UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS

ESCOLA DE VETERINRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINRIOS APLICADOS

TCNICAS PARA AVALIAO DA INTEGRIDADE E

FUNCIONALIDADE DO INTESTINO UTILIZADAS NA CINCIA

ANIMAL

Fernanda Vieira Castejon

Orientador: Prof. Dr. Jos Henrique Stringhini

GOINIA

2011

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FERNANDA VIEIRA CASTEJON

TCNICAS PARA AVALIAO DA INTEGRIDADE E

FUNCIONALIDADE DO INTESTINO UTILIZADAS NA CINCIA

ANIMAL

Seminrio apresentado junto disciplina

Seminrios Aplicados do Programa de Ps-

graduao em Cincia Animal da Escola de

Medicina Veterinria e Zootecnia da

Universidade Federal de Gois

Nvel: Mestrado

rea de concentrao:

Produo animal

Linha de pesquisa:

Metabolismo nutricional, alimentao e

forragicultura na produo animal

Orientador:

Prof. Dr. Jos Henrique Stringhini EVZ/UFG

Comit de orientao:

Prof. Dr. Edemilson Cardoso da Conceio FF/UFG

Prof. Dra. Elisabeth Gonzales EVZ/UFG

GOINIA

2011

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SUMRIO

1 INTRODUO ................................................................................................. 1

2 REVISO DA LITERATURA ............................................................................ 2

2.1 AVALIAO DA INTEGRIDADE INTESTINAL ............................................... 2

2.1.1 Avaliao da diferenciao e desenvolvimento ........................................... 2

2.1.2 Avaliao dos fatores endgenos que regulam o desenvolvimento e

crescimento intestinal ............................................................................................. 9

2.2 AVALIAO DA FUNCIONALIDADE ............................................................ 12

2.2.1 Avaliao dos parmetros fsico-qumicos ................................................ 12

2.2.2 Avaliao da permeabilidade intestinal ..................................................... 14

2.2.3 Avaliao das protenas da parede intestinal ............................................ 16

3 CONSIDERAES FINAIS ........................................................................... 19

REFERNCIAS .................................................................................................... 20

1 INTRODUO

Pesquisadores da cincia animal tm um objetivo comum, que o

de manter a integridade fsica, funcional e comportamental dos animais. Isso

obtido por meio de um conjunto de aes e fatores interdependentes que vo

desde o perodo anterior ao nascimento (melhoramento gentico e qualidade

das matrizes) nutrio e ambincia adequadas.

Na produo animal, para que se obtenha os melhores resultados

zootcnicos (menor mortalidade, melhor converso alimentar e menor tempo

de criao at o abate), o perfeito funcionamento intestinal necessrio. A

integridade fsica e funcional da parede intestinal dos animais um dos

principais fatores a serem considerado na produo, pois se deve associar

essa integridade intestinal a correta digesto dos alimentos e absoro dos

nutrientes.

Alm das funes de digesto e absoro, outra funo no menos

importante do epitlio intestinal, a de proteo. O epitlio intestinal possui a

capacidade de impedir que substncias indesejveis como microorganismos e

toxinas presentes no lmen intestinal atravessem a mucosa e atinjam tecidos e

rgos.

A integridade da mucosa intestinal mantida por dois fatores

principais. O primeiro deles a prpria camada contnua de clulas que

ntegras constituem uma forte barreira. O segundo a camada de muco

produzido pelas clulas caliciformes que recobre as clulas intestinais.

H necessidade que os estudos feitos por pesquisadores da rea de

produo animal elucidem os princpios bsicos morfolgicos e fisiolgicos dos

animais para que se possa obter, de fato, o controle completo de todos os

fatores envolvidos.

Existem algumas tcnicas desenvolvidas e que esto

constantemente sendo aprimoradas para avaliar o intestino e auxiliar na

compreenso de processos que ocorrem no mesmo.

Objetivou-se elucidar alguns fatores que afetam a integridade

intestinal, assim como especificar as metodologias mais utilizadas na cincia

animal para avaliaes dos mesmos.

2

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 AVALIAO DA INTEGRIDADE INTESTINAL

2.1.1 Avaliao da diferenciao e do desenvolvimento

As clulas que compem o epitlio intestinal so formadas nas

criptas atravs de divises mitticas de clulas totipotentes. Essas clulas

produzidas migram ao longo da membrana basal at o topo da vilosidade, e

durante esse processo amadurecem. J no topo da vilosidade, ocorre a

apoptose da clula que ento descartada no lmen intestinal (JEURISSEN et

al., 2002). O processo de extruso de clulas no pice dos vilos ocorre,

tambm, em decorrncia do atrito com o bolo alimentar, presena de toxinas e

microorganismos com potencial patognico (MAIORKA et al., 2002).

O processo de absoro de nutrientes totalmente dependente dos

mecanismos que ocorrem na mucosa intestinal. Desta forma, a integridade no

pode ser comprometida, pois influencia diretamente a produtividade dos

animais, devendo permanecer saudvel e funcional por toda a vida (SANTOS,

2010).

O desenvolvimento intestinal consiste basicamente da associao

entre a renovao celular e a perda de clulas. O equilbrio entre esses dois

processos denomina-se turnover celular.

O desenvolvimento e diferenciao intestinal podem ser avaliados

por diversas tcnicas, variando de algumas bastante especficas a outras que

devem ser realizadas em conjunto com outras tcnicas para que seja possvel

apresentar resultados confiveis.

Uma das tcnicas utilizadas a quantificao do cido ribonuclico

(RNA), cido desoxirribonuclico (DNA) e protenas totais. A dosagem de RNA

indicadora da capacidade de sntese protica, e a de DNA indicadora da

proliferao celular do epitlio (BAGALDO et al., 2006).

A quantidade de protena por clula verificada pela relao

protena/DNA. A concentrao de RNA e protenas pode aumentar, mesmo

mantendo constante o nmero de clulas. A esse estado denomina-se

hipertrofia da mucosa (MAIORKA et al., 2002).

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FURLAN (2008) afirmou que o mecanismo de secreo de enzimas

e transportadores de membrana depende de estmulos para ativar a transcrio

de genes, os quais pelo processo de traduo sintetizam as enzimas

envolvidas na digesto e absoro de nutrientes.

As concentraes de DNA, RNA e suas relaes com o contedo de

protena passam por uma variao natural durante o desenvolvimento do trato

gastrointestinal especficos para cada espcie.

De acordo com MAIORKA et al., (2002) o mtodo mais comumente

utilizado para essa avaliao a incorporao de 3H-timidina (istopo

radioativo) ao DNA e quantificados atravs de auto-radiografias ou

radioautografia. Porm, trabalhos que utilizam essa tcnica, em sua maioria,

no a utilizaram com a finalidade de quantificar DNA e RNA.

GARTNER & HIATT (2003) descrevem a tcnica de radioautografia,

e afirmam ser um mtodo til para localizao e o estudo de uma seqncia

temporal de eventos. WHEBY et al. (1963) utilizaram a tcnica de

radioautografias para verificar a absoro intestinal de ferro em ratos.

GERSHON et al., (1965) tambm utilizaram a tcnica, porm para avaliar a

sntese e liberao de serotonina pelo plexo mioentrico do intestino de ratos

(Figura 1).

FIGURA 1 - Radioautografias do plexo mioentrico do intestino de ratos. Seqncia temporal (A e B). O acmulo de gros prata que indica presena de serotonina titulveis em torno de clulas ganglionares(G). Fonte: GERSHON et al. (1965)

4

O elemento que se deseja estudar radiomarcado (etapa de

incorporao) e injetado no animal. Fragmentos do tecido em estudo so

colhidos em vrios intervalos de tempo. A lmina de vidro recoberta com uma

fina camada de emulso radiogrfica. Posteriormente, a lmina colocada em

uma caixa escura por alguns dias ou semanas, durante os quais partculas

emitidas pelo istopo radioativo atingem a emulso nos locais da clula em que

o istopo est localizado. A emulso revelada e fixada por tcnicas

fotogrficas e pequenos gros de prata fixam-se nas pores expostas da

emulso. O espcime ento lacrado com uma lamnula e observado em

microscpio ptico (GARTNER & HIATT, 2003). Provavelmente, o menor uso

dessa tcnica, atualmente, devido descoberta de novas tcnicas com maior

rapidez e facilidade de execuo, e que no necessitem de instalao

especfica para uso de material radioativo.

Os mtodos que utilizam o espectrofotmetro para quantificao de

DNA e RNA so os mais utilizados. BAGALDO et al. (2006) realizaram

experimento para comparar o desenvolvimento dos segmentos jejuno e leo do

intestino delgado de bezerros com o uso de indicadores de atividade celular

(DNA, RNA e protena) e pela expresso do gene do IGF-I (insuline like growth

factor) e de seu receptor. Para extrao do DNA um grama de tecido foi

homogeneizado em 19 mL de gua deionizada, e aps seguiu-se a

metodologia de LABARCA & PAIGEN (1980) que utilizaram o

espectrofotmetro calibrado para diferentes comprimentos de ondas. Para a

quantificao da protena total, retirou-se 1mL do homogenato, sendo feita a

determinao segundo o mtodo de LOWRY et al. (1951). A utilizao dessas

tcnicas possibilitou a concluso, pelos autores, de que as pores do intestino

delgado, jejuno e leo, apresentam diferenas temporais no seu

desenvolvimento.

BAGALDO et al. (2007) determinaram o DNA total do jejuno, leo e

fgado de bezerros para verificar a ao do IGF-I presente no colostro de vacas

tratadas com o hormnio somatrotopina recombinante bovina (rbST). A

determinao do DNA e RNA foi realizada pelas mesmas metodologias j

citadas. Atravs das respostas dos indicadores de atividade celular intestinal e

heptica, os autores sugeriram a importante participao do IGF- I na

maturao celular e no comportamento da primeira gerao de entercitos.

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Outra tcnica, utilizada para identificao do material gentico

celular, a reao em cadeia da polimerase (PCR). A tcnica bsica foi sendo

modificada para diferentes finalidades, fazendo com que hoje existam diversos

tipos de protocolos. O PCR em tempo real, por exemplo, pode quantificar a

expresso gnica. Em humanos, bastante utilizada na pesquisa de doenas e

cncer de intestino (DYDENSBORG et al., 2006). HOUGHTON & COCKERILL

(2006) publicaram uma reviso sobre a tcnica relatando tambm vrias

aplicaes da mesma, inclusive a possvel aplicao para avaliao intestinal.

LEHMANN & KREIPE (2001) fizeram algumas consideraes sobre

a tcnica de PCR em tempo real para a quantificao de DNA e RNA em

tecidos j fixados com formalina e embebidos em parafina, o que bem til

quando se faz anlises conjuntas de um mesmo material por diferentes

tcnicas.

A avaliao do intestino atravs de cortes histolgicos e mensurao

de parmetros morfomtricos , sem dvida, a tcnica mais utilizada nos

trabalhos feitos para avaliao intestinal, principalmente na cincia animal.

uma tcnica simples, barata e que oferece bons resultados para avaliao.

O desenvolvimento da mucosa intestinal avaliado por meio de

dados morfomtricos do tamanho e nmero de vilos, da profundidade das

criptas, da altura do epitlio, da altura e nmero de microvilos do entercito e

da integridade da mucosa ou perda de epitlio (STERZO, 2007).

Quando o intestino responde a algum agente com desequilbrio da

relao de extruso e proliferao, ocorre modificao na altura dos vilos. O

nmero e o tamanho dos vilos dependem do nmero de clulas que o

compem. Assim, quanto maior o nmero de clulas, maior o tamanho do vilo,

e por conseqncia, maior a rea de absoro de nutrientes. No geral, a

maior altura de vilos e relao vilo/cripta esto associadas com uma boa

diferenciao da mucosa intestinal (JEURISSEN et al., 2002). Criptas menos

profundas indicam melhor estado de sade intestinal (VIOLA & VIEIRA, 2007).

SCHEEMAN et al. (1982) sugeriram que vilos curtos (relativo a profundidade de

cripta) tem menos clulas absortivas e mais clulas secretrias.

Outro fator relevante para a absoro dos nutrientes na membrana

luminal a quantidade de microvilos existentes nos entercitos. Os microvilos

so modificaes do plasmalema apical das clulas epiteliais que recobrem as

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vilosidades intestinais (GARTNER & HIATI, 2003). O nmero de microvilos atua

como um amplificador de rea para a absoro dos nutrientes (MAIORKA et

al., 2002).

As metodologias utilizadas para confeco das lminas histolgicas

para visualizao em microscpio ptico j so consolidadas e variam entre si

de acordo com protocolos dos laboratrios nos quais feito o processamento

do material. Fragmentos do duodeno, jejuno e leo so coletados e

imediatamente lavados com soluo fisiolgica e fixados, na maioria dos

protocolos, em soluo de Bouin por 24 horas. Passam pelas etapas de

desidratao em lcool, diafanizao ou clareamento por xilol e incluso em

parafina. So feitos cortes com micrtomo que, posteriormente, so corados.

Quanto colorao, SILVA et al. (2010) em anlise dos efeitos da

infeco causada pelo Toxoplasma gondii sobre a parede do duodeno de

gatos, utilizaram em seu experimento diferentes corantes, sendo o Azan para

evidenciao de fibras colgenas, o Tricrmico-Mallory para deteco das

clulas de Paneth. J o cido Peridico de Schiff (PAS) indicado para

deteco de mucinas neutras e sialomucinas lbeis. O Alcian- Blue (AB) pH 2,5

para deteco de sialomucinas e sulfomucinas e Alcian-Blue (AB) pH 1,0 para

deteco das sulfomucinas. Um dos resultados encontrados por SILVA et al.

(2010), foi que na avaliao qualitativa, as fibras colgenas ocupavam uma

rea dos estratos da parede intestinal visivelmente maior, o que sugere que

estejam aumentadas no grupos infectados (Figura 2).

FIGURA 2 - Cortes transversais, corados com Azan, de 3 m da parede do duodeno de gatos. Evidncia de fibras colgenas envolvendo glndulas duodenais. Gatos hgidos (esquerda) e submetidos infeco pelo Toxoplasma gondii (direita). Fonte: Adaptado de SILVA et al. (2010).

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A colorao para a anlise morfomtrica feita com os corantes

hematoxilina e eosina (HE) que so de utilizao rotineira na avaliao

histolgica de tecidos. Pode-se, tambm, quantificar linfcitos intraepiteliais.

A hematoxilina cora preferencialmente os componentes cidos da

clula com tonalidade azulada. Como o DNA e o RNA, o ncleo e as regies do

citoplasma ricas em ribossomos coram-se em azul-escuro, estes componentes

so ditos basfilos. A eosina um cido que cora os componentes bsicos da

clula com uma cor rsea. Como muitos dos componentes citoplasmticos tm

pH bsico, vrias regies do citoplasma se coram em rosa, estes elementos

so ditos como acidfilos (GARTNER & HIATT, 2003).

A avaliao feita a partir de imagens dos cortes corados com HE,

capturadas com o auxlio de uma cmera digital acoplada a um microscpio de

luz. So efetuadas medidas, em micrmetros, de vilosidades e profundidade de

cripta. As medidas de altura das vilosidades so tomadas a partir da regio

basal. A medida de profundidade das criptas realizada da base at a regio

de transio cripta-vilo.

FASINA et al. (2010) estudaram a influncia da infeco por

Salmonella enterica Sorovar Typhimurium nas clulas caliciformes e na

morfologia de vilos intestinais de frangos de corte. Determinaram a densidade e

o tamanho das clulas caliciformes, alm dos tradicionais parmetros

morfomtricos. A densidade foi definida pelo nmero de clulas PAS ou Alcian

blue (ALB) positivas por mm2 de superfcie quadrada do vilo (Figura 3).

A segunda barreira de proteo da integridade do epitlio intestinal

o muco. O muco produzido por clulas caliciformes, glndulas unicelulares,

que se encontram entre as clulas epiteliais. O duodeno tem o menor nmero

de clulas caliciformes e seu nmero aumenta ao se aproximar do jejuno.

Essas clulas produzem mucingeno, cuja forma hidratada constitui a mucina,

um componente do muco (GARTNER & HIATT, 2003).

composto por glicosaminoglicanas que protegem o vilo, ou at

mesmo participam do processo absortivo atravs das protenas ligadoras de

clcio (MACARI et al. 1994). O aumento da proliferao celular na cripta pode

alterar o nmero de clulas caliciformes e podem mudar a composio da

mucina e propriedades fsico-qumicas do muco.

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A determinao do nmero de clulas caliciformes uma tcnica

estabelecida usando segmentos intestinais corados com Alcian blue e cido

peridico Schiff (PAS). Embora a alta densidade de clulas caliciformes pode

resultar em um aumento da secreo de mucina, o nmero de clulas

caliciformes no pode ser usado para quantificar a secreo de mucina, que

necessita de anlise especfica.

A biometria dos rgos que compem o sistema digestrio outra

metodologia utilizada para avaliao do desenvolvimento intestinal expressa

pelo comprimento e peso relativo. O peso do intestino grosso dado pela soma

do peso dos cecos (aves), clon e reto. O peso e comprimento do intestino

delgado so medidos da poro compreendida entre o piloro e a juno leo-

ceco-clica (LEITO, 2007).

ROCHA (2009) avaliou a incluso de glicomanano esterificado em

raes para frangos contendo milho ou sorgo contaminado por fungos, e fez a

biometria dos rgos do aparelho digestrio das aves. Obteve resultados

diferentes dos relatados na literatura. O autor sugere que a avaliao somente

dos dados de peso dos rgos no constitui em bom indicador de avaliao do

efeito de gros de diferentes tipos e qualidades na rao.

FIGURA 3 Vilosidades do jejuno coradas em PAS, ALB e HE, respectivamente. ME: camada epitelial da mucosa; VLP: lmina prpria. 1) Clulas coradas em rosa so PAS positivas; 2) Clulas coradas em azul so ALB positivas. 3) a- altura do vilo; b- largura do vilo; c- profundidade de cripta. Fonte: Adaptado de FASINA et al. (2010)

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Portanto, avaliao qualitativa e quantitativa da perda do epitlio

muito importante, tendo em conta que permitem uma avaliao confivel da

capacidade digestiva e absortiva do intestino, alm da avaliao dos danos

causados mucosa intestinal por agentes patognicos ou jejum.

Para avaliao qualitativa da mucosa intestinal, tem-se usado a

tcnica de microscopia eletrnica de varredura. Usada para observar a

superfcie de um espcime slido, obtendo uma imagem tridimensional do

objeto. O material a ser observado preparado de um modo especial que torna

possvel o depsito de uma delgada camada de metal pesado (ouro, paldio,

smio, etc.) sobre a superfcie do espcime.

O microscpio emite um feixe de eltrons que varre a superfcie do

objeto. Alguns eltrons so refletidos diretamente, mas outros so emitidos

pela cobertura de metal pesado. Ambos so capturados por detectores de

eltrons e essas diferenas so interpretadas e mostradas em um monitor

como uma imagem tridimensional. Pode ser acoplado a um computador para

armazenar as imagens obtidas (GARTNER & HIATT, 2003).

GOMIDE JUNIOR et al. (2004) realizaram, com microscopia

eletrnica, estudo sobre a estrutura do duodeno, jejuno e leo de frangos de

corte que passaram por perodo de restrio hdrica e alimentar. Com as

imagens obtidas, fizeram classificao por escore das leses atravs das

imagens obtidas. Assim, o nmero de vilosidades com perda de epitlio foi

expressa como porcentagem do nmero total de vilosidades, considerando

cada grau de perda do epitlio. Desta forma puderam no s qualificar quanto

quantificar as leses (Figura 4).

2.1.2 Avaliao de fatores endgenos que regulam o desenvolvimento e

crescimento intestinal

Estudos relacionados ao controle do crescimento e renovao da

mucosa intestinal tm sido feitos, principalmente, em relao aos efeitos

modulatrios dos peptdeos secretados na mucosa. Os peptdeos so

produzidos por clulas enteroendcrinas e tm ao regulatria sobre o

desenvolvimento da mucosa.

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Dentre esses peptdeos incluem-se os fatores de transformao do

crescimento (transforming growth factor) TGF, sendo os mesmos TGF-,

TGF- e IGF (insuline like growth factor). O TGF- estimulador da

proliferao celular e o TGF- potente inibidor da proliferao das clulas

intestinais indiferenciadas. As evidncias de participao desses peptdeos no

processo regulatrio so claras, pois o TGF- encontrado em grandes

concentraes nas clulas no proliferativas dos vilos. Por outro lado, a

expresso do TGF- tem sido verificada em maior concentrao nas clulas da

cripta (MAIORKA et al., 2002).

Como a maioria dos fatores de crescimento, o IGF-I produzido

amplamente pelo organismo e liberado assim que sintetizado, diferindo da

FIGURA 4 Micrografia eletrnica de varredura de intestino de frangos. Nveis de perda epitelial das vilosidades intestinais. A) graus 0 e 1; B) grau 2; C) grau 3; D) grau 4; E) grau 5; F) grau 6. Fonte: Adaptado de GOMIDE JUNIOR et al. (2004)

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maioria dos hormnios clssicos que so armazenados em grnulos secretores

(BAGALDO et al., 2006). A sntese do IGF-I difusa, porm o fgado a maior

fonte do peptdeo circulante (MURPHY et al., 1987).

Em aves, o receptor do IGF expresso na maioria dos tecidos. No

intestino, expresso na regio da submucosa e clulas da cripta. A quantidade

de receptor de IGF diminui com o avanar da idade (JEURISSEN et al., 2002).

Os nveis sricos de IGF podem ser detectados em radioimuno

ensaios (RIE). KINDLEIN et al. (2008) realizou ensaio imunoradiomtrico

utilizando kit comercial para quantificao da concentrao de IGF-I no

colostro.

O radioimunoensaio uma reao de ligao competitiva, na qual

uma quantidade fixa de antgeno radio-marcado e antgeno da amostra

competem por um nmero limitado de stios de ligao de anticorpos

especficos. Ambos os antgenos, marcado e no marcado, ligam-se ao

anticorpo e formam complexos precipitveis. Os antgenos marcados livres e

os ligados ao anticorpo so separados por centrifugao, decantao, etc. para

mensurar a radioatividade dos radioistopos ligados. A concentrao de

antgeno nas amostras testadas inversamente proporcional quantidade de

radioatividade na frao ligada (STEINBECK & WYNER, 1993).

O RIE possui alta sensibilidade para detectar antgenos em

concentraes picomolares ou inferiores. prtico, pois na maioria dos kits de

RIE os tubos j possuem forrao com o anticorpo especfico, diminuindo

assim a quantidade de pipetagens a serem realizadas e facilitando o processo

de separao (STEINBECK & WYNER, 1993).

As desvantagens deste mtodo so que a utilizao do radioistopo

de iodo, 125I, exige licena e instalaes adequadas para sua manipulao e

descarte, ocasionando ainda, problemas de armazenamento e, principalmente,

o perigo de exposio sua radiao (REGHELIN, 2007).

Outra tcnica que pesquisadores utilizam para mensurar IGF a

quimioluminescncia. TSE et al. (2010), avaliando a adio de protenas

lcteas e zinco suplementar em leites desmamados, analisaram as

concentraes sricas de IGF-I pelo mtodo de quimioluminescncia com kits

comerciais.

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Vrios sistemas esto disponveis comercialmente com a finalidade

de dosar hormnios, drogas e outras substncias presentes em baixos nveis

em fluidos orgnicos. Esses mtodos utilizam um anticorpo ligado a um

marcador quimioluminescente ou luminescente (luciferina, luciferase, luminol e

outros). A energia excedente dissipada na forma de radiao

eletromagntica, diferente do que a maioria das reaes exotrmicas, onde a

dissipao na forma de calor ou exitao rotacional ou vibracional (SANTOS

et al., 1993)

Segundo REGHELIN (2007), as principais vantagens da

quimioluminescncia em relao ao RIE so a ausncia do risco de

contaminao radioativa tanto pessoal quanto ambiental e o fato de no serem

necessrias licenas para que sejam realizados. Porm, possui menor

sensibilidade, ocorrem problemas na leitura de algumas amostras e h

necessidade de ambiente refrigerado, pois os reagentes s atuam

adequadamente em baixas temperaturas.

2.2 AVALIAO DA FUNCIONALIDADE

2.2.1 Avaliao dos parmetros fsico-qumicos

A viscosidade e o pH do contedo intestinal so os principais

parmetros fsico-qumicos avaliados, pois podem interferir nos processos

digestivos e absortivos.

A viscosidade da dieta fator importante principalmente em animais

no ruminantes. Dietas que contm grandes quantidades de polissacardeos

no amilceos (PNAs) solveis apresentam maior viscosidade. So dietas

formuladas com trigo, aveia, centeio e outros cereais.

MEURER & HAYASHI (2003) relataram que a diminuio do

desempenho animal relacionado ao aumento dos nveis de PNAs na rao

consequncia da influncia destes elementos sobre a digesto. Ocorre menor

digestibilidade dos nutrientes e energia, alm de diminuio da ingesto de

matria seca. H aumento da demanda energtica com o aumento da

produo de secrees digestivas, aumento do tamanho dos rgos do trato

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gastrointestinal e maior taxa de renovao celular, quando o organismo faz

modificaes adaptativas s raes com altos nveis de PNAs. O aumento da

viscosidade do bolo alimentar dificulta o acesso das enzimas aos substratos e

dos alimentos digeridos borda do intestino (BEDFORD, 1996).

JEURISSEN et al. (2002) afirmaram que o aumento da viscosidade

intraluminal pode limitar a mistura de nutrientes da dieta com enzimas

pancreticas e cidos biliares. Alm disso, tambm aumenta a espessura da

camada aquosa estacionria que recobre as clulas da mucosa. As duas aes

limitam, respectivamente, a digesto e absoro de nutrientes.

Os mesmos autores ainda acrescentam que o crescimento de

determinados microorganismos pode ser favorecido, j que a reduo da

mistura diminui a oxigenao do contedo intestinal. H aumento na velocidade

de passagem, com dietas contendo PNA insolvel,que tambm pode interferir

no equilbrio da microbiota intestinal.

A medida da viscosidade da dieta feita por uma tcnica

estabelecida por BEDFORD & CLASSEN (1993) em que h coleta e

centrifugao do contedo do intestino delgado, com a viscosidade do

sobrenadante sendo determinada por um viscosmetro. A limitao dessa

tcnica a quantidade de digesta. Aps a centrifugao deve haver quantidade

suficiente de sobrenadante para avaliar a viscosidade.

O pH intestinal aumenta da extremidade oral para aboral e o pH de

cada segmento regulado pela atividade secretria do prprio segmento. A

produo bacteriana de metablitos cidos diminui o pH no papo, ceco e clon.

Essa alterao do pH ao longo do trato gastrointestinal necessria para que

atividade enzimtica seja tima para os grupos enzimticos presentes em cada

segmento.

Modificao no pH da dieta pode, alm de interferir na atuao

enzimtica, alterar tambm a absoro, j que alguns mecanismos de

absoro ativa dependem de potenciais inicos. A absoro de minerais, assim

como o tamanho dos complexos minerais tambm podem ser alterados

(JEURISSEN et al., 2002).

A determinao do pH simples, e pode ser feita na mesma frao

aquosa na qual a viscosidade medida.

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CALAA (2009) ao pesquisar cidos orgnicos para controle de

Salmonella enteritidis, mensurou o pH intestinal utilizando a metodologia

descrita por SILVA et al. (2000), em que os contedos do intestino e cecos

foram colhidos, diludos 15 mL em gua destilada, homogeneizados por 30

minutos, deixado em descanso por 5 minutos e determinado o pH.

A determinao do pH utiliza o peagmetro digital. O principio de

funcionamento desse equipamento a quantificao de ons H+ devido

diferena de potencial entre a substncia na qual o pH est sendo medido e

soluo padro presente dentro do eletrodo.

2.2.2 Avaliao da permeabilidade intestinal e turnover

A permeabilidade intestinal (PI) est relacionada com a capacidade

da mucosa intestinal em permitir a passagem de molculas para a corrente

sangunea (MENDONA et al., 2009), por difuso (JEURISSEN et al., 2002).

As tcnicas estudadas so capazes de estimar a permeabilidade

intestinal atravs da administrao oral de acares que no so

metabolizados, e posteriormente so determinados em fluidos biolgicos,

principalmente na urina. Os acares mais utilizados, segundo JEURISSEN et

al. (2002) so L-rhamnose, manitol, lactulose, 3-O-metilglicose, porm outros

monossardeos e dissacardeos so utilizados.

STEINER et al. (2000) descrevem, na introduo de seu trabalho

para avaliao da permeabilidade em caninos, os principais tipos de transporte.

Acredita-se que h dois tipos de transporte que permitem a passagem de

molculas de maneira passiva pela mucosa gastrointestinal. Poros menores

esto localizados entre as clulas da parede intestinal (dimetro mximo de 0,4

nm) permitindo a passagem de molculas pequenas (massa molecular 150-185

Da) como os monossacardeos. A freqncia desses poros transcelulares

maior e mais dependente da rea de superfcie da mucosa intestinal.

Poros maiores com raios mximos de dimetro de aproximadamente

0,5 a 0,8 nm permitem a penetrao de molculas maiores, como o Cr-EDTA e

dissacardeos (aproximadamente 340 Da). Esses poros esto localizados na

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rea das junes celulares (tight junctions). A freqncia desses poros

paracelulares bem menor e muito dependente da integridade da mucosa.

O mtodo mais aceito para verificao da integridade da barreira

intestinal o teste de manitol (monossacardeo) e lactulose (dissacardeo) que

so transportados por caminhos transcelular e paracelular, respectivamente.

Atravs da razo lactulose/manitol (L/M) infere-se as condies da

permeabilidade intestinal (MENDONA et al., 2009).

Em processos patolgicos do intestino delgado, as junes

paracelulares podem permitir a passagem de molculas maiores, levando ao

aumento da permeabilidade dos marcadores dissacardeos. Geralmente esto

associados a diminuio da rea de superfcie, levando a diminuio da

permeabilidade a marcadores monossacardeos (STEINER et al., 2000).

Para medir a presena dos acares na urina muitos mtodos j

foram desenvolvidos e validados. H relatos do uso de cromatografia lquida de

alta eficincia, ensaio imunoenzimtico, espectrometria de massas (LEE &

CHUL CHUNG, 2006) e cromatografia gasosa. MENDONA et al. (2009)

desenvolveram um protocolo de cromatografia gasosa que permite medir

adequadamente a presena de manitol e lactulose em amostras biolgicas,

comprovando ser um excelente mtodo para explorar a permeabilidade

intestinal normal e em condies patolgicas. mais realizada em humanos e

em animais nos quais a urina facilmente coletada. Em aves, h limitao ao

uso dessa tcnica, devido produo de excretas. Entretanto, possvel que

seja realizada utilizando sondas nas aves (JEURISSEN et al., 2002).

A integridade intestinal tambm pode ser avaliada in vitro. A

vantagem que pode-se investigar a permeabilidade de diferentes regies

intestinais, e h a possibilidade de eliminar a interferncia de outros fatores que

no sejam o objeto de estudo, j que as condies experimentais podem ser

controladas e monitoradas.

So estudos que utilizam a metodologia semelhante realizada por

WAGNER & GALEY (2003). Os autores fizeram anlise cintica do transporte

de hexoses para determinar a cintica de absoro de medicamentos.

Para avaliao do turnover intestinal e da taxa metablica dos

tecidos, tcnicas que utilizam istopos estveis esto sendo cada vez mais

usadas. Os istopos so tomos de um mesmo elemento qumico que

16

possuem mesmo nmero de prtons, mas diferente nmero de nutrons.

Caractersticas que fazem com que tenham propriedades fsicas distintas, mas

as mesmas propriedades qumicas. So ditos estveis por no emitirem

radiao. Para mensurao das diferenas de proporo entre istopos nos

tecidos, aps preparao do material, utiliza-se espectrmetro de massa

(BORDINHON, 2008).

CALDARA et al., 2010 afirmaram que dietas isotopicamente distintas

podem ser usadas para medir taxas de turnover nos tecidos do animal. Aps a

troca de dieta, a mudana na composio isotpica do tecido depende de quo

rpido esses constituintes so assimilados.

Tecidos com rpido metabolismo refletem dietas recentes, enquanto

aqueles com baixo turnover metablico representam dietas consumidas h

mais tempo. Esses autores avaliaram a influncia da glutamina sobre o

turnover do carbono da mucosa intestinal de leites desmamados.

PELCIA et al. (2011) utilizando tambm istopos estveis de

carbono, avaliaram o efeito da dieta suplementada com nucleotdeos sobre

taxa de turnover da mucosa intestinal de frangos antes e aps leses causadas

por coccidiose.

2.2.3 Avaliao das protenas da parede intestinal

A camada de muco presente no trato gastrointestinal, como j

mencionado, secretada pelas clulas caliciformes e fundamental na

manuteno da integridade e sade intestinal. As propriedades funcionais das

mucinas so a lubrificao das superfcies epiteliais, formao da barreira de

difuso para nutrientes, proteo contra microorganismos patognicos e

interao com o sistema imune.

Vrias tcnicas foram desenvolvidas e modificadas durante os anos

para mensurar a secreo de muco. Variam de testes inespecficos at

imunoensaios para quantificao de determinadas protenas mucinas. Os

ensaios de protena por espctofotometria permitem a quantificao da protena

total do muco dentro de uma rea especfica do intestino, mas sem a

especificidade da origem dessa protena.

17

Tcnicas colorimtricas so formas especficas para medir as

glicoprotenas que so presentes em uma amostra a partir de superfcies

epiteliais. Alm disso, so uma forma muito barata para determinar a

quantidade e composio do muco.

SHIRAISHI et al. (2009) estudaram a dinmica de mucinas

secretadas no leo de frangos infectados por Toxoplasma gondii. Utilizaram o

protocolo descrito por MYERS et al. (2008), no qual foi quantificado o nmero

de clulas caliciformes presentes em 0,3 mm2 de tnica mucosa de cada

animal. Essa anlise foi realizada com lminas submetidas s tcnicas

histoqumicas para deteco de glicoconjugados (PAS, AB pH 2,5 e AB pH

1,0).

A composio de mucinas em condies patolgicas expressa

pela alterao na relao entre mucinas neutras, sulfatadas e sialomucinas. No

estudo de SHIRAISHI et al. (2009) houve somente alterao no perfil

secretrio de mucinas neutras. Sugere-se que o aumento da secreo de

mucinas neutras nos grupos infectados tem a finalidade de deixar mais denso o

muco que recobria o epitlio, no intuito de proteg-lo da abraso que

normalmente ocorre durante a diarria que foi observada nesses animais.

MONTAGNE et al. (2000) propuseram um teste de ELISA (Enzyme-

Linked Immunoabsorbent Assay) para isolamento, caracterizao e

quantificao de mucinas na digesta ileal desenvolvido para bezerros. O

mtodo utilizado para realizar o teste se baseia na interao anticorpo-

antgeno. A limitao da utilizao do ELISA a necessidade de desenvolver

teste especfico para cada espcie animal. As mucinas no apresentam

reatividade cruzada entre as espcies animais (JEURISSEN et al., 2002).

Aumento na secreo de mucina pode ser benfico ou no de

acordo com a espessura da camada de muco. Se essa camada aumenta

somente em quantidades suficientes para maior proteo contra adeso

bacteriana, pode ser benfico. Porm, se tornar-se demasiadamente densa,

pode ocorrer alterao na mistura da digesta com enzimas digestivas.

O aumento da renovao celular resulta em maturidade reduzida de

clulas caliciformes. Nessa situao verifica-se aumento de sialomucinas e

reduo de sulfomucinas. Assim, o tipo de mucina produzida pode ser reflexo

18

do comprimento do vilo e, portanto, o perfil de mucina particular pode ser

indicativo de uma morfologia intestinal alterada.

Outra avaliao que pode ser feita a da atividade das enzimas da

borda em escova. Na superfcie dos microvilos so encontradas enzimas de

membrana (dissacaridases, oligapeptidases, etc.) que tm papel importante na

digesto de nutrientes (MACARI et al., 1994). So dissacaridases, fosfatase

alcalina, g-glutamiltransferase, aminopeptidases, sacarase-isomaltase (BOLELI

et al., 2002), que degradam oligmeros e oligopeptdeos em componentes

absorvveis.

SAKAMOTO (2009) utilizou a metodologia descrita por DAHLQVIST

(1964) com espectrofotmetro para avaliao de atividade enzimtica em

frangos de corte suplementados com glutamina e nucleotdeos. A unidade de

atividade especifica das enzimas foi definida como a quantidade de enzima que

hidrolisa 1 mol de substrato por mg de protena por minuto.

19

3 CONSIDERAES FINAIS

Tcnicas histolgicas para observao em microscpio de luz

continuam sendo bastante utilizadas para avaliao intestinal devido

facilidade de execuo, custo reduzido, e principalmente, porque resultam em

bons dados para anlise.

Porm, as metodologias moleculares so promissoras por serem

bastante especficas, sensveis, possibilitar diagnsticos rpidos e no serem

invasivas. Na medicina humana essas tcnicas so as mais utilizadas e nota-

se que a pesquisa animal j est seguindo esse caminho, principalmente

devido preocupao crescente com o nmero de animais utilizados pela

experimentao animal. Pelo mesmo motivo, metodologias in vitro para

determinar funes fisiolgicas tambm devem ser promissoras.

As tcnicas disponveis para avaliao da integridade e

funcionalidade intestinal tm mostrado serem eficientes para as determinaes

em que so utilizadas. Porm, alguns ajustes nas metodologias so sempre

necessrios para que as diferenas fisiolgicas entre indivduos e espcies

sejam minimizadas.

Sempre que possvel, deve-se preferir realizar as anlises de dados

obtidos por vrias tcnicas, para que se tenha maior segurana ao relatar um

evento no intestino. E assim, poder inferir os eventos de digesto e absoro,

conhec-los e otimiz-los, obtendo o melhor desempenho do animal.

20

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