficam aderidas, formando uma estrutura conhecida comopseudomiclio (p.ex., Candida). As leveduras tambm podem sereproduzir sexuadamente atravs de ascosporos oubasidiosporos. Portanto, aobservao microscpica deestruturas assexuadas e sexuadas bastante empregada naidentificao genrica das leveduras.


A sp e c t o s Mi c ro sc p i co s e Ma c ro s c p ic o s do s F ung o s 362) ASPECTOS MACROSCPICOS DOS FUNGOS (Observao macroscpicadas colnias em meio slido).

Ao contrrio do que se verifica no estudo dasinfeces bacterianas, em que o cultivo o principal mtododiagnstico, nas infeces fngicas ele um complemento doexame microscpico direto. As razes que podem contribuirpara isso, so o crescimento lento dos fungos e asdificuldades para cultivar alguns deles.

O isolamento primrio, seguido da corretaidentificao dos agentes etiolgicos, uma condioindispensvel para o diagnstico laboratorial das micoses, e,para tanto, a escolha do meio de cultura adequado umatarefa de extrema importncia.

Uma ampla variedade de meios de cultura pode serutilizada num laboratrio de micologia, atendendo a diversosfins, tais como: isolamento primrio do fungo a partir dosespcimes clnicos, a identificao taxonmica dos gneros eespcies, a estocagem e manuteno em micoteca, e, maisrecentemente a execuo de testes de susceptibilidade frentea diferentes antifngicos.

A seleo do meio a ser empregado deve, basicamente,levar em considerao o tipo de amostra biolgica a sersemeado e a suspeita clnica.

Apesar da variedade de meios de cultivodisponveis(muitos vendidos pronto para uso, outrospreparados artesanalmente), o gar Sabouraud ainda o meiomais utilizado dentro de um labotatrio de micologia. A essemeio podem ser acrescidos muitos inibidores,tais como ocloranfenicol e a cicloeximida, objetivando otimizar oisolamento em espcimes clnicas possivelmente contaminadaspor bactrias e fungos anemfilos (fungos que apresentam suasestruturas de reproduo comumente vetorizadas por correntesde ar). O meio de Sabouraud o principal meio de culturautilizado na micologia mdica. utilizado para o cultivoprimrio geral dos fungos (leveduras, filamentosos e algunsdimrficos), emespecial para Dermatoftos, uma vez que asprincipais caractersticas macro e microscpicas dessegrupamento fngico so descritas a partir do seu crescimentonesse meio.

Porm importante salientar que alguns fungosfilamentosos dos gneros Aspergillus, Fusarium,Scopulariopsis, ou algumas leveduras como o Cryptococcusneoformans, por exemplo, podem ter seu crescimento inibido napresena da cicloeximida.

As caractersticas principais deste meio so o seu pHcido (5.8) e seu elevado teor em glicose, que o torna maisseletivo para fungos, dificultando o crescimento bacteriano.Entretanto, o meio no totalmente impediente parabactrias, por esta razo deve ser acrescido de antibiticosque inibem o crescimento destes microrganismos. Oclorafenicol um dos antibiticos mais utilizados, pelacomodidade do seu uso, pois pode ser esterelizado naautoclave e pelo seu amplo espectro de ao.


A sp e c t o s Mi c ro sc p i co s e Ma c ro s c p ic o s do s F ung o s 37A composio do gar Sabouraud foi,inicialmente

proposta pelo micologista Raymond Jacques Sabouraud, em 1904,e vem apresentando diversas modificaes com o passar dosanos, com alteraes na quantidade de alguns componentes,tais como a dextrose e a adio de substncias inibidoras ,como o clorofenicol e a cicloeximida.

COMPOSIO DO MEIO GAR SABOURAUD:Dextrose (glicose) ---- 20gPeptona -------------- 10ggar ------------------ 20ggua ---------------- 1.000mlpH final = 5.6

Dissolver agar, peptona e dextrose em gua destilada,aquecendo em banho-maria. Autoclavar, por 15 minutos, a121C.

OUTROS MEIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO DOSFUNGOS: gar batata dextrose, gar malte, gar fub, garextrato de levedura glicose, etc.


A sp e c t o s Mi c ro sc p i co s e Ma c ro s c p ic o s do s F ung o s 382.1- Aspectos macroscpicos dos fungos filamentosos

A morfologia das colnias dos fungos filamentosos umimportante dado e pode auxiliar bastante em suaidentificao. Para isso so feitas observaes quanto textura, cor, topografia, consistncia, contorno da colnia,etc.

TEXTURA A textura da colnia refere-se s caractersticasdos miclios areos em seu conjunto e pode ter aspecto: ALGODONOSO OU COTONOSO: miclio areo denso e alto; AVELUDADO: miclio areo baixo, lembrando veludo; PULVURULENTO: hifas planas, esfarelam-se facilmente devido

densa produo de condias; CREO OU GLABROSO: superfcie lisa, pois no produzem

miclio areo.

COR- A colnia pode ser branca, amarelada, acinzentada,alaranjada, verde, rosa, creme, marrom, etc. A cor do verso eanverso da colnia e os anis concntricos de diferentescores so aspectos a serem considerados na identificao.

CONSISTNCIA- A colnias pode ser pastosa, branda, coricea,mole, etc.

CONTORNO- A colnia pode ser circular, oval, elptica,irregular, etc.

2.2- Aspectos macroscpicos das levedurasA maioria das leveduras cresce adequadamente a 30oC ou

temperatura ambiente em gar Sabouraud. Caractersticascomo cor, consistncia, bordos, superfcie e topografiatambm so observadas em meios de cultivo slidos. Com 2 a 3dias de incubao formam-se colnias de cor branca a creme,amarelada, alaranjada ou vermelha, de textura pastosa,mucides ou secas, lisas ou enrugadas.

A habilidade da levedura crescer a 37oC umacaracterstica importante; a maioria das leveduraspatognicas cresce bem a 30-37oC, enquanto as saprfitas nocrescem em temperaturas mais elevadas.



ASPECTOS DAS COLNIAS FNGICAS QUANTO AO RELEVO1. Cerebriformes2. Rugosas3. Apiculadas4. Crateriformes



ASPECTOS DE COLNIAS FNGICAS QUANTO TEXTURA1.Algodonosas2.Furfurceas3.Penungentes4.Arenosas5.Veludosas6.Glabrosas


R e a e s Ant g en o - An t i co rp o 41VIII REAES ANTGENO ANTICORPO

Introduo tericaA exposio de eptopos (antgenos=imungenos) a um

sistema de clulas e tecidos imunologicamente competentes,origina estimulao de linfcitos B e T . Os primeiros(LB),diferenciam-se aps divises mitticas, em plasmcitos queso clulas munidas de um Sistema de membranas (Golgi eRE)prprios de clulas produtores e secretoras de protenas.Estas protenas so glicoprotenas globulares com funo dese combinar quimicamente com os elementos que formam parte doeptopo que deu origem a todo este fenmeno celular esecretor.

Os linfcitos T, ao serem estimulados, secretaminterleucinas, que so protenas cuja funo estimularoutros linfcitos T e B (interleucinas 2,4) macrfagos, NK,linfcitos citotxicos (interferon gama)por exemplo.

Apenas discutiremos, por enquanto, a ao dasglobulinas produzidas pelos plasmcitos: Os anticorpos ouimunoglobulinas.

AES IN VITRO: Reaes antgeno anticorpo

Estas acontecem entre a poro Fabdas molculas deanticorpo e o eptopo dos imungenos. Nesta poro Fab, quese estabelecem ligaes no covalentes fracas como :pontes deHidrognio, ligaes eletrostticas, hidrfobas e medianteforas de Van der Waals. Conhecendo os tipos de ligaes quese estabelecem e mantm unidos o complexo antgeno-anticorpo, fica fcil entender o conceito de especificidade,pois somente podero se formar estas ligaes em nmerosuficiente para se manterem estveis, SE O ANTICORPOREALMENTE FR DIRIGIDO CONTRA ESSE EPTOPO. Se as ligaes seformam tambm a nvel de estrutura primria e secundria doanticorpo, formando numerosas ligaes de curto alcance, ocomplexo estvel.

Ento, numa primeira instancia, deve haver interaoqumica entre imungeno (antgeno quando falamos de reao invitroE FAB do anticorpo. Numa Segunda etapa, grande nmero demolculas do complexo antgeno-anticorpo, tendem a formarmalhas que naturalmente sedimentam como grumos grosseiros oucomo sedimento fino, dependendo da condio fsica doantgeno. Se particulado (hemcias, bactrias, protozorios)se observam grumos; se solvel, se forma fino precipitado como imunocomplexo.ALGUNS CONCEITOS IMPORTANTES: Atravs das reaes sorolgicas pode-se pesquisar

anticorpos contra um determinado antgeno bacteriano,parasitrio, mictico, ou at mesmo contra componentes do


R e a e s Ant g en o - An t i co rp o 42prprio indivduo como acontece nas doenas autoimunes.Nestes casos ,variaes no ttulo de anticorpos indicamevoluo ou involuo da doena ou infeco. J ,quandointeressa utilizar estas reaes para detectar antgenoscirculantes no soro ou plasma, basta saber se estes existemou no, as reaes podem ser apenas qualitativas. Se quiserquantificar o antgeno, basta comparar o resultado comconcentraes de padres bem quantificados.

Ttulo: a maior diluio do soro que ainda reagepositivamente numa reao antgeno-anticorpo. Assim, umalto ttulo indica uma grande quantidade de anticorpos(foinecessrio diluir muito os anticorpos presentes para queestes desaparecessem na unidade de volume pr-fixada. Ex.:ttulo 1/10

R e a e s Ant g en o - An t i co rp o 43aplicaes existem na rotina laboratorial para estastcnicas:

Imunodifuso radial Imunodifuso dupla Imunoeletroforese Contra imunoeletroforese

REAO DE FLOCULAO TCNICA DE VDRLTeste no treponmico para o diagnstico de Sfilis: VDRL

A tcnica de VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory) um exemplo de reao de floculao, cujo objetivo apesquisa de anticorpos em um indivduo com suspeita desfilis, sendo esta doena causada pela espiroqueta Treponemapallidum sub-espcie pallidum.

A tcnica de VDRL pode ser realizada atravs dos mtodosqualitativo e quantitativo. utilizada como triagemsorolgica para a pesquisa de anticorpos em um indviduo comsuspeita de sfilis e tambm para acompanhamento da respostateraputica do paciente positivo, atravs da titulao dosanticorpos. A cardiolipina o antgeno utilizado na tcnicaque pesquisa anticorpos, chamados de reagina. Trata-se de umfosfolpideo que atualmente preparado a partir do coraobovino, sendo assim denominado cardiolipina. Aparentemente,ocorre produo de um anticorpo denominado reagina nasfilis, que reage com este complexo de cardiolopina-lipoprotena. No se sabe exatamente por que a reagina produzida; todavia, no se trata de um anticorpo especficocontra o T. pallidum. Os espiroquetas possuem uma substncialipide, e possvel que esta substncia sejasuficientemente semelhante ao complexo de cardiolipina-lipoprotena para que os anticorpos produzidos contra oantgeno lipide dos espiroquetas tambm possam reagir com acardiolipina.Um fato de grande importncia nesse teste de triagemsorolgica para Sfilis, que nem todo sifiltico comprovado


R e a e s Ant g en o - An t i co rp o 44atravs de provas treponmicas, produz reao positiva paraessa prova de VDRL. Outro dado de grande importncialaboratorial, o fato de cerca de 2% de pacientes na sfilisprimria e secundria serem falsamente negativos devido a umexcesso deantgenos (fenmeno conhecido como pr-zona).Devido a esta ocorrncia a OMS, sugeriu a realizao desseteste de triagem, qualitatiamente e quantitativamente nadiluio de 1/8 para todos pacientes submetidos a esse meiode diagnstico laboratorial.Por outro lado, alguns pacientes apresentam resultados falso-positivos, sem possuir a doena ou terem se submetido a algumtipo de exposio. Segue abaixo as principais causas deresultados falso-positivos:

1. Infeces virais ou bacterianas e em muitos estadosfebris, como hipersensibilidade ou vacinao;

2. Doenas sistmicas crnicas, com presena de anticorposantifosfolpideos;

3. Doenas reumatides do colgeno;4. Doenas infecciosas como Malria e Tuberculose;5. Doenas treponmicas no-sifilticas, como bouba,

pinta, Borrelia (doena de Lyme) ou febre recidivante.

Material para um grupo

Mtodo qualitativo

VDRL, soro positivo e negativo, ponteiras, pipeta automticade 50 l, lminas, luva descartvel, culos protetor.

Procedimento: Sobre a lmina limpa marcar retngulos. Colocar 50 l de da amostra do soro positivo e do

soro negativo. Colocar uma gota do antgeno (cardioplina).


R e a e s Ant g en o - An t i co rp o 45 Homogenizar durante um minuto com movimentos de vaivm

para que ocorra a reao Antgeno-Anticorpo e observar apresena ou no de floculao na lmina.

Leitura dos resultados:O resultado observado pela floculao que ocorrer,

poder ser uma floculao leve, moderada ou intensa,dependerda presena do ttulo dos anticorpos no soro do indivduo.


R e a e s Ant g en o - An t i co rp o 46TESTE RPIDO DE TRIAGEM QUALITATIVA PARA DETECO DEANTICORPOS PARA HIV 1/2.

O teste rpido HIV 1/2 - Bio-Manguinhos um teste detriagem, que usa um coquetel de antgenos para detectaranticorpos para HIV 1/2 em soro, plasma ou sangue totalhumano. O teste se baseia nas tecnologias deimunocromatografia e fluxo lateral.

Resumo:O Vrus da Imunodeficincia Humana (HIV) um retrovrus,

identificado em 1983 como agente etiolgico da Sndrome deImunodeficincia Adquirida. A AIDS caracterizada poralteraes em funo e nmero na populao de linfcitos T (Thelper), que desempenha um papel chave na respostaimunolgica do hospedeiro humano, deixando os portadoresdeste vrus suscetveis a infeces oportunistas e certasmalignidades.

O HIV constitudo por uma molcula de RNA, protegidapor um capsdeo e um envelope. O envelope do vrus oprincipal alvo da resposta imune. A presena do vrus faz comque o sistema imune dos pacientes produza anticorp

apostila de microbiologia

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