ANTIGENICIDAD DE LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS INFLUENZA PORCINA SUBTIPO

(H1N1) CLSICO COMO CANDIDATO A VACUNA EN UN VECTOR DE EXPRESIN EN

CLULAS DE MAMFERO

Diana Marcela Echeverry Muoz

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Posgrados Interfacultades

Bogot, Colombia

2012

ANTIGENICIDAD DE LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS INFLUENZA PORCINA SUBTIPO

(H1N1) CLSICO COMO CANDIDATO A VACUNA EN UN VECTOR DE EXPRESIN EN

CLULAS DE MAMFERO

Diana Marcela Echeverry Muoz

Trabajo de investigacin presentada(o) como requisito parcial para optar al ttulo de:

Magister en Ciencias Microbiologa

Director (a):

MV. MSc. PhD. Gloria Consuelo Ramrez Nieto

Lnea de Investigacin:

Virologa Animal

Grupo de Investigacin:

Microbiologa y Epidemiologa Veterinaria

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Posgrados Interfacultades

Bogot, Colombia

2012

A mis padres y mis hermanos quienes me han

apoyado con su amor y compresin en cada instante

de mi vida.

A Fred Eduardo por apoyarme incondicionalmente.

Vivimos en el mundo cuando amamos, solo una

vida vivida para los dems merece la pena ser

vivida

Hay una fuerza motriz ms poderosa que el vapor,

la electricidad y la energa atmica: la voluntad

Albert Einstein

Agradecimientos A mis padres y mis hermanos por el apoyo y comprensin durante esta etapa de mi vida

y por brindarme las herramientas necesarias para mi formacin espiritual y profesional.

A Fred Eduardo por su apoyo, amor y por su apoyo en esta parte de mi vida.

A la Dra. Gloria Ramrez Nieto por todo su apoyo, comprensin durante la realizacin de

este trabajo y por su orientacin en mi formacin acadmica y personal.

Gracias al Dr. Vctor Vera y al Dr. Jairo Jaime por sus apoyos y aportes a este trabajo.

A mis compaeros de laboratorio y de maestra quienes estuvieron apoyndome durante

este largo trabajo e hicieron que los momentos difciles fueran llevaderos.

A los profesores Martha Fontanilla y Fabio Aristizbal por su conocimiento transmitido y

apoyo durante la Maestra.

Resumen y Abstract IX

Resumen La infeccin por virus de la influenza A es una causa importante de enfermedades

respiratorias, afectando diferentes especies de aves y mamferos incluido el humano. En

los cerdos, adems del efecto en salud animal, representa una amenaza para la industria

porcina a nivel mundial por su impacto econmico. Desde el punto de vista de salud

pblica, la influenza plantea problemas debido a que el cerdo juega un papel importante

como mediador en la transmisin inter-especie del virus. Las vacunas disponibles

actualmente para la prevencin de influenza en cerdos, son de tipo inactivado, por lo que

proveen una proteccin limitada contra la infeccin.

En Colombia, a pesar de que la infeccin en cerdos ha sido detectada desde hace ms

de cuarenta aos y recientemente se han aislado cepas de virus de influenza del tipo

H1N1, no existe una vacuna aprobada contra el virus de influenza en cerdos, lo cual lleva

a la necesidad de desarrollar una vacuna altamente eficaz, de rpida produccin y de

fcil manejo con el fin de evitar la transmisin inter-especies y la generacin de nuevos

subtipos virales. Adicionalmente se requiere que la vacuna no represente un riesgo en

cuanto a la posibilidad de recombinacin con virus circulantes en los cerdos de campo y

que la vacuna est dirigida antignica y molecularmente a los virus de influenza

presentes en la especie porcina de Colombia.

Con ste fin, en el presente trabajo se evalu la capacidad antignica de la

Hemaglutinina (HA) del virus de influenza A del subtipo H1N1 en un vector de expresin

de clulas de mamfero como un posible candidato a vacuna de virus recombinante en

cerdos. Se amplific y se clon en un Adenovector el gen de la HA a partir de

secuencias de cepas del virus de influenza porcino H1N1 aislados de cerdos en

Colombia. La expresin de la protena y amplificacin del adenovector se realiz en

clulas HEK- 293A. La antigenicidad de la protena expresada se evalo mediante

reactividad con sueros de cerdos serolgicamente positivos a influenza como resultado

de la exposicin natural al virus de influenza porcina H1N1.

X

Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en Clulas de

Mamfero

Se logr expresar la protena HA y se demostr su reconocimiento por anticuerpos

dirigidos contra el virus de influenza porcina H1N1 en sueros provenientes de cerdos de

campo, lo que permiti evidenciar la presencia y conservacin de eptopes existentes en

la protena recombinante. La expresin de protenas del virus de influenza como la

protena hemaglutinina, considerado el principal determinante antignico en los virus de

influenza, en un sistema eucaritico (Adenovector) constituye un candidato para el

desarrollo de una vacuna que permita prevenir y controlar la diseminacin de ste

agente, y que induzca una respuesta inmune protectora, al mismo tiempo que elimina la

posibilidad de reordenamiento genmico.

Palabras Claves: Virus de influenza porcina, Vacunas, Adenovectores, Hemaglutinina

Abstract Influenza virus infection is an important cause of respiratory disease affecting different

species of birds and mammals including humans. The disease represents a threat to the

swine industry worldwide and is a significant problem due to the role that pigs could play

as an intermediate host in the interspecies transmission of this virus. Currently available

vaccines to prevent of swine influenza are mainly inactivated and therefore they provide

limited protection against the infection. In spite of having evidence of influenza virus

infection on pigs in Colombia from more than forty years and the recent isolation of H1N1

SIV, vaccination againts Influenza virus is not approved in this country yet. As a result

there is a need to develop a highly effective and easy to produce recombinant vaccine in

order, to prevent inter-species transmission and to avoid the generation of new viral

subtypes .In addition, it is higly recommended to use a virus that is antigenically and

molecularly close to SIV circulating on the field in Colombian pig farms.

For this reason, this study evaluated the antigenicity of the HA protein of H1N1 influenza

A virus in an expression vector for mammalian cells to be used as a potential

recombinant virus vaccine candidate. The hemagglutinin (HA), obtained from strains of

Contenido XI

swine influenza viruses isolated from pigs in Colombia was amplified and cloned in an

adenovector. The protein expression and adenovector amplification was performed in

HEK-293 cells (Invitrogen). The antigenicity of the expressed protein was evaluated

using sera from serologically positive pigs as a result of natural exposition to swine

influenza virus (H1N1).

We demonstrated expression of the HA protein and its recognition by antibodies against

H1N1 swine influenza virus from swine serum, allowing us to evidence the presence and

conservation of epitopes in the recombinant protein. These results showed that

expression of the HA protein (the major antigenic determinant of influenza virus) in an

eukaryotic system is a good vaccine candidate. This could be used to prevent and/or

control spread of this agent while inducing a protective immune response and prevents

genomic rearrangement possibilities.

.

Keywords: Swine Influenza Virus (SIV), Vaccines, Adenoviral, Hemagglutinin

Contenido XIII

Contenido

Pg.

Resumen ......................................................................................................................... IX

Lista de figuras ............................................................................................................. XV

Lista de tablas ............................................................................................................ XVII

Lista de smbolos y abreviaturas ............................................................................. XVIII

Introduccin .................................................................................................................... 1 Captulo 1

1. Revisin de literatura ............................................................................................... 5 1.1 Generalidades de la Influenza porcina.5 1.2 Virus de Influenza A.. ..7 1.2.1 Replicacin del virus9 1.2.2 Aspectos clnicos12 1.3 La importancia del cerdo en la transmisin del virus de influenza A 12 1.4 Epidemiologa del virus de influenza porcina13 1.4.1 Virus de influenza porcina en Colombia.16 1.5 Vacunas contra el virus de influenza..18 1.5.1 Vacunas basada en vectores virales..21 Adenovector....22 1.5.2 Candidatos a vacunas contra el virus de Influenza .23 1.6 Hemaglutinina.25 Captulo 2

2. Metodologa ........................................................................................................... 29 2.1 Amplificacin del gen de la Hemaglutinina 30 2.1.1 Extraccin de RNA del virus de influenza A y sntesis de cDNA ...30 2.1.2 Diseo de los Oligonucletidos ....31 2.1.3 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ..31 2.2 Clonacin, transformacin y seleccin en el plsmido de transferencia pENTR2B Dual.......32 2.2.1 Doble digestin de los productos de PCR y del plsmido pENTR2B Dual....32 2.2.2 Electroforesis en Gel de agarosa....33 2.2.3 Purificacin de Insertos y Plsmidos..33

XIV Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en Clulas de

Mamfero

2.2.4 Ligacin del gen HA en pENTR2B Dual.34 2.2.5 Transformacin de bacterias E. coli competentes34 2.2.6 Extraccin ADN plasmdico 35 2.2.7 Verificacin de la clonacin de HA en pENTR2B Dual....35 Anlisis con enzimas de restriccin... 35 PCR. 36 Secuenciacin 36 2.3 Recombinacin del plsmido pENTR2B Dual en el adenovector pAd/CMV/V5-DEST.. 36 2.4 Expresin del gen HA en clulas de mamfero (HEK 293-A). 38 2.4.1 Transfeccin de clulas HEK 293-A 38 2.4.2 Infeccin de clulas HEK-293A... 39 2.4.3 Prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFA). 40 2.4.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida .. 40 2.4.5 Inmunoblot 41 2.5 Determinacin de la antigenicidad de la hemaglutinina 42 2.5.1 Reactividad Serolgica .. 42 2.5.2 Inmunoblot. 42 Captulo 3

3. Resultados y Discusin ........................................................................................ 433 3.1 Amplificacin del gen de la hemaglutinina H1..43 3.2 Clonacin y anlisis del gen HA en el plsmido de transferencia ..45 3.3 Recombinacin del plsmido de transferencia en el Adenovector...49 3.4 Expresin del gen ha como protena recombinante en un adenovector 51 3.5 Antigenicidad de la hemaglutinina evidenciada por su reconocimiento

por sueros provenientes de cerdos de explotaciones de campo.........63

4. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 655 4.1. Conclusiones 65 4.2. Recomendaciones 66

Anexo A: Secuencia nucleotdica del gen HA en el Adenovector pAd/CMV/V5-DEST69

Bibliografa .....................................................................................................................75

Contenido XV

Lista de figuras Pg.

Figura 1-1. Estructura del Virus de Influenza A. 7

Figura 1-2. Pasos de la replicacin del virus de influenza A. 11

Figura 1-3. Reordenamiento gentico del virus de influenza con referencia a virus de influenza humana y porcino 14

Figura 1-4. Comportamiento serolgico del virus de influenza porcina en Colombia 17

Figura 1-5. Inmunogenicidad Protectora y variabilidad de las protenas del virus influenza A. 24

Figura 1-6. Estructura de la glicoprotena hemaglutinina (HA). 26

Figura 2-1. Flujograma de la metodologa empleada 29

Figura 2-2. Mapa del plsmido pENTR2B Dual 34

Figura 2-3. Mapa vector de expresin pAd/CMV/V5-DEST. 37

Figura 3-1. Amplificacin del gen HA 44

Figura 3-2. Producto de PCR purificado 44

Figura 3-3. Digestin de los productos de PCR y plsmido pENTR2B Dual 45

Figura 3-4. Extraccin de ADN plasmdico de los clones recombinantes del gen HA. 46

Figura 3-5. Digestin del plsmido pENTR2B Dual con el gen HA 48

Figura 3-6. Amplificacin del gen HA en el plsmido pENTR2B Dual 48

Figura 3-7. ADN plasmdico de los clones recombinantes de pAd/CMV/V5-DEST + gen HA. 49

Figura 3-8. Resultados de la digestin del plsmido pAd/CMV/V5-DEST + gen HA. 50

Figura 3-9. Lnea celular HEK-293A posterior a la transfeccin con el plsmido Adenoviral recombinante pAd/CMV/V5-DEST + gen HA. 53

XVI Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en Clulas de

Mamfero

Figura 3-10. Lnea celular HEK-293A posterior a la transfeccin con el plsmido Adenoviral recombinante pAd/CMV/V5-DEST + gen HA, en medio con Agarosa. 54

Figura 3-11. Expresin del gen HA con cola V5. 55

Figura 3-12. Perfil electrofortico de la expresin de los clones virales pAd/CMV/V5-DEST + gen HA. 57

Figura 3.13. Reconocimiento de las colas de V5 de la protena HA expresada en clulas HEK-293A. 58

Figura 3-14. Reconocimiento de la protena HA con sueros de cerdos inmunizados con un modelo de vacuna inactivada del virus de influenza porcino H1N1 clsico. 59

Figura 3-15. Western-blot de los clones virales con suero pre-calostral de cerdo. 60

Figura 3-16. Reconocimiento de la protena HA con anticuerpos especficos contra el virus de influenza porcina H1N1 61

Figura 3-17. Reconocimiento por sueros provenientes de cerdos de explotaciones de campo frente a los clones recombinantes 64

Contenido XVII

Lista de tablas Pg.

Tabla 1-1. Segmentos de RNA del genoma del virus de Influenza A 8 Tabla 1-2. Ventajas y desventajas de las Vacunas de influenza A en desarrollo 19 Tabla 2-1. Oligonucletidos empleados para la amplificacin del gen HA. 31 Tabla 3-1. Fragmentos esperados al digerir el plsmido pENTR2B Dual con o sin el gen HA 47

Tabla 3-2. Fragmentos esperados al digerir el pAd/CMV/V5-DEST con o sin el gen HA 50

Contenido XVIII

Lista de Smbolos y abreviaturas Smbolos con letras griegas

Smbolo Trmino

-2,3 Receptor de tipo alpha 2,3 -2,6 Receptor de tipo alpha 2,6 Marcador de peso lambda

Subndices Subndice Trmino Marca registrada MT

Abreviaturas Abreviatura Trmino ARN cido ribonucleico ADN cido desoxirribonucleico PB1 Polimerasa Bsica 1 PA Polimerasa cida PB2 Polimerasa Bsica 2 HA Hemaglutinina NA Neuraminidasa NP Nucleoprotena M1-M2 Protena de matrz 1 2 NS1 Protena NS cDNA cido desoxirribonucleico copia mARN cido ribonucleico mensajero LB Medio Luria Bertani MDCK Lnea celular Madyn Darbi Canine Kidney ECP Efecto Citoptico PCR Reaccin en cadena de la polimerasa

Introduccin La infeccin por virus de la influenza A es una causa frecuente de enfermedades

respiratorias en el cerdo en todo el mundo. La infeccin con virus de influenza porcina

ocasiona sntomas como fiebre, anorexia, letargo, estornudos, tos y disnea (Larsen, et

al.,2001). Aunque rara vez conduce a la muerte, la gripe porcina impone una carga

econmica debido a las tasas de deterioro en la ganancia de peso en los cerdos

afectados. Factores como la edad del hospedero, la cepa del virus e infecciones

secundarias aumentan la severidad de la enfermedad clnica (Easterday,1980).

La influenza porcina plantea importantes problemas de salud pblica debido a que el

cerdo juega un papel importante en la transmisin inter-especie del virus (Ma, et al.,

2009, Parmar, et al., 2011). Las clulas epiteliales de los cerdos presentan receptores de

superficie celular que son de preferencia no solo para los virus porcinos sino tambin

para los virus de influenza aviar y humanos, permitiendo as la infeccin por varios

subtipos del virus en una misma clula. Por lo anterior, se ha sugerido que los cerdos

pueden actuar como un recipiente de mezcla para la generacin de nuevos subtipos de

virus debido al reordenamiento gnico por el shift antignico, el cual consiste en la

generacin de una progenie viral con segmentos genmicos de dos o mas virus que han

infectado a la misma clula (Scholtissek, 1990; Brown, 2000; Ma, et al., 2009).

La rpida diseminacin del virus y su habilidad para cruzar la barrera entre especies

resalta la necesidad de desarrollar estrategias de control efectivas. Las vacunas

disponibles actualmente para la prevencin de influenza en cerdos, son de tipo

inactivado, por lo que proveen proteccin limitada contra la infeccin (Macklin et al.,

1998). Adems, el sistema de produccin y el largo tiempo requerido para el proceso de

la vacuna generan grandes costos y no permite una disponibilidad rpida. Una solucin

a este problema es la utilizacin de vacunas de ADN o de virus recombinantes por su

rpido y fcil manejo (Ulmer, 2002; Ellebedy y Webby, 2009; Tang, et al., 2009).

2 Introduccin

En el caso particular de Colombia no existe una vacuna aprobada contra el virus de

influenza porcina en cerdos y son mnimos los estudios epidemiolgicos del virus de

influenza por lo que se conoce muy poco del comportamiento y caracterizacin molecular

de las cepas circulantes en los cerdos. En el ao 2007 por la constante importacin de

cerdos y la necesidad de prevenir la infeccin de influenza A en las granjas de cerdos, el

gremio y el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural destinaron recursos para el

proyecto de investigacin Estudio sobre la influenza porcina en Colombia, aislamiento,

diagnstico y control, el cual fue ejecutado por el grupo de investigacin en

Microbiologa y Epidemiologa Veterinaria, de la Facultad de Medicina veterinaria y de

Zootecnia de la Universidad Nacional. Como resultado se report la presencia del virus

de influenza en cerdos y se realiz aislamiento por primera vez del virus de influenza

porcino en Colombia (Ramrez- Nieto, et al., 2012)

En general, las vacunas contra la influenza A se han enfocado principalmente en la

expresin de las glicoprotenas hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) ya que estas

son las inductoras de los anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, estas glicoprotenas

continuamente acumulan mutaciones (deriva gentica y cambios antignicos como el

reordenamiento gentico) para escapar al reconocimiento por el sistema inmune;

mientras que muchos otros factores probablemente contribuyen a la virulencia y a la

transmisibilidad, la evasin inmune es fundamental para la rpida propagacin del virus,

la generacin de epidemias y pandemias (WHO, 2003, Ekiert, 2009).

La hemaglutinina al ser una de las glicoprotenas de superficie del virus y responsable de

la unin del virus a la membrana plasmtica de la clula husped es un excelente

candidato a vacuna, ya que los anticuerpos especficos contra la HA bloquean la

infeccin del virus a la clula. En ste sentido, las vacunas de ADN y vacunas de virus

recombinante han demostrado la induccin de anticuerpos contra la HA, la activacin de

linfocitos T citotxicos, y una respuesta inmune especifica en cerdos (Macklin, et

al.,1998; Wesley, et al., 2004; Toro et al., 2010; Alexander, et al., 2012).

En el presente trabajo se amplific, se clon y se expres la protena HA del virus de

influenza A porcino del subtipo H1N1 clsico en un Adenovector recombinante. El

reconocimiento contra la protena recombinante Hemaglutinina del virus de influenza

porcina H1N1 clsico por los sueros provenientes de cerdos de campo, evidenci la

Introduccin 3

presencia y conservacin de eptopes existentes en la protena recombinante como un

posible candidato a vacuna en futuras investigaciones. Esto permitira brindar al sector

productivo una alternativa para el control de la enfermedad y contribuira al mejoramiento

de la salud animal, la produccin porccola, e igualmente tendra un impacto positivo en

la salud pblica, por el papel que el virus de la influenza porcina puede tener en la salud

humana.

1. Revisin de literatura

1.1 Generalidades de la Influenza porcina La Influenza porcina es una infeccin viral generalizada y endmica en las poblaciones

de cerdos en todo el mundo y est involucrada como una de las causas del Complejo

Respiratorio Porcino (CRP). Siendo la influenza porcina una de las principales

enfermedades respiratorias que afecta a la industria porcina a nivel mundial (Nakamura,

et al., 1972; Nakharuthai, et al., 2008)

El virus de la Influenza porcina (SIV) pertenece a la familia Orthomyxoviridae, al gnero

Influenzavirus A y a la especie Influenza A virus (International Committee on Taxonomy

of Viruses, 2009). Esta especie se clasifica en subtipos debido a las diferencias

existentes en sus dos glicoprotenas de superficie, la hemaglutinina (HA) y la

neuraminidasa (NA). Hasta el momento se han identificado diecisiete subtipos de HA y

nueve subtipos de NA para los virus de influenza A (Jiang, et al., 2010, Tong, et al.,

2012). En humanos se han reportado principalmente dos subtipos de NA (N1 y N2) y

tres subtipos de HA (H1, H2, H3), en aves acuticas se ha hallado la totalidad de HA y

NA, en equinos se han identificado dos subtipos de HA (H3 y H7) y dos de NA (N7 y N8),

en cerdos se han encontrado dos subtipos de HA (H1 y H3) y dos subtipos de NA (N1 y

N2) (Nicholson, et al., 2003). Recientemente se ha identificado en murcilagos un nuevo

subtipo de HA llamada H17 (Tong, et al., 2012). En la prctica, los subtipos H1N1, H3N2

y H1N2 son los ms comunes y los de mayor significancia patolgica para el cerdo

(Nicholson, et al., 2003, Chang, et al., 2009).

La influenza porcina se relaciona principalmente con la introduccin de animales nuevos

o de cerdos infectados a poblaciones vulnerables. Una vez que el lote de cerdos est

infectado, es probable que el virus persista a travs de la generacin de pie de cria

susceptible. Los brotes de la enfermedad se observan durante todo el ao, pero

alcanzan su pico mximo en los meses ms fros. La infeccin a nivel de la piara es

6 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

atpica, se propaga lentamente y el 25-30% de los animales presenta signos clnicos

(Nakamura, et al., 1972)

La principal va de transmisin es a partir de animales enfermos que eliminan el virus al

toser y estornudar o indirectamente por va nasofarngea despus del contacto fsico con

mucosas nasales contaminadas. Durante la fase aguda febril de la infeccin las

secreciones nasales contienen grandes concentraciones del virus el cual es excretado

durante 6 o 7 das aproximadamente (Van Reeth, et al., 2003). La gravedad de la

enfermedad clnica esta asociada a mltiples factores, principalmente aquellos

relacionados con la inmunidad materna, la cepa del virus, la va de infeccin y las

contaminaciones secundarias por bacterias. La inmunidad materna disminuye la

severidad de la infeccin y principalmente los cerdos seronegativos sern los que

presentan sntomas clnicos (Nakharuthai, et al., 2008).

La cantidad de virus que llega a las vas respiratorias ms profundas y la produccin del

virus infeccioso en los pulmones determinan la gravedad de la enfermedad. Aunque el

virus de la influenza se replica en todo el tracto respiratorio, los pulmones parecen ser el

rgano diana importante para la replicacin del virus (Nakharuthai, et al., 2008).

La presencia de los virus de influenza porcino en la granjas afecta los indicadores de

produccin, ocasionando disminucin en la tasa de crecimiento, en la ganancia diaria, en

la conversin alimenticia, y en consecuencia en el peso de los cerdos al final de la etapa

productiva (Sanchez, et al., 2010). Estrada y Hill reportan que cerdos afectados con

problemas respiratorios presentan una disminucin en la ganancia de peso de 41.1 g

diarios y tardan 16.7 das mas del tiempo normal en salir al mercado, lo que ocasiona un

aumento en el costo del alimento en 79,8 pesos por cerdo (Estrada, 1988; Hill, et al.,

1992). Adems de afectar la industria porcina los virus de influenza porcina en las

granjas pueden comportarse como agentes zoonticos convirtindose as en un riesgo

potencial para la salud pblica. Lo anterior se debe a que el cerdo es susceptible a la

infeccin con virus de influenza tanto humana como aviar, lo cual brinda la posibilidad de

generacin de nuevos subtipos de virus de influenza con capacidad de infectar tanto a

los humanos como a los cerdos; tal es el caso del virus de influenza del tipo H1N1 que

ocasion la reciente pandemia en el ao 2009 (Garten, 2009).

Captulo 1 7

1.2 Virus de Influenza A El virus de Influenza A, se caracteriza por ser cubierto, esfrico o pleomrfico, con un

dimetro promedio de 80-190 nm de longitud y puede presentar formas filamentosas. La

morfologa del virin es modelada principalmente por la protena de matriz M1, rodeada a

su vez por una capa doble de lpidos para constituir la envoltura exterior. Sobre la

superficie externa se proyectan alrededor de 500 picos distintivos que representan a dos

glicoprotenas; la hemaglutinina (HA) barra trimrica con la cabeza globular, y la

neuraminidasa (NA) con forma de champin, cuya estructura es tetramrica. Estas dos

glicoprotenas se intercalan en una relacin de HA a NA 4-5 a 1 respectivamente (Figura

1-1) (Lamb y Choppin, 1983; Lamb & krug, 1996; Nicholson, et al., 2003).

Los viriones son muy sensibles al tratamiento con calor, solventes de lpidos, detergentes

no inicos, formaldehdo y agentes oxidantes. Igualmente la infectividad se reduce

despus de la exposicin a la irradiacin (Lamb y Krug, 1996).

Figura 1-1. Estructura del Virus de Influenza A.

Componentes y ubicacin de cada una de las protenas y del material genmico del virus de influenza A.

Tomado de Nelson y Holmes, 2007.

El genoma del virus est formado por ocho segmentos de cadena simple de ARN en

sentido negativo que codifica para 12 protenas (Tabla. 1-1) y tiene una capacidad

codante total de 13,600 nucletidos de largo (Lamb, 1989). El ARN viral con polaridad

negativa (v-ARN) sirve como un molde: los segmentos tienen secuencias comunes en el

extremo 3 de 12 nucletidos (nt) y en el extremo opuesto 5 de 13 nucletidos, as como

8 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

seis unidades sucesivas de uridina (U), las cuales sirven como seal en la poliadenilacin

durante la sntesis de ARNm (Hay, et al., 1977; Robertson, et al., 1981).

Cada segmento de ARN esta unido a la nucleoprotena y en su extremo 5 a tres

polimerasas: polimerasa bsica 1 (PB-1), polimerasa bsica 2 (PB-2) y polimerasa cida

(PA). Cada uno de ellos codifican para una protena estructural o no estructural interna o

externa, o ARN polimerasa necesaria para la replicacin del genoma (Tabla 1). Los

segmentos de ARN que codifican los segmentos del cuatro al seis y el segmento 1 son

monocistrnicos, y los dems segmentos sintetizan dos pptidos cada uno, para un total

de 12 pptidos funcionales (Lamb y Choppin, 1983, Zamarin, et al.,2005, Carrada, 2010,

Jagger, et al., 2012).

Tabla 1-1. Segmentos de RNA del genoma del virus de Influenza A Segmentos de RNA del genoma del virus Influenza A

Segmento Tamao (nucletidos)

Codifica la protena

Tamao protena (aa)

Nmero de molculas por virin

Observaciones

1 2.341 PB2 polimerasa 759 30-60 Actividad endonucleasa. La cual usa el mARN del hospedero para obtener la caperuza (Cap) (Cheung y Poon, 2007).

2

2.341 PB1 polimerasa 757 30-60 Transcriptasa. Alargamiento molecular. Actividad de endonucleasa.

297 PB1-F2 87-99 ? Presenta una rpida degradacin dependiente del proteosoma y se localiza principalmente en la mitocondria.(Chen, et al., 2001). Se ha observado su expresin en virus de influenza humana y recientemente en influenza porcina (Zell, et al., 2007) Esta protena media la respuesta inmune del hospedero , induce la apoptosis de macrfagos reduciendo su capacidad de participar en la respuesta inmune (Zamarin, et al., 2005).

3 2.233 PA polimerasa 716 30-60 Transcriptasa. Proteasa. Esta protena es esencial para la transcripcin y la replicacin viral, lo que permite la acumulacin nuclear de la subunidad PB1 (Cheung y Poon, 2007).

123-183 PA-X 29 Reprime la expresin gnica celular, modula la virulencia en un modelo de infeccin en ratn y modula la respuesta del husped a la infeccin (Jagger,

Captulo 1 9

et al.,2012)

4 1.778 Hemaglutinina (HA)

566 500 Glicoprotena de superficies. Trmero responsable de la unin de la partcula viral con los receptores de las clulas hospedera que contienen acido silico. (Lamb y Krug, 1996).

5 1.565 Nucleoprotena (NP)

498 1,000 Asociado con segmentos de ARN para formar ribonucleoprotenas. Transportadora del ARN viral (v-ARN) del ncleo al citoplasma

6 1.413 Neuraminidasa (NA)

454 100 Tetrmero, glicoprotena con actividad destructora del receptor mediante la escisin del ligando alfa entre un cido silico terminal y un residuo adyacente D-galactosa o D-galactosamina (Matrosovich, et al., 2004). Actividad neuraminidasa. Liberacin de viriones maduros

7

1.027 Protena M1 252 3.000 Protena matriz, soporte de la cpside. La protena M1 forma una capa para separar la ribonucleoprotena (RNP) a partir de la membrana viral e interacta con el ARN viral, ARNv y componentes proteicos RNP durante el montaje y en el desmontaje del virus de Influenza.

316 Protena M2 96 Empalme del mARN Protena integral trans-membranal que encierra un canal inico esencial para la regulacin del pH dentro de la partcula viral, necesaria para la etapa de desnudacin en la clula. (Schnell y Zhou, 2008).

276 ? 9 ? mARN empalmado 8 890 NS1 Protena no estructural. Funcin

de transporte de ARN celular , empalme, traduccin y protena anti-interfern.

NS2 Protena no estructural: ncleo y citoplasma, funcin desconocida.

Modificado de Lamb y Choppin, 1983.

1.2.1 Replicacin del virus La entrada del virus a las clulas del tracto respiratorio es mediada por la protena de

superficie hemaglutinina que interacta con los receptores de membrana que contienen

glicanos con cido silico terminales (ASI) (Olsen, 2002). Despus del reconocimiento

inicial, el virin es englobado por endocitosis hasta penetrar en una vescula endosmica

como se observa en la figura 1-2. La vescula es acidificada hasta un pH 5, por el paso

10 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

selectivo de protones a travs de los canales inicos formados por la protena M2. Esto

lleva a la desestabilizacin de la Protena M1 (Lamb y Choppin, 1983).

La macromolcula HA es clivada por enzimas semejantes a la tripsina, generando una

hendidura molecular sobre la base del tallo, produciendo dos pptidos secundarios: HA-1

con 329 aminocidos (aa) lleva la porcin NH2 terminal; el otro pptido, ms pequeo,

HA-2 contiene 221 aa. Ambos estn unidos por un puente disulfuro existente entre la

cistena -14 de HA-1 y la cis -137 de HA-2. Cuando HA-2 se libera, queda expuesto el

llamado pptido de fusin responsable de unir la cpside del virus con la membrana de

la clula, aunque HA-2 sirve tambin como punto de anclaje sobre la envoltura viral

(Chen, et al., 1998). Finalmente los 8 segmentos de ribonucleoprotena (RNP) llegan al

ncleo para el proceso de la replicacin.

Durante la transcripcin se sintetiza el mensajero (mARN) incompleto. Esta molcula

tiene el extremo 3 poli-adelinatado, aunque no posee los 16 nucletidos del vARN. En el

extremo 5 lleva la caperuza (Cap-snatching) aunque los nucletidos del 9 al 15 son

obtenidos de un mARN presente en las clulas hospedera. Por otro lado, el ARN

completo es copiado (c-ARN), y el producto resultante se usa para generar nuevas

molculas del ARNv .

En las dos primeras horas post-infeccin (fase temprana) en la clula infectada hay

sntesis del ADN celular, en esta etapa PB2 (protena viral) se liga con la cap-m7G del

ARNm de la clula hospedera, tal estructura es apartada del ARNm celular por la

protena viral PB1. La caperuza es un iniciador de la sntesis del ARN, aunque los

nucletidos del 11- 15 son aadidos por PB1, poco despus PB2 se disocia del ramal en

crecimiento y PB1 junto con PA complementan la sntesis total de la hebra con sentido

(+), obteniendo otro ARN intermedio con hebra doble (+/-) (Smith y Hay, 1982).

Captulo 1 11

Figura 1-2. Pasos de la replicacin del virus de influenza A.

El virus se une a receptores en la superficie de la clula husped y es internalizado en un endosomas.

Eventos de fusin dependientes del pH, generan la liberacin del genoma viral en forma de

ribonucleoprotenas virales (vRNPs) en el citoplasma. Los vRNPs luego son importados en el ncleo para la

replicacin. El ARNm es exportado fuera del ncleo hacia el citoplasma para la sntesis de protenas.

Algunas de las protenas son importadas al ncleo para la replicacin del ARN viral y el ensamble de los

vRNPs. Al final de la infeccin, los virus son ensamblados y brotan a travs de la membrana citoplasmtica.

Modificado de Josset y colaboradores 2008.

Ncleo

Endosoma

cido Silico

Ensamblaje

Aparato de Golgi

12 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

1.2.2 Aspectos Clnicos Los cerdos infectados nicamente con el virus de influenza A muestran signos clnicos

leves, los cuales incluyen tos, estornudos, secrecin nasal y ocular, fiebre con una

temperatura corporal igual o superior a 40,5 C, disminucin del apetito y disnea. Si no

existen complicaciones por asociacin con otros agentes infecciosos por lo general los

signos clnicos mejoran en 10 a 14 das (Nakharuthai, et al., 2008, Parmar, et al., 2011).

Teniendo en cuenta lo anterior, la morbilidad puede ser hasta un 100%, con una tasa de

mortalidad baja y una rpida recuperacin (Easterday, 1980). Sin embargo, las

infecciones bacterianas secundarias pueden aumentar la gravedad de la enfermedad y

dar lugar a complicaciones como la neumona. Una alta morbilidad, como resultado de la

infeccin, tiene graves consecuencias econmicas debido al aumento del tiempo

necesario para que los cerdos alcancen el peso adecuado para su comercializacin (Kay,

et al., 1994).

1.3 La importancia del cerdo en la transmisin del virus de influenza A

Los primeros sntomas de influenza en cerdos fueron identificados en 1918 al mismo

tiempo que se present la epidemia de gripe espaola ocasionada por el subtipo H1N1,

observando que los brotes comenzaron en el cerdo o en humanos y se transmitan

rpidamente del uno al otro (Ma, et al, 2009). En 1931 se aisl por primera vez y se

caracteriz el virus de influenza A H1N1. Actualmente, los subtipos H1N1, H3N2 y H1N2

son los ms comunes y los de mayor significado patolgico para el cerdo (Nicholson, et

al., 2003).

El virus de influenza utiliza receptores celulares especficos para infectar las clulas

epiteliales del tracto respiratorio como son los receptores de cido silico del tipo 2,3-

galactosa presentes en aves y 2,6-galactosa presentes preferencialmente en humanos

(Naffakh, et al., 2009). Ambos tipos de receptores se encuentran en el cerdo lo cual los

hace susceptibles a la infeccin por los subtipos de influenza A aviar y humano; en

consecuencia, la co-infeccin por dos subtipos del virus de Influenza en el cerdo puede

Captulo 1 13

llevar al reordenamiento gentico entre stos (Kida, et al., 1994, Thacker y janke, 2008),

soportando la teora propuesta en 1985 de que el cerdo puede ser el recipiente de

mezcla en la generacin de nuevos virus de influenza (Scholtissek, 1990). Esto se

observ claramente en la pandemias de Asia en 1957 y Hong Kong en 1968, las cuales

fueron el resultado de virus de influenza provenientes de virus de origen humano y aviar

(Ma, et al., 2009).

1.4 Epidemiologa del virus de influenza porcina

El genoma segmentado del virus permite el intercambio de material gentico (segmentos

de ARN) con otro virus de la influenza A en el momento que se esta formando el nuevo

virin (Jong, et al., 2000). Este aspecto es de gran relevancia en la epidemiologa de la

enfermedad al observar los diferentes reordenamientos genticos que ha presentado el

virus a lo largo de la historia (Figura 1-3) (Morens, et al., 2009). La influenza porcina fue

propuesta por primera vez como una enfermedad relacionada con la influenza humana

durante la pandemia de 1918 ocasionada por el virus H1N1 la cual fue llamada la "gripe

espaola". Durante esta pandemia se observ las primeras manifestaciones clnicas en

el cerdo al mismo tiempo que en humanos. Solo hasta 1931, el virus de influenza H1N1

es aislado y caracterizado por primera vez en cerdos (Lewis y Shope, 1931).

En 1957, el virus H2N2 causa la "gripe asitica" y en 1968 el virus H3N2 es el

responsable de la "gripe de Hong Kong" (Belshe, 2005). Tanto en 1957 como en 1968, el

nuevo virus de influenza provena del reordenamiento gentico entre dos subtipos de

influenza A. La infeccin dual de un cerdo con virus de la gripe aviar H2N2 y de la gripe

humana H1N1 result en 1957 en la aparicin de un nuevo subtipo de virus influenza A

que contiene la hemaglutinina, la neuraminidasa, y el gen de una de las protenas de la

polimerasa (PB1) del virus de influenza aviar H2N2, junto con los otros cinco segmentos

genticos del virus de influenza humana H1N1 (Belshe, 2005).

Este nuevo subtipo viral recombinante circul en los seres humanos hasta 1968,

momento en el cual apareci un nuevo virus recombinante, el virus de influenza H3N2 de

Hong Kong originado por la sustitucin de los genes de la hemaglutinina (H2) y de la

14 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

polimerasa (PB1) del subtipo H2N2 con dos genes de origen aviar, H3 y PB1. Hoy, los

descendientes de este virus siguen causando la mayora de las infecciones por influenza

en seres humanos. Cinco de los genes del virus de influenza H3N2 que circula

actualmente tienen su origen en el virus causante de la pandemia de 1918 (Belshe,

2005).

Figura 1-3. Reordenamiento gentico del virus de influenza con referencia a virus de influenza humano y porcino.

Las flechas amarillas muestran la exportacin de uno o ms genes del virus de influenza aviar A a la gentica

del virus. La flecha roja punteada indica un perodo sin circulacin del virus. Las flechas rojas continuas

indican los caminos evolutivos de los linajes humanos del virus de influenza; las flechas azules, del linaje del

virus de influenza porcina; y la flecha azul a rojo, de un virus de influenza humana de origen porcino. Tomado

de Morens y colaboradores 2009.

Para la dcada de los 40, se reportaron en Europa (Checoslovaquia, Reino Unido y

Alemania) epidemias en cerdos causadas por el subtipo H1N1. En 1976 el virus de

Captulo 1 15

influenza porcina reemergi en granjas del norte de Italia y fue asociado con cepas

clsicas del tipo H1N1 que probablemente fueron introducidas por cerdos importados de

USA. En Blgica, Francia, Holanda y Alemania en 1979, se reporta una epizootia de

influenza porcina, relacionada con virus del subtipo H1 proveniente de aves y

posiblemente transmitida a los cerdos por los patos (Easterday, et al., 1999).

En Amrica del Norte, el virus H1N1 perteneciente al linaje porcino clsico est

genticamente relacionado con el virus H1N1 humano responsable de la pandemia de

influenza espaola de 1918. Desde 1965, el virus H1N1 se mantuvo altamente

conservado y fue el nico subtipo de virus de influenza A aislado en los cerdos de

Amrica (Nakharuthai, et al., 2008), sin embargo, en 1998 surge el subtipo H3N2 porcino,

causando brotes en los cerdos del Oeste de Amrica. Este subtipo H3N2 contena

segmentos de genes provenientes de diferente origen como resultado de la

recombinacin de los virus de influenza A H3N2 proveniente de humanos, H1N1 de

influenza porcina clsica y de un virus de influenza A de origen aviar (Zhou, et al., 1999).

Posteriormente un virus triple recombinante (RT) H3N2 aislado de cerdos en Minnesota,

Iowa y Texas contena segmentos de genes del virus porcino clsico (NS, NP y M), de un

virus humano (HA, NA y PB1) y un virus aviar (PB2 y PA) (Zhou, et al, 1999). En 1999, el

virus triple recombinante H3N2 evolucion a travs de la deriva gentica y la

redistribucin gnica con el virus porcino clsico H1N1 para producir los virus H1N2,

H1N1 y H3N1. En 1999, el virus de influenza porcino del subtipo H1N2 fue encontrado

en cerdos en Indiana y posteriormente se observaron brotes en el medio oeste de

Amrica (Karasin, et al., 2002). Los virus triple recombinante H3N2, H1N2 y H1N1 son los subtipos predominantes que

circulan en la poblacin porcina de los EE.UU., mientras que los virus dobles

recombinantes H3N2 no se extendieron de manera eficiente entre los cerdos (Webby, et

al., 2000, Ma, et al, 2009).

En abril del 2009, una pandemia con el virus de influenza A subtipo A/H1N1 surgi en la

poblacin humana de Amrica del Norte (Garten, 2009). El genoma de este virus

emergente es una combinacin de genes del virus de la gripe porcina (SIV) de Amrica

del Norte y linajes de Euro-Asia que nunca antes haba sido identificado en cerdos u

otras especies. El virus H1N1 que emergi se propag rpidamente en la poblacin

16 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

humana, alcanzando el nivel 6 de pandemia declarada por la Organizacin Mundial de la

Salud el 11 de junio de 2009 (WHO, 2009, Vincent, et al., 2010).

En centro y Sudamrica es poca la informacin sobre la prevalencia serolgica del virus

de influenza A porcino. Se han reportado casos con serologa positiva en Mxico,

observando casos de humanos positivos a cepas porcinas (Ayora-Talavera, et al., 2005).

Otros pases latinoamericanos como Venezuela (Boulanger, et al., 2004; Ramrez, et al.,

2005), Brasil (Mancini, et al., 2006) y Argentina han reportado casos aislados de

serologa con resultados positivos para ambos subtipos de influenza porcina (Teodoroff,

et al., 2003; Teodoroff, et al., 2004). En Venezuela se ha observado una reaccin

serolgica positiva para virus de influenza porcina de 7,9% para el subtipo H1N1 y del

8,2% para el subtipo H3N2 (Boulanger, et al., 2004).

En Argentina un estudio serolgico report virus de influenza porcina con una reaccin

positiva para el subtipo H1 del 41,2% y H3 del 41,6% (Teodoroff, et al., 2003; Pineyro, et

al., 2006). Adems, se ha reportado en este pas la presencia de dos nuevos virus de

influenza porcina en los cerdos resultado de dos eventos de recombinacin

independiente entre el virus de Influenza pandmico H1N1 y virus de influenza porcino,

que muestra la constante evolucin de los virus de influenza en la interfaz hombre-cerdo

y el riesgo potencial para la salud humana. Sin embargo la falta de informacin sobre la

circulacin de los SIV en Amrica del Sur, no descarta la posibilidad de que stos sean

provenientes del virus H1N1 pandmico o de SIV que han estado presentes en esta

regin (Pereda, et al. 2011).

1.4.1 Virus de influenza porcina en Colombia Son pocos los datos disponibles acerca del virus de influenza porcina en Colombia,

posiblemente porque los estudios epidemiolgicos en los cerdos no han sido

referenciados apropiadamente. El primer reporte que se relaciona con el virus de

influenza porcina en Colombia corresponde a un estudio de reactividad serolgica en

1977 realizado por Hanssen y colaboradores usando 278 sueros provenientes de cerdos

del departamento de Antioquia, Colombia, los cuales fueron colectados en un perodo de

dos aos (1971-1972) y evaluados mediante la prueba de inhibicin de la

Captulo 1 17

hemaglutinacin (HI), para los virus de influenza A/Hong Kong/1/68 (H3N2),

A/Swine/Iowa/l5/30, y A/Swine/Wisconsin/ 1/73, encontrando una tasa de positividad del

14%, 34% y 21%, respectivamente. A pesar de que no se lograron aislar virus de

influenza, se encontr un porcentaje mayor de sueros positivos en granjas que no

cumplan con las medidas de higiene adecuadas (Hanssen, et al., 1977). Para el ao de

1991 se estableci una reactividad del 6.5% a la cepa H3N2 (Cucaita, 2005). Un

monitoreo serolgico realizado en Antioquia, entre los aos 19971999 mostr una

reactividad del 43.5% para el virus H3N2 y del 0.8% para el virus H1N1, y entre los aos

20002001 se report una reactividad del 10% para el virus H3N2 (Mogolln, et al.,

2003). En otro estudio en el ao 2001 a travs de la prueba de inhibicin de

hemaglutinacin se observ una reactividad del 10% al virus A/SW/Texas/4199/H3N2 y

una reactividad puntual del 19.85% en cerdas multparas y del 3.13% en cerdas de

reemplazo (Moscoso y Neira 2001), (Figura 1-4).

Figura 1-4. Comportamiento serolgico del virus de influenza porcina en Colombia

Datos serologicos del virus de influenza porcina en Colombia reportados hasta el momento. Tomado de

Jaime y colaboradores, 2011.

Un aspecto importante a considerar en Colombia es la constante importacin de

ejemplares porcinos al mercado. En el ao 2005 un total de 214 cerdos fueron

introducidos para reproduccin, procedentes de Canad (56,1%), Estados Unidos

(33,2%) y Chile (10,7%) (Orjuela, et al., 2007). En el ao 2008 se importaron 186

porcinos para reproduccin, procedentes de Canad (65,0%) y Estados Unidos (35,0%)

18 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

(Orjuela, et al., 2009). Por la constante importacin de especie porcina y por la necesidad

de prevenir la infeccin por virus de influenza A en las granjas de cerdos, el gremio y el

Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia (MADR) destinaron recursos en

el 2007 para el proyecto de investigacin Estudio sobre la influenza porcina en

Colombia, aislamiento, diagnstico y control, ejecutado a partir del 2008 por el grupo de

investigacin de Microbiologa y Epidemiologa de la Universidad Nacional de Colombia.

Resultados preliminares durante 2008 y 2009 demostraron una reactividad serolgica por

individuo del 12.92% para el virus H3N2 y del 0.82% para el H1N1 en tres regiones de

estudio del pas (Antioquia, Occidental y Central) (Jaime-Correa, et al., 2011). Adems,

se report la presencia y el primer aislamiento de virus de influenza porcina en Colombia

H1N1 pandmico y clsico (Ramrez-Nieto, et al., 2012)

En Colombia, se considera que en el ao 2009 los porcicultores perdieron tres mil

millones de pesos como consecuencia de la disminucin en la demanda de carne de

cerdo, a causa de la alarma presentada por el virus de influenza A/H1N1. La Asociacin

Colombiana de Porcicultores (2009), enfatiz que las prdidas alcanzaron los 580

millones de pesos diarios.

1.5 Vacunas contra el virus de influenza La vacunacin es actualmente el nico medio prctico de reducir o contrarrestar la carga

de morbilidad en una especie como resultado de la infeccin con virus de influenza. Sin

embargo, la capacidad del virus de influenza A para eludir la inmunidad adquirida en

respuesta a la infeccin o la vacunacin, por medidas progresivas como deriva antignica

requiere la actualizacin peridica de la composicin de vacunas, a fin de reflejar los

virus circulantes.

En trminos generales, existen varias formulaciones de vacunas contra el virus de

influenza las cuales se dividen en dos grupos: las vacunas convencionales que son

vacunas con virus inactivados y vacunas de virus completo atenuado; las vacuna libres

de virus de influenza que incluye las vacunas de ADN (Ulmer, et al.,1993, Ulmer, et al.,

1994, Chen, et al., 2008), vacunas de protena recombinante con antgenos de superficie

Captulo 1 19

del virus (HA y NA), vacunas con virus recombinantes- vectores (Adeno-vectores y

Baculovirus) (Cox, 2008). En la actualidad, las vacunas ms usadas contra el virus de

influenza porcina en cerdos son las vacunas inactivadas, preparadas con virus cultivados

en huevos embrionados de gallina y estimulan altos ttulos de IgG en suero (Thacker y

Janke, 2008; Ellebedy y Webby, 2009; Tang, et al., 2009) (Tabla 1-2).

Tabla 1-2. Ventajas y desventajas de las Vacunas de influenza A en desarrollo Vacunas de Influenza

Caractersticas Ventajas Desventajas

Vac

unas

Con

venc

iona

les

Viru

s In

activ

ado

Uso del virin completo, partculas virales o subunidades de protenas como HA y NA, inactivados por medio de mtodos qumicos como betapropiolactona u xido de etileno.

-Principalmente generacin de anticuerpos contra las protenas de superficie (HA, NA ect).

- La eficacia se reduce en los lactantes y los ancianos. - Las vacunas con subunidades deben ser administradas al menos dos veces para generar una respuesta inmune protectora. - El sistema de produccin que depende del uso de huevos embrionarios o de clulas para la generacin del virus. - La longitud de tiempo entre la seleccin de la cepa vacunal, la produccin y disponibilidad de las primeras dosis de vacunas formuladas.

Viru

s vi

vo

aten

uado

Uso de virus vivos atenuados, con fenotipo antignico de la cepa de inters pero con fenotipo atenuado de una cepa maestra. Inoculacin intra-nasal

Genera anticuerpos locales neutralizantes y una respuesta inmune mediada por clulas.

- Requiere dos dosis para generar una respuesta inmune. - Presenta el mismo problema en el tiempo de produccin de la vacuna.

Vac

unas

libr

es d

e vi

rus

de In

fluen

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Baj

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Vac

unas

de

AD

N

Uso de Plsmidos empleados como vector que codifican un antgeno bajo el control de un promotor eucaritico constitutivo o inductivo. (Varias combinaciones de HA y NA de los virus).

Produccin de antgenos los cuales son presentados al sistema inmune asociado con molculas de clase I y II del complejo mayor de histocompatibilidad (Ulmer, 2002). - Efecto protector en pollos, ratones y cerdos.- La produccin de estas vacunas es relativamente segura y potencialmente econmica y rpida.- Poca cantidad de ADN para inducir una respuesta inmune.

- Riesgo de afectar a los genes que controlan el crecimiento celular - Posible induccin de respuestas de anticuerpos anti-ADN (Du et al., 2008).

20 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

Vac

unas

de

Vi

rus

Rec

ombi

nant

es (V

ecto

res)

Uso de virus empleados como vector que codifican un antgeno bajo el control de un promotor eucaritico constitutivo o inductivo (Varias combinaciones de HA y NA de los virus).

Genoma viral de fcil manipulacin, crecimiento hasta ttulos elevados y no necesita refrigeracin despus de liofilizado. Una respuesta inmune de larga duracin que estimula tanto la memoria B y las clulas T

- Riesgo de que se incorpore al genoma de la clula.

Las investigaciones con vacunas inactivadas como son las vacunas inactivada H1N1,

H3N2 y H1N1 porcina clsica, han demostrado que stas reducen la severidad de la

enfermedad clnica y el grado de diseminacin del virus en los cerdos despus del

desafo, pero no proveen proteccin completa contra la infeccin (Macklin, et al., 1998;

Larsen, et al., 2001, Vincent, et al., 2008). Adems, deben ser administradas hasta que

los anticuerpos maternos hayan decado a un segundo plano o a un nivel suficientemente

bajo para que no interfieran en la eficacia de la vacuna, aproximadamente en la doceava

semana y la segunda dosis en la dieciseisava semana de edad. Dado que ste intervalo

de tiempo depende de la cantidad inicial de anticuerpos adquiridos de forma pasiva por

cada cerdo , el momento real de una vacuna exitosa es slo estimado. Esto conlleva a la

necesidad de una vacuna que pueda estimular la inmunidad en el cerdo recin nacido,

incluso en presencia de anticuerpos maternos que ofrezcan una proteccin y seguridad

adicional (Wesley y Lager, 2006; Kitikoon, et al., 2006).

Una parte fundamental en la produccin de vacunas inactivadas o de virus vivo atenuado

es la utilizacin de grandes volmenes de cultivos de virus vivos, lo que con lleva a un

problema de bioseguridad si no se cumple con las normas exigidas. Adems, hay

factores que influyen en la propagacin del virus de influenza durante el desarrollo y la

produccin de una vacuna como es la facilidad de replicacin de ste en el laboratorio, el

hecho de que algunas cepas son altamente letales para el personal o los huevos

embrionados (H5N1), y que todos los virus de influenza son propensos a las mutaciones

y eventos de reordenamiento lo cual puede desencadenar una pandemia en lugar de

prevenir una (Tang, et al., 2009).

Captulo 1 21

En situaciones de pandemia en donde la necesidad de generar una vacuna efectiva y

rpida apoya el uso injustificado de vacunas que no necesariamente cumplen con las

pruebas de efectividad adecuadas pudiendo interferir de sta manera con una adecuada

respuesta a la vacunacin (Sipo, et al., 2011). Los investigadores se han enfocado al

uso de vacunas libres de virus de influenza por su bajo costo, menor tiempo requerido

para su produccin, alta seguridad y control de produccin. Estas vacunas pueden ser

producidas rpidamente usando tcnicas de biologa molecular una vez se conozca la

secuencia del virus circulante o problema (Tang, et al., 2009).

Las vacunas de ADN al igual que los vectores recombinantes ofrecen muchos de los

beneficios potenciales de las vacunas de virus vivos atenuados sin sus riesgos. Los

primeros experimentos que demuestran la eficacia de las vacunas de ADN han sido con

genes que codifican protenas del virus de influenza como son la HA, la NA, la matriz y la

nucleoprotena administrados por va intramuscular y por va intradrmica (Larsen, et al.,

2001; Olsen, 2000). Estas vacunas de ADN o de Vectores Recombinantes como es el

Adeno-vector pueden ser ms eficaces contra diferentes cepas de virus, que las vacunas

convencionales con virus inactivado, ya que han demostrado la induccin de una

respuesta humoral y celular especfica, la activacin de linfocitos T citotxicos y eficacia

protectora en pollos, ratones y cerdos (Donnelly, et al., 1995; Justewicz, et al., 1995;

Kendirg et al., 2008, Macklin, et al., 1998; Sipo, et al., 2011; Ulmer, et al., 1994).

1.5.1 Vacunas basada en vectores virales La expresin de protenas del virus de influenza en vectores virales recombinantes puede

inducir una respuesta humoral y celular comparable con la infeccin natural (Souza, et

al., 2005). La vacunacin con vectores recombinantes producen una respuesta inmune

de larga duracin que estimula tanto los linfocitos B de memoria y las clulas T, una

respuesta muy diferente a la que resulta de la aplicacin de las vacunas inactivadas

actuales contra el virus de influenza, las cuales inducen anticuerpos de vida corta.

Adems, la fabricacin de las Vacunas Recombinante implica un riesgo sustancialmente

menor al expresar en grandes cantidades protenas como hemaglutinina (HA) y

neuraminidasa (NA) de virus influenza de alta patogenicidad. (Kopecky-Bromberg y

Palese, 2009).

22 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

Para el desarrollo de vacunas recombinantes contra el virus de Influenza se han utilizado

para la expresin de protenas del virus de influenza (HA, M2, NP) diferentes vectores

virales como los baculovirus y los adenovectores. Aunque recientemente se ha

reportado el uso de alfavirus para la expresin de la HA subtipo H3 el cual ha inducido

una inmunidad protectora (Bosworth, et al., 2010). Los adeno-vectores, han logrando

inducir una respuesta humoral contra la HA, M2 y nucleoprotena del virus de influenza

(Sipo, et al., 2011).

Adenovectores Los adenovirus son virus desnudos de doble cadena de ADN lineal, icosadricos (70-

100nm) y miembros de la familia Adenoviridae. La partcula viral est compuesta en un

13% de ADN, 87 % de protenas; carecen de envoltura viral (membrana o lpidos), y

contienen pequeas cantidades de hidratos de carbono proporcionado por la protena

fibra del virin (Russell, 2000). Son causantes de enfermedades respiratorias agudas,

gastroenteritis, conjuntivitis, miocarditis, cistitis hemorrgica e incluso se les asocia con

oncognesis (Krilov, 2005). La transmisin del virus y los sntomas clnicos de la

infeccin varan de acuerdo al serotipo viral y a la edad de la poblacin susceptible.

Los Adenovirus han sido totalmente explorados para su uso potencial como vectores de

expresin de vacunas recombinantes (Kopecky-Bromberg y Palese, 2009; Sipo, et al.,

2011). Los Adeno-vectores se caracterizan por su replicacin defectuosa impidiendo la

propagacin de clula a clula, por las deleciones de la porcin E1 del genoma viral,

regin necesaria para la iniciacin de la replicacin viral (Souza, et al., 2005). Adems,

presentan un genoma viral de fcil manipulacin, crecen hasta ttulos elevados y no

necesitan de refrigeracin despus de liofilizados. Debido a estas caractersticas, el

adenovirus ha sido uno de los vectores recombinantes ms populares.

Entre los 49 serotipos de Adenovirus humano, los vectores derivados del serotipo 5

(Vector- Ad5) han sido caracterizados ampliamente, modificados y empleados en los

ensayos de vacunacin y terapia gnica (Hartman, et al., 2008). Durante la expresin de

Antgenos en un vector- Ad5 en clulas animales stos se pliegan en su forma

conformacional nativa, con sus modificaciones postranscripcionales y postraduccionales,

y pueden ser presentados al complejo mayor de histocompatibilidad induciendo una

Captulo 1 23

respuesta inmune ms eficaz en comparacin con sus homlogos de vacunas de

subunidades purificadas bioqumicamente (Bright, et al., 2007). La inmunogenicidad del

vector- Ad5, aunque indeseable para la terapia gnica, proporciona una actividad

adyuvante capaz de potenciar la inmunogenicidad de antgenos exgenos (Molinier-

Frenkel, et al, 2002). A diferencia de los adyuvantes no naturales (molculas sintticas y /

o administracin a un sitio apropiado) que pueden inducir consecuencias impredecibles

(Tang, et al., 2009), la infeccin natural por Ad5 con actividad adyuvante intrnseca es

generalmente benigna. Los resultados de aos de uso como una medida preventiva para

la infeccin adenoviral han demostrado la seguridad de la administracin oral de

Adenovirus en los seres humanos por va entrica con recubrimiento protector entrico

(Tucker, et al., 2008).

Se ha evidenciado que los vectores de adenovirus recombinantes que expresan

protenas de virus de la influenza pueden proteger a animales como el cerdo, ratones y

pollos despus del desafo (Wesley, et al., 2004; Gao, et al., 2006; Toro, et al., 2010;

Steitz, et al., 2010; Sobolesky, et al., 2011; Alexander, et al., 2012). A pesar de que el

uso de vacunas con vector Ad-5 en humanos esta limitado por la preexistencia de

anticuerpos contra la exposicin humana de Ad5; en animales como los cerdo jvenes o

en crecimiento los anticuerpos maternales preexistentes no interferirn en la eficacia de

la vacuna debido a que los cerdos carecen de inmunidad a los adenovirus humanos

(Tang, et al., 2009). Estos anticuerpos adquiridos pasivamente son importantes para la

proteccin temprana de los lechones o del animal, pero son una causa comn de fallo de

las vacunas tradicionales existentes, si stas se administran a los cerdos jvenes

lactantes; Problema que se resolvera al usar vacunas con Adenovectores (Wesley y

Lager, 2006, Chen, et al., 2007).

1.5.2 Candidatos a vacunas contra el virus de Influenza Existe una variedad de antgenos capaces de inducir una respuesta inmune, entre estos

estn la hemaglutinina y la neuraminidasa que presentan una alta inmunogenicidad

protectora y una alta variabilidad de eptopes; con respecto a otros antgenos como

nucleoprotena (NP), M1 y M2 que son altamente conservados (Figura 1-5) (Ellebedy y

Webby, 2009; Skehel y Wiley, 2000).

24 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

Los investigadores han tratado de disear vacunas contra el virus de influenza a partir de

eptopes conservados de las protenas M2, nucleoprotena y la polimerasa del virus. La

porcin extracelular de la protena M2 es uno de los ms estudiados y desarrollados

como vacuna universal, relacionada con la formacin del canal inico transmembrana.

stos estudios han demostrado que en las configuraciones adecuadas y en algunos

modelos animales, los anticuerpos contra el dominio M2e pueden proteger de la infeccin

(Ellebedy y Webby, 2009). Sin embargo, estudios realizados en cerdos con la protena

M2 y NP como vacunas, usando vectores virales, no indujeron proteccin al ser

desafiados con virus de influenza porcina del tipo H1N1, a pesar de que se indujo una

respuesta de anticuerpos contra M2 y una respuesta de linfo-proliferacin especfica

contra la protena NP del virus de influenza. Los cerdos vacunados presentaron signos

clnicos ms severos que el grupo control indicando que los anticuerpos para M2 en

combinacin con una respuesta mediada por clulas inmunes podran exacerbar la

enfermedad (Heinen, et al., 2002).

Figura 1-5. Inmunogenicidad protectora y variabilidad de las protenas del virus influenza A.

HA y NA antgenos mas variables y protectores. M2e la protena mas conservada pero con poca capacidad

protectora. Modificada de Ellebedy y Webby, 2009.

Otros estudios se han enfocado en la protena NS1 como un candidato a vacunas a virus

vivo atenuado, induciendo mutaciones (deleciones) en la protena NS1. Estas

mutaciones no le permiten a la protena NS1 cumplir su funcin de inhibir la sntesis de

interfern en la clula hospedera, por lo que aumenta la sntesis de IFN / una vez que

la clula hospedera (clulas epiteliales de cerdo), ha detectado el virus (Solrzano, et al.,

2005).

Captulo 1 25

1.6 Hemaglutinina La hemaglutinina (HA) es una glicoprotena de membrana codificada por el segmento 4

de ARN. Este segmento es de 1765 nucletidos de largo, codifica una regin de 1698

nucletidos (566 aminocidos) (Porter, et al., 1979; Krystal, et al., 1982). La HA es

responsable de la unin del virus a la membrana plasmtica de la clula husped y de la

fusin de las membranas una vez el virus ha penetrado a la clula hospedera (Wiley,

1987; Stevens, et al., 2006).

La HA se sintetiza como un precursor de cadena nica (HA0) en el retculo

endoplasmtico, donde se ensambla como un homotrmero y luego se exporta a la

superficie celular a travs del aparato de Golgi. Este homotrmero es clivado

proteoliticamente en la regin del pptido seal en dos cadenas de polipptidos HA1 y

HA2 (Suzuki y Nei, 2001). El monmero de hemaglutinina tiene un tallo constituido

principalmente por el pptido HA2, que a su vez est formado por una hlice beta larga

carboxi-terminal y otra hlice alfa corta amino-terminal unidas por un asa en horquilla. En

la parte basal de las dos hlices est situado el pptido de fusin hidrofbico que sirve

como punto de anclaje de la glicoprotena dentro de la bicapa de lpidos propia del virin

(Figura 1-6) (Wilson, et al., 1981).

El pptido HA1 es una protena de unin al receptor y es el objetivo principal de la

respuesta inmune. ste pptido forma la regin de reconocimiento hipervariable llamada

cabeza globular de la hemaglutinina. Adems, forma cinco regiones con funcin de

eptopes las cuales rodean el sitio donde tiene lugar la unin con el cido silico (Lamb y

Choppin, 1983).

26 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

Figura 1-6. Estructura de la glicoprotena hemaglutinina (HA).

Cada virin tiene 170 trmeros de hemaglutinina (HA) con peso molecular 75 kDa. Esta glicoprotena est

formada por dos pptidos glicosilados: HA1 (color azul) 329 aminocidos y HA2 (color amarillo), 221

aminocidos dominio hidrofbico que sirve como ancla. Tomado de Carrada, 2010

Sobre la superficie de la molcula se disponen varias cadenas de carbohidratos que

participan tambin como antgenos funcionales, cuatro cadenas de carbohidratos

complejos en HA1 y uno en HA2 que consisten en N-acetilglucosamina, manosa, y

galactosa y dos cadenas de carbohidratos simples en HA1 que consisten en N-acetil-

glucosamina y manosa. Todas las cadenas estn vinculadas a travs de enlaces N-

glicosdicos a residuos de asparagina (Wilson, et al., 1981). Hay cuatro puentes disulfuro

en el interior de HA1, uno en HA2, y uno en la unin de HA1 y HA2. Los sitios

conservados de glicosilacin son requeridos para la integridad estructural y la estabilidad

para el proceso de la biosntesis y formacin de los viriones (Chen, 2011). Adems, los

glicanos en los eptopes antignicos de la HA intervienen con el acceso de los

anticuerpos neutralizantes evadiendo la respuesta inmune debido a cambios de

aminocidos en la protena que altera el nmero y las posiciones de las glicosilaciones

en la HA, posiblemente dando lugar a la deriva antignica del virus de la influenza (Chen,

et al., 2011).

La HA es el principal antgeno sobre la superficie viral al que los anticuerpos

neutralizantes se dirigen y su variacin antignica es el principal factor en la virulencia y

transmisin del virus de influenza (Steinhauer, 1999; Wilson, 1990). Esta variacin

Captulo 1 27

gentica implica dos procesos separados, el cambio antignico y la deriva antignica, y

afecta la eficacia de las vacunas.

Las vacunas de ADN que codifican a la protena HA comparada con otras protenas del

virus influenza A han demostrado que es mas efectiva en inducir niveles altos de

anticuerpos y respuesta de clulas T, proporcionando una mejor proteccin en ratones

inmunizados con la HA y desafiados con el virus H5N1 (Jiang, et al., 2010) o con el virus

H3N2 (Tang, et al., 2002; Tian, et al., 2006). Igualmente, las vacunas de vectores

recombinantes como son los adenovectores usados para la expresin de la protena HA

han inducido una respuesta humoral y celular y proteccin en cerdos, ratones y pollos al

ser desafiados con virus de influenza del tipo H3N2 (Wesley, et al., 2004), H1N1

pandmico (Steitz, et al., 2010) y H5N1, respectivamente (Gao, et al., 2006; Kopecky-

Bromberg y Palese, 2009; Toro, et al., 2010; Alexander, et al., 2012).

2. - Metodologa

Figura 2-1. Flujograma de la metodologa empleada

30 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

Objetivo No. 1. Identificar la expresin de la glicoprotena Hemaglutinina del virus de influenza porcina (H1N1) clsico en un sistema eucaritico.

2.1 Amplificacin del gen de la Hemaglutinina Para la obtencin del ARN se utiliz un virus de influenza A (H1N1) porcino clsico

aislado en Colombia, el cual forma parte del banco de cepas del grupo de Virologa

Animal, de la Universidad Nacional de Colombia.

2.1.1 Extraccin de ARN del virus de influenza A y sntesis de cDNA

La extraccin del RNA se llev a cabo usando el kit QIAamp Viral RNA Mini Kit

(Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las recomendaciones de la casa comercial.

El RNA extrado se us para obtener cDNA con ayuda de la enzima SuperScript III

Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA), empleando el primer Uni12 cuya

secuencia es: 5- UCGUUUUCGUCC -3 y se encuentra reportada en la literatura

(Hoffman et.al., 2001). Se emple un volumen de reaccin de 13ul conteniendo 5g de

RNA, 0,5l de oligonucletido 5M, 2l de dNTPs 10M (Invitrogen, Carlsbad, CA) y

6,5l de H2O, el cual se incub durante 5 min a 65C. A continuacin, se agreg 4l

tampn 10x, 1l de DTT 0,1M (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1l de RNAsa OUT

(Invitrogen, Carlsbad, CA) y 1l de la enzima transcriptasa reversa III (Invitrogen,

Carlsbad, CA), y se incub durante 1h a 42C.

Captulo 2 31

2.1.2 Diseo de los Oligonucletidos Para amplificar la regin codificante del gen de la hemaglutinina sin codn de parada se

disearon oligonucletidos basados en las secuencias de la Hemaglutinina del virus de

influenza A del tipo H1N1 porcino clsico aislados en Colombia (algunas publicadas en

el Genbank). A cada oligonucletido se le agreg una regin de reconocimiento por la

enzima EcorV o Sal en el extremo 5 con el fin de generar en el producto de PCR

extremos cohesivos o romos para su clonacin.

El oligonucletido antisentido se dise antes del codn de parada de la regin

codificante del gen HA y se agreg al extremo 5 la regin de reconocimiento por la

enzima de restriccin EcorV. Para el oligonucletido con sentido se utiliz el

oligonucletido reportado por Hoffman (2001) para amplificar el gen de la HA (Bm-HA-1).

Este oligonucletido se modific en su extremo 5, se elimin la secuencia que tenia de

enzima de restriccin y se agreg la regin de reconocimiento por la enzima de

restriccin SalI o EcorV. Los oligonucletidos se analizaron con la herramienta

PrimerSelect del paquete de ADNstar para determinar la temperatura de anillaje y la

formacin de posibles estructuras secundarias.

Tabla 2-1. Oligonucletidos empleados para la amplificacin del gen HA. Secuencia de las enzimas de restriccin subrayada.

Oligonucletidos

Gen HA con la enzima SAlI y EcorV

HA sal F- 5-TATTGTCGACAGCAAAAGCAGGGG-3

HA EcorV 1730R 5-GATATCAATGCATATTCTGCACTGC -3

Gen HA con la enzima EcorV

HA EcorV F 5-TATTGATATCAGCAAAAGCAGGGG -3

HA EcorV 1730R 5-GATATCAATGCATATTCTGCACTGC-3

2.1.3 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La tcnica de PCR se realiz de acuerdo a las recomendaciones generales descritas por

la casa comercial productora de la enzima de alta fidelidad Expand High Fidelity PCR

system (Roche, Mannheim, Germany). El gen de la hemaglutinina se amplific en 25 l

de reaccin en una mezcla conteniendo 0,5l de dNTPs 10M (Invitrogen), 0,38l de

32 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

cada oligonucletidos en concentracin de 20M, 1,3 U de ADN polimerasa alta fidelidad

(Roche, Mannheim, Germany), 2.5 l de tampn 10X. Se utiliz un equipo Eppendorf

Mastercycler gradient, 5331 programado de la siguiente manera: 1 precalentamiento a

94C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificacin: denaturacin: 20

segundos a 94C, anillamiento: 30 segundos a 56C y amplificacin: 5 minutos a 72C ,

un ciclo de finalizacin de 10 minutos a 72C y 4C hasta su finalizacin . Los tubos de

PCR se almacenaron a -20C hasta que se realiz el anlisis por electroforesis en gel de

agarosa.

2.2 Clonacin, transformacin y seleccin en el plsmido de transferencia pENTR2B Dual

El producto de PCR se clon en el plsmido pENTR 2B Dual (Invitrogen, Carlsbad,

CA). Este plsmido de transferencia permite la clonacin dirigida del gen HA en un

vector Gateway; adems, optimiza la expresin del gen de inters despus de la

recombinacin con el vector.

2.2.1 Doble digestin de los productos de PCR y del plsmido pENTR2B Dual

Para generar los extremo cohesivos o romos de la clonacin, el plsmido pENTR2B

Dual y los productos de PCR (gen HA) se digirieron con enzimas de restriccin tipo II y se

purificaron a partir de gel. Cada producto de PCR se digiri con las enzimas Sal I y

EcorV o solo con la enzima EcorV (de acuerdo al diseo de los oligonucletidos). El

plsmido se digiri en dos formas: una con las dos enzimas de restriccin Sal I y EcorV

generando extremos cohesivos; y otra con solo la enzima EcorV generando extremos

romos.

Los productos de PCR (inserto gen HA) y el plsmido pENTR2B Dual se sometieron a

digestin con 1U de cada una de las enzimas de restriccin SalI y EcorV (New England

Biolabs, Ipswich, MA), en un volumen final de reaccin de 50 l. A la mezcla de

reaccin se adicionaron 5 l tampn 10X (New England Biolabs, Ipswich, MA) y 0.2 g

Captulo 2 33

BSA-acetilada, y se incub durante 3 horas a 37C. El producto de digestin se someti

a anlisis por electroforesis en gel de agarosa. Es importante recalcar, que los

amplificados no posean un sitio SalI ni EcorV, estos sitios fueron incluidos en los

oligonucletidos sentido y anti-sentido. Para la realizacin de este trabajo se hicieron

aproximadamente 50 ensayos de digestin para la optimizacin de la clonacin.

2.2.2 Electroforesis en Gel de agarosa Se us un total de 5-10l del producto de las reacciones de amplificacin por PCR o de

la doble digestin para la evaluacin en gel de agarosa al 1% (p/v), las muestras fueron

mezcladas con EZ-VISION (Amresco, Solon, OH) el cual cumpli la funcin de buffer de

carga y de revelado para la visualizacin del gel. Para la corrida electrofortica se us el

tampn TAE 1X (Tris-Acetato 0.04 M, EDTA 1mM). y las muestras se sometieron a

electroforesis con voltaje constante (80V) durante 1 hora, empleando una fuente de

poder Power-Pac 300 (Bio-Rad,, Hercules, CA). Como marcador de peso molecular se

us el GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder o Hind III (Fermentas, Waltham, MA)

2.2.3 Purificacin de Insertos y Plsmidos El inserto y el plsmido pENTR2B Dual digerido se purificaron usando el kit Pure Link

TM Quick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA) para la clonacin. En resumen, el

inserto o vector se someti a electroforesis en gel de agarosa al 1.2% (p/v). La banda de

tamao de 1730pb correspondiente al gen HA, y la banda de 3800pb correspondiente al

plsmido pENTR2B Dual fueron extradas del gel. Cada fragmento de gel con la

banda se incub durante 15 minutos a 55C en el tampn GS1, la mezcla se deposit en

una columna Quick gel extraction y se centrifug durante 1 minuto a 10000 rpm

(revoluciones por minuto). Posteriormente se lav con 500 l de tampn GS1, luego con

700 l de tampn W9, dejndolo en la columna por 5 minutos y se centrifug

nuevamente a las mismas condiciones. El ADN se eluy con 50 l de agua estril y se

cuantific usando un Nanodrop (Thermo scientific). El material recolectado se congel

a 20C hasta su utilizacin.

34 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

2.2.4 Ligacin del gen HA en pENTR2B Dual Una vez purificados los productos de digestin mencionados anteriormente se lig el gen

HA en el plsmido de transferencia pENTR2B Dual (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este vector presenta un sitio de clonacin mltiple (sitios de reconocimiento por enzimas de

restriccin), un origen de replicacin pUC, una secuencia kozak para la iniciacin eficaz

de la traduccin en eucariotas, sitios de recombinacin especficos attL1 y attL2, un gen

de resistencia a kanamicina para la seleccin en E.coli y un gen de resistencia a

cloranfenicol (Figura 2-2).

El inserto se lig en el plsmido con 1 unidad de ADN ligasa T4 (New England Biolabs,

Ipswich, MA), cocientes molares 3:1 inserto:vector y se incub durante 1 hora a 25C. La

mezcla se us para transformar bacterias E. coli TOP10 competentes (Invitrogen,

Carlsbad, CA).

Figura 2-2. Mapa del plsmido pENTR2B Dual.

Presenta un gen de resistencia a la kanamicina, pUC ori: un origen pUC de replicacin, una regin de

enzimas de restriccin (Sal I, EcorV), attL1 y attL2: sitios de recombinacin especficos, CmR: un gen de

resistencia al cloranfenicol y el gen ccdB: para la seleccin o muerte de clulas bacterianas

2.2.5 Transformacin de bacterias E. coli competentes Las bacterias E. coli qumicamente competentes (TOP10) se transformaron por choque

trmico. Se depositaron 1-5 l de la mezcla de ligacin en 50 l de bacterias

Captulo 2 35

competentes descongeladas. Se incubaron durante 30 minutos en hielo y se sometieron

a choque trmico durante 30 S 1 min a 42C, trasladndolas inmediatamente a hielo

durante 5 minutos. Las bacterias transformadas se incubaron durante 1 hora a 37C en

agitacin constante (300 rpm) en el medio Luria Bertani (LB) sin antibiticos y

posteriormente se sembraron en medio agar LB con antibitico (Kanamicina, 100 g/ml)

para la seleccin de las bacterias con el inserto. Las unidades formadoras de colonias

(UFC) se crecieron en medio LB lquido para realizar la extraccin del ADN plasmdico y

verificacin de la clonacin.

2.2.6 Extraccin ADN plasmdico Para la extraccin de ADN plasmdico de los clones recombinantes, se sembr una UFC

en medio lquido LB enriquecido con antibitico (Kanamicina o Ampicilina) y se incub

durante 16 horas a 37C a 300 rpm. Luego se transfiri este cultivo a un tubo eppendorf

de 1.5 ml y se centrifug a 10000 rpm por 30 S a 4C. El precipitado de bacterias se

resuspendi en 100 l de la solucin I (50 mM glucosa, 25 mM tris-HCl pH 8.0, 10 mM

EDTA pH: 8.0) y en 200 l de la solucin II (0,2 N NaOH, 1% SDS). Luego se adicion

150 l de la solucin III (AcK 5 M, cido actico glacial 3 M) se mezcl por inversin y se

centrifug a 14000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se mezcl con 2 volmenes de

etanol y se centrifug a las mismas condiciones mencionadas previamente. El producto

obtenido se lav con etanol al 70%. El ADN obtenido se resuspendi en 50 l de agua

estril y se guard a -20C. Una vez verificada la clonacin o la recombinacin se realiz

extraccin de DNA plasmdico con el kit de extraccin

2.2.7 Verificacin de la clonacin de HA en pENTR2B Dual

Anlisis con enzimas de restriccin Para verificar la presencia del inserto en el vector se realiz una doble digestin con las

enzimas, SalI, SspI, BamHI y HpaI. Se utiliz 1U de cada enzima de restriccin en un

volumen final de 20 l de reaccin. Se adicion 6 l tampn 10X (New england

biolabs) a la mezcla de reaccin y 0.2 g BSA-acetilada, y se incub durante 3h a

36 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

37C. El producto de la digestin se someti a un anlisis por electroforesis en gel de

agarosa al 1.2%.

PCR Para verificar la presencia del inserto se realiz PCR con los oligonucletidos del inserto.

El producto de PCR se someti a un anlisis por electroforesis en gel de agarosa al

1.2%.

Secuenciacin Para verificar el marco de lectura y la ligacin del inserto en el plsmido pENTR2B

Dual o pAd/CMV/V5-DEST en la direccin correcta, se realiz secuenciacin en

ambas direcciones en un secuenciador ABI Prism 3100 Avant (Applied Biosystem,

Foster City, CA) usando el kit Big Dye terminador v3.1. Para la secuenciacin se

utilizaron los cebadores T7 sentido y T7 antisentido.

2.3 Recombinacin del plsmido pENTR2B Dual en el adenovector pAd/CMV/V5-DEST

Se realiz una recombinacin entre el plsmido pENTR2B Dual + Inserto (HA) y el

vector pAd/CMV/V5-DEST. Este vector presenta sitios de recombinacin especficos

attL1 y attL2, un gen de resistencia (Ampicilina) para la seleccin en E.coli, un origen de

replicacin pUC, un promotor de citomegalovirus (CMV) de expresin alta y el vector le

confiere a la protena de inters en la regin C-terminal una secuencia de antiV5 para la

identificacin de la protena (Figura2-3). Adems, el vector presenta secuencias del

Adenovirus humano subtipo 5 que codifica genes y elementos (ITRS, secuencias

repetitivas) requeridos para el buen empaquetamiento y produccin del adenovirus.

Para la recombinacin se utiliz una mezcla de 1l vector pAd/CMV/V5-DEST

(150ng/ul), 7ul plsmido pENTR2B Dual + Inserto (HA) (400ng) y 2ul de la enzima

Gateway LR Clonase II. Se incub durante 1h a 25C. Luego se agreg a la

reaccin 1ul de proteinasa K y se incub a 37C por 10min. La reaccin de

recombinacin LR se utiliz para transformar clulas competente E. coli y seleccionar los

Captulo 2 37

clones de expresin. Para seleccionar los clones positivos se realiz PCR, y digestin

por enzimas de restriccin de acuerdo al numeral 2.2.7.

Figura 2-3. Mapa vector de expresin pAd/CMV/V5-DEST.

En la parte superior se muestra los dos sitios de recombinacin attR1 y attR2, la regin de eptope V5 que la

agrega a la protena de inters expresada, un gen de resistencia a la ampicilina, pUC ori: un origen pUC de

replicacin, CmR: un gen de resistencia al cloranfenicol, el gen ccdB: para la seleccin o muerte de clulas

bacterianas, Pcmv: un promotor de citomegalovirus para una alta expresin del gen de inters, ITRs

secuencias repetitivas del adenovirus, y TK: una secuencias de poliadenilacin para la eficiencia de

terminacin de la transcripcin.

.

Una vez seleccionados los clones recombinantes se realiz extraccin de ADN

plasmdico a mediana escala con QIAGEN Plasmid Mini kit y se digiri con la enzima

PacI de acuerdo al numeral 2.2.7. Esta digestin se realiz para eliminar secuencias

bacterianas (origen PUC y gen de resistencia a Ampicilina) y exponer los ITRs virales

izquierdos y derechos para permitir la replicacin y empaquetamiento viral.

38 Antigenicidad de la Hemaglutinina del Virus Influenza Porcina Subtipo (H1N1) Clsico como Candidato a Vacuna en un Vector de Expresin en

Clulas de Mamfero

2.4 Expresin del gen HA en clulas de mamfero (HEK 293-A)

2.4.1 Transfeccin de clulas HEK 293-A Para expresar el gen de la hemaglutinina como una protena recombinante en un sistema

eucaritico, se transfectaron las clulas embrionarias de rin humano (HEK 293-A) con

el vector recombinado pAd/CMV/V5-DEST + inserto (gen HA). Mediante un complejo

liposomal, usando lipofectamina se introdujo el DNA plasmdico a la clula en donde la

interaccin con la membrana celular permiti su absorcin por endocitosis y despus su

liberacin en el citoplasma. La lnea HEK 293-A es una lnea celular establecida de

clulas primarias embrionarias de rin humano modificada con DNA de Adenovirus

humano tipo 5. Estas clulas expresan en cis genes que codifican la regin E1 de

adenovirus y participan en la transactivacin de algunos promotores virales. Adems,

complementa la delecin de E1 en los vectores adenovirales recombinantes

Para la transfeccin de las clulas se sembr el da anterior 350.000 clulas/pozo en una

placa de seis pozos para obtener al da siguiente una confluencia de 90 al 95%. Esto es

para garantizar que un mayor nmero de clulas capturen el ADN y que la tasa de

viabilidad despus de la transfeccin sea alta, ya que los reactivos empleados pueden

ser txicos para la clula.

En cada tubo eppendorf se diluy 1, 2 y 3 ug de AD