ap5 - critérios de validação dos testes sorológicos

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Trabalho realizado pelas posgraduandas Josiane S. Martins Carvalho e Maria Teresita F. Bendicho, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Aula 5

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Aula prática: Critérios de validação dos testes sorológicos

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Trabalho realizado pelas posgraduandas Josiane S. Martins Carvalho e Maria Teresita F. Bendicho, sob orientação dos Professores

Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do

Instituto de Ciências da Saúde da UFBA.Atualizado em junho de 2003

Aula 5

Os testes sorológicos são assim chamados porque buscam detectar a presença de anticorpos existentes

no soro, produzidos pelo indivíduo contra um an-tígeno específico. Por exemplo: um indivíduo que

tenha sido infectado com o Trypanossoma cruzi, vaiapresentar no seu soro, anticorpos contra este para-sita – estes anticorpos podem então ser detectadospor um teste sorológico, o que poderá confirmar,

no caso, ser o referido indivíduo um portadorda Doença de Chagas.

Por extensão, a detecção deum antígeno também se enquadra neste tipo de teste.

Veja a grande utilidade dos

testes sorológicos. Eles são correntemente usados para:

Definição da suspeita clínica

Diferenciação de fases da doença

Diagnóstico de doença congênita

Triagem sorológica em banco de sangue

Seleção de doadores e receptores de órgãos para transplante

Prognóstico da doença

Critérios de cura

Avaliação / monitoramento da terapêutica

Diferenciação da imunidade naturalmente adquirida ou artificialmente

induzida

Estabelecimento da prevalência da doença

Verificação de erradicação da doença

Verificação de reintrodução de novos casos em áreas consolidadas

Um teste sorológico pode ser qualitativo, semi-quantitativo ou quantitativo:

- qualitativo, se os seus resultados informam apenas sehouve ou não reação / detecção (positivo ou negativo).

Veja um laudo imaginário: Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra rubéola

Resultado: positivo

- semi-quantitativo, se a amostra testada (soro) foi diluída –a maior diluição a apresentar reação é o seu título.

Veja um laudo imaginário:Teste – detecção por imunofluorescência de anticorpos IgG contra o T. cruzi

Resultado: positivo até a diluição de 1:320

- quantitativo, se é capaz de informar a quantidade absoluta do material detectado.

Veja um laudo imaginário:Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra o T. gondii

Resultado: 63 UI/ml

Cont. negativoCut-offCont. positivo

A placa abaixo apresenta o resultado de um teste “ELISA” (você conhecerá este teste com detalhes adiante). Observe os poços com soros controle positivo, controle negativo e o “cut-off” (ponto de corte). Note que as cores são nitidamente diferentes. Esta placa

será lida por um fotocolorímetro, que informará os valores de den-sidade ótica. Todos os outros poços contem soros que estão sendo testados. Todos aqueles que apresentarem resultados abaixo do

“cut-off” serão considerados negativos, enquanto que os que mos-trarem valores maiores, serão positivos.

Trata-se portanto de um teste qualitativo

Agora veja um teste semi-quantitativo, que você também conhecerá adiante(hemaglutinação passiva):

Sorostestes

controle positivocontrole negativo diluições seriadas dos soros testes

de 1: 2 a .................. 1:1024

Veja que na primeira fileira (de cima para baixo), a reação foi positiva até adiluição de 1:32 . Já na segunda fileira o resultado foi negativo em todas as

diluições.O resultado do primeiro soro teste acima referido é: reagente até a

diluição de 1:32 (ou título:1:32). O segundo soro teste é não reagente.

Um teste quantitativo fornece resultados precisos, com valores absolutos. Estes valores podem ser expressos em massa por volume

(por exemplo, mg/ml) ou em unidades internacionais também por volume (por exemplo, UI/ml).

Você aprenderá adiante que estes valores são encontrados por inter- polação do valor da análise obtido com o soro teste (por exemplo,

o valor de densidade ótica) em curvas construídas com valores padrões.

valores basaisvariação

linear platô

Abscissa: valores padrões conhecidos (por exemplo, mg/ml.)

Ordenada:valores obtidos pelo

instrumento de medida(por exemplo, D.O.)

Você também aprenderá que a interpolação para a dosagem dos soros testes só pode ser feita para valores que se encaixem na zona de variação linear, vista acima.

Veja:

A segura interpretação dos testes sorológicos depende de algumascaracterísticas e parâmetros que

o definem, como por exemplo:- A sua reprodutibilidade

- A sua validade- A sua especificidade- A sua sensibilidade - O seu valor preditivo

O teste, quando semi-quantitativo ou quantitativo, deve ter um valor conhecido, acima do qual seja considerado positivo e

abaixo do qual seja negativo. -este valor é o seu ponto de corte (“cut-off”)

É importante também ter em mente o objetivo de sua utilização,

por exemplo, - se é para diagnóstico - se é para triagem

A seguir você será apresentado aos significados e quando for o caso,

às maneiras de calcular os parâmetrosmencionados.

Você está também recebendo impressos contendo situações concretas com exemplos e exer-

cícios para os cálculos mencionados.

REPRODUTIBILIDADE = confiabilidade, fidedignidade, ou precisão

Capacidade de obter resultados com valores muito próximos entre si, quando analisadas uma mesma amostra em um mesmo ou em diferentes ensaios.

 

Reprodutibilidade – termo usado para testes qualitativos.

Precisão - testes quantitativos (determina-se o coeficiente de variação).

 

Reprodutibilidade (%) = Número de resultados concordantes X 100

Número total de resultados

 

Testes quantitativos: cv = s

X

cv- coeficiente de variação s= desvio padrão X = média dos resultados 

 VALIDADE = acuidade, acurácia ou exatidão

Grau em que o exame é apropriado para medir o verdadeiro valor daquilo que é medido, observado ou interpretado. Capacidade de produzir valores muito próximos aos obtidos num ensaio de referência (padrão ouro).

O cálculo é feito pela expressão: 

Número de resultados corretos X 100 Número total de resultados

   

SENSIBILIDADE – é a capacidade de detectar amostras verdadeiramente positivas. É, portanto, a relação entre: S = AP X 100 AP + FN  ESPECIFICIDADE – é a capacidade em detectar amostras verdadeiramente negativas. O seu valor é obtido pela expressão: E = AN X 100 AN + FP ________________________ AP = amostras verdadeiramente positivasAN = amostras verdadeiramente negativasFP = amostras falso-positivasFN = amostras falso-negativas  Um teste será mais sensível quando apresentar menos resultados falso-negativos, e mais específico quando apresentar menos resultados falso-positivos.

VALOR PREDITIVO

       Valor preditivo positivo (VPP) - probabilidade de que um resultado positivo ser verdadeiramente positivo.

       Valor preditivo negativo (VPN) - probabilidade de que um resultado negativo ser verdadeiramente negativo . Veja as expressões para VPP e VPN VPP = AP X 100 AP + FP  VPN = AN X 100 FN + AN  

Os valores preditivos de um teste variam de acordo com a prevalência da doença ou infecção.

PREVALÊNCIA – corresponde ao número total de casos de uma doença ou infecção numa determinada população, num período de tempo.

 

 PONTO DE CORTE PARA DELIMITAR RESULTADOS POSITIVOS

 O ponto de corte para um teste sorológico (“cut off”) ou limiar de reatividade, é o valor que define o limite entre um teste negativo e um teste positivo. A definição do ponto de corte leva em conta a distribuição das frequências dos resultados observados na população, bem como os valores requeridos para a especificidade e a sensibilidade do teste em questão. Veja os gráficos abaixo:

A curva ROC ( “receiver operating curve” ), representada abaixo, tem sido bastante utilizada para definição de valores de “cut-off”. Veja abaixo, como exemplo, a curva ROC de um teste ELISA (“ELISA

BHI”), desen- volvido pelo Laboratório de Imunologia, para uma doença caprina (linfadenite caseosa). Neste caso, o “cut-off” foi

determinado em 0,25,pois tal valor combina os melhores percentuais de sensibilidade e

especificidade requeridos para o teste. Curva ROC do ELISA BHI

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1 - Especificidade (%)

Sen

sib

ilid

ade

(%)

0,075

0,5

0,10,150,17

0,5

0,4

0,3

0,20,25

UTILIZAÇÃO DOS TESTES SOROLÓGICOS

A maior ou menor sensibilidade e especificidade de um teste sorológico depende de qual a sua finalidade.

- Para diagnóstico - é necessário a utilização de testes mais específicos. Nestes casos, é importante que sejam evitados os testes falso-positivos.

- Para triagem em Banco de Sangue (ou outras finalidades similares)– os testes são usados com fins preventivos, ou seja, a função é prevenir a contaminação do receptor. Aqui busca-se evitar os testes falso-negativos (a repetição de um teste com resultado falso-positivo custa pouco, entretanto, a disseminação da doença em consequência de um resultado falso-negativo, tem que ser impedida a todo custo).

FIM