Teste de imunofluorescência direta para a detecção dos vírus da Influenza A e B.1. UTILIZAÇÃO PREVISTAO IMAGEN™ Influenza virus A e B é um teste qualitativo por imunofluorescência direta para a detecção e diferenciação dos vírus da influenza A e da influenza B em amostras clínicas ou para a confirmação e diferenciação dos vírus da influenza A e B em culturas celulares.2. RESUMOOs vírus da influenza A e B são membros do género Influenza virus classificados na família Orthomyxoviridae1. As estirpes do vírus influenza A afectam diversos animais, incluindo seres humanos, cavalos, porcos, mamíferos marinhos e aves, ao passo que o vírus da influenza B parece apenas infectar seres humanos2.Nos seres humanos, as infecções pelos vírus da influenza A e B podem provocar doenças respiratórias agudas e, por vezes, graves tanto em indivíduos imunocompetentes, como imunocomprometidos. As infecções virais por influenza A e B ocorrem em epidemias anuais, sendo frequente surgirem e disseminarem-se com rapidez. Estas epidemias podem ocorrer sob a forma de pequenos surtos localizados ou epidemias mundiais, dependendo do tipo de estirpe que prevalece3. Periodicamente, em resultado da contínua evolução dos vírus da influenza A, ocorrem epidemias da doença que podem ter um impacto significativo na saúde mundial2,4. A transmissão das infecções pelo vírus da influenza ocorre através da inalação de gotículas carregadas de vírus provindas de secreções de portadores sintomáticos ou assintomáticos. As condições ambientais, como o excesso de indivíduos num mesmo local, facilitam a transmissão da infecção. A replicação do vírus ocorre nas células epiteliais colunares ciliadas das vias respiratórias superiores e inferiores, resultando em necrose e exsudação das células. O período de maior propagação viral ocorre entre um dia antes e 3 a 4 dias após o início da doença.Durante uma epidemia de influenza, a estirpe viral prevalente pode estar associada a entre 15 e 50% das infecções respiratórias que ocorrem em adultos e crianças. O espectro de doenças respiratórias que ocorrem pode variar desde a doença ligeira das vias respiratórias superiores até à pneumonia grave3. A pneumonia aguda provocada pelos vírus A ou B pode ser fatal, especialmente quando está associada a infecções microbianas concomitantes ou secundárias em pacientes idosos ou imunocomprometidos.Os vírus da influenza foram associados a surtos nosocomiais de infecções das vias respiratórias em enfermarias pediátricas e geriátricas, resultando numa hospitalização prolongada e no aumento da morbilidade e da mortalidade.O diagnóstico laboratorial rápido das infecções pelos vírus da influenza A ou B desempenha um papel importante no tratamento do paciente, influenciando a aplicação da terapêutica antiviral e permitindo o tratamento e o controle efectivos dos surtos3,5. Os métodos de diagnóstico incluem a detecção direta do vírus ou das proteínas virais em amostras clínicas (por exemplo, aspirados

nasofaríngeos), isolamento de vírus viáveis em monocamadas de culturas celulares inoculadas com secreções respiratórias e detecção de imunoglobulinas específicas do vírus da influenza. O isolamento de vírus da influenza a partir de amostras respiratórias pode ser efectuado em linhas celulares, como as de células renais primárias do macaco rhesus, ou de células renais caninas Madin-Darby (MDCK), usando técnicas como a hemadsorção ou a hemaglutinação para identificar a presença da estirpe do vírus. Utilizaram-se diversas técnicas para confirmar a identificação de isolados do vírus da influenza, incluindo a inibição da hemadsorção, a inibição da hemaglutinação, testes de neutralização, a microscopia electrónica ou a imunofluorescência. Estas técnicas são laboriosas, demoradas e requerem um grau de especialização técnica que pode não estar disponível em todos os laboratórios.Os testes de imunofluorescência direta que utilizam anticorpos monoclonais específicos proporcionam um método rápido, sensível e específico para a detecção direta dos vírus da influenza A e B em amostras clínicas, como aspirados nasofaríngeos, ou para a confirmação de vírus da influenza isolados em monocamadas de culturas celulares6. IMAGEN Influenza virus A e B é um teste de imunofluorescência direta para a detecção e a identificação das estirpes A e B do vírus da influenza em amostras clínicas ou culturas celulares. O teste utiliza anticorpos monoclonais específicos da espécie para detectar epítopos das glicoproteínas e proteínas de fusão de vírus da influenza, os quais são específicos para o vírus de tipo A ou o vírus de tipo B.

3. PRINCÍPIO DO TESTE

O IMAGEN Influenza virus A e B contém anticorpos monoclonais conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) específicos para o vírus da influenza A ou para o vírus da influenza B. Estes anticorpos são utilizados numa técnica de imunofluorescência direta unifásica. Incubam-se as amostras com os reagentes do anticorpo conjugado com FITC durante 15 minutos e lava-se o excesso de reagente com soro fisiológico com tampão fosfato (PBS). Montam-se as áreas coradas e observam-se ao microscópio utilizando iluminação por epifluorescência. Caso o vírus da influenza A ou o vírus da influenza B esteja presente, observa-se uma fluorescência verde-maçã brilhante característica com o reagente correspondente, no citoplasma e no núcleo das células, que contrasta com a coloração vermelha de fundo das células não infectadas.Os anticorpos monoclonais utilizados neste teste provieram do Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia, EUA.O imunogénio utilizado para elevar os anticorpos anti-influenza A incluiu as estirpes A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) e A/Bangkok/1/79 (H3N2). O imunogénio utilizado para elevar os anticorpos anti-influenza B incluiu as estirpes B/Lee/40 e B/Singapore /-222/79.4. DEFINIÇÕESOs símbolos que se seguem foram utilizados em todas as informações sobre o produto.

Código do produto e número de catálogo

Consultar as instruções de utilização

N Conteúdo suficiente para <N> ensaios

Fabricante

IMAGEN INFLUENZA VIRUS A AND B

K610511-2 50

Dispositivo médico para diagnóstico in vitro

Utilizar até

Código de lote

Limites de temperatura de armazenagem

5. REAGENTES FORNECIDOS

50 - Cada kit contém materiais suficientes para testar 50

preparações de culturas celulares. - A duração em armazenagem do kit está indicada no rótulo da embalagem exterior.5.1. REAGENTES DO IMAGEN INFLUENZA VIRUS A E B

Um folheto de Instruções de utilização.Lâminas de controle positivo de 2 x 2 poços contendo células renais do macaco verde africano (Vero) fixadas em acetona com vírus da influenza A ou com vírus da influenza B, em áreas de poços separadas.

Um frasco de cada um dos seguintes: 3mL de líquido para montagem. O líquido para montagem contém um inibidor de fotobranqueamento em solução de glicerol (pH 10,0)1,4mL de reagente de teste IMAGEN Influenza A virus O reagente contém anticorpos monoclonais murinos purificados específicos para o vírus da influenza A, conjugados com FITC. Os anticorpos monoclonais ligam-se especificamente à proteína da matriz e à nucleoproteína do vírus da influenza A.1,4mL de reagente de teste IMAGEN Influenza B virus O reagente contém anticorpos monoclonais murinos purificados específicos para o vírus da influenza B, conjugados com FITC. Os anticorpos monoclonais ligam-se especificamente à nucleoproteína e à proteína hemaglutinina do vírus da influenza B.

5.2. PREPARAÇÃO, ARMAZENAGEM E REUTILIZAÇÃO DOS COMPONENTES DO KIT

Para que o kit tenha um desempenho óptimo, é importante que todos os seus componentes que ainda não tenham sido utilizados sejam armazenados de acordo com as instruções abaixo.5.3. LÂMINAS DE CONTROLE POSITIVO - As lâminas de controle positivo são fornecidas individualmente em bolsas de folha de alumínio com nitrogénio. Armazene as lâminas que ainda não foram utilizadas entre 2-8°C. A lâmina deve ser deixada dentro da bolsa durante 5 minutos, à temperatura ambiente (15-30°C), antes da abertura.Core a lâmina imediatamente após a abertura.

5.4. LÍQUIDO PARA MONTAGEM - Pronto para ser utilizado. Armazene entre 2-8°C. O líquido para montagem deve ser deixado à temperatura ambiente (15-30°C), durante 5 minutos, antes da utilização.5.5. REAGENTES DO IMAGEN INFLUENZA A E B - /

Prontos para ser utilizados. Armazene o Reagent A e o Reagent B, antes da abertura, entre 2-8°C. Os reagentes devem ser

armazenados no escuro, entre 2-8°C e deixados à temperatura ambiente (15-30°C), durante 5 minutos, antes da utilização. 6. REAGENTES ADICIONAIS6.1. REAGENTESAcetona preparada no dia de utilização (para a fixação).Soro fisiológico com tampão fosfato (PBS), a pH 7,5, para lavar as amostras coradas e para a preparação das amostras.6.2. ACESSÓRIOSOs produtos abaixo indicados destinam-se a ser utilizados em conjunto com o IMAGEN Influenza Virus A e b. Contactar a filial ou o distribuidor local da Oxoid para obter mais informações.GeralLâminas de microscópio de vidro revestidas com teflon com um poço único de 6mm de diâmetro (100 lâminas por caixa), disponibilizadas pela filial ou pelo distribuidor local da Oxoid (NO de código S611430-6).IMAGEN Influenza Positive Control Slide (NO de código S611230-2).7. EQUIPAMENTOÉ necessário o seguinte equipamento:Pipeta de precisão e pontas descartáveis para medir 25μLTanque de lavagemLamela cobre-objectos adequada para um poço de 6mm de diâmetroÓleo de imersão não fluorescenteMicroscópio de epifluorescência com sistema de filtração para FITC (comprimento máximo de onda de excitação 490nm, comprimento médio de onda de emissão 520nm) e ampliação de x200 a x500Incubadora a 37°CCentrífuga de baixa velocidadePara amostras diretasExtractor de muco (apenas amostras nasofaríngeas)Para confirmação de culturasZaragatoas estéreis, meio de transporte viral (VTM) e recipiente adequado à recolha, transporte e cultura de vírus da influenzaLinhas celulares recomendadas para a cultura e isolamento de vírus da influenza8. PRECAUÇÕES

- Apenas para utilização diagnóstica “in vitro”. Os ensaios feitos com este produto devem ser levados a cabo apenas por pessoal versado em procedimentos de laboratório que tenha recebido a devida formação em termos da utilização do produto. 8.1. PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA8.1.1 Os reagentes IMAGEN Influenza A e B contêm azida

sódica a 15mmol/L, que é venenosa. A azida sódica pode reagir com a tubagem de chumbo e cobre, formando azidas metálicas altamente explosivas. Descarte sempre os materiais que contém azida lavando com grandes quantidades de água.

8.1.2 Os vírus influenza A e B foram processados no controle positivo por métodos de fixação de forma a que não contenham microrganismos vivos detectáveis; esta lâmina deve contudo ser processados e descartados como se fossem infecciosos.

PT

8.1.3 Se, com base nos actuais critérios de rastreio clínico e epidemiológico recomendados pelas autoridades de saúde pública, se suspeitar de uma infecção provocada por um novo vírus influenza A, devem ser colhidas amostras, seguindo as devidas precauções de controle de infecções para novos vírus influenza virulentos, que devem, em seguida, ser enviadas para laboratórios centrais de referência, para serem testadas. Nestes casos, não se deve tentar proceder à cultura viral, a não ser que estejam disponíveis instalações de segurança biológica de nível 3 ou superior para receber e cultivar as amostras.

8.1.4 O reagente contém o corante azul Evans. Este pode ser carcinogénico, devendo evitar-se o contato com a pele.

8.1.5 O utilizador deve m anusear o l íquido para montagem com cuidado, pois o mesmo pode causar irritação da pele. Caso ocorra o contato com a pele, lavá-la repetidamente com água.

8.1.6 Não comer ou beber, não armazenar ou preparar alimentos nem aplicar cosméticos dentro da área de trabalho designada.

8.1.7 Não utilizar a boca para pipetar os materiais.8.1.8 Envergar luvas descartáveis ao manusear as amostras

clínicas e células infectadas, lavando sempre as mãos depois de trabalhar com materiais infecciosos.

8.1.9 Descartar todas as amostras clínicas em conformidade com os regulamentos locais.

8.1.10 Encontra-se disponível aos utilizadores profissionais, mediante pedido, a folha de dados de segurança.

8.2. PRECAUÇÕES TÉCNICAS8.2.1 Os componentes não podem ser utilizados após a

data de validade impressa nos rótulos. Não misture ou troque lotes/remessas diferentes de reagentes.

8.2.2 Os reagentes são fornecidos em concentrações operacionais fixas. O desempenho do teste é afectado negativamente se os reagentes forem armazenados sob condições que não as indicadas na Secção 5.

8.2.3 Prepare a quantidade necessária de Soro fisiológico com tampão fosfato (PBS) no próprio dia.

8.2.4 A lavagem tem de ser efectuada em PBS. A utilização de outras soluções de lavagem, como água da torneira ou água destilada, compromete os resultados do teste.

8.2.5 Evite a contaminação microbiana dos reagentes.8.2.6 Os reagentes não podem estar congelados.9. RECOLHA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS7,8

A recolha e a preparação das amostras é de importância fundamental para o diagnóstico de virus de influenza por imunofluorescência direta e métodos de cultura celular. As amostras têm de ser recolhidas do local principal da infecção, sendo preparadas de forma a preservar ou células intactas sem muco aderente, etc, para microscopia direta das amostras, ou a viabilidade dos vírus nas amostras a cultivar.9.1. AMOSTRAS CLÍNICAS9.1.1 Aspirados/secreções nasofaríngeosRecolha As secreções da região nasofaríngea devem ser recolhidas para um extractor de muco por meio de uma sonda de alimentação de tamanho 8. O extractor de muco e a tubagem devem ser mantidos entre 2-8ºC e enviados para o laboratório para processamento logo que possível.

Separação das célulasSe necessário, adicione 2mL de soro fisiológico com tampão fosfato (PBS) à amostra antes da centrifugação para reduzir a viscosidade e diluir o muco. Centrifugue o extractor de muco à temperatura ambiente (15-30°C), durante 10 minutos, a 380g. Remova o sobrenadante, que pode ser utilizado para cultura de células. Ressuspenda o depósito de células em 2mL de PBS e pipete com cuidado as células, para cima e para baixo, com uma pipeta de ponta larga, ou agite no vórtice com cuidado, até que o muco se degrade e o material celular seja libertado. Evite pipetar ou agitar no vórtice com força, para não danificar as células. Após a obtenção de uma suspensão homogénea, adicione mais PBS, conforme necessário, pipetando ou agitando no vórtice após a adição do PBS extra para lavar melhor as células. Remova e descarte quaisquer vestígios visíveis de muco que ainda subsistam nesta altura. O excesso de muco tem de ser removido, já que impede a penetração adequada do reagente e pode resultar em fluorescência não específica.Se todas as secreções permanecerem na sonda de alimentação e nenhuma atingir o extractor de muco, remova todas as secreções da sonda lavando com PBS. A melhor forma de o fazer é introduzir uma pipeta de Pasteur na extremidade da sonda que estava ligada ao extractor de muco. Sugue o líquido necessário para dentro da sonda e expila-o repetidamente, até as secreções se desprenderem da parede do tubo. Pipete a suspensão para cima e para baixo até o muco estar suficientemente degradado.Preparação das lâminasApós efectuar o processo de separação das células, centrifugue a suspensão celular daí resultante à temperatura ambiente (15-30°C), durante 10 minutos, a 380g e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o depósito de células numa quantidade de PBS suficiente para diluir qualquer muco que ainda esteja presente, mas mantendo, simultaneamente, uma densidade celular elevada. Pipete 25μL do depósito de células ressuspendido para as áreas de poços na lâmina.Deixe a amostra secar bem ao ar, à temperatura ambiente (15-30°C) e fixe com acetona preparada no própria dia, à temperatura ambiente (15-30°C), durante 10 minutos. Se a amostra não for corada imediatamente, armazene a –70°C até que seja necessária. As lâminas armazenadas devem ser analisadas até duas semanas após a preparação, já que se podem deteriorar se a duração de armazenagem for muito longa.9.2. CULTURA CELULARInoculação das culturas celularesAs amostras recolhidas para o diagnóstico de infecções pelo vírus da influenza devem ser inoculadas nas linhas celulares normalmente utilizadas no laboratório de acordo com os métodos laboratoriais estabelecidos. Devem examinar-se regularmente as culturas celulares para verificar a ocorrência de efeito citopático (ECP), executando-se testes de hemadsorção em intervalos regulares. Pode recolher-se uma amostra e testar a presença de vírus da influenza A ou B em quaisquer culturas que exibam hemadsorção ou em culturas celulares que apresentem ECP.Preparação das lâminasRaspar, com uma pipeta esterilizada, o conteúdo da folha celular para cima do meio de cultura. Deposite as células por centrifugação a 200g, durante 10 minutos, à temperatura ambiente (15-30°C) e remova o sobrenadante.Lave as células ressuspendendo o depósito em PBS e repita a centrifugação. Remova o sobrenadante e ressuspenda o depósito de células num pequeno volume de PBS fresco de forma a manter

uma elevada densidade celular.Distribua alíquotas de 25μL da suspensão celular pelos poços individuais das lâminas. Deixe secar bem ao ar e fixe em acetona preparada no próprio dia, à temperatura ambiente (15-30°C), durante 10 minutos. Se a amostra não for corada imediatamente, armazene a 4°C durante a noite ou a –70°C até que seja necessária. As lâminas armazenadas devem ser analisadas até duas semanas após a preparação, já que se podem deteriorar se a duração de armazenagem for muito longa.10. PROCEDIMENTO DE TESTECONSULTE POR FAVOR A SECÇÃO 8.2 DAS PRECAUÇÕES TÉCNICAS ANTES DE PROCEDER AO TESTE10.1. ADIÇÃO DE REAGENTEAdicione 25μL do Reagent A a uma área da preparação celular fixada num poço de 6mm e 25μL do Reagent B a outra área da preparação celular fixada noutro poço de 6mm da lâmina (ver Secção 6) ou aos respectivos poços da lâmina de controle positivo. Assegure-se de que os reagentes cobrem a totalidade das áreas dos poços. gente A, deve ser usado em um poço positve Reagente B e tem de ser utilizado em B poço positivo.10.2. PRIMEIRA INCUBAÇÃOIncube as lâminas com os reagentes numa câmara húmida, durante 15 minutos, a 37°C. Não deixe o reagente secar sobre a amostra, já que tal provoca o aparecimento de coloração não específica.10.3. LAVAGEM DA LÂMINALave o excesso de reagente com soro fisiológico com tampão fosfato (PBS), lavando em seguida a lâmina num tanque de imersão de agitação, contendo PBS, durante 5 minutos. Escorra o PBS e deixe a lâmina secar ao ar à temperatura ambiente (15-30°C).

10.4. ADIÇÃO DO LÍQUIDO PARA MONTAGEMAdicione uma gota do líquido para montagem ao centro de cada poço e coloque uma lamela sobre o mesmo e a amostra, assegurando-se de que não ficam retidas quaisquer bolhas de ar.10.5. LEITURA DA LÂMINAExamine a totalidade das áreas dos poços que contêm a amostra corada através de um microscópio de epifluorescência. A fluorescência, tal como é descrita na Secção 11, deverá ser visível a uma ampliação de x200 a x500. Para obter os melhores resultados, devem examinar-se as amostras imediatamente após a coloração, mas estas podem ser armazenadas entre 2-8°C, no escuro, durante até 24 horas.11. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DO TESTE11.1. CONTROLES11.1.1 Lâminas de controle positivoQuando corada e visualizada tal como é descrito na Secção 10, a lâmina de controle positivo deverá revelar células com fluorescência verde-maçã intracelular nuclear e/ou citoplasmática, contrastando com um fundo de material contracorado. Estas células são ligeiramente maiores do que as células epiteliais respiratórias, mas exibem uma fluorescência nuclear e/ou citoplasmática semelhante quando infectadas pelos vírus da influenza. As lâminas de controle positivo devem ser utilizadas para verificar se o procedimento de coloração foi devidamente efectuado.Estas lâminas são preparadas a partir de estirpes do vírus da influenza em monocamadas de culturas celulares e apenas

permitem o controle adequado do procedimento de teste, não dos passos de processamento da amostra. Os procedimentos de processamento da amostra devem ser controlados por meio de material clínico.11.1.2 Controle negativoCaso seja necessário um controle negativo, recomenda-se a utilização de células intactas não infectadas do tipo usado para a cultura e isolamento do vírus da influenza. As células devem ser preparadas e fixadas tal como descrito na Secção 9.2 e coradas de acordo com a Secção 10.11.2. AMOSTRAS CLÍNICAS11.2.1 Aspecto das células infectadas pelo vírus da influenzaAs células epiteliais respiratórias infectadas pelo vírus da influenza exibem uma fluorescência verde-maçã granular intracelular, nuclear e/ou citoplasmática.As células não infectadas são coradas de vermelho pelo contracorante azul Evans.11.2.2 InterpretaçãoO diagnóstico é positivo quando uma ou mais células da amostra corada fixada exibem fluorescência específica, descrita na Secção11.2.1, seja com o reagente do vírus da influenza A ou o reagente do vírus da influenza B.O diagnóstico é negativo quando as amostras coradas e fixadas não exibem fluorescência com nenhum dos reagentes.No caso de amostras de aspirado nasofaríngeo coradas directamente, têm de se observar pelo menos 20 células epiteliais respiratórias não infectadas antes de se concluir por um resultado negativo. Consulte a Secção 11.2.3 caso o número de células seja insuficiente.No caso de amostras recolhidas em outros locais (por exemplo, de expectoração), têm de se observar pelo menos 50 células epiteliais respiratórias não infectadas antes de se concluir por um resultado negativo.11.2.3 Número de células insuficiente Se o número de células presentes na lâmina for insuficiente, deve centrifugar o resto da amostra clínica a 380g, durante 10 minutos, à temperatura ambiente (15-30°C). Ressuspenda as células num volume de PBS menor antes da redistribuição (25μL) pelas áreas dos poços. Em alternativa, pode pedir uma nova amostra clínica.11.3. CONFIRMAÇÃO DA CULTURA CELULAR11.3.1 Aspecto das células infectadas pelo vírus da influenzaAs células infectadas apresentam uma fluorescência verde-maçã intracelular, nuclear e/ou citoplasmática e devem ser consideradas positivas quanto à presença de influenza.As células não infectadas são coradas de vermelho pelo contracorante azul Evans e devem ser consideradas negativas quanto à presença de influenza.11.3.2 Interpretação dos resultadosO diagnóstico é positivo quando uma ou mais células da amostra corada fixada exibem o padrão de fluorescência típico descrito Secção11.3.1, seja com o reagente IMAGEN Influenza A, seja com o reagente IMAGEN Influenza B.Têm de estar presentes na lâmina pelo menos 50 células não infectadas da cultura celular que está a ser testada antes de se concluir por um resultado negativo. Consulte a Secção 11.2.3 caso

o número de células seja insuficiente.11.3.3 Células insuficientesSe o número de células presentes na lâmina for insuficiente, deve centrifugar o resto da amostra clínica a 200g, durante 10 minutos, à temperatura ambiente (15-30°C). Ressuspenda as células num volume de PBS menor antes da redistribuição (25μL) pelas áreas dos poços. Em alternativa, pode pedir uma nova amostra clínica.12. LIMITAÇÕES DO DESEMPENHO12.1. Utilize apenas o líquido para montagem fornecido.12.2. O aspecto visual da imagem obtida por fluorescência

pode variar com o tipo de microscópio e com a fonte de luz usada.

12.3. Recomenda-se a utilização de 25μL de reagente para cobrir uma área de poço de 6mm de diâmetro. Uma redução deste volume pode levar a dificuldades na cobertura da área da amostra, podendo reduzir a sensibilidade.

12.4. Todos os reagentes são fornecidos em concentrações operacionais fixas. O desempenho do teste pode ser afectado caso os reagentes sofram qualquer tipo de modificação ou não sejam armazenados nas condições recomendadas.

12.5. A incapacidade de detectar os vírus da influenza pode resultar de factores como a recolha da amostra num momento inadequado da doença, a amostragem e/ou manuseamento incorretos da amostra, a falha da cultura celular, etc. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de infecção pelo vírus da influenza.

12.6. O teste IMAGEN Influenza virus A e B detecta antígenos da influenza A e B específicos dos tipos. Não pode, assim, ser usado para a identificação de subtipos da influenza A e B.

12.7. A presença do vírus da influenza nas secreções nasofaríngeas não exclui necessariamente a possibilidade de infecção concomitante por outros agentes patogénicos. Os resultados do teste devem ser interpretados em conjunto com informações disponíveis em estudos epidemiológicos, o diagnóstico clínico do paciente e outros procedimentos diagnósticos.

12.8. Por vezes, observa-se uma coloração não específica como artefacto do teste imunocitoquímico, devido à ligação entre as regiões Fc do anticorpo e o antígeno da proteína A encontrado na parede celular de algumas estirpes de Staphylococcus aureus9. O reagente do teste IMAGEN Influenza virus A e b foi modificado de forma a não se ligar à proteína A da estirpe Cowan 1 de Staphylococcus aureus.

12.9. Os resultados do teste devem ser interpretados em conjunto com informações disponíveis em estudos epidemiológicos, a avaliação clínica do paciente e outros procedimentos diagnósticos.

12.10. Indivíduos que tenham recebido a vacina contra o vírus influenza A administrada por via nasal poderão apresentar resultados de teste positivos até um período de três dias após a vacinação.

13. VALORES ESPERADOSNas zonas temperadas, os surtos de influenza causados tanto pelo tipo A, como pelo tipo B, ocorrem principalmente entre o fim do Outono e o início da Primavera, mas nas zonas tropicais a época de prevalência é menos bem definida.

No geral, as taxas de infecção relativas ao vírus da influenza A em crianças e adultos não imunizados são semelhantes, apresentando as manifestações clínicas da infecção uma correlação inversa com a idade10,11,12. Durante o inverno, quando o vírus da influenza prevalente já está em circulação há alguns anos e, em consequência, uma boa parte da população está imune, verifica-se que estes vírus podem ser responsáveis por aproximadamente 15% de todas as infecções respiratórias. Após a introdução de uma nova estirpe antigénica do vírus da influenza na comunidade, para a qual uma boa proporção dos indivíduos expostos não possui imunidade, a estirpe do vírus da influenza pode causar até 50% de todas as infecções respiratórias. Num surto definido e reconhecido, a taxa de detecção pode aproximar-se dos 100% se se utilizarem métodos serológicos e métodos de detecção dos antígenos para o diagnóstico15.14. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DO DESEMPENHO14.1. REACTIVIDADE DOS ANTICORPOS MONOCLONAISDemonstrou-se por imuno-ensaio que os anticorpos monoclonais utilizados neste teste são específicos para estes tipos. Os anticorpos contra o vírus da influenza A detectam as estirpes H1N1, H2N2, H3N2 deste vírus, detectando os anticorpos contra os vírus da influenza B vários destes vírus recolhidos entre 1940 e 19846,16,17.14.2. ESTUDOS CLÍNICOSO teste IMAGEN Influenza virus A e B foi avaliado para uso directo em dois centros de ensaios clínicos utilizando secreções nasofaríngeas e expectoração recolhidos de crianças e adultos hospitalizados com sintomas de infecção respiratória. O teste foi também avaliado em cinco centros de ensaio em culturas celulares de estirpes do vírus armazenadas para confirmar a presença de vírus da influenza. Estes estudos foram efectuados nos EUA, na Europa e no Extremo Oriente.

Os centros de ensaio efectuaram testes directos em 213 amostras clínicas e em 227 amostras para confirmação de culturas celulares. As estirpes detectadas pelos anticorpos monoclonais do teste IMAGEN Influenza virus A e B incluíram 22 estirpes diferentes do vírus da influenza A e 20 estirpes diferentes do vírus da influenza B. Os métodos padrão (referência) utilizados foram o teste de imunofluorescência direta efectuado directamente nas amostras e a cultura dos vírus em células renais de babuíno, células MDCK ou ovos de galinha embrionados. As culturas virais positivas foram confirmadas por imunofluorescência indirecta através de anticorpos monoclonais e policlonais, ou por inibição da hemaglutinação (HAI). 14.3. DESEMPENHO CLÍNICO14.3.1 Amostras diretasAs amostras clínicas foram recolhidas principalmente nos invernos de 1984 a 1987, tendo os centros de ensaio comparado o teste IMAGEN Influenza virus A e B com os métodos padrão. Para estas avaliações utilizaram-se tanto amostras clínicas frescas, como anteriormente congeladas.O resultado do método de referência era considerado positivo se a cultura celular ou a imunofluorescência indirecta da amostra direta fossem positivas. Este procedimento permitiu que se detectasse a presença de vírus não viáveis por fluorescência ou que se detectasse vírus não ligados a células por cultura celular.A Tabela 14.3.1 apresenta os resultados obtidos com o reagente do IMAGEN Influenza virus A. A incidência global da influenza A nestas populações foi de 24,9%. Os resultados do IMAGEN Influenza A estão correlacionados com os testes padrão em 211

casos (99,1%). A sensibilidade do teste foi de 96,2% (51/53), tendo a especificidade sido de 100% (160/160), partindo do princípio de que os testes padrão são 100% sensíveis e específicos. Os valores de previsão de resultados positivos e negativos foram de 100% (51/51) e 98,8% (160/162), respectivamente.A sensibilidade, a especificidade e os valores de previsão foram calculados da forma anteriormente descrita18.A Tabela 14.3.2 apresenta os resultados obtidos com o reagente do IMAGEN Influenza virus B. A incidência global da influenza B nestas populações foi de 7,0%. Este facto reflecte a baixa prevalência da influenza B na Europa durante os ensaios clínicos. Os resultados do IMAGEN Influenza B estão correlacionados com os testes padrão em 210 casos (98,6%). A sensibilidade do teste foi de 86,7% (13/15) e a especificidade de 99,5% (197/198). Os valores de previsão de resultados positivos e negativos foram de 92,9% (13/14) e 98,9% (197/199), respectivamente.Tabela 14.3.1 Comparação dos resultados do teste com utilização direta do reagente do IMAGEN Influenza virus A em amostras clínicas com os testes padrão

TESTE RESULTADOSMétodo padrão Neg Pos Pos NegIMAGEN Influenza virus A Neg Pos Neg PosCentro 1 59 35 1 0Centro 2 101 16 1 0N° total de amostras (213) 160 51 2 0

Tabela 14.3.2 Comparação dos resultados do teste com utilização direta do reagente do IMAGEN Influenza virus B em amostras clínicas com os testes padrão

TESTE RESULTADOSMétodo padrão Neg Pos Pos NegIMAGEN Influenza virus B Neg Pos Neg PosCentro 1 81 12 1 1Centro 2 116 1 1 0N° total de amostras (213) 197 13 0 1

14.3.2 Confirmação de culturasCinco centros de ensaio testaram o teste IMAGEN Influenza virus A e B em isolados clínicos e em estirpes armazenadas isoladas em cultura celular. O isolamento do vírus foi efectuado em células renais de macaco babuíno primárias ou secundárias, ou ainda em células renais caninas Madin-Darby (MDCK). As culturas celulares foram lavadas em PBS antes de serem colocadas nas lâminas (ver Secção 9.2). As lâminas foram fixadas em acetona e testadas com os reagentes do IMAGEN Influenza virus A e b. Para esta avaliação utilizaram-se tanto isolados clínicos frescos, como amostras anteriormente congeladas.Avaliou-se um total de 227 culturas, incluindo 54 culturas com resultados positivos para o vírus A e 30 culturas com resultados positivos para o vírus da influenza B. Os isolados das culturas celulares foram confirmados por imunofluorescência ou por inibição da hemaglutinação (HAI).Os resultados (Tabelas 14.3.3 e 14.3.4) indicam que o reagente do vírus da influenza A detectou todos os vírus deste tipo isolados (sensibilidade 100%) e o reagente do vírus da influenza B detectou todos os vírus deste tipo isolados (sensibilidade 100%).

A especificidade de ambos os reagentes foi de 100%.Tabela 14.3.3 Comparação dos resultados do teste com utilização do reagente do IMAGEN Influenza virus A em culturas de confirmação com os testes padrão

TESTE RESULTADOSMétodo padrão Neg Pos Pos NegIMAGEN Influenza virus A Neg Pos Neg PosCentro 1 59 13 0 0Centro 2 27 1 0 0Centro 3 43 13 0 0Centro 4 23 22 0 0Centro 5 21 5 0 0N° total de amostras (227) 173 54 0 0

Tabela 14.3.4 Comparação dos resultados do teste com utilização do reagente do IMAGEN Influenza virus B em culturas confirmação com os testes padrão

TESTE RESULTADOSMétodo padrão Neg Pos Pos NegIMAGEN Influenza virus B Neg Pos Neg PosCentro 1 69 3 0 0Centro 2 25 3 0 0Centro 3 54 2 0 0Centro 4 27 18 0 0Centro 5 22 4 0 0N° total de amostras (227) 197 30 0 0

14.4. REACTIVIDADE CRUZADAO teste IMAGEN Influenza virus A e B foi efectuado em preparações de outros vírus e organismos passíveis de estarem presentes em secreções respiratórias ou culturas celulares. Todos os organismos testados (Tabela 14.4) apresentaram resultados negativos com ambos os reagentes do IMAGEN Influenza virus A e b.Tabela 14.4 Organismos analisados com o teste IMAGEN Influenza virus A e B cujos resultados foram negativos

Acholeplasma laidlawii Mycoplasma pneumoniaeAdenovirus tipos 1 5 e 7 Mycoplasma salivariumBordetella parapertussis Mycoplasma oraleBordetella pertussis Mycoplasma hominisBranhamella catarrhalis Mycoplasma argininiCandida albicans Mycoplasma hyorhinusChlamydia psittaci Neisseria meningitidis AChlamydia trachomatis Neisseria meningitidis BVírus Coxsackie tipos A9 e B4 Neisseria lactamicaCitomegalovírus Neisseria perflavaEcovírus tipos 3, 6, 9, 11 e 22 Neisseria cinerareaVirus de Epstein-Barr Vírus da parainfluenza tipos 1,

2 e 3Espumavírus Pneumocystis cariniiVírus do herpes simples tipos 1 e 2

Vírus da polio tipos 1 e 2

Legionella pneumophila Vírus sincicial respiratórioVírus do sarampo RinovírusVírus da papeira Vírus do símio tipos 5 e 40Mycobacterium tuberculosis Staphylococcus aureusMycobacterium avium Streptococcus gps A,B,C,D F e G

Mycobacterium intracellulare Virus da varicela zoster

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