apostila de água 2004

Análise

Microbiológica

Da

Água

Departamento de Engenharia Química - UFPE

Maria de Los Angeles Perez palhaAlice G. Andrade Lima

Sônia Albuquerque

2004

3

ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA POTÁVEL

1-Introdução

Embora possa parecer que a água constitui uma reserva natural inesgotável, isso não

representa a realidade, já que 95% da água do planeta é salgada, sendo imprópria para o

consumo humano e dos 5% restantes, 4,7% estão sob a forma de geleiras ou em regiões

subterrâneas de difícil acesso, o restante apto ao consumo humano, encontra-se em lagos,

rios e lençóis subterrâneos.

Particularmente para o Brasil, a aparente abundância é falsa, uma vez que 80%

encontra-se no Amazonas onde vivem apenas 5% da população. O nordeste com 1/3 da

população do país dispõe de apenas 3,3% das reservas hídricas do país. No mundo inteiro há

países ou regiões com graves problemas de abastecimento: ora devido a seca crônica, ora a

má distribuição dos recursos hídricos, ora a contaminação desses recursos. A água

contaminada é responsável por cerca de 70% das internações hospitalares, são pacientes

vítimas de doenças de origem hídrica (tabela1), como disenteria, hepatite, febre tifóide,

cólera e, indiretamente leptospirose e dengue (Macedo, 2001)

Além da contaminação microbiana, o desenvolvimento industrial, a ocupação

inadequada do solo e o uso de fertilizantes vêm comprometendo as águas disponíveis para o

consumo humano, recreação e agricultura, aumentando consideravelmente o risco de

transmissão de doenças de origem hídrica (figura 1). Segundo a Organização Mundial de

Saúde (OMS), 80% das moléstias que ocorrem nos países em desenvolvimento são

ocasionadas por contaminação da água: 15 milhões de crianças de 0 a 5 anos morrem devido

a enfermidades contraídas por conta da falta ou ineficiência dos sistemas de tratamento de

águas e esgotos. Apenas 30% da população utiliza água tratada, o restante faz uso de águas

de poços, rios, lagos, estando, portanto passíveis à contaminações (Macedo, 2001).

Desta forma se faz necessária a vigilância rotineira da qualidade química e

particularmente, microbiológica das águas por parte das autoridades sanitárias, órgãos de

saneamento, indústrias, clínicas de hemodiálise, hospitais, entre outros. A pesquisa de

patógenos nem sempre é fácil ou econômica para que seja feita rotineiramente. Assim, é

imprescindível o uso de microrganismos indicadores de contaminação fecal.

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Tabela 1 - Microrganismos patogênicos encontrados intermitentemente em fezes humanas e transmissores comprovados de doenças através da água.

Microrganismo Patógeno DoençaBactérias Vibrio cholerae

Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei

Salmonella typhiSalmonella paratyphi Salmonella enteridisSalmonella choleraesuis

Cólera

Disenteria Bacilar

Febre tifóide ou entéricas

Vírus Vírus da hepatite tipo ARotavírusAdenovírus poliovírus

HepatiteGastroenterites em criançasGastroenteritespoliomielite

Protozoários Entamoeba histolyticaGiardia lamblia

Disenteria amebiana

Helmintos Ascaris lumbricoidesTrichuris trichiura

Verminoses

Figura 1- Principais vias de Transmissão de patógenos (Sanchez, 1999)

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Fezes Humanas

Água de drenagem Esgotos Fossas

Oceanos e estuários

Rios e lagos Água subterrânea

Fertilização e irrigação

Moluscos Águas recreacionais

Suprimento de água potável

potável

Produtos agrícolas

Aerossóis

Homem

2. Microrganismos indicadores

Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de organismos, que quando

presentes em um produto, fornecem informações sobre a ocorrência de contaminação de

origem fecal, presença de patógenos, manipulação e/ou tratamento inadequada, assim como

deterioração potencial de bens de consumo. Os indicadores microbianos servem para avaliar

as condições sanitárias a que o produto foi submetidas. O uso de Escherichia coli como

indicador de contaminação de origem entérica em águas e alimentos foi proposto em 1892,

uma vez que esse microrganismo é encontrado nos intestinos do homem e de animais de

sangue quente, sendo o mais utilizado por preencher alguns requisitos, tais como:

Ser um microrganismo que prevalece em esgotos e é excretado pelo homem e

outros animais (50 milhões de células/g de dejetos humanos).

Ocorrer em número muito alto e em relação direta ao grau de contaminação fecal.

Ser incapaz de se multiplicar em ambiente aquático.

Apresentar alta resistência ao ambiente extra-enteral.

Ser detectado por técnicas rápidas, simples, precisas e econômicas.

As bactérias do grupo coliforme fazem parte da flora normal do intestino, onde não

causam doenças, na realidade são fundamentais ao funcionamento normal desse órgão. No

entanto, esses microrganismos mostram-se patogênicos quando fora do trato intestinal,

colonizando outros tecidos, como trato urinário, peritônio, meninges, entre outros e,

dependendo das condições de defesa do indivíduo, podem causar doenças e morte.

No caso de águas minerais, além dos indicadores de contaminação fecal

(Coliformes totais e fecais), é recomendada a pesquisa Streptococcus faecalis, Pseudomonas

aeruginosa e Clostridium perfrigens.

Não existe um indicador ideal ou universal, que reúne todos os requisitos necessários,

de modo que a sua ausência ateste uma água de puríssima qualidade. Assim, vários autores

preconizam a pesquisa de bactérias do gênero Pseudomonas aliada à bactéria E. coli, uma

vez que essa bactéria, em determinadas concentrações, inibe o crescimento da Escherichia,

no entanto segundo portaria publicada no Diário Oficial em vigor (Nº518 - 25/03/2004), esse

cuidado não é necessário.

2.1 Grupo Coliforme6

As bactérias pertencentes ao grupo coliforme são encontradas normalmente nos

intestinos do homem e demais animais de sangue quente, sendo expelidas em grande

quantidade, através de seus dejetos, podendo também estar presentes em vários setores do

meio ambiente como esgotos, águas superficiais, solos, vegetação, insetos, entre outros.

Verifica-se, dessa maneira, que o risco de transmissão de moléstias infecciosas através da

água está estreitamente vinculado as doenças infecciosas intestinais. ( tabela 1.0).

Uma água destinada ao consumo público, deve estar isenta de bactérias ofensivas ao

organismo humano. É portanto a pureza bacteriológica que condiciona a potabilidade de

uma água, sendo inclusive, fator mais importante do que qualquer outro requisito de ordem

físico-química.

O grupo Coliforme é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae, são

bastonetes Gram negativos, não formadores de esporos, anaeróbios facultativos ou aeróbios,

são capazes de fermentar um grande número de carbohidratos (Pelczar Jr. et al, 1997). Essa

família engloba vários gêneros destacando-se entre outros:

1. Escherichia: E. coli2. Proteus: P. vulgaris3. Klebsiella: K.pneumoniae4. Citrobacter:5. Serratia: S. marcescens6. Enterobacter : E. aerogenes7. Salmonella: S. typhi8. Shigella: S. sonnei

Alguns microrganismos entéricos, por ex.: Escherichia coli, fazem parte da flora

normal do intestino e, acidentalmente causam doenças, enquanto outros, Salmonella e

Shigella, são sempre patógenos aos seres humanos. Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella,

além de serem encotrados nas fezes, também encontram-se em vegetais e solo, onde

persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal. A E. coli é o

subgrupo mais importante, sendo escolhido como microrganismo indicador. Consegue

hidrolizar o dissacarídeo lactose e, conseqüentemente, fermentar este açúcar com produção

de gás, quando incubado a 35-37ºC, por 48h.. Espécies relacionadas, fermentadoras da

lactose também são encontradas no solo e em desenvolvimento sobre plantas e material

vegetal. O E. aerogenes, principal representante desse subgrupo, também fermentador da

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lactose, é encontrado tipicamente no solo e em plantas. Pode ocorrer igualmente no trato

intestinal do homem e de animais de sangue quente, não parecendo, contudo, ser ali seu

habitat regular, por isso se atribui pouca importância à sua presença na água. Não obstante, a

presença de qualquer tipo de organismo coliforme na água potável sugere, um tratamento

inadequado ou acesso de material indesejável à água, após o tratamento.

A velocidade de morte de uma população de Escherichia coli em água, em geral,

acompanha a taxa de mortalidade das bactérias patogênicas como S. typhi nesse mesmo

meio. Os outros membros do grupo coliforme, como o E. aerogenes, têm resistência um

pouco maior.

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3. Análise Microbiológica da água

As técnicas de análise tradicionalmente utilizadas para pesquisa de bactérias em água

são as de tubos múltiplos e a de membrana filtrante. Novos métodos têm sido adotadas nos

últimos anos, em particular o de presença / ausência, além de outros que fazem uso de

reativos cromogênicos de alta sensibilidade. A escolha da metodologia adequada, desde que

respeite as normas vigentes, será função do tipo de água, da finalidade da mesma, da infra-

estrutura do laboratório, da capacitação pessoal e dos recursos financeiros disponíveis.

3.1 COLETA DA AMOSTRA

Frasco de Amostragem

Dá-se preferência a frascos com capacidade para recolher pelo menos 100 ml de água

deixando espaço para o ar, tornando possível a homogeneização da amostra. Os mais

indicados são frascos de vidro transparente, incolor, com capacidade nominal de 250 ml

dotados tampa de vidro esmerilhada.

Os frascos devem ser lavados e esterilizados. Para a coleta de água clorada, deve-se

adicionar ao frasco 0,1ml de solução de tiossulfato de sódio a 10%. Esta solução tem a

função de eliminar a ação do cloro residual na amostra. No entanto, este teor não tem

qualquer ação nociva aos germes porventura existentes.

Na preparação do frasco coloca-se entre a tampa e o gargalo uma tirinha de papel

alumínio, para permitir a saída livre do ar e circulação do vapor saturado durante a

esterilização no autoclave. Protege-se ainda a tampa do frasco com um papel ou folha

metálica e autoclava-se a 120ºC durante 20 minutos.

Técnica de Coleta Procedimento:1. Não tocar o interior ou a tampa do frasco; o papel deve ser afrouxado, devendo o

operador segurar a tampa, para abri-lo, sem remover o papel deixando entretanto cair a tirinha inserida no gargalo por não ser mais necessária.

2. Para a coleta de amostras na rede de distribuição de água, escolhe-se uma torneira e lava-se a mesma e o encanamento próximo com detergente. Alguns autores indicam a assepsia com etanol a 70%. Abre-se e deixa-se a água fluir em jato forte durante 3 a 5 minutos.

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3. Em seguida com a torneira aberta moderadamente, colhe-se a amostra até o volume de 2/3 do frasco, de modo a permitir a sua homogeneização.

4. Registro de dados: Devem ser anotados: Data e hora da coleta Temperatura e pH da água Localização da tomada de amostra

Sempre que possível medir o teor residual de cloro no momento da coleta. Deve-se

considerar as condições sanitárias do local onde foi feita a amostragem, anotando-se

detalhes como profundidade do poço, tempo de funcionamento, proximidade de fossas,

matadouros, curtumes.

Cuidados: Na tomada de amostras de rede do abastecimento público, não efetuar a coleta em

torneiras que não estejam ligadas diretamente ao sistema distribuidor.

Na coleta de amostras de uma fonte superficial como rio, açude, etc, a amostragem

deverá ser feita em um ponto que esteja o mais próximo possível da estação de

tratamento.

Poços com bombas manuais são operados de maneira semelhante, bombeando-se por

5 minutos antes da tomada da amostra. Se o poço não tem bomba, faz-se descer o

frasco esterilizado, ligado a um peso e com um dispositivo que permita abri-lo

debaixo d’água. Existem frascos e dispositivos especiais para a coleta de amostras de

água abaixo da superfície, a profundidade desejada.

3.2 TRANSPORTE E TEMPO DE ESPERA

Tanto quanto possível manter a temperatura da amostra próxima à da ocasião da sua

retirada. Os métodos modernos de análise não mais recomendam o seu resfriamento pois

consideram desprezíveis as alterações em tipos e números de bactérias durante a

conservação, no entanto deve ser guardada a uma temperatura que oscile entre 0 e 10ºC. O

exame deve começar de preferência dentro de 1 hora após a coleta e no máximo decorrido

24 horas.

10

3.3 TÉCNICA DO EXAME:

Os métodos de exame bacteriológico da água são padronizados e a metodologia deve ser seguida regiamente. Os processos de rotina para água potável consiste em:

Contagem padrão de bactérias heterotróficas em placa Testes que revelem a existência de bactérias do grupo coliforme

3.3.1Técnica dos tubos múltiplos

Princípio do método

Consiste no inóculo de volumes decrescentes da amostra, em meio de cultura

adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado

em uma série de tubos (série de 05 ou de 03). Para análises de águas, têm sido utilizado

preferencialmente o fator 10 para diluição, sendo inoculados múltiplos e submúltiplos de

1ml da amostra, usando-se, geralmente, as séries de 5 tubos para cada volume a ser

inoculado. Os resultados são avaliados através da tabela de Hoskins (anexo 1), que permite a

obtenção de uma estimativa da densidade original das bactérias pesquisadas, através da

aplicação de cálculos de probabilidade (N.M.P.: número mais provável) que é expressa

como NMP por 100 ml . O exame completo se processa através de três ensaios

consecutivos:

a) Ensaio presuntivo

b) Ensaio confirmativo

c) Ensaio completo ou diferencial

No entanto, são de realização obrigatória para todos os tipos de amostras de água o

ensaio presuntivo e confirmativo. A contagem padrão em placas e o ensaio presuntivo são

feitos paralelamente.

1º Etapa:

ENSAIO PRESUNTIVO

Geralmente são usadas três séries de 5 tubos grandes dotados dos respectivos tubos

de Durham ou ampolas de injeção ( para recolher os gases). A primeira série contém, cada

tubo, 10 ml de meio de caldo lactosado em concentração dupla(CLD). As duas outras,

compostas de 10 tubos menores, também com tubos de Durham, contêm em cada, 10 ml de

caldo lactosado em concentração simples (CLS) (figura - 2).

11

Técnica:

Com pipeta estéril de 10 ml, inocular cada um dos 5 tubos grandes ( C.L.D.) com 10 ml da amostra;

Com uma outra pipeta de 1 ml estéril, inocular 1 ml da amostra em cada um dos 5 tubos menores com caldo lactosado simples

Transferir 1 ml da amostra para um tubo de diluição com 9 ml de água destilada estéril ou água tamponada estéril. Desta diluição (1/10), inocular 1 ml em cada um dos 5 tubos com caldo lactosado simples restantes.

Agitar os tubos cuidadosamente e incubá-los a 35ºC por 24/48h.

Após 24 horas de incubação, se houver formação de gás em qualquer quantidade,

em qualquer tubo, o ensaio presuntivo é positivo. Se não houver gás esperar por mais 24

horas.

Se após 48h não houver formação de gás em qualquer tubo, o ensaio é negativo e a

análise está encerrada quanto a coliformes. Havendo formação de gás, anota-se o número de

tubos positivos e negativos e prossegue-se o ensaio (ensaio confirmativo).

CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS EM PLACAS

Este ensaio constitui um dos indicadores da qualidade da água e da eficácia do

tratamento. Visa determinar a densidade de bactérias que são capazes de crescer na presença

de compostos orgânicos contidos em meio de cultura apropriado sob condições pré-

determinadas. Com a finalidade de se conseguir uma maior confiabilidade nos resultados,

costuma-se além da inoculação da amostra original, efetuar diluições decimais que vão

desde 1/10 (para águas sabidamente boas) até 1/105 para contagem de mesófilos

heterotróficos (figura-2). Essas diluições são feitas em frascos ou tubos contendo águas

tamponadas (com KH2PO4) ou água estéril. A amostra deve ser agitada vigorosamente antes

de se iniciar as diluições.

Técnica:

Faz-se a primeira diluição (1:10) colocando 1 ml da amostra em 9 ml de água estéril ;

agita-se bem e transfere-se 1 ml desse tubo para outro contendo 9 ml de água estéril

(1/100) e assim, sucessivamente até que se tenha todas as diluições desejadas.

De cada diluição transfere-se então 1 ml para Placa de Petri estéril (deve-se fazer

duplicatas ou triplicatas) e adiciona-se de 10 a 15 ml de meio de Agar-glicosado (GA)

fundido e resfriado a 42-45ºC.

12

Agitam-se as placas com movimentos circulares nos sentidos horário e anti-horário,

evitando-se sujar a tampa da placa. Deixa-se solidificar e incuba-se em estufa a 35ºC

durante 24/48h horas.

Após incubação examina-se as placas escolhendo-se para contagem as que tenham

entre 30 a 500 colônias* (evidentemente se a placa inoculada com 1ml da amostra não

diluída tiver um número inferior a 30 colônias, esse número será registrado). Para auxiliar na

contagem é utilizado um aparelho especial munido de lupa, o Contador de Colônias tipo

Quebec.

Se as placas escolhidas forem originadas de qualquer das diluições não se deve

esquecer que o resultado final será a média do número de colônias nas placas (das

duplicatas ou triplicatas), multiplicado pela recíproca da diluição. O resultado obtido é

expresso em unidades formadoras de colônias de bactérias heterotróficas por mililitro

(UFC/ml). Contar somente as colônias que apresentarem as seguintes características:

a)colônias circulares lisa e rugosas

b)colônias ovaladas, lisas, rugosas e estreladas;

c)colônias brancas, amarelas, azuis, etc.

* O número máximo permitido de unidades formadoras de colônias por placa varia de

acordo com a finalidade da água.

13

14

1

11 ml

1 ml

1 ml

10 mlAmostra

Tubos contendo 10 ml de CLD

Tubos contendo 10 ml de CLS

1 ml

1 ml

1 ml

9 ml de água estéril


10-2

10-2

1 ml

1 ml

1 ml10-1

10-1


Figura 2 – Esquema de inoculação para ensaio presuntivo e contagem em placas

Amostra

1

11 ml

1 ml

1 ml

10 mlAmostra

Tubos contendo 10 ml de CLD


1 ml

1 ml

1 ml



10-2

10-2

1 ml

1 ml

1 ml10-1

10-1


Figura 2 – Esquema de inoculação para ensaio presuntivo e contagem em placas

Amostra

2º Etapa:

ENSAIO CONFIRMATIVO

Um ensaio presuntivo positivo, não indica necessariamente a presença de coliformes;

alguns germes da flora normal de água e de solo, principalmente bacilos Gram-positivos,

esporulantes, anaeróbios, do gênero Clostridium são capazes de fermentar a lactose com

produção de gases. Também a ação sinérgica de 2 espécies diferentes de bactérias pode

resultar no aparecimento de gases. Nesta hipótese, uma das espécies seria capaz de

hidrolizar a lactose liberando glicose e galactose; a glicose é um açúcar facilmente

fermentável, sendo atacada pela 2ª espécie. O ensaio confirmativo tem assim por finalidade

afastar essas duas possibilidades.

Meios de Cultura Utilizados:

Os meios de cultura empregados inibem as bactérias Gram-positivas, permitindo o

desenvolvimento das Gram-negativas. Podem ser usados os meios líquidos como o caldo

Lactosado adicionado de verde-brilhante ou de fucsina ou de cristal violeta, adicionado de

bile a 2% ou ainda meios sólidos igualmente adicionados de substâncias inibidoras. Esta

etapa reduz a possibilidade de ocorrência de falsos-positivos, decorrentes da atividade

metabólica de bactérias esporulantes Gram-positivas fermentadoras da lactose.

Ensaio Confirmativo para coliformes totais

De cada um dos tubos positivos usados no ensaio presuntivo transferir com alça estéril,

após agitação, uma gota para um tubo com caldo verde brilhante lactose bile, igualmente

dotado de tubinhos de Durham. Assim serão usadas tantos tubos de caldo verde brilhante

bile quantos forem os tubos positivos no ensaio presuntivo.

Incubar todos os tubos por 483 horas a 35ºC .

Proceder a leitura, considerando como teste confirmativo positivos para coliformes totais

todos os tubos que apresentarem formação de gás nos tubinhos de Durham

Anotar os resultados obtidos e calcular, recorrendo-se à tabela de HOSKINS, o número

mais provável de coliformes existentes em 100 ml da amostra.

15

ENSAIO CONFIRMATIVO EM MEIO SÓLIDO

Pode-se partir de um tubo ou mais fermentados do ensaio presuntivo ou de dos tubos

positivos usado no ensaio confirmativo em meio líquido. Neste ensaio pode ser utilizado os

meios de EMB (eosina azul de metileno), ENDO, Mac Conkey entre outros.

Técnica:

Com uma alça de platina espalhar uma gota do líquido (do tubo positivo) na

superfície do meio solidificado pela técnica de esgotamento na placa.(ver figura - 3).

Figura 3- Técnica de espalhamento de uma gota

de líquido na superfície de meio sólido

Incuba-se a placa em estufa a 35ºC durante 48 horas. Observa-se, para determinar se

houve ou não crescimento de colônias; o não crescimento indica que o ensaio confirmativo é

negativo, ou seja, não há presença de germes coliformes. Esta possibilidade refere-se ao uso

direto de um tubo de caldo lactosado do ensaio presuntivo para inocular a placa de meio

confirmativo.

Quando, no entanto, partindo-se de um tubo fermentado do ensaio confirmativo ou

de um tubo positivo do ensaio presuntivo aparecem colônias, estas devem ser escolhidas e

transferidas cada uma para dois tubos, um contendo meio de AN (agar-nutritivo) e outro

caldo lactosado. A escolha das colônias baseia-se no conhecimento prático do operador, que

determinará a colônia típica do grupo coliforme a ser transferida. Algumas características

dessas colônias podem ser observadas na tabela 2.

16

12

3

Tabela. 2 - Diferenciação entre a E.coli e o E. aerogenes em placas de EMB

Colônias E. coli E. aerogenes

Tamanho Colônias bem isoladas, com 2 a 3 mm

de diâmetro.

Colônias bem isoladas, porém

maiores do que as da E. coli;

4 a 6 mm de diâmetro ou mais.

Aglutinação As colônias vizinhas mostram pouca

tendência para a aglomeração

As colônias vizinhas se aglomeram

facilmente

Altura As colônias apresentam pouca altura,

têm a superfície plana ou levemente

côncava; raramente são convexas

As colônias são consideravelmente

elevadas e acentuadamente

convexas; ocasionalmente,

aparecem depressões no centro das

colônias.

Aspecto à luz transmitida Os centros são escuros, quase negros, e

se estendem por mais de ¾ do diâmetro

da colônia; é difícil distinguir a

estrutura interna da parte escura central.

Os centros são de cor marrom, mas

não tão escuros como os da E. coli e

menores em relação ao resto da

colônia. A estrutura interna, nas

colônias novas, é habitualmente,

estriada.

Aspecto à luz refletida Colônias escuras, em forma de botão.

Regra geral: semelhantes a anéis

concêntricos com brilho metálico

esverdeado.

Mais claras do que as do E. coli.

Não se observa brilho metálico,

exceto, ocasionalmente, nas

depressões do centro das colônias,

quando elas existem.

Os tubos de AN e caldo lactosado inoculados a partir de colônias típicas ou em falta

destas, de uma colônia rósea, clara, atípica, serão incubados a 35ºC durante 24 / 48 horas. Se

após 48 h não houver fermentação no tubo com caldo lactosado, este ensaio confirmativo

será negativo.

Caso haja formação de gás, faz-se uma coloração de Gram, partindo-se da cultura em

AN. Tratando-se de bastonetes Gram negativo, não esporulantes, o ensaio confirmativo é

positivo.

17

3º Etapa:

ENSAIO DIFERENCIAL PARA COLIFORMES FECAIS

Geralmente os testes referidos são suficientes para determinar a espécie de coliforme

presente. Entretanto, muitas vezes deseja-se separar os componentes de origem fecal dos

provenientes de outras fontes. Estas determinações de coliformes fecais são aplicáveis às

estimativas do grau de poluição das águas brutas submetidas a processo de depuração, ou a

estudos de poluição dos cursos de água, ou ainda à interpretação de dados sobre coliformes

totais cuja significação seja duvidosa.

Técnica:

Este ensaio é realizado a partir dos tubos positivos do ensaio presuntivo.

De cada tubo positivo, inocula-se um tubo com meio EC dotado de tubo Durham.

Incubando-se em seguida em banho-maria a 44,5º 0,5ºC durante 24 2 horas.

A produção de gás dentro de 24 horas é considerada positiva para a presença de

coliformes fecais e sua densidade numérica é calculada pela tabela do NMP.

Quando o ensaio confirmativo for efetuado paralelamente ao teste diferencial para

coliformes fecais, considerar a dupla confirmação (caldo lactosado-verde brilhante-bile e

Meio EC) como teste completo positivo

Se a finalidade for o exame completo, prosseguir a partir dos tubos com caldo lactosado-

verde brilhante-bile com resultado positivo no ensaio confirmativo

4º Etapa:

ENSAIO COMPLETO OU DIFERENCIAL (opcional)

Partindo-se da cultura de coliforme em Agar-nutritivo (AN) obtida a partir do ensaio em

meio confirmativo sólido (EMB), inocula-se:

a) um tubo de caldo-peptona ou caldo-triptona, para o teste de Indol.

Caso se use peptona dá-se preferência a de caseína ou faz-se teste, usando-se uma

cultura conhecida de E. coli, para verificar a presença de triptofano na peptona utilizada (Se

a bactéria Escherichia coli típica não produzir Indol, a peptona não deve ser usada).18

b) Um tubo com caldo glicosado-fosfatado (meio de Clark Lubs), para os testes de

vermelho de metila e de Acetilmetilcarbinol ou de Voges-Proskauer.

c) Um tubo com meio citrato (o citrato de Koser) para a prova de utilização de citrato.

Pode-se também usar um meio de citrato sólido ( o meio de citrato de Simmons)

Esses testes são conhecidos pela sigla da língua inglesa I.M.Vi.C. (Indol, Methyl red,

Voges-Proskauer, Citrate). Após o semeio, os tubos serão incubados a 35ºC por tempos

variáveis.

Teste de Indol: Após incubação durante 18 a 24 horas, juntar à cultura crescida 0,2 a

0,3 ml do reagente de Kovac’s.

Aparecimento de anel sobrenadante vermelho intenso indica a presença de Indol,

teste positivo.

Se a cor do reagente permanecer inalterada: teste negativo.

Teste de Voges-Proskauer: Após incubação por 48 horas, retira-se com pipeta estéril

1ml da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6 ml de solução de -

naftol e 0,2 ml de KOH a 40%. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa

a 35ºC. Observa-se a partir de 15 minutos até o máximo de 4 horas:

Aparecimento de coloração cereja que se estende da superfície para o fundo do

tubo indica teste VP positivo.

O aparecimento de coloração acobreada ou mesmo de coloração vermelha após 4

horas de observação indica teste VP negativo.

Teste de vermelho de metila: a cultura inoculada em meio de caldo glicosado-fosfatado

deve permanecer incubada por 4 a 5 dias a 35ºC. No fim desse período, junta-se

algumas gotas do indicador vermelho de metila:

Cor vermelha: teste positivo

Cor amarela: teste negativo.

Teste de citrato: a amostra de coliforme é inoculada no meio de citrato de Koser, de

preferência com a alça em forma de agulha, levando-se o mínimo possível de material.

Incuba-se o tubo em estufa a 35ºC por 72 / 96 horas.

Teste positivo: crescimento visível (o meio fica turvo);

Teste negativo: ausência de crescimento (o meio permanece límpido)

19

Quando realizado em meio de Simmons uma virada de indicador azul de

bromotimol, de verde para azul indica: citrato positivo. A tabela-3 apresenta o teste IMViC

para alguns microrganismos presentes na flora intestinal. Como exemplo, escolheu-se duas

colônias que após terem sido submetidas aos ensaios bioquímicos (IMViC) apresentou os

resultados a seguir:

Tubo 1: + + - -

Tubo 2: - - + +

Consultando-se a tabela 3, pode-se concluir que no tubo 1 foi encontrado a bactéria

Escherichia coli variedade 1 e no tubo 2, Enterobacter aerogenes.

Tabela 3.0 – Interpretação das reações IMViC

Microorganismos IndolVermelhodeMetila

VogesProskauer

Citrato

Escherichia coli

Variedade I

Variedade II

+

+

+

Citrobacter freundii

(intermédiarios)

Variedade I

Variedade II

+

+

+

+

Enterobacter aerogenes

Variedade I

Variedade II

+

Na figura 4 são apresentadas, de forma esquemática, todas as etapas necessárias a

pesquisa de coliforme em uma amostra de água. Dependendo da finalidade ou da suspeita

sobre a qualidade da água, outros microrganismos devem ser pesquisados, tais como:

Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus, clostridium, Vibrio cholerae, vírus,

cianobactérias, entre outros.

20

Figura 4 - Todas as etapas necessárias à pesquisa de coliforme em uma amostra de água

21

PRESENÇA DE GÁSColiformes presentes

AUSÊNCIA DE GÁSProva negativa

Coliformes ausentes

ENSAIO CONFIRMATIVOCaldo verde brilhante lactose bile

35ºC - 24/48 2h

MEIO DE EC44,5 0,5ºC -24 2h

AUSÊNCIA DE GÁSProva negativa

coliformes ausentes

PRESENÇA DE GÁS Prova positiva

PRESENÇA DE GÁS Prova positiva

Coliformes fecais presentes

MEIO CONFIRMATIVO SÓLIDOMeio EMB, ENDO.35º 0,5ºC / 24 2h

ENSAIO PRESUNTIVOCaldo lactosado – 24/48 2h / 35ºC

AMOSTRAVolumes Decimais Adequados

CALDO LACTOSADO24/48 2h 35º 0,5ºC

Ensaio completoou diferencial

AGAR NUTRITIVO24/48 2h 35º 0,5ºC

Colônias típicas de coliformes

Ausência de Colônias.Coliformes ausentes

Colônias atípicas

Teste de GramAUSÊNCIA DE GÁSColiformes ausentes

5. PESQUISA DA BACTÉRIA Pseudomonas aeruginosa

Como já foi comentado anteriormente, a legislação em vigor considera a bactéria

Escherichia coli , os coliformes fecais e a contagem de heterotróficas como indicadores de

contaminação fecal. No entanto, a ausência desses indicadores não determina a sanidade da

água analisada, uma vez que bactérias como Pseudomonas aeruginosa podem interferir na

detecção desses microrganismos. Embora não haja microrganismos com características de

indicador universal, vários autores advogam a necessidade da adição às análises rotineiras, a

pesquisa da bactéria Pseudomonas aeruginosa como indicador de contaminação hídrica.

O gênero Pseudomonas é amplamente distribuído na natureza, sendo comum em

ambientes hospitalares. Compõem-se de várias espécies, destacando-se a espécie

Pseudomonas aeruginosa, por ser saprófita em seres humanos, provocando doenças

naqueles cujas defesas estejam alteradas. São bacilos Gram-negativos, móveis, aeróbios

estritos, não apresentam grandes exigências nutricionais, crescem a 40º 5ºC e toleram pH

altos. Algumas linhagens produzem pigmentos fluorescentes e toxinas como a exotoxina A,

que é responsável por necrose de tecidos e pode ser letal quando injetada na forma

purificada.

ENSAIOS PARA DETERMINAÇÃO DA BACTÉRIA Pseudomonas aeruginosa

Utiliza-se a técnica de tubos múltiplos (5tubos), onde as amostras são inicialmente

inoculadas em caldo-asparagina (3 alçadas consecutivas) e, confirmadas em caldo-

acetamida, incubadas a 35o C por 24-48h. Os resultados são expressos em NMP (número

mais provável de P. aeruginosa em 100mL da amostra). Para isolar culturas dessa bactéria

ou impedir a possibilidade de ocorrência de resultados falsos-positivos, inóculos oriundos

dos tubos positivos em caldo acetamida são inoculados em meio de agar- leite a 35ºC por

48h .

22

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• ATLAS, R.. M., 1989, Microbiology - Fundamentals and Applications. 2 ed.

New York, Macmillan Publishing Company.

• BROCK,T.D. & MADIGAN, M.T., 1991, Biology of Microorganisms. 6th ed., London,

Prentice-Hall International.

• CETESB, São Paulo. Apostila Microbiologia Ambiental, 2000

• GUILHERME, E. F. M. & SILVA, J. A M., 2000, “Pseudomonas aeruginosa, como

indicador de contaminação hídrica”, Higiene Alimentar, 11(76).

• JAWETZ, E.; MELNICK, J.L.; ADELBERG, E. A.; BROOKS, G. F.; BUTEL, J. S.;

ORNSTON, L. N., 1991, Microbiologia Médica. 18a ed., Rio de Janeiro, Guanabara

Koogan.

• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e

Aplicações. 2 ed., v. 1., Rio de Janeiro. Makron Books do Brasil.

• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e

Aplicações. 2 ed., v. 2, Rio de Janeiro, Makron Books do Brasil.

• MACEDO, J. A B., 2001, Águas & Águas. 1ª ed., São Paulo, Varela.

• SANCHEZ, P.S.. Apostila Atualização em Técnicas para o Controle Microbiológico

de águas minerais. 1999. São Paulo. ABINAM / Universidade Presbiteriana Mackenzie

• BRASIL, Leis , decretos, etc.... Resolução CONAMA nº 274 de 29 de novembro de

2000.

• BRASIL, Leis , decretos, etc.... Portaria nº 1469 de 29 de dezembro de 2000, Normas de

qualidade da água para consumo humano. Diário Oficial (Republica Federativa do

Brasil, 19 de fevereiro de 2001).

23

*Referência: Standard Methods 20ª Edição, 1998

24

ANEXO 1ÍNDICE DE NMP E LIMITES DE CONFIANÇA DE 95%, QUANDO SÃO UTILIZADOS INÓCULOS DE 10ml, 1ml E 0,1ml EM SÉRIES DE 5 TUBOS*

10ml

0000111112222223333334444444444555555555555555555555555

111111221223353446675779

129

121215169

1020102030203040304060805070100120160100100200300600

10101311151518181720212425292429293535403845465563566567778086110140120150180170210250250300360410390480580690820940

1300200029005300

Limites de confiança de 95%

Inferior superior

Número de tubos com reação positiva, em séries de 5tubos, inóculos de:

Índice de NNP por 100ml da amostra

22242446647799

12811111414171317172126222627333423304030506050709080110140170130170220280350240300500900

16001600

0012001120011230011220011122334000111222333344444555555

0,1ml

0100010100101000101010101201010012012012012301234012345

1 ml

ANEXO 2

Meios de cultura utilizados na Análise Bacteriológica de Água

Estes meios podem ser encontrados sob forma desidratada de fabricantes como Difco,

Sigma, Merk, Oxoid, entre outros.

1- Caldo lactosado

Extrato de carne - 3,0 g

Peptona - 5,0 g

Lactose - 5,0 g

Água destilada - 1 1

PH 6,8-7,0. Autoclava-se a 120ºC, 15 min. Caso

se deseje o caldo lactosado de concentração dupla,

usa-se a metade da água destilada.

3-Glicose-agar GA

Extrato de carne - 3,0 g

Peptona - 5,0 g

Glicose -10,0 g

Agar (em pó) -10,0 g

Água destilada -1 1

PH 6,8-7,0. Autoclava-se a 120ºC, 20 min

2-Caldo de verde brilhante – lactose - bile

Peptona - 10,0 g

Lactose - 10,0 g

Bile de boi - 20,0 g

Verde brilhante - 0,0133 g


PH 7,2.

Autoclava-se a 115ºC, 15 min. Para adicionar o

verde brilhante pode-se preparar uma solução a

0,1% em água destilada e dela juntar 13,3 ml ao

meio de cultura

4- Endo - agar

Peptona - 10,0 g

Lactose - 10,0 g

K2HPO4 - 3,5 g

Sulfito de Sódio - 2,5 g

Fucsina básica - 0,5 g

Agar (em pó) -10,0 g


PH 7,4. Esterilizar 115ºC, 15 min.

7- Caldo glicose-fosfato

Peptona - 5,0 g

Glicose - 5,0 g

K2HPO4 - 5,0 g


Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaio e

autoclavar a 120ºCpor 15 min.

8 - Citrato de Kozer

Citrato de sódio - 3,0 g

K2HPO4 - 1,0 g

MgSO4.7H2O - 0,2 g

NaNH4HPO4.4H2O - 1,5 g


Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaios e

autoclavar a 120ºC por 15 min.

25

9- Eosina-azul de metileno-agar EMB

Peptona - 10,0 g

Lactose - 5,0 g

Sacarose - 5,0 g

HK2PO4 - 2,0g

Agar -10,0 g

Coloca-se em balões de 100 ml ou 200 ml exatos.

Esterilizar a 120ºC, 30 min.

Quando for distribuir em placas, para uso, fundir o

meio, esfriar a 45ºC e juntar para cada 100 ml, 1

ml de solução aquosa estéril de Eosina a 4 g/100

ml e 1 ml de solução aquosa estéril de azul-de

metileno (0,65 g/100 ml.)

10- Citrato de Simmons

Citrato de sódio - 2,0 g

MgSO4.7H2O - 0,2 g

NH4H2PO4 - 1,0 g

NaCl - 5,0 g

Azul de bromotimol -0,08 g

Agar (em pó) - 10 g


Fundir, colocar em tubos de ensaio e autoclavar a

120ºC por 15 min.

11- Meio EC

Triptose ou tripticase – 20,0 g

Lactose - 5,0 g

Mistura de sais biliares ou

Sais biliares n.º 3 -1,5 g

K2HPO4 -4,0 g

KH2PO4 -1,5 g

NaCl - 5,0 g


pH 6,9

Colocar em tubos de fermentação e autoclavar a

115ºC por 15 min.

12- Preparação da água tamponada para diluições

Prepara-se uma solução “stock” dissolvendo 34,0

g de KH2PO4 em 500 ml de água destilada,

ajusta-se, com NaOH 1N, o pH a 7,2 e completa-

se o litro com água destilada.

Para preparar a água tamponada de diluição,

junta-se 1,25 ml da solução “stock” a 1 l de água

destilada. Distribui-se em frascos ou tubos

convenientemente e autoclava-se a 120ºC por 15

min.

26

Soluções corantes e reagentes

Cristal violeta ou violeta de genciana

Solução A : Cristal violeta (90% corante) - 2,0 g

Álcool etílico (95%) - 20 ml

Solução B: Oxalato de amônio - 0,8 g

Água destilada - 80 ml

Juntar as soluções A e B

Lugol

Iodo - 1 g

Iodeto de potássio - 2 g


Misturar num almofariz o iodo e o iodeto de potássio,

depois juntar a água.

Reagente indicador de vermelho de metila

Vermelho de metila - 0,1 g

Álcool absoluto - 300 ml


Reagente de Kovac’s

Para-dimetil amino benzaldeido - 5,0 g

Álcool amílico ou butílico - 75 ml

HCl concentrado - 25 ml

Reagente para a prova de Voges-Proskauer

(Método de Barrit)

Solução A: naftol - 5,0 g

Álcool absoluto - 100 ml

Solução B: KOH - 40,0 g

Água destilada - para completar 100 ml

Safranina

Safranina - 0,25 g

Álcool etílico (95%) - 10 ml


Portaria MS 518 , de 25 de março de 2004, que aprova a norma de qualidade da água para consumo humano. Publicada no Diário Oficial de 26 de março de 2004 - Revoga a Portaria 1469 GM/MS de 29/12/2000.

27

ANÀLISE BACTERIOLÒGICA

CERTIFICADO N.º - 3333/2002 AMOSTRA: 03TIPO DE AMOSTRAGEM: Água de poço (não clorada)OBSERVAÇÃO: Saída do poçoLOCAL DA AMOSTRAGEM: Escola de QuímicaTEMPO DE PERFURAÇÃO: 16 anosPROFUNDIDADE DO POÇO: 17 metrosDATA DA COLETA: 28/01/2004 HORA DA COLETA: 15:00 hSOLICITADA POR: Rachel PerezENDEREÇO: Rua da Esperança no 301, Solicitude RESPOSÁVEL PELA COLETA: O solicitante

RESULTADOS:

1. PESQUISA DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME

Coliformes totais em 100 ml da amostra:

Coliformes fecais em 100 ml da amostra:

CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS EM PLACAS:

2. PESQUISA DE Pseudomonas aeruginosa:

CONCLUSÃO:

Recife, 06 de fevereiro de 2004.

______________________________André Armando Perez y Palha

Engenheiro QuímicoCRQ 17.379375 – 1ª Região

28

MINISTÉRIO DA SAÚDE

GABINETE DO MINISTRO(*)

PORTARIA Nº 518, DE 25 de MARÇO DE 2004

Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências.

0 Ministro de Estado da Saúde, INTERINO, no uso das atribuições e

considerando o disposto no Artigo 2º do Decreto nº 79.367, de 9 de março de 1977, resolve:

Art. 1º Aprovar a Norma de Qualidade da Água para Consumo Humano, na forma do Anexo desta Portaria, de uso obrigatório em todo território nacional.

Art 2º Fica estabelecido o prazo máximo de 12 meses, contados a partir da publicação desta Portaria, para que as instituições ou órgãos aos quais esta Norma se aplica, promovam as adequações necessárias a seu cumprimento no que se refere ao tratamento por filtração de água para consumo humano suprida por manancial superficial e distribuída por meio de canalização e da obrigação do monitoramento de cianobactérias e cianotoxínas.

Art. 3º É de responsabilidade da União, dos Estados, do Distrito Federal e dos Municípios a adoção das medidas necessárias para o fiel cumprimento desta Portaria.

Art. 4º 0 Ministério da Saúde promoverá, por intermédio da Secretaria de Vigilância em Saúde - SVS, a revisão da Norma de Qualidade da Água para Consumo Humano estabelecida nesta Portaria, no prazo de 5 anos ou a qualquer tempo, mediante solicitação devidamente justificada de órgãos governamentais ou não governamentais de reconhecida capacidade técnica nos setores objeto desta regulamentação.

Art. 5º Fica delegada competência ao Secretário de Vigilância em Saúde para editar, quando necessário, normas regulamentadoras desta Portaria.

Art. 6º Esta Portaria entra em vigor na data de sua publicação. Art. 7º Fica revogada a Portaria nº 1469, de 29 de dezembro de

2000, publicada no DOU nº 1 – E de janeiro de 2001, Seção 1, página nº 19.

GASTÃO WAGNER DE SOUSA CAMPOS

29

apostila de água 2004

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