Centro de Ciências e Tecnologia Cursos de Engenharia Ambiental e Química

Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki

Recife 2011

ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA

Prof. Dr. Carlos Alberto Alves da Silva Profa. Dra. Galba Maria de Campos Takaki

OBJETIVO: • Analisar bacteriologicamente de uma amostra de água utilizando a técnica dos tubos múltiplos de fermentação.

INTRODUÇÃO: Uma água destinada ao consumo humano deverá ser isenta de microrganismos considerados patogênicos e de substâncias químicas prejudiciais ao organismo humano. A água pode se apresentar sob a forma perfeitamente límpida em sua aparência, livre de sabores e odores peculiares, e no entanto, se apresentar contaminada microbiologicamente. A qualidade da água só pode ser avaliada por meio de testes laboratoriais, químicos e bacteriológicos. A análise química pode indicar a poluição de componentes químicos, porém não consegue detectar pequenos graus de contaminação. Sendo, portanto, a pureza bacteriológica que condiciona a potabilidade de uma água. Devido a grande dificuldade de se ter resultados satisfatórios através das pesquisas de bactérias patogênicas, a análise bacteriológica é feita através da investigação de certas espécies bacterianas indicadoras de poluição: a Escherichia coli e organismos com ela relacionados, sendo denominados de coliformes, os estreptococos fecais (Streptococcus faecalis) e o Clostridium perfringens. Estas bactérias fazem parte da flora normal existente no intestino grosso do homem e dos animais, estando presentes na matéria fecal. Assim a presença de qualquer uma dessas espécies bacterianas na água, evidencia sinais de poluição fecal de origem humana ou animal na água analisada. Se tais microrganismos estão presentes numa amostra de água, para os agentes patogênicos, encontrados igualmente, nas fezes.

Os coliformes como indicadores de poluição têm sido escolhidos mundialmente porque apresentam as seguintes vantagens: • têm presença constante no intestino humano, em número muito

elevado. • cerca de bilhões destes germes são eliminados por uma pessoa

no espaço de 24 horas; • são mais resistentes fora do habitat natural que as espécies

enteropatogênicas; • são mais facilmente identificados em meios simples de

laboratório. No laboratório para se analisar bacteriologicamente uma água pode-se utilizar o método da membrana filtrante ou o método dos tubos múltiplos de fermentação. Nossa prática se deterá na utilização deste último. O método de fermentação em tubos múltiplos determina a presença e o número aproximado de coliformes, através da inoculação de uma série de porções da amostra de água em tubos com meios de cultura adequados para comprovar a presença de organismos coliformes. O exame compreende três ensaios sucessivos: (1) o ensaio presuntivo, (2) o ensaio de confirmação (3) o ensaio completo ou diferencial.

Meios de Cultura Caldo Lactosado Duplo Extrato de carne ................... 6 g/L Peptona ............................... 10 g/L Lactose ................................ 10 g/L pH = 6,9 – 7,0 Caldo Lactosado Simples Extrato de carne ................... 3 g/L Peptona ............................... 5 g/L Lactose ................................ 5 g/L pH = 6,9 – 7,0 Caldo Verde Brilhante Peptona .............................. 10 g/L Lactose ............................... 10 g/L Bile de boi desidratada .......... 20 g/L Verde brilhante .................... 0,0133 g/L pH = 7,2 – 7,4 * Pesar 40 g do meio desidratado “Brilliant Green Bile Broth” a 2% e acrescentar 1000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente até a completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Distribuir em volumes de 10 mL em tubos de ensaio de 16 mm X 150 mm, tendo no seu interior tubos de Durham invertidos. Tamponar e esterelizar em autoclave a 121 oC, durante 15 minutos.

Meio E.C (Escherichia coli) Triptose ............................. 20 g/L Lactose .............................. 5,0 g/L Sais biliares ....................... 1,5 g/L Fosfato dipotássico ............. 4,0 g/L Fosfato monopotássico ........ 1,5 g/L Cloreto de sódio ................... 5,0 g/L pH = 6,9 – 7,0 * Pesar 40 g do meio desidratado “E.C. Médium” e acrescentar 1000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente até a completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Distribuir em volumes de 5 mL em tubos de ensaio de 12 mm X 120 mm, tendo no seu interior tubos de Durham invertidos. Tamponar e esterelizar em autoclave a 121 oC, durante 15 minutos. Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB) Peptona ................................... 10 g/L Lactose .................................... 10 g/L Fosfato dipotássico .................... 2 g/L Eosina ...................................... 0,4 g/L Azul de metileno ........................ 0.065 g/L Agar .......................................... 20 g/L * Pesar 37,5 g do meio desidratado “E.M.B. Agar” e acrescentar 1000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando freqüentemente até a completa dissolução do meio, tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. Tamponar e esterelizar em autoclave a 121 oC, durante 15 minutos.

ENSAIO PRESUNTIVO 1a ETAPA - Inoculação para o Ensaio Presuntivo e Contagem Padrão em Placas a. Inoculação nos tubos Com uma pipeta de 10ml estéril, inocular 10ml da amostra de água em cada um dos 5 tubos de caldo lactosado duplo (CD). Com uma outra pipeta de 1ml estéril, inocular 1ml da amostra de cada 5 tubos com caldo lactosado simples (CS1). Transferir com pipeta estéril, 1 mL da amostra para um tubo de diluição com 9ml de água estéril ou água tamponada estéril; agitar bem. Inocular 1mL em cada um dos 5 tubos de caldo lactosado simples (CS2) restantes. Agitar cuidadosamente os tubos e incubá-los a 35oC, durante 24/48 horas. b. Contagem Padrão de Colônias em Placas Transferir com pipeta estéril, 1 mL da suspensão para um dos tubos de água estéril ou água tamponada estéril; agitar bem e deste tubo retirar 1mL e transferir para outro tubo com água e assim sucessivamente sendo realizada uma série de diluições 10-2, 10-3, 10-4.

De cada tubo transferir para duas placas estéreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 mL de meio de Glicose-agar fundido e resfriado a 45oC. Agitar cuidadosamente, esperar solidificar e incubá-las em aerobiose a 35oC, durante 24/48 horas. Observe o esquema 1 de operações que conjuga o ensaio presuntivo e a contagem em placas simultaneamente.

FIGURA 1. Esquema de Inoculação do Ensaio Presuntivo e Contagem Padrão em Placas

2a ETAPA - Resultado do Ensaio Presuntivo e da Contagem Padrão em Placas e Inoculação para o Ensaio Confirmativo a) Resultado do Ensaio Presuntivo Após 24 horas de incubação, se houver formação de gás em qualquer quantidade, em qualquer tubo, o ensaio presuntivo é positivo. Se não houver gás incubar por mais 24 horas na mesma temperatura. Após 48 horas de incubação se não houver gás em qualquer tubo, o ensaio é negativo e a análise está encerrada quanto a coliformes. Caso seja observada a formação de gás, o ensaio presuntivo é considerado positivo. b) Resultado da Contagem Padrão em Placas Examinar as placas e escolher para contagem as que tenham entre 30 e 300 colônias (evidentemente se a placa inoculada com 1 mL da amostra não diluída tiver um número inferior a 30 colônias, esse número é registrado). Pode-se usar para auxiliar na contagem um aparelho especial munido de lupa, o Contador de colônias tipo Quebec. Se as placas forem originadas de qualquer diluição não se esquecer que o resultado será: a média do número de colônias multiplicada pela diluição. c) Inoculação para o Ensaio Confirmativo c.1) Ensaio Confirmativo para Coliformes Totais De cada um dos tubos positivos usados do ensaio presuntivo transferir com alça estéril, após agitação, uma gota para um tubo com caldo verde brilhante lactose bile (VBLB), igualmente dotado de tubinhos de Durham. Assim serão usados tantos tubos de caldo verde brilhante quantos forem os tubos positivos do ensaio presuntivo. Incubar a 35oC durante 24-48 horas. c.2) Ensaio Confirmativo para Coliformes Fecais De cada um dos tubos positivos usados do ensaio presuntivo transferir com alça estéril, após agitação, uma gota para um tubo

com caldo E.C., igualmente contendo de tubinhos de Durham. Assim serão usados tantos tubos de caldo E.C. quantos forem os tubos positivos do ensaio presuntivo. Incubar a 44,5oC em banho-maria durante 24 horas. Os tubos devem ser previamente aquecidos a 44,5oC e após inoculação colocados imediatamente no banho-maria. c.3) Ensaio Confirmativo em Meio Solidificado O ensaio confirmativo em meio solidificado deverá ser realizado mediante a inoculação do em placas de Petri com meios diferencial específicos para coliformes (Eosina Azul de Metileno - EMB; Endo, Mac Conkey ou outros). Incubar a 35oC durante 24-48 horas. Maiores detalhes sobre esta técnica estão no esquema apresentado na figura 2.

FIGURA 2- Esquema de Inoculação do Ensaio Confirmativo.

3a ETAPA - Resultados do Ensaio Confirmativo a) Resultado do Ensaio em Meio Líquido de Verde-Brilhante Após incubação durante 24-48 horas os tubos que apresentarem bolha de gás são aqueles em que ficou confirmada a presença de coliformes. Devem ser anotados todos os tubos positivos e recorrendo-se em seguida à tabela estatística de Hoskins que indica, o número mais provável de coliformes existentes em 100mL da amostra. Este número constitui o NMP de coliformes totais. b) Resultado do Ensaio em Meio Líquido de E.C. Após incubação durante 24 horas os tubos de E.C. que apresentarem bolha de gás são aqueles em que ficou confirmada a presença de coliformes fecais. Devem ser anotados todos os tubos positivos e recorrendo-se em seguida à tabela estatística de Hoskins que indica, o número mais provável de coliformes existentes em 100mL da amostra. Este número constitui o NMP de coliformes fecais. c) Ensaio em Meio Sólido Observar as placas para determinar se houve ou não crescimento de colônias típicas de coliformes. O resultado do exame deverá ser analisado da seguinte maneira: • O não crescimento de colônias típicas indica que o ensaio

confirmativo é negativo; • O crescimento de colônias típicas de coliformes indica que o teste

para coliformes é positivo. Se o ensaio confirmativo for positivo as colônias típicas escolhidas devem ser transferidas cada uma para dois tubos, um contendo meio de Agar-nutritivo (AN) e outro de caldo lactosado simples ou caldo lactosado duplo. 4a ETAPA: Inoculação para o Ensaio Completo ou Diferencial (IMViC) O ensaio completo ou diferencial utiliza reações de caracterização que são provas bioquímicas que se realizam para a

identificação dos microrganismos dentro do grupo dos coliformes. Estes testes são conhecidos pela sigla IMViC. Técnica: Partindo-se da cultura de coliforme crescido em agar-nutritivo (AN) obtida a partir do ensaio anterior inocula-se: • Com uma alça em círculo, um tubo de caldo triptonado, para o

teste de Indol; • Com uma alça em círculo, dois tubos com caldo glicosado-

fosfatado (meio de Clark Lubs), um para o testes de Vermelho de Metila e outro para o teste de Voges Proskauer;

• Com uma alça em agulha, um tubo com meio líquido de citrato de Koser para prova de utilização de Citrato. Pode-se também usar um meio citratado solidificado, chamado de meio Citrato de Simons.

Após o cultivo, todos os tubos são incubados a 35oC. Sendo o tempo específico para cada teste.

FIGURA 3. Esquema de inoculação para o ensaio completo ou diferencial

5a ETAPA: Resultados do Ensaio Completo ou Diferencial 1) Teste do Indol: após incubação durante 18 a 24 horas, juntar à cultura crescida 0,2 a 0,3mL do reagente de Kovac’s. • O aparecimento de um anel sobrenadante vermelho intenso

indica a presença de indol • Se a cor do reagente permanece inalterada indica que o teste é

negativo. 2) Teste de Vermelho de Metila: após incubação da cultura em meio de caldo-glicosado-fosfatado por 4 a 5 dias, juntar 2 a 3 gotas do indicador vermelho de metila • Cor vermelha indica teste positivo • Cor amarela indica teste negativo 3) Teste de Voges Proskauer: após 48 horas de incubação, retira-se com pipeta estéril 1mL da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6ml de solução de α-naftol e 0,2 mL de KOH a 40 %. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa a 35oC. Observa-se a partir de 15 minutos até um máximo de 4 horas. • O aparecimente de uma uma coloração cereja que se estende da

superfície para o fundo do tubo indica um teste Voges Proskauer positivo.

• O aparecimento de uma coloração acobreada ou mesmo vermelha indica teste negativo.

4) Teste de citrato: após 72 a 96 horas de incubação em meio citratado, observa-se: • Crescimento visível (o meio fica turvo) - prova positiva • Ausência de crescimento (o meio permanece límpido) - prova

negativa Observação: Quando o teste é realizado em meio solidificado de Simons uma virada do indicador azul de bromotimol, de verde para azul indica: citrato positivo.

Com os resultados dos quatro testes anteriores pode-se determinar o gênero do coliforme isolado através da tabela 1, que fornece uma interpretação dos resultados das reações do IMViC.

TABELA 1: Interpretação das reações IMViC

Microrganismo Indol Vermelho

de Metila

Voges

Proskauer

Citrato

Eschericha coli

Variedade I

Variedade II

+

-

+

+

-

-

-

-

Citrobacter freundii

(Intermediário)

Variedade I

Variedade II

-

+

+

+

-

-

+

-

Enterobacter

aerogenes

Variedade I

Variedade II

-

+

-

-

+

+

+

+

OBSERVAÇÃO: a prática deverá ser encerrada mediante a apresentação de um relatório e um laudo bacteriológico da água analisada.

Expressão dos Resultados

A densidade de coliformes é expressa como NMP de coliformes / 100 mL.

O NMP de coliformes é obtido através de um quadro em que são dados os limites de confiança de 95%, para cada valor de NMP determinado.

Para expressão de resultados é necessária a composição de um código onde são utilizados apenas resultados positivos correspondentes a 3 séries consecutivas, sendo que o primeiro algarismo escolhido para compor o código será o de menor volume da amostra (> diluição) em que todos os tubos apresentem resultados positivos, desde que tenham sido inoculados diluições subsequentes para totalizar os 3 algarismos para o código.

Encontra-se o código no quadro e o NMP a ela correspondente, o valor final do NMP será obtido através da aplicação da fórmula. Valor do NMP correspondente ao código x 10 . Maior volume inoculado selecionado para compor o código

Tabela 1 -Quadro contendo os Códigos com o Valor do NMP, para Cálculo da Densidade de Bactérias de uma Amostra.

Número de tubos com reação positiva, a partir de 5 tubos de 10 mL

Índice de NMP

(100 mL)

Limites de Confiança de 95%

Inferior Superior

0 < 2,2 1 6,0

1 2,2 0,1 12,6

2 5,1 0,5 19,2

3 9,2 1,6 29,4

4 16,0 3,3 52,9

5 16,0 8,0 Infinito

Índice de NMP e limites de confiança de 95%, quando são inoculadas 5 porções de 10 mL da amostra.

Tabela 2 -Quadro contendo os Códigos com o Valor do NMP, para Cálculo da Densidade de Bactérias de uma Amostra.

Número de tubos com reação positiva, a partir de 10 tubos de 10 mL

Índice de NMP

(100 mL)

Limites de Confiança de 95%

Inferior Superior

0 < 1,1 0 3,0

1 1,1 0,03 5,9

2 2,2 0,26 8,1

3 3,6 0,69 10,6

4 5,1 1,3 13,4

5 6,9 2,1 16,8

6 9,2 3,1 21,1

7 12,0 4,3 27,1

8 16,1 5,9 36,8

9 23,0 8,1 59,5

10 >23,0 13,5 Infinito

Índice de NMP e limites de confiança de 95%, quando são inoculadas 10 porções de 10 mL da amostra.

Tabela 3 – Quadro contendo os Códigos com o Valor do NMP, para Cálculo da Densidade de Bactérias de uma Amostra.

Número de tubos com reação positiva quando são utilizados, em séries de 5 tubos, inóculos de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL

Índice de NMP

(100 mL)

Limites de Confiança de 95%

Inferior Superior

0 0 0 < 2 - -

0 0 1 2 < 1 10

0 1 0 2 < 1 10

0 2 0 4 < 1 13

1 0 0 2 < 1 11

1 0 1 4 1 15

1 1 0 4 1 15

1 1 1 6 2 18

1 2 0 6 2 18

2 0 0 4 1 17

2 0 1 7 2 20

2 1 0 7 2 21

2 1 1 9 3 24

2 2 0 9 3 25

2 3 0 12 5 29

3 0 0 8 3 24

3 0 1 11 4 29

3 1 0 11 4 25

3 1 1 14 6 35

3 2 0 14 6 35

3 2 1 17 7 40

4 0 0 13 5 38

4 0 1 17 7 45

4 1 0 17 7 46

4 1 1 21 9 55

4 1 2 26 12 63

4 2 0 22 9 56

4 2 1 26 12 65

4 3 0 27 12 67

4 3 1 33 15 77

4 4 0 34 16 80

5 0 0 23 9 86

5 0 1 30 10 110

5 0 2 40 20 140

5 1 0 30 10 120

5 1 2 60 30 180

5 2 0 50 20 170

5 2 1 70 30 210

5 2 2 90 40 250

5 3 0 80 30 250

5 3 1 110 40 300

5 3 2 140 60 360

5 3 3 170 80 410

5 4 0 1307 50 390

5 4 1 170 70 480

5 4 2 220 100 580

5 4 3 280 120 690

5 4 4 350 160 820

5 5 0 240 100 940

5 5 1 300 100 1300

5 5 2 500 200 2000

5 5 3 900 300 2900

5 5 4 1600 600 5300

5 5 5 ≥ 1600 - -

Índice de NMP e limites de confiança de 95%, quando são utilizados inóculos 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL da amostra

DESINFECÇÃO DE RESERVATÓRIO 1. Para executar esta limpeza, o reservatório deve ser esvaziado

completamente e retirado de seu interior todo material indesejável (folhas, pedras, areia etc...).

2. O reservatório deve ser lavado com água e as paredes

escovadas. O material resultante do escovamento deve ser retirado pela tubulação de descarga do reservatório ou manualmente quando não existir tal tubulação.

3. Ao executar esta limpeza deve-se fechar as tubulações de

entrada e saída de água do reservatório, para evitar o entupimento das mesmas com o material que está sendo removido. Deve-se utilizar na limpeza materiais novos (rodos, estopas, vassouras...).

PROCEDIMENTO PARA A DESINFECÇÃO Quantidade de desinfetante: Numa vasilha limpa, separe a quantidade do agente desinfetante a ser usado, levando em conta o volume do reservatório. a) Hipoclorito de Sódio - 500mL (½ litro) para cada 1.000 litros de

água (1m3). b) Hipoclorito de Cálcio (cal clorada) 200g para cada 1.000 litros de

água (1m3). Neste caso em que o agente desinfetante é sólido deve-se dissolvê-lo em uma quantidade de água para separar o material insolúvel.

MÉTODOS DE DESINFECÇÃO 1. Após concluída a limpeza, o reservatório deverá ser enchido com

água da rede de distribuição. 2. A seguir, lançar no reservatório a quantidade do desinfetante,

devendo ser feita uma agitação para homogeneizá-lo na água. 3. Espere no mínimo 4 horas para a desinfeção total do reservatório

e retire toda essa água armazenada. Essa água não deverá ser utilizada em nenhuma hipótese.

4. Após retirar toda solução desinfetante do reservatório, este deverá ser enxaguado com água limpa.

5. A partir daí seu(s) reservatório(s) estará (ão) em condições sanitárias de armazenar água.

Obs.: Recomenda-se antes de utilizar a água do reservatório, proceder exame bacteriológico. Caso seja encontrado a presença de Coliformes, repetir o processo de desinfecção até a obtenção de resultados considerados satisfatórios.

DEVE-SE PROCEDER A DESINFEÇÃO DO RESERVATÓRIO, SEMPRE QUE HOUVER OCORRÊNCIA DE QUALQUER POLUIÇÃO OU ANUALMENTE, PARA GARANTIR A PROTEÇÃO ADEQUADA SOB O PONTO DE VISTA SANITÁRIO.