análises físico-químicas e bacteriológicas de mel
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUÍMICA
CURSO DE ANÁLISES
FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS DE
MEL DE ABELHA
São Luís
2008
1 INTRODUÇÃO
O mel floral é um produto obtido do néctar das flores, que é processado por
insetos sociais em especial as abelhas, que possuem toda a sua anatomia adaptada,
onde sua anatomia interna é utilizada para armazenar, transportar o néctar das
flores, bem como transformar o néctar em mel e transportar a água coletada no
campo (ANEXO A). Segundo Guedes (2000), em artigo para o Almanaque Rural
Apicultura, as abelhas então produzem o mel com características que variam de
acordo com o tipo floral visitado. (Figura 1).
Figura 1 - Abelha sem ferrão não identificada.
Para produzir 100 g de mel uma abelha deve visitar cerca de um milhão de
flores com ajuda de sua problocide (tromba), a abelha suga o néctar e o armazena
em seu estômago de mel, voltando para a colméia. Uma abelha sem carga voa a 65
km/h, juntando-se a sua colheita, cujo peso pode alcançar 1/4 do peso do seu corpo,
ela diminui a sua velocidade de vôo para 30 km/h. Para obter 1 kg de mel, a abelha
deve levar para colméia de 120.000 a 150.000 cargas de néctar. Se as flores, das
quais as abelhas coletam a substância adocicada, estão a 1,5 km da colméia, para
transportar cada 963 cargas cada abelha terá que voar 3 km. Conseqüentemente
deverá percorrer um total de 360.000 a 460.000 km, para produzir um quilo de mel.
(FUENTES, 2004).
Nos tempos antigos fazia-se abundante consumo de mel como alimento
promovedor de saúde e longevidade. A exemplo de Hipócrates, Pitágoras e tantos
outros. Com a descoberta do açúcar de cana, e mais recentemente com os
adoçantes químicos artificiais, o consumo de mel como alimento infelizmente caiu
em desuso. Essa substituição trouxe enormes prejuízos ao homem.
Mel de abelhas é o único alimento que não apodrece. Os arqueólogos
encontraram mel nas tumbas egípcias com mais de 2.000 anos no estado
cristalizado, em perfeito estado de conservação. Tanto que para validade do mel, é
apenas simbólica, sendo concedido o prazo máximo de alimentos, que é de dois
anos, além da observação de que é melhor “consumir até...”, o que não quer dizer
que após aquela data o produto esteja estragado.
Mel de abelhas é ao mesmo tempo alimento e medicamento, já afirmava
Hipócrates o pai da medicina. O mel faz bem ao: coração, fígado, intestino, pulmões,
pele, boca, rins e praticamente a todo corpo humano, sem nenhuma contra
indicação.
Seu uso diário, em substituição ao açúcar industrializado, só traz vantagens
à saúde, principalmente à prevenção de cáries e o desaparecimento de gorduras
localizadas, comuns aos consumidores de açúcar. (NATIPE, 2002).
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 História do surgimento das abelhas
Há evidências de que as plantas eram polinizadas por abelhas desde o
período terciário. Entre 24 e 40 milhões de anos atrás, já havia abelhas Pebleia sp
(Figura 2) e Proplebeia (Mirins), seus fósseis foram encontrados na atual República
Dominicana, no Caribe, perfeitamente conservados em âmbar. Um fóssil de Trigona
sp (Figura 3) com 30 milhões de anos foi encontrado na Sicília e há outros de
diferentes regiões, datados em 40 milhões de anos. Essas relíquias indicam que no
período Eoceno já havia abelhas especializadas em determinadas plantas e que a
maioria dos grupos conhecidos hoje já existia. Alguns estudiosos acreditam que a
origem das abelhas tenha ocorrido no período Cretáceo, devido à descoberta de
fóssil de Meliponae em New Jersey, América do Norte, sendo datada em 80 milhões
de anos, idade que corresponde à Era Cretácea. (GUEDES, 2000).
Figura 2 - Abelha Plebéia sp. Figura 3 - Trigona sp na flor
de coroa-de-cristo.
2.1.1 Primeiros Apicultores
Acredita-se que os primeiros apicultores da história foram os egípcios,
porque já criavam abelhas em potes de barro no ano 2.400 a.C. Prática que foi
imortalizada nas paredes de suas pirâmides. No entanto, há registros que vinculam o
pioneirismo a outro lugar. Os hindus já apreciavam mel em 6.000 a.C. e utilizavam
própolis como cicatrizante. O mel também fazia parte do cardápio dos Sumérios
(Figura 4) em 5.000 a.C. e havia colméias na ilha de Creta por volta de 3.400 a.C.
(GUEDES, 2000).
Tumba de Pa-bu-sa. Luxor. Egipto.
Cueva de la Araña, em Bicorp (Valencia, Espana)
Figura 4 - Pinturas Rupestre de aproximadamente 8.000 e 630 a.C. 2.1.2 Apicultura no Brasil
2.1.2.1 Meliponicultura
Até 1840 as abelhas criadas no Brasil eram as nativas dos gêneros
Lestrimellitini, Trigonini e Meliponini (Meliponae) (Figura 5), onde a sua maioria no
mundo habita as regiões tropicais e subtropicais do país. Adaptadas ao meio
ambiente são fundamentais para polinização de algumas espécies vegetais, porém
inúmeras abelhas já foram extintas pelas queimas e desmatamentos provocados
pelo homem. (GUEDES, 2000).
Figura 5 - Mandassaia (Melipona quadrifasciata)
Segundo o Dr. Paulo Nogueira Neto, estudioso das abelhas Meloponineos
para o Museu Nacional, primeiro a ensaiar uma criação científica, as velas, de muitos
lugares da América Latina, são feitas de cera produzidas pelas abelhas. Segundo
este estudioso “é provável que a maior parte do mel e da cera usados nos três
primeiros séculos após o descobrimento viesse da abelha Urussú, a mais vulgar e a
mais abundante em todo o Brasil” (NOGUEIRA NETO apud MEL E ABELHAS
BRASILEIRAS, 2004).
Entre 1850 e 1870 o brilhante farmacêutico Theodoro Peckolt ocupou-se em
classificar e estudar as Trigonildas, abelhas sociais do Brasil. As abelhas bem como
as observações biológicas de Peckolt foram enviadas a Frederic Smith, do British
Musseum em remessas sucessivas. O pesquisador britânico fez uma monografia
sobre as abelhas sociais do Brasil. (MEL E ABELHAS BRASILEIRAS, 2004).
Nos estudos químicos realizados por Peckolt há a constatação de ausência
de sacarose em alguns méis indígenas. Essa constatação química serviu de pretexto
para que Rodolfo não incluísse a produção das abelhas nativas na farmacopéia
brasileira (MEL E ABELHAS BRASILEIRAS, 2004).
Os farmacêuticos brasileiros passaram quase toda a década de 40 do século
XX tentando revisar a farmacopéia brasileira. Entre os quais estava o mel, tendo
como grande defensor Elsior Coutinho que publicou suas idéias na revista brasileira
de farmácia em 1941.
2.1.2.2 Apicultura
Em 1839, teve início à criação de abelhas que não eram de origem nativa do
Brasil, aonde colméias vindas de Portugal para o Rio de Janeiro, a mando do Padre
Antônio Carneiro Aureliano, ao fim de dois anos já haviam produzido mais de 200
colméias dessas abelhas na Quinta Imperial. (GUEDES, 2000).
Outros imigrantes, de origem alemã, em meados de 1845 iniciaram uma
criação de abelhas Apis Nigra e Apis mellifera, para os estados do sul e sudoeste do
país. “Em 1879, o apicultor Frederico Hanemann introduziu abelhas italianas (Apis
mellifera lingustica) no Rio Grande do Sul, e uma colônia da mesma espécie chegou
a Pernambuco em 1895, trazida pelo Padre Amato Van Emelen” (GUEDES, 2000, P.
8).
A partir das descobertas do geneticista Warwick Estevan Kerr, na década de
40, aumentou o interesse comercial e científico na cultura das abelhas. Suas
observações a respeito dos hábitos e comportamentos das abelhas nativas e
introduzidas no Brasil trouxeram um enorme desenvolvimento para a apicultura
brasileira. (GUEDES, 2000).
2.2 Taxonomia
A taxonomia das abelhas mostra as principais características físicas e
morfológicas das abelhas, nativas sem ferrão, daquelas que possuem ferrão, das
sugadoras e das lambedoras de néctar bem como daquelas que formam colônias e
aquelas que são solitárias. (Figura 6).
Figura 6 - Fluxograma - Taxonomia.
A Tiúba (Melipona compressipes fasciculata), abelha nativa sem ferrão
genuinamente maranhense, enquadra-se no filo Arthropoda, classe Insecta,
subclasse Pterygota (possuem asas), ordem Hymenoptera (insetos com quatro asas
membranosas), subfamília Apoidea, família Apidae (abelhas sugadoras de língua
Filo: Arthropoda
Classe: Insecta
Subclasse: Pterygota
Ordem: Hymenoptera
Subfamília: Apoidea
Apinae (Abelhas com ferrões)
Meliponinae (Abelhas sem ferrões)
Apis Bombus Meliponini Trigonini Lestrimellitini
longa), gênero Meliponinae, na subfamília meliponae (abelhas com ferrão atrofiado)
dos gêneros Meliponini.
2.3 Definição do mel de abelha
A elaboração do mel resulta de duas modificações principais (processos)
sofridas pelo néctar, uma física pela desidratação (eliminação da água), através da
evaporação na colméia e absorção no papo, a outra reação química que atua sobre
o néctar, transformando a sacarose, através da enzima invertase, em glicose e
frutose. Ocorrem mais duas reações, em escala menor, que consiste em transformar
o amido do néctar, através da enzima amilase em maltose e a enzima glicose-
oxidase transforma a glicose em ácido glicônico e peróxido de hidrogênio, este
último, conhecido como água oxigenada. (LENGLER, 2001). A fonte principal do mel
é o néctar das flores, açúcares dissolvidos secretados pelos nectários e colhido
pelas abelhas. (Figura 7).
Figura 7 - Abelha Uruçu (Melipona scutelaris)
Outra fonte, em pequena proporção é o mel originado do orvalho, cuja
secreção, de folhas de certas plantas, cochonilhas (muito freqüente nos Alpes
Europeus) e substâncias doces diversas (bagaço de cana-de-açúcar e frutas).
(LENGLER, 2001).
O mel é basicamente uma mistura complexa de açúcares altamente
concentrada.
O mel de abelhas é um produto muito apreciado, no entanto, de fácil
adulteração com açúcares ou xaropes. Desta forma, é necessário que haja algumas
análises para a determinação da sua qualidade para que seja comercializado.
Sua composição química foi objeto de revisões bibliográficas como a
realizada por Campos e Serrano et al, apresentada em obra de Vilhena e Murandian,
(1999 apud EVANGELISTA-RODRIGUES; SILVA; BESERRA, 2000, p. 5-6), “que
sugeriram ser a composição do mel dependente de muitos fatores tais como:
espécies colhidas, natureza do solo, raça de abelhas, estado fisiológico da colônia,
estado de maturação do mel, condições meteorológicas, etc”.
O mel da abelha do gênero meliponae, abelhas nativas sem ferrão, pouco se
conhece a respeito de suas propriedades e características físico-químicas, tendo
como base para estes estudos comparações com dados já existentes em relação ao
mel das abelhas africanizadas. “Assim, se faz necessário estudar esse produto,
porque os hábitos das abelhas nativas se diferenciam das abelhas africanizadas,
podendo alterar também a composição do produto” (NOGUEIRA-NETO, 1997 apud
EVANGELISTA-RODRIGUES; SILVA; BESERRA, p. 6).
2.4 Composição química do mel de abelha
Sabe-se que o mel é um produto que tem inúmeros componentes e
substâncias em sua composição, desde açúcar até sais minerais, proteínas e
vitaminas, com valores e proporções já determinados e que este mel é o da abelha
Apis mellifera. O mais analisado para se obter dados e padrões a respeito dos
valores e proporções destes componentes e substâncias presentes, como mostram
as Tabelas 1 e 2 no item 2.4.1.
2.4.1 Composição química do mel em geral
A Tabela 1 apresenta valores de algumas análises físico-químicas realizadas
com o mel de abelhas africanizadas (Apis mellifera).
Tabela 1 - Composição físico-química do mel de flores e melato - instrução
normativa nº 11 de 20 de outubro de 2000.
Parâmetros físico-químicos Mel de flores Mel de melato
1. Umidade máxima (%) 20,0 20,0
2. Açúcares redutores (mínimo) (%) 65,0 60,0
3. Sacarose (máximo) (%) 6,0 15,0
4. Cinzas (resíduo mineral) (máximo) (%) 0,6 1,2
5. Hidroxi Metil Furfural (máximo) (mg/kg) 60,0 60,0
6. Acidez (máxima) (mg/kg) 50,0 50,0
7. Atividade diastásica como mínimo 8 na escala Göthe (méis com baixo conteúdo
enzimático, mínimo 3 na escala Göthe, sempre que o conteúdo de Hidroxi Metil
Furfural não exceda a 15 mg/kg)
8. Sólidos insolúveis em água (máximo) 0,1%, exceto mel prensado se tolera 0,5%
Fonte: Lengler, 2001 Açúcares redutores = glicose e frutose
Quando o mel é secado e aquecido, no resíduo fica seu conteúdo em
minerais. A Tabela 2 apresenta, em partes por milhão (ppm) o conteúdo de minerais
do mel.
Tabela 2 - Minerais em mel claro e mel escuro.
Minerais Mel claro (ppm) mg/kg
Mel escuro (ppm) mg/kg
Potássio Cloro
Enxofre Cálcio Sódio
Fósforo Magnésio
Sílica Ferro
Manganês Cobre
205 52 58 49 18 35 19 22
2,40 0,30 0,29
1676 113 100 51 76 47 35 36
9,40 4,09 0,56
Fonte: Lengler, 2001
No mel podem ser encontradas as seguintes substâncias:
� Vitaminas: Vitamina A, Vitamina B (Tiamina), Vitamina B2 (Riboflavina),
Vitamina B5 (Ácido Pantatênico), Vitamina B6 (Piridoxina), Vitamina B (Ácido Fólico),
Vitamina C (Ácido Ascórbico), Vitamina H (Biotina), Vitamina PP (Niaciamina,
niacina, ácido nicotínico);
� Sais minerais: Cálcio, fósforo, enxofre, potássio, cloro, ferro, manganês,
cobre, sílica, sódio;
� Enzimas: Invertase, diastase, lípase, inulase, glicose-oxidase, catalase e
fosfatase ácida;
� Proteínas e aminoácidos: Prolinas, lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico,
arginina, cistina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, felilalanina, serina,
treonina, triptofano e tirocina.
Temos ainda na composição do mel: cetonas e aldeídos e os ácidos e seus
éteres.
2.4.2. Aspectos Microbiológicos do Mel
Além do seu uso como alimento, o mel tem sido utilizado pelas suas
propriedades medicamentosas. A sua eficácia, como auxiliar terapêutico, tem sido
demonstrada, embora, a explicação bioquímica desses efeitos ainda não seja
conclusiva (MOLAN, 2001). Alguns dos compostos do mel são substâncias
conhecidas como tendo ações fisiológicas que poderiam explicar tais efeitos. Sua
capacidade de proteger a mucosa estomacal de ratos contra lesões induzidas por
etanol está relacionada com a alta osmolaridade que é potencializada pelo aumento
do fluido sem aumentar a acidez gástrica (GHARZOULI, 2001). Entre os diversos
efeitos biológicos produzidos pelo mel, tem sido observado que este apresenta
propriedades antibacteriana, antifúngica, imunológica e antioxidante (MOLAN, 2001;
MOREIRA et al., 2001).
O mel, quanto a suas propriedades é dividido em dois grandes grupos:
méis peróxidos e méis não peróxidos ambos com poder bactericida sob uma grande
variedade de microrganismos. Os méis peróxidos são os que têm como substância
ativa o peróxido de hidrogênio e os méis não peróxidos têm seu efeito devido a
outros compostos químicos como: ácidos orgânicos, destacando-se o ferúlico e o
caféico, outros compostos fenólicos, flavonóides como: galangina, crisina e
quercitina (TAORMINA et al., 2001). As ações antibacteriana e antifúngica têm sido
amplamente divulgadas, nos mais diferentes agentes etiológicos de interesse
médico, como Escherichia coli, Salmonella thyphimurium, Shigella sonnei, Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Helicobacter pylori
e Candida albicans, entre outros (THEUNISSEN et al., 2001).
Um aspecto importante da produção do mel em qualquer nível é a
manutenção da qualidade do produto. A qualidade do mel utilizado como alimento
está relacionada a pelo menos quatro fatores básicos: 1) o tipo de frasco utilizado
para o envaze; 2) às condições de estocagem do produto; 3) às condições higiênicas
da coleta e 4) às características higiênicas das abelhas.
As embalagens apresentam um papel fundamental na preservação dos
alimentos, funcionam como uma barreira física entre o produto embalado e seu
entorno, resguardando o produto da incidência de luz e contato direto com a
umidade atmosférica. A deficiência de hermetismo entre a tampa e o corpo da
embalagem permite a passagem de umidade para o interior o que pode
comprometer consideravelmente a sua qualidade. A umidade pode favorecer a
fermentação de açúcares causada por microrganismos osmofílicos presentes no mel
que fazem parte da sua microbiota ou que foram veiculados durante o processo de
manejo ou que ainda não foram totalmente eliminados ou controlados durante o
processo de pasteurização (RIEDEL, 1981).
Segundo Lengler (2003), o armazenamento prolongado e em temperatura
acima de 30ºC favorece a produção de hidroxi-metil-furfural (HMF) no mel, que deve
ser avaliada em função do tempo de armazenamento. As modificações físico-
químicas, como a produção de (HMF), que é tóxico para as abelhas, serve de
indicador de armazenamento inadequado e de adulteração do mel. Diferentes
temperaturas de armazenamento podem favorecer granulação, fermentação e
cristalização no mel, porém, mel cristalizado sem indícios de fermentação, pode ser
consumido.
A coleta do mel é de grande importância para a qualidade do produto
destinado à comercialização. Tem que ser levado em consideração a época do ano
com menor pluviosidade e umidade, além do procedimento de coleta de forma
higiênica. Alguns produtores extraem o mel espremendo os favos com as mãos,
outros utilizam hastes de metal ou madeira para perfurar o favo, fazendo-o escorrer e
depois o filtram. Existe ainda a coleta por meio da aspiração com auxílio de uma
bomba e a coleta por centrifugação (KERR, 1996).
A qualidade do mel não depende apenas das práticas higiênicas do
produtor, mas também está relacionada com os hábitos higiênicos das abelhas. A
maioria das meliponas costuma visitar excrementos humanos, de animais e águas
poluídas (NOGUEIRA NETO, 1997), ainda segundo este autor, com relação a esses
hábitos, as abelhas são classificadas em: limpas, ocasionalmente limpas e sujas.
Neste último grupo há as abelhas com hábitos bem menos adequados a ponto de
seu mel não ser recomendado para consumo humano. A abelha mais higiênica é a
popular Jati, (Tetragonisca angustula). Outras com hábitos higiênicos impróprios
incluem: a Cupira, (Partamona cupira), Mandassaia (M. quadrifasciata), Jandaíra do
Nordeste, (M. subnitida), Uruçú do Nordeste, (M. scutellaris), e (T. testaceicornis) já
foram vistas coletando excrementos humanos, de animais e, a maioria, até mesmo
barro para a construção de suas colméias. A Trigona necrofaga e outras espécies de
trigonas são descritas como tendo o hábito de visitar carcaças de animais mortos
para retirar deles sua fonte de proteínas. Nogueira Neto (1997) alerta para o risco de
o mel transmitir a hepatite A. Além disso, existe ainda o risco de transmissão do
botulismo infantil (NAKANO, H. & SAKAGUCHI, 1991) e da salmonelose, uma vez
que o agente etiológico desta última patologia permanece viável por até 34 dias no
mel de Apis. Este risco está relacionado com práticas higiênicas inadequadas. No
mel das meliponas a viabilidade da Salmonella ainda não é conhecida (GROSSO et
al., 2002).
Para as abelhas do gênero Apis com características biológicas,
produtividade, tipo de colônias, características físico-químicas e hábitos higiênicos
diferentes das meliponas, existem normas estabelecidas para o físico-químico de
qualidade do mel. O mesmo não acontece com o mel produzido por meliponas, pois
não há, até o momento, normas que possam direcionar os procedimentos de análise
ou que permitam estabelecer critérios para o consumo, tempo de estocagem,
critérios de aceitação ou rejeição do consumo deste. Os artigos que se referem ao
mel de meliponas sempre traçam paralelos com méis das abelhas do gênero Apis o
que é inaceitável (CORTOPASSI-LAURINO & GUELLI, 1991).
2.4.3. Mel de abelhas sem ferrão
O mel das abelhas sem ferrão é rico em açúcar, contendo sais minerais,
vitaminas, proteínas, podendo ser usado na complementação alimentar, como fonte
desses nutrientes e até mesmo na prevenção de algumas doenças e infecções.
O mel das abelhas sem ferrão é armazenado em potes feito de cera para
armazenamento, maturação e conservação sendo que assim que o mel estiver
maduro os potes são abertos e servem para alimentar todas as abelhas da colméia,
inclusive a rainha, sendo que, esta recebe uma quantidade maior de mel para poder
se desenvolver (ANEXO B), diferentemente do que ocorre com as abelhas
africanizadas que guardam o seu mel em favos organizados de uma maneira
totalmente diferente a das abelhas nativas sem ferrão e alimentam a sua rainha com
geléia real. (Figura 8).
Figura 8 - Potes de mel e favos de cria da abelha nativa.
Outras características desse mel são suas propriedades organolépticas
como cor, viscosidade, sendo mais fluido e mais claro que o mel da abelha Apis.
Segundo Fuentes (2004, p. 2). (Figura 9).
Figura 9 - Méis de abelhas indígenas sem ferrão corretamente
colhidos e armazenados.
2.5 Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel de Abelha
Considerando a necessidade de padronizar o processamento de produtos de
origem animal, visando assegurar igualitárias e total transparência da elaboração e
comercialização deste produto, resolve segundo a instrução normativa nº 11 de 20
de outubro de 2000 do Ministério da Agricultura e do Abastecimento:
� Art. 1° - Aprovar o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel de
Abelha;
a) Art. 2° - Revogar a Portaria n° 367, de 4 de setembro, que aprovou o
Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel de Abelha.
2.5.1 Objetivo
Estabelecer a identidade e os requisitos mínimos de qualidade que deve
cumprir o mel destinado ao consumo humano direto.
Este Regulamento não se aplica para mel industrial e mel utilizado como
ingrediente em outros alimentos.
2.5.2. Definição
Entende-se por mel, o produto alimentício produzido pelas abelhas melíferas,
a partir do néctar das flores ou das secreções procedentes de partes vivas das
plantas ou de excreções de insetos sugadores de plantas que ficam sobre partes
vivas de plantas, que as abelhas recolhem, transformam, combinam com
substâncias específicas próprias, armazenam e deixam madurar nos favos da
colméia.
2.5.3 Classificação
2.5.3.1 Por sua origem
a) Mel floral - é o mel obtido dos néctares das flores.
� Mel unifloral ou monofloral - quando o produto proceda
principalmente da origem de flores de uma mesma família, gênero ou
espécie e possua características sensoriais, físico-químicas e
microscópicas próprias.
� Mel multifloral ou polifloral - é o mel obtido a partir de diferentes
origens florais.
b) Melato ou Mel de Melato - é o mel obtido principalmente a partir de
secreções das partes vivas das plantas ou de excreções de insetos sugadores
de plantas que se encontram sobre elas.
2.5.3.2 Segundo o procedimento de obtenção de mel do favo
a) Mel virgem - produto que flui espontaneamente dos favos, quando
desoperculados;
b) Mel centrifugado - obtido por processo de centrifugação;
c) Mel prensado - obtido por compressão a frio;
d) Mel em favos - mantido dentro dos próprios favos.
3. CONTROLE DE QUALIDADE FÍSICO-QUÍMICO DO MEL DE ABELHA
3.1 Equipamentos e acessórios
Relacionam-se, aos equipamentos a serem usados nas análises.
3.1.1 Balança digital
Utiliza-se uma balança digital Automarte, modelo AL500, com carga
mínima de 0,02 g e carga máxima de 500 g, para determinação das massas das
amostras.
3.1.2 Forno Mufla
Utiliza-se um forno mufla elétrico QUIMIS-TECNAL, com termostato
variando sua temperatura de 100 a 1200º C, para calcinação do mel.
3.1.3 Estufa de secagem e esterilização
Utiliza-se uma estufa para a secagem modelo 315-SE, com circulação
mecânica de ar e com variação de 0 a 110°C.
3.1.4 Chapa de aquecimento
Utiliza-se para aquecimento e secagem das amostras, chapa metálica de
aquecimento marca FANEM, modelo 170/3, com variação de temperatura de 0 a
100º C.
3.1.5 pH-metro
Para leitura de pH, utiliza-se um pH-metro, marca DIGMED, modelo
Dmph/1, com precisão de 10-1 unidades.
3.1.6 Refratômetro
Utiliza-se para medir a percentagem direta de sólidos solúveis das
amostras.
3.1.7 Bomba a vácuo
Utiliza-se para eliminar o excesso de água por sucção e ajudar em favor
da filtração na determinação de sólidos insolúveis em água.
3.2 Materiais e vidrarias
Materiais e vidrarias a serem utilizados:
� Cápsulas de porcelana;
� Cadinhos de porcelana;
� Garra metálica;
� Suporte universal;
� Bico de bunsen;
� Pêra de sucção;
� Tela de amianto;
� Papel de filtro;
� Pinça;
� Espátula;
� Tripé;
� Agitador magnético;
� Magneto;
� Pisseta;
� Provetas (normais e rolhas
esmerilhadas);
� Buretas;
� Bolinhas de vidro;
� Erlenmeyers;
� Pipetas (graduadas e
volumétricas);
� Balões volumétricos;
� Beckers;
� Bastão de vidro;
� Dessecador;
� Tubos de ensaio;
� Bomba a vácuo.
3.3 Reagentes e soluções
3.3.1 Reagentes
Reagentes a serem utilizados:
� Éter etílico;
� Resorcina;
� Ácido tânico;
� Hidróxido de sódio;
� Sal de Rochelle (tartarato de
sódio e potássio tetrahidratado)
� Ácido clorídrico;
� Amido.
� Glicerina;
3.3.2 Soluções
Soluções a serem utilizadas:
� Solução de ácido tânico 0,5%;
� Solução clorídrica de resorcina;
� Hidróxido de sódio 5 mol/L;
� Solução de lugol;
� Azul de metileno 1%;
� Solução de Fehling A e B;
� Soluções de mel;
� Solução de hidróxido de sódio
0,05 N;
� Ácido clorídrico 0,05 N.
3.4 Análises físico-químicas do mel de abelha
As análises serão realizadas segundo os métodos físico-químicos para
análise de alimentos do Instituto Adolfo Lutz (2005).
3.4.1 Brix
A percentagem de sólidos solúveis é obtida pela leitura direta no
refratômetro de cada amostra analisada. Utiliza-se a tabela do respectivo aparelho,
onde nos deu a devida correção da temperatura em que foi lida.
3.4.2 Umidade
Umidade corresponde à perda de peso pelo produto quando aquecido em
condições em que a água é removida. Utiliza-se como referência a Tabela de
Chataway (ANEXO C), obtendo a umidade em percentagem, simplesmente, pelo
valor de grau Brix obtido. Onde, fez-se a devida correção da temperatura de 30°C
para 20°C com auxílio da Tabela do aparelho refratômetro.
3.4.3 Acidez
Na determinação da acidez de cada amostra pesa-se 10 g das mesmas em
erlenmeyers de 250 mL onde se colocam 75 mL de água livre de CO2 e agita-se.
Titula-se com solução de hidróxido de sódio 0,05 N até o pH chegar a 8,5; logo em
seguida acrescenta-se 10 mL de NaOH 0,05 N imediatamente. Titula-se novamente,
agora com solução de ácido clorídrico 0,05 N até o pH chegar a 8,3. A determinação
da acidez pode ser expressa pela Equação 3.
� Correções:
NaOH corrigido = volume gasto NaOH x fator do NaOH
HCl corrigido = volume gasto do HCl x fator do HCl
� Cálculos:
Acidez livre = (NaOH gasto corrigido – branco) x 50 / peso da amostra. (Eq. 1)
Acidez lactônica = (10 – vol. HCl gasto corrigido) x 50 / peso da amostra. (Eq. 2)
Acidez total = Acidez livre + Acidez lactônica (meq/kg) (Eq. 3)
3.4.4 Cinzas
Resíduo mineral fixa ou cinzas é o nome dado ao resíduo obtido por
aquecimento de um produto em temperatura próxima a 550 – 570°C.
Pesa-se 5,0 g de cada amostra em cadinhos de porcelana, previamente
aquecida em forno mufla a 550°C, resfria-se em dessecador até temperatura
ambiente e pesa-se. Calcina-se em temperatura baixa e incinera-se no forno mufla a
550°C, por quatro horas. Resfria-se em dessecador até temperatura ambiente e
pesa-se. A determinação do teor de cinzas pode ser expressa pela Equação 4.
Cinzas (%) = P
N100 × (Eq. 4)
Onde:
N = massa em gramas de cinzas;
P = massa em gramas da amostra.
3.4.5 Açúcares redutores
Determina a osmolaridade a qual está envolvida na eliminação e controle da
fauna microbiana.
Na determinação de açúcares redutores, pesa-se 2,0 g de cada amostra e
em seguida completa-se o volume em um balão volumétrico de 100 mL.
Em erlenmeyers junta-se 50 mL de água destilada mais 10 mL da solução
de Fehling A e adiciona-se 10 mL da solução de Fehling B, deixa-se ferver, marca-
se dois minutos e começa-se a titular com a solução de mel diluída, sob agitação,
usa-se como indicador 3 gotas de azul de metileno a 1% e titula-se até atingir
coloração vermelho tijolo. A determinação dos açúcares redutores pode ser
expressa pela Equação 5.
Açúcares redutores (%) = x VP
Fc x 100 100 × (Eq. 5)
Onde:
Fc = Fator de correção equivalente a 0,05;
P = massa em gramas da amostra;
V = volume em mL gasto na titulação.
3.4.6 Açúcares totais
Determinam-se os açúcares de cada amostra tomando-se 50 mL da solução
restante de mel da análise de açúcares redutores num balão de 100 mL, acrescenta-
se 3 gotas de HCl concentrado e leva-se em banho-maria por 15 minutos, deixa-se
esfriar em temperatura ambiente, neutraliza-se com NaOH 5 mol/L e completa-se o
volume do balão. Titula-se da mesma forma que foi realizada para os açúcares
redutores. Em seguida procede-se igual à determinação de açúcares redutores
sendo expressa pela Equação 6.
Açúcares totais (%) = x VP
Fc x 100 100 × (Eq. 6)
Onde:
Fc = Fator de correção equivalente a 0,05;
P = massa em gramas da amostra;
V = volume em mL gasto na titulação.
3.4.7 Açúcares não-redutores
A determinação de açúcares não-redutores é realizada pela subtração dos
valores dos açúcares totais menos os valores dos açúcares redutores em relação a
cada amostra. A determinação dos açúcares não-redutores pode ser expressa pela
Equação 7.
% Açúcares não-redutores = % A.T. – % A.R . (Eq. 7)
Onde:
A.T. = açúcares totais;
A.R. = açúcares redutores.
3.4.8 Determinação de pH
“Representa as concentrações de íons de hidrogênio em uma solução que é
influenciada por fatores além da quantidade de ácidos presentes, particularmente
pelo conteúdo mineral”. (WHITE, 1992 apud CARVALHO, 2001, p. 11).
Pesa-se 10,0 g de mel dilui-se em 10 mL de água destilada e mede-se o pH
usando-se o pH-metro previamente calibrado e estabilizado.
3.4.9 Cor
A cor é um fator determinante para a aceitação do mel no mercado mundial,
sendo os méis mais claros os preferidos pelos consumidores. A cor do mel está
relacionada com a origem floral, o processamento e o armazenamento (SEEMANN e
NEIRA, 1988), mas ainda depende dos fatores climáticos durante o fluxo do néctar e
da temperatura na qual o néctar é transformado em mel no interior da colméia
(SMITH, 1967).
Para a determinação da cor seleciona-se o espectrofotômetro na faixa de
560 nm, deixa-se estabilizar, zera-se o equipamento, usando-se como branco de
glicerina PA. Faz-se a leitura em absorbância e usa-se como referência a Escala de
Pfund (ANEXO D), para a determinação da cor de acordo com a faixa.
3.4.10 Determinação de sólidos insolúveis em água
Pesa-se 25,0 g de cada amostra em beckers de 400 mL, adiciona-se 200 mL
de água quente e deixa-se em ebulição durante 20 minutos, substituindo a água
evaporada. Filtra-se em papel de filtro whatman nº 4 ou equivalente (previamente
lavado com água quente, colocado em placa de petri e aquecido em estufa a 100-
110°C, durante 1 hora, resfriado em dessecador até a temperatura ambiente e
pesado). Lava-se com 800 mL de água quente, elimina-se o excesso de água por
sucção, coloca-se o papel de filtro com o resíduo na mesma placa de petri e aquece-
se em estufa a 100-110°C, resfria-se em dessecador e pesa-se. A determinação do
teor de sólidos insolúveis em água pode ser expressa pela Equação 8.
Sólidos insolúveis (%) = P
N100 × (Eq. 8)
Onde:
N = massa em gramas do resíduo;
P = massa em gramas da amostra.
3.4.11 Lund
Pesa-se 2,0 g de cada amostra. Transfere-se para uma proveta de 50 mL,
com rolha esmerilhada, com auxílio de 20 mL de água. Adiciona-se 5 mL da solução
de ácido tânico a 0,5%. Adiciona-se água até completar o volume de 40 mL. Agita-
se, deixa-se em repouso por 24 horas.
O teste deve ser positivo formando-se um precipitado floculoso entre 0,6 a
3,0 mL, indicando que a amostra é pura. Ausência ou vestígio de precipitação indica
a presença de glicose comercial.
3.4.12 Fiehe
Pesa-se 5g de cada amostra em erlenmeyers de 250 mL. Adiciona-se 5 mL
de éter e agita-se vigorosamente. Transfere-se a camada etérea para tubos de
ensaio e deixa-se o éter evaporar à temperatura ambiente. Adiciona-se ao resíduo
dos tubos 5 gotas de solução clorídrica de resorcina.
O teste indica a presença de glicose comercial ou açúcar invertido técnico,
ou ainda um mel que sofreu superaquecimento. Adquirindo cor vermelha intensa,
indica presença de glicose comercial ou açúcar, indica ainda a presença de
hidróximetilfurfural (HMF), que reage com a resorcina em meio ácido.
Se a coloração for salmão, indica que o mel foi aquecido intensamente ou
estocado prolongada mente em temperatura ambiente elevada. O teste deverá ser
negativo para o mel puro.
3.4.13 Lugol
O teste indica a presença de amido e dextrinas ou açúcares comerciais.
Pesa-se 10,0 g de cada amostra em beckers de 50 mL. Adiciona-se 10 mL
de água. Agita-se, adiciona-se 1 mL de solução de lugol em cada amostra.
Caso o mel seja puro, o teste deve ser negativo, a coloração final é próxima
a do mel, caso contrário, adquirindo cor vermelho-violeta a azul, indica a presença
de amido e dextrina.
3.4.14 Determinação da atividade diastásica
Através deste teste pode-se determinar a presença de fermentos
diastásicos.
Na determinação da atividade diastásica, em tubos de ensaio, mistura-se 5
mL de solução de mel a 20% mais 5 mL de água destilada e 1 mL de solução de
amido 1%. Incuba-se em banho-maria a 45°C por 1 hora exatamente e, então,
acrescenta-se 1 mL da solução de lugol.
O teste deve ser positivo formando-se uma coloração parda clara, indicando
que o mel é legítimo e que possui atividade diastásica. Caso contrário, adquirindo
cor azul, representa um mel sem atividade diastásica, mel artificial, não hidrolisa o
amido.
A Figura 10 apresenta de forma simplificada as etapas de coletas e análises
físico-químicas do mel de abelha Tiúba (Melipona compressipes fasciculata).
Figura 10. Fluxograma referente às análises físico-químicas do mel.
QUANTITATIVAS QUALITATIVAS
Cor
Brix
Umidade
Acidez
Açúcares redutores
Açúcares totais
Açúcares não - redutores
Atividade diastásica
Sólidos insolúveis em água
Lund
Fiehe
Lugol
Cinzas
pH
COLETA DAS AMOSTRAS
T2 T1
ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
4. CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DO MEL DE ABELHA
4.1. Equipamentos e acessórios
4.1.1 Materiais, vidrarias e equipamentos
Materiais e vidrarias a serem utilizados:
� Tubos de ensaio;
� Placas de Petri;
� Bico de bunsen;
� Erlenmeyers;
� Pipetas (graduadas);
� Beckers;
� Bastão de vidro;
� Swab
� Discos de papel de filtro
� Estufa Bacteriológica (37ºC);
� Banho-maria (44,5ºC ± 0,5º)
4.1.2 Meios de cultura e soluções
4.1.2.1 Meios de cultura
Meios de cultura a serem utilizados:
� Caldo Lauril Sulfato;
� Caldo Verde Brilhante e Bile 2%;
� Caldo E.C;
� Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI)
� Caldo Tetrationato;
� Caldo Rapapport;
� Agar Batata Dextrose;
� Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC);
� Agar Plate Count (PCA);
� Agar Mueller-Hinton;
� Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS).
4.1.2.2 Soluções
Soluções a serem utilizadas:
� Solução salina 0,85% estéril;
� Solução de ácido tartárico 10%;
� Solução de lugol;
� Solução de verde brilhante.
5. CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS
Os microrganismos patogênicos estão presentes no solo e,
conseqüentemente, nas colheitas, nas aves e nos peixes, enfim em vários
alimentos. Portanto, é inevitável que os produtos in natura utilizados como
ingredientes sejam veículos de contaminação patogênica. Dessa forma, para evitar
toxinfecções alimentares, os patógenos dos ingredientes devem ser identificados e
controlados. Os programas de controle devem ser implantados, sendo monitorados
quanto à sua eficácia, além de serem revisados e modificados, sempre que
necessário.
5.1 Microrganismos indicadores da qualidade higiênico-sanitária dos alimentos
e causadores de enfermidades de origem alimentar
5.1.1 Coliformes Totais
Este grupo é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae, são
capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a 35º-37ºC
por 24-48 horas. São bacilos gram negativos não esporulados. Fazem parte desse
grupo às bactérias do gênero Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella,
além de serem encontrados nas fazes, também podem persistir longos períodos e
se multiplicar em ambientes não fecais, como vegetais, solo. A presença de
coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal
recente. O índice de coliformes totais é utilizado para avaliar as condições
higiênicas, sendo que as altas contagens significam contaminação pós-
processamento, limpezas e sanificações deficientes, tratamentos térmicos
ineficientes ou multiplicação durante o processamento ou estocagem.
Coliformes a 45ºC e Escherichia coli as bactérias pertencentes a este grupo
correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar
fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas à temperatura de
45ºC. Nessas condições, em torno de 90% das culturas de E. coli são positivas. O
índice de coliformes a 45ºC ou de E. coli nos alimentos é empregado como indicador
de contaminação fecal, ou seja, condições higiênico-sanitárias, visto que se estima
que a população deste grupo é constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem
seu habitat exclusivo no trato intestinal do homem e de outros animais. Assim, sua
presença pode indicar a possibilidade de ocorrerem outros microrganismos entéricos
na amostra.
Em alimentos processados, a presença de um número considerável de
coliformes ou de enterobactérias pode indicar: processamento inadequado e/ou
recontaminação pós-processamento, sendo as causas mais freqüentes aquelas
provenientes da matéria-prima, equipamento sujo ou manipulação sem a devida
higiene; proliferação microbiana que poderia permitir a multiplicação de
microrganismos patogênicos.
5.1.2. Diferenciação dos coliformes
A enumeração dos coliformes pode ser efetuada utilizando métodos
convencionais e métodos rápidos. O método convencional ainda muito empregado é
o método dos tubos múltiplos que pode ser utilizado para estimar o número de
coliformes pela técnica do Número Mais Provável (NMP). Para diferenciação entre
os coliformes fecais dos não-fecais são necessários testes bioquímicos para
identificação das espécies. Esses testes são coletivamente designados como
reações IMVic → indol; vermelho de metila; reação de Voges-Proskauer e citrato de
Simmons. Outros testes também são sugeridos como os carboidratos e
aminoácidos.
5.2. Escherichia coli
Escherichia coli é a espécie predominante entre os diversos microrganismos
anaeróbios facultativos que fazem parte da microbiota intestinal de animais de
sangue quente. Pertence à família Enterobacteriaceae e entre suas principais
características destacam-se: bacilos gram negativos não esporulados, capazes de
fermentar glicose com produção de ácido e gás. A maioria fermenta também a
lactose, com produção de ácido e gás.
As linhagens patogênicas de E. coli são divididas de acordo com os
sintomas clínicos nos seguintes grupos.
E. coli enterotoxigênica (ETEC)
E. coli enteropatogênica (EPEC)
E. coli enterohemorrágica (EHEC)
E. coli enterogregativa (EAggEC)
E. coli enteroinvasora (EIEC)
E. coli difusamente adesiva (DAEC)
Está relacionada com casos de diarréias, principalmente infantil, com colites
hemorrágicas, disenterias, infecções da bexiga, dos rins, infecções de feridas
cirúrgicas, septicemia, síndrome urêmica hemolítica. Algumas destas enfermidades
terminam em óbitos.
5.3. Salmonella spp.
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae. São gram
negativos, anaeróbios facultativos, não formam esporos e têm forma de bastonetes
curtos. A temperatura ótima de crescimento é de aproximadamente 38ºC e a
temperatura mínima é de 5ºC. Como não formam esporos, são relativamente
termolábeis, podendo ser destruídos a 60ºC por 15 a 20 minutos.
Existem mais de 2.5001 sorotipos de salmonelas, dentre os quais 1.478
pertencem à subespécie I, incluindo Salmonella sorotipo Typhi. Mudanças
significativas ocorrem na nomenclatura e taxonomia das salmonelas nos últimos
anos, baseadas, principalmente, nas suas características bioquímicas.
O gênero Salmonella está dividido em duas espécies Salmonella entérica e
Salmonella bongori, sendo a primeira subdividida em seis subespécies. Essas
enterobactérias são transmitidas ao homem, principalmente, por meio de consumo
de alimentos contaminados por fezes de animais ou humanas.
Os sintomas característicos de doenças de origem alimentar causadas por
Salmonella são: diarréia, náuseas, febre branda e calafrios, algumas vezes, vômitos,
dor de cabeça e fraqueza. O período de incubação antes da doença é de cerca de
16 a 72 horas. A enfermidade é, normalmente, auto-limitante e persiste durante 2 a 7
dias. A pessoa infectada excretará grandes quantidades de Salmonella pelas fezes
durante o período da doença. A dose infecciosa varia de acordo com a idade e a
saúde da vítima, com o alimento e ainda com a linhagem da Salmonella. As doses
infecciosas podem variar de 20 até 106 células.
A contaminação do alimento ocorre devido ao controle inadequado de
temperatura, de práticas de manipulação ou por contaminação cruzada de alimentos
crus com alimentos processados. O microrganismo se multiplica no alimento até
atingir a dose infecciosa.
5.3. Bolores e leveduras
O crescimento de bolores e leveduras é mais demorado do que o de
bactérias em alimentos de baixa acidez e alta atividade de água. Portanto,
dificilmente serão responsáveis pela deterioração desses alimentos. Em alimentos
ácidos e de baixa atividade de água, no entanto, o crescimento de fungos é maior,
provocando deterioração com grande prejuízo econômico em frutas frescas,
vegetais e cereais. São também responsáveis pela deterioração de sucos de frutas,
queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva como picles, quando
armazenados em condições inadequadas.
A presença de fungos filamentosos (bolores) e leveduras em índice elevado
nos alimentos pode fornecer várias informações:
� condições higiênicas deficientes de equipamentos;
� multiplicação no produto em decorrência de falhas no
� processamento e/ou estocagem;
� matéria-prima com contaminação excessiva.
A presença desses microrganismos pode tornar-se um perigo à saúde
pública devido à produção de micotoxinas pelos bolores. Algumas medidas devem
ser tomadas por manipuladores de alimentos suscetíveis a essa contaminação, na
tentativa de reduzir ou eliminá-la:
� boas práticas de higiene levam à redução da carga de esporos;
� esses alimentos devem chegar o mais rapidamente possível ao
� consumidor;
� o armazenamento de alimentos congelados deve ser a temperaturas
� inferiores a -12ºC;
� eliminar ou reduzir o contato com o ar através de embalagens, por
� exemplo;
� adicionar ácidos ou conservadores químicos como benzoatos ou
� sorbatos, para retardar o crescimento fúngico.
Baixas contagens de bolores e leveduras são normais em alimentos frescos
e congelados, não sendo, portanto, significativas. Somente quando o crescimento de
bolor for visível ou o alimento apresentar um número elevado de leveduras, o
consumidor será capaz de reconhecer a deterioração. Esta deterioração por
leveduras não é prejudicial à saúde.
6. MÉTODOS DE ANÁLISES
6.1. Amostragem
A obtenção correta das amostras, seu transporte para o laboratório e sua
preparação para análise são etapas fundamentais para o sucesso de uma análise
microbiológica.
Seguir as seguintes etapas:
� A amostra deve ser representativa, os produtos prontos para consumo
devem ser coletados em suas embalagens originais fechadas, com especificações
de dados que o identifique como, nº. do lote, data de fabricação, etc. Quando
embalagens abertas precisam ser analisadas, é importante que sejam
acondicionadas adequadamente para evitar contaminação com outros alimentos,
manipuladores, e com o ambiente.
� Os produtos acondicionados em embalagens, de difícil transporte para
o laboratório podem ser amostrados “in loco”, com a máxima assepsia.
� Alimentos perecíveis refrigerados devem ser mantidos entre 0º e 44ºC
até o início da análise. Quando se tratar de alimentos congelados, as amostras
devem ser descongeladas somente para a realização da análise. Como regra geral,
toda amostra deve ser analisada até 36 horas após sua obtenção. Produtos
perecíveis que não puderem ser analisados nesse período podem ser refrigerados
ou ainda congelados, dependendo do tipo de produto, objetivo da análise e tipo de
microrganismo a ser pesquisado.
� O número de unidades a serem coletadas para análise e dos critérios
adotados para aprovação ou reprovação de um produto definem um plano de
amostragem.
6.2. Preparo da amostra para análise microbiológica
6.2.1 Coleta da amostra
� Técnicas assépticas devem ser utilizadas em todas as etapas;
� Deve-se proceder à limpeza e a desinfecção da embalagem do
alimento a ser analisado com álcool a 70%;
� A quantidade analisada do alimento é muitas vezes na faixa de 25g (ou
mL) 50g
� A mostra precisa ser homogeneizada com diluente apropriado, a
escolha do diluente depende do tipo do produto e dos microrganismos a serem
pesquisados;
� A homogeneização das amostras com o diluente pode ser feita em
liquidificadores ou homogeneizadores de laboratório, denominados stomacher.
6.2.2 Retirada da amostra
A operação de retirada da amostra deve ser efetuada, preferencialmente,
dentro de uma capela de fluxo laminar, ou próxima de um bico de Bunsen, com a
chama a meia altura.
As embalagens devem ser desinfetadas antes de sua abertura que deverá
ocorrer de maneira asséptica. Amostras de alimentos líquidos devem ser retiradas
com pipeta estéril, e os alimentos sólidos ou semi-sólidos devem ser pesados
assepticamente.
6.2.3 Preparo das diluições
No preparo das diluições sucessivas, podem ser utilizados diversos
diluentes; solução salina-peptonada, salina a 0,85% ou água estéril e outros.
Para obtenção da diluição inicia (1/10) procede-se do seguinte modo:
a) Retirar assepticamente porções de 25g ou 25 mL da amostra, colocando–se em
homogeneizadores esterilizados ;
b) Adicionar 225 mL do diluente;
c) Homogeneizar por alguns minutos em velocidade reduzida, para não danificar as
células microbianas.
d) A partir da diluição inicial (1/10), proceder às diluições seguintes (1/100); (1/1000),
etc. (Anexo E).
6.3. Estimativa da população de coliformes totais, a 45ºC e Escherichia coli
através do número mais provável (NMP).
Tradicionalmente, as bactérias do grupo coliformes têm sido consideradas
como indicadoras de poluição fecal em alimentos e águas. São bastonetes gram
negativas, não esporuladas, de metabolismo aeróbio ou facultativo anaeróbio, da
família das Entenobacteriaceae. O grupo dos coliformes totais (CT) apresenta a
característica de fermentar a lactose com produção de gás dentro de 48 horas a
35ºC. Mais de 20 espécies de bactérias podem ser classificadas como coliformes,
originárias tanto do trato gastrintestinal do homem e de animais, como também de
outros ambientes.
O grupo de coliformes a 45ºC é formado pelos coliformes que fermentam
lactose, com produção de gás dentro de 24-48 horas, em temperatura de 45ºC,
normalmente em Caldo EC. Podem ser Citrobacter freundi, Enterobacter spp.,
(incluindo E. aerogenes e E. cloacae), Kleblsiella etc. Entretanto, Escherichia coli é a
única espécie cujo habitat é o trato gastrintestinal do homem e de animais.
Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter podem desenvolver-se fora do trato intestinal,
tais como vegetais e solo.
Quando se determina à população dos coliformes a 45ºC, 90% corresponde
á população de Escherichia coli. A técnica mais usada nos laboratórios para
determinação de coliformes (totais e a 45ºC) é a do número mais provável (NMP)
dos tubos múltiplos, onde se estima quantitativamente este grupo, utilizando-se a
Tabela de Hoskins (Apêndice F). Outras técnicas são utilizadas para determinação
de coliformes como membrana filtrante e simplate.
6.3.1 Método Coliformes Totais
� Prova Presuntiva
Visa detectar a presença de microrganismos fermentadores de lactose,
especialmente o grupo coliforme. Células estressadas por tratamentos térmicos,
pelo congelamento ou outro motivo, podem ser recuperados nessa fase.
� Procedimento
Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular uma série de três
tubos de ensaio contendo, em cada tubo, 10 mL de Caldo Lauril Sulfato e tubos de
Durhan invertidos com cada uma das diluições decimais preparadas. Colocar, em
cada tubo com o Caldo Lauril, 1,0 mL de do inoculo. Incubar em estufa de
bacteriologia a 35-37ºC por 24 a 48 horas. Após as 48 horas, retirar os tubos de
ensaio da estufa. São considerados positivos aqueles que apresentarem turvação do
meio e presença de gás (bolhas de ar) no interior dos tubos de Durhan. Em seguida
contar o número de tubos positivos correspondentes a cada diluição (Apêndice G).
� Prova Confirmatória (Coliformes totais)
O meio utilizado, o Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2%, contém dois
inibidores (Bile e Verde Brilhante) do crescimento da microbiota acompanhante,
especialmente bactérias gram-positivas. Assim, a produção de gás nos tubos, nas
condições do teste, indica que houve desenvolvimento ou bactérias gram-negativas
que fermentaram lactose, características do grupo coliforme.
� Procedimento
Riscar os tubos de ensaio positivos no Caldo Lauril Sulfato para os tubos de
Caldo Verde Brilhante a 35-37ºC por 24 a 48 horas. Os tubos positivos apresentam
turvação e formação de bolhas de gás nos tubos de Durhan. Anotar os resultados de
consulte a tabela para NMP (Número Mais Provável) para coliformes totais por
grama ou mL.
6.3.2. Coliformes a 45ºC
Para a qualificação dos coliformes a 45ºC risque os tubos de ensaio
positivos no Caldo Lauril Sulfato e/ou dos tubos positivo do Caldo Verde Brilhante
para os tubos de Caldo EC e coloque no banho-maria por 24 ou 48 horas. Os tubos
positivos apresentam positividade semelhante nos Caldo Lauril e Verde Brilhante.
Anotar os resultados consultando a tabela do NMP para coliformes a 45ºC por
grama ou mL.
6.3.2.1. Identificação de Escherichia coli
A partir de cada tubo de ensaio positivo com Caldo EC riscar (estriar) placas
de Petri para Agar EMB (Eosina Azul de Metileno) com auxilio de alça de níquel
cromo e incubar a 35ºC por 18 a 24 horas. Ter o cuidado de, durante a inoculação,
não colocar muito material da amostra, afim de não superlotar as placas,
proporcionando às colônias crescimento isolado, transcorrido este tempo, verificar o
crescimento de colônias com características de E. coli, ou seja, 2 a 3 cm de
diâmetro, com brilho metálico esverdeado ou com centro escuro (Apêndice H).
De cada placa correspondente a cada tubo, repicar de 2 a 3 colônias
características para tubo com Agar Triptona de Soja (TSA) inclinado e incubar por
18-24 horas a 35-37ºC. Efetuar em cada cultura em TSA, as provas bioquímicas:
IMViC -Indol, Vermelho de metila, Vogues-Proskauer e Citrato de Simmons).
Considerar a cultura positiva para E.coli, quando forem obtidos os seguintes
resultados para o IMViC (Tabela 1).
Tabela 1. IMViC.
OBS:
1- Outros testes bioquímicos podem ser adicionados, como os testes de
carboidratos e aminoácidos.
2- Tabela do NMP (Apêndice B).
6.3.3. Pesquisa de Salmonella spp.
Salmonella é um gênero da família Enterobacteriaceae, gram negativo, não
esporulado. Várias espécies são patogênicas ao homem e aos animais. Habitando o
trato intestinal de animais, Salmonella é eliminada pelas fezes. A possibilidade de
contato dessas fezes contaminadas com águas, superfícies e manipuladores, torna
iminente a sua veiculação por alimentos.
Existem vários métodos para o isolamento de Salmonella, nenhum é
completamente satisfatório para isolar todos os sorotipos presentes em qualquer
alimento. Eles compreendem as seguintes etapas: pré-enriquecimento,
enriquecimento seletivo, isolamento em agar seletivo e diferencial e seleção de
colônias suspeitas, com as quais realizam-se provas bioquímicas, sorologia e
fagotipagem, que definirão, finalmente, o sorotipo.
� Técnica de Análise
a) Pré-enriquecimento: Pesar 25 g ou medir 25 mL da amostra e adicionar 225mL de
Caldo Lactosado ou Água Peptonada Tamponada. Incubar a 35-37ºC por 24 horas.
b) Enriquecimento seletivo: Agitar o caldo pré-enriquecimento e inocular 0,1mL em
10mL do meio Rapapport e 1,0mL em 10mL do Caldo Tetrationato. Incubar os meios
a 37ºC e 42ºC/24 horas.
c) Plaquemento em meio seletivo e diferencia l: Agitar os tubos de Caldo Rapapport
e Tetrationato e estriar uma alçada de cada cultura em placas nos seguintes meios
de cultura: Agar Hektoen, Agar Rambac e Agar XLD, identificando a origem das
culturas (Rapapport e tetrationato). Incubar as placas invertidas a 35ºC por 24 horas.
d) Seleção de colônias suspeitas: Transcorrido o período de incubação do
plaqueamento seletivo, observar as colônias suspeitas de Salmonella com auxílio de
manuais especializados (Apêndice I).
e) Provas bioquímicas de triagem: Transferir duas ou mais colônias suspeitas de
cada placa para tubos inclinados, contendo Agar TSI e LIA. Com auxílio de agulha
de inoculação, tocar levemente o centro da colônia, estriar na superfície inclinada
(ápice) do TSI e dar uma picada na base. Sem flambar a agulha, dar duas picadas
na base do meio LIA e estriar na superfície. Rotular os tubos, identificando a origem
das culturas e incubar a 35ºC por 24 horas.
Reações típicas de Salmonella nos tubos de TSI e LIA, são as seguintes:
� TSI → ápice alcalino (vermelho) e base ácida (amarela), com ou sem
produção de gás (bolha) e de H2S (escurecimento do meio).
� LIA → base alcalina (púrpura), a maioria produz H2S. Coloração
vermelho-tijolo no ápice do meio LIA não é tipo de Salmonella.
Submeter todas as culturas com reações típicas no meio LIA (base alcalina)
e/ou no meio TSI (alcalina/ácida) a testes bioquímicos e sorológicos. Descartar
apenas as culturas ápice/base ácidas no meio TSI e aquelas com base ácida no
meio LIA (Apêndice J).
� Provas bioquímicas de confirmação
� Teste da urease: Inocular com alça, tubos de ensaio com Caldo Uréia.
Incubar a 35ºC por 24 horas. Reação positiva: alteração da cor do meio para rosa
escuro, pela viragem alcalina do indicador. A maioria das cepas de Salmonella é
urease negativa (não altera a coloração do meio).
Para os testes posteriores, renovar as culturas urease negativas em meio
TSI inclinado e incubar a 35ºC por 24 horas.
� Teste de fermentação do dulcitol: Inocular uma alçada em tubos de
ensaio com Caldo Púrpura de Bromocresol com 0,5% de dulcitol. Incubar a 35ºC por
48 horas. Reação positiva: acidificação do meio (amarelo). Reação negativa:
coloração púrpura do meio. A maioria das cepas de Salmonella fermenta dulcitol.
� Teste de utilização do malonato: Inocular cultura para tubos de ensaio
com Caldo Malonato e incubar a 35ºC por 48 horas, mas examinar após 24 horas.
Incubar um tubo controle não inoculado. A maioria dos sorotipos de Salmonella é
malonato negativo (coloração verde). Malonato positivo (alteração de cor verde para
azul).
As culturas de Salmonella spp. apresentam o seguinte quadro:
Teste Resultado Citrato de Simmons + Malonato - Vermelho de meti la + Voges-Proskauer - Indol _ Urease - Lisina + Açúcares; lactose - Açúcares; gl icose + Açúcares; dulcitol + Moti l idade (meio SIM) +
6.3.4. Contagem de Bolores e Leveduras
Os bolores são fungos com estruturas filamentosas. As leveduras são fungos
unicelulares de forma esférica, ovóide, cilíndrica. Os fungos são talvez a causa mais
comum de deterioração de alimentos estocados em ambientes domésticos, além
disso, alguns bolores produzem micotoxinas.
Técnica de Análise
Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar as diluições
sucessivas (10-1 a 10-3). Pipetar alíquotas de 1mL de cada diluição para placas de
Petri, fazendo de cada diluição placas em duplicatas. Adicionar a cada placa 15mL
do Agar batata dextrose, previamente fundido, resfriado a 45ºC e acidificado com o
ácido tartárico. Homogeneizar com movimentos em forma de oito. Deixar solidificar a
temperatura ambiente. Incubar as placas a 25ºC por 3 a 5 dias.
Para a contagem de bolores e leveduras em placas utilizando o Agar
Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) alíquotas de 0,1 mL das diluições,
serão inoculadas na superfície das placas contendo o agar em duplicatas sendo
espalhadas com bastão em “L”. As placas inoculadas serão incubadas por 3 a 5 dias
à temperatura de 25° C .
Resultados
Após o período de incubação, considerar para contagem somente as
placas da mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias. Em seguida,
multiplicar a média das duas placas pelo fator de diluição correspondente,
expressando o resultado em Unidades Formadoras de Colônias por grama ou
mililitros (UFC/g ou mL) (Apêndice L).
6.3.5 Pesquisa de Clostrídos Sulfito Redutores
As bactérias do gênero Clostridium estão amplamente distribuídas na
natureza, podendo ser encontradas no solo, ar, poeira, água, alimentos e até no
trato intestinal do homem e de animais.
Estas bactérias têm sido freqüentemente associadas a surtos de DTAs,
quando uma população de, no mínimo 1 milhão de bactérias, contamina estes
alimentos.
A detecção de clostrídios sulfito redutores se faz por contagem em placas,
em meio contendo sulfito de sódio e sais de ferro, além de antibiótico. A redução de
sulfito, produzindo sulfeto, é detectada por sua reação com ferro, provocando o
aparecimento de colônias negras, dentre aquelas redutoras de sulfito. Podem ser
utilizados dois meios seletivos, o Agar Seletivo Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS)
e o Agar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) com emulsão de gema de ovo, usado
para plaqueamento em profundidade.
Uma outra bactéria sulfito redutora de grande importância é. C. botulinum
que, se presente, será igualmente detectada.
Muitos casos de surtos de toxinfecções relacionados a bactérias
produtoras de toxinas de elevada potência em conservas enlatadas têm sido
relatados.
A pesquisa de determinadas espécies, como C. perfringens ou C.
botulinum, se faz a partir da estimativa em meio de cultura, pela amostragem de
colônias suspeitas e pelas respectivas provas bioquímicas.
� Técnica de Análise
Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL da amostra e preparar
diluições sucessivas. Pipetar alíquotas de 1mL de dada diluição em placas com Agar
(SPS) ou TSC, previamente fundido e resfriado a 50ºC. Após a absorção do inoculo,
adicionar uma sobrecamada cerca de 10mL do meio fundido e resfriado e permitir
mais uma vez a sua solidificação. Incubar em jarra anaeróbica a 46ºC por 24 horas
permitir mais uma vez a sua solidificação.
Contar o número total de colônias negras, observando o limite entre 20 e
200 colônias negras com ou sem halo por placa. Contar todas as colônias negras e
calcular a média das duas placas (Apêndice M).
� Confirmação das colônias típicas de Clostridium sulfito redutor
Selecionar várias colônias típicas e transferir para tubos de Caldo Infusão
Cérebro Coração (BHI), previamente desaerados. Incubar os tubos inoculados a
35ºC/24 horas, preparar um esfregaço da cultura para coloração de gram e utilizar o
caldo remanescente para teste de catalase.
� Teste de catalase
Adicionar ao tubo de BHI 1,0mL de peróxido de hidrogênio 3% e observar
se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (teste negativo). Os
clostrídios sulfito redutores são bastonetes gram positivos, catalase negativos.
� Cálculo dos resultados
Considerar como confirmadas todas as culturas de bastonetes gram positivos
catalase negativos. Calcular o número de UFC/g ou mL em função do número de
colônias típicas, diluição inoculada e percentual de colônias confirmadas. Por
exemplo, para plaqueamento em profundidade, diluição 10-2, 25 colônias típicas, 10
submetidas à confirmação, 8 confirmadas (80%) � UFC/g ou mL = 2,5 x 102 x 0,8 =
2,0 x 103.
6.3.6. Contagem Padrão em Placas (CPP) de Microrganismos Aeróbios
Mesófilos Viáveis
O método da Contagem Padrão em Placas (CPP), estima o número de
células viáveis contidas em um alimento qualquer. Este método, não diferencia tipos
de bactérias, sendo utilizado para se obter informações gerias sobre a qualidade de
produtos, práticas de manufatura, matérias primas utilizadas, condições de
processamento, manipulação e vida de prateleira. Não é um indicar de segurança,
pois não estar diretamente relacionado à presença de patógenos ou toxinas.
Sua presença em grande número indica:
a) Matérias-primas excessivamente contaminadas;
b) Limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas;
c) Higiene inadequada na produção;
d) Condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção ou
a conservação dos alimentos ou uma combinação destas circunstâncias.
As técnicas utilizadas para se quantificar as bactérias são: “Pour Plate”,
“Spread Plate”. O método CPP baseia-se na premissa de que cada célula viável,
isolada, homogeneizada em um meio sólido (agar), dará origem a uma colônia uma
vez que é teoria biológica que uma colônia provém de uma única célula microbiana.
� Técnica de Análise
Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar diluições
sucessivas. Pipetar alíquotas de 1mL de cada diluição para placa de Petri
esterilizadas. Adicionar a cada placa 15-20mL de Agar Padrão para Contagem,
previamente fundido e resfriado a temperatura de 45ºC. Homogeneizar em
movimentos suaves em forma de oito (cerca de dez vezes) e deixar a temperatura
ambiente, até a completa solidificação do agar. Após a solidificação, incubar as
placas em posição invertida a 35-37ºC/48 horas (Apêndice N).
� Resultados
Transcorrido o tempo de incubação, considerar para contagem, somente
as placas da mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias; o resultado
deve ser expresso seguindo a formula:
Nº de unidades formadoras de colônias/mL ou g = Nº de colônias x
diluição.
Sempre que quiser trabalhar com segurança, o método CPP exige o uso
de placas de Petri em duplicatas. Muitos erros podem ser cometidos na execução do
método: erros de pesagem, erros da amostra, erros na medida dos volumes dos
diluentes e nas alíquotas a serem distribuídas nas diluições, erros no espalhamento
do inoculo, contaminação nas operações e erros na homogeneização das amostras.
No resultado:
Contagem de bactérias = 36; Diluição = 10-3; Nº UFC = 36 x 103 UFC/g ou
mL ou 36000 = 3,6 x 104 UFC/g ou mL.
6.3.7. Atividade Antibacteriana do Mel pelo Método de KIRBY-BAUER (1966)
Este método tem por objetivo verificar a ação de substâncias
antimicrobianas no crescimento de bactérias.
A determinação da atividade antimicrobiana do mel será realizada frente
três bactérias patogênicas: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus
mirabilis.
� Procedimentos
1. Realizar o cultivo das cepas em caldo BHI (35°C/24h);
2. Semear alíquotas de 0,1ml da cultura sobre a superfície do Agar Mueller Hinton,
espalhando o inóculo com auxilio do swab (Figura 11).
3. Após a semeadura, os discos impregnados com 0,75µl do mel são colocados
sobre a superfície do agar inoculado e levemente pressionados com auxilio de uma
pinça (Figura 12).
4. Incubar as placas a 35°C pelo mínimo de 18 horas e máximo de 48 horas.
� Interpretação dos resultados
1. Observar as placas do antibiograma, verificando a presença ou ausência de halos
de inibição do crescimento em torno dos discos.
2. A zona clara de inibição (raio do halo de inibição) ao redor de cada disco é
medida em milímetros com auxílio de régua (Figura 13).
Figura 11. Semeadura da bactéria no Agar Muller Hinton
Figura 12. Deposição dos discos impregnados com o mel
Figura 13. Visualização da placa do teste de antibiograma
7. REFERÊNCIAS
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ANEXOS
ANEXO A – ANATOMIA INTERNA DA ABELHA
ANEXO B – ABELHA NATIVA (Rainha)
ANEXO C – TABELA DE CHATAWAY* - UMIDADE
Índice de refração a 20°C
Sólidos Solúveis %
Peso específico a 20°C
Umidade %
1,4844 79,0 1,3966 21,0 1,4849 79,2 1,3979 20,8 1,4853 79,4 1,3992 20,6 1,4858 79,6 1,4006 20,4 1,4862 79,8 1,4020 20,2 1,4866 80,0 1,4033 20,0 1,4871 80,2 1,4046 19,8 1,4876 80,4 1,4060 19,6 1,4880 80,6 1,4074 19,4 1,4885 80,8 1,4086 19,2 1,4890 81,0 1,4101 19,0 1,4895 81,2 1,4115 18,8 1,4900 81,4 1,4129 18,6 1,4905 81,6 1,4143 18,4 1,4910 81,8 1,4156 18,2 1,4915 82,0 1,4171 18,0 1,4920 82,2 1,4182 17,8 1,4925 82,4 1,4197 17,6 1,4930 82,6 1,4212 17,4 1,4935 82,8 1,4225 17,2 1,4940 83,0 1,4239 17,0 1,4945 83,2 1,4254 16,8 1,4950 83,4 1,4267 16,6 1,4955 83,6 1,4282 16,4 1,4960 83,8 1,4295 16,2 1,4965 84,0 1,4310 16,0 1,4970 84,2 1,4324 15,8 1,4975 84,4 1,4338 15,6 1,4980 84,6 1,4352 15,4 1,4985 84,8 1,4367 15,2 1,4990 85,0 1,4381 15,0 1,4995 85,2 1,4395 14,8 1,5000 85,4 1,4409 14,6 1,5005 85,6 1,4424 14,4 1,5010 85,8 1,4438 14,2 1,5015 86,0 1,4453 14,0 1,5020 86,2 1,4466 13,8 1,5025 86,4 1,4481 13,6 1,5030 86,6 1,4495 13,4 1,5035 86,8 1,4510 13,2 1,5040 87,0 1,4525 13,0
ANEXO D – TABELA DE CLASSIFICAÇÃO DA COR (ESCALA DE PFUND)
Cor Escala de Pfund Faixa de cor
Branco d’água 1 a 8 mm 0,030 ou menos
Extra branco mais de 8 a 17 mm mais de 0,030 inc. 0,060
Branco mais de 17 a 34 mm mais de 0,060 inc. 0,120
Extra âmbar claro mais de 34 a 50 mm mais de 0,120 inc. 0,188
Âmbar claro mais de 50 a 85 mm mais de 0,188 inc. 0,440
Âmbar mais de 85 a 114 mm mais de 0440 inc. 0,945
Âmbar escuro mais de 114 mm mais de 0,945 inc. ...
Anexo E . Esquema das di luições sucessivas.
Diluição
Alimento (25g)
Homogeneizar
225mL de H2O peptonada, 0,85%
10-2 10-3
1mL
1mL
10-1
Anexo F. Tabela do Número Mais Provável (NMP), para séries de três
tubos (NMP/g ou mL).
Número de tubos positivas nas diluições Número de tubos positivos nas diluições
10-1 10-2 10-3 NMP 10-1 10-2 10-3 NMP
0 0 0 3 2 0 0 9.1 0 1 0 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6.1 2 1 1 20 0 1 2 9.2 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6.2 2 2 0 21 0 2 1 9.3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9.4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3.6 3 0 0 23 1 0 1 7.2 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7.3 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 2400
Anexo G. Enumeração de coliformes totais e a 45ºC.
1ml 1ml 1ml
10-1 10-2 10-3
Caldo Lauryl (CL)
ESTUFA 35ºC/24-48h
2 alçadas
Teste Confirmativo coliformes a 45ºC
(Caldo E.C.)
2 alçadas
Teste Confirmativo coliformes totais
(Caldo VB)
BANHO-MARIA 45ºC/24h
ESTUFA 35ºC/24-48h
Gás (+) Presença de
coliformes a 45ºC
Gás (-) Ausência de
coliformes a 45ºC
Gás (+) Presença de
coliformes totais
Gás (-) Ausência de
coliformes totais
TESTE BIOQUÍMICO Teste API-20E
Anexo H. Identif icação de Escherichia col i.
Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB) com crescimento de E. coli .
Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)
Caldo E.C., presença de gás (+) para coliformes a 45ºC.
INDOL
E. coli (+)
Série Bioquímica
Anexo I. Pesquisa de Salmonella spp.
Estrias
225ml de Água Peptonada Tamponada
ESTUFA A 35ºC/24 horas
ENRIQUECIMENTO
0,1mL 1mL
10mL de Caldo Tetrationato
10mL de Caldo Rapapport
ESTUFA A 35ºC/24 horas
Agar Tripcase Soja
Testes Bioquímicos
Agar Hektoen Agar Rambach
INCUBAÇÃO 35ºC/24H
ALIMENTO 25g ou 25ml
Anexo J . Identif icação de Salmonella spp.
Citrato de Simmons
Uréia Agar LIA Agar TSI
a Testes Preliminares ( 1 Etapa )
Vogues - Proskauer Vermelho de Metila
Indol
Testes Finais ( 2 a Etapa )
Fermentação de Lactose Fermentação de Sacarose Caldo Malonato
Anexo L. Contagem de Bolores e Leveduras.
225ml solução salina estéril
Agar Batata Dextrose adicionado Ácido Tartárico
9 ml sol. salina
1ml
10-2 10-3 10-4 10-1
1ml 1ml
1ml 1ml 1ml 1ml
ALIMENTOS 25g ou 25 ml
ESTUFA B.O.D. 25ºC/ 5 dias
Contagem das placas que contenham entre 30 e 300 colônias (UFC/g ou ml)
Anexo M. Contagem de Clostr idium spp.
Contagem das colônias típicas de Clostridium spp. em Agar SPS
Isolamento em Agar Tripticase Soja (Agar TSA)
1ml 1ml 1ml 1ml
9 ml sol. salina 1ml
225ml solução salina estéril
10-2 10-3 10-4 10-1
1ml 1ml ALIMENTO 25g ou 25ml
ESTUFA 46ºC/48 horas (Em Anaerobiose)
TESTES BIOQUÍMICOS
Anexo N. Esquema da técnica de análise de Contagem Padrão em
Placas de bactérias mesófi las.
1mL
1mL 1mL Amostra
(25g)
10-2
10-3
10-4
10-1
1mL 9 mL sol.
salina 0,85% NaCl
225mL solução
salina estéril
Plate Count
Agar (PCA) 1mL 1mL 1mL
Incubação 37ºC/48h
Contagem das placas contendo
30 a 300 colônias
